RU2507266C2 - НЕТРАНСКРИБИРУЕМЫЙ ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР pBL-T ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ СЛОЖНЫХ ГЕНОМНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ И МНОГОМОДУЛЬНОЙ СБОРКИ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ КОНСТРУКЦИЙ (ВАРИАНТЫ), И НАБОР, СОДЕРЖАЩИЙ УКАЗАННЫЙ ВЕКТОР - Google Patents
НЕТРАНСКРИБИРУЕМЫЙ ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР pBL-T ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ СЛОЖНЫХ ГЕНОМНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ И МНОГОМОДУЛЬНОЙ СБОРКИ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ КОНСТРУКЦИЙ (ВАРИАНТЫ), И НАБОР, СОДЕРЖАЩИЙ УКАЗАННЫЙ ВЕКТОР Download PDFInfo
- Publication number
- RU2507266C2 RU2507266C2 RU2011146242/10A RU2011146242A RU2507266C2 RU 2507266 C2 RU2507266 C2 RU 2507266C2 RU 2011146242/10 A RU2011146242/10 A RU 2011146242/10A RU 2011146242 A RU2011146242 A RU 2011146242A RU 2507266 C2 RU2507266 C2 RU 2507266C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- vector
- cloning
- pbl
- dna
- plasmid
- Prior art date
Links
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 112
- 238000010367 cloning Methods 0.000 title claims abstract description 57
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims abstract description 23
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 13
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 11
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 9
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 40
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 21
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 16
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 claims description 12
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 claims description 12
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims description 8
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims description 8
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 6
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 claims description 4
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 claims description 4
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 claims description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 3
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 claims description 2
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 claims description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 2
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 claims description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 claims 1
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 claims 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 abstract description 54
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 abstract description 3
- 101000909800 Xenopus laevis Probable N-acetyltransferase camello Proteins 0.000 abstract 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 66
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 50
- 239000000047 product Substances 0.000 description 29
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 14
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 14
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 13
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 10
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 10
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 8
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 6
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- XKKCQTLDIPIRQD-JGVFFNPUSA-N 1-[(2r,5s)-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical group O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)CC1 XKKCQTLDIPIRQD-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 4
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 4
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 4
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 3
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 108010077524 Peptide Elongation Factor 1 Proteins 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102100037116 Transcription elongation factor 1 homolog Human genes 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C(Cl)=C12 OPIFSICVWOWJMJ-AEOCFKNESA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 241000702371 Enterobacteria phage f1 Species 0.000 description 2
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108091081548 Palindromic sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 2
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 2
- 108010011035 endodeoxyribonuclease DpnI Proteins 0.000 description 2
- 108010035814 endodeoxyribonuclease XcmI Proteins 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 101100287651 Caenorhabditis elegans kbp-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- 101000966481 Mus musculus Dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 101100301239 Myxococcus xanthus recA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 108010002747 Pfu DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 206010035500 Plasmodium falciparum infection Diseases 0.000 description 1
- 241001262641 Plasmodium yoelii yoelii Species 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 244000292604 Salvia columbariae Species 0.000 description 1
- 235000012377 Salvia columbariae var. columbariae Nutrition 0.000 description 1
- 235000001498 Salvia hispanica Nutrition 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 241001648319 Toronia toru Species 0.000 description 1
- 108010064978 Type II Site-Specific Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical group C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000003149 assay kit Methods 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 235000014167 chia Nutrition 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- OFEZSBMBBKLLBJ-BAJZRUMYSA-N cordycepin Chemical group C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)C[C@H]1O OFEZSBMBBKLLBJ-BAJZRUMYSA-N 0.000 description 1
- 239000012045 crude solution Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L dipotassium hydrogen phosphate Chemical compound [K+].[K+].OP([O-])([O-])=O ZPWVASYFFYYZEW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000396 dipotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019797 dipotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 101150023497 mcrA gene Proteins 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150012154 nupG gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Нетранскрибируемый плазмидный вектор состоит из гена маркера селекции с промотором и терминатором, области инициации репликации и полилинкера, содержащего 15 или более уникальных гексануклеотидных сайтов расщепления эндонуклеазами рестрикции, 3 или более октануклеотидных сайтов расщепления эндонуклеазами рестрикции и два сайта узнавания Xcml, расположенные в центре области полилинкера в противоположной ориентации и образующие при расщеплении указанной рестриктазой непарные выступающие одиночные остатки дезокситимидина на 3′-концах цепей ДНК. Предложена также линеаризованная форма нетранскрибируемого вектора. Предложен также набор, содержащий нетранскрибируемый плазмидный вектор или нетранскрибируемый линейный вектор, лигазу и инструкцию по применению набора. Изобретение позволяет получить векторы, обеспечивающие возможность прямого клонирования ПЦР-продуктов, клонирования GC- AT-богатых последовательностей, модульной сборки генетических конструкций. 3 н. и 6 з.п. ф-лы, 6 ил., 4 табл., 10 пр.
Description
Область техники
Изобретение относится к области биотехнологии и генной инженерии, а именно к технологии молекулярного клонирования фрагментов ДНК, точнее к методам получения транскрипционно неактивных плазмидных векторов и их производных.
Предшествующий уровень техники
Впервые гибридная (вариант - рекомбинантная) ДНК была получена в 1972 году [Jackson, D.A., R.H. Symons, et al. (1972). "Biochemical method for inserting new genetic information into DNA of Simian Virus 40: circular SV40 DNA molecules containing lambda phage genes and the galactose operon of Escherichia coli." Proc Natl Acad Sci USA 69(10):2904-2909.], векторные плазмиды с селективным маркером (геном устойчивости к антибиотику) применены в 1973 [Cohen, S. N. and А. С.Chang (1973). "Recircularization and autonomous replication of a sheared R-factor DNA segment in Escherichia coli transformants." Proc Natl Acad Sci USA 70(5):1293-1297; Cohen, S. N., A.C. Chang, et al. (1973). "Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro." Proc Natl Acad Sci USA 70(11):3240-3244].
Первый многофункциональный вектор, несущий гены устойчивости к ампициллину и тетрациклину, область инициации репликации, (ориджин) и генетический элемент ограничения копийности (ROP) получен в 1977 [Bolivar, F., R.L. Rodriguez, et al. (1977). "Construction and characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose cloning system." Gene 2(2):95-113].
Векторные системы на основе бактериофага М13 и плазмиды pBR322 (система pUC18/19) [Messing, J., В. Gronenbom, et al. (1977). "Filamentous coliphage М13 as a cloning vehicle: insertion of a HindII fragment of the lac regulatory region in М13 replicative form in vitro." Proc Natl Acad Sci USA 74(9):3642-3646.; Norrander, J., T. Kempe, et al. (1983). "Construction of improved М13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis." Gene 26(1):101-106.; Yanisch-Perron, С., J. Vieira, et al. (1985). "Improved М13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors." Gene 33(1):103-119.] получили широкое распространение с начала 80-х гг. Свойства плазмидных и линейных фаговых векторов сочетают гибридные конструкции - фагмиды, содержащие, кроме плазмидных последовательностей, межгенный участок одноцепочечного нитевидного фага f1, ответственный за репликацию фага. Среди них pD4 [Dotto GP, Horiuchi K, Replication of a plasmid containing two origins of bacteriophage f1, Journal of Molecular Biology, Volume 153, Issue 1, 25 November 1981, Pages 169-176], pEMBL [L Dente, G Cesareni, and R Cortese. pEMBL: a new family of single stranded plasmids. Nucleic Acids Res. 1983 March 25; 11(6):1645-1655], pKUN9, pKUN19 [Peeters BP, Schoenmakers JG, Konings RN. Plasmid pKUN9, a versatile vector for the selective packaging of both DNA strands into single-stranded DNA-containing phage-like particles. Gene. 1986; 41(1):39-46]. Наибольшее распространение получили серия фагмидных векторов pGEM-Zf ("Promega") и серия векторов pBluescript ("Stratagene"), характеризующиеся стандартными чертами фагмидных векторов, отличающиеся организацией полилинкера и генами устойчивости к антибиотикам. Общим ограничением использования векторов на основе плазмид, бактериофага М13 и фагмид является их емкость - предельный размер клонируемой вставки, поэтому для клонирования крупных (свыше 20 т.п.н.) фрагментов ДНК используются другие системы. Однако клонирование столь протяженных фрагментов ДНК требуется для решения узкой задачи - создания геномных библиотек, в остальных приложениях (работы с библиотеками кДНК, создания конструкций для экспрессии чужеродных генов и т.д.) преимущественно работа ведется с фрагментами ДНК, не превышающими 15 т.п.н.
Высококопийные векторы небольшого размера часто используются для прямого клонирования продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР) для целей последующего секвенирования. Большинство современных систем быстрого клонирования продуктов полимеразной цепной реакции основаны на лигировании ПНР-продуктов с выступающим непарным 3' дезоксиаденозиновым остатком, образующимся у большинства молекул ДНК в ходе ПЦР, и линеаризованного вектора с непарными выступающими нуклеотидными остатками 3'Т, реже 3'U и 3'I. Примерами таких систем являются pCR2001, pCR.II, рТОРО ТА (Invitrogen, США); pKRX (ATCC, США); pSC-A (Stratagene, США); рТА12 (Invitrogen, США), pGEM-T (Promega, США), pT7Blue (Novagen, США). Наибольшее распространение получили системы pGEM-T и pGEM-T Easy (Promega, США), в России также доступен функциональный аналог pGEM-T Easy - PAL-TA (Евроген, Россия).
Перечисленные векторы, являясь производными векторов PUC18/19 и фагмид семейства pGEM, обладают следующими особенностями: содержат системы транскрипции селективного маркера LacZ для проведения бело-голубого скрининга, а также в ряде случаев регуляторные последовательности бактериофагов для получения одноцепочечной ДНК и/или регуляторные последовательности для бесклеточной транскрипции и трансляции. Эти особенности, удобные для большинства приложений, ограничивают их применение для клонирования "сложных" последовательностей ДНК.
Так, стандартные векторы принципиально не подходят для клонирования некоторых участков геномной ДНК высших эукариот. В частности, проблемными для клонирования в традиционных системах являются последовательности со сложной структурой - содержащие протяженные GC или AT тракты, повторяющиеся или палиндромные последовательности, а также последовательности с выраженными функциональными особенностями - регуляторные участки и токсичные для Е.coli открытые рамки считывания (ОРС) белков.
Наличие негативной селекции сложных последовательностей иллюстрируется проблемами при клонировании библиотек ДНК некоторых патогенов с высоким содержанием AT [Gardner, M.J. (2001). "A status report on the sequencing and annotation of the P.falciparum genome." Mol Biochem Parasitol 118(2):133-138; Gardner, M.J., N. Hall, et al. (2002). "Genome sequence of the human malaria parasite Plasmodium falciparum" Nature 419(6906):498-511; Rocha, Е. P. and A. Danchin (2002). "Base composition bias might result from competition for metabolic resources." Trends Genet 18(6):291-294; Vaughan, A., S. Y. Chiu, et al. (2008). "Assessment and improvement of the Plasmodium yoelii yoelii genome annotation through comparative analysis." Bioinformatics 24(13):i383-389] и выбыванием значительного количества (1600 ОРС) длинных и содержащих много повторов ОРС из масштабного протеомного исследования библиотеки MGS (Mammalian Gene Collection NIH) [Temple, G., D. S. Gerhard, et al. (2009). "The completion of the Mammalian Gene Collection (MGC)." Genome Res 19(12):2324-2333]. При применении типичных векторных систем для клонирования описана негативная селекция против ОРС, а также регуляторных элементов [Adhya, S. and M. Gottesman (1982). "Promoter occlusion: transcription through a promoter may inhibit its activity." Cell 29(3):939-944], повторов [Bowater, R.P. and R.D. Wells (2001). "The intrinsically unstable life of DNA triplet repeats associated with human hereditary disorders." Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 66:159-202], поли-Т трактов [Kiyama, R. and M. Oishi (1994). "Instability of plasmid DNA maintenance caused by transcription of poly(dT)-containing sequences in Escherichia coli." Gene 150(1):57-61.], показано, что активные промоторные последовательности во вставке могут запускать транскрипцию структурных областей вектора и интерферировать как с репликацией плазмиды [Stueber, D. and H. Bujard (1982). "Transcription from efficient promoters can interfere with plasmid replication and diminish expression of plasmid specified genes." EMBO J 1(11):1399-1404], так и с экспрессией селективного маркера [Adhya, S. and M. Gottesman (1982). "Promoter occlusion: transcription through a promoter may inhibit its activity." Cell 29(3):939-944].
Распространенная система селекции трансформантов по нарушению рамки считывания гена LacZ, известная как "бело-голубой скрининг" [Gronenbom, В. and J. Messing (1978). "Methylation of single-stranded DNA in vitro introduces new restriction endonuclease cleavage sites." Nature 272(5651):375-377], обладает рядом неустранимых недостатков, среди которых:
1. высокая частота ложнопозитивных клонов с нарушением рамки считывания гена LacZ вследствие спонтанных точечных мутаций,
2. высокая стоимость и нестабильность субстрата (X-Gal),
3. избирательность ориентации (не выживают трансформанты с токсичным продуктом экспрессии клонируемой последовательности, направленным по ходу гена LacZ, т.е. при клонировании ПЦР-продуктов вероятность получения позитивного клона снижается вдвое).
Наличие системы бело-голубого скрининга вызывает высокий уровень транскрипции/трансляции области вставки, что ведет к отрицательной селекции вставок с ОРС, транскрибирующиеся вставки с тандемными тринуклеотидными повторами и полиТ-тракты также подвергаются отрицательной селекции. Для того чтобы уйти от недостатков системы бело-голубой селекции при клонировании «сложных» последовательностей, разработан ряд «transcription free» систем, лишенных транскрипции (LacZ, Т7), что увеличивает стабильность вставки. Например, коммерчески доступные вектора pSMART (Lucigen Corporation, США, US7723103) и pSPARK (Canvax Biotech, Испания).
Распространенные векторные системы для прямого клонирования ПЦР-продуктов, такие как pCR2001, pCR.II, рТОРО ТА (Invitrogen, Carlsbad, Calif.); pKRX (ATCC, Rockville, Md.); pSC-A (Stratagene, La Jolla, Calif.); pTA12 vector (Invitrogen), pGEM-T (Promega, Madison, Wis.), pT7Blue (Novagen, Madison, Wis.) не применимы для клонирования «сложных» и токсичных последовательностей и модульной сборки генетических конструкций.
Ближайшие аналоги настоящего изобретения - «нетранскрибируемые» векторы pSMART (Lucigen Corporation, США) и pSPARK (Canvax Biotech, Испания) имеют ряд существенных недостатков. Так, векторы семейства pSMART содержат выступающие 3'G нуклеотиды, что делает невозможным прямое клонирование продуктов ПЦР. При использовании этих векторов необходимо проводить ПЦР при помощи специальных дорогостоящих и низкопроцессивных полимераз с корректирующей активностью, а затем проводить стадию нематричного присоединения 3' нуклеотида («тейлинга») с добавлением стандартной полимеразы и избытка dCTP.
Другой важный недостаток векторов pSMART и pSPARK - малый размер и неудачный дизайн полилинкера (MCS, multiple cloning site), что делает практически невозможной сборку модульных генетических конструкций (длинных ОРС, ОРС гибридных белков, кассет с регуляторными элементами). MCS существующих "нетранскрибируемых" векторов и большинства стандартных векторов содержат не более 15 сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции II типа, преимущественно узнающих гексануклеотидные палиндромные последовательности.
Необходимым условием для возможности использования в молекулярном клонировании закодированных в MCS сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции является их уникальность, т.е. эти сайты не должны встречаться в остальной последовательности вектора, а также (при сборке модульных конструкций) в последовательности вставки (модуля). Чем больше длина соединяемых модулей ДНК, тем выше вероятность того, что в последовательности будет содержаться палиндром, узнающийся эндонуклеазой рестрикции. Так, при случайном распределении сайтов определенный тетрануклеотид будет встречаться 1 раз на каждые 44 (256) нуклеотидов, гексануклеотид - 1 раз на 46 нуклеотидов (4096), октануклеотид - 1 раз на 48 (114688). Таким образом, наличие нескольких октануклеотидных сайтов в MCS вектора позволяет практически гарантировать возможность сборки модульной конструкции по уникальным сайтам узнавания рестриктаз.
В полилинкерах вышеперечисленных векторов октануклеотидные сайты узнавания либо вовсе не представлены, либо представлено не более двух октануклеотидных сайтов (pGEM - NotI, SbfI; pSMART - SwaI, pSPARK - PmeI, NotI, причем содержащиеся в MCS transcription-free векторов сайты эндонуклеаз, расщепляющих ДНК с образованием «тупых» концов, SwaI и PmeI, неудобны для клонирования).
Для сборки модульных конструкций описан ряд специализированных систем, требующих либо проведения мультиплексного дотирования (Interxon Corporation, US 20090226976 A1, US 20090170727 A1), либо последовательной сборки без возможности извлечения модуля и инсерции дополнительного модуля между ранее вставленными (US 20090123973 A1), либо система в целом предназначена для решения узкой задачи и требует последовательного применения нескольких векторов (например, трансфер-векторы и вектор для экспрессии антител US 20050176099 A1, Schering Corporation).
Для быстрого клонирования продуктов полимеразной цепной реакции за счет выступающих на 5' концах амплифицированных фрагментов ДНК дезоксиаденозиновых остатков широко применяются так называемые Т-векторы - линеаризованные плазмидные векторы с выступающими 3' дезокситимидиновыми остатками [Zhou MY, Gomez-Sanchez CE. Universal ТА cloning. Curr Issues Mol Biol. 2000; Jan; 2(1):1-7. Review. PubMed PMID: 11464915]. Существует два метода их получения: 1). первый основан на расщеплении эндонуклеазой рестрикции с образованием ровных («тупых») концов с последующим присоединением 3'Т при помощи ДНК полимеразы [Holton ТА, Graham MW. A simple and efficient method for direct cloning of PCR products using ddT-tailed vectors. Nucleic Acids Res. 1991 Mar 11; 19(5):1156; Marchuk D, Drumm M, Saulino A, Collins FS. Construction of T-vectors, a rapid and general system for direct cloning of unmodified PCR products. Nucleic Acids Res. 1991 Mar 11; 19(5):1154; Papp T, Kirchner S, Diener U, Jafari M, Golka A, Schiffman D. Cloning of PCR fragments with a modified M13mp18 T-vector. Trends Genet. 1995 May; 11(5):169), 2). Второй метод основан на обработке плазмидного вектора ступенчато щепящей эндонуклеазой с образованием 3'Т концов, например, описано использование ферментов XcmI [Cha J, Bishai W, Chandrasegaran S. New vectors for direct cloning of PCR products. Gene. 1993 Dec 22; 136(1-2):369-70; Kwak JH, Kim MY. Construction of T-vector for direct cloning and expression of cloned genes in Escherichia coli. Anal Biochem. 1995 Jun 10; 228(1):178-80; Borovkov AY, Rivkin MI. XcmI-containing vector for direct cloning of PCR products. Biotechniques. 1997 May; 22(5):812-4; de Vries E. pUCPCR1. A vector for direct cloning of PCR products in a double XcmI restriction site offering compatible single 3'-overhanging T residues. Mol Biotechnol. 1998 Dec; 10(3):273-4], а также ферментов AspEI/Eam1105I/AhdI [Ichihara Y, Kurosawa Y. Construction of new T vectors for direct cloning of PCR products. Gene. 1993 Aug 16; 130(1):153-4; Ido E, Hayami M. Construction of T-tailed vectors derived from a pUC plasmid: a rapid system for direct cloning of unmodified PCR products. Biosci Biotechnol Biochem. 1997 Oct; 61(10):1766-7; Jeung JU, Cho SK, Shim KS, Ok SH, Lim DS, Shin JS. Construction of two pGEM-7Zf(+) phagemid T-tail vectors using AhdI-restriction endonuclease sites for direct cloning of PCR products. Plasmid. 2002 Sep; 48(2):160-3].
Технической задачей, решаемой авторами настоящего изобретения, являлась разработка эффективных «нетранскрибируемых» векторов, обеспечивающих возможность:
1. прямого клонирования ПЦР-продуктов;
2. клонирования «сложных» GC- AT- богатых последовательностей (часто встречающихся в геномах патогенных микроорганизмов или в регуляторных областях генома эукариот), а также токсичных для бактерий открытых рамок считывания полипептидов;
3. модульной сборки генетических конструкций (в частности, сборки кассет для экспрессии эукариотических генов, сборки ДНК-конструкций для генной терапии).
Технический результат достигался созданием нетранскрибируемого линейного вектора малого размера (т.е. менее 4 т.п.о.), содержащего ген маркера селекции с промотором и терминатором, область инициации репликации, полилинкер, содержащий 15 или более уникальных гексануклеотидных сайтов расщепления эндонуклеазами рестрикции, 3 или более октануклеотидных сайтов и непарные выступающие одиночные остатки дезокситимидина на 3'-концах цепей ДНК для клонирования продуктов ПЦР.
Термин «линейный Т-вектор» означает линеаризованную плазмидную ДНК с выступающими 3' дезокситимидиновыми остатками, образующую после лигирования вставки кольцевую плазмиду, содержащую все необходимые генетические элементы для репликации в бактериальной клетке и экспрессии гена селективного маркера, например, такие, как ориджин репликации и ген устойчивости к антибиотику с промотором, соответственно, а также протяженный полилинкер, содержащий уникальные сайты узнавания эндонуклеазами рестрикции, при этом указанный полилинкер содержит сайты узнавания октануклеотидных эндонуклеаз рестрикции, расщепляющих ДНК с образованием «липких» концов.
Конкретными примерами генетических элементов, необходимых для репликации в бактериальной клетке согласно настоящему изобретению, являются ориджины репликации высококойпийных плазмид pUC, pBR и подобные им. Использование ориджина pUC является наиболее предпочтительным.
Конкретными примерами генетических элементов, необходимых для экспрессии гена селективного маркера согласно настоящему изобретению, являются ген бета-лактамазы (amp), обеспечивающий усточивость к ампилиллину, ген хлорамфениколацетилтрансферазы (cat), обеспечивающий усточивость к хлорамфениколу, гены монооксигеназ (tet), обеспечивающие усточивость к тетрациклину, ген неомицинфосфотрансферазы II (kan), обеспечивающий усточивость к канамицину, но не ограничиваются ими.
Конкретными примерами гексануклеотидных эндонуклеаз рестрикции, сайты узнавания которых присутствуют в полилинкере, являются XhoI, PstI, EcoRI, NcoI, SacI, BspEI, SalI, AatII, NdeI, XbaI, XmaI, PvuI, PsiI, BamHI, NheI, но не ограничиваются ими. Конкретными примерами октануклеотидных эндонуклеаз рестрикции, сайты узнавания которых присутствуют в полилинкере, являются AbsI, AscI и NotI, но не ограничиваются ими.
Предпочтительным вариантом реализации настоящего изобретения является Т-вектор pBL-T, представляющей собой линеаризованную плазмиду, размером 2032 п.о. с выступающими 3' дезокситимидиновыми остатками, который соедржит фрагмент длиной 100 п.о., представляющий собой протяженный полилинкер, фрагмент плазмиды pUC18 (+) длиной 1932 п.о., содержащийо область инициации репликации плазмиды, и ген бета-лактамазы с промотором и терминатором. Схема вектора с указанием координат функциональных элементов представлена на Фиг.2.
Полная нуклеотидная последовательность линейного Т-вектора (pBL-T) представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1.
Вектор может быть получен с использованием стандартных методов генной инженерии, плазмиды pUC18 (ЕР 0316378) и химически синтезированных олигонуклеотидов [Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular Cloning. 2nd ed. New York, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 1989]. Например, линейный Т-вектор может быть получен методом ПЦР, а также рестрикцией плазмиды-предшественника, несущей кассету, состоящую из тандема расположенных на обеих комплементарных цепях ДНК сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции, расщепляющих ДНК с образованием неспаренных 3' дезокситимидиновых нуклеотидов. Согласно данному изобретению конкретным примером такой эндонуклеазы является, но не ограничивается им, эндонуклеаза XcmI. Схема получения линейного Т-вектора (pBL-T) согласно настоящему изобретению представлена на Фиг.1. Схема соответствующей кольцевой плазмиды-предшественника pBL-1 представлена на Фиг.5. Полная нуклеотидная последовательность плазмиды предшественника (pBL-1), содержащей два сайта узнавания XcmI, расположенные в центре области полилинкера в противоположной ориентации и образующие при расщеплении указанной рестриктазой непарные выступающие одиночные остатки дезокситимидина на 3'-концах цепей ДНК, представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2.
Разработанное семейство векторов pBL-T сочетает полезные свойства «нетранскрибируемых» векторов для клонирования сложных GC- и AT- богатых последовательностей, позволяет вести прямое клонирование ПЦР продуктов и обладает удобным протяженным полилинкером для обеспечения удобства сборки модульных конструкций. Векторы pBL могут применяться для рутинного клонирования при отсутствии необходимости в проведении бело-голубого скрининга в виду очень высокой эффективности клонирования.
Данный Т-вектор пригоден для лигирования с ПЦР-продуктами, полученными с помощью методов, хорошо известных специалисту в данной области техники с использованием термостабильной ДНК-полимеразы Taq или смесей полимераз, в состав которых входит ДНК-полимераза Taq.
Лигирование вставки и Т-вектора проводят широко известными методами, например, с использованием фермента ДНК-лигазы фага Т4. Полученной смесью продуктов лигирования можно трансформировать бактериальную клетку, предпочтительно бактерию, принадлежащей к роду Escherichia, восприимчивую к подобной трансформации указанной плазмидой. Выбор конкретной клетки не является критическим, поскольку методология и приемы трансформации хорошо известны специалисту в данной области техники.
Основные свойства pBL-1 в сравнении с ближайшими аналогами суммированы в Таблице 1.
| Таблица 1 | |||||
| pGEM-T, PAL-TA | pSPARK | pSMART | pBL-1 | ||
| Размер | 3 т.п.о. | 3 т.п.о. | 1,8 т.п.о. | 2 т.п.о. | |
| Прямое клонирование ПЦР-продуктов | Возможно | Только после проведения дополнительных модификаций 3' концов ПЦР продукта | Возможно | ||
| Клонирование «сложных» GC-богатых последовательностей | Ограничено | Возможно | |||
| Клонирование токсичных ОРС | Ограничено | Возможно | |||
| Сборка модульных генетических конструкций | Ограничена | Ограничена | Затруднена | Возможно | |
Один из вариантов воплощения настоящего изобретения обеспечивает набор для клонирования одного или нескольких полинуклеотидов. В дополнение к вектору согласно настоящего изобретения указанный набор содержит инструкцию, информирующую пользователя о том, каким образом используется указанный набор. Также дополнительными компонентами, обычно присутствющими в указанном наборе, являются ДНК полимераза без корректирующей активности, недискриминирующая ДНК полимераза или терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза и один или несколько компонентов, выбранных их лигазы, киназы, ДНК полимеразы с корректирующей активностью, одна или несколько пар праймеров для секвенирования, одна или несколько пар праймеров для амплификации, компетентные клетки, дезоксинуклеотидтрифосфаты, дидезоксинуклеотидтрифосфаты, аналоги нуклеотидов и реакционные буферы, пригодные для осуществления любой из стадий модификации и клонирования полинуклеотидов.
Особенности полученного Т-вектора и результаты его практического применения приведены на следующих Фигурах.
Краткое описание Фигур:
На Фигуре 1 показана схема последовательного получения плазмид pBL-3, PEL-2, pBL-1 и Т-вектора pBL-T. Обозначения:
LacZ - ген N-концевого фрагмента бета-галактозидазы Е.coli. Стрелкой обозначен промотер гена LacZ; (XcmI)х2 - блок сайтов узнавания эндонуклеазы рестрикции XcmI; пунктирной линией обозначены стадии ПЦР, под линией указаны названия праймеров для инвертированного ПЦР.
На Фигуре 2 показана карта линейного вектора pBL-T. Используются следующие обозначения: Amp (bla) - ген β-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину; bla promoter - промотер гена β-лактамазы; pUC ori - участок инициации репликации; SQ Blanf primer, SQ primer - сайты отжига праймеров для секвенирования области вставки и полилинкера. Стрелками указаны направления транскрипции генов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания. Звездочками обозначены неспаренные 3'Т нуклеотиды.
На Фигуре 3 показана карта плазмиды pBL-3. Используются следующие обозначения: Amp (bla) - ген β-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину; bla promoter - промотер гена β-лактамазы; pUC ori - участок инициации репликации; SQ Blanf primer, SQ primer - сайты отжига праймеров для секвенирования области вставки и полилинкера. Стрелками указаны направления транскрипции генов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.
На Фигуре 4 показана карта плазмиды pBL-2. Используются следующие обозначения: Amp (bla) - ген β-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину; bla promoter - промотер гена β-лактамазы; pUC ori - участок инициации репликации; SQ Blanf primer, SQ primer - сайты отжига праймеров для секвенирования области вставки и полилинкера. Стрелками указаны направления транскрипции генов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.
На Фигуре 5 показана карта плазмиды pBL-1. Используются следующие обозначения: Amp (bla) - ген β-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину; bla promoter - промотер гена β-лактамазы; pUC ori - участок инициации репликации; MCS - полилинкер; pUC18 fragment - фрагмент гомологичный pUC18; SQ Blanf primer, SQ primer - сайты отжига праймеров для секвенирования области вставки полилинкера. Стрелками указаны направления транскрипции генов. Курсивом выделены сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции, в скобках указаны номера нуклеотидов в точках разрезания.
На Фигуре 6 показана электрофореграмма вектора pBL-1, линеаризованного эндонуклеазой рестрикции XcmI с образованием pBL-T. Разделение проведено в 1%-ном агарозном геле, визуализация окрашиванием бромистым этидием (цвета инвертированы).
Обозначения: 2U; 0,3U; 0,09U; 0,03U - продукты рестрикции 1 мкг плазмиды pBL-1 2U; 0,3U; 0,09U и 0,03U единицами активности XcmI, соответственно. Pink - контрольная рестрикционная смесь, в которую не вносили фермент. Объем реакции 50 мкл, инкубация 16 ч. при 37°С. Pk - не инкубировавшаяся при при 37°С плазмида. М - маркер размера. Размер полос маркера указан в п.о. Положение pBL-T и pBL-1 указано стрелкой.
Настоящее изобретение будет более подробно описано ниже со ссылкой на следующие не ограничивающие настоящее изобретение Примеры.
Пример 1 Получение плазмиды pBL-3
Для изменения участка клонирования и удаления ОРС бета-галактозидазы был проведен сайт-направленный мутагенез плазмиды pUC18 методом инвертированной ПЦР с использованием праймеров IP-PL-F (SEQ ID NO:3) и IP-PL-R (SEQ ID NO:4).
Сайт-направленный мутагенез методом инвертированной ПЦР проводили по [Michael P. Weiner, Tim Gackstetter, Gina L. Costa, John C. Bauer, and Keith A. Kretz. Site-directed Mutagenesis using PCR in Molecular Biology: Current Innovations and Future Trends. Eds. A.M. Griffin and H.G.Griffin. ISBN 1-898486-01-8 1995 Horizon Scientific Press, PO Box 1, Wymondham, Norfolk, U.K.] с модификациями
Каждый праймерный олигонуклеотид фосфорилировали отдельно. Реакцию проводили в буфере Трис-HCl, рН 7,5, содержащем 10 мМ MgCl2, 50 мМ дитиотреитола, 1 мМ АТФ и 100 пМ олигонуклеотида, 1 ед. полинуклеотидкиназы фага Т4 (Сибэнзим, Россия) в течение 30 минут при 37°С. После окончания реакции фермент инактивировали при 65°С 10 мин. Затем реакционную смесь использовали для проведения инвертированной ПЦР в количестве 20 пМ на реакцию. ПЦР проводили с использованием набора реактивов "Encyclo PCR kit" (ЗАО Евроген, Россия) по инструкции производителя. ПЦР проводили по следующей схеме: 1 цикл: 4 мин. 94°С, 2 мин. 50°С, 2 мин. 72°С; затем 11 циклов 1 мин. - 94°С, 1 мин. - 55°С, 2 мин. 72°С. После чего разводили вдвое однократным буфером эндонуклеазы DpnI добавляли эндонуклеазу DpnI (10 U) и инкубировали при 37°С 30 мин., затем вносили полимеразу Pfu (2.5U) и переносили на 72°С и инкубировали еще 30 мин. Полученную смесь очищали, используя набор "Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System" («Promega», CHIA) по протоколу производителя. После чего проводили лидирование очищенного продукта инвертированной ПЦР с использованием ДНК-лигазы фага Т4 и стандартного буферного раствора (Fermentas, Литва) в течение 1 часа при комнатной температуре. Полученной лигазной смесью трансформировали клетки Е.coli штамма ТОР10 (Invitrogen, США), с генотипом: F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 nupG recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galE15 galK16 rpsL(StrR) endA1. Для этого к 100 мкл замороженной суспензии клеток Е.coli добавляли 5 мкл лигазной смеси, инкубировали на льду 30 минут для сорбции плазмидной ДНК, нагревали до 42 С на 60 секунд и инкубировали на льду 5 минут. После чего добавляли 800 мкл питательного бульона SOC и инкубировали при 37°С 60 минут. После инкубации переносили суспензию на чашку Петри с твердой агаризованной средой, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл агара, и помещали в термостат на 37 С 18 часов.
Колонии Е.coli, отобранные в результате бело-голубого скрининга (целевые клоны были лишены гена галактозидазы и поэтому давали белые колонии), анализировали методом ПЦР с клонов, с использованием праймерных олигонуклеотидов к конститутивным элементам последовательностей исходной и мутантной плазмид олигонуклеотидов SQ-BlaN-F (SEQ ID NO:5) и M13Rev (SEQ ID NO:6).
4 клона наращивали в 5 мл питательного бульона 2xYT-Amp и выделяли плазмидную ДНК при помощи набора GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Литва) по протоколу производителя. Для полученных генетических конструкций определяли нуклеотидную последовательность методом ПЦР-секвенирования с использованием олигонуклеотидов SQ-BlaN-F (SEQ ID NO:5) и M13Rev (SEQ ID NO:6). Последовательность полученной плазмиды pBL-3 представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:7.
Пример 2 Получение «нетранскрибируемой» плазмиды pBL-2
Для удаления pLac промотора был проведен сайт-направленный мутагенез плазмиды pBL-3 методом инвертированной ПЦР с использованием праймеров IP-TFpBL-F (SEQ ID NO:8) и IP-TFpBL-R (SEQ ID NO:9).
Сайт-направленный мутагенез методом инвертированной ПЦР проводили как написано в примере 1. Для полученных генетических конструкций определяли нуклеотидную последовательность методом ПЦР-секвенирования с использованием олигонуклеотидов SQ-BlaN-F (SEQ ID NO:5) и SQprimer (SEQ ID NO:10). Последовательность полученной плазмиды pBL-2 представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:11.
Пример 3 Получение плазмиды pBL-1
Для введения кассеты, содержащей два сайта узнавания эндонуклеазы XcmI, расположенные в противоположной ориентации, провели сайт-направленный мутагенез плазмиды pBL-2 методом инвертированной ПЦР с использованием праймеров IP-XpBL-F (SEQ ID NO:12) и IP-XpBL-R (SEQ ID NO:13). Сайт-направленный мутагенез методом инвертированной ПЦР проводили как написано в примере 1. Для полученных генетических конструкций определяли нуклеотидную последовательность методом ПЦР-секвенирования с использованием олигонуклеотидов SQ-BlaN-F (SEQ ID NO:5) и SQprimer (SEQ ID NO:10). Последовательность полученной плазмиды pBL-1 представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2
Пример 4. Препаративпое получение линейного вектора PBL-T
Аликвоту компетентных клеток (100 мкл) Е.coli штамма ТОРЮ (Invitrogen, США), трансформировали 50 пг плазмидной ДНК pBL-1, как описано в примере 1, и высевали на 2xYT-агар с ампициллином (50 мкг/мл). Отбирали колонии Е.coli с типичным фенотипом штамма ТОР10 и подращивали в течение 18 часов в 5 мл среды 2xYT с ампициллином (50 мкг/мл), проверяли наличие плазмиды минипрепаративным выделением пДНК (как описано в Примере 1 и создавали музей штамма E.coli ТОР10/pBL-1, добавляя к 1 мл аликвотам культуры глицерин до 15% с последующей заморозкой пробирок в жидком азоте. Для препаративного получения pBL-1 в две пробирки, содержащие по 5 мл среды 2xYT с ампициллином бактериологической петлей сеяли колонии штамма Е.coli TOP10/pBL-1, выращенные на агаризованной среде из музея штамма Е.coli TOP10/pBL-1. Пробирки помещали в термостат и инкубировали в течение 14-16 ч. при 37°С при перемешивании 260 об/мин. Затем выращенный посевной материал пересевали в соотношении 1:250 в две колбы, содержащие по 250 мл среды Terrific Broth (12 г/л триптона, 24 г/л дрожжевого экстракта, 4 мл/л глицерина, 0,017 М калия дигидрофосфата, 0,072 М калия гидрофосфата) и 50 мкг/мл ампициллина. Колбы помещали в термостат и инкубировали 48 ч. при 37°С при перемешивании 260 об/мин. Отделение биомассы от культуральной жидкости проводили центрифугированием, среднее количество биомассы составляло 10 г/л, содержание плазмиды - 30,5 мг/л.
Выделяли сверхскрученную плазмидную ДНК щелочным лизисом, для этого осадок биомассы ресуспендировали в буферном растворе (0,05 М Трис-HCl, 0,01 М ЭДТА-Na, 0,05 М глюкозы, рН 8,0) в соотношении 10 мл раствора на 1 г биомассы, затем производили лизис клеток путем добавления равного объема раствора 1% додецилсульфата натрия и 0,2 М NaOH, и перемешивали суспензию покачиванием в течение 5 мин. Добавляли половинный объем нейтрализующего раствора, содержащего 3 М ацетата калия в 11% уксусной кислоте, и перемешивали суспензию покачиванием до получения равномерной взвеси белых хлопьев. Образовавшийся осадок отделяли фильтрованием через полиамидную ткань с ячейками 100 мкм и последующим центрифугированием в течение 10 мин при ускорении 12000 м/с2. Производили концентрирование неочищенного раствора плазмидной ДНК pBL-1 до объема 15 мл ультрафильтрацией с использованием картриджа с кассетой VIVAFLOW (размер пор 500 кДа, Sartorius Stedim, Германия).
Хроматографическую очистку сверхскрученной плазмидной ДНК проводили с использованием жидкостного хроматографа AKTApurifier (GE Healthcare), длина волны - 254 нм.
Для отделения примесей РНК от плазмидной ДНК проводили гель-фильтрацию с использованием сорбента Sepharose 6 Fast flow (GE Healthcare). На колонку, предварительно уравновешенную буфером А (2,1 М (NH4)2SO4, 10 мМ ЭДТА, 100 мМ Трис-HCl, рН 7,5) наносили пробу ДНК, собирали фракцию, соответствующую первому пику, поглощающему на 254 нм (эта фракция содержит кольцевую ДНК).
Для отделения открытой кольцевой и линейной форм плазмидной ДНК проводили псевдоаффинную хроматографию с использованием сорбента PlasmidSelect Xtra (GE Healthcare). На колонку, уравновешенную буфером В (2 М (NH4)2SO4, 10 мМ ЭДТА, 100 мМ Трис-HCl, рН 7,5) наносили пробу ДНК после гель-фильтрации, затем, изменив направление потока через колонку, производили десорбцию суперспирализованной кольцевой ДНК буфером С (0,3 М NaCl, 1,7 М (NH4)2SO4, 10 мМ ЭДТА, 100 мМ Трис-HCl, рН 7,5), собирали фракцию, соответствующую первому пику, поглощающему на 254 нм (эта фракция содержит суперспирализованную кольцевую ДНК).
Для окончательной очистки и концентрирования сверхскрученной плазмидной ДНК производили анионообменную хроматографию с использованием сорбента SOURCE 30 Q (GE Healthcare). Перед нанесением на колонку раствор пДНК после псевдоаффинной хроматографии разбавляли двумя объемами воды очищенной, затем наносили на колонку, уравновешенную буфером D (0,4 М NaCl, 10 мМ ЭДТА, 100 мМ Трис-HCl, рН 7,5), изменив направление потока через колонку, производили десорбцию очищенной кольцевой ДНК буфером Е (1,0 М NaCl, 10 мМ ЭДТА, 100 мМ Трис-HCl, рН 7,5), собирали фракцию, соответствующую первому пику, поглощающему на 254.
Полученный раствор сверхскрученной пДНК pBL-1 обессоливали ультрафильтрацией с помощью одноразовых ультрафильтрационных пробирок VIVASPIN 6 (размер пор 5 кДа, Sartorius Stedim, Германия). Измеряли концентрацию пДНК в полученном растворе при помощи спектрофотометрии, раствор разделяли на аликвоты по 5 мг пДНК и хранили при -20°С.
Линеаризацию плазмиды pBL-1 проводили при помощи эндонуклеазы ферментом XcmI (New England Biolabs) по методике производителя. Экспериментально на небольших аликвотах плазмиды pBL-1 подбирали оптимальное соотношение фермента и субстрата, приводящее к распаду более 95% плазмиды. Результаты определения соотношения приведены на Фиг.6, видимое отсутствие сверхскрученной пДНК зафиксировано для соотношения составившее 0,3 ЕД фермента XcmI на 1 мкг плазмиды.
Очистку полученного линейного вектора pBL-T проводили анионообменной хроматографией. Образец расщепленной рестриктазой XcmI ДНК (50 мкг) был нанесен без разбавления на колонку MonoQ (GE Healthcare), уравновешенную раствором А (0,1 М Трис-HCl, 0,4 М натрия хлорида, 10 мМ ЭДТА). После промывки колонки 10 мл раствора А, вели градиентную элюцию ДНК концентрацией хлорида натрия, профиль градиента 0-100% буфера В (0,1 М Трис-HCl, 1 М натрия хлорида, 10 мМ ЭДТА) за 60 мин при скорости потока 0,5 мл/мин. Основной пик, соответствующий линейной пДНК, элюировали при концентрации хлорида натрия около 760 мМ. Собранный основной пик обессоливали ультрафильтрацией, как указано выше, определяли концентрацию пДНК спектрофотометрически, разделяли раствор на аликвоты, содержащие по 100 нг пДНК, высушивали в вакуумной центрифуге и хранили закрытые пробирки при -20°С.
Пример 5 Эффективность клонирования открытых рамок считывания в нетранскрибируемый Т-вектор pBL-T
Для определения эффективности клонирования открытых рамок считывания (ОРС) использовали ОРС кДНК гена дигидрофолатредуктазы мыши (DHFR, NM_000791.3), полученную методом ПЦР с праймеров AD-DHFR-F (SEQ ID NO:14) и AD-DHFR-R (SEQ ID NO:15) при использовании в качестве матрицы плазмиды pOptiVec (Invitrogen, США).
Продукт ПЦР, соответствующий полной ОРС DHFR, очищали из агарозного геля как описано в примере 1. Очищенный продукт лигировали с 50 нг линейного Т-вектора pBL-T, или 50 нг коммерчески доступного транскрибируемого Т-вектора с системой бело-голубой селекции pAL-TA (Евроген) (Т-1) или с 50 нг стандартного плазмидного вектора pUC18, линеаризованного эндонуклеазой рестрикции SmaI с образованием "тупых" концов молекулы. Во всех случаях использовали молярное соотношение вставки и вектора 3:1, объем лигирования 30 мкл, фермент для лигирования - ДНК-лигаза фага Т4 (Fermentas, Литва). Лигирование вели в течение 16 часов при температуре 14°С.
Полученные смеси добавляли к компетентным клеткам штамма ТОР10 и вели трансформацию, как описано в Примере 1, после чего переносили суспензию трансформированных бактерий на две чашки Петри (100 мкл и 900 мкл) с агаризованной средой 2xYT, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл, ИПТГ и X-Gal и помещали чашки в термостат на 37 С 18 часов.
Полученные данные о числе клонов представлены в Таблице 2.
| Таблица 2. | |||
| Эффективность лигирования ОРС с Т-векторами pBL-T, pUC18 и Т1. | |||
| Наличие ДНК "вставки" в лигазной смеси | pBL-T, КОЕ* | pUC18 - SmaI, число КОЕ/"белых" КОЕ | Т-1, число КОЕ/"белых" КОЕ |
| - | 1 | 27/0 | 0/0 |
| + | 42 | 63/3 | 3/3 |
| * колониеобразующая единица | |||
Для 4-х колоний трансформантов, полученных при помощи вектора pBL-T, нарастили и выделили плазмиды и провели секвенирование области вставки. Установили, что все плазмиды содержат вставку; ориентация вставки в двух случаях была "прямой" и в двух случаях "обратной". Вектор pBL-T обеспечивал наибольшее число позитивных клонов, содержащих вставку ОРС, среди всех исследованных.
Пример 6. Эффективность клонирования в нетранскрибируемый Т-вектор pBL-T GC-богатых фрагментов ДНК.
Для определения эффективности клонирования GC богатых фрагментов использовали fr5EF - участок промоторной области фактора элонгации трансляции 1 китайского хомяка и frEBVTR - участок терминального повтора вируса Эппштейн-Барр.
Участок промоторной области фактора элонгации трансляции 1 китайского. хомяка - fr5EF - получали методом ПЦР при помощи набора Encyclo (Евроген, Россия) по инструкции производителя. Использовали синтетические олигонуклеотиды AD-5CH-5F (SEQ ID NO:16) и AD-5CH-5R (SEQ ID NO:17), в качестве матрицы использовали с геномную ДНК, выделенную из культуры клеток СНО DG-44 (Invitrogen, США) при помощи набора Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega, США) по инструкции производителя.
Последовательность ПЦР-продукта fr5EF (1290 п.о.) представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:18, содержание GC - 70.34%. Последовательность ПЦР-продукта содержит сигнальные области эукариотического промотора, а также области прямых и обратных повторов.
Участок концевого повтора вируса Эпштейн-Барр - frEBVTR - получали отжигом комплементарных олигонуклеотидов. Последовательность frEBVTR представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:19, содержание GC - 73.8%.
ПЦР, очистку продуктов ПЦР, дотирование и трансформацию проводили как описано в примерах 1 и 5. Дополнительно был использован коммерчески доступный транскрибируемый Т-вектор с системой бело-голубой селекции с повышенной стабильностью при хранении в растворе pGEM-T (Promega) (T-2). Полученные данные представлены в Таблице 3.
| Таблица 3. | |||
| Эффективность лигирования GC-богатых фрагментов ДНК с Т-вектором pBL-T. | |||
| Состав лигазной смеси | pBL-T, КОЕ | Т-1, число КОЕ/"белых" КОЕ | T-2, число КОЕ/"белых" КОЕ |
| Вектор | 3 | 0/0 | 11/5 |
| Вектор + fr5EF | 40 | 1/1 | 52/50 |
| Вектор + frEBVTR | 2253 | 11/11 | 244/238 |
Вектор pBL-T обеспечивал большее число позитивных клонов для обеих вставок, чем контрольный Т-вектор "Т-1", и лучшее отношения числа позитивных клонов к числу негативных клонов, чем контрольный Т-вектор "T-2" при сходном или большем числе позитивных клонов.
Пример 7. Эффективность клонирования в нетранскрибируемый Т-вектор pBL-T АТ-богатых фрагментов ДНК.
Для определения эффективности клонирования АТ-богатых фрагментов использовали fr3EF - участок 3' нетранскрибируемой области гена фактора элонгации трансляции 1 китайского.
Участок 3' нетранскрибируемой области фактора элонгации трансляции 1 китайского хомячка получали, как указано в Примере 6. Использовали синтетические олигонуклеотиды AD-3CH-1F (SEQ ID NO:20) и AD-3CH-1R (SEQ ID NO:21). Последовательность fr3EF (622 п.о.) представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:22, содержание AT 60,8%.
ПЦР, очистку продуктов ПЦР, лигирование и трансформацию проводили как описано в Примере 6.
Измерения проводили в 3 параллелях и определяли среднее значение и стандартное отклонение. Полученные данные представлены в Таблице 4.
| Таблица 4. | |||
| Эффективность лигирования АТ-богатого фрагмента ДНК с Т-вектором pBL-T. | |||
| Состав лигазной смеси | pBL-T, КОЕ | Т-1, число КОЕ/"белых" КОЕ | Т-2, КОЕ |
| Вектор | 3 | 0/0 | 11/5 |
| Вектор + fr3EF | 973 | 6/6 | 105/101 |
Вектор pBL-T обеспечивал большее число позитивных клонов для АТ-богатой вставки, чем "транскрибируемые" Т-вектора.
Пример 10. Увеличение скорости рутинного молекулярного клонирования при использовании нетранскрибируемого Т-вектора pBL-T.
Существенное ускорение рутинных процедур клонирования, включающее получение препарата очищенной плазмидной ДНК на следующий день после запуска реакции лигирования вектора pBL-T и вставки достигается применением нижеследующего протокола.
После проведения ПЦР в стандартных условиях, очищенный ПЦР продукт лигируют с нетранскрибируемым Т-вектором pBL-T при помощи Т4-ДНК лигазы I час (Fermentas, Литва), трансформируют химически компетентные клетки Е.coli TOP10, подращивают трансформированные клетки 1 час в среде SOC и высевают 100-500 мкл культуры на чашку Петри, содержащую агаризованную среду 2xYT и 50 мкг/мл ампициллина. Чашку Петри инкубируют в течение ночи (14-16 ч) при +37°С и переносят несколько колоний в пробирки с 5 мл жидкой среды 2xYT и 50 мкг/мл ампициллина. Культуру растят 6 ч при перемешивании со скоростью 260 об/мин и температуре +37°С. Проводят выделение плазмид при помощи набора GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Fermentas, Литва) по протоколу производителя (20 мин) и определяют концентрацию пДНК при помощи набора Quant-iT dsDNA Broad-Range Assay Kit (Invitrogen, США) (5 мин). Выход пДНК при использовании нетранскрибируемого Т-вектора pBL-T с различными вставками находился в диапазоне 1,5-7,5 мкг с 5 мл культуры. Получаемые количества пДНК достаточны для проведения рестрикционного картирования или нескольких реакций секвенирования ДНК. Проведение вышеуказанной процедуры с использованием коммерчески доступного транскрибируемого Т-вектора Т-2 приводило к выходу пДНК в диапазоне 0,25-1,0 мкг с 5 мл бактериальной культуры. Такое количество пДНК недостаточно для проведения рестрикционного картирования или секвенирования области вставки и последующего получения рестрикционного фрагмента вставки для последующего субклонирования. Таким образом, увеличение копийности плазмид на основе нетранскрибируемого Т-вектора pBL-T по сравнению с плазмидами па основе распространенных Т-векторов позволяет существенно увеличить скорость рутинного молекулярного клонирования.
Хотя указанное изобретение описано в деталях со ссылкой на Примеры, для специалиста в указанной области техники очевидно, что могут быть совершены различные изменения и произведены эквивалентные замены, и такие изменения и замены не выходят за рамки настоящего изобретения.
Claims (9)
1. Нетранскрибируемый плазмидный вектор для прямого клонирования фрагментов ДНК, являющихся продуктами ПЦР, и модульной сборки генетических конструкций, состоящий из гена маркера селекции с промотором и терминатором, области инициации репликации и полилинкера, содержащего 15 или более уникальных гексануклеотидных сайтов расщепления эндонуклеазами рестрикции, 3 или более октануклеотидных сайтов расщепления эндонуклеазами рестрикции и два сайта узнавания XcmI, расположенные в центре области полилинкера в противоположной ориентации и образующие при расщеплении указанной рестриктазой непарные выступающие одиночные остатки дезокситимидина на 3′-концах цепей ДНК.
2. Вектор по п.1, отличающийся тем, что геном маркера селекции является ген бета-лактамазы, а область инициации репликации представляет собой область инициации репликации pUC.
3. Вектор по п.2, отличающийся тем, что указанным вектором является вектор рВL1, нуклеотидная последовательность которого представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2.
4. Нетранскрибируемый линеаризованный вектор для прямого клонирования фрагментов ДНК, являющихся продуктами ПЦР, и модульной сборки генетических конструкций, состоящий из гена маркера селекции с промотором и терминатором, области инициации репликации и полилинкера, содержащего 15 или более уникальных гексануклеотидных сайтов расщепления эндонуклеазами рестрикции, 3 или более октануклеотидных сайтов расщепления эндонуклеазами рестрикции и непарных выступающих одиночных остатков дезокситимидина на 3′-концах цепей ДНК.
5. Вектор по п.4, отличающийся тем, что геном маркера селекции является ген бета-лактамазы, а область инициации репликации представляет собой область инициации репликации pUC.
6. Вектор по п.5, отличающийся тем, что указанным вектором является вектор pBL-T, нуклеотидная последовательность которого представлена в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1.
7. Набор для клонирования фрагментов ДНК, являющихся продуктами ПЦР, содержащий нетранскрибируемый плазмидный вектор по п.1 или нетранскрибируемый линейный вектор по п.4, лигазу и инструкцию по применению набора.
8. Набор по п.7, отличающийся тем, что нетранскрибируемым плазмидным вектором является вектор рВL1, представленный в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:2, а нетранскрибируемым линейным вектором является вектор pBL-T, представленный в Перечне последовательностей под номером SEQ ID NO:1.
9. Набор по п.7, отличающийся тем, что дополнительно содержит один или несколько компонентов, выбранных из группы, состоящей из ДНК полимеразы без корректирующей активности, ДНК полимеразы с корректирующей активностью, недискриминирующей ДНК полимеразы, терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазы, киназы, одной или нескольких пар праймеров для секвенирования, одной или нескольких пар праймеров для амплификации, компетентных клеток, дезоксинуклеотидтрифосфатов, дидезоксинуклеотидтрифосфатов, аналогов нуклеотидов и реакционных буферов, пригодных для осуществления любой из стадий модификации и клонирования полинуклеотидов.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011146242/10A RU2507266C2 (ru) | 2011-11-16 | 2011-11-16 | НЕТРАНСКРИБИРУЕМЫЙ ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР pBL-T ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ СЛОЖНЫХ ГЕНОМНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ И МНОГОМОДУЛЬНОЙ СБОРКИ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ КОНСТРУКЦИЙ (ВАРИАНТЫ), И НАБОР, СОДЕРЖАЩИЙ УКАЗАННЫЙ ВЕКТОР |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2011146242/10A RU2507266C2 (ru) | 2011-11-16 | 2011-11-16 | НЕТРАНСКРИБИРУЕМЫЙ ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР pBL-T ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ СЛОЖНЫХ ГЕНОМНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ И МНОГОМОДУЛЬНОЙ СБОРКИ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ КОНСТРУКЦИЙ (ВАРИАНТЫ), И НАБОР, СОДЕРЖАЩИЙ УКАЗАННЫЙ ВЕКТОР |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2011146242A RU2011146242A (ru) | 2013-05-27 |
| RU2507266C2 true RU2507266C2 (ru) | 2014-02-20 |
Family
ID=48788971
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2011146242/10A RU2507266C2 (ru) | 2011-11-16 | 2011-11-16 | НЕТРАНСКРИБИРУЕМЫЙ ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР pBL-T ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ СЛОЖНЫХ ГЕНОМНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ И МНОГОМОДУЛЬНОЙ СБОРКИ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ КОНСТРУКЦИЙ (ВАРИАНТЫ), И НАБОР, СОДЕРЖАЩИЙ УКАЗАННЫЙ ВЕКТОР |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2507266C2 (ru) |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0738779A2 (en) * | 1990-09-27 | 1996-10-23 | Invitrogen Corporation | Direct cloning of PCR amplified nucleic acids |
| US20080166773A1 (en) * | 2007-01-08 | 2008-07-10 | Lucigen Corporation | Vectors, kits and methods for cloning dna |
| RU2008144131A (ru) * | 2006-04-07 | 2010-05-20 | Георг-Аугуст-Универзитет Геттинген Штифтунг Эффентлихен Рехтс (De) | СИНТЕТИЧЕСКАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ МеСР2 ДЛЯ БЕЛКОВОЙ ЗАМЕСТИТЕЛЬНОЙ ТЕРАПИИ |
| CN101948862A (zh) * | 2010-09-13 | 2011-01-19 | 原平皓(天津)生物技术有限公司 | 一种构建t载体的方法 |
-
2011
- 2011-11-16 RU RU2011146242/10A patent/RU2507266C2/ru not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0738779A2 (en) * | 1990-09-27 | 1996-10-23 | Invitrogen Corporation | Direct cloning of PCR amplified nucleic acids |
| RU2008144131A (ru) * | 2006-04-07 | 2010-05-20 | Георг-Аугуст-Универзитет Геттинген Штифтунг Эффентлихен Рехтс (De) | СИНТЕТИЧЕСКАЯ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ МеСР2 ДЛЯ БЕЛКОВОЙ ЗАМЕСТИТЕЛЬНОЙ ТЕРАПИИ |
| US20080166773A1 (en) * | 2007-01-08 | 2008-07-10 | Lucigen Corporation | Vectors, kits and methods for cloning dna |
| CN101948862A (zh) * | 2010-09-13 | 2011-01-19 | 原平皓(天津)生物技术有限公司 | 一种构建t载体的方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| 2009. Newsletter Techniques, September 2011: How to Create Your Perfect MCS, Addgene, (найдено он-лайн 31.07.2012) (найдено по адресу http://www.addgene.org/static/cms/files/How-to-create-a-perfect-MCS.pdf). * |
| HOHEISEL J.D. A cassette with seven unique restriction sites, including octanucleotide sequences: extension of multiple-cloning-site plasmids // Gene. 1989 Aug 1; 80(1):151-4. * |
| HOHEISEL J.D. A cassette with seven unique restriction sites, including octanucleotide sequences: extension of multiple-cloning-site plasmids // Gene. 1989 Aug 1; 80(1):151-4. JURGEN BROSIUS Superpolylinkers in Cloning and Expression Vectors", DNA. DECEMBER 1989, 8(10):759-777. HOHEISEL J.D. Extension of a pUC18-like polylinker by the octanucleotide recognition sites of NotI, Fsel, Sfil and Pad // Trends Genet. 1990 Nov; 6(11):346. Cloning vector pcDNA3.1+PA, complete sequence, * |
| HOHEISEL J.D. Extension of a pUC18-like polylinker by the octanucleotide recognition sites of NotI, Fsel, Sfil and Pad // Trends Genet. 1990 Nov; 6(11):346. Cloning vector pcDNA3.1+PA, complete sequence, Newsletter Techniques, September 2011: How to Create Your Perfect MCS, Addgene, (найдено он-лайн 31.07.2012) (найдено по адресу http://www.addgene.org/static/cms/files/How-to-create-a-perfect-MCS.pdf). * |
| JURGEN BROSIUS Superpolylinkers in Cloning and Expression Vectors", DNA. DECEMBER 1989, 8(10):759-777. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2011146242A (ru) | 2013-05-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2022201465C1 (en) | Expression constructs and methods of genetically engineering methylotrophic yeast | |
| Matsumoto et al. | Autogenous regulation of the gene for transcription termination factor rho in Escherichia coli: localization and function of its attenuators | |
| JP4264703B2 (ja) | 合成遺伝子、およびＣｐＧを欠く細菌プラスミド | |
| US12492405B2 (en) | Promoter and carrier composed of same and application thereof | |
| CA2073630C (en) | Method for synthesizing single-stranded stem-loop dnas, the products and uses therefor | |
| WO2023039378A1 (en) | Class ii, type v crispr systems | |
| CN104109687A (zh) | 运动发酵单胞菌CRISPR-Cas9系统的构建与应用 | |
| US12570989B2 (en) | Promoter and use thereof | |
| US12435323B2 (en) | Enzymes with RUVC domains | |
| WO2021184766A1 (zh) | 一种基因表达组件及其构建的克隆载体和应用 | |
| CN102703424A (zh) | 一种重组工程介导的大肠杆菌基因组点突变的方法 | |
| IT202000028688A1 (it) | Varianti della citidina deaminasi per l’editazione di basi | |
| JP2009523428A (ja) | 直鎖状ベクター、宿主細胞およびクローニング法 | |
| CN110499274B (zh) | 一种基因工程红球菌及其构建方法与应用 | |
| CN116917485A (zh) | 表达岩藻糖基转移酶的重组微生物和使用其生产2’-岩藻糖基乳糖的方法 | |
| US20220081692A1 (en) | Combinatorial Assembly of Composite Arrays of Site-Specific Synthetic Transposons Inserted Into Sequences Comprising Novel Target Sites in Modular Prokaryotic and Eukaryotic Vectors | |
| CN107002070A (zh) | 共表达质粒 | |
| CN116286931A (zh) | 用于富养罗尔斯通氏菌快速基因编辑的双质粒系统及应用 | |
| RU2507266C2 (ru) | НЕТРАНСКРИБИРУЕМЫЙ ПЛАЗМИДНЫЙ ВЕКТОР pBL-T ДЛЯ КЛОНИРОВАНИЯ СЛОЖНЫХ ГЕНОМНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ И МНОГОМОДУЛЬНОЙ СБОРКИ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ КОНСТРУКЦИЙ (ВАРИАНТЫ), И НАБОР, СОДЕРЖАЩИЙ УКАЗАННЫЙ ВЕКТОР | |
| Rogulin et al. | Plasmid pRARE as a Vector for Cloning to Construct a Superproducer of the Site-Specific Nickase N. Bsp D6I | |
| JP3851059B2 (ja) | 遺伝子の機能の制御方法 | |
| WO2021046486A1 (en) | Combinatorial assembly of composite arrays of site-specific synthetic transposons inserted into sequences comprising novel target sites in modular prokaryotic and eukaryotic vectors | |
| CN104371964B (zh) | 有氧下可提升重组蛋白质表现的菌株 | |
| Renaudin et al. | Plasmid and viral vectors for gene cloning and expression in Spiroplasma citri | |
| CA2156260A1 (en) | Bi-functional expression system |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20161117 |