RU2639477C2

RU2639477C2 - Способ ферментативной обработки тканевых продуктов

Info

Publication number: RU2639477C2
Application number: RU2013148157A
Authority: RU
Inventors: Йи ЧЕН
Original assignee: Лайфселл Корпорейшн
Priority date: 2011-04-28
Filing date: 2012-04-27
Publication date: 2017-12-21
Also published as: BR112013027307A2; KR102068071B1; CN103491986B; US9956316B2; KR20190116524A; AU2020203189A1; EP3789047A1; AU2018200162A1; DK2701755T3; BR112013027307B1; JP6437598B2; WO2012149253A1; KR102030196B1; US20180214607A1; ES2847409T3; ES2720137T3; CA2832731C; AU2018200162B2; JP6243326B2; DK3473278T3

Abstract

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к хирургии и трансплантологии, и предназначена для ферментативной обработки тканевых продуктов с получением бесклеточной тканевой матрицы. Для обработки тканевой матрицы осуществляют выбор содержащей коллаген кожной тканевой матрицы, удаление всех клеток и клеточных компонентов из кожной тканевой матрицы и последующее приведение кожной тканевой матрицы в контакт с протеолитическим ферментом при условиях, достаточных для получения необходимого повышения пластичности в кожной тканевой матрице. Также обеспечивается бесклеточная тканевая матрица, полученная с помощью обработки, которая включает выбор бесклеточной кожной тканевой матрицы и приведение бесклеточной кожной тканевой матрицы в контакт с протеолитическим ферментом при условиях, достаточных для получения необходимого повышения пластичности в бесклеточной кожной тканевой матрице. Использование группы изобретений позволяет повысить пластичность в бесклеточной кожной тканевой матрице, не снижая при этом другие ее механические свойства. 3 н. и 17 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 пр.

Description

[0001] Данная заявка заявляет приоритет предварительной заявки на патент США №61/479937, которая была подана 28 апреля 2011 года, согласно §119 раздела 35 U.S.С.

[0002] Настоящее раскрытие относится к тканевым матрицам и, более конкретно, к способам контроля пластичности тканевых матриц с помощью обработки матриц протеолитическими ферментами.

[0003] Различные полученные из тканей продукты применяют для регенерации, восстановления или иной обработки пораженных заболеванием или поврежденных тканей и органов. Такие продукты могут включать трансплантаты на основе интактных тканей и/или бесклеточные или реконструированные бесклеточные ткани (например, бесклеточные тканевые матрицы из кожи, кишечника или других тканей с высеянными клетками или без них). Такие продукты, в целом, характеризуются механическими свойствами, определяемыми источником ткани (т.е. типом ткани и животного, из которого она происходит) и параметрами обработки, применяемыми для получения тканевых продуктов. Поскольку тканевые продукты часто используют в хирургических применениях и/или при замещении или наращивании тканей, механические свойства тканевых продуктов являются важными. Например, хирурги, как правило, предпочитают ткани, которые являются более естественными на ощупь и/или с которыми легче обращаться в ходе хирургических процедур. Тем не менее некоторые тканевые продукты являются нежелательно жесткими и являются неестественными на ощупь. Соответственно, обеспечиваются способы обработки тканевых продуктов для получения более желаемых механических свойств.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] Согласно определенным вариантам осуществления предусматривается способ обработки тканевой матрицы. Способ может включать выбор содержащей коллаген тканевой матрицы и приведение тканевой матрицы в контакт с протеолитическим ферментом при условиях, достаточных для получения необходимого уровня пластичности в тканевой матрице.

[0005] В другом варианте осуществления предусматривается способ обработки тканевой матрицы. Способ может включать выбор содержащей коллаген бесклеточной тканевой матрицы и приведение тканевой матрицы в контакт с протеолитическим ферментом при условиях, достаточных для получения необходимого уровня пластичности в тканевой матрице и для повышения пористости тканевой матрицы.

[0006] В некоторых вариантах осуществления предусматривается бесклеточная тканевая матрица. Матрицу можно получить с помощью обработки, включающей выбор бесклеточной тканевой матрицы и приведение тканевой матрицы в контакт с протеолитическим ферментом при условиях, достаточных для получения необходимого уровня пластичности в тканевой матрице.

ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

[0007] На Фиг.1А-1D показаны бесклеточные тканевые матрицы после обработки ферментами с применением способов согласно настоящему раскрытию, а также необработанные контроли.

[0008] Фигура 2 представляет собой ящичковую диаграмму экспериментальных данных прочности на растяжение для обработанных и контрольных образцов.

[0009] Фигура 3 представляет собой ящичковую диаграмму экспериментальных данных прочности при сшивании для обработанных и контрольных образцов.

[0010] Фигура 4 представляет собой ящичковую диаграмму экспериментальных данных прочности на разрыв для обработанных и контрольных образцов.

[0011] Фигура 5 представляет собой ящичковую диаграмму экспериментальных данных обработки коллагеназой для обработанных и контрольных образцов.

[0012] Фигура 6 представляет собой ящичковую диаграмму экспериментальных данных сопротивления ползучести для обработанных и контрольных образцов.

ОПИСАНИЕ ОПРЕДЕЛЕННЫХ ИЛЛЮСТРАТИВНЫХ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[0013] Далее будет приведено подробное описание определенных иллюстративных вариантов осуществления согласно настоящему раскрытию, определенные примеры которых проиллюстрированы в прилагаемых графических материалах. Там, где это возможно, одинаковые позиционные обозначения будут применяться в графических материалах для обозначения одинаковых или подобных частей.

[0014] В данной заявке использование формы единственного числа включает форму множественного числа, если специально не указано иное. В данной заявке использование ʺилиʺ означает ʺи/илиʺ, если не указано иное. Более того, использование выражения ʺвключающийʺ, а также других форм, таких как ʺвключаетʺ и ʺвключенныйʺ, не является ограничивающим. Будет понятно, что любой диапазон, описанный в данном документе, будет включать конечные значения и все значения между конечными значениями.

[0015] Заголовки разделов, используемые в данном документе, представлены только с целью упорядочивания, и их не следует трактовать как ограничивающие описываемый объект изобретения. Все документы или части документов, цитируемые в данной заявке, в том числе без ограничения патенты, патентные заявки, статьи, книги и научные труды, таким образом явно включены с помощью ссылки в их полноте с любой целью.

[0016] Как используется в данном документе, ʺтканевой продуктʺ будет относиться к любой ткани человека или животного, которая содержит белки внеклеточного матрикса. ʺТканевые продуктыʺ могут включать бесклеточные или частично децеллюляризованные тканевые матрицы, децеллюляризованные тканевые матрицы, которые были повторно заселены экзогенными клетками, и/или содержащие клетки ткани, которые были обработаны для изменения направления по меньшей мере некоторых из коллагеновых волокон в пределах внеклеточного матрикса ткани.

[0017] Различные ткани человека и животных можно применять для получения продуктов для лечения пациентов. Например, были получены различные тканевые продукты для регенерации, восстановления, наращивания, укрепления и/или лечения тканей человека, которые были повреждены или утрачены вследствие различных заболеваний и/или структурного повреждения (например, от травмы, оперативного вмешательства, атрофии и/или длительного износа и дегенерации). Такие продукты могут включать, например, бесклеточные тканевые матрицы, тканевые аллотрансплантаты или ксенотрансплантаты и/или реконструированные ткани (т.е. по меньшей мере частично децеллюляризованные ткани, которые были засеяны клетками для получения жизнеспособных материалов).

[0018] Для хирургических применений часто необходимо получать тканевые продукты, которые имеют определенные механические свойства. Например, тканевой продукт, который может включать лист материала, должен обладать достаточной прочностью, чтобы выдерживать предполагаемое применение. Например, определенные тканевые продукты можно применять для восстановления дефектов (например, грыж), для поддержки окружающих тканей или имплантатов (например, для увеличения и/или реконструкции молочной железы) или для замещения поврежденной или утраченной ткани (например, после травмы или хирургического удаления). Независимо от конкретного применения тканевой продукт должен обладать достаточной прочностью, эластичностью и/или другими механическими свойствами, чтобы функционировать до тех пор, пока произойдет регенерация и/или восстановление ткани.

[0019] Кроме того, тканевые продукты должны иметь необходимое свойство на ощупь. Например, хирурги, как правило, предпочитают материалы, которые имеют естественное похожее на ткань свойство на ощупь (например, являются достаточно мягкими, пластичными и/или эластичными). Более того, для тканевых продуктов желательно, чтобы они после имплантации были более естественными на ощупь. Например, ткани, применяемые для увеличения молочной железы, не должны быть чрезмерно жесткими с тем, чтобы получить молочную железу, более естественную на ощупь.

[0020] Тем не менее некоторые тканевые продукты могут быть чрезмерно жесткими. Например, некоторые хирурги отмечают, что полученные из свиньи кожные материалы, такие как STRATTICE™, являются менее пластичными, чем полученные из человека кожные продукты, такие как ALLODERM®. Тем не менее способы улучшения свойства на ощупь таких продуктов не должны отрицательно влиять на биологические и/или механические свойства продуктов. В частности, обработка продуктов для улучшения свойства продуктов на ощупь не должна приводить к нежелательному снижению других механических свойств, таких как прочность на растяжение, и не должна изменять белковую матрицу таким образом, чтобы материал не поддерживал регенерацию и/или восстановление ткани.

[0021] Настоящее раскрытие предусматривает способы обработки тканей для улучшения свойства на ощупь тканевых продуктов, полученных из тканей. Настоящее раскрытие также предусматривает тканевые продукты, полученные с применением способов обработки. Кроме того, настоящее раскрытие предусматривает способы обработки тканей для контроля пористости тканевых продуктов, полученных из тканей. В некоторых случаях контроль пористости может улучшить клеточную инфильтрацию и регенерацию и/или восстановление ткани.

[0022] Соответственно, в одном варианте осуществления предусматривается способ обработки тканевой матрицы. Способ может включать выбор содержащей коллаген тканевой матрицы и приведение тканевой матрицы в контакт с протеолитическим ферментом при условиях, достаточных для получения необходимого уровня пластичности в тканевой матрице. В другом варианте осуществления предусматривается способ обработки тканевой матрицы. Способ может включать выбор содержащей коллаген бесклеточной тканевой матрицы и приведение тканевой матрицы в контакт с протеолитическим ферментом при условиях, достаточных для получения необходимого уровня пластичности в тканевой матрице и для повышения пористости тканевой матрицы. На Фиг.1А-1D показаны бесклеточные тканевые матрицы (STRATTICE™) после обработки ферментами с применением способов согласно настоящему раскрытию, а также необработанные контроли. Показано, что обработанные образцы являются значительно более пластичными.

[0023] В различных вариантах осуществления обработка тканевых матриц протеолитическими ферментами обеспечивает улучшенные механические свойства, не вызывая ухудшение одного или нескольких биологических свойств. Например, обработка тканевых матриц может давать необходимую жесткость, свойство на ощупь, тактильные свойства и/или необходимую пористость, не вызывая усиленное воспаление или образование рубца и/или не вызывая снижение способности тканевых матриц стимулировать прорастание клеток и регенерацию.

[0024] Ткани можно выбирать, чтобы придать ряд различных биологических и механических свойств. Например, бесклеточную тканевую матрицу или другой тканевой продукт можно выбрать для обеспечения прорастания и ремоделирования ткани, чтобы способствовать регенерации ткани, в норме обнаруживаемой в месте, куда имплантируют матрицу. Например, при имплантации на или в фасцию бесклеточная тканевая матрица может быть выбрана для обеспечения регенерации фасции без чрезмерного фиброза или образования рубца. В определенных вариантах осуществления тканевой продукт можно образовать из ALLODERM® или STRATTICE™, которые представляют собой бесклеточные матрицы на основе кожи человека и свиньи, соответственно. В качестве альтернативы можно применять другие подходящие бесклеточные тканевые матрицы, которые дополнительно описаны ниже. Ткани можно выбрать из ряда источников ткани, включающих кожу (дерму или цельную кожу), фасцию, перикардиальную ткань, твердую мозговую оболочку, ткань пупочного канатика, плацентарную ткань, ткань сердечного клапана, ткань связки, ткань сухожилия, артериальную ткань, венозную ткань, соединительную ткань нервной системы, ткань мочевого пузыря, ткань мочеточника и ткань кишечника. Способы, описанные в данном документе, можно применять для обработки любого типа коллагенсодержащей ткани и для любого продукта на основе тканевой матрицы. Например, ряд биологических каркасных материалов описаны Badylak и соавт., и способы согласно настоящему раскрытию можно применять для обработки таких или других тканевых продуктов, известных в уровне техники. Badylak et al., ʺExtracellular Matrix as a Biological Scaffold Material: Structure and Function,ʺ Acta Biomaterialia (2008), doi:10.1016/j.actbio.2008.09.013.

[0025] В некоторых случаях тканевая матрица может быть в виде децеллюляризованной тканевой матрицы. Подходящие бесклеточные тканевые матрицы дополнительно описаны ниже. В других случаях способ может дополнительно включать обработку интактной ткани для удаления клеток или других материалов. Ткани можно полностью или частично децеллюляризовать для получения бесклеточных тканевых матриц или тканевых материалов на основе внеклеточных структур, подлежащих применению у пациентов. Например, различные ткани, такие как ткань кожи, кишечника, кости, хряща, нерва (например, нервные волокна или твердая мозговая оболочка), сухожилия, связки или другие ткани можно полностью или частично децеллюляризовать для получения тканевых продуктов, применяемых у пациентов. В некоторых случаях эти децеллюляризованные продукты можно применять без добавления экзогенных клеточных материалов (например, стволовых клеток). В определенных случаях эти децеллюляризованные продукты можно засеять клетками из аутологичных источников или других источников для содействия лечению. Подходящие способы получения бесклеточных тканевых матриц описаны ниже.

[0026] Для обработки тканевых матриц может применяться ряд различных ферментов. Например, подходящие ферменты могут включать сульфгидрильные протеазы, такие как бромелаин. Кроме того, они могут включать бромелаин, папаин, фицин, актинидин или их комбинации. Ферменты можно приобрести коммерчески или экстрагировать из плодовых источников. Например, одним источником бромелаина является разрыхлитель мяса MCCORMICK MEAT TENDERIZER®, но ферменты можно также экстрагировать из ананаса и/или приобрести в составе для применения в медицине.

[0027] Ферменты можно приводить в контакт с тканями для повышения пластичности ткани, не вызывая нежелательное ухудшение других механических и/или биологических свойств. Например, когда партию материалов производят с ферментативными обработками, обсуждаемыми в данном документе, или без них, то ферментативные обработки не будут приводить к нежелательному изменению по меньшей мере одного из прочности на растяжение, прочности на разрыв, прочности при сшивании, сопротивления ползучести, чувствительности к коллагеназе, содержания глюкозаминогликана, содержания лектина, прочности на продавливание, температуры теплового перехода или их комбинации. В некоторых случаях нежелательное изменение представляет собой статистически значимое снижение любого одного из прочности на растяжение, прочности на разрыв, прочности при сшивании, сопротивления ползучести, содержания глюкозаминогликана, содержания лектина, прочности на продавливание; повышения чувствительности к коллагеназе или изменения (в сторону повышения или снижения) температуры теплового перехода (что измеряют с использованием дифференциальной сканирующей калориметрии).

[0028] Как отмечалось выше, в некоторых вариантах осуществления ткани обрабатывают ферментом для повышения пористости ткани. В различных вариантах осуществления повышение пористости ткани проводят с увеличением количества и/или размера каналов, что может улучшить скорость клеточной инфильтрации и регенерации ткани.

[0029] В некоторых случаях ферменты выбирают так, чтобы они вызывали сайт-специфическое расщепление белков в тканях. Например, было обнаружено, что обработка кожных материалов свиньи бромелаином не вызывает дополнительных изменений в структуре матрицы после определенного числа обработок. Следовательно, обработка дермы бромелаином не вызывает дополнительного изменения в матрице при продолжительном воздействии или после длительных периодов времени.

[0030] Кроме того, фермент можно применять к тканям в составе ряда подходящих растворов. Например, было обнаружено, что бромелаин является эффективным при применении к тканям в нормальном солевом растворе, но можно применять другие подходящие буферы (например, PBS).

Бесклеточные тканевые матрицы

[0031] Выражение ʺбесклеточная тканевая матрицаʺ, как используется в данном документе, относится, как правило, к любой тканевой матрице, которая, по сути, не содержит клеток и/или клеточных компонентов. Кожа, части кожи (например, дерма) и другие ткани, такие как кровеносные сосуды, сердечные клапаны, фасция, хрящ, кость и соединительная ткань нервной системы, можно применять для создания бесклеточных матриц в пределах объема настоящего раскрытия. Бесклеточные тканевые матрицы можно исследовать или оценить различными способами, чтобы определить, являются ли они, по сути, не содержащими клеток и/или клеточных компонентов. Например, обработанные ткани можно осмотреть с помощью световой микроскопии, чтобы определить, остались ли клетки (живые или мертвые) и/или клеточные компоненты. Кроме того, определенные анализы можно использовать для определения присутствия клеток или клеточных компонентов. Например, анализы ДНК или других нуклеиновых кислот можно использовать для подсчета оставшихся ядерных материалов в тканевых матрицах. Как правило, отсутствие оставшихся ДНК или других нуклеиновых кислот будет указывать на полную децеллюляризацию (т.е. удаление клеток и/или клеточных компонентов). В конечном счете, другие анализы, с помощью которых определяют специфические для клеток компоненты (например, поверхностные антигены), можно использовать, чтобы определить, являются ли тканевые матрицы бесклеточными. Кожа, части кожи (например, дерма) и другие ткани, такие как кровеносные сосуды, сердечные клапаны, фасция, хрящ, кость и соединительная ткань нервной системы, можно использовать для создания бесклеточных матриц в пределах объема настоящего раскрытия.

[0032] В целом, этапы, включенные в получение бесклеточной тканевой матрицы, включают забор ткани от донора (например, трупа человека или животного источника) и удаление клеток при условиях, которые сохраняют биологическую и структурную функцию. В определенных вариантах осуществления способ включает химическую обработку для стабилизации ткани и избежания биохимического и структурного разложения вместе с или перед удалением клеток. В различных вариантах осуществления стабилизирующий раствор подавляет и предотвращает осмотическое, гипоксическое, аутолитическое и протеолитическое разложение, защищает от микробного загрязнения и снижает механическое повреждение, которое может иметь место в тканях, которые содержат, например, гладкомышечные компоненты (например, кровеносные сосуды). Стабилизирующий раствор может содержать соответствующий буфер, один или несколько антиоксидантов, одно или несколько онкотических средств, один или несколько антибиотиков, один или несколько ингибиторов протеазы и/или один или несколько гладкомышечных релаксантов.

[0033] Ткань затем помещают в раствор для децеллюляризации, чтобы удалить жизнеспособные клетки (например, эпителиальные клетки, эндотелиальные клетки, гладкомышечные клетки и фибробласты) из структурной матрицы без повреждения биологической и структурной целостности коллагеновой матрицы. Раствор для децеллюляризации может содержать соответствующий буфер, соль, антибиотик, один или несколько детергентов (например, TRITON X-100™, дезоксихолат натрия, полиоксиэтилен(20)-сорбитанмоноолеат), одно или несколько средств для предотвращения сшивания, один или несколько ингибиторов протеазы и/или один или несколько ферментов. В некоторых вариантах осуществления раствор для децеллюляризации содержит 1% TRITON X-100™ в среде RPMI с гентамицином и 25 мМ EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота). В некоторых вариантах осуществления ткань инкубируют в растворе для децеллюляризации в течение ночи при 37°С с аккуратным встряхиванием при 90 об/мин. В определенных вариантах осуществления для удаления жира из образца ткани можно использовать дополнительные детергенты. Например, в некоторых вариантах осуществления 2% дезоксихолат натрия добавляют к раствору для децеллюляризации.

[0034] После процесса децеллюляризации образец ткани тщательно отмывают солевым раствором. В некоторых иллюстративных вариантах осуществления, например, когда применяют ксеногенный материал, децеллюляризованную ткань затем обрабатывают в течение ночи при комнатной температуре раствором дезоксирибонуклеазы (ДНКазы). В некоторых вариантах осуществления образец ткани обрабатывают раствором ДНКазы, приготовленном в буфере для ДНКазы (20 мМ HEPES (4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота), 20 мМ CaCl₂ и 20 мМ MgCl₂). Необязательно, раствор антибиотика (например, гентамицина) можно добавлять к раствору ДНКазы. Любой подходящий буфер можно использовать при условии, что буфер обеспечивает подходящую ДНКазную активность.

[0035] Хотя бесклеточную тканевую матрицу можно получить из одной или нескольких особей того же вида, что и реципиент трансплантата бесклеточной тканевой матрицы, это не является обязательным. Таким образом, например, бесклеточную тканевую матрицу можно получить из ткани свиньи и имплантировать пациенту-человеку. Виды, которые могут служить в качестве реципиентов бесклеточной тканевой матрицы и доноров тканей или органов для получения бесклеточной тканевой матрицы, включают без ограничения млекопитающих, таких как люди, любые приматы за исключением человека (например, обезьяны, бабуины или шимпанзе), свиньи, коровы, лошади, козы, овцы, собаки, кошки, кролики, морские свинки, песчанки, хомяки, крысы или мыши.

[0036] Ликвидация эпитопов α-gal в содержащем коллаген материале может снижать иммунную реакцию на содержащий коллаген материал. Эпитоп α-gal экспрессируется у не относящихся к приматам млекопитающих и у обезьян Нового Света (обезьян Южной Америки), а также на макромолекулах, таких как протеогликаны внеклеточных компонентов. U. Galili et al., J. Biol. Chem. 263: 17755 (1988). Однако этот эпитоп отсутствует у приматов Старого Света (обезьян Азии и Африки и человекообразных обезьян) и людей. Идиотипические антитела к gal вырабатываются у людей и приматов в результате иммунной реакции на эпитоп α-gal на углеводных структурах на бактериях желудочно-кишечного тракта. U. Galili et al., Infect. Immun. 56: 1730 (1988); R.M. Hamadeh et al., J. Clin. Invest. 89: 1223 (1992).

[0037] Поскольку не относящиеся к приматам млекопитающие (например, свиньи) вырабатывают эпитопы α-gal, то ксенотрансплантация содержащего коллаген материала из этих млекопитающих в приматов часто приводит к отторжению из-за связывания антител к Gal с этими эпитопами на содержащем коллаген материале. Связывание приводит к разрушению содержащего коллаген материала посредством реакции связывания комплемента и посредством антителозависимой клеточной цитотоксичности. U. Galili et al., Immunology Today 14: 480 (1993); M. Sandrin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11391 (1993); H. Good et al., Transplant. Proc. 24: 559 (1992); В.H. Collins et al., J. Immunol. 154: 5500 (1995). Более того, ксенотрансплантация приводит к значительной активации иммунной системы с выработкой повышенных количеств высокоаффинных антител к gal. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления, когда в качестве источника ткани используются животные, у которых вырабатываются эпитопы α-gal , устойчивую ликвидацию эпитопов α-gal из клеток и из внеклеточных компонентов содержащего коллаген материала и предотвращение повторной экспрессии клеточных эпитопов α-gal может ослабить иммунную реакцию на содержащий коллаген материал, связанную со связыванием антитела к gal с эпитопами α-gal.

[0038] Для удаления эпитопов α-gal после тщательной отмывки ткани солевым раствором для удаления раствора ДНКазы образец ткани можно подвергать одной или нескольким ферментативным обработкам для удаления определенных иммуногенных антигенов, если они присутствуют в образце. В некоторых вариантах осуществления образец ткани можно обработать ферментом α-галактозидазой для ликвидации эпитопов α-gal, если они присутствуют в ткани. В некоторых вариантах осуществления образец ткани обрабатывают α-галактозидазой в концентрации 300 Ед/л, приготовленной в 100 мМ фосфатном буфере при рН 6,0. В других вариантах осуществления концентрацию α-галактозидазы повышают до 400 Ед/л для надлежащего удаления эпитопов α-gal из забранной ткани. Любую подходящую концентрацию фермента и буфер можно применять при условии, что достигается достаточное удаление антигенов.

[0039] В качестве альтернативы, вместо того чтобы обрабатывать ткань ферментами, в качестве источника ткани можно выбрать животных, которые были генетически модифицированы так, что у них отсутствует один или несколько антигенных эпитопов. Например, в качестве источника ткани можно выбрать животных (например, свиньи), которые были генетически модифицированы так, что у них отсутствует концевой α-галактозный фрагмент. Для описания соответствующих животных смотрите находящуюся одновременно на рассмотрении заявку на патент США с серийным номером 10/896594 и патент США №6166288, раскрытия которых включены в настоящий документ посредством ссылки в своей полноте. Кроме того, определенные иллюстративные способы обработки тканей для получения бесклеточных матриц со сниженными количествами альфа-1,3-галактозных фрагментов или без таковых или с отсутствием таковых описаны в Xu, Hui. et al., ʺA Porcine-Derived Acellular Dermal Scaffold that Supports Soft Tissue Regeneration: Removal of Terminal Galactose-α-(1,3)-Galactose and Retention of Matrix Structure,ʺ Tissue Engineering, Vol.15, 1-13 (2009), включенной в данный документ с помощью ссылки в своей полноте.

[0040] После образования бесклеточной тканевой матрицы гистосовместимые жизнеспособные клетки можно необязательно высевать в бесклеточную тканевую матрицу с получением трансплантата, который может дополнительно ремоделироваться хозяином. В некоторых вариантах осуществления гистосовместимые жизнеспособные клетки можно добавлять к матрицам с помощью стандартных методик совместного культивирования клеток in vitro перед трансплантацией или с помощью повторного заселения клетками in vivo после трансплантации. Повторное заселение клетками in vivo можно осуществлять с использованием собственных клеток реципиента, мигрирующих в бесклеточную тканевую матрицу, или путем инфузии или инъекции клеток, полученных от реципиента, или гистосовместимых клеток от другого донора в бесклеточную тканевую матрицу in situ. Можно применять различные типы клеток, в том числе эмбриональные стволовые клетки, взрослые стволовые клетки (например, мезенхимальные стволовые клетки) и/или нервные клетки. В различных вариантах осуществления клетки можно наносить прямо на внутреннюю часть бесклеточной тканевой матрицы непосредственно до или после имплантации. В определенных вариантах осуществления клетки можно помещать в бесклеточную тканевую матрицу, подлежащую имплантации, и культивировать перед имплантацией.

Пример

[0041] Следующий пример иллюстрирует способ обработки бесклеточных тканевых матриц на основе кожи свиньи бромелаином для повышения пластичности материала. Как обсуждается ниже, обработка не вызывала нежелательного изменения различных механических свойств. Кроме того, обработка повышала пористость материала, что может улучшать скорость клеточной инфильтрации и регенерации ткани.

[0042] В данном эксперименте использовали бесклеточные тканевые матрицы STRATTICE™, которые были получены от LIFECELL CORPORATION (Бранчбург, Нью-Джерси). STRATTICE™ доступна в пластичной форме и более жестком варианте в зависимости от анатомического местоположения, из которого был получен материал. Оба типа использовали в данном эксперименте. Образцы, используемые в исследовании, разрезали на четыре части и обрабатывали три части. Необработанные образцы (1 четвертая часть) использовали в качестве контролей; контроли охлаждали в ходе обработки. STRATTICE™ упакован в растворе, и, следовательно, он не нуждается в регидратации. Обработанные образцы помещали в 0,5 литра холодной водопроводной воды, содержащей 55 г разрыхлителя мяса MCCORMICK MEAT TENDERIZER.

[0043] На Фиг.1А-1D показаны бесклеточные тканевые матрицы после обработки ферментами с использованием способов согласно настоящему раскрытию, а также необработанные контроли. Фигуры 2-6 представляют собой ящичковые диаграммы показателей прочности на растяжение, прочности при сшивании, прочности на разрыв, разложения эластазой и сопротивления ползучести для каждого из обработанных и контрольных образцов. Обработанные образцы имели заметно повышенную пластичность по сравнению с контролями, но не характеризовались значительным снижением других механических свойств. Кроме того, не обнаружено значительного изменения в температуре теплового перехода или чувствительности к коллагеназе. По всем результатам парный Т-критерий показывал отсутствие статистически значимого различия между группами контроля и обработки.

Claims

1. Способ обработки тканевой матрицы, включающий:

выбор содержащей коллаген кожной тканевой матрицы,

удаление всех клеток и клеточных компонентов из кожной тканевой матрицы и

последующее приведение кожной тканевой матрицы в контакт с протеолитическим ферментом при условиях, достаточных для получения необходимого повышения пластичности в кожной тканевой матрице.

2. Способ по п. 1, где фермент представляет собой бромелаин.

3. Способ по п. 1, где фермент выбирают из бромелаина, папаина, фицина, актинидина или их комбинаций.

4. Способ по п. 1, где тканевую матрицу приводят в контакт с протеолитическим ферментом при условиях, которые не приводят к нежелательному изменению по меньшей мере одного из прочности на растяжение, прочности на разрыв, прочности при сшивании, сопротивления ползучести, прочности на продавливание, температуры теплового перехода или их комбинаций.

5. Способ по п. 1, где кожную тканевую матрицу приводят в контакт с протеолитическим ферментом при условиях, которые повышают пористость кожной тканевой матрицы.

6. Способ по п. 1, где кожную тканевую матрицу приводят в контакт с протеолитическим ферментом при условиях, которые не вызывают статистически значимого снижения прочности на растяжение, прочности на разрыв, прочности при сшивании, сопротивления ползучести, температуры теплового перехода или их комбинаций.

7. Способ обработки тканевой матрицы, включающий:

выбор содержащей коллаген бесклеточной кожной тканевой матрицы;

приведение бесклеточной кожной тканевой матрицы в контакт с протеолитическим ферментом при условиях, достаточных для получения необходимого повышения пластичности в бесклеточной кожной тканевой матрице и для повышения пористости бесклеточной кожной тканевой матрицы.

8. Способ по п. 7, где фермент представляет собой бромелаин.

9. Способ по п. 7, где фермент выбирают из бромелаина, папаина, фицина, актинидина или их комбинаций.

10. Способ по п. 7, где бесклеточную кожную тканевую матрицу приводят в контакт с протеолитическим ферментом при условиях, которые не приводят к нежелательному изменению по меньшей мере одного из прочности на растяжение, прочности на разрыв, прочности при сшивании, сопротивления ползучести, прочности на продавливание, температуры теплового перехода или их комбинаций.

11. Способ по п. 7, где бесклеточную кожную тканевую матрицу приводят в контакт с протеолитическим ферментом при условиях, которые не вызывают статистически достоверного снижения прочности на растяжение, прочности на разрыв, прочности при сшивании, сопротивления ползучести, температуры теплового перехода или их комбинаций.

12. Бесклеточная тканевая матрица, полученная с помощью обработки, включающей:

выбор бесклеточной кожной тканевой матрицы и

приведение бесклеточной кожной тканевой матрицы в контакт с протеолитическим ферментом при условиях, достаточных для получения необходимого повышения пластичности в бесклеточной кожной тканевой матрице.

13. Бесклеточная тканевая матрица по п. 12, где фермент представляет собой бромелаин.

14. Бесклеточная тканевая матрица по п. 12, где фермент выбран из бромелаина, папаина, фицина, актинидина или их комбинаций.

15. Бесклеточная тканевая матрица по п. 12, где бесклеточная кожная тканевая матрица приводится в контакт с протеолитическим ферментом при условиях, которые не приводят к нежелательному изменению по меньшей мере одного из прочности на растяжение, прочности на разрыв, прочности при сшивании, сопротивления ползучести, прочности на продавливание, температуры теплового перехода или их комбинаций.

16. Бесклеточная тканевая матрица по п. 12, где бесклеточную кожную тканевую матрицу приводят в контакт с протеолитическим ферментом при условиях, которые не вызывают статистически достоверного снижения прочности на растяжение, прочности на разрыв, прочности при сшивании, сопротивления ползучести, температуры теплового перехода или их комбинаций.

17. Бесклеточная тканевая матрица по п. 12, где бесклеточная кожная тканевая матрица приводится в контакт с протеолитическим ферментом при условиях, которые повышают пористость кожной тканевой матрицы.

18. Способ по п. 1, где кожная тканевая матрица по существу состоит из дермы.

19. Способ по п. 7, где кожная тканевая матрица по существу состоит из дермы.

20. Бесклеточная тканевая матрица по п. 12, где кожная тканевая матрица по существу состоит из дермы.