RU2209088C2 - Опосредованная рецепторами доставка генов с использованием векторов на основе бактериофагов - Google Patents
Опосредованная рецепторами доставка генов с использованием векторов на основе бактериофагов Download PDFInfo
- Publication number
- RU2209088C2 RU2209088C2 RU2000107789/14A RU2000107789A RU2209088C2 RU 2209088 C2 RU2209088 C2 RU 2209088C2 RU 2000107789/14 A RU2000107789/14 A RU 2000107789/14A RU 2000107789 A RU2000107789 A RU 2000107789A RU 2209088 C2 RU2209088 C2 RU 2209088C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- phage
- ligand
- cells
- protein
- gene
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 265
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims description 107
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 title description 74
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 title description 74
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 title description 35
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 title description 7
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims abstract description 160
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 111
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 66
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims abstract description 53
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 claims abstract description 36
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 17
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 149
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 81
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims description 63
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 54
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 40
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 36
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 29
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 25
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 23
- 108091008794 FGF receptors Proteins 0.000 claims description 21
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 18
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 claims description 17
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 claims description 17
- 102000044168 Fibroblast Growth Factor Receptor Human genes 0.000 claims description 17
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 claims description 17
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 14
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 claims description 14
- 108010084592 Saporins Proteins 0.000 claims description 10
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 claims description 9
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000829 Ribosome Inactivating Proteins Proteins 0.000 claims description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 9
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 claims description 9
- 231100000599 cytotoxic agent Toxicity 0.000 claims description 7
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 claims description 7
- 230000030648 nucleus localization Effects 0.000 claims description 7
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 7
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 claims description 6
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 claims description 6
- 239000002254 cytotoxic agent Substances 0.000 claims description 6
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 5
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims description 4
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 claims 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 abstract description 31
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 9
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 9
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 263
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 96
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 77
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 73
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 69
- 102100035290 Fibroblast growth factor 13 Human genes 0.000 description 57
- 101150021185 FGF gene Proteins 0.000 description 44
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 42
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 41
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 41
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 40
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 39
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 39
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 32
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 32
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 32
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 32
- 239000000047 product Substances 0.000 description 29
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 27
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 26
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 25
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 25
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 24
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 23
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 23
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 23
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 22
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 20
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 20
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 18
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 18
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 17
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 16
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 15
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 15
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 15
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 15
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 14
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 14
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 13
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 13
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 13
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 13
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 13
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 13
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 13
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 13
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 13
- 230000006870 function Effects 0.000 description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 13
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 13
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 12
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 12
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 11
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 11
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 11
- 108700010839 phage proteins Proteins 0.000 description 11
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 11
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 10
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 10
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 10
- 108010087904 neutravidin Proteins 0.000 description 10
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 10
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 9
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 9
- 238000002823 phage display Methods 0.000 description 9
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 9
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 9
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 8
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 8
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 8
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 8
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 8
- -1 probazin Proteins 0.000 description 8
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 8
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 7
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 7
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 7
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 7
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 7
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 7
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 7
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 7
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 7
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 7
- 102100026189 Beta-galactosidase Human genes 0.000 description 6
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 6
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 6
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 6
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 6
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 6
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 6
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 6
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 6
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 6
- JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 3-(pyridin-2-yldisulfanyl)propanoate Chemical compound O=C1CCC(=O)N1OC(=O)CCSSC1=CC=CC=N1 JWDFQMWEFLOOED-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N (S)-chloroquine Chemical compound ClC1=CC=C2C(N[C@@H](C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 5
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 5
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 5
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 5
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 5
- 101100007328 Cocos nucifera COS-1 gene Proteins 0.000 description 5
- 108091027757 Deoxyribozyme Proteins 0.000 description 5
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 5
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 5
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 5
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 5
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 5
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 5
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 5
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 5
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 230000001188 anti-phage Effects 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 229960003677 chloroquine Drugs 0.000 description 5
- WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N chloroquine Natural products ClC1=CC=C2C(NC(C)CCCN(CC)CC)=CC=NC2=C1 WHTVZRBIWZFKQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 5
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 5
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 5
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 5
- 230000005937 nuclear translocation Effects 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 5
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 5
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 4
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 108010022366 Carcinoembryonic Antigen Proteins 0.000 description 4
- 102100025475 Carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 5 Human genes 0.000 description 4
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 4
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 4
- AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N Doxorubicin Chemical compound O([C@H]1C[C@@](O)(CC=2C(O)=C3C(=O)C=4C=CC=C(C=4C(=O)C3=C(O)C=21)OC)C(=O)CO)[C@H]1C[C@H](N)[C@H](O)[C@H](C)O1 AOJJSUZBOXZQNB-TZSSRYMLSA-N 0.000 description 4
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 4
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 4
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 4
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 4
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 4
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 4
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 4
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 4
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 4
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 4
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 4
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 4
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 4
- 102100023543 Vascular cell adhesion protein 1 Human genes 0.000 description 4
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 4
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 4
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 4
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 4
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 4
- 238000013461 design Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 4
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 4
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 4
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 4
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 4
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 4
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 4
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 4
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 4
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 4
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 4
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 4
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 4
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 108010066676 Abrin Proteins 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000000311 Cytosine Deaminase Human genes 0.000 description 3
- 108010080611 Cytosine Deaminase Proteins 0.000 description 3
- 102100037241 Endoglin Human genes 0.000 description 3
- 108010036395 Endoglin Proteins 0.000 description 3
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 3
- 102100028072 Fibroblast growth factor 4 Human genes 0.000 description 3
- 108090000385 Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 3
- 102100028071 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 3
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 3
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Natural products C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 3
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 3
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 3
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 3
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 3
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 3
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 101100446506 Mus musculus Fgf3 gene Proteins 0.000 description 3
- 102000008299 Nitric Oxide Synthase Human genes 0.000 description 3
- 108010021487 Nitric Oxide Synthase Proteins 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 108010035766 P-Selectin Proteins 0.000 description 3
- 108091008606 PDGF receptors Proteins 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 102000011653 Platelet-Derived Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 3
- 102100033237 Pro-epidermal growth factor Human genes 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 3
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 3
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 3
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 3
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 3
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010000134 Vascular Cell Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 3
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 3
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000013529 alpha-Fetoproteins Human genes 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 3
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 3
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 102000052178 fibroblast growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 3
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 3
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 3
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 3
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 3
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 3
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 3
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 3
- 230000006444 vascular growth Effects 0.000 description 3
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 3
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 3
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 3
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- IPVFGAYTKQKGBM-BYPJNBLXSA-N 1-[(2r,3s,4r,5r)-3-fluoro-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-iodopyrimidine-2,4-dione Chemical compound F[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 IPVFGAYTKQKGBM-BYPJNBLXSA-N 0.000 description 2
- MTVWFVDWRVYDOR-UHFFFAOYSA-N 3,4-Dihydroxyphenylglycol Chemical compound OCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 MTVWFVDWRVYDOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100295756 Acinetobacter baumannii (strain ATCC 19606 / DSM 30007 / JCM 6841 / CCUG 19606 / CIP 70.34 / NBRC 109757 / NCIMB 12457 / NCTC 12156 / 81) omp38 gene Proteins 0.000 description 2
- 108010064733 Angiotensins Proteins 0.000 description 2
- 102000015427 Angiotensins Human genes 0.000 description 2
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 description 2
- 101100395863 Caenorhabditis elegans hst-2 gene Proteins 0.000 description 2
- ZEOWTGPWHLSLOG-UHFFFAOYSA-N Cc1ccc(cc1-c1ccc2c(n[nH]c2c1)-c1cnn(c1)C1CC1)C(=O)Nc1cccc(c1)C(F)(F)F Chemical compound Cc1ccc(cc1-c1ccc2c(n[nH]c2c1)-c1cnn(c1)C1CC1)C(=O)Nc1cccc(c1)C(F)(F)F ZEOWTGPWHLSLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 2
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 2
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 101100481408 Danio rerio tie2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 2
- 108010053187 Diphtheria Toxin Proteins 0.000 description 2
- 102000016607 Diphtheria Toxin Human genes 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 2
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 2
- 102100021474 Electrogenic sodium bicarbonate cotransporter 1 Human genes 0.000 description 2
- 102100038083 Endosialin Human genes 0.000 description 2
- 101710144543 Endosialin Proteins 0.000 description 2
- 101150019331 FGF2 gene Proteins 0.000 description 2
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 2
- 108090000382 Fibroblast growth factor 6 Proteins 0.000 description 2
- 102100028075 Fibroblast growth factor 6 Human genes 0.000 description 2
- 108090000368 Fibroblast growth factor 8 Proteins 0.000 description 2
- 102100037680 Fibroblast growth factor 8 Human genes 0.000 description 2
- 102100023593 Fibroblast growth factor receptor 1 Human genes 0.000 description 2
- 101710182386 Fibroblast growth factor receptor 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- 101150066002 GFP gene Proteins 0.000 description 2
- 208000015872 Gaucher disease Diseases 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150101014 HST1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101800001649 Heparin-binding EGF-like growth factor Proteins 0.000 description 2
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 2
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 description 2
- 101001060274 Homo sapiens Fibroblast growth factor 4 Proteins 0.000 description 2
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 2
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 2
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 2
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 description 2
- 108010064600 Intercellular Adhesion Molecule-3 Proteins 0.000 description 2
- 102100037871 Intercellular adhesion molecule 3 Human genes 0.000 description 2
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 2
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 2
- 102000003777 Interleukin-1 beta Human genes 0.000 description 2
- 108090000193 Interleukin-1 beta Proteins 0.000 description 2
- 108090000177 Interleukin-11 Proteins 0.000 description 2
- 102000003815 Interleukin-11 Human genes 0.000 description 2
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 2
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 2
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 2
- 102000004125 Interleukin-1alpha Human genes 0.000 description 2
- 108010082786 Interleukin-1alpha Proteins 0.000 description 2
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 2
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 2
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 2
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 2
- 108010064548 Lymphocyte Function-Associated Antigen-1 Proteins 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 2
- 101000878182 Mus musculus Fibroblast growth factor 15 Proteins 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 2
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 2
- 102000002488 Nucleoplasmin Human genes 0.000 description 2
- 102000011931 Nucleoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010061100 Nucleoproteins Proteins 0.000 description 2
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102100023472 P-selectin Human genes 0.000 description 2
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 2
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 102100035703 Prostatic acid phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 101000762949 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) Exotoxin A Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 2
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 2
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 2
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 description 2
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 description 2
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 2
- 101150047749 VIII gene Proteins 0.000 description 2
- 101900150902 Varicella-zoster virus Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 229960004150 aciclovir Drugs 0.000 description 2
- MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N aciclovir Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(COCCO)C=N2 MKUXAQIIEYXACX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 2
- 238000002399 angioplasty Methods 0.000 description 2
- 101150042295 arfA gene Proteins 0.000 description 2
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 2
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 2
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 2
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 2
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 2
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 108010018828 cadherin 5 Proteins 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 2
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 2
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 2
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 2
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 2
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 229940124447 delivery agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000011033 desalting Methods 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 229960004679 doxorubicin Drugs 0.000 description 2
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 239000005038 ethylene vinyl acetate Substances 0.000 description 2
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 2
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 2
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 2
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OSWPMRLSEDHDFF-UHFFFAOYSA-N methyl salicylate Chemical compound COC(=O)C1=CC=CC=C1O OSWPMRLSEDHDFF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 2
- AEMBWNDIEFEPTH-UHFFFAOYSA-N n-tert-butyl-n-ethylnitrous amide Chemical compound CCN(N=O)C(C)(C)C AEMBWNDIEFEPTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100001083 no cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 239000003865 nucleic acid synthesis inhibitor Substances 0.000 description 2
- 108060005597 nucleoplasmin Proteins 0.000 description 2
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 2
- 101150087557 omcB gene Proteins 0.000 description 2
- 101150115693 ompA gene Proteins 0.000 description 2
- 101150093139 ompT gene Proteins 0.000 description 2
- 239000005022 packaging material Substances 0.000 description 2
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 229920001200 poly(ethylene-vinyl acetate) Polymers 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 2
- 102000005912 ran GTP Binding Protein Human genes 0.000 description 2
- 108010005597 ran GTP Binding Protein Proteins 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 230000003584 silencer Effects 0.000 description 2
- 238000004088 simulation Methods 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 2
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 150000003573 thiols Chemical group 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 230000010415 tropism Effects 0.000 description 2
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 2
- CJDRUOGAGYHKKD-XMTJACRCSA-N (+)-Ajmaline Natural products O[C@H]1[C@@H](CC)[C@@H]2[C@@H]3[C@H](O)[C@@]45[C@@H](N(C)c6c4cccc6)[C@@H](N1[C@H]3C5)C2 CJDRUOGAGYHKKD-XMTJACRCSA-N 0.000 description 1
- FLCQLSRLQIPNLM-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 2-acetylsulfanylacetate Chemical compound CC(=O)SCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O FLCQLSRLQIPNLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BQWBEDSJTMWJAE-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 4-[(2-iodoacetyl)amino]benzoate Chemical compound C1=CC(NC(=O)CI)=CC=C1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O BQWBEDSJTMWJAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- YKPCEENRZZBDMC-DRNPGQERSA-N (2r,3r,4s,5r)-2-[6-[[(3s)-3-bicyclo[2.2.1]heptanyl]amino]purin-9-yl]-5-(hydroxymethyl)oxolane-3,4-diol Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N[C@@H]3C4CCC(C4)C3)=C2N=C1 YKPCEENRZZBDMC-DRNPGQERSA-N 0.000 description 1
- LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N (2s,3r)-2-[[(2r)-1-[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-hydroxybutanoic acid Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)CCCCN LOGFVTREOLYCPF-KXNHARMFSA-N 0.000 description 1
- CHADEQDQBURGHL-UHFFFAOYSA-N (6'-acetyloxy-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3'-yl) acetate Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(OC(C)=O)C=C1OC1=CC(OC(=O)C)=CC=C21 CHADEQDQBURGHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UNJJHOQIVSZFDN-RRKCRQDMSA-N 1-[(2r,4s,5r)-5-(aminomethyl)-4-hydroxyoxolan-2-yl]-5-iodopyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 UNJJHOQIVSZFDN-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QOVUZUCXPAZXDZ-RXMQYKEDSA-N 2-amino-9-[(3r)-3,4-dihydroxybutyl]-3h-purin-6-one Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2CC[C@@H](O)CO QOVUZUCXPAZXDZ-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- SYGQYQGDQAUORG-UHFFFAOYSA-N 3-[3-(2,5-dioxopyrrol-1-yl)benzoyl]-1-hydroxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1N(O)C(=O)CC1(S(O)(=O)=O)C(=O)C1=CC=CC(N2C(C=CC2=O)=O)=C1 SYGQYQGDQAUORG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GIMSJJHKKXRFGV-BYPJNBLXSA-N 4-amino-1-[(2r,3s,4r,5r)-3-fluoro-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-5-iodopyrimidin-2-one Chemical compound C1=C(I)C(N)=NC(=O)N1[C@H]1[C@@H](F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 GIMSJJHKKXRFGV-BYPJNBLXSA-N 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 1
- 206010001367 Adrenal insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 208000003120 Angiofibroma Diseases 0.000 description 1
- 102000008873 Angiotensin II receptor Human genes 0.000 description 1
- 108050000824 Angiotensin II receptor Proteins 0.000 description 1
- 102100034278 Annexin A6 Human genes 0.000 description 1
- 108090000656 Annexin A6 Proteins 0.000 description 1
- 108700031308 Antennapedia Homeodomain Proteins 0.000 description 1
- 101710145634 Antigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 1
- 102100021569 Apoptosis regulator Bcl-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 1
- 208000037260 Atherosclerotic Plaque Diseases 0.000 description 1
- 108091012583 BCL2 Proteins 0.000 description 1
- 239000005711 Benzoic acid Substances 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 244000056139 Brassica cretica Species 0.000 description 1
- 235000003351 Brassica cretica Nutrition 0.000 description 1
- 235000003343 Brassica rupestris Nutrition 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 108010063916 CD40 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 108010029697 CD40 Ligand Proteins 0.000 description 1
- 102100032937 CD40 ligand Human genes 0.000 description 1
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 1
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 1
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 1
- 102100029761 Cadherin-5 Human genes 0.000 description 1
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical class [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000016362 Catenins Human genes 0.000 description 1
- 108010067316 Catenins Proteins 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000032544 Cicatrix Diseases 0.000 description 1
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000004510 Collagen Type VII Human genes 0.000 description 1
- 108010017377 Collagen Type VII Proteins 0.000 description 1
- 244000205754 Colocasia esculenta Species 0.000 description 1
- 235000006481 Colocasia esculenta Nutrition 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 1
- 240000008067 Cucumis sativus Species 0.000 description 1
- 235000010799 Cucumis sativus var sativus Nutrition 0.000 description 1
- 208000000280 Cyclic neutropenia Diseases 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 1
- HOOWCUZPEFNHDT-UHFFFAOYSA-N DHPG Natural products OC(=O)C(N)C1=CC(O)=CC(O)=C1 HOOWCUZPEFNHDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000011724 DNA Repair Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010076525 DNA Repair Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 101710172390 DNA ligase Proteins 0.000 description 1
- 101710111492 DNA repair polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 101100481404 Danio rerio tie1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 108010024212 E-Selectin Proteins 0.000 description 1
- 102100023471 E-selectin Human genes 0.000 description 1
- 229920003345 Elvax® Polymers 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108010041308 Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- 102400000686 Endothelin-1 Human genes 0.000 description 1
- 101800004490 Endothelin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101710189136 Envelope fusion protein Proteins 0.000 description 1
- 101710181478 Envelope glycoprotein GP350 Proteins 0.000 description 1
- 108010044099 Ephrin-B1 Proteins 0.000 description 1
- 102100033946 Ephrin-B1 Human genes 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 1
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 102100029951 Estrogen receptor beta Human genes 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101150092822 FGF5 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 1
- 241000701087 Felid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 102000003971 Fibroblast Growth Factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 108050003237 Fibroblast growth factor 11 Proteins 0.000 description 1
- 102100028413 Fibroblast growth factor 11 Human genes 0.000 description 1
- 108090000046 Fibroblast growth factor 14 Proteins 0.000 description 1
- 102000003685 Fibroblast growth factor 14 Human genes 0.000 description 1
- 108090000378 Fibroblast growth factor 3 Proteins 0.000 description 1
- 102100028043 Fibroblast growth factor 3 Human genes 0.000 description 1
- 108090000381 Fibroblast growth factor 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100028073 Fibroblast growth factor 5 Human genes 0.000 description 1
- 108090000380 Fibroblast growth factor 5 Proteins 0.000 description 1
- 102000003972 Fibroblast growth factor 7 Human genes 0.000 description 1
- 102100037665 Fibroblast growth factor 9 Human genes 0.000 description 1
- 108090000367 Fibroblast growth factor 9 Proteins 0.000 description 1
- 102100023600 Fibroblast growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 101710182389 Fibroblast growth factor receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710086299 Fructose-2,6-bisphosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000223221 Fusarium oxysporum Species 0.000 description 1
- 101710113436 GTPase KRas Proteins 0.000 description 1
- 241000701047 Gallid alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 1
- 208000020322 Gaucher disease type I Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700004714 Gelonium multiflorum GEL Proteins 0.000 description 1
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 1
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 1
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 1
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 1
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N HA peptide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)C1=CC=C(O)C=C1 HVLSXIKZNLPZJJ-TXZCQADKSA-N 0.000 description 1
- 108010091938 HLA-B7 Antigen Proteins 0.000 description 1
- 102100039165 Heat shock protein beta-1 Human genes 0.000 description 1
- 101710100504 Heat shock protein beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 1
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 description 1
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 description 1
- 102400001369 Heparin-binding EGF-like growth factor Human genes 0.000 description 1
- 208000007514 Herpes zoster Diseases 0.000 description 1
- 241000700586 Herpesviridae Species 0.000 description 1
- 102000017013 Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein A1 Human genes 0.000 description 1
- 108010014594 Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein A1 Proteins 0.000 description 1
- 101710123026 High molecular weight antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000821968 Homo sapiens Electrogenic sodium bicarbonate cotransporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001010910 Homo sapiens Estrogen receptor beta Proteins 0.000 description 1
- 101001052035 Homo sapiens Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 101001060261 Homo sapiens Fibroblast growth factor 7 Proteins 0.000 description 1
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 1
- 101001033279 Homo sapiens Interleukin-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 description 1
- 101000835745 Homo sapiens Teratocarcinoma-derived growth factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000622304 Homo sapiens Vascular cell adhesion protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001082397 Human adenovirus B serotype 3 Hexon-associated protein Proteins 0.000 description 1
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 1
- 206010020575 Hyperammonaemia Diseases 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 102000038455 IGF Type 1 Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010031794 IGF Type 1 Receptor Proteins 0.000 description 1
- 101150062179 II gene Proteins 0.000 description 1
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102100023915 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 1
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 1
- 108010008212 Integrin alpha4beta1 Proteins 0.000 description 1
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 1
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 1
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010002335 Interleukin-9 Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 101710198693 Invasin Proteins 0.000 description 1
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 229930064664 L-arginine Natural products 0.000 description 1
- 235000014852 L-arginine Nutrition 0.000 description 1
- 108010001831 LDL receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102100024640 Low-density lipoprotein receptor Human genes 0.000 description 1
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 1
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 1
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 1
- 101001133631 Lysinibacillus sphaericus Penicillin acylase Proteins 0.000 description 1
- 102000000440 Melanoma-associated antigen Human genes 0.000 description 1
- 108050008953 Melanoma-associated antigen Proteins 0.000 description 1
- 241001502481 Meleagrid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 108010036176 Melitten Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 235000006679 Mentha X verticillata Nutrition 0.000 description 1
- 235000002899 Mentha suaveolens Nutrition 0.000 description 1
- 235000001636 Mentha x rotundifolia Nutrition 0.000 description 1
- 206010027406 Mesothelioma Diseases 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 101000859568 Methanobrevibacter smithii (strain ATCC 35061 / DSM 861 / OCM 144 / PS) Carbamoyl-phosphate synthase Proteins 0.000 description 1
- 101150076359 Mhc gene Proteins 0.000 description 1
- 229920000168 Microcrystalline cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000219470 Mirabilis Species 0.000 description 1
- 108010008707 Mucin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 description 1
- 208000002678 Mucopolysaccharidoses Diseases 0.000 description 1
- 206010056893 Mucopolysaccharidosis VII Diseases 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101100403745 Mus musculus Myot gene Proteins 0.000 description 1
- 101100481410 Mus musculus Tek gene Proteins 0.000 description 1
- 101100481406 Mus musculus Tie1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000005604 Myosin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010084498 Myosin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 101001055320 Myxine glutinosa Insulin-like growth factor Proteins 0.000 description 1
- BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N N-acetylcarnosine Chemical compound CC(=O)NCCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 BKAYIFDRRZZKNF-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 208000034827 Neointima Diseases 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 241000232901 Nephroma Species 0.000 description 1
- 102000011779 Nitric Oxide Synthase Type II Human genes 0.000 description 1
- 108010076864 Nitric Oxide Synthase Type II Proteins 0.000 description 1
- 102000008052 Nitric Oxide Synthase Type III Human genes 0.000 description 1
- 108010075520 Nitric Oxide Synthase Type III Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- XDMCWZFLLGVIID-SXPRBRBTSA-N O-(3-O-D-galactosyl-N-acetyl-beta-D-galactosaminyl)-L-serine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](OC[C@H]([NH3+])C([O-])=O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1OC1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 XDMCWZFLLGVIID-SXPRBRBTSA-N 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 102000016979 Other receptors Human genes 0.000 description 1
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 1
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- 208000031481 Pathologic Constriction Diseases 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- JNTOCHDNEULJHD-UHFFFAOYSA-N Penciclovir Chemical compound N1C(N)=NC(=O)C2=C1N(CCC(CO)CO)C=N2 JNTOCHDNEULJHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- 108010064851 Plant Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 229920002732 Polyanhydride Polymers 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 229920001710 Polyorthoester Polymers 0.000 description 1
- 102100033762 Proheparin-binding EGF-like growth factor Human genes 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 1
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 1
- 229940123573 Protein synthesis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010071563 Proto-Oncogene Proteins c-fos Proteins 0.000 description 1
- 102000007568 Proto-Oncogene Proteins c-fos Human genes 0.000 description 1
- 101000781681 Protobothrops flavoviridis Disintegrin triflavin Proteins 0.000 description 1
- 101000918244 Pseudoalteromonas phage PM2 Peptidoglycan hydrolase P7 Proteins 0.000 description 1
- 101001120093 Pseudoalteromonas phage PM2 Protein P8 Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 101100084022 Pseudomonas aeruginosa (strain ATCC 15692 / DSM 22644 / CIP 104116 / JCM 14847 / LMG 12228 / 1C / PRS 101 / PAO1) lapA gene Proteins 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N Purine Natural products N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010037649 Pyogenic granuloma Diseases 0.000 description 1
- 229940123752 RNA synthesis inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 201000000582 Retinoblastoma Diseases 0.000 description 1
- 206010038933 Retinopathy of prematurity Diseases 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000001332 SRC Human genes 0.000 description 1
- 108060006706 SRC Proteins 0.000 description 1
- 101000767160 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Intracellular protein transport protein USO1 Proteins 0.000 description 1
- 241000282695 Saimiri Species 0.000 description 1
- 241000701026 Saimiriine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 206010039710 Scleroderma Diseases 0.000 description 1
- 108091081021 Sense strand Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 201000001828 Sly syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000004598 Small Nuclear Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010003165 Small Nuclear Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010087132 Sodium-Bicarbonate Symporters Proteins 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 241000256251 Spodoptera frugiperda Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 241001481798 Stochomys longicaudatus Species 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010042566 Superinfection Diseases 0.000 description 1
- 101150050863 T gene Proteins 0.000 description 1
- 206010042971 T-cell lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 208000027585 T-cell non-Hodgkin lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 description 1
- 108091005735 TGF-beta receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100026404 Teratocarcinoma-derived growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710177717 Terminase small subunit Proteins 0.000 description 1
- 101001099217 Thermotoga maritima (strain ATCC 43589 / DSM 3109 / JCM 10099 / NBRC 100826 / MSB8) Triosephosphate isomerase Proteins 0.000 description 1
- OAOIXPPCQSJBRI-UHFFFAOYSA-N Thioxanthine monophosphate Chemical group N1C(=O)NC(=S)C2=C1N(OP(O)(=O)O)C=N2 OAOIXPPCQSJBRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010043515 Throat cancer Diseases 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- 102000016715 Transforming Growth Factor beta Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000003932 Transgelin Human genes 0.000 description 1
- 108090000333 Transgelin Proteins 0.000 description 1
- 244000078912 Trichosanthes cucumerina Species 0.000 description 1
- 235000008322 Trichosanthes cucumerina Nutrition 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 1
- 102100039094 Tyrosinase Human genes 0.000 description 1
- 108060008724 Tyrosinase Proteins 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000002495 Uterine Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000008790 VE-cadherin Human genes 0.000 description 1
- 108010065667 Viral Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000726445 Viroids Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- MNOGBRROKHFONU-CJUKMMNNSA-N ac1l2wzw Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(NCCOP(O)(O)=O)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 MNOGBRROKHFONU-CJUKMMNNSA-N 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 208000017515 adrenocortical insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 1
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 1
- 102000007362 alpha-Crystallins Human genes 0.000 description 1
- 108010007908 alpha-Crystallins Proteins 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 229940069428 antacid Drugs 0.000 description 1
- 239000003159 antacid agent Substances 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000001458 anti-acid effect Effects 0.000 description 1
- 230000002785 anti-thrombosis Effects 0.000 description 1
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 1
- 230000001746 atrial effect Effects 0.000 description 1
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N bis(2-chloroethyl) sulfide Chemical compound ClCCSCCCl QKSKPIVNLNLAAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 108010049223 bryodin Proteins 0.000 description 1
- 229950003665 buciclovir Drugs 0.000 description 1
- DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N but-3-enoic acid;ethene Chemical compound C=C.OC(=O)CC=C DQXBYHZEEUGOBF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000011496 cAMP-mediated signaling Effects 0.000 description 1
- 102000006783 calponin Human genes 0.000 description 1
- 108010086826 calponin Proteins 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 238000013172 carotid endarterectomy Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 108091006116 chimeric peptides Proteins 0.000 description 1
- 210000001612 chondrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229940075614 colloidal silicon dioxide Drugs 0.000 description 1
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 1
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 108010045325 cyclic arginine-glycine-aspartic acid peptide Proteins 0.000 description 1
- 239000002619 cytotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N dexamethasone Chemical compound C1CC2=CC(=O)C=C[C@]2(C)[C@]2(F)[C@@H]1[C@@H]1C[C@@H](C)[C@@](C(=O)CO)(O)[C@@]1(C)C[C@@H]2O UREBDLICKHMUKA-CXSFZGCWSA-N 0.000 description 1
- 229960003957 dexamethasone Drugs 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K dioxido-sulfanylidene-sulfido-$l^{5}-phosphane Chemical compound [O-]P([O-])([S-])=S NAGJZTKCGNOGPW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000007646 directional migration Effects 0.000 description 1
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- XACKNLSZYYIACO-DJLDLDEBSA-N edoxudine Chemical compound O=C1NC(=O)C(CC)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 XACKNLSZYYIACO-DJLDLDEBSA-N 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 102000052116 epidermal growth factor receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108700015053 epidermal growth factor receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 1
- 125000005745 ethoxymethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 229960004396 famciclovir Drugs 0.000 description 1
- GGXKWVWZWMLJEH-UHFFFAOYSA-N famcyclovir Chemical compound N1=C(N)N=C2N(CCC(COC(=O)C)COC(C)=O)C=NC2=C1 GGXKWVWZWMLJEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010685 fatty oil Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 108060002895 fibrillin Proteins 0.000 description 1
- 102000013370 fibrillin Human genes 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 102000003684 fibroblast growth factor 13 Human genes 0.000 description 1
- 108090000047 fibroblast growth factor 13 Proteins 0.000 description 1
- 230000019305 fibroblast migration Effects 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- XRECTZIEBJDKEO-UHFFFAOYSA-N flucytosine Chemical compound NC1=NC(=O)NC=C1F XRECTZIEBJDKEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004413 flucytosine Drugs 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000005558 fluorometry Methods 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 239000008369 fruit flavor Substances 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 108010001671 galactoside 3-fucosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 108010062699 gamma-Glutamyl Hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 239000007903 gelatin capsule Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 1
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 1
- 201000011066 hemangioma Diseases 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004293 human mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000003463 hyperproliferative effect Effects 0.000 description 1
- 230000001969 hypertrophic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 1
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000012151 immunohistochemical method Methods 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 201000001371 inclusion conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000001320 lysogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- VDXZNPDIRNWWCW-JFTDCZMZSA-N melittin Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(N)=O)CC1=CNC2=CC=CC=C12 VDXZNPDIRNWWCW-JFTDCZMZSA-N 0.000 description 1
- SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N melphalan Chemical class OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(N(CCCl)CCCl)C=C1 SGDBTWWWUNNDEQ-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- 230000005906 menstruation Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229960001047 methyl salicylate Drugs 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical compound CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012737 microarray-based gene expression Methods 0.000 description 1
- 235000019813 microcrystalline cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008108 microcrystalline cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940016286 microcrystalline cellulose Drugs 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 230000000921 morphogenic effect Effects 0.000 description 1
- 206010028093 mucopolysaccharidosis Diseases 0.000 description 1
- 208000025919 mucopolysaccharidosis type 7 Diseases 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000012243 multiplex automated genomic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000010460 mustard Nutrition 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000003098 myoblast Anatomy 0.000 description 1
- YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N n-[3-[[6-[3-(trifluoromethyl)anilino]pyrimidin-4-yl]amino]phenyl]cyclopropanecarboxamide Chemical compound FC(F)(F)C1=CC=CC(NC=2N=CN=C(NC=3C=C(NC(=O)C4CC4)C=CC=3)C=2)=C1 YOHYSYJDKVYCJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021278 navy bean Nutrition 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 201000003142 neovascular glaucoma Diseases 0.000 description 1
- 208000025351 nephroma Diseases 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 230000000263 nonmitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001293 nucleolytic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 101150110245 ompC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150073640 ompF gene Proteins 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 1
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 1
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 description 1
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000004091 panning Methods 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 229960001179 penciclovir Drugs 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 101150009573 phoA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-N phosphoramidic acid Chemical compound NP(O)(O)=O PTMHPRAIXMAOOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000003014 phosphoric acid esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- SIOXPEMLGUPBBT-UHFFFAOYSA-N picolinic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=N1 SIOXPEMLGUPBBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 235000021118 plant-derived protein Nutrition 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 239000000106 platelet aggregation inhibitor Substances 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 150000004032 porphyrins Chemical class 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 108010043671 prostatic acid phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 230000003947 protein internalization Effects 0.000 description 1
- 239000000007 protein synthesis inhibitor Substances 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012429 reaction media Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940081974 saccharin Drugs 0.000 description 1
- 235000019204 saccharin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000901 saccharin and its Na,K and Ca salt Substances 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 1
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 201000010106 skin squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036262 stenosis Effects 0.000 description 1
- 208000037804 stenosis Diseases 0.000 description 1
- 230000002966 stenotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 150000003457 sulfones Chemical class 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 101150098170 tat gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 229940126585 therapeutic drug Drugs 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 239000002562 thickening agent Substances 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 208000008732 thymoma Diseases 0.000 description 1
- FUSNMLFNXJSCDI-UHFFFAOYSA-N tolnaftate Chemical compound C=1C=C2C=CC=CC2=CC=1OC(=S)N(C)C1=CC=CC(C)=C1 FUSNMLFNXJSCDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 206010044325 trachoma Diseases 0.000 description 1
- 235000010487 tragacanth Nutrition 0.000 description 1
- 239000000196 tragacanth Substances 0.000 description 1
- 229940116362 tragacanth Drugs 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 108091006107 transcriptional repressors Proteins 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012250 transgenic expression Methods 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- VSQQQLOSPVPRAZ-RRKCRQDMSA-N trifluridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C(F)(F)F)=C1 VSQQQLOSPVPRAZ-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 229960003962 trifluridine Drugs 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 229940030325 tumor cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 231100000588 tumorigenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000000381 tumorigenic effect Effects 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 206010046766 uterine cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 1
- 230000006442 vascular tone Effects 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 230000006490 viral transcription Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
- C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
- C40B40/00—Libraries per se, e.g. arrays, mixtures
- C40B40/02—Libraries contained in or displayed by microorganisms, e.g. bacteria or animal cells; Libraries contained in or displayed by vectors, e.g. plasmids; Libraries containing only microorganisms or vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
- A61K47/6901—Conjugates being cells, cell fragments, viruses, ghosts, red blood cells or viral vectors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/50—Fibroblast growth factor [FGF]
- C07K14/503—Fibroblast growth factor [FGF] basic FGF [bFGF]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
- C12N15/1037—Screening libraries presented on the surface of microorganisms, e.g. phage display, E. coli display
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
- C12N2795/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
- C12N2795/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2795/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
- C12N2795/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2795/10045—Special targeting system for viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/14011—Details ssDNA Bacteriophages
- C12N2795/14111—Inoviridae
- C12N2795/14122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
- C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
- C12N2810/80—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates
- C12N2810/85—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian
- C12N2810/851—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from vertebrates mammalian from growth factors; from growth regulators
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области медицинской генетики. Сущность изобретения составляют нитевидные фаговые частицы, имеющие на своей поверхности лиганд. Эти частицы используют для доставки к клеткам терапевтического гена. Лиганд является протеином, образованным при слиянии с фаговым капсидным протеином, ковалентно конъюгированным с фаговыми частицами. Технический результат: расширение арсенала средств генной терапии. 6 с. и 39 з.п.ф-лы, 9 ил., 1 табл.
Description
Изобретение относится в общих чертах к доставке генов и более конкретно к получению и использованию модифицированных лигандами бактериофагов для доставки генов, которые изменяют фенотип, функции, генную экспрессию, или жизнеспособность клеток с терапевтическими целями.
Предпосылки изобретения
В одном из подходов генная терапия предпринимает попытки делать клетки мишенью специфическим образом. Так терапевтический ген связывают каким-либо образом с направляющей молекулой для того, чтобы доставить ген в намеченную клетку или ткань. Современные методы обычно включают связывание направляющей молекулы, такой как лиганд или антитело, которое распознает интернализующий рецептор, либо с "голой" ДНК, либо с клеточным вирусом млекопитающего (например, аденовирусом), содержащим целевой ген. Если используют голую ДНК, ее следует конденсировать in vitro в компактную геометрическую форму для проникновения в клетку. Для нейтрализации заряда на ДНК и конденсации ее в тороидную структуру обычно используют поликатион, такой как полилизин. Однако такой процесс конденсации не совсем понятен, и его трудно контролировать, что делает приготовление гомогенных генных терапевтических лекарств крайне проблематичным.
В одном из подходов генная терапия предпринимает попытки делать клетки мишенью специфическим образом. Так терапевтический ген связывают каким-либо образом с направляющей молекулой для того, чтобы доставить ген в намеченную клетку или ткань. Современные методы обычно включают связывание направляющей молекулы, такой как лиганд или антитело, которое распознает интернализующий рецептор, либо с "голой" ДНК, либо с клеточным вирусом млекопитающего (например, аденовирусом), содержащим целевой ген. Если используют голую ДНК, ее следует конденсировать in vitro в компактную геометрическую форму для проникновения в клетку. Для нейтрализации заряда на ДНК и конденсации ее в тороидную структуру обычно используют поликатион, такой как полилизин. Однако такой процесс конденсации не совсем понятен, и его трудно контролировать, что делает приготовление гомогенных генных терапевтических лекарств крайне проблематичным.
Напротив, вирусы млекопитающих могут упаковывать ДНК в однородные частицы, но из-за их сложности они представляют сложности с точки зрения генетической манипуляции и получение вирусных частиц для доставки генов является дорогостоящей и длительной процедурой. Бактериофаги предлагают привлекательную альтернативу в качестве природного способа конденсации и упаковки терапевтических ДНК и благодаря их простоте они достаточно легко подвергаются генетическим манипуляциям (при сохранении функций). Более того, так как бактериофаг представляет чрезвычайно простой объект, крупномасштабное получение векторов на основе фагов для доставки генов окажется гораздо проще и дешевле, нежели получение, например, вирусных векторов млекопитающих.
Бактериофаг, такой как лямбда и нитевидный фаг, иногда использовали при попытках перенести ДНК в клетки млекопитающих. Вообще было обнаружено, что трансдукция лямбда является относительно редким актом и экспрессия репортерного гена слаба. В попытке повысить эффективность трансдукции были использованы способы, использующие фосфат кальция или липосомы (которые специфически не направлены на рецептор клеточной поверхности) используют в связи с лямбда. Перенос гена наблюдали за счет лямбда фага, используя соосаждение с фосфатом кальция (Ishiura, M. et al., Mol. Cell. Biol., 2:607-616, 1982), или за счет нитевидного фага, используя DEAE-декстран или липополиамин (Yokoyama-Kobayashi и Kato, Biochem. Biophys. Res. Comm. 192:935-939, 1993; Yokoyama-Kobayashi и Kato, Anal. Biochem. 223:130-134, 1994). Однако эти способы введения ДНК в клетки млекопитающих не практичны для применения в генной терапии, так как эффективность трансфекции имеет тенденцию быть слабой, неспецифичной, и такая трансфекция не только сложна, но и непредсказуема в отношении типа клеток. Необходимы более надежные средства для нацеливания векторов на специфические клетки (или рецепторы) и обеспечение гарантий степени терапевтической полезности доставки генов и их экспрессии, если бактериофаги необходимо оформить в векторы, пригодные для терапевтических применений.
Попытки направить нитевидный фаг к клеткам, используя слияние циклического RGD пептида и протеина оболочки фага или слияния пептид-оболочковый протеин имели ограниченный успех. Хотя фаги были нацелены и интернализованы, экспрессия гена фага не ожидалась и не была отмечена (Hart et al., J. Biol. Chem. 269:12468-12474, 1994; Barry et al., Nature Med. 2:299-305, 1996). Хотя обычно понятно, что RGD пептидная последовательность, используемая Hart с сотр. связывается с интегринами, Hart описывает осуществляемый за счет RGD захват фага как процесс, аналогичный захвату фагоцитом бактерии за счет протеина инвазина (RGD протеина); аденовирусы используют связывание RGD-инвазин в связи со связыванием лиганд-рецептор для интернализации. Поэтому неясно, что связывание RGD-интегрин облегчает проникновение пептида или слияние протеина за счет рецепторов опосредствованного эндосомального механизма, который, как было показано, обеспечивает превосходные результаты.
Так, для случаев применения доставки генов были бы весьма выгодны способы и терапевтические агенты, которые просты для получения и осуществления цели, эффективны и направляются к специфическим клеткам. Аналогично были бы необходимы векторы, которые доставляют терапевтически полезные количества представляющих интерес генов при различных способах введения, включая пероральные способы. Удовлетворяя эти давние нужды, в настоящем изобретении предложены композиции и способы доставки генов с использованием бактериофага, который экспрессирует лиганд и несет представляющий интерес ген, а также обеспечивает другие связанные с этим преимущества.
Краткое содержание изобретения
В одном из аспектов настоящего изобретения предложен способ доставки генов, включающий введение пациенту нитевидных фаговых частиц, представляющих лиганд на своей поверхности, где вектор внутри фага кодирует генный продукт под контролем промотора.
В одном из аспектов настоящего изобретения предложен способ доставки генов, включающий введение пациенту нитевидных фаговых частиц, представляющих лиганд на своей поверхности, где вектор внутри фага кодирует генный продукт под контролем промотора.
В родственных аспектах в изобретении предложены способы лечения опухолей, заболеваний клеток гладкой мускулатуры или ангиогенных заболеваний, включающие введение пациенту фармацевтической композиции, включающей физиологически приемлемый буфер и частицы нитевидного фага, представляющие лиганды на своих поверхностях, где геном фага кодирует терапевтический генный продукт под контролем промотора.
В предпочтительном варианте лигандом является полипептид, реакционноспособный с FGF рецептором и в наиболее предпочтительном варианте лигандом служит FGF-2. В других вариантах лигандом является антитело и предпочтительно одноцепочечное антитело.
Лиганд может быть генетически слит с протеином фагового капсида или химически конъюгирован для образования ковалентного присоединения или присоединения методом "сэндвича". Обычно капсидным протеином для генного слияния является ген III или ген VIII.
В предпочтительном варианте эндосомальный фрагмент ускользания включен в лиганд или другим способом представлен на поверхности фагов. Этот лиганд или фаг могут также включать далее последовательность ядерной локализации.
В другом предпочтительном варианте фаговым геномом является фагемид.
В предпочтительных вариантах терапевтический генный продукт выбирают из группы, состоящей из протеина, рибозима и антисмыслового олигонуклеотида, а в других вариантах терапевтический генный продукт является цитотоксическим агентом (например протеином, инактивирующим рибосому, таким как сапорин), или является антителом, которое связывается с HER2/neu.
В других аспектах в настоящем изобретении предложена фармацевтическая композиция, включающая физиологически приемлемый буфер и нитевидные фаговые частицы, представляющие лиганд на своих поверхностях, где фаговый геном кодирует терапевтический генный продукт под контролем промотора, и нитевидные фаговые частицы, представляющие лиганд на своей поверхности, где фаговый геном кодирует терапевтический генный продукт под контролем промотора.
Эти и другие аспекты настоящего изобретения станут очевидны со ссылкой на следующее подробное описание и прилагаемые чертежи. Кроме того, представленные далее различные ссылки, в которых более подробно описаны некоторые процедуры и композиции (например, плазмиды и т.д.), включены сюда полностью для ссылки.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1А и 1В схематически представляют фаговые векторы для трансдукции клеток млекопитающих. На фиг.1А представлен родительский фаговый вектор с дикого типа pIII оболочковым протеином. Основным вектором является М13 геном с геном устойчивости к ампициллину (AmpR) и GFP экспрессионной кассетой, встроенной в интергенный участок между pIV и рII (MEGFP3). Вектор MEGFP3 содержит следующие элементы: ori-CMV, SV40 начало репликации и CMV промотор; EGFP, усиленный ген флуоресцирующего зеленым протеина; BGH, и последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста. Фиг.1В представляет FGF-pIII слияние, представляющее фаг (MF2/1G3).
Фиг. 1А и 1В схематически представляют фаговые векторы для трансдукции клеток млекопитающих. На фиг.1А представлен родительский фаговый вектор с дикого типа pIII оболочковым протеином. Основным вектором является М13 геном с геном устойчивости к ампициллину (AmpR) и GFP экспрессионной кассетой, встроенной в интергенный участок между pIV и рII (MEGFP3). Вектор MEGFP3 содержит следующие элементы: ori-CMV, SV40 начало репликации и CMV промотор; EGFP, усиленный ген флуоресцирующего зеленым протеина; BGH, и последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста. Фиг.1В представляет FGF-pIII слияние, представляющее фаг (MF2/1G3).
Фиг.2 представляет график, демонстрирующий количество клеток, экспрессирующих флуоресцирующий зеленым протеин, когда FGF-фаг инкубирует с клетками в присутствии повышенного количества свободных FGF.
Фиг.3А и 3В представляют графики, демонстрирующие экспрессию репортерных генов GFP (3А) и βGal (3B) в целевых клетках как функцию титра фага.
Фиг. 4А-4D являются графическим представлением, демонстрирующим специфичность нацеливания FGF2.
Фиг. 5 представляет график, демонстрирующий количество FGF позитивных клеток, образующихся после инкубирования структур полилизин+фаг или FGF-полилизин+фаг.
Фиг. 6 представляет сканированное изображение результатов Вестернблоттинга, представляющего определение протеина слияния FGF2-pIII в протеиновых экстрактах из очищенного FGF2-фага (FGF2-MEGFP).
Фиг.7А и 7В представляют графики в виде прямоугольников определения FGF2 на FGF2-фаге методом ELISA. Фиг.7А представляет количество фагового протеина, определенное с использованием как пустого вектора MEGFP3, так и конструкции слияния FGF2 (FGF2-MEGFP). Фиг.7В представляет количество FGF2, определенное на фаге, содержащем конструкцию слияния.
Фиг. 8А и 8В представляют графики в виде прямоугольников, представляющие трансдукцию COS клеток FGF2-фагом.
Фиг. 9А и 9В представляют изображение, полученное с помощью флуоресцентной микроскопии, стабильных трансфектантов, экспрессирующих репортерный ген GFP.
Подробное описание изобретения
Как было указано ранее, настоящее изобретение в основном относится к способам доставки терапевтических агентов к целевым клеткам и тканям сайт-специфическим образом и к конструкциям, пригодным для таких применений. Одним из применений раскрытого изобретения является терапия с использованием замещения или усиления гена. Проще говоря, описанные здесь векторы и способы можно использовать для лечения индивидуумов, ткани которых лишены способности продуцировать достаточные количества некоторых важных молекул и соединений, например необходимых ферментов. Другим применением настоящего изобретения является использование способности описанных здесь векторов нацеливать клетки с повышенной специфичностью, что делает такие векторы идеальными для лечения различных опухолей и других злокачественных образований.
Как было указано ранее, настоящее изобретение в основном относится к способам доставки терапевтических агентов к целевым клеткам и тканям сайт-специфическим образом и к конструкциям, пригодным для таких применений. Одним из применений раскрытого изобретения является терапия с использованием замещения или усиления гена. Проще говоря, описанные здесь векторы и способы можно использовать для лечения индивидуумов, ткани которых лишены способности продуцировать достаточные количества некоторых важных молекул и соединений, например необходимых ферментов. Другим применением настоящего изобретения является использование способности описанных здесь векторов нацеливать клетки с повышенной специфичностью, что делает такие векторы идеальными для лечения различных опухолей и других злокачественных образований.
Как здесь подробно описано, предпочтительные векторы для использования для целевой доставки терапевтических агентов включают нитевидные фаговые частицы, экспрессирующие один или более из предварительно отобранных лигандов на поверхности вирусных частиц независимо от способа каким прикреплены лиганды. Поэтому независимо от того, прикреплены ли лиганды за счет ковалентной связи, или за счет протеина слияния, целевые фаговые векторы настоящего изобретения способны доставить терапевтические нуклеотидные последовательности к целевым клеткам.
Нитевидные фаговые частицы являются особенно полезными векторами, как здесь раскрыто, частично из-за того, что они не имеют нативного тропизма у млекопитающих. Поэтому существует необходимость снятия нативного тропизма у фагового вектора для того, чтобы сделать его полезным для терапевтических применений, что необходимо для чаще используемых ретровирусных векторов. Векторы на основе фагов настоящего изобретения также обладают целым рядом преимуществ, включая, например, способность принимать крупные объекты; способность точно достигать специфические клеточные рецепторы, не повреждая здоровые клетки; и способность доставлять терапевтические нуклеотидные последовательности к ядрам целевых клеток, усиливая тем самым экспрессию терапевтических последовательностей в целевых клетках.
Вышеуказанные характеристики и другие, которые будут раскрыты более подробно далее, делают описываемые здесь векторы особенно привлекательными для применений в генной терапии, так как их легко можно сконструировать для упаковки, транспорта и доставки выбранных экспрессируемых генов в клетки, ткани или органы пациента, нуждающегося в лечении. Как было указано ранее, раскрытые здесь векторы и способы особенно подходят для лечения болезненных состояний, которые не поддаются более "обычному" терапевтическому лечению.
I. БАКТЕРИОФАГ
А. Нитевидные бактериофаги
Нитевидные фаги охватывают группу бактериофагов, которые способны инфицировать различные грам-отрицательные бактерии за счет взаимодействия с концом F пилуса. Хорошо известные нитевидные фаги включают М13, f1 и fd.
А. Нитевидные бактериофаги
Нитевидные фаги охватывают группу бактериофагов, которые способны инфицировать различные грам-отрицательные бактерии за счет взаимодействия с концом F пилуса. Хорошо известные нитевидные фаги включают М13, f1 и fd.
Геномы этих фагов представляют одноцепочечные ДНК, но реплицируются через двухцепочечную форму. Фаговые частицы собраны в бактериях и выделяются в среду. Так как бактерии продолжают расти и делиться, хотя и с меньшей скоростью, чем неинфицированные клетки, титры фагов достигают относительно высоких значений. Более того, на репликацию и сборку, по-видимому, не влияет размер генома. Благодаря своему строению и жизненному циклу нитевидные фаги стали ценным дополнением к арсеналу инструментов молекулярной биологии.
Дальнейшее развитие нитевидных фаговых систем привело к разработке клонирующих векторов, называемых фагемидами, которые объединяют отличительные особенности плазмид и фагов. Фагемиды содержат начало репликации и сигнал упаковки нитевидного фага так, же, как начало репликации плазмид. Обычно присутствуют также и другие элементы, применяемые для клонирования и/или экспрессии молекул чужеродной нуклеиновой кислоты. Такие элементы включают, без ограничения, селектируемые гены, сайт множественного клонирования, праймерные последовательности. Фагемиды могут быть реплицированы как и для других плазмид, и могут быть упакованы в фаговые частицы после освобождения хелперным нитевидным фагом. В том смысле, как здесь использован, термин "нитевидные фаговые частицы" относится к частицам, содержащим либо фаговый геном, либо фагемидный геном. Эти частицы могут содержать другие молекулы в добавление к нитевидным капсидным протеинам.
Нитевидные фаги были разработаны как системы для представления протеинов и пептидов на поверхности фаговых частиц. Путем встраивания молекул нуклеиновой кислоты в гены для фаговых капсидных протеинов получают протеины слияния, которые собраны в капсид (Smith, Science 228:1315, 1985; патент США 5223409). В результате чужеродный протеин или пептид оказывается на поверхности фаговой частицы. Способы и методики для представления фага хорошо известны специалистам (см. также Кау et al., Phage Display of Peptides и Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, San Diego, 1996).
В. Векторы
Нитевидные фаговые векторы обычно подразделяют на две категории: фаговый геном и фагемиды. Каждый тип вектора можно использовать в контексте настоящего изобретения, предпочтительно использовать фаговые геномные векторы. Доступны многие такие коммерческие векторы. Например, можно использовать серии pEGFP векторов (Clontech; Palo Alto, СА), Ml3mp векторы (Pharmacia Biotech, Sweden), pCANTAB 5E (Pharmacia Biotech), pBluescript серии (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) и многие другие. Одним из наиболее подходящих коммерческих векторов является pEGFP-N1, который содержит флуоресцирующий зеленым протеин (GFP) под контролем CMV предраннего промотора. Эта плазмида включает также SV40 начало репликации для усиления генной экспрессии за счет обеспечения репликации плазмиды с большим числом копий в клетках, которые вырабатывают SV40 Т антиген.
Нитевидные фаговые векторы обычно подразделяют на две категории: фаговый геном и фагемиды. Каждый тип вектора можно использовать в контексте настоящего изобретения, предпочтительно использовать фаговые геномные векторы. Доступны многие такие коммерческие векторы. Например, можно использовать серии pEGFP векторов (Clontech; Palo Alto, СА), Ml3mp векторы (Pharmacia Biotech, Sweden), pCANTAB 5E (Pharmacia Biotech), pBluescript серии (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) и многие другие. Одним из наиболее подходящих коммерческих векторов является pEGFP-N1, который содержит флуоресцирующий зеленым протеин (GFP) под контролем CMV предраннего промотора. Эта плазмида включает также SV40 начало репликации для усиления генной экспрессии за счет обеспечения репликации плазмиды с большим числом копий в клетках, которые вырабатывают SV40 Т антиген.
Другие векторы разработаны учеными (см. например. Smith, в Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors и their Uses, Rodriquez и Denhardt, eds. , Butterworth, Boston, с. 61-84, 1988), или могут быть сконструированы с использованием стандартных способов (Sarabrook et al., Molecular Biology: A Laboratory Approach, Cold Spring Harbor, NY, 1989; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing, NY, 1995) в соответствии с обсуждаемыми далее принципами.
Для использования в настоящем изобретении вектор, как минимум, должен принять кассету, содержащую промотор и терапевтический ген (трансген) в функциональной связи. Можно использовать любой промотор, который активен в клетках, которые необходимо трансфектировать. Этот вектор должен также содержать начало репликации фага и сигнал упаковки для сборки векторной ДНК с капсидными протеинами.
В конструкцию могут быть также включены другие элементы. В предпочтительных вариантах конструкция включает последовательность терминации транскрипции, включая последовательность полиаденилирования, сайты сплайсинга донора и акцептора и энхансер. Могут быть также использованы другие элементы, применимые для экспрессии и сохранения конструкции в клетках млекопитающих или в других эукариотных клетках (например, начало репликации). Так как эти конструкции удобно получать в бактериальных клетках, в них включают элементы, которые необходимы или усиливают размножение в бактериях. Такие элементы включают начало репликации, селектируемый маркер и т.п. (см. обсуждение далее).
Промотор, который контролирует экспрессию трансгена, должен быть активным или активируемым в целевой клетке. В рамках настоящего изобретения целевой клеткой может быть клетка млекопитающего, птицы, растения и т.п. Большая часть применений настоящего изобретения включает трансфекцию клеток млекопитающих, включая человека, собак, кошек, лошадей и т.п. Выбор промотора будет зависеть частично от типа целевой клетки и степени или типа необходимого контроля. Промоторы, которые являются подходящими в контексте настоящего изобретения, включают, но ими не ограничиваются, конститутивные, индуцируемые, ткане-специфические, специфические в отношении типа клеток, временно-специфические или событийно-специфические.
Примеры конститутивных или неспецифических промоторов включают SV40 ранний промотор (патент США 5118627), SV40 поздний промотор (патент США 5118627), CMV ранний генный промотор (патент США 5168062), промотор вируса бычьей папилломы, и промотор аденовируса. В добавлении к вирусным промоторам в контексте настоящего изобретения применимы также клеточные промоторы. В частности полезны клеточные промоторы для так называемых генов "домашнего хозяйства" (например, β-актин). Вирусные промоторы обычно являются более сильными промоторами, нежели клеточные промоторы.
Ткане-специфические промоторы особенно подходят для экспрессии в эндотелиальных клетках. Используя один из этого класса промоторов, можно достичь дополнительной степени специфичности. Например, эндотелиально-специфические промоторы особенно полезны в отношении пролиферативных заболеваний, включающих эндотелиальные клетки. Примеры ткане-специфических или клетко-специфических промоторов включают промоторы, специфические в отношении лимфоидных и фибробластных клеток, специфические в отношении печени, почек, гепатоцит-специфические и т.п.
Можно также использовать индуцируемые промоторы. Эти промоторы включают MMTV LTR (РСТ WO 91/13160), индуцируемый дексаметазоном, металлотионеин, индуцируемый тяжелыми металлами, и промоторы с элементами, реагирующими на сАМР, промоторы, индуцируемые сАМР термошоком. Используя индуцируемые промоторы, в клетку можно доставить нуклеиновую кислоту, и она будет оставаться неактивной до добавления индуктора. Это позволяет осуществлять дальнейший контроль за временем продуцирования генного продукта.
Событийного типа специфические промоторы являются активными или усиливающими регуляцию только после этого события, такие как опухолегеничность, или инфицирование вирусом. HIV LTR является хорошо известным событийно-специфическим промотором. Этот промотор является неактивным, если только не присутствует tat генный продукт, что происходит после инфицирования вирусом. Некоторые событийного типа промоторы являются также ткане-специфическими.
Кроме того, можно использовать промоторы, которые согласованно регулируются с конкретным клеточным геном. Например, можно использовать промоторы генов, которые согласованно экспрессируются, когда экспрессируется конкретный FGF рецепторный ген. Затем нуклеиновая кислота будет транскрибирована, когда экспрессируется FGF рецептор, такой как FGFR1, а не тогда, когда экспрессируется FGFR2. Такой тип промотора особенно полезен, если известна схема FGF рецепторной экспрессии в конкретной ткани, так что специфические клетки в этой ткани могут быть убиты после транскрипции гена цитотоксического агента, причем не будут затронуты окружающие ткани.
Примеры промоторов, здесь обсуждающихся, включают промоторы для альфафетопротеина, альфа-актин, мио D, карциноэмбрионный антиген VEGF-рецептор (GenBank регистрационный Х89776); FGF рецептор; ТЕК или tie 2 (GenBank регистрационный L06139); tie (GenBank регистрационные Х60954; S89716); рецептор урокиназы (GenBank регистрационный S78532); Е- и Р-селектины (GenBank регистрационные М64485; L01874); VCAM-1 (GenBank регистрационный M92431): эндоглин (GenBank регистрационный HSENDOG): эндосиалин (Rettig et al., PNAS 89: 10832, 1992); альфа V-бета3 интегрин (Villa-Garcia et al., Blood 3:668, 1994; Donahue et al., BBA 1219:228, 1994); эндотелин-1 (GenBank регистрационные M25377; J04819; J05489); ICAM-3 (GenBank регистрационный S50015); E9 антиген (Wang et al., Int. J. Cancer 54:363, 1993); фактор von Willebrand (GenBank регистрационный HUMVWEI; HUMVWFA); CD44 (GenBank регистрационный HUMCD44B); CD40 (GenBank регистрационный HACD40L; HSCD405FR); сосудисто-эндотелиальный кадхерин (Martin-Padura et al., J.Pathol. 175:51, 1995); notch 4 (Uyttendaele et al., Development 122:2251, 1996), связанный с меланомой высокомолекулярный антиген; специфический антиген-1 простаты, пробазин, FGF рецептор, VEGF рецептор, erb B2; erb B3; erb B4; MUC-1; HSP-27; int-1; int-2, CEA, HBEGF рецептор; EGF рецептор; тирозиназа, MAGE, IL-2, IL-2 рецептор; фосфатаза простатовой кислоты, пробастин, специфический мембранный антиген простаты, альфа-кристаллин, EGFR, PDGF рецептор, рецептор интегрина, α-актин, SM1 и SM2 тяжелые цепи миозина, калпонин-h1, SM22 альфа рецептор ангиотензина, IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, тяжелая цепь иммуноглобулина, легкая цепь иммуноглобулина, CD4, и т.п. применимы в контексте настоящего изобретения.
В дополнении к промотору можно встроить репрессорные последовательности, негативные регуляторы или ткане-специфические сайленсеры для уменьшения неспецифической экспрессии цитоцидов или пролекарств. Множественные репрессорные элементы можно встроить в промоторный участок. Репрессия транскрипции не зависит от ориентации репрессорных элементов или расстояния от промотора. Одним из типов репрессорных последовательностей является изоляторная последовательность. Такие последовательности ингибируют транскрипцию (Dunaway et al. , Mol. Cell. Biol 17: 182-9, 1997; Gdula et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA PJ:9378-83, 1996, Chan et al., J. Virol 70:5312-28, 1996; Scott и Geyer. EMBOJ 14:6258-67, 1995; Kalos и Fournier, Mol. Cell. Biol 15:198-207, 1995; Chung et al., Cell 74:505-14, 1993) и будут подавлять фоновую транскрипцию.
Негативные регуляторные элементы были охарактеризованы в промоторных участках ряда различных генов. Функции репрессорных элементов как репрессоров транскрипции в отсутствии факторов, таких как стероиды, подобны NSE в промоторном участке гена овальбумина (Haecker et al., Mol. Endocrinology 9: 1113-1126, 1995). Эти негативные регуляторные элементы связывают специфические протеиновые комплексы из фаллопиевых труб, ни один из которых не чувствителен к стероидам. Три различные элемента расположены в промоторе гена овальбумина. Олигонуклеотиды, соответствующие участку этих элементов, подавляют вирусную транскрипцию ТК репортера. Один из сайленсерных элементов разделяет идентичность последовательности с сайленсерами в других генах (TCTCTCCNA).
Репрессорные элементы были также идентифицированы в промоторном участке гена коллагена II. Исследования задержки в геле показали, что ядерные факторы из HeLa клеток связываются специфически с ДНК фрагментами, содержащими сайленсерный участок, тогда как экстракты ядер хондроцитов не демонстрируют какой-либо связывающей активности (Savanger et al., J.Biol. Chem. 265 (12): 6669-6674, 1990). Было также показано, что репрессорные элементы регулируют транскрипцию в гене карбамоил-фосфат синтетазы (Goping et al., Nucleic Acid Research 23(10): 1717-1721, 1995). Этот ген экспрессируется только в двух различных типах клеток, гепатоцитах и эпителиальных клетках слизистой оболочки кишечника. Негативные регуляторные участки были также идентифицированы в промоторном участке гена холинацетил-трансферазы, промоторе альбумина (Нu et al. , J.Cell Growth Differ. 3(9):577-588, 1992), промоторе гена фосфоглицерат-киназы (PGK-2) (Misuno et al., Gene 119(2):293-297, 1992), и в гене 6-фосфофрукто-2-киназа/фруктозо-2,6-бисфосфатазы, где негативный регуляторный элемент ингибирует транскрипцию в непеченочных клеточных линиях (Lemaigre et al., Mol. Cell Biol. 11(2):1099-1106). Кроме того, был идентифицирован негативный регуляторный элемент Тsе-1 в ряде печень-специфических генов, включая тирозинамино-трансферазу (ТАТ). Экспрессия ТАТ гена специфична и индуцируется как глюкокортикоидными, так и сАМР сигнальными путями. Было показано, что сАМР реагирующий элемент (CRE) является мишенью для репрессии за счет Тsе-1 гепатоцит-специфических элементов (Boshart et al., Cell 61(5):905-916, 1990).
В предпочтительных вариантах элементы, которые усиливают экспрессию целевого продукта, включены в конструкцию. Такие элементы включают внутренние рибосомные связывающие сайты (IRES; Wang и Siddiqui, Curr. Top. Microbiol. Iminunol 203: 99, 1995; Ehrenfeid и Semler, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 203:65, 1995; Rees et al., Biotechniques 20:102, 1996, Sugimoto et al., Biotechnology 12: 694, 1994). IRES повышает эффективность трансляции. Другие последовательности также могут усилить экспрессию. Для некоторых генов, последовательности, особенно с 5' конца, ингибируют транскрипцию и/или трансляцию. Эти последовательности обычно являются палиндромами, которые могут образовывать структуры в виде шпилек. Любые такие последовательности в нуклеиновой кислоте, которую необходимо доставить, обычно исключают. Уровни экспрессии продуктов транскрипции или трансляции анализируют для подтверждения или определения того, какие последовательности влияют на экспрессию. Уровни транскрипции можно определить любым известным способом, включая Нозернблоттинг гибридизацию, защиту РНКазы с помощью зонда и т.п. Уровни протеинов можно определить любым известным способом, включая ELISA.
В предпочтительных вариантах фаг имеет начало репликации, подходящий для трансфектированных клеток. Можно использовать системы репликации вирусов, такие как EBV ori и ENBA ген, SV40 ori и Т антиген, или BPV ori. Другие системы репликации млекопитающих могут быть взаимозаменяемы. А также гены репликации могут привести к большому числу копий. Экспрессия терапевтических генов из фагового генома может быть усилена за счет увеличения числа копий генома фага. В одном из способов используют SV40 начало репликации в присутствии SV40 Т антигена, для того чтобы вызвать получение нескольких сотен тысяч копий. Ген Т антигена может уже присутствовать в клетках, интродуцированный отдельно или индуцированный в геноме фага под транскрипционным контролем подходящего клеточного промотора. Можно также использовать другие системы репликации вирусов для увеличения числа копий, такие как начало EBV и EBNA.
В других предпочтительных вариантах пептиды или другие фрагменты, которые позволяют или стимулируют "ускользание" векторов (и любой молекулы, к ним присоединенной или в них заключенной) из эндосомы, включены и экспрессированы на поверхности бактериофага. Такие "другие фрагменты" включают молекулы, которые сами не являются пептидами, но которые обладают способностью разрушать эндосомальные мембраны, тем самым облегчая "ускользание" вектора и молекул, которые в противном случае имитируют эндосомальные свойства "ускользания" описанных здесь пептидных последовательностей (см. например, опубликованную РСТ публикацию WO 96/10038 и Wagner et al., PNAS 89:7934-7938, 1992, раскрытие которых включено сюда в качестве ссылки).
Пептидные последовательности, которые придают способность "ускользания" из эндосомы, наиболее предпочтительны. Такие последовательности хорошо известны и могут быть легко слиты ковалентно или генетически с оболочковым протеином, таким как ген III или ген VIII нитевидного фага. Хотя слияние одной или более из пептидных последовательностей с оболочковым протеином описывается здесь как предпочтительный вариант, следует понимать, что другие способы присоединения (и другие фрагменты кроме пептидов) могут быть использованы, как здесь раскрыто.
Так, пример двоякого представления нитевидного фага представляет лиганд (например, FGF) как слияние с геном III и эндосомальный пептид ускользания, слитый с геном VIII. Локализации лиганды и последовательностей ускользания являются взаимозаменяемыми и более того, могут находиться в одном и том же слитом протеине. Последовательности ускользания, которые пригодны, включают, без ограничений, следующие примеры последовательностей: пептид экзотоксина Pseudomonas (Donnelley, J. J., et al., PNAS. 90, 3530-3534, 1993); пептиды гриппа, такие как НА пептид и пептиды, из него полученные, такие как пептид FP13; слитогенный пептид Sendal Virus; слитогенная последовательность из HIV gр1 протеина; Paradaxin слитогенный пептид; и Melittin слитогенный пептид (см. опубликованную РСТ публикацию WO 96/41606, раскрытие которой включено сюда в качестве ссылки). Примерами двух других эндосоморазрушающих пептидов, иногда называемых слитогенными пептидами, являются:
GLFEAIEGFIENGWEGMIDGGGC (SEQ. ID 1) и
GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGC (SEQ. ID 2).
GLFEAIEGFIENGWEGMIDGGGC (SEQ. ID 1) и
GLFEAIEGFIENGWEGMIDGWYGC (SEQ. ID 2).
Другие пептиды, пригодные для разрушения эндосом, можно определить с помощью различных общих характеристик. Например, эндосоморазрушающие пептиды обычно имеют длину в 25-30 остатков, содержат чередующиеся гидрофобные домены и кислотные домены, и при низких значениях рН (например, рН 5) образуют амфифатические α-спирали. Эндосоморазрушающий пептид может присутствовать в виде единичной копии или в виде множества копий как с N-, так и с С-конца лиганда.
Пептиды ускользания можно также отобрать, используя стратегию молекулярной эволюции. Короче, в одном из подходов конструируют библиотеку случайных пептидов в протеине гена VIII фагового вектора, у которого имеется лиганд, который слит с геном III и который несет детектируемый (например, GFP) или селектируемый маркер (например, устойчивости к лекарству). Клетки млекопитающих инфицируют этой библиотекой и клетки отбирают по выявляемому маркеру. Клетки, которые имеют наиболее эффективную эндосомальную последовательность ускользания, должны отличаться наивысшей экспрессией или наибольшей устойчивостью. Множество циклов селекции можно осуществить для уменьшения сложности генов, кодирующих выделенные пептиды. Гены пептидов выделяют, конструируют в фаговые векторы.
Кроме того, или в качестве альтернативы, мембраноразрушающие пептиды можно включить в комплексы. Так например, как известно, аденовирусы усиливают разрушение эндосом. Не содержащие вирусов протеины, такие как гемагглютинин НА-2 вируса гриппа, также разрушают эндосомы и могут быть использованы в настоящем изобретении. Другие протеины можно протестировать в анализах, раскрытых здесь, с целью обнаружения специфических эндосоморазрушающих агентов, которые увеличивают доставку генов. Обычно эти протеины и пептиды являются амфифатичными (см. Wagner et al., Adv. Drug Del. Rev. 14:113-135, 1994).
Другой последовательностью, которую можно включить в вектор, является последовательность, которая облегчает доставку протеинов в ядро. Для усиления экспрессии предпочтительно, чтобы терапевтическая нуклеотидная последовательность была направлена в ядро. Эти так называемая ядерная транслокация или ядерные локализующие последовательности (NLS) обычно содержат много положительно заряженных аминокислот. Так как карбоксильные концы протеина гена VIII нитевидных фагов уже несут на себе положительный заряд, увеличение заряда и вероятность ядерного переноса можно увеличить путем слияния известных NLS последовательностей клеток млекопитающих с протеином гена VIII. NLS слияние с оболочковыми протеинами нитевидных фагов могут быть замещены. NLS можно слить с капсидным протеином, отлично от слияния лиганд/капсид.
Примеры NLS последовательностей включают те, которые напоминают короткие основные NLS SV40 Т антигена, состоящие из двух частей NLS нуклеоплазмина; рибонуклеопротеиновую последовательность A1; маленькую ядерную рибонуклеопротеиновую последовательность UA1 и протеин вируса-1 Tax Т-лимфоцита человека. Другие полезные NLS последовательности включают NLS HIV матричного протеина и компоненты ядерной транслокации importain/hSRPI и Ran/TC4; консенсусную последовательность КХХ (K/R), фланкированную Pro или А1а; последовательность ядерной транслокации нуклеоплазмина; или NLS из antennapedia (см. WO 96/41606).
В некоторых случаях пептиды, конденсирующие нуклеиновую кислоту, связаны с неосновными последовательностями ядерной локализации, функция которых состоит в транспорте нуклеопротеина. Примеры таких последовательностей включают нуклеопротеин гриппа и протеин HIV MA. Другие полезные NLS включают hnRNP A1 протеин, протеин, который транспортирует комплексы рибонуклеопротеинов. Другой полезный NLS включен в пептиды, такие как NBC1 и NBC2, функция которых состоит в конденсации нуклеиновой кислоты (см. WO 96/41606). Таким образом, в настоящем изобретении предложено использование указанных выше последовательностей, а также и других, раскрытых здесь.
Библиотеку последовательностей случайных пептидов можно скринировать в поисках новых последовательностей, которые стимулируют ядерную транслокацию. Короче, в одном из таких способов библиотеку случайных пептидных генов гибридизуют с генами нитевидных фагов VIII, VII и IX и скринируют в поисках эффективной ядерной транслокации, анализируя инфицированные клетки в отношении экспрессии репортерного гена или осуществляя селекцию с помощью лекарств.
Могут быть включены дополнительные факторы, которые усиливают экспрессию трансгена. Такие факторы можно идентифицировать способом, в котором последовательности сливают с протеинами оболочки фага и осуществляют селекцию фага на основании эффективной экспрессии репортерного гена. Известные ДНК репарационные ферменты или полимеразы из клеток млекопитающих, или одноцепочечные ДНК вирусы представляют собой возможные последовательности.
Конструируют фаг, который представляет лиганд как результат слияния с фаговым оболочковым протеином, таким образом, чтобы они содержали соответствующие кодирующие участки. Обычно для нитевидных фагов используют гены III и VIII. Другие капсидные протеины могут служить заменой. Методики для встраивания кодирующей лиганд последовательности в ген фага хорошо известны (см. например, Sambrook et al., выше; Ausubel et al., выше).
В некоторых вариантах размножение или стабильное сохранение такой конструкции может оказаться желательным, или может быть необходимым для достижения достаточного количества или достаточной концентрации генного продукта для эффективной генной терапии. Примеры реплицирующих и стабильных источников репликации эукариотного происхождения известны.
II. ЛИГАНДЫ
В том смысле, как здесь использован, термин "лиганд" относится к любому пептиду, полипептиду, протеину или не протеину, такому, как пептидомиметин, который способен связываться с молекулой на поверхности клетки и интернализоваться. Интернализация по эндосомальному пути является предпочтительным способом проникновения. В том смысле, как здесь использован, термин "связываться с рецептором" относится к способности лиганда специфически распознавать и детектируемо связываться с рецептором, о чем свидетельствуют стандартные in vitro анализы.
В том смысле, как здесь использован, термин "лиганд" относится к любому пептиду, полипептиду, протеину или не протеину, такому, как пептидомиметин, который способен связываться с молекулой на поверхности клетки и интернализоваться. Интернализация по эндосомальному пути является предпочтительным способом проникновения. В том смысле, как здесь использован, термин "связываться с рецептором" относится к способности лиганда специфически распознавать и детектируемо связываться с рецептором, о чем свидетельствуют стандартные in vitro анализы.
В контексте настоящего изобретения лиганд конъюгирован с протеином бактериофага либо как протеин слияния, либо за счет химической конъюгации, и используется для доставки объекта с нуклеиновой кислотой (т.е. терапевтического гена) в клетку. Известно множество молекул, которые связываются со специфическим рецептором и интернализуются обычно за счет эндосом. Другими молекулам могут служить антитела и производные антител. Кроме того, предложены способы селекции других лигандов, которые удовлетворяют изложенным свыше критериям.
В рамках настоящего изобретения можно использовать фрагменты этих лигандов, если только такие фрагменты сохраняют способность связываться с соответствующей молекулой клеточной поверхности. Аналогично, можно использовать лиганды с замещениями или другими изменениями, при которых сохраняется связывающая способность. Также термин лиганд относится к полипептиду (полипептидам) с аминокислотной последовательностью нативного лиганда так же, как и к модифицированным последовательностям (например, содержащим аминокислотные замещения, делеции, вставки или дополнения по сравнению с нативным протеином), до тех пор, пока такой лиганд сохраняет способность связываться с его рецептором на эндотелиальной клетке и может быть интернализован.
Лиганды также охватывают мутеины, которые обладают способностью связываться с клетками, экспрессирующими их рецептор, и могут быть интернализованы. Такие мутеины включают (но ими не ограничиваются) те, которые получены в результате замены одного или более цистеино серином, как здесь раскрыто. Обычно такие мутеины содержат замены консервативных аминокислот. ДНК, кодирующая такие мутеины, будет, если только не модифицирована заменой дегенеративных кодонов, гибридизоваться, по крайней мере в мягких условиях, с нативной ДНК последовательностью, кодирующей лиганд дикого типа.
ДНК, кодирующую лиганд, можно получить синтетически на основании известной аминокислотной или ДНК последовательности, выделить, используя известные специалистам способы (например, ПЦР амплификацией), или получить из коммерческих или других источников. ДНК, кодирующая лиганд, может отличаться от указанных выше последовательностей замещением дегенеративных кодонов или тем, что кодирует отличающиеся аминокислоты. Различия в аминокислотных последовательностях, такие как наблюдающиеся среди гомологичных лигандов различных видов, а также среди отдельных организмов или видов, допустимы в тех случаях, если этот лиганд связывается со своим рецептором. Лиганды можно выделить из природных источников или получить синтетически, например в результате химического синтеза или с использованием рекомбинантных методик.
В контексте настоящего изобретения нет необходимости в том, чтобы лиганды сохраняли какие-либо свои in vitro биологические активности помимо способности связываться с рецептором на клетке и способности к интернализации. Однако в некоторых контекстах может оказаться желательным, чтобы лиганд проявлял некоторые из своих биологических активностей. Например, если в качестве носителя для ДНК, кодирующей молекулу, пригодную для лечения ран, используют VEGF, желательно, чтобы VEGF проявлял активность в отношении проницаемости сосудов и в отношении стимулирования миграции фибробластов и ангиогенеза. В этих примерах FGF мутеины с пониженной митогенной активностью были сконструированы в результате сайт-направленного мутагенеза. Не митогенные протеины, или протеины с пониженной митогенной активностью также можно сконструировать путем обмена рецептор-связывающего домена с рецептор-связывающим доменом родственного протеина. Например, домен FGF2 можно заменить рецептор-связывающим доменом FGF7 для создания FGF, который не вызывает пролиферации и может изменить характер связывания. Если лиганд модифицирован таким образом, что в нем отсутствует одна или более из биологических активностей, связывание и интернализацию все еще можно анализировать с помощью любого из следующих тестов или других эквивалентных тестов. Обычно эти тесты включают введение метки в лиганд, инкубирование его с целевыми клетками и визуализацию или количественное определение внутриклеточных меток. Например, в лиганд можно ввести флуоресцентную метку FITC или радиометку 125I, инкубированную с клетками, и определить интернализацию микроскопически с помощью флуоресцентного микроскопа или конфокального микроскопа. Из содержания настоящего изобретения будет ясно, какую именно из биологических активностей желательно сохранить.
А. Протеины, которые связываются с клетками и интернализуются
Лиганды можно получить рекомбинантными или другими способами получения для присоединения к фаговым капсидным протеинам. ДНК последовательности и способы получения последовательностей этих лигандов хорошо известны (см. GenBank). На основании ДНК последовательностей гены можно синтезировать либо синтетически (для маленьких протеинов) амплифицировать из клеточных геномных или кДНК, выделить из геномных или кДНК библиотек, и т.п. Для облегчения клонирования в фаговый или фагемидный вектор можно включить рестрикционные сайты, например в праймеры для амплификации.
Лиганды можно получить рекомбинантными или другими способами получения для присоединения к фаговым капсидным протеинам. ДНК последовательности и способы получения последовательностей этих лигандов хорошо известны (см. GenBank). На основании ДНК последовательностей гены можно синтезировать либо синтетически (для маленьких протеинов) амплифицировать из клеточных геномных или кДНК, выделить из геномных или кДНК библиотек, и т.п. Для облегчения клонирования в фаговый или фагемидный вектор можно включить рестрикционные сайты, например в праймеры для амплификации.
Такие молекулы включают (но ими не ограничиваются) протеины, которые связывают раковые клетки, эндотелиальные клетки, клетки сердечно-сосудистой системы, клетки глаза и т.п. Такие лиганды включают факторы роста и цитокины. Многие факторы роста и семейства факторов роста разделяют структурные и функциональные свойства и могут быть использованы в настоящем изобретении. Семейства факторов роста включают факторы роста фибробластов FGF-1 до FGF-15 и факторы роста эндотелия сосудов (VEGF). В рамках настоящего изобретения могут быть использованы другие факторы роста, такие как PDGF (фактор роста, полученный из тромбоцита), TGF-α (трансформирующий фактор роста), TGF-β, HB-EGF, ангиотензин, бомбезис, эритопоэтин, фактор стволовых клеток, M-CSF, G-CSF, GM-CSF и эндоглин, также связывающиеся со специфическими идентифицированными рецепторами на поверхности клеток. Цитокины, включая интерлейкины, CSFs (колониестимулирующие факторы) и интерфероны, имеют специфические рецепторы и могут быть использованы, как здесь описано.
Например, лиганды и пары лиганд/рецептор включают урокиназа/урокиназа рецептор (GenBank регистрационный Х02760/Х74309); (α-1,3-фукозилтрансферазу, α1-антитрипсин/Е-селектин (GenBank регистрационные М98825, D38257/M87862); лиганд гликопротеина Р-селектина, лиганд Р-селектина/Р-селектин (GenBank регистрационный U25955, U02297/L23088), VCAM1/VLA-4 (GenBank регистрационный Х53051/Х16983); Е9 антиген (Blann et al., Atherosclerosis 120:221, 1996)/TGFβ рецептор; фибронектин (GenBank регистрационный Х02761); тип I α1-коллагена (GenBank регистрационный Z74615), тип I β2-коллагена (GenBank регистрационный Z74616), гиалуроновая кислота/CD44 (GenBank регистрационный М59040); CD40 лиганд (GenBank регистрационный L07414)/CD40 (GenBank регистрационный М83312); EFL-3, LERTK-2 лиганды (GenBank регистрационный L37361, U09304) для elk-1 (GenBank регистрационный М25269); VE-кадхерин (GenBank регистрационный Х79981); лиганд для катенинов; ICAM-3 (GenBank регистрационный Х69819) лиганд для LFА-1, и фактор von Willebrand (GenBank регистрационный Х04385), фиброноген и фибронектин (GenBank регистрационный Х92461), лиганды для αvβ3 интегрина (GenBank регистрационный U07375, L28832).
Другие лиганды включают CSF-1 (GenBank регистрационный М11038, М37435); GM-CSF (GenBank регистрационный X03021); IFN-α (интерферон) (GenBank регистрационный А02076; WO 8502862-A); IFN-γ (GenBank регистрационный А02137; WO 8502624-A); IL-1-α (интерлейкин 1 альфа) (GenBank регистрационный Х02531, М15329); IL-1-β (интерлейкин 1 бета) (GenBank регистрационный Х02532, М15330, М15840); IL-1 (GenBank регистрационный K02770, M54933, M38756); IL-2 (GenBank регистрационный A14844, A21785, X00695, X00200, X00201, X00202); IL-3 (GenBank регистрационный M14743, M20137); IL-4 (GenBank регистрационный М13982); IL-5 (GenBank регистрационный X04688, J03478); IL-6 (GenBank регистрационный Y00081, X04602, M54894, M38669, M14584); IL-7 (GenBank регистрационный J04156); IL-8 (GenBank регистрационный Z11686); IL-10 (GenBank регистрационный X78437, M57627); IL-11 (GenBank регистрационный M57765, M37006); IL-13 (GenBank регистрационный Х69079, U10307); TNF-α (фактор некроза опухоли) (GenBank регистрационный А21522); TNF-β (GenBank регистрационный D12614); и GP30 лиганд (S68256) для erbB2.
Дополнительно другие лиганды включают PDGF (GenBank регистрационный Х03795, Х02811), ангиотензин (GenBank регистрационный К02215), и все RGD-содержащие пептиды и протеины, такие как ICAM-1 (GenBank регистрационный Х06990) и VCAM-1 (GenBank регистрационный Х53051), которые связываются с рецепторами интегрина. Другие лиганды включают TNFα(GenBank регистрационный А21522, Х01394), IFN-γ (GenBank регистрационный А11033, А11034), IGF-I (GenBank регистрационный
А29117, Х56773, S61841, Х56774, S61860), IGF-II (GenBank регистрационный A00738, X06159, Y00693), атриальный природный пептид (GenBank регистрационный Х54669), эндотелин-1-(GenBank регистрационный Y00749), фактор коагуляции Ха (GenBank регистрационные L00395, L00396, L29433, N00045, М14327), TGF-β1 (GenBank регистрационный А23751), IL-1α (GenBank регистрационный Х03833), IL-Iβ (GenBank регистрационный M15330) и эндоглин (GenBank регистрационный Х72012).
А29117, Х56773, S61841, Х56774, S61860), IGF-II (GenBank регистрационный A00738, X06159, Y00693), атриальный природный пептид (GenBank регистрационный Х54669), эндотелин-1-(GenBank регистрационный Y00749), фактор коагуляции Ха (GenBank регистрационные L00395, L00396, L29433, N00045, М14327), TGF-β1 (GenBank регистрационный А23751), IL-1α (GenBank регистрационный Х03833), IL-Iβ (GenBank регистрационный M15330) и эндоглин (GenBank регистрационный Х72012).
Семейство FGF протеинов в настоящее время включает FGF-I (кислотный FGF или aFGF), FGF-2 (основной FGF или bFGF), FGF-3 (int-2), FGF-4 (hst-1/K-FGF), FGF-5, FGF-6 (hst-2), FGF-7 (фактор роста кератиноцитов или KGF), FGF-8, FGF-9, FGF-11 (WO 96/39507), FGF-13 (WO 96/39508), FGF-14 (WO 96/39506), и FGF-15 (WO 96/39509). Для целей настоящего изобретения можно использовать другие полипептиды, которые реакционноспособны в отношении FGF рецептора, то есть любые полипептиды, которые специфически взаимодействуют с FGF рецептором, предпочтительно с большим сродством к FGF рецептору, и переносятся через эндосомы в клетку за счет их взаимодействия с FGF рецептором.
В. Антитела к рецепторам, которые интернализуются
Антитела к молекулам, которые экспрессированы на поверхности клеток, полезны в контексте настоящего изобретения до тех пор, пока эти антитела могут интернализоваться после связывания. Такие антитела включают (но ими не ограничиваются) антитела к FGF рецепторам, VEGF рецепторы, рецептор урокиназы, Е- и Р-селектины, VCAM-1, PDGF рецептор, TGF рецептор, эндосиалин, αvβ3 интегрин, LFA-1, E9 антиген, CD40, кадхерин и elk-1. Антитела, которые специфичны к молекулам клеточной поверхности, экспрессируемым клетками, легко получить как моноклональные или поликлональные антисыворотки. Многие такие антитела доступны (например, из American Type Culture Collection, Rockville, MD). В другом варианте можно также использовать антитела к лигандам, которые связываются/интернализуются. При таком подходе фаговые частицы должны иметь антитела на их поверхности, которые затем образуют комплексы с лигандом (см. обсуждение далее).
Антитела к молекулам, которые экспрессированы на поверхности клеток, полезны в контексте настоящего изобретения до тех пор, пока эти антитела могут интернализоваться после связывания. Такие антитела включают (но ими не ограничиваются) антитела к FGF рецепторам, VEGF рецепторы, рецептор урокиназы, Е- и Р-селектины, VCAM-1, PDGF рецептор, TGF рецептор, эндосиалин, αvβ3 интегрин, LFA-1, E9 антиген, CD40, кадхерин и elk-1. Антитела, которые специфичны к молекулам клеточной поверхности, экспрессируемым клетками, легко получить как моноклональные или поликлональные антисыворотки. Многие такие антитела доступны (например, из American Type Culture Collection, Rockville, MD). В другом варианте можно также использовать антитела к лигандам, которые связываются/интернализуются. При таком подходе фаговые частицы должны иметь антитела на их поверхности, которые затем образуют комплексы с лигандом (см. обсуждение далее).
В контексте настоящего изобретения термин антитела, включает моноклональные антитела, поликлональные антитела, антиидиотипические антитела, фрагменты антител (например Fab, и F(ab')2, Fv вариабельные участки или гипервариабельные участки. Антитела обычно рассматривают как специфические против индолицидиновых аналогов, если они связываются с Kd больше или равным 10-7 М, предпочтительно, больше или равным 10-8 М. Степень сродства моноклонального антитела или связывающего партнера может легко определить специалист (Scatchard, Ann. N.Y. Acad. Sci. 51:660-672, 1949). После того как получены подходящие антитела, их можно выделить или очистить с помощью множества способов, известных специалистам.
Коммерчески доступные антитела к молекулам клеточных поверхностей можно использовать, если их интернализовать. Вкратце, антитела вырабатывают путем иммунизации мышей, крыс, кроликов или других животных с нормальными опухолегенными, или культивируемыми клетками. Различные схемы иммунизации можно найти, например, у Harlow и Lane Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 и у Coligan с сотр. (Current Protocols in Immunology, Greene Publishing, 1995). После иммунизации извлекают селезенку или лимфатические узлы для создания гибридом или собирают сыворотку для поликлональных антител. Гибридомы предпочтительнее (патенты США RE 32011, 4902614, 4543439 и 4411993; Harlow и Lane, выше; и Coligan с сотр. выше). Гибридомы, секретирующие антитела, выращивают и антитела тестируют на связывание с иммунизованными клетками с помощью ELISA, секционного окрашивания, цитометрии в потоке, конфокальной микроскопии и т.п.
Далее позитивные антитела тестируют в отношении интернализации. Одним из используемых анализов является тест на поиски антитела, которое убивает клетки. Вкратце, тестируемое гибридомное антитело и тестируемые клетки инкубируют. Не связанные антитела смывают. Антитело второй стадии, такое как анти-IgG антитело, конъюгированное с сапорином, инкубируют с тестируемыми клетками. Гибель клеток оценивают известными способами, включая вытеснение трипаном синим, захват МТТ, окрашивание флуоресциндиацетатом и т.п.
Для конструирования моноклональных антител можно также использовать другие способы (Huse et al., Science 246:1275-1281, 1989; Sastry et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5728-5732, 1989; Alting-Mees et al., Strategies in Molecular Biology 3:1-9, 1990, описывающие рекомбинантные методики). Эти способы включают клонирование тяжелых и легких цепей кДНК иммуноглобулина в подходящие векторы, такие как λ ImmunoZap (Н) и λlmmunoZap (L). Эти рекомбинанты можно скринировать индивидуально или соэкспрессировать для образования Fab фрагментов или антител (Huse et а1., ранее; Sastry et al., ранее). Позитивные бляшки можно затем превратить в нелитические плазмиды, что обеспечит высокий уровень экспрессии фрагментов моноклональных антител из E. coli.
Аналогично части или фрагменты, такие как Fab и Fv фрагменты антител, можно также сконструировать, используя обычные методики ферментативного расщепления или рекомбинантных ДНК, для выхода выделенных вариабельных участков антитела. В одном из вариантов гены, которые кодируют вариабельный участок из гибридомы, продуцирующей представляющий интерес моноклональное антитело, амплифицируют, используя нуклеотидные праймеры для вариабельного участка. Кроме того, можно использовать методики для изменения "мышиного" антитела на "человеческое" антитело, не изменяя специфичности связывания антитела.
С. Отбор других лигандов
В настоящем изобретении можно использовать другие связывающиеся с рецептором лиганды. Может быть использован любой протеин, пептид, аналог, пептидомиметик или его фрагмент, который связывается с рецептором клеточной поверхности и интернализуется. Эти лиганды можно идентифицировать и отобрать таким способом, как фаговый дисплей (например, патент США 5223409 и находящуюся на одновременном рассмотрении заявку "Methods using phage display for selecting internalizing ligands for gene delivery", поданную 29 августа 1997).
В настоящем изобретении можно использовать другие связывающиеся с рецептором лиганды. Может быть использован любой протеин, пептид, аналог, пептидомиметик или его фрагмент, который связывается с рецептором клеточной поверхности и интернализуется. Эти лиганды можно идентифицировать и отобрать таким способом, как фаговый дисплей (например, патент США 5223409 и находящуюся на одновременном рассмотрении заявку "Methods using phage display for selecting internalizing ligands for gene delivery", поданную 29 августа 1997).
Вкратце, в этом способе ДНК последовательности встраивают в ген III или ген VIII нитевидного фага, такого как М13. Несколько векторов с сайтами мультиклонирования были созданы для встраивания (McLafferty et al., Gene 128: 29-36, 1993; Scott и Smith, Science 249:386-390, 1990; Smith и Scott, Methods Enzymol. 217:228-257, 1993). Встроенные ДНК последовательности могут быть созданы случайно или могут быть вариантами известных связывающих доменов для связывания целевых клеток. Используя этот способ, можно легко создать одноцепочечные антитела. Обычно вставки кодируют от 6 до 20 аминокислот. Пептид, кодируемый последовательностью вставки, представляется на поверхности бактериофага. Бактериофаг, экспрессирующий связывающий домен для целевых клеток, отбирают по связыванию с клетками или предпочтительно по экспрессии детектируемого или селектируемого трансгена, кодируемого геномом бактериофага.
Для селекции трансгенов или способов детектирования клетки выращивают в селективной среде (например, содержащей лекарство) или выделяют на основании экспрессии (например, с помощью проточной цитометрии). Встроенную ДНК выделяют обычно с помощью амплификации подвергнутых лизису клеток, анализируют (например, в анализе последовательностей ДНК) и используют в настоящем изобретении (Barry et al. см. ранее). Элюированный фаг размножают в бактерии хозяине. В любом из этих способов можно осуществить дальнейшие циклы селекции для отбора нескольких фагов, отличающихся высоким сродством связывания. Затем определяют ДНК последовательность вставки в связывающем фаге. После того как предсказанная аминокислотная последовательность связывающего пептида известна, подходящий пептид для использования в химическом конъюгате можно создать с помощью рекомбинантных методик или синтетически и с помощью рекомбинантных методик для использования в качестве слитого протеина. Пептид может быть создан как тандем для двух или более пептидов для достижения максимального сродства, или связывания.
D. Модификация связывающих рецептор интернализованных лигандов
Предназначенные для использования здесь лиганды можно подогнать для конкретного применения. Средства для модификации протеинов представлены далее. Вкратце, добавления, замены и делеции аминокислот можно осуществить любыми обычно используемыми рекомбинантными ДНК методиками. Модифицированные пептиды, особенно те, которые лишены пролиферативной функции, и химерные пептиды, которые сохраняют свои активности специфического связывания и интернализации, также подходят для использования в настоящем изобретении. Модификации также включают добавления или делеции остатков, такие как добавление цистеина для облегчения конъюгации и для образования конъюгатов, которые отвечают определенному молярному отношению (например, 1: 1) полипептидов (например, патент США 5175147; РСТ заявку WO 89/00198, США 07/070797; РСТ заявку WO 91/15229 и США 07/505124). Другие полезные модификации включают добавление последовательности, которую подвергают посттрансляционной модификации (например, миристилированию, пальматилированию, фосфорилированию, рибозилированию), что улучшает или изменяет функции протеина, стабильность или т.п.
Предназначенные для использования здесь лиганды можно подогнать для конкретного применения. Средства для модификации протеинов представлены далее. Вкратце, добавления, замены и делеции аминокислот можно осуществить любыми обычно используемыми рекомбинантными ДНК методиками. Модифицированные пептиды, особенно те, которые лишены пролиферативной функции, и химерные пептиды, которые сохраняют свои активности специфического связывания и интернализации, также подходят для использования в настоящем изобретении. Модификации также включают добавления или делеции остатков, такие как добавление цистеина для облегчения конъюгации и для образования конъюгатов, которые отвечают определенному молярному отношению (например, 1: 1) полипептидов (например, патент США 5175147; РСТ заявку WO 89/00198, США 07/070797; РСТ заявку WO 91/15229 и США 07/505124). Другие полезные модификации включают добавление последовательности, которую подвергают посттрансляционной модификации (например, миристилированию, пальматилированию, фосфорилированию, рибозилированию), что улучшает или изменяет функции протеина, стабильность или т.п.
Модификацию полипептида можно осуществить любыми известными специалистам способами. Предпочтительные в рамках настоящего изобретения способы основаны на модификации ДНК, кодирующих полипептид и экспрессирующих модифицированную ДНК. ДНК, кодирующую один из связывающих рецептор интернализованных лигандов, обсуждавшихся ранее, можно подвергнуть мутации, используя стандартные способы. Так например, цистеиновые остатки, которые отвечают за образование агрегатов, можно удалить или заменить. При необходимости идентичность цистеиновых остатков, которые вносят вклад в образование агрегатов, можно определить эмпирически, удаляя и/или заменяя цистеиновый остаток и определяя, образует ли полученный протеин агрегаты в растворах, содержащих физиологически приемлемые буферы и соли. Кроме того, можно сконструировать и использовать фрагменты этих связывающих рецептор интернализованных лигандов. Участки связывания многих из этих лигандов были описаны. Так например, рецепторный участок связывания FGF2 был идентифицирован с помощью анализа мутаций и FGF пептидные агонисты/антагонисты находятся между остатками 33-77 и между 102-129 из 155 аминокислотной формы (Baird et al., PNAS 85:2324; Erickson et al. , Biochem 88:3441). Экзоны 1-4 из VEGF необходимы для рецепторного связывания. Можно также показать с помощью любого из описанных здесь тестов, что фрагменты связаны и интернализованы.
Любым из способов, известных специалистам, можно осуществить мутации, включая сайт-специфический или сайт-направленный мутагенез ДНК, кодирующей протеин, и использовать методы амплификации ДНК, используя праймеры для введения и амплификации изменений в матрице ДНК, такие как ПЦР сплайсинг, путем перекрывания участков липких концов (SОЕ). Сайт-направленный мутагенез обычно осуществляют, используя фаговый вектор, который имеет одноцепочечную и двухцепочечную формы, такой как фаговый вектор М13, который хорошо известен и коммерчески доступен. Можно использовать другие подходящие векторы, которые содержат одноцепочечное фаговое начало репликации (например, Veira et al., Meth. Enzymol. 15:3, 1987). Обычно сайт-направленный мутагенез осуществляют, получая одноцепочечный вектор, который кодирует представляющий интерес протеин (например, член семейства FGF или цитотоксичную молекулу, такую как сапорин). Олигонуклеотидный праймер, который содержит нужную мутацию в участке гомологичности с ДНК в одноцепочечном векторе, отжигают с вектором с последующим добавлением ДНК полимеразы, такой как E.coli ДНК полимераза I (фрагмент Кленова), которая использует двухцепочечный участок в качестве праймера для получения гетеродуплекса, в котором одна цепочка кодирует измененную последовательность, а другая исходную последовательность. Этот гетеродуплекс вводят в клетки соответствующей бактерии и отбирают клоны, которые включают целевую мутацию. Полученная измененная молекула ДНК может быть экспрессирована рекомбинантно в клетках соответствующего хозяина с получением модифицированного протеина.
Подходящие консервативные замещения аминокислот хорошо известны и могут быть осуществлены обычно без изменения биологической активности полученных молекул. Например, такие замещения обычно делают путем взаимозамены внутри групп полярных остатков, заряженных остатков, гидрофобных остатков, маленьких остатков и т.п. При необходимости такие замещения можно определить эмпирически, тестируя полученный модифицированный протеин на способность связываться с соответствующими рецепторами и интернализоваться после связывания. Те, что сохраняют эту способность, пригодны для использования в конъюгатах и способах настоящего изобретения. Как таковой аминокислотный остаток рецептор-связывающего интернализованного лиганда не существенен, если полипептид, который был модифицирован путем делении или изменения остатка, обладает практически той же способностью к связыванию со своим рецептором и интернализации связанного агента, что и немодифицированный полипептид.
Е. Лиганды-пептидомиметики
Лиганды или их фрагменты, которые связываются с рецепторами клеточной поверхности и интернализуются, но которые являются имитацией "истинных" полипептидов, также пригодны для использования в настоящем изобретении. Так, в одном из аспектов настоящее изобретение включает получение и использование непептидных пептидомиметиков, пригодных для имитирования активности пептидов, что делает пептидомиметики дополнительным источником целевых лигандов, которые могут быть присоединены к векторам на основе фагов настоящего изобретения.
Лиганды или их фрагменты, которые связываются с рецепторами клеточной поверхности и интернализуются, но которые являются имитацией "истинных" полипептидов, также пригодны для использования в настоящем изобретении. Так, в одном из аспектов настоящее изобретение включает получение и использование непептидных пептидомиметиков, пригодных для имитирования активности пептидов, что делает пептидомиметики дополнительным источником целевых лигандов, которые могут быть присоединены к векторам на основе фагов настоящего изобретения.
Способы создания и идентификации подходящих пептидомиметиков, как здесь раскрыто, известны специалистам (например, WO 93/17032). Например, вышеуказанная заявка описывает способ получения соединений-пептидомиметиков, которые пригодны для имитирования активности пептидов, и описывает пептидоподобную активность одной из таких имитаций. Аналогично продуцирование пептидомиметических лекарств за счет использования химически модифицированных фрагментов для имитации структуры антител на основе конформационных исследований раскрыто в патенте США 5331573. Способы тестирования полученных таким образом лекарств также там раскрыты. Пептидомиметики антител, таким образом, полезны, как здесь раскрыто, не только как лиганды, но и как молекулы, пригодные для связывания фаговых частиц с нацеленными лигандами.
Другие полезные пептидомиметические молекулы, пригодные в качестве лигандов и/или "линкеров" настоящего изобретения, раскрыты в опубликованной РСТ публикации WO 92/20704; Brandt et al., Antimicrob Agents Chemother, 40: 1078, 1996; Sepp-Lorenzino et al., Cancer Res. 55:5302, 1995: и Chancier et al., J.Pharm. Sci, 84:404, 1995.
Несмотря на тот факт, что такие имитации не являются истинными пептидами, различные ковалентные и нековалентные средства связывания таких пептидомиметических молекул с протеинами фаговой оболочки можно использовать, как здесь раскрыто.
F. Векторы экспрессии для получения лигандов
В том смысле, как здесь использован, термин "функциональное связывание" или функциональная ассоциация двух нуклеотидных последовательностей относится к функциональному взаимоотношению между такими последовательностями. Нуклеотидные последовательности включают (но ими не ограничиваются) ДНК кодирующую продукт, ДНК кодирующую сигнальную последовательность, промоторы, энхансеры, сайты окончания транскрипции и трансляции, и сигналы полиаденилирования. Например, функциональное связывание ДНК, кодирующей цитоцид с промотором, относится к физическому и функциональному взаимоотношению между ДНК и промотором, так что транскрипция ДНК инициируется из промотора за счет РНК полимеразы, которая специфически распознает ДНК, связывается с ДНК и транскрибирует ее.
В том смысле, как здесь использован, термин "функциональное связывание" или функциональная ассоциация двух нуклеотидных последовательностей относится к функциональному взаимоотношению между такими последовательностями. Нуклеотидные последовательности включают (но ими не ограничиваются) ДНК кодирующую продукт, ДНК кодирующую сигнальную последовательность, промоторы, энхансеры, сайты окончания транскрипции и трансляции, и сигналы полиаденилирования. Например, функциональное связывание ДНК, кодирующей цитоцид с промотором, относится к физическому и функциональному взаимоотношению между ДНК и промотором, так что транскрипция ДНК инициируется из промотора за счет РНК полимеразы, которая специфически распознает ДНК, связывается с ДНК и транскрибирует ее.
Организмы хозяев включают такие организмы, в которых рекомбинантное продуцирование гетерологичных протеинов было осуществлено, такие как бактерии (например, E.coli), дрожжи (например, Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris), клетки млекопитающих и клетки насекомых. В настоящее время предпочтительными организмами в качестве хозяев являются бактериальные штаммы E. coli.
ДНК конструкцию, кодирующую целевой протеин, вводят в плазмиду для экспрессии в соответствующем хозяине. В предпочтительном варианте осуществления хозяином является бактериальный хозяин. Последовательность, кодирующую лиганд, предпочтительно кодон-оптимизируют для экспрессии в конкретном хозяине. Так, например, если в бактериях экспрессируется человеческий FGF-2, кодоны должны быть оптимизированы для использования в бактериях. Для небольших кодирующих участков ген можно синтезировать как единичный олигонуклеотид. Для более крупных протеинов можно использовать сплайсинг множества олигонуклеотидов, мутагенез или другие известные специалистам способы. Последовательности нуклеотидов в плазмидах, которые являются регуляторными участками, такие как промоторы и операторы, функционально связаны друг с другом для транскрипции. Последовательность нуклеотидов, кодирующая фактор роста или фактор роста-химеру, может также включать ДНК, кодирующую сигнал секреции, и тогда полученный пептид является предшественником протеина. Полученный процессированный протеин можно выделить из периплазмического пространства или ферментационной среды.
Плазмиды, используемые в настоящем изобретении, включают промотор в функциональной ассоциации с ДНК, кодирующей представляющий интерес протеин или полипептид, и сконструированы для экспрессии протеинов в бактериальном хозяине. Подходящие промоторы для экспрессии протеинов и полипептидов настоящего изобретения широко доступны и хорошо известны специалистам. Предпочтительны индуцируемые промоторы или конститутивные промоторы, которые связаны с регуляторными участками. Такие промоторы включают (но ими не ограничиваются) Т7 фаговый промотор и другие, подобные Т7 фаговому промотору, такие как Т3, Т5 и SP6 промоторы, trp, lpp и lac промоторы, такие как lаcUV5 из E. coli; P10 или промотор гена полиэдрона экспрессионной системы бакуловирус/клетка насекомого (например, патенты США 5243041, 5242687, 5266317, 4745051 и 5169784), и индуцируемые промоторы из других эукариотных экспрессионных систем. Для экспрессии протеинов такие промоторы встраивают в плазмиду в функциональном связывании с контрольным участком, таким как lac оперон.
Предпочтительными промоторными участками являются те, которые индуцируемы и функциональны в E.coli. Примеры подходящих индуцируемых промоторов и промоторных участков включают (но ими не ограничиваются) E.coli lac оператор, реагирующий на изопропил-β-D-тиогалактопиранозид (IPTG; Nakamura et al. , Cell 18:1109-1117, 1979); металлрегуляторные элементы промотора металлотионена, реагирующие на индуцирование тяжелым металлом (например, цинком) (патент США 4870009, выданный Evans et al.); фаговый Т71ас промотор, реагирующий на IPTG ( например, патент США 4952496; и Studier et al., Meth. Enzymol. 185:60-89, 1990) и ТАС промотор.
Плазмиды также предпочтительно включают селективный маркерный ген или гены, которые функциональны в хозяине. Селективный маркерный ген включает любой ген, который придает фенотип бактерии, позволяющий трансформировать бактериальные клетки так, что их можно идентифицировать и селективно выращивать, выбрав из большего числа нетрансформированных клеток. Гены подходящих селектируемых маркеров для бактериальных хозяев, например, включают ген устойчивости к ампициллину (Ampr), ген устойчивости к тетрациклу (Tcr) и ген устойчивости к канамицину (Kanr). Ген устойчивости к канамицину предпочтителен.
Плазмиды могут также включать ДНК, кодирующие сигнал для секреции функционально связанного протеина. Сигналы секреции, пригодные для использования, легко доступны и широко известны специалистам. Можно использовать прокариотные и эуакариотные сигналы секреции функциональные в E.coli. Предпочтительные в настоящее время сигналы секреции включают (но ими не ограничиваются) те, которые кодируются следующими генами E.coli: ompA, ompT, ompF, ompC, бета-лактамазы, и щелочной фосфатазы и тому подобными (von Heijne, J. Mol.Biol. 184:99-105, 1985). Кроме того, можно использовать бактериальный сигнал секреции ре1В гена (Lei et al., J.Bacteriol. 169:4379, 1987), phoA сигнал секреции и cek2, функциональные в клетках насекомых. Наиболее предпочтительным сигналом секреции является E.coli ompA сигнал секреции. Можно также использовать другие прокариотные и эукариотные сигналы секреции, известные специалистам (например, von Heijne. J. Mol. Biol. 184: 99-105, 1985). Используя описанные здесь способы, специалисты смогут заменить сигналы секреции, которые функциональны как в дрожжевых клетках, так и в клетках насекомых или млекопитающих, для секреции протеинов из этих клеток.
В предпочтительных вариантах ДНК плазмиды также включают последовательность терминации транскрипции. Полноразмерный терминатор транскрипции можно получить из протеин-кодирующего гена, который может быть тем же самым или может отличаться от встроенного гена или источника промотора.
Особенно предпочтительные плазмиды для трансформации клеток E.coli включают векторы экспрессии рЕТ (патент США 4952496; доступны от Novagen, Madison, WI). Такие плазмиды включают рЕТ 11а, который содержит Т71ас промотор, Т7 терминатор, индуцируемый E.coli lac оператор и lac репрессорный ген; рЕТ 12а-с, который содержит Т7 промотор; Т7 терминатор и E.coli ompT сигнал секреции; и рЕТ 15b, который содержит His-TagТМ лидерную последовательность для использования при очистке на His колонке, и сайт расщепления тромбина, который позволяет осуществлять расщепление после очистки на колонке, Т7-1ас промоторный участок и Т7 терминатор.
Другие предпочтительные плазмиды включают рКК плазмиды, в частности рКК 223-3, которая содержит tac промотор (Pharmacia Biotech). Плазмида рКК была также модифицирована путем замены гена устойчивости к ампициллину кассетой устойчивости к канамицину (Pharmacia Biotech). Другие плазмиды включают pIN-IIIompA плазмиды (патент США 4575013), которые имеют сайт клонирования, связанный с транскрипционной рамкой считывания с четырьмя функциональными фрагментами, полученными из гена липопротеина E.coli и отрА сигнальной последовательности.
Бакуловирусные векторы, такие как pBlueBac (называемый также pJVETL и его производные), в частности pBlueBac III (Invitrogen, San Diego, CA), можно использовать для экспрессии полипептидов в клетках насекомых. ДНК конструкцию можно создать в бакуловирусном векторе, а затем сотрансформировать с вирусом дикого типа в sf9 клетки насекомых из Spodoptera frugiperda (например, Luckow et al. , Bio/technology 6: 47-55, 1988 и патент США 4745051).
Векторы экспрессии, совместимые с эукариотными клетками, предпочтительно совместимые с клетками млекопитающих, также можно использовать для создания рекомбинантных молекул нуклеиновых кислот для использования в настоящем изобретении. Векторы экспрессии клеток млекопитающих хорошо известны специалистам и доступны из ряда коммерческих источников. Обычно предоставляются такие векторы, содержащие обычные рестрикционные сайты для встраивания нужного ДНК сегмента и обеспечения сигналов, необходимых для экспрессии генов в клетках млекопитающих. Типичными такими векторами являются pREP серии векторов и pEBVhis, доступные от Invitrogen (San Diego, CA), векторы pTDTl (ATCC 31255), pCPl (ATCC 37351) и pJ4W (АТСС 37720), которые можно получить из Американской коллекции типовых культур (American Type Culture Collection (ATCC)).
Успешно трансформированные клетки, т.е. клетки, которые содержат молекулу нуклеиновой кислоты настоящего изобретения, можно идентифицировать хорошо известными способами. Например, клетки, полученные в результате введения рДНК настоящего изобретения, можно подвергнуть анализу для определения присутствия специфической рДНК, используя метод гибридизации нуклеиновых кислот, как раскрыто Southern, J. Mol. Biol. 98:503, 1975 или Berent et al., Biotech. 3:208, 1985. Кроме непосредственного анализа присутствия рДНК успешные трансформации можно подтвердить хорошо известными иммунологическими способами определения присутствия экспрессированного протеина. Например, клетки, успешно трансформированные вектором экспрессии, продуцируют протеины, которые затем можно проанализировать непосредственно иммунологическими методами в отношении наличия функции экспрессированного протеина.
Другие подходящие векторы экспрессии млекопитающих хорошо известны, и их можно легко получить из различных начал (например, Ausubel et al., 1995; Sambrook et al. , ранее; Invitrogen, San Diego, CA; Novagen. Madison, WI; Pharmacia Biotech; и др.).
В различных предпочтительных вариантах ДНК фрагмент реплицируются в бактериальных клетках, предпочтительно в E.coli. Предпочтительный фрагмент ДНК включает также бактериальное начало репликации. Предпочтительные бактериальные начала репликации включают (но ими не ограничиваются) fl-ori и col E1 начала репликации. Предпочтительные хозяева содержат хромосомные копии ДНК, кодирующей Т7 РНК полимераэу, функционально связанную с индуцируемым промотором, таким как lacUV промотор (патент США 4952496). Такие хозяева включают (но ими не ограничиваются) лизогенные штаммы E.coli HMS174(DE3)pLysS, BL21(DE3)pLysS, HMS174(DE3) и BL21(DE3). Штамм BL21 (DE3) предпочтителен.
Предложенные ДНК фрагменты могут также содержать ген, кодирующий репрессорный протеин, который способен подавлять транскрипцию промотора, который содержит сайт связывания для репрессорного протеина. Этот промотор можно дерепрессировать, изменяя физиологические условия клетки. Предпочтительные репрессорные протеины включают (но ими не ограничиваются) E.coli lad репрессор, реагирующий на IPTG индукцию, термочувствительный λ с1857 репрессор и т.п.
В одном из описанных здесь предпочтительных вариантов "плазмидой" является фагемид pEGFP-N1 (Clontech; Palo Alto, CA), который содержит ген флуоресценцирующего зеленым протеина (GFP) под контролем CMV предраннего промотора. CMV промотор высоко активен в большом числе клеточных линий млекопитающих; однако можно использовать другие промоторы клеток млекопитающих. Примеры других подходящих промоторов, активных в клетках млекопитающих, включают вирусные промоторы (например, ретровирусные LTR(s), MMTV LTR, HIV LTR, SV40 ранний и поздний промоторы, бычий папилломавирус (BPV) или невирусные индуцируемые промоторы (например, промоторы, реагирующие на металлотионеин, термошок, стероидные гормоны). Еще другие промоторы включают те, которые являются конститутивными (например, бета-актин) или ткане-специфическими (например, альфа-фетопротеин (AFP), карциноэмбрионный антиген (СЕА), альфа-актин и Myo D). Дополнительно полезными промоторами являются те, которые здесь всюду описаны.
Предпочтительно, чтобы фагемид включал также SV40 начало репликации для усиления генной экспрессии. Другие вирусные системы репликации также можно использовать, например, как здесь раскрыто, используют EBV начало и EBNA или BPV.
Предпочтительным штаммом E.coli, в котором размножают фагемиды, является штамм E. coli DH5αF'. Подходящие системы настоящего изобретения могут также выиграть от использования хелперного бактериофага. Например, М13 хелпер М13К07 особенно полезен в сочетании с вышеупомянутыми бактериальными штаммами.
Способы получения фагемидных частиц известны специалистам и могут быть соответствующим образом модифицированы в зависимости от используемой системы, как очевидно специалистам (например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, 1989; Rider et al., в Phage Display of Peptides и Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, 1996).
III. КОНСТРУИРОВАНИЕ ЛИГАНД-МОДИФИЦИРОВАННОГО БАКТЕРИОФАГА
Различные конструкции и методы можно легко адаптировать для использования при связывании фага с лигандом для использования специфического нацеливания и доставки терапевтического фрагмента или агента. Таким образом, фаг представляет лиганд, который является частью протеина слияния, непосредственной химической связи или сэндвича. Примеры способов модификации бактериофага лигандами настоящего изобретения описаны далее. Лиганды получают, как здесь раскрыто, любыми подходящими способами, включая рекомбинантные ДНК технологии, выделение из подходящего источника, покупку в коммерческих источниках или химический синтез. Различные предпочтительные способы и модификации лигандов, которые могут облегчить связывание лиганда с фаговым протеином, раскрыты в опубликованной РСТ публикации WO 96/36362.
Различные конструкции и методы можно легко адаптировать для использования при связывании фага с лигандом для использования специфического нацеливания и доставки терапевтического фрагмента или агента. Таким образом, фаг представляет лиганд, который является частью протеина слияния, непосредственной химической связи или сэндвича. Примеры способов модификации бактериофага лигандами настоящего изобретения описаны далее. Лиганды получают, как здесь раскрыто, любыми подходящими способами, включая рекомбинантные ДНК технологии, выделение из подходящего источника, покупку в коммерческих источниках или химический синтез. Различные предпочтительные способы и модификации лигандов, которые могут облегчить связывание лиганда с фаговым протеином, раскрыты в опубликованной РСТ публикации WO 96/36362.
Так, например, ДНК, кодирующую полипептидные лиганды, можно выделить, синтезировать или получить из коммерческих источников или получить, как здесь раскрыто. Экспрессию рекомбинантных полипептидов можно осуществить, как здесь раскрыто; и ДНК, кодирующую эти полипептиды, можно использовать в качестве исходных материалов для раскрытых здесь способов. ДНК можно получить синтетически на основании аминокислотных или ДНК последовательностей или можно выделить, используя известные специалистам способы, такие как ПЦР, зондовая гибридизация библиотек, и т.п., или получить из коммерческих или других источников.
А. Создание протеинов слияния
Протеины слияния настоящего изобретения предпочтительно включают ген, кодирующий весь лиганд или рецептор-связывающую полипептидную часть лиганда (например, FGF2), генетически слитую или связанную с геном, кодирующим оболочковый протеин частицы бактериофага, используя известные специалистам способы (например. Smith и Scott Meth Enzymol, 217:228-257, 1993; Kay et al., Phage Display of Peptides и Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, 1996). Предпочтительно, чтобы фаг был нитевидным фагом; М13 раскрыт здесь как пример предпочтительного варианта. Здесь же раскрыто получение протеина слияния, включающего М13 гены III или VIII оболочкового протеина.
Протеины слияния настоящего изобретения предпочтительно включают ген, кодирующий весь лиганд или рецептор-связывающую полипептидную часть лиганда (например, FGF2), генетически слитую или связанную с геном, кодирующим оболочковый протеин частицы бактериофага, используя известные специалистам способы (например. Smith и Scott Meth Enzymol, 217:228-257, 1993; Kay et al., Phage Display of Peptides и Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, 1996). Предпочтительно, чтобы фаг был нитевидным фагом; М13 раскрыт здесь как пример предпочтительного варианта. Здесь же раскрыто получение протеина слияния, включающего М13 гены III или VIII оболочкового протеина.
Следует отметить, что предпочтительно, чтобы если фаговые векторы объединены, лиганд-фаговый оболочковый протеины слияния были преобладающими видами. Обычно число копий слияний лиганд-фаговой оболочки по сравнению с протеинами оболочки дикого типа можно легко контролировать по появлению слияний с большим числом копий (векторы типа 3 или типа 8) или с малым числом копий (векторы типа 3+3 или типа 8+8).
Нуклеотидные последовательности для лигандов легко доступны (например, из GenBank) или могут быть синтезированы или выделены стандартными способами. Кодирующие лиганд участки встраивают в фаговые векторы, используя хорошо известные способы.
Нуклеотидные последовательности, кодирующие слияния лиганд-фаг, можно также дальше модифицировать, встраивая репортерный ген млекопитающего для дальнейшей проверки связывания и интернализации и успешности экспрессии нуклеиновой кислоты. Одним из примеров репортерного гена млекопитающих является EGFP; другие включают последовательности для β-галактозидазы, люциферазы, человеческого гормона роста (HGH) и секретированной щелочной фосфатаэы. Способы получения и использования таких последовательностей, как здесь раскрыто, известны специалистам (например, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press 1989).
В различных предпочтительных вариантах экспрессионная кассета включает также начало репликации. SV40 ori особенно подходит для осуществления репликации с большим числом копий в клеточных линиях, содержащих Т антиген (например, клетки COS). Доступно множество подходящих способов и схем, которые используют те или иные начала репликации (например, Sambrook et al., ранее).
Слияния лиганд-оболочкового протеина можно тестировать на связывание фага с подходящим рецептором (например, схожего рецептора с лигандом) известными способами, такими как ELISA. Связывание и интернализацию слияния легко определить известными специалистам способами, такими как иммуногистохимическими (Barry et al., Nature Med. 2: 299-305, 1996; Li, Nature Biotech. 15:559-563, 1997).
Модифицированный фаг можно далее протестировать в отношении трансдукции репортерного гена в клетки (предпочтительно в клетки млекопитающих), добавляя фаг к клеточным культурам на определенный промежуток времени; в зависимости от схемы и используемого репортера количество клеток, экспрессирующих репортерный генный продукт в последующий определенный момент времени, легко оценить, используя известные способы. Например, если репортерным геном является EGFP, который транслирован в флуоресцирующий зеленым протеин (GFP), если происходит доставка гена и экспрессия, можно легко измерить число автофлуоресцирующих клеток несколько часов спустя. Результаты легко подсчитать. Например, если используют флуоресцентные репортеры, проточная цитометрия особенно подходит для измерения распределения клеток, экспрессирующих флуоресцентный репортерный ген в популяции и можно с помощью флуорометрии клеточных экстрактов измерить полные количества экспрессированных репортерных протеинов.
Варианты вышеуказанных процедур включают конструирование протеина слияния, включающего всю молекулу антитела или ее часть и фаговый протеин, в результате чего получают фаговый конъюгат протеин-антитело. Хотя получение слияния одноцепочечное антитело - фаговый оболочковый протеин раскрыто в качестве примера, другие антитела и их фрагменты также можно использовать, как здесь раскрыто.
Обычно антитело или его часть, например mAb, Fab или ScFv, либо получают прямым синтезом (например, используя сплайсингом сайта перекрывающихся одноцепочечных участков ПЦР с необязательным добавлением рестрикционных сайтов с 5' и 3' концов последовательности) или отбирают и выделяют из асцитов, а затем очищают известными способами, такими как афинная хроматография. Если нужно использовать только Fab фрагмент, антитело, собранное из асцитов, модифицируют далее в соответствии со стандартными схемами получения Fab, например, используя папаиновое расщепление.
Одним из примеров антител, которые специфически нацелены на FGF рецептор, является 11А8 антитело, полученное из 11А8 гибридомы. 11А8, которое распознает ECDR1 с помощью Вестерн-блоттинга, может иммуноосадить FGFRs из экстрактов SK-HEP-1 и SK-MEL-28, клеток меланомы. Антитело 11А8 также окрашивает SK-HEP-1 клетки на клеточной поверхности. Рецептор-связывающие фрагменты и варианты 11А8 и аналогичных рецептор-связывающих антител, предпочтительно антител, которые также интернализуются, можно также нековалентно (или ковалентно) присоединить к фаговой оболочке для того, чтобы они могли функционировать как полезные лиганды, как здесь раскрыто. Другие антитела (и их фрагменты), которые специфически нацелены на клеточные рецепторы, предпочтительно те антитела и их фрагменты, которые связываются и интернализуются, можно идентифицировать и синтезировать в соответствии с раскрытыми здесь способами и путем использования других способов, описанных в этой области.
Диплифицированные тяжелые и легкие цепи клонируют в векторы экспрессии. Выбранный вектор экспрессии предпочтительно содержит соответствующие промоторы и также удобные рестрикционные сайты. Полученный протеин может быть необязательно экспрессирован как N-терминальный и как С-терминальный протеин слияния. Кроме того, гибкие линкеры могут быть добавлены между антителом и лигандом для того, чтобы способствовать правильной укладки протеина. Использование более мелких фрагментов антител (например. Fab или ScFv), по-видимому, еще более облегчает укладку. Экспрессию, очистку и оценку протеинов слияния антитело-фаг легко осуществить в клетках хозяина, например в клетках бактерий, используя известные схемы.
В другом варианте можно слить два моноспецифических антитела или их иммунологически активные части с различными протеинами фаговых оболочек, где каждое антитело направлено против того же самого рецептора, или против различных рецепторов. Такая конструкция может оказаться полезной в ситуациях, в которых экспрессируемые клеточные рецепторы являются полиморфными, а использование фаговых векторов направленно на два или более из указанных полиморфизмов должно иметь большее сходство с доставкой объекта к нужным клеткам. Достижение слияния между протеином фаговой оболочки и биспецифическими антителами также входит в объем настоящего изобретения.
В результате векторы доставки генов, направленные на один или более из рецепторов, можно легко получить в соответствии с раскрытыми здесь способами. В другом варианте часть (части) гибридного антитела нацеливают на другие лиганды в противоположность специфическим рецепторам скорее, нежели направляют антитела непосредственно к родственным рецепторам. Такая процедура может быть особенно полезной в ситуациях, когда способность лиганда связывать свой родственный рецептор зависит от способности лиганда достигать вторичной или третичной структуры, что вовсе не так легко осуществить, если лиганд был включен в протеин слияния лиганд-фаг.
Например, химерные антитела, включая рецептор-связывающие лиганды в месте их константного участка, такие, как те, которые описаны в опубликованной РСТ публикации WO 91/14438, можно использовать, как здесь раскрыто. Более того, биспецифические антитела, созданные, как раскрыто в опубликованной патентной заявке Великобритании GB 2197323, также предпочтительны для использования в настоящем изобретении. Далее, мостиковые антитела, такие как те, которые описаны в опубликованной РСТ публикации WO 92/08801, могут быть полезны при лечении состояний, при которых желательно "удлиненное по времени выделение" терапевтических нуклеотидных последовательностей. Так, использование биспецифических антител, которые связывают фаговый вектор с мишеневой клеткой во время совместного или последующего введения векторов, несущих высокоспецифичные протеазы, рибозимы или дезоксирибозимы, которые высвобождают связанные векторы, тем самым обеспечивая им возможность непосредственно связываться с их целевым рецептором и интернализовать вектор, также входят в объем настоящего изобретения.
Для того чтобы быть полезными в нацеливании векторов бактериофагов, рекомбинантный протеин слияния должен связываться с родственным рецептором. Протеины слияния можно анализировать в отношении их связывающей способности в анализе ELISA в соответствии с известными методиками. Для проверки функциональности домена связывания рецептора анализ связывания и интернализации можно осуществить на рецептор-позитивных клетках, а специфичность связывания определить, включая немеченый протеин слияния в качестве конкурента в стандартные схемы.
В одном из примерных способов интернализацию протеина слияния определяют, предварительно инкубируя рецептор-позитивные клетки с меченым протеином слияния, промывая клетки для удаления несвязанного меченого протеина и осуществляя дальнейшие инкубирования при заранее определенных температурах и для различных временных интервалов, для того чтобы обеспечить интернализацию рецепторов. После удаления связанного с поверхностью радиомеченного протеина клетки подвергают лизису и радиоактивность определяют для клеточного лизата. Этот анализ определяет способность протеинов слияния связываться с родственным рецептором в контексте протеина слияния.
Для облегчения присоединения последовательности лиганда к последовательности фага, протеин фага можно модифицировать на молекулярном уровне. Так, нуклеотидную последовательность, кодирующую терапевтическую молекулу, токсин или другие регуляторные молекулы, можно функционально связать для экспрессии с нуклеотидной последовательностью фага, в особенности с последовательностью, кодирующей структурный протеин. Например, протеин III или протеин VII нитевидного фага (например, М13) можно модифицировать путем присоединения гетерологичной нуклеотидной последовательности к С-концу гена, кодирующего указанный протеин. В другом варианте, одну или более из гетерологичных последовательностей можно встроить по внутреннему сайту, например, внутрь последовательности протеина фаговой оболочки. Различные способы получения таких слияний доступны специалистам и раскрыты в настоящем изобретении.
И, наконец, следует учитывать, что фаговые протеины можно модифицировать способами, которые не являются в точности "иммунологическими" или "генетическими". Модификация фаговых протеинов способами, которые отличаются от представленных здесь в качестве примеров, полностью входят в объем настоящего изобретения. Например, полезные векторы на основе нитевидных фагов настоящего изобретения можно подвергнуть химическим изменениям их оболочковых протеинов, например, таким способом, который влияет на иммуногенность векторов, для того чтобы регулировать захват и устойчивость векторов в клетках индивидуума, которому вводят раскрытые здесь терапевтические конструкции и композиции. Способы осуществления таких изменений протеинов химическими или физическими способами (например, термошок) известны специалистам, и могут быть легко найдены в соответствующей литературе.
В. Использование антител для связывания вектора и лиганда
Вариантом процедур, раскрытых выше, которые направлены на получение протеинов слияния, является использование биспецифических антител или их фрагментов, например, в форме биспецифических ScFv для нацеливания фага на конкретный клеточный рецептор, используя антитело или его часть, которое выработано против протеина фаговой оболочки и связывает это антитело с одним из тех, которые были выработаны против лиганда. Хотя это не совсем то же, что конструкция протеина слияния, различные методики, суммированные выше (например, в отношении получения ScFv), можно использовать для получения биспецифических антител для использования по способу настоящего изобретения.
Вариантом процедур, раскрытых выше, которые направлены на получение протеинов слияния, является использование биспецифических антител или их фрагментов, например, в форме биспецифических ScFv для нацеливания фага на конкретный клеточный рецептор, используя антитело или его часть, которое выработано против протеина фаговой оболочки и связывает это антитело с одним из тех, которые были выработаны против лиганда. Хотя это не совсем то же, что конструкция протеина слияния, различные методики, суммированные выше (например, в отношении получения ScFv), можно использовать для получения биспецифических антител для использования по способу настоящего изобретения.
В другом варианте протеин слияния, включающий протеин фаговой оболочки и моноспецифическое антитело, полезен для связывания фагового вектора с лигандом. Получение антитела или его фрагмента очевидно специалистам; см. также раздел А выше. Часть антитела из конструкции антитело-протеин слияния предпочтительно вырабатывают против предварительно выбранного лиганда, например такого, который нелегко включается в протеин слияния, возможно, из-за конформационных трудностей. Такой протеин антитело-фаговая оболочка можно затем использовать для связывания лиганда, который направляет специфический рецептор к фаговому вектору, с целью доставки объекта к клетке, экспрессирующей соответствующий родственный рецептор.
С. Использование авидин-биотина для связывания бактериофага с лигандом
Одним из способов нацеливания фага на клеточные рецепторы является связывание фага с лигандом за счет авидин-биотина, что можно осуществить следующим образом. Комплекс лиганд-фаг образуют в присутствии тестируемых клеток при 0oС с последующим инкубированием при 37oС для осуществления интернализации. Молекулу лиганда конъюгируют с биотином по одной свободной сульфгидрильной группе, используя биотин-ВМСС (Pierce; Rockfold, IL) в соответствии с указаниями изготовителя. Непрореагировавший биотин удаляют, пропуская реакционную среду через обессоливающую колонку PD-10.
Одним из способов нацеливания фага на клеточные рецепторы является связывание фага с лигандом за счет авидин-биотина, что можно осуществить следующим образом. Комплекс лиганд-фаг образуют в присутствии тестируемых клеток при 0oС с последующим инкубированием при 37oС для осуществления интернализации. Молекулу лиганда конъюгируют с биотином по одной свободной сульфгидрильной группе, используя биотин-ВМСС (Pierce; Rockfold, IL) в соответствии с указаниями изготовителя. Непрореагировавший биотин удаляют, пропуская реакционную среду через обессоливающую колонку PD-10.
Культивируемые клетки (например, COS клетки) инкубируют в течение заранее определенного промежутка времени (например, в течение 24 часов) перед добавлением фага. Клетки промывают, и затем добавляют биотинилированный лиганд (часто на льду), и препарат инкубируют в течение заранее определенного промежутка времени. Добавляют авидин (например, Neutravidin, нейтральный, лишенный углеводов авидин; Pierce; Rockfold, IL) и клетки повторно промывают. Добавляют биотинилированное антифаговое антитело (такое как анти-М13 антитело, если фагом является М13) и инкубируют в течение заранее определенного промежутка времени. Клетки снова промывают и добавляют достаточное количество колоний образующих единиц в каждую лунку или ячейку с последующим дальнейшим инкубированием, предпочтительно на льду. Клетки снова промывают, снова суспендируют в свежей среде, и обеспечивают дальнейшее инкубирование в течение соответствующего промежутка времени при определенной заранее температуре. После этого определяют экспрессию агента, кодируемого последовательностью терапевтической нуклеиновой кислоты, транспортированной фаговым вектором. В различных предпочтительных вариантах вектор еще включает репортерный ген, такой как EGFP, который можно легко контролировать с помощью флуоресцентной микроскопии или с помощью сортера активированных флуоресценцией клеток (FACS) в соответствии со стандартными способами.
D. Ковалентное связывание/химическая конъюгация
1. Связывание лигандов с бактериофагом с помощью поликатионов
Лиганд может быть альтернативно связан с поликатионом, таким как полилизин, который затем связывают с фагемидными частицами в результате взаимодействия позитивно заряженного поликатиона и негативно заряженного фага. В одной из приведенных в качестве примера процедур лиганд ковалентно связывают с полилизином, используя S-2-пиридилдисульфид (SPDP) известным способом (например, Sosnowski et al. , J.Bioi. Chem. 271:33647-33653, 1996). Затем фагемидные частицы смешивают с конструкцией лиганд-полилизин или одним только полилизином и оставляют при комнатной температуре на заранее определенный
промежуток времени перед тем, как тестировать конъюгаты в культивируемых клетках, или перед ex vivo или in vivo введением. Для подтверждения экспрессии можно включить в конструкцию лиганд-полилизин-фаг репортерную последовательность; флуоресцентные маркеры, такие как GFP и флуоресцин, особенно полезны для in vitro анализов.
1. Связывание лигандов с бактериофагом с помощью поликатионов
Лиганд может быть альтернативно связан с поликатионом, таким как полилизин, который затем связывают с фагемидными частицами в результате взаимодействия позитивно заряженного поликатиона и негативно заряженного фага. В одной из приведенных в качестве примера процедур лиганд ковалентно связывают с полилизином, используя S-2-пиридилдисульфид (SPDP) известным способом (например, Sosnowski et al. , J.Bioi. Chem. 271:33647-33653, 1996). Затем фагемидные частицы смешивают с конструкцией лиганд-полилизин или одним только полилизином и оставляют при комнатной температуре на заранее определенный
промежуток времени перед тем, как тестировать конъюгаты в культивируемых клетках, или перед ex vivo или in vivo введением. Для подтверждения экспрессии можно включить в конструкцию лиганд-полилизин-фаг репортерную последовательность; флуоресцентные маркеры, такие как GFP и флуоресцин, особенно полезны для in vitro анализов.
В контексте процедуры анализа обработанные клетки исследуют обычными способами (например, с помощью флуоресцентной микроскопии или FACS). Далее, если репортерной последовательностью является EGFP, подсчитывают автофлуоресцентные GFP позитивные клетки для подтверждения того, что GFP ген (и присоединенные к нему нуклеотидные последовательности) были успешно трансдуцированы в клетки за счет фага, связанного с лигандом через полилизин. Этот метод фаговой трансдукции представляет привлекательную альтернативу применению описанной здесь системы авидин-биотин.
2. Связывание лигандов с бактериофагом с использованием перекрестносшивающих реагентов
Оболочковые протеины бактериофага, предпочтительно нитевидного бактериофага, можно конъюгировать непосредственно с лигандом, используя гетеробифункциональные перекрестносшивающие реагенты. Например, свободный лизин с N-конца гена VIII оболочкового протеина М13 фага доступен для химической модификации (Armstrong et al., EMBO J. 2:1641-1646, 1983) и может быть с успехом использован для этой цели. Обычно процедуру можно описать следующим образом.
Оболочковые протеины бактериофага, предпочтительно нитевидного бактериофага, можно конъюгировать непосредственно с лигандом, используя гетеробифункциональные перекрестносшивающие реагенты. Например, свободный лизин с N-конца гена VIII оболочкового протеина М13 фага доступен для химической модификации (Armstrong et al., EMBO J. 2:1641-1646, 1983) и может быть с успехом использован для этой цели. Обычно процедуру можно описать следующим образом.
Вначале тиолируют фаговые частицы (например, добавляя SPDP) в течение заранее определенного промежутка времени и при определенной температуре. Непрореагировавший реагент удаляют; затем осуществляют реакцию лиганда с тиолированным фагом. Свободный лиганд удаляют, а связанный с лигандом фаг очищают далее в соответствии со стандартными схемами. В аналогичных процедурах можно использовать N-сукцинимидил S-ацетилтиоацетат (SATA) и другие подходящие гетеробифункциональные химические реагенты для введения тиольной функции, а не SPDP в соответствии с известными способами. Например, выбранный линкер или линкеры связывают с рецептор-связывающими интернализованными лигандами с помощью химических реакций, обычно полагаясь на доступный тиол или аминогруппу на рецептор-связывающих интернализованных лигандах. Гетеробифункциональные линкеры особенно подходят для химической конъюгации) и включают такие молекулы, как сложный эфир m-малеимидобензоил-N-гидроксисульфосукциниимида, N-сукцинимидил-(4-иодоацетил)амино-бензоат и N-сукцинимидил-3-(2-пиридилтио)пропионат (например, опубликованные патентные заявки Великобритании GB 2268492, 2253626 и 2257431, включенные сюда в качестве ссылки).
Связь лиганда с фаговым протеином легко подтвердить с помощью гель-электрофореза в полиакриламидном геле и иммуно-блоттинга фаговых протеинов. Например, в невосстанавливающих условиях модифицированный лигандом протеин гена VIII оказывается измененным по его очевидной молекулярной массе в несвязанной форме в сторону значительно большей очевидной молекулярной массы, если связь оказывается успешной. Добавление восстанавливающего агента к образцовому буферу разрушает дисульфидную связь и приводит к получению свободного лиганда и протеина гена VIII.
Затем химически модифицированные конструкции лиганд-фаг можно проанализировать по их способности к трансдукции клеток млекопитающих. Лиганд-модифицированные фагемидные частицы, несущие экспрессионную кассету, содержащую промотор и репортерную последовательность, добавляют к посеянным клеткам в многоячейковых планшетах. Клетки анализируют на предмет экспрессии маркерного протеина через заранее определенные интервалы после добавления конструкций лиганд-фаг.
3. Дополнительные способы связывания
Другие способы химического связывания лиганда с фаговыми частицами включают экспрессию специфического реакционноспособного фрагмента на поверхности фаговой частицы, где этот фрагмент затем конъюгируют специфически и непосредственно с выбранным лигандом. Примеры реакционноспособных фрагментов, которые можно легко сконструировать на поверхности протеина фаговой частицы, включают различные связывающие протеины, протеин А, цистеин и широкий круг реакционноспособных групп (например, опубликованные патентные заявки Великобритании GB 2268492 и 2257431, включенные сюда в качестве ссылки).
Другие способы химического связывания лиганда с фаговыми частицами включают экспрессию специфического реакционноспособного фрагмента на поверхности фаговой частицы, где этот фрагмент затем конъюгируют специфически и непосредственно с выбранным лигандом. Примеры реакционноспособных фрагментов, которые можно легко сконструировать на поверхности протеина фаговой частицы, включают различные связывающие протеины, протеин А, цистеин и широкий круг реакционноспособных групп (например, опубликованные патентные заявки Великобритании GB 2268492 и 2257431, включенные сюда в качестве ссылки).
Способы конструирования таких фрагментов на поверхности фаговых частиц доступны специалистам и были также раскрыты в предыдущих разделах. Например, способ сайт-специфического мутагенеза можно использовать для изменения последовательности аминокислотных остатков протеина фаговой оболочки, тем самым облегчая связывание лиганда с родственным сайтом (сайтами). После этого предварительно выбранный лиганд (например, полипептид, который связывается с FGF рецептором) конъюгируют с поверхностью фага за счет реакционноспособного фрагмента. В добавлении к FGFR-связывающим полипептидам другие полезные лиганды, которые можно конъюгировать с поверхностью фаговых частиц, включают антитела и их фрагменты (например, 11А8), включая в качестве примеров одноцепочечные антитела и цистеин.
Другие лиганды также можно присоединить к оболочковым протеинам фаговой поверхности. Размер слияний с оболочковыми протеинами может быть небольшим, как в мелких случайных пептидах размером от 6 (Scott и Smith, Science, 249: 386-390, 1990) до 38 аминокислот (Кау, Gene 128:59-65, 1993), из которых были выделены пептиды, которые связываются с рецепторами клеточной поверхности. Молекулы протеинов, такие как фрагменты Fab антитела (~50 кДa), также были слиты с протеинами фаговой оболочки. Целые протеины, такие как щелочная фосфатаза, ингибитор трипсина поджелудочной железы быка, трипсин, β-лактамаза, цитокин IL3 и глутатион-S-трансфераза, PDGF рецептор (Chiswell и McCafferty, Trends Biotechnol. 10: 80, 1992) и IgE эктодомен (Robertson, J. Biol. Chem. 268: 12736, 1993) также были слиты с поверхностью фага. Известен к настоящему времени справочный список протеинов, представленных на фаге см. www.unc.edu/depts/biology/bkay/phagedisplay/html. Экспрессия мелких пептидов на поверхности фагов существенно эффективна, тогда как более крупные пептиды экспрессируются в количестве примерно 50 копий до менее 1 копии на фаг.
Е. Размножение модифицированного фага
Модифицированный фаг размножают по способу Sambrook et а1. Подходящую бактерию-хозяина, которая содержит F' эписому, выращивают из выделенной колонии до середины логарифмической фазы роста. Изоляты бактериофага можно отобрать с бляшек, которые образуются на газоне инфицированных клеток, выращиваемых на полутвердой среде. Мутные бляшки являются более медленно растущими инфицированными клетками, которые видны невооруженным глазом на газоне более плотных неинфицированных бактерий. Запас бляшек можно получить в жидкой культуральной среде из хорошо выделенных бляшек. Около 1/10 фагов из одной бляшки используют для инфицирования 50 мкл бактерий-хозяев в 2 мл среды. Культуру инкубируют при 37oС в течение 5-6 часов при постоянном перемешивании. Более длительных времен инкубирования следует избегать для предотвращения делеционных мутантов. Бактерии осаждают микроцентрифугированием, и надосадочную жидкость переносят в свежую ампулу. Титр фага в надосадочной жидкости должен быть около 1012 бое/мл, и его можно хранить при 4oС или неограниченно долго при -20oС.
Модифицированный фаг размножают по способу Sambrook et а1. Подходящую бактерию-хозяина, которая содержит F' эписому, выращивают из выделенной колонии до середины логарифмической фазы роста. Изоляты бактериофага можно отобрать с бляшек, которые образуются на газоне инфицированных клеток, выращиваемых на полутвердой среде. Мутные бляшки являются более медленно растущими инфицированными клетками, которые видны невооруженным глазом на газоне более плотных неинфицированных бактерий. Запас бляшек можно получить в жидкой культуральной среде из хорошо выделенных бляшек. Около 1/10 фагов из одной бляшки используют для инфицирования 50 мкл бактерий-хозяев в 2 мл среды. Культуру инкубируют при 37oС в течение 5-6 часов при постоянном перемешивании. Более длительных времен инкубирования следует избегать для предотвращения делеционных мутантов. Бактерии осаждают микроцентрифугированием, и надосадочную жидкость переносят в свежую ампулу. Титр фага в надосадочной жидкости должен быть около 1012 бое/мл, и его можно хранить при 4oС или неограниченно долго при -20oС.
IV. ТРАНСДУЦИРУЮЩИЕ ГЕНЫ
Трансдуцирующий ген в том смысле, как здесь раскрыто, относится к гену, который кодирует дедектируемый продукт в целевой клетке. Предпочтительно, чтобы трансдуцирующий ген был терапевтическим геном. Термины "терапевтическая нуклеиновая кислота" или "терапевтический ген" описывают любую молекулу нуклеиновой кислоты, используемую в контексте настоящего изобретения, которая осуществляет лечение, обычно за счет модификации транскрипции или трансляции гена. Она включает (но ими не ограничивается) следующие типы нуклеиновых кислот: нуклеиновые кислоты, кодирующие протеин, рибозим, антисмысловую нуклеиновую кислоту, ДНК, предназначенную для образования триплексных молекул, протеин, связывающий нуклеиновые кислоты и небольшие нуклеотидные молекулы. Как таковой продукт терапевтического гена может быть ДНК или РНК. Эти генные последовательности могут быть природно полученными последовательностями или полученными рекомбинантными методами. Терапевтическую нуклеиновую кислоту можно использовать для осуществления генной терапии, когда она служит взамен дефективного гена, путем кодирования терапевтического продукта, такого как TNF, или путем кодирования цитотоксической молекулы, особенно фермента, такого как сапорин. Терапевтическая нуклеиновая кислота может кодировать весь ген или его часть и может функционировать, рекомбинируя ДНК, которая уже присутствует в клетке, заменяя тем самым дефективную часть гена. Она может также кодировать часть протеина и проявлять этот эффект путем сосупрессии генного продукта.
Трансдуцирующий ген в том смысле, как здесь раскрыто, относится к гену, который кодирует дедектируемый продукт в целевой клетке. Предпочтительно, чтобы трансдуцирующий ген был терапевтическим геном. Термины "терапевтическая нуклеиновая кислота" или "терапевтический ген" описывают любую молекулу нуклеиновой кислоты, используемую в контексте настоящего изобретения, которая осуществляет лечение, обычно за счет модификации транскрипции или трансляции гена. Она включает (но ими не ограничивается) следующие типы нуклеиновых кислот: нуклеиновые кислоты, кодирующие протеин, рибозим, антисмысловую нуклеиновую кислоту, ДНК, предназначенную для образования триплексных молекул, протеин, связывающий нуклеиновые кислоты и небольшие нуклеотидные молекулы. Как таковой продукт терапевтического гена может быть ДНК или РНК. Эти генные последовательности могут быть природно полученными последовательностями или полученными рекомбинантными методами. Терапевтическую нуклеиновую кислоту можно использовать для осуществления генной терапии, когда она служит взамен дефективного гена, путем кодирования терапевтического продукта, такого как TNF, или путем кодирования цитотоксической молекулы, особенно фермента, такого как сапорин. Терапевтическая нуклеиновая кислота может кодировать весь ген или его часть и может функционировать, рекомбинируя ДНК, которая уже присутствует в клетке, заменяя тем самым дефективную часть гена. Она может также кодировать часть протеина и проявлять этот эффект путем сосупрессии генного продукта.
Как обсуждалось выше, терапевтический ген представлен в функциональной связи с выбранным промотором и необязательно в функциональной связи с другими элементами, которые принимают участие в транскрипции, трансляции, локализации, стабильности и т.п.
Композиция терапевтических нуклеотидов настоящего изобретения имеет длину от около 20 пар оснований до около 100000 пар оснований. Предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты содержала от около 50 пар оснований до около 50000 пар оснований. Более предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты содержала от около 50 пар оснований до около 10000 пар оснований. И еще более предпочтительно, чтобы молекула нуклеиновой кислоты содержала от около 50 пар оснований до около 4000 пар оснований.
Такие композиции нуклеиновых кислот можно доставить с помощью бактериофага настоящего изобретения различными способами, включая например, in vitro, in vivo,и ex vivo способы трансдукции.
А. Замена или усиление гена
Нуклеиновые кислоты для доставки включают также молекулы ДНК, которые кодируют протеины, которые должны заменить дефективные гены или обеспечить доставку факторов для борьбы с некоторыми заболеваниями или синдромами. Многие генетические дефекты вызваны мутациями в единичном гене. Введение гена дикого типа будет служить для ослабления дефицита или генетических отклонений. Такие гены включают HPRT, аденозиндеаминазу, LDL рецептор, фактор IX, фактор VIII, гормон роста, фактор von Willebrand, PTH (паратироидный гормон), M-CSF, TGF-β, PDGF, VEGF, FGF, IGF, BMP (костный морфогенный протеин), коллаген типа VII, фибриллин, инсулин, регулятор трансмембранной проводимости при муковисцедозе, аденозиндиаминазу и т.п.
Нуклеиновые кислоты для доставки включают также молекулы ДНК, которые кодируют протеины, которые должны заменить дефективные гены или обеспечить доставку факторов для борьбы с некоторыми заболеваниями или синдромами. Многие генетические дефекты вызваны мутациями в единичном гене. Введение гена дикого типа будет служить для ослабления дефицита или генетических отклонений. Такие гены включают HPRT, аденозиндеаминазу, LDL рецептор, фактор IX, фактор VIII, гормон роста, фактор von Willebrand, PTH (паратироидный гормон), M-CSF, TGF-β, PDGF, VEGF, FGF, IGF, BMP (костный морфогенный протеин), коллаген типа VII, фибриллин, инсулин, регулятор трансмембранной проводимости при муковисцедозе, аденозиндиаминазу и т.п.
Так, например, при ишемии эндотелиальные клетки и клетки гладкой мускулатуры не могут пролиферировать. Конструкцию, которая экспрессирует FGF, отдельно или в сочетании с FGF протеином обеспечивает кратковременное облегчение и индуцирует FGF рецептор, можно использовать для борьбы с проявлениями ишемии. В этом случае предпочтителен FGF ген с лидерной последовательностью для стимулирования секреции. Кроме того, предпочтительно, чтобы FGF ген управлялся бы конститутивным промотором.
Кроме того, некоторые пациенты с ангиогенными заболеваниями страдают от недостатка ангиогенного фактора, и как следствие, наблюдается микрососудистая недостаточность. Некоторые аспекты репродукции, такие как овуляция, восстановление маток после менструаций и развитие плаценты зависят от ангиогенеза. Для репродуктивных расстройств, связанных с ангиогенной дисфункцией, могут оказаться благоприятными конструкции, которые экспрессируют FGF, VEGF или другие ангиогенные факторы.
Иммунотерапия цитокинами является модификацией иммуногенной терапии и включает введение вакцин опухолевых клеток, которые генетически модифицированы ex vivo или in vivo таким образом, чтобы экспрессировать различные гены цитокинов. В моделях с опухолями на животных перенос генов цитокинов приводил к значительной противоопухолевой иммунной реакции (Fearon et al., Cell 60: 387-403, 1990; Wantanabe et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 86: 9456-9460, 1989). Так, в настоящем изобретении используют фаги для доставки ДНК, кодирующей цитокины, такие как IL-12, IL-10, IL-2, GM-CSF, INF-γ, или МНС ген, такой как HLA-B7. Доставка этих генов будет изменять иммунную систему, повышая потенциал противоопухолевого иммунитета хозяина. В другом варианте ДНК, кодирующую костимулирующие молекулы, такие как В7.1 и В7.2, лиганды для CD28 и CTLA-4 соответственно можно также доставить для повышения иммунитета, обеспечиваемого Т клетками. Эти гены можно доставить совместно с генами цитокинов, используя те же самые или другие промоторы, и необязательно с внутренним связывающим рибосомы сайтом. Аналогично, экспрессия α-1,3-галактозил-трансферазы на опухолевых клетках обеспечит умерщвление клеток, опосредствованное комплементом.
Кроме того, приобретенные или комплексные мультиспецифические заболевания, такие как дефицит эритропротеина, вызванный почечной недостаточностью, болезнь Паркинсона (дефицит допамина), надпочечниковая недостаточность, иммунодефицит, циклическая нейтропения, можно лечить, используя терапевтические гены, доставляемые лигандами. В некоторых случаях желателен рост сосудов. Так как клетки гладкой мускулатуры выстилают сосуды, выгодна доставка эндотелиальных факторов роста, таких как FGF, особенно FGF2, VEGF, tie1 и tie2, через клетки гладкой мускулатуры.
В. Гены, кодирующие протеиновые цитоциды (включая пролекарства)
Цитоцид-кодирующим агентом является молекула нуклеиновой кислоты (например, ДНК или РНК), которая после интернализации клеткой и последующей транскрипции (если это ДНК) и/или трансляции в продукт становится цитотоксичной или цитостатичной для клетки, например, ингибируя клеточный рост за счет нарушения синтеза протеинов или в результате нарушения клеточного цикла. Такой продукт может действовать, расщепляя рРНК или рибонуклеопротеин, ингибируя фактор удлинения, расщепляя мРНК, или вследствие другого механизма, который уменьшает синтез протеина до такого уровня, что клетки не выживают. Этот продукт может быть протеином, рибозимом, дезоксирибозимом, антисмысловым и т.п.
Цитоцид-кодирующим агентом является молекула нуклеиновой кислоты (например, ДНК или РНК), которая после интернализации клеткой и последующей транскрипции (если это ДНК) и/или трансляции в продукт становится цитотоксичной или цитостатичной для клетки, например, ингибируя клеточный рост за счет нарушения синтеза протеинов или в результате нарушения клеточного цикла. Такой продукт может действовать, расщепляя рРНК или рибонуклеопротеин, ингибируя фактор удлинения, расщепляя мРНК, или вследствие другого механизма, который уменьшает синтез протеина до такого уровня, что клетки не выживают. Этот продукт может быть протеином, рибозимом, дезоксирибозимом, антисмысловым и т.п.
Примеры подходящих продуктов включают, без ограничений, сапорин, рицины, абрин, другие инактивирующие протеины рибосомы (RIP), экзотоксин Pseudomonas, ингибиторы ДНК, РНК или синтеза протеинов, антисмысловые нуклеиновые кислоты, другие ингибиторы метаболизма (например, молекулы, расщепляющие ДНК), пролекарства (например, тимидинкиназа из HSV и бактериальная цитозиндеаминаза), активируемый светом порфирин, рицин, А цепь рицина, RIP кукурузы, гелонин, токсин дифтерии, А цепь токсина дифтерии, трихозантин, тритин, противовирусный протеин лаконоса (РАР), противовирусный протеин мирабилиса (MAP), диантинус 32 и 30, абрин, монордин, бриодин, шига, каталитический ингибитор биосинтеза протеина из семян огурца (например, WO 93/24620) экзотоксин Pseudomonas, биологически активные фрагменты цитотоксинов и другие известные специалистам.
Предпочтительны молекулы ДНК, которые кодируют фермент, приводящий к гибели клеток, или усиливает подверженность клеток гибели после добавления другого продукта. Инактивирующие рибосомы протеины (RIP), которые включают рицин, абрин и сапорин, являются растительными протеинами, которые каталитически инактивируют рибосомы эукариотов. Инактивирующие рибосомы протеины инактивируют рибосомы, вмешиваясь в синтез протеина на стадии удлинения протеина. Например, инактивирующий рибосомы протеин сапорин является ферментом, который расщепляет рРНК и ингибирует синтез протеинов. Другие ферменты, которые ингибируют синтез протеинов, являются особенно подходящими для целей настоящего изобретения. Любые из этих протеинов, если не получены из млекопитающих, могут использовать предпочтительные для млекопитающих кодоны. Примеры предпочтительного использования кодонов см. в Current Protocols in Molecular Biology, и у Zhang et al. (Gene 105:61, 1991).
Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая пролекарство, может быть альтернативно использована в контексте настоящего изобретения. Пролекарства неактивны в клетке хозяина до тех пор, пока не появляется либо субстрат, либо активирующая молекула. В том смысле, как здесь использован, термин "пролекарство" обозначает соединение, которое в результате метаболизма или как-либо иначе превращает неактивное, нетоксичное соединение в биологически, фармацевтически, терапевтически или токсически активную форму соединения, или модифицируется после введения, образуя активное соединение в результате метаболизма или других процессов. Чаще всего пролекарство активирует соединение с незначительной цитотоксичностью или без цитотоксичности в токсическое соединение. Две из наиболее часто используемых молекул пролекарств, пригодные для целей настоящего изобретения, являются HSV тимидинкиназой и E.coli цитозиндеаминазой.
Короче, широкий круг генных продуктов, которые либо непосредственно, либо косвенно активируют соединение с незначительной цитотоксичностью (или вовсе без нее) в токсический продукт, можно использовать в контексте настоящего изобретения. В качестве примеров таких генных продуктов можно привести HSVTK (тимидинкиназу вируса герпес симплекс) и VZVTK (тимидинкиназу вируса варицелла зостер), которые селективно фосфорилируют некоторые пуринарабинозиды и замещенные пиримидиновые соединения. Фосфорилирование превращает эти соединения в метаболиты, которые являются цитотоксичными или цитостатичными. Например, экспонирование лекарств ганцикловира, ацикловира или любого из их аналогов (например FIAU, FIAC, DHPG) клеткам, экспрессирующим HSVTK, обеспечивает превращение лекарства в его соответствующую активную нуклеотидтрифосфатную форму.
Другие генные продукты, которые можно использовать в контексте настоящего изобретения включают E.coli гуанинфосфорибозил-трансферазу, которая превращает тиоксантин в токсичную тиоксантинмонофосфатную форму. (Besnard et al. , Mol. Cell. Biol. 7:4139-4141, 1987); щелочную фосфатазу, которая превращает неактивные фосфорилированные соединения, такие как митомицин-фосфат и доксорубицин-фосфат в токсичные дефосфорилированные соединения; грибковую (например, Fusarium охуsporum) или бактериальную цитозин-деаминазу, которая превращает 5-фторцитозин в токсичное соединение 5-фторурацил (Mullen, PNAS 89: 33, 1992); карбоксипептидазу G2, которая отщепляет глутаминовую кислоту от napa-N-бис(2-хлорэтил)аминобензоилглутаминовой кислоты, создавая при этом токсичную мустард бензойную кислоту; и пенициллин-V-амидазу, которая превращает производные доксорубицина и мелфалана в токсичные соединения (Vrudhula et al., J. of Med. Chem. 36(7):919-923, 1993; Kern et al., Canс. Immun. Immunother. 31(4):202-206, 1990). Более того, пригоден широкий круг Herpesviridae тимидинкиназ, включая вирусы герпеса как приматов, так и не приматов. Такие вирусы герпеса включают простой вирус герпеса типа 1 (McKnight et al., Nuc, Acids Res 8:5949-5964, 1980), простой вирус герпеса типа 2 (Swain и Galloway, J.Virol. 46:1045-1050, 1983), опоясывающий вирус Варицелла. (Davison и Scott, J.Gen.Virol. 67:1759-1816, 1986), вирус герпеса игрунка (Otsuka и Kit, Virology 135:316-330, 1984), кошачий вирус герпеса типа 1 (Nunberg et al., J.Virol. 63:3240-3249, 1989), вирус псевдобешенства (Kit и Kit, патент США 4514497, 1985), лошадиный вирус герпеса типа 1 (Robertson и Whalley, Nuc. Acids Res. 16:11303-11317, 1988), бычий вирус герпеса типа 1 (Mittal и Field, J.Virol 70:2901-2918, 1989), индюшачий вирус герпеса (Martin et al., J.Virol. 63:2847-2852, 1989), вирус болезни Марека (Scott et al. , J. Gen. Virol. 70:3055-3065, 1989), вирус герпеса Саимири (Honess et al. , J.Gen, Virol. 70:3003-3013, 1989) и вирус Эпштейна-Барра (Baer et al., Nature (London) 310:207-311, 1984). Такие вирусы герпеса можно легко получить из коммерческих источников, таких как American Type Culture Collection ("ATCC"; Manassas, VA).
Кроме того, как указано выше, широкий круг неактивных предшественников можно превратить в активные ингибиторы. Например, тимидинкиназа может фосфорилировать нуклеозиды (например, dT) и аналоги нуклеозидов, такие как ганцикловир (9-{ [2-гидрокси-1-(гидроксиметил)этоксил метил}гуанозин], фамцикловир, буцикловир, пенцикловир, валцикловир, ацикловир (9-[2-гидрокси этокси)метил]гуанозин), трифтортимидин, 1-[2-дезокси, 2-фтор, бета-D-арабино фуранозил] -5-иодоурацил, ара-А (аденазин-арабинозид, виварабин), 1-бета-D-арабинофураноксил тимин, 5-этил-2'-дезоксиуридин, 5-иодо-5'-амино-2,5'-дидезоксиуридин, идоксиуридин (5-йодо-2'-дезоксиуридин), AZT (3' азидо-3' тимидин), ddC (дидезоксицитидин), AIU (5-иодо-5' амино 2',5'-дидезоксиуридин) и АrаС (цитидинарабинозид). Другие генные продукты могут делать клетки подверженными токсическим агентам. Такие продукты включают фактор некроза опухоли, вирусные протеины и мембранные протеины, которые транспортируют лекарства.
Более того, цитоцид-кодирующий агент можно сконструировать как пролекарство, которое, будучи экспрессировано в клетки подходящего типа, процессируется или модифицируется в активную форму. Например, ген сапорина можно сконструировать с N- или С-терминальными липкими концами, содержащими протеазочувствительный сайт. Липкие концы делают исходно транслированный протеин неактивным, и последующее расщепление в клетке, экспрессирующей соответствующую протеазу, возвращает ферментную активность.
Последовательности ДНК этих продуктов хорошо известны (GenBank). Молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую одну из них, можно выделить стандартными способами, такими как амплификация (например, ПЦР), зондовая гибридизация геномной или кДНК библиотек, скринирование антителами экспрессионных библиотек, химический синтез, или их можно получить из коммерческих или других источников.
Дополнительные типы цитоцидов, которые можно доставить способами настоящего изобретения, являются молекулы антител, которые предпочтительно экспрессированы внутри целевых клеток, поэтому этим молекулам антител было дано название "интратела". Обычные способы получения антител и их секвенирования можно использовать для получения интрател и кодирующих их последовательностей нуклеиновых кислот, именно сайт действия интрател придает определенную новизну таким молекулам. (Для обзора различных способов и композиций, полезных для изменения функций протеинов в клетках в результате использования интрател, см. опубликованную международную заявку WO 96/07321).
Интратела представляют собой антитела и производные антител (включая одноцепочечные антитела или "SCA"), введенные в клетки как трансгены, которые связываются с внутриклеточным протеином или инкапсулируются в нем в клетках, которые экспрессируют антитела. В том смысле, как здесь использован термин, интратела охватывают моноклональные, одноцепочечные антитела, V участки и т. п., если только они связываются с целевым протеином. Интратела к протеинам, которые участвуют в репликации клеток, опухолегенезе и т.п. (например, HER2/neu, VEGF, VEGF рецептор, FGF рецептор, FGF) особенно полезны.
Например, антитела к HER2/neu (называемые также еrbВ-2) можно использовать для ингибирования функций этого протеина. HER2/neu играет центральную роль в развитии некоторых опухолей молочной железы и яичников человека, а также карциномы легких. Так, ингибирование функций HER2/neu может привести к замедлению или остановке роста опухоли (например, патент США 5587458). С учетом того факта, что HER2/neu является рецепторным протеином, он может также функционировать как "мишень" для антитела, конъюгированного с поверхностью фаговой частицы, как далее раскрыто по всему описанию.
С. Антимысловые последовательности и рибозимы
Представленные здесь конъюгаты можно также использовать для доставки рибозима, антисмысловой последовательности, и т.п. к целевым клеткам. Такие продукты включают антисмысловые РНК, антисмысловые ДНК, рибозимы, дезоксирибозимы, образующие триплекс олигонуклеотиды и олигонуклеотиды, которые связывают протеины. Нуклеиновые кислоты могут также включать РНК транспортные сигналы, такие как последовательности упаковки вирусов (например, Sullenger et al., Science 262:1566, 1994).
Представленные здесь конъюгаты можно также использовать для доставки рибозима, антисмысловой последовательности, и т.п. к целевым клеткам. Такие продукты включают антисмысловые РНК, антисмысловые ДНК, рибозимы, дезоксирибозимы, образующие триплекс олигонуклеотиды и олигонуклеотиды, которые связывают протеины. Нуклеиновые кислоты могут также включать РНК транспортные сигналы, такие как последовательности упаковки вирусов (например, Sullenger et al., Science 262:1566, 1994).
Нуклеиновые кислоты и олигонуклеотиды, предназначенные для использования как раскрыто выше, можно синтезировать любым известным специалистам способом (например, WO 93/01286, заявку США 07/723454, патенты США 5218088, 5175269, 5109124). Идентификация олигонуклеотидов и рибозим для использования в качестве антисмысловых агентов и ДНК кодирующих генов для целевой доставки при генной терапии включает известные специалистам способы. Например, нужные свойства, длины и другие характеристики таких олигонуклеотидов хорошо известны. Антисмысловые олигонуклеотиды можно сконструировать так, чтобы они были устойчивы к расщеплению под действием эндогенных нуклеолитических ферментов, используя связи, такие как фосфоротиолат, метилфосфонат, сульфон, сульфат, кетил, фосфородитиоат, фосфороамидат, сложные фосфатные эфиры и т. п. (например, Stein в: Oligodeoxynucleotides. Аntisense Inhibitors of Gene Expression, Cohen, Ed, Macmillan Press, London, с. 97-117, 1989); Jager et al., Biochemistry 27:7237, 1988).
Антисмысловыми нуклеотидами являются олигонуклеотиды, которые связываются последовательность-специфическим образом с нуклеиновыми кислотами, такими как мРНК или ДНК. Будучи связаны с мРНК, которая содержит комплементарные последовательности, антисмысловой олигонуклеотид предотвращает трансляцию мРНК (например патенты США 5168053, 5190931, 5135917, 5087617). Триплексные молекулы относятся к сигнальным ДНК цепочкам, которые связывают дуплекс ДНК, образуя колинеарную триплексную молекулу, предотвращая тем самым транскрипцию (например патент США 5176996).
Особенно полезными антисмысловыми нуклеотидами и триплексными молекулами являются молекулы, которые комплементарны или связаны со смысловой цепочкой ДНК или мРНК, которые кодируют протеин, участвующий в клеточной пролиферации, такой как онкоген или фактор роста, (например, bFGF, int-2, hst-1/K-FGF, FGF-5, hst-2/FGF-6, FGF-8). Другие полезные антисмысловые олигонуклеотиды включают те, которые специфичны для IL-8 (например, патент США 5241049), c-src, c-fos H-ras (рак легких), K-ras (рак молочной железы), урокиназа (меланома), BCL2 (лимфома Т-клеток), IGF-1 (глиобластома), IGF-1 рецептор (глиобластома), TGF-β1 и CRIPTO EGF рецептор (рак толстой кишки). Эти конкретные антисмысловые плазмиды снижают опухолегенность у атимичных и сингенных мышей.
Рибозим является РНК молекулой, которая специфически расщепляет РНК субстраты, такие как мРНК, что приводит к ингибированию или нарушению роста клеток или экспрессии. Существует, по крайней мере, пять классов рибозимов, принимающих участие в расщеплении и/или лигировании РНК цепей. Рибозимы можно направить к любому РНК транскрипту, и они могут каталитически расщепить этот транскрипт (например, патент США 5272262, патент США 144019 и патенты США 5168053, 5180818, 5116742 и 5093246).
Кроме того, ингибиторы или индуцируемая синтаза окиси азота (NOS) и эндотелиальная синтаза окиси азота являются цитоцидами, которые пригодны для доставки к клеткам. Предполагается, что окись азота (NO) участвует в регуляции роста сосудов и тонуса при атеросклерозе. NO образуется из L-аргинина за счет синтазы окиси азота (NOS) и изменяет иммунную, воспалительную и сердечно-сосудистую реакцию.
Как здесь раскрыто, фаговые векторы настоящего изобретения можно использовать для доставки различных терапевтических последовательностей к целевым клеткам. В различных вариантах терапевтические последовательности кодируют или включают ферментные ДНК и/или РНК молекулы, которые способны расщеплять другие молекулы нуклеиновых кислот, включая молекулы ДНК, молекулы РНК и их гибриды. Так, векторы экспрессии, полезные в таких вариантах, также включены в объем настоящего изобретения (например, опубликованные международные заявки WO 92/06693, WO 96/17086 и WO 95/31551; и патенты США 4987071, 5580967 и 5595873, раскрытие которых включено сюда по ссылке).
Вкратце, используя ферментные РНК молекулы ("рибозомы") в качестве примера, способ создания векторов экспрессии ферментных РНК молекул включает обеспечение вектора, включающего нуклеиновую кислоту, кодирующую первый рибозим, и обеспечение одноцепочечной ДНК молекулы, кодирующей второй рибозим. Затем одноцепочечную ДНК подвергают отжигу с образованием частично дуплексной ДНК, которую можно достроить в результате обработки подходящим ферментом, таким как ДНК полимераза, в присутствии dNTPs с образованием дуплексной ДНК, которую затем можно лигировать в вектор.
Затем можно выбрать крупные векторы, получающиеся в результате использования этого способа, чтобы убедиться, что большое число копий одноцепочечной ДНК, кодирующей ферментную РНК молекулу, включено в вектор. Подходящие сайты рестрикционных эндонуклеаз также можно обеспечить для облегчения конструирования такого вектора в ДНК векторах или в реквизитных ДНК векторах РНК экспрессионной системы.
Настоящее изобретение также раскрывает экспрессию векторов, включая сегмент нуклеиновой кислоты, кодирующей ферментную ДНК или РНК молекулу, предпочтительно таким способом, который позволяет осуществить экспрессию этой НК молекулы в целевой клетке. Так, обычно вектор экспрессии, применяемый вместе с рибозимами или дезоксирибозимами, включает бактериальный, вирусный или эукариотный промотор в плазмидном, космидном, фагемидном, вирусном, вироидном или фаговом векторе. Другие подходящие векторы включают двухцепочечную ДНК (dsDNA), частично двухцепочечную ДНК, двухцепочечную РНК (dsRNA), частично двухцепочечную РНК, одноцепочечную РНК (ssRNA) или ДНК (ssDNA). Следует учитывать, что подходящие векторы настоящего изобретения не должны быть замкнутыми.
Предпочтительно также, чтобы нуклеотидная последовательность, кодирующая ферментную НК молекулу, была транскрипционно связана с промоторной последовательностью. Например, вектор настоящего изобретения может включать ферментную РНК молекулу под контролем вирусного промотора, такого как промотор вируса Эпштейн-Барра (EBV). Специалистам известны различные вирусные промоторы, пригодные для этой цели, (например, те, которые раскрыты в опубликованной РСТ заявке WO 93/23569, включенной сюда в качестве ссылки).
В другом варианте в вектор могут быть включены одна или более из дополнительных нуклеотидных последовательностей, кодирующих ферментную РНК молекулу, причем указанные дополнительные последовательности, кодирующие ферментную РНК молекулу, могут быть расположены с любой стороны или с обеих сторон нуклеотидной последовательности, кодирующей первую ферментную РНК молекулу. Предпочтительно, чтобы существовали прерывающие нуклеотиды или нуклеотидные последовательности между последовательными последовательностями, кодирующими ферментную РНК молекулу.
Если необходима доставка вектора, включающего рибозимную или дезоксирибозимную конструкцию, к эукариотной клетке, клеточные сплайсинговые механизмы в целевой клетке (клетках) можно использовать или интегрировать для отщепления терапевтической второй ферментной РНК молекулы (молекул) путем кодирования распознающих последовательностей для вторых ферментных РНК молекул внутри фланкирующих последовательностей экспрессированного транскрипта. Можно обеспечить множественные копии выделенной первой ферментной РНК молекулы для усиления выделения второй (т.е. терапевтической) ферментной РНК молекулы, если скорость превращения меньше, чем скорость расщепления второй ферментной РНК молекулы.
Способы создания векторов экспрессии ферментной РНК молекулы и продуцирования ферментных РНК молекул описаны более подробно в вышеуказанных опубликованных заявках и выданных патентах, включенных сюда в качестве ссылки.
V. КОМПОЗИЦИИ И ВВЕДЕНИЕ НОСИТЕЛЕЙ ДОСТАВКИ
Предложенные здесь конъюгаты и комплексы применимы для лечения и профилактики различных заболеваний, синдромов и гиперпролиферативных нарушений, таких как рестеноз, других заболеваний клеток гладкой мускулатуры, опухолей, таких как меланомы, рак яичников, нейробластомы, птеричий, вторичное помутнение хрусталика, и т. п. В том смысле, как здесь использован, термин "лечение" означает любой способ, при котором симптомы состояния, нарушения или заболевания ослабляются или как-либо изменяются в благоприятную сторону. Лечение также охватывает любое фармацевтическое использование композиций настоящего изобретения. В том смысле, как здесь использован, термин "ослабление" симптомов конкретного нарушения относится к любому уменьшению независимо от того, временное оно или постоянное, длительное или кратковременное, которое можно приписать или связать с введением композиции.
Предложенные здесь конъюгаты и комплексы применимы для лечения и профилактики различных заболеваний, синдромов и гиперпролиферативных нарушений, таких как рестеноз, других заболеваний клеток гладкой мускулатуры, опухолей, таких как меланомы, рак яичников, нейробластомы, птеричий, вторичное помутнение хрусталика, и т. п. В том смысле, как здесь использован, термин "лечение" означает любой способ, при котором симптомы состояния, нарушения или заболевания ослабляются или как-либо изменяются в благоприятную сторону. Лечение также охватывает любое фармацевтическое использование композиций настоящего изобретения. В том смысле, как здесь использован, термин "ослабление" симптомов конкретного нарушения относится к любому уменьшению независимо от того, временное оно или постоянное, длительное или кратковременное, которое можно приписать или связать с введением композиции.
В некоторых вариантах композиции настоящего изобретения можно использовать для лечения ангиогенеззависимых заболеваний. При таких заболеваниях наблюдается избыточный рост сосудов или нежелательный рост других тканей за счет притока крови. Такие заболевания включают ангиофиброму, артериовенозные злокачественные новообразования, артриты, атеросклеротические бляшки, неоваскуляризацию трансплантатов роговицы, замедленное заживление ран, диабетическую ретинопатию, грануляции, связанные с ожогами, гемангиомы, гемофилию суставов, гипертрофированные рубцы, неоваскулярную глаукому, переломы со смещением, синдром Osler-weber, псориаз, пиогенную гранулему, ретролентальную фиброплазию, склеродерму, твердые опухоли, трахому и слипание сосудов.
Путем ингибирования образования сосудов (ангиогенез), нежелательный рост можно замедлить или предотвратить, тем самым ослабив заболевание. В нормальном сосуде монослой эндотелиальных клеток выстилает просвет, и рост сосуда требует пролиферации эндотелиальных клеток и клеток гладкой мускулатуры.
Фаги настоящего изобретения можно также использовать для лечения опухолей. При этих заболеваниях рост клеток избыточен, или не поддается контролю. Опухоли, которые можно лечить в контексте настоящего изобретения, включают (но ими не ограничиваются) опухоли молочной железы, глиомы, меланомы, рак простаты, гепатомы, саркомы, лимфомы, лейкемии, опухоли яичников, тимомы, нефромы, рак поджелудочной железы, рак прямой кишки, рак головы и горла, рак желудка, рак легких, мезотелиомы, миеломы, нейробластомы, ретинобластомы, рак шейки матки, рак матки и карциному сквамозных клеток кожи. Для такого лечения выбирают такие лиганды, которые связываются с рецепторами клеток поверхности, которые обычно преимущественно экспрессируются в опухолях.
За счет доставки композиций настоящего изобретения нежелательный рост клеток можно замедлить или прекратить, тем самым ослабив заболевание. Способы, используемые в настоящем изобретении, специфически метят и убивают опухолевые клетки или прекращают пролиферацию опухолевых клеток, которые содержат рецепторы для лигандов на своих поверхностях.
Фаги также можно использовать для лечения или предотвращения атеросклероза и стеноза, процесс и возникающее вследствие этого состояние которых наблюдаются после ангиопластики, при которой наблюдается повторная закупорка артерий. Обычно лечение атеросклероза включает расширение просвета стенозного сосуда, обеспечивая больший поток крови и оксигенацию периферических тканей. К сожалению, эти процедуры вызывают обычные реакции заживления в сосудах, что приводит к рестенозу. Из трех компонентов нормальной реакции сосудов на повреждение, тромбоз, эластичную тягу и пролиферацию клеток гладкой мускулатуры, антитромботические/тромбоцитные ингибиторы и сосудистые стенты эффективно помогают при острых/подострых трмбозах и эластичной тяге соответственно. Однако никакая терапия не может изменить ремоделирование сосуда, которое связано с пролиферацией клеток гладкой мускулатуры в месте поражения, и отложение внеклеточной матрицы и последующее образование неоинтимы. Соответственно фаги можно использовать для доставки терапевтических нуклеоиновых кислот или протеинов, которые могли бы ингибировать рестеноз.
Раневая реакция наблюдается также после других вмешательств, таких как баллонная ангиопластика коронарных и периферических сосудов с или без стентов, каротидные эндартерэктомии; трансплантаты вен и синтетические трансплантаты периферических артерий и артериовенозные шунты. Хотя временной характер раневых реакций не вполне определен, длительного преимущества можно достичь, если такую реакцию можно подавить в течение короткого промежутка времени (примерно 2 недели).
В некоторых вариантах бактериофаги настоящего изобретения можно использовать для лечения различных генетических нарушений, таких как дефицит важных функциональных ферментов. Примеры таких заболеваний включают болезнь Гошера (дефицит глюкоцереброзидазы), мукополисахаридоз (дефицит бета-глюкуронидазы), гипераммонемию (дефицит оринитин-транскарбамилазы) и др.
Специалистам должно быть ясно, что фаги настоящего изобретения можно доставить in vivo путем введения индивидууму обычно путем системного введения (например, перорально, внутривенно, внутрибрюшинно, внутримышечно, подкожно или интракраниально) или путем местного применения (например, через кожу и мембраны слизистой оболочки). Используемые направленные лиганды, бактериофаги настоящего изобретения способны направляться к клеткам конкретного типа для трансдукции.
В другом варианте фаги настоящего изобретения можно доставить в клетки ex vivo. Ex vivo лечение предусматривает извлечение или удаление популяции клеток у пациента, трансдукцию с помощью бактериофага, содержащего терапевтическую нуклеиновую кислоту, и реимплантацию в организм пациента. Примеры процедур для осуществления обобщенной ех vivo генной терапии раскрыты в патентах США 5399346 и 5665350. Кроме того, клетки, которые были трансдуцированы фагами ех vivo, можно повторно вводить пациенту или животному способами, которые хорошо известны. (например, патенты США 5399346, 5665350, РСТ публикацию WO 92/15676 (заявляющую приоритет по США серийному 667169), РСТ публикацию WO 90/06997 (заявляющую приоритет по США серийному 283586)).
Примеры клеточных популяций для ех vivo трансдукции включают клетки костного мозга, клетки печени, клетки поджелудочной железы, все гемопоэтичные клетки и пупочные клетки. Такие клетки можно обработать для выделения нужной клеточной популяции для трансдукции, например, для получения специфического субнабора клеток для трансдукции. Предпочтительные способы очистки включают различные методики сортинга клеток, такие как пэннинг антител, FАСS и афинная хроматография, использующая матрицу с присоединенными антителами, специфически реакционноспособными с нужным субнабором клеток. Затем выделенные клетки можно трансдуцировать и повторно вводить пациенту или в другом варианте клетки можно размножить в культуре перед повторным введением.
А. Получение фармацевтических агентов
Фармацевтические носители или агенты доставки, пригодные для введения конъюгатов и комплексов, здесь представленные, включают любой из таких носителей, который, как известно специалистам, пригоден для конкретного способа введения. Кроме того, бактериофаг можно приготовить как отдельный фармацевтически активный ингредиент в композиции или можно объединить с другими активными ингредиентами.
Фармацевтические носители или агенты доставки, пригодные для введения конъюгатов и комплексов, здесь представленные, включают любой из таких носителей, который, как известно специалистам, пригоден для конкретного способа введения. Кроме того, бактериофаг можно приготовить как отдельный фармацевтически активный ингредиент в композиции или можно объединить с другими активными ингредиентами.
Бактериофаг можно вводить любым подходящим способом, например перорально, парентерально, включая внутривенное, чрезкожное, подкожное и местное введение, в жидкой, полужидкой или твердой форме, после приготовления его в форме, подходящей для каждого из способов введения. Предпочтительные способы введения зависят от лечебных показаний.
Бактериофаг можно подготовить в виде фармацевтических композиций, пригодных для локального, внутривенного и системного введения. Желательны также формы с отсроченным по времени выделением. Эффективные концентрации бактериофага смешивают с подходящим фармацевтическим носителем или агентом доставки. В том смысле, как здесь использован, термин "эффективное количество" соединения для лечения конкретного заболевания является таким количеством, которого достаточно для ослабления или каким-либо другим способом уменьшения симптомов, связанных с этим заболеванием. Такие количества можно вводить в виде единичной дозы или можно вводить в соответствии со схемой, если это эффективно. Это количество может вылечить заболевание, но обычно его вводят с целью ослабления симптомов заболевания. Для достижения необходимого ослабления симптомов может понадобиться повторное введение.
Фаговые векторы настоящего изобретения особенно подходят для перорального введения, и обладают способностью доставлять терапевтические генные последовательности на системном уровне в отличие от большинства векторов доставки генов, находящихся в настоящее время на стадии проверки и использования. Как было указано выше, фаги способны выдерживать жесткие условия окружающей среды и такие условия, как те, которые наблюдаются обычно в пищеварительном тракте млекопитающих; таким образом, они идеально подходят для приготовления и для введения пероральных/системных композиций. Дополнительным преимуществом раскрытых здесь векторов является тот факт, что многие из лигандов, описанных здесь как предпочтительные варианты, являются протеазоустойчивыми, такие лиганды особенно предпочтительны для использования в рецептурах и композициях, созданных для перорального/системного введения.
Терапевтически эффективные концентрации и количества можно определить эмпирически, тестируя конъюгаты и комплексы в известных in vitro и in vivo системах, таких, как здесь описаны; дозы для людей или других животных можно экстраполировать из них. Бактериофаг включен в фармацевтически приемлемый носитель в количестве, которого достаточно для проявления терапевтически полезного эффекта в отсутствии нежелательных побочных эффектов в отношении пациента. Фаг можно доставить в виде фармацевтически приемлемых солей, сложных эфиров или других производных конъюгатов, включая любые соли, сложные эфиры или производные, которые могут легко получить специалисты, используя известные методы для таких модификаций, в результате которых получают соединения, которые можно вводить животным или людям без существенных токсичных эффектов. Следует учитывать, что число и степень побочных эффектов зависит от состояния, для лечения которого вводят эти конъюгаты и комплексы. Например, некоторые токсичные и нежелательные побочные эффекты могут допускаться при лечении угрожающих жизни заболеваний, таких как опухоли, тогда как они недопустимы при лечении менее угрожающих заболеваний.
Растворы или суспензии, используемые для парентерального, внутрикожного, подкожного или местного введения могут включать любой из следующих компонентов: стерильный разбавитель, такой как вода для инъекций, физиологический раствор, густое масло, полиэтиленгликоль, глицерин, пропиленгликоль или другие синтетические растворители; антимикробные агенты, такие как бензиловый спирт и метилпарабен, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота и бисульфит натрия, хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA); буферы, такие как ацетаты, цитраты и фосфаты; и агенты для регулирования токсичности, такие как хлорид натрия или декстроза. Препараты для парентерального введения могут быть заключены в ампулы, одноразовые шприцы или флаконы, содержащие множество доз, выполненные из стекла, пластика или других подходящих материалов.
Для внутривенного введения подходящие носители включают физиологический раствор или физиологический раствор с фосфатным буфером (PBS) и растворы, содержащие загущающие и солюбилизирующие агенты, такие как глюкоза, полиэтиленгликоль, пропиленгликоль и их смеси. Липосомные суспензии также можно использовать в качестве фармацевтически приемлемых носителей. Их можно получить в соответствии с известными специалистам методами.
Фаг может также быть смешан с другими активными материалами, которые не придают необходимого действия, или с материалами, которые дополняют необходимое действие.
Фаги можно приготовить с носителями, которые предотвращают их быстрое выведение из организма так, чтобы обеспечить композиции с замедленным выделением или с нанесенным покрытием. Такие носители включают композиции с контролируемым выделением, такие как (но ими не ограничиваются) имплантаты и микроинкапсулированные системы доставки, и биоразлагаемые, биосовместимые полимеры, такие как этиленвинилацетат, полиангидриды, полигликолевая кислота, сложные полиортоэфиры, полимолочная кислота и другие. Например, композицию можно нанести во время хирургической операции, используя тампоны, такие как коммерчески доступные тампоны (например, патенты США 3956044 и 4045238), пропитанные фагом. Фаг можно также принимать в виде пилюль (таких как пилюли Элвакса (сополимерная смола этилен-винилацетат)). Предпочтительные в этом плане носители включают генактивированную матрицу (GAM), как раскрыто в РСТ публикации WO 97/38729 (заявленный приоритет по США серийному номеру 08/631334) и РСТ публикация WO 95/22611 (заявленный приоритет по США серийному номеру 08/199780 и 08/316650). Короче, ген-активированная матрица является матрицей из любого материала, содержащей ДНК, кодирующую терапевтический агент, например бактериофаг настоящего изобретения. Далее предпочтительно, чтобы такие ген-активированные матрицы были получены из любого биосовместимого материала.
Если желательно пероральное введение, фаг следует ввести в композицию, которая защитит его от кислотной среды желудка, например в желудочное покрытие, или использовать в сочетании с антацидом. В другом варианте высушенные замораживанием бактерии, которые "инфицированы" фагом, можно использовать для целей перорального введения, так как они обладают способностью размножаться в кишечнике и выделять фаг.
Обычно композиции для перорального введения включают инертный разбавитель или съедобный носитель и могут быть спрессованы в таблетки или заключены в желатиновые капсулы. Таблетки, пилюли, капсулы, лепешки и т.п. могут содержать любые из следующих ингредиентов или соединений аналогичного характера: связующее, такое как микрокристаллическая целлюлоза, смола трагаканта и желатин; наполнитель, такой как крахмал и лактоза, разрыхляющий агент, такой как (но ими не ограничиваются) альгиновая кислота и кукурузный крахмал; смазывающий агент, такой как (но ими не ограничиваются) стеарат магния; скользящее, такое как (но ими не ограничиваются) коллоидная двуокись кремния; подслащивающий агент, такой как сахароза или сахарин, и корригент, такой как мята, метилсалицилат и фруктовые вкусовые добавки. Если единичная дозовая форма представляет собой капсулу, она может содержать помимо материала вышеуказанного типа такой жидкий носитель, как жирное масло.
И наконец, соединения могут быть упакованы согласно заводским технологиям по использованию упаковочного материала, один или более из конъюгатов и комплексов или композиций, предложенных в настоящем изобретении, внутри упаковочного материала, и метки, которые содержат указания относительно показаний, для которых предназначен конъюгат.
В. Тестирование конструкций
Носители для доставки нуклеиновых кислот могут быть проанализированы в любой из множества in vitro и in vivo модельных систем. Как здесь обсуждалось и как показано в примерах, фаг должен связываться с клеткой специфическим образом и интернализоваться (по-видимому, по эндосомальной схеме). Более
того, трансген должен экспрессироваться клетками хозяина (целевыми клетками). Так, подходящие анализы включают, без ограничений, анализ связывания для проверки того, что фаги присоединились к целевым клеткам, анализ вытеснения, чтобы показать, что фаг может быть вытеснен избытком свободного лиганда, и анализ интернализации, чтобы продемонстрировать, что фаги интернализованы (Barry et al., см. выше; Dunn, выше; и Hart et al., выше), и функциональный анализ, чтобы показать, что трансген активен в клетках хозяина (например, США, предварительный серийный номер 60/057067).
Носители для доставки нуклеиновых кислот могут быть проанализированы в любой из множества in vitro и in vivo модельных систем. Как здесь обсуждалось и как показано в примерах, фаг должен связываться с клеткой специфическим образом и интернализоваться (по-видимому, по эндосомальной схеме). Более
того, трансген должен экспрессироваться клетками хозяина (целевыми клетками). Так, подходящие анализы включают, без ограничений, анализ связывания для проверки того, что фаги присоединились к целевым клеткам, анализ вытеснения, чтобы показать, что фаг может быть вытеснен избытком свободного лиганда, и анализ интернализации, чтобы продемонстрировать, что фаги интернализованы (Barry et al., см. выше; Dunn, выше; и Hart et al., выше), и функциональный анализ, чтобы показать, что трансген активен в клетках хозяина (например, США, предварительный серийный номер 60/057067).
Нижеследующие примеры предложены с целью иллюстрации и не являются ограничительными.
ПРИМЕРЫ
ПРИМЕР 1
Получение фагемидных частиц
Фагемид pEGFP-N1 (Clontech; Palo Alto, CA) содержит ген флуоресцирующего зеленым протеина (GFP) под контролем CMV предраннего промотора. CMV отличается высокой активностью в большом числе клеточных линий млекопитающих, однако можно использовать и другие промоторы клеток млекопитающих. RC-CMVb фагемид является производным pRC-CMV (InVitrogen; San Diego, CA). Ген lacZ E.coli встраивают в pRC-CMV фагемид по EcoRV сайту мультиклонирования, расположенному в прямом направлении от CMV промотора, для получения pRC-CMVb. Оба фагемида содержат три начала ДНК репликации: pUC начало репликации как двухцепочечной плазмиды в E.coli; F1 начало репликации как одноцепочечной фаговой ДНК, и SV40 начало для большого числа копий репликаций в COS-1 (большое содержание Т-антигена) клетках млекопитающих. Они также содержат ген неомицинфосфотрансферазы, регулируемый SV40 ранним генным промотором, который придает устойчивость к антибиотику G418, будучи экспрессирован в клетки млекопитающих (Southern и Berg, J.Mol. Appl. Genet. 1:327-341, 1982).
ПРИМЕР 1
Получение фагемидных частиц
Фагемид pEGFP-N1 (Clontech; Palo Alto, CA) содержит ген флуоресцирующего зеленым протеина (GFP) под контролем CMV предраннего промотора. CMV отличается высокой активностью в большом числе клеточных линий млекопитающих, однако можно использовать и другие промоторы клеток млекопитающих. RC-CMVb фагемид является производным pRC-CMV (InVitrogen; San Diego, CA). Ген lacZ E.coli встраивают в pRC-CMV фагемид по EcoRV сайту мультиклонирования, расположенному в прямом направлении от CMV промотора, для получения pRC-CMVb. Оба фагемида содержат три начала ДНК репликации: pUC начало репликации как двухцепочечной плазмиды в E.coli; F1 начало репликации как одноцепочечной фаговой ДНК, и SV40 начало для большого числа копий репликаций в COS-1 (большое содержание Т-антигена) клетках млекопитающих. Они также содержат ген неомицинфосфотрансферазы, регулируемый SV40 ранним генным промотором, который придает устойчивость к антибиотику G418, будучи экспрессирован в клетки млекопитающих (Southern и Berg, J.Mol. Appl. Genet. 1:327-341, 1982).
Фагемид pEGFP-N1 размножают в E. coli штамме-хозяине, DH5αF', чтобы обеспечить суперинфицирование М13 хелперным бактериофагом, М13К07. Фагемидные частицы получают известными способами (например Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, 1989; и Rider et al. в Phage Display of Peptides и Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, 1996). Свежую бактериальную колонию, содержащую pEGFP-Nl, суспендируют в 3 мл 2Х YT среды, М13К07 добавляют до конечного титра 2Х107 бое/мл и культуру инкубируют в течение 1 часа при 37oС. Добавляют канамицин до конечной концентрации 70 мкг/мл и инкубирование продолжают в течение 14-18 часов. Бактериальную культуру осаждают при 12000•g в течение 10 минут и надосадочную жидкость переносят в свежую ампулу. Фагемидные частицы осаждают, добавляя 1/3 объема 30% полиэтиленгликоля (PEG)-1,5 M NaCl. Раствор центрифугируют и охлаждают в течение 1 часа на льду и в течение ночи при 4oС. Фаг осаждают центрифугированием при 12000•g в течение 10 минут при 4oС. Осадок осторожно сливают и снова суспендируют в 1/10 исходного объема PBS (буферированный фосфатом физиологический раствор рН 7,4). PEG осаждение повторяют и осадок снова суспендируют в 1/20 объема PBS. Фагемидную суспензию предварительно пастеризуют, нагревая при 65oС в течение 5 минут, фильтруют через 0,45 мкМ фильтр и хранят при 4oС.
ПРИМЕР 2
Получение модифицированных векторов для трансдукции клеток млекопитающих
Экспрессионную кассету млекопитающих встраивают в вектор на основе фага или фагемида и используют для определения опосредствованного лигандом включения фага за счет экспрессии репортерного гена в клетках млекопитающих. Нитевидный фаговый вектор типа 3 модифицируют для трансдукции клеток млекопитающих, встраивая GFP экспрессионную кассету, содержащую CMV промотор транскрипции млекопитающих, флуоресцирующего зеленым ген протеина, из pEGFP-N1 (Clontech; Palo Alto, CA), терминатор транскрипции бычьего гормона роста и сигнал полиаденилирования для получения вектора MEGFP3 (фиг.1А). Экспрессионная кассета млекопитающих содержит также SV40 начало репликации, присоединенный к CMV промотору. Аналогичные конструкции для контроля за включением с последующей экспрессией геномов фагов в клетках млекопитающих создают из других векторов на основе фагов или фагемидов, включая pCANTAB 5 Е (Pharmacia Biotech; Piscataway, NJ) или М13 типа 3 или 33 для слияний гена III (Кау, В. К. et al., Phage Display of Peptides и Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, 1996, McConnell, S.J. et al., Mol. Divers. 1:165-176, 1996) и М13 типа 8 или 88 вектор для слияний с протеином гена VIII (Roberts et al., Methods Enzymol. 267:68-82, 1996; Markland, W. et al., Gene 109:13-19, 1991).
Получение модифицированных векторов для трансдукции клеток млекопитающих
Экспрессионную кассету млекопитающих встраивают в вектор на основе фага или фагемида и используют для определения опосредствованного лигандом включения фага за счет экспрессии репортерного гена в клетках млекопитающих. Нитевидный фаговый вектор типа 3 модифицируют для трансдукции клеток млекопитающих, встраивая GFP экспрессионную кассету, содержащую CMV промотор транскрипции млекопитающих, флуоресцирующего зеленым ген протеина, из pEGFP-N1 (Clontech; Palo Alto, CA), терминатор транскрипции бычьего гормона роста и сигнал полиаденилирования для получения вектора MEGFP3 (фиг.1А). Экспрессионная кассета млекопитающих содержит также SV40 начало репликации, присоединенный к CMV промотору. Аналогичные конструкции для контроля за включением с последующей экспрессией геномов фагов в клетках млекопитающих создают из других векторов на основе фагов или фагемидов, включая pCANTAB 5 Е (Pharmacia Biotech; Piscataway, NJ) или М13 типа 3 или 33 для слияний гена III (Кау, В. К. et al., Phage Display of Peptides и Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, 1996, McConnell, S.J. et al., Mol. Divers. 1:165-176, 1996) и М13 типа 8 или 88 вектор для слияний с протеином гена VIII (Roberts et al., Methods Enzymol. 267:68-82, 1996; Markland, W. et al., Gene 109:13-19, 1991).
ПРИМЕР 3
Связывание FGF с фагемидными частицами с использованием авидин-биотина
Одним из способов направленной доставки фага к FGF рецепторам является связывание фага с FGF с помощью авидин-биотина. Такой комплекс FGF-фаг собирают в присутствии тестируемых клеток при 0oС с последующим инкубированием при 37oС для обеспечения интернализации. Подвергнутый мутации FGF, FGF2-3 (Cys остатка 96 изменен в результате мутации на Ser) (Sosnowski et al., J. Biol. Chem. 271: 33647-33653, 1996) конъюгируют с биотином по одной свободной сульфгидрильной группе, используя биотин-ВМСС (Pierce; Rockford, IL) в соответствии с рекомендациями изготовителей. Непрореагировавший биотин удаляют, пропуская реакцию через PD-10 обессоливающую колонку. При необходимости биотинилированный трансферин покупают в Sigma (St. Louis, МО), а биотинилированный EGF покупают в Molecular Probes (Eugene, OR).
Связывание FGF с фагемидными частицами с использованием авидин-биотина
Одним из способов направленной доставки фага к FGF рецепторам является связывание фага с FGF с помощью авидин-биотина. Такой комплекс FGF-фаг собирают в присутствии тестируемых клеток при 0oС с последующим инкубированием при 37oС для обеспечения интернализации. Подвергнутый мутации FGF, FGF2-3 (Cys остатка 96 изменен в результате мутации на Ser) (Sosnowski et al., J. Biol. Chem. 271: 33647-33653, 1996) конъюгируют с биотином по одной свободной сульфгидрильной группе, используя биотин-ВМСС (Pierce; Rockford, IL) в соответствии с рекомендациями изготовителей. Непрореагировавший биотин удаляют, пропуская реакцию через PD-10 обессоливающую колонку. При необходимости биотинилированный трансферин покупают в Sigma (St. Louis, МО), а биотинилированный EGF покупают в Molecular Probes (Eugene, OR).
Клетки COS инкубируют в 12 ячеечных пластинах при концентрации 20000 кл/ячейку в течение примерно 24 часов перед добавлением фага. Клетки промывают дважды в ледяном PBS/FBS (PBS с 2% плодной бычьей сывороткой). Затем добавляют 1,2 мкг B-FGF (биотинилированный FGF) на льду в течение 15 минут. Добавляют нейтравидин (NAV; нейтральный без углеводов авидин; Pierce, Rockford, IL) в концентрации 10 мкг/мл в 1 мл PBS/FBS в течение 15 минут на льду. Клетки повторно промывают и добавляют биотинилированное анти-М13 антитело (овечий анти-М13-биотин, 5 Prime --> 3 Prime, Inc.; Boulder, CO) в концентрации 10 мкг/мл в 1 мл PBS/FBS в течение 15 минут на льду. Клетки снова промывают и в каждую ячейку добавляют 108 колонийобразующих единиц в 1 мл PBS/FBS в течение 1 часа на льду. Клетки снова промывают, снова суспендируют в свежей среде и возвращают в инкубатор при 37oС. GFP экспрессию в клетках контролируют с помощью флуоресцентной микроскопии (Nikon Diaphot инвертированный микроскоп), используя набор флуоресцеиновых фильтров (FITC).
В одном из экспериментов после 72 часов инкубирования наблюдают около 30-35 автофлуоресцирующих GFP-экспрессирующих клеток. Несколько меньше автофлуоресцирующих клеток наблюдают по мере того, как уменьшается количество добавленных фагов. В случаях для 105 CFU или меньше фагов на ячейку позитивно флуоресцирующих клеток вовсе не наблюдается.
Результаты контрольных экспериментов представлены в таблице. Обработка одноцепочечной нуклеазой (нуклеаза фасоли-маш; New England Biolabs, MA) не влияет значительно на эффективность GFP экспрессии, что указывает на то, что трансфекция наблюдается за счет интактных фагов, а не связана со свободной одноцепочечной фаговой геномной ДНК. Аналогичные результаты получены с использованием ДНКазы I, одно- и двухцепочечной нуклеазы вместо нуклеазы фасоли-маш. Добавление 2 мкг EGFP-N1 ДНК вместо фага не приводит к получению каких-либо GFP позитивных клеток, что указывает на то, что GFP инфицирование не связано с интернализацией примесных плазмидных ДНК в фаговых препаратах.
Как видно, появление GFP-экспрессирующих клеток зависит от присутствия биотинилированного-FGF, NAV и анти-М13 антитела (таблица). Включение только биотинилированного-FGF и NAV, или только анти-М13 и NAV, приводит к значительному снижению эффективности трансфекции (1 позитивная клетка по сравнению с 35 на ячейку). Никаких позитивных клеток не наблюдается, если опускают стадию добавления NAV или если добавляют только эквивалентные титры фага.
Если свободный FGF (не биотинилированный) добавляют до полного количества с биотинилированным FGF, захват фага ингибируется (фиг.2). Свободный FGF добавляют за 5 минут до добавления биотинилированного FGF в увеличивающихся концентрациях. Как видно на фиг.2, количество автофлуоресцирующих клеток ингибируется зависимым от дозы образом по мере того, как добавляют больше FGF. Эти результаты свидетельствуют о том, что интернализация фага происходит за счет взаимодействия биотинилированного FGF с его рецептором.
В другом эксперименте клетки COS инкубируют в 6 ячеечных пластинах при плотности 40000 кл/ячейку в течение 24 часов перед добавлением фага. Комплекс FGF2-фаг собирают на поверхности клеток, используя модификацию процедуры, описанной Моrо et al. для нацеливания антител к опухоли (Моrо et al., Cancer Res. 57:1922-1928, 1997). Клетки дважды промывают ледяным PBS/FBS (PBS с 2% плодной бычьей сывороткой) и в течение 15 минут добавляют биотинилированный FGF, биотинилированный трансферин или биотинилированный FGF. Затем добавляют нейтравидин (NAV), нейтральный авидин без углеводов (Pierce, Rock-ford, IL) для связывания биотинилированного FGF2 на поверхности клеток в ледяном PBS/FBS еще на 15 минут, и клетки снова промывают. Спустя 15 минут после добавления аликвоты биотинилированного анти-М13 антитела (кроличий анти-М13-биотин, Sigma; St. Louis, МО) (30 мкг/мл), для реакции с NAV-биотинилированным FGF2 комплексом на клеточной поверхности, клетки промывают и добавляют фаг в PBS/FBS. После часа на льду клетки промывают, помещают в свежую культуральную среду и возвращают в инкубатор при 37oС для проведения интернализации. В некоторых случаях хлорохин (50-100 мкМ) добавляют в среде в течение 2 часов после удаления фага.
Экспрессию GFP и β-галактозидазы оценивают в обработанных фагемидными частицами клетках и COS-1 контрольных клетках через 72 часа после добавления фагемидных частиц. Экспрессию GFP в обработанных фагом клетках определяют, подсчитывая количество автофлуоресцентных клеток. Клетки дважды промывают в PBS/FBS, и в каждую ячейку добавляют 1 мл PBS Дульбекко. Флуоресцентные клетки определяют непосредственно в культуральных пластинах, используя эпифлуоресцентный инвертированный микроскоп (Nikon Diaphot), снабженный набором фильтров флуоресцеинизотиоцианата (FITC). Эксперименты GFP проводят трижды и повторяют, по крайней мере, один раз.
β-галактозидазу в лизатах определяют из клеток, обработанных фагемидными частицами, используя систему для анализа люминесцентной β-галактозидазы от Clontech (Palo Alto, CA) в соответствии с рекомендациями изготовителя. Клетки промывают в PBS, соскребают в 1,5 мл микроампулы, и определяют концентрации осажденных протеинов в лизатах. Активность эндогенного фермента определяют в нетрансфектированном клеточном экстракте COS и это значение вычитают из каждого результата. Эксперименты с β-галактозидазой проводят в двойных ячейках и повторяют, по крайней мере, один раз.
В типичном эксперименте 250-1800 (в зависимости от используемого титра фага, см. график зависимости от дозы на фиг.3А) GFP-экспрессируюшие и автофлуоресцирующие клетки наблюдают в ячейках через 72 часа после направления FGF2 к COS-1 клеткам. Как видно на фиг.3А, всего лишь 10 фагов (m.o.i. 250) приводит к обнаружению GFP-экспрессирующих клеток. Как видно на фиг.3В, необходимо больше RC-CMVβ-фагемидных частиц для обнаружения трансгенной активности, что указывает на то, что анализ β-галактозидазы полного клеточного лизата менее чувствителен, нежели обнаружение GFP-позитивных клеток при непосредственном наблюдении.
Результаты нескольких контрольных экспериментов представлены на фиг. 4А-4С. Если для конкуренции с целевым связыванием с фагом используют увеличенное количество FGF2, 100-кратный молярный избыток свободного FGF2 успешно блокирует зависящую от фагемидных частиц трансфекцию клеток COS-1 (фиг. 4А). На неспецифическую трансдукцию, которая наблюдается только с фагом, не влияет добавление такого же количества свободного FGF2 (не показано). Для дальнейшего исследования возможности того, что трансдукция клеток за счет FGF2-целевой доставки фага зависит от высокого сродства FGF рецептора, фаговые частицы нацеливают на L6 крысиные миобластные клетки, в клеточной линии которых отсутствует сродство к высокоафинным рецепторам FGF2 (Olwin и Hauschka, J.Cell Biochem. 39:443-454, 1989; доступны из АТСС; Manassas. VA) и сравнивают с реакцией на стабильные трансфектанты L6 (Flg37), которые конститутивно сверхэкспрессируют FGFR1 (получены от Dr. Murray Korc, UCI; Irvine, CA: кроме того, их легко могут получить специалисты). Как видно на фиг.4В, присутствие отличающихся высоким сродством FGF2 рецепторов облегчает FGF2-нацеленный перенос гена фага. Более высокую эффективность трансдукции наблюдают у FGFR-позитивных Flg37 клеток, чем у родительских L6 клеток и никаких GFP позитивных клеток не наблюдают ни для каких клеточных линий в отсутствии NAV. Сравнение между FGF2 нацеливанием и 2 другими нацеливающими лигандами, трансферрином (Zatloukal et al., 1992) и EGF (Watkins et al., Gene Ther. 4:1004-1012, 1997), также легко осуществить. Оба они относительно неэффективны в отношении доставки фага к COS-1 клеткам для экспрессии гена. Количество GFP-экспрессируюших клеток заметно снижается, если биотинилированные FGF2 заменяют на биотинилированный трансферрин или биотинилированный EGF (фиг.4С).
ПРИМЕР 4
Внутриклеточная направленная миграция
COS клетки обрабатывают хлорохином по способу Sosnowski et al., (J. Biol. Chem. 271:33647-33653, 1996), обычно в концентрациях от 50 до 100 мкМ в течение 2 часов. Sosnowski с сотр. продемонстрировали потенциирующее действие хлорохина, когда FGF2 нацеливает голую плазмидную ДНК, однако, если хлорохин используют в комбинации с трансдукцией клеток FGF2-нацеленными фагемидными частицами, хлорохин неожиданно оказывает ингибирующее действие на трансдукцию целевых клеток (фиг.4В).
Внутриклеточная направленная миграция
COS клетки обрабатывают хлорохином по способу Sosnowski et al., (J. Biol. Chem. 271:33647-33653, 1996), обычно в концентрациях от 50 до 100 мкМ в течение 2 часов. Sosnowski с сотр. продемонстрировали потенциирующее действие хлорохина, когда FGF2 нацеливает голую плазмидную ДНК, однако, если хлорохин используют в комбинации с трансдукцией клеток FGF2-нацеленными фагемидными частицами, хлорохин неожиданно оказывает ингибирующее действие на трансдукцию целевых клеток (фиг.4В).
ПРИМЕР 5
Связывание FGF с фагемидными частицами с использованием полилизина
В этом примере FGF связывают с полилизином, который затем связывается с фагемидными частицами в результате взаимодействия между положительно заряженным полилизином и отрицательно заряженным фагом.
Связывание FGF с фагемидными частицами с использованием полилизина
В этом примере FGF связывают с полилизином, который затем связывается с фагемидными частицами в результате взаимодействия между положительно заряженным полилизином и отрицательно заряженным фагом.
FGF ковалентно связывают с поли-D-лизином (средняя длина полимера 84), используя S-2-пиридилдисульфид (SPDP) по способу Sosnowski с сотр. (J. Biol. Chem. 271: 33647-33653, 1996). EGFP-N1 фагемидные частицы смешивают с 5 мкг FGF-полилизина или 2,5 мкг одного только полилизина (FGF-полилизин составляет примерно 50% полилизина по весу) и оставляют при комнатной температуре на 30 минут перед добавлением к COS клеткам, которые выращивают в 12 ячеечных пластинах. Клетки исследуют через 72 часа с помощью флуоресцентной микроскопии и подсчитывают количество автофлуоресцентных GFP позитивных клеток.
Как видно на фиг.5, GFP ген трансдуцирован в COS клетки за счет фага в присутствии FGF-полилизина. Увеличение титра фага приводит к увеличению числа GFP позитивных клеток. Примерно 1/3 GFP позитивных клеток представляет фон, связанный с неспецифическим захватом фагов, покрытых только полилизином.
ПРИМЕР 6
Ковалентное связывание FGF с фагемидными частицами
В этом примере оболочковые протеины М13 фага конъюгируют непосредственно с FGF, используя гетеробифункциональные перекрестносшивающие реагенты. Свободный лизин с N-конца оболочкового протеина гена VIII доступен для химической модификации (Armstrong et al., EMBO J. 2:1641-1646, 1983). В этом способе фаговые частицы вначале тиолируют, добавляя 3-30 молярный избыток SPDP в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,5, 0,1 М NaCl на 30 минут при 23oС. Непрореагировавший реагент удаляют с помощью гель-фильтрации. FGF2-3 мутеин FGF подвергают затем взаимодействию с тиолированным фагом в 2-10 кратном молярном избытке на 24 часа при 23oС. Свободный FGF2-3 удаляют гель-фильтрацией. Связанный с FGF фаг подвергают дальнейшей очистке с помощью афинной хроматографии на колонке с гепарин-сефарозой.
Ковалентное связывание FGF с фагемидными частицами
В этом примере оболочковые протеины М13 фага конъюгируют непосредственно с FGF, используя гетеробифункциональные перекрестносшивающие реагенты. Свободный лизин с N-конца оболочкового протеина гена VIII доступен для химической модификации (Armstrong et al., EMBO J. 2:1641-1646, 1983). В этом способе фаговые частицы вначале тиолируют, добавляя 3-30 молярный избыток SPDP в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,5, 0,1 М NaCl на 30 минут при 23oС. Непрореагировавший реагент удаляют с помощью гель-фильтрации. FGF2-3 мутеин FGF подвергают затем взаимодействию с тиолированным фагом в 2-10 кратном молярном избытке на 24 часа при 23oС. Свободный FGF2-3 удаляют гель-фильтрацией. Связанный с FGF фаг подвергают дальнейшей очистке с помощью афинной хроматографии на колонке с гепарин-сефарозой.
Связывание FGF с фаговым протеином подтверждают с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и иммуноблоттинга фагового протеина. В невосстанавливающих условиях FGF модифицированный протеин гена VIII сдвигается по значениям кажущейся молекулярной массы с 5500 до 23500 Дa. Добавление восстанавливающего агента к тому же самому буферу приводит к разрушению дисульфидной связи и образованию свободного FGF (примерно 18000 Дa) и протеина гена VIII.
Химически модифицированный FGF-фаг анализируют по способности к трансдукции клеток млекопитающих. FGF модифицированные pEGFP-N1 фагемидные частицы, содержащие CMV-GFP экспрессионную кассету, добавляют к COS клеткам, посеянным в концентрации 20000 кл/ячейку в 12-ячеечные пластины. Клетки анализируют по GFP экспрессии с помощью флуоресцентной микроскопии через 72 часа после добавления фага.
ПРИМЕР 7
Генетическое слияние FGF с оболочковым протеином фага
В нижеследующих примерах фаг, который представляет FGF2 на своей поверхности, используют для связывания с FGF2 рецептором на клетках млекопитающих, и он интернализуется. FGF2 ген субклонируют в модифицированный М13 фаговый типа 3 вектор, MEGFP3 (фиг.1А), для создания фага, представляющего лиганд, MF2/1G3 (фиг.1В). Вектор MEGFP3 был модифицирован экспрессионной кассетой млекопитающих, сконструированной для экспрессии репортерного гена GFP для контроля за трансдукцией клеток млекопитающих фагом. Результаты трансдукции определяют затем количественно с помощью проточной цитометрии (FACscan, Becton Dickinson, Mountain View, CA) для определения распределения GFP экспрессирующих клеток в популяции, и с помощью флуориметрии клеточных экстрактов для определения полного количества продуцированных GFP. Другие векторы включают pCANTAB 5 Е (Pharmacia Biotech; Piscataway, NJ) или М13 типа 3 или 33 для гена III слияний (Кау et al., Phage Display of Peptides и Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, 1996; McConnell et al., Mol. Divers. 1: 165-176, 1996). Аналогично FGF2-3 клонируют в М13 типа 8 или 88 вектор для слияния с протеином гена VIII (Roberts et al., Methods Enzymol. 267: 68-82, 1996; Markland et al., Gene 109:13-19, 1991).
Генетическое слияние FGF с оболочковым протеином фага
В нижеследующих примерах фаг, который представляет FGF2 на своей поверхности, используют для связывания с FGF2 рецептором на клетках млекопитающих, и он интернализуется. FGF2 ген субклонируют в модифицированный М13 фаговый типа 3 вектор, MEGFP3 (фиг.1А), для создания фага, представляющего лиганд, MF2/1G3 (фиг.1В). Вектор MEGFP3 был модифицирован экспрессионной кассетой млекопитающих, сконструированной для экспрессии репортерного гена GFP для контроля за трансдукцией клеток млекопитающих фагом. Результаты трансдукции определяют затем количественно с помощью проточной цитометрии (FACscan, Becton Dickinson, Mountain View, CA) для определения распределения GFP экспрессирующих клеток в популяции, и с помощью флуориметрии клеточных экстрактов для определения полного количества продуцированных GFP. Другие векторы включают pCANTAB 5 Е (Pharmacia Biotech; Piscataway, NJ) или М13 типа 3 или 33 для гена III слияний (Кау et al., Phage Display of Peptides и Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press, 1996; McConnell et al., Mol. Divers. 1: 165-176, 1996). Аналогично FGF2-3 клонируют в М13 типа 8 или 88 вектор для слияния с протеином гена VIII (Roberts et al., Methods Enzymol. 267: 68-82, 1996; Markland et al., Gene 109:13-19, 1991).
Для облегчения клонирования FGF2 ген амплифицируют с помощью ПЦР, используя олигонуклеоидные праймеры, которые содержат соответствующие рестрикционные эндонуклеазные сайты в фаговом векторе гена III или VIII. Полученный фаг экспрессирует FGF2 на их оболочке поверхности, что определяют с помощью анти-FGF2 антител в Вестернблоттинге (фиг.6) и с помощью ELISA (фиг. 7). Связывание FGF2 фага слияния с FGF2 рецептором определяют с помощью ELISA, где рекомбинантный FGF2 рецептор присоединен к твердой фазе, и антитело антифаг используют в качестве антитела первичного детектирования. При определении с помощью Вестернблоттинга FGF2-pIII слияния используют экстракты из эквивалентных фаговых титров очищенного FGF2 фага и контрольного фага (MEGFP3), разделяемых с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и блоттинга на нитроцеллюлозе. FGF2 и FGF2-фаг слияния детектируют с помощью анти-FGF2 моно-клонального антитела (Transduction Labs; Lexington, KY) и HRP конъюгированного антимышиного вторичного антитела (American Qualex; San Clemente, CA) с возникновением хемилюминесценции. Одиночная полоса протеина определяется в цезийхлоридом очищенном FGF2-фаговом экстракте, которая смещена примерно на 80 кДa. Это примерно соответствует предсказанию для FGF2-pIII протеина слияния (FGF2 (18 кДa), слитый с pIII (смещается на ~60 кДa)). Очистку с помощью CsCl осуществляют для удаления всех не ковалентно связанных FGF2 протеинов слияния из фаговых частиц.
Связывание FGF2 фага слияния с FGF2 рецептором определяют с помощью ELISA, где рекомбинантный FGF2 рецептор прикреплен к твердой фазе, и антитело антифаг используют в качестве первичного детектирующего антитела. Короче, фаги захватываются анти-FGF2 кроличьей поликлональной антисывороткой, связанной с ячейками пластины. HRP, конъюгированное анти-М13 антитело (Pharmacia Biotech; Piscataway, NY) используют для определения связанного фага. Если антифаговое антитело используют для захвата фага и эквивалентная ОП (оптическая плотность) наблюдается как для контрольного (MEGFP3), так и для FGF2-фага (MF2/1G3), указывая на то, что эквивалентные фаговые частицы внесены на пластину (фиг. 7). На фиг.7В повышенная ОП указывает на присутствие FGF2 на MF2/1G3 FGF2-фаге.
ПРИМЕР 8
Трансдукция клеток млекопитающих с помощью FGF-лиганд представляющего фага
FGF2, представляющий фаг (MF2/1G3), и идентичный фаг, у которого отсутствует FGF2 ген (MEGFP3), сравнивают в отношении опосредствованной рецептором интернализации и экспрессии репортерного гена в COS клетках. Фаг инкубируют с клетками в течение 4 часов при 37oС в DME (Дульбекко модифицированная среда Игла; Sigma Chemical; St. Louis, МО), содержащей 2% BSA (бычьего сывороточного альбумина) в качестве блокирующего агента. После промывки для удаления несвязанного фага, клетки возвращают в инкубатор на дополнительные 72 часа. Трансдукцию измеряют, подсчитывая GFP позитивные автофлуоресцентные клетки. Как видно на фиг.8В, FGF2, представляющий фаг, отличается примерно в 10 раз большей эффективностью трансдукции, нежели контрольный фаг, что свидетельствует о том, что представление FGF2 лиганда на поверхности фаговых частиц приводит к рецептором опосредствованному связыванию и интернализации фага с последующей экспрессией репортерного гена фага. Специфичность FGF2-фага, опосредующего трансдукцию, демонстрируется путем последовательного ингибирования трансдукции избытком свободного FGF2 (2 мкг/мл) (фиг. 8В). На низкий уровень неспецифического захвата и трансдукции контрольным фагом (MEGFP3) не влияет присутствие избытка FGF2.
Трансдукция клеток млекопитающих с помощью FGF-лиганд представляющего фага
FGF2, представляющий фаг (MF2/1G3), и идентичный фаг, у которого отсутствует FGF2 ген (MEGFP3), сравнивают в отношении опосредствованной рецептором интернализации и экспрессии репортерного гена в COS клетках. Фаг инкубируют с клетками в течение 4 часов при 37oС в DME (Дульбекко модифицированная среда Игла; Sigma Chemical; St. Louis, МО), содержащей 2% BSA (бычьего сывороточного альбумина) в качестве блокирующего агента. После промывки для удаления несвязанного фага, клетки возвращают в инкубатор на дополнительные 72 часа. Трансдукцию измеряют, подсчитывая GFP позитивные автофлуоресцентные клетки. Как видно на фиг.8В, FGF2, представляющий фаг, отличается примерно в 10 раз большей эффективностью трансдукции, нежели контрольный фаг, что свидетельствует о том, что представление FGF2 лиганда на поверхности фаговых частиц приводит к рецептором опосредствованному связыванию и интернализации фага с последующей экспрессией репортерного гена фага. Специфичность FGF2-фага, опосредующего трансдукцию, демонстрируется путем последовательного ингибирования трансдукции избытком свободного FGF2 (2 мкг/мл) (фиг. 8В). На низкий уровень неспецифического захвата и трансдукции контрольным фагом (MEGFP3) не влияет присутствие избытка FGF2.
Важно показать, что MEGFP3 контрольный фаг одинаково способен к трансдукции клеток млекопитающих, как фаг представления, когда он соответствующим образом нацелен. Для сравнения трансдукционной способности как FGF2-фага, так и контрольного фага эквивалентные титры каждого из фагов используют для трансфекции COS клеток, используя метод авидин-биотин FGF2 мечения. В этом способе биотинилированный FGF2 контактируют с клетками и используют для захвата фаговых частиц путем добавления авидина и биотинилированного антифагового антитела. Связывание фаг/FGF2/клетка осуществляют на льду, несвязанный фаг удаляют промывкой, клетки возвращают в инкубатор при 37oС и трансдукцию регистрируют через 72 часа. Как видно на фиг.8А, не наблюдается существенной разницы для трансдукции между FGF2-фагом и контрольным фагом, если FGF2 присоединен к фагу за счет авидин-биотиновой связи. В этом случае биотинилированный FGF2 оказывается в избытке FGF2, представленного на фаговой поверхности, так что ожидается, что интернализация происходит главным образом за счет биотинилированного FGF2. Эти данные демонстрируют опосредствованную специфическим рецептором трансдукцию клеток млекопитающих нитевидным фагом, который генетически представляет нацеливающий лиганд (FGF2).
ПРИМЕР 9
Непрерывная экспрессия за счет селективного давления
Для определения, может ли трансгенная экспрессия сохраняться в клетках после введения в клетку фагемидных частиц, устойчивость к неомицину используют для отбора трансфектированных клеток. Клетки обрабатывают фагемидными частицами, как описано выше, и спустя 48 часов клетки разводят в свежей среде в соотношении 1:10. Среду удаляют и заменяют селективной средой, содержащей G418 (700 мкг/мл) через 24 часа. По мере образования выживающих колоний (7-10 дней) содержание в них GFP оценивают с помощью флуоресцентной микроскопии. Клеточные линии, полученные из этих колоний, поддерживают при G418 отборе (более 3 месяцев).
Непрерывная экспрессия за счет селективного давления
Для определения, может ли трансгенная экспрессия сохраняться в клетках после введения в клетку фагемидных частиц, устойчивость к неомицину используют для отбора трансфектированных клеток. Клетки обрабатывают фагемидными частицами, как описано выше, и спустя 48 часов клетки разводят в свежей среде в соотношении 1:10. Среду удаляют и заменяют селективной средой, содержащей G418 (700 мкг/мл) через 24 часа. По мере образования выживающих колоний (7-10 дней) содержание в них GFP оценивают с помощью флуоресцентной микроскопии. Клеточные линии, полученные из этих колоний, поддерживают при G418 отборе (более 3 месяцев).
Как видно на фиг.9А (стократное увеличение), если трансдуцированные клетки культивируют в присутствии G418, устойчивые к лекарству колонии, которыми, по-видимому, были почти все клетки, оказались позитивными в отношении GFP активности. Колонии были размножены и их сохраняли как стабильные клеточные линии, экспрессирующие GFP протеин, более 3 месяцев (фиг.9В (увеличение в 400 раз)).
Следует учитывать, что хотя здесь были описаны с целью иллюстрации конкретные варианты, различные модификации могут быть осуществлены в рамках сути и объема настоящего изобретения. Соответственно настоящее изобретение ничем не ограничено кроме как прилагаемой формулой изобретения.
Claims (45)
1. Способ доставки генов, включающий введение пациенту нитевидных фаговых частиц, представляющих на своей поверхности лиганд, где вектор внутри фага кодирует генный продукт под контролем промотора.
2. Способ лечения опухолей, включающий способ доставки генов за счет введения пациенту фармацевтической композиции, включающей физиологически приемлемый буфер и нитевидные фаговые частицы, представляющие лиганд на своей поверхности, где фаговый геном кодирует терапевтический генный продукт под контролем промотора.
3. Способ лечения заболеваний клеток гладкой мускулатуры, включающий способ доставки генов за счет введения пациенту фармацевтической композиции, включающей физиологически приемлемый буфер и нитевидные фаговые частицы, представляющие лиганд на своей поверхности, где фаговый геном кодирует терапевтический генный продукт под контролем промотора.
4. Способ лечения ангиогенных заболеваний, включающий способ доставки генов за счет введения пациенту фармацевтической композиции, включающей физиологически приемлемый буфер и нитевидные фаговые частицы, представляющие лиганд на своей поверхности, где фаговый геном кодирует терапевтический генный продукт под контролем промотора.
5. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что лигандом является полипептид, реагирующий с FGF рецептором.
6. Способ по п.5, отличающийся тем, что лигандом является FGF-2.
7. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что лигандом является антитело.
8. Способ по п.7, отличающийся тем, что лигандом является одноцепочечное антитело.
9. Способ по п.1, отличающийся тем, что антитело реагирует с HER2/neu.
10. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что лиганд генетически слит с фаговым капсидным протеином.
11. Способ по п.10, отличающийся тем, что фаговым капсидным протеином является ген III.
12. Способ по п.10, отличающийся тем, что фаговым капсидным протеином является ген VIII.
13. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что лиганд химически конъюгирован с фаговым капсидным протеином.
14. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что лиганд дополнительно включает эндосомальный фрагмент ускользания.
15. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что фаговые частицы представляют фрагмент эндосомального пептида ускользания на поверхности фагов.
16. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что фаговый геном является фагемидом.
17. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что лиганд дополнительно содержит последовательность ядерной локализации.
18. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что фаговые частицы представляют на поверхности фагов последовательность ядерной локализации.
19. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что терапевтический генный продукт выбирают из группы, состоящей из протеина, рибозима и антисмыслового олигонуклеотида.
20. Способ по п.19, отличающийся тем, что протеин заменяет дефектный ген или частично снимает дефицит генного продукта.
21. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что терапевтическим генным продуктом является цитотоксический агент.
22. Способ по п.21, отличающийся тем, что цитотоксическим агентом является инактивирующий рибосому протеин.
23. Способ по п.21, отличающийся тем, что инактивирующий рибосому протеин является сапорином.
24. Способ по любому из пп.1-4, отличающийся тем, что терапевтическим генным продуктом является антитело, которое связывается с HER2/neu.
25. Фармацевтическая композиция, включающая физиологически приемлемый буфер и частицы нитевидного фага, имеющие лиганд на своих поверхностях, где фаговый геном кодирует терапевтический генный продукт под контролем промотора.
26. Композиция по п.25, отличающаяся тем, что лигандом является полипептид, реакционноспособный с FGF рецептором.
27. Композиция по п. 26, отличающаяся тем, что полипептидом является FGF-2.
28. Композиция по п.25, отличающаяся тем, что лигандом является антитело.
29. Композиция по п.28, отличающаяся тем, что антителом является одноцепочечное антитело.
30. Композиция по п. 28, отличающаяся тем, что антитело реагирует с HER2/neu.
31. Композиция по п.25, отличающаяся тем, что лиганд генетически слит с фаговым капсидным протеином.
32. Композиция по п.31, отличающаяся тем, что фаговым капсидным протеином является ген III.
33. Композиция по п.31, отличающаяся тем, что фаговым капсидным протеином является ген VIII.
34. Композиция по п.25, отличающаяся тем, что лиганд химически конъюгирован с фаговым капсидным протеином.
35. Композиция по п.25, отличающаяся тем, что лиганд дополнительно содержит эндосомальный фрагмент ускользания.
36. Композиция по п. 25, отличающаяся тем, что фаговые частицы представляют фрагмент эндосомального пептида ускользания на поверхности фагов.
37. Композиция по п.25, отличающаяся тем, что фаговый геном является фагемидой.
38. Композиция по п. 25, отличающаяся тем, что лиганд дополнительно включает последовательность ядерной локализации.
39. Композиция по п. 25, отличающаяся тем, что фаговые частицы представляют последовательность ядерной локализации на поверхности фагов.
40. Композиция по п. 25, отличающаяся тем, что терапевтический генный продукт выбирают из группы, состоящей из протеина, рибозима и антисмыслового олигонуклеотида.
41. Способ по п.25, отличающийся тем, что протеин заменяет дефектный ген или частично снимает дефицит генного продукта.
42. Композиция по п. 25, отличающаяся тем, что терапевтическим генным продуктом является цитотоксический агент.
43. Композиция по п.42, отличающаяся тем, что цитотоксическим агентом является инактивирующий рибосому протеин.
44. Композиция по п.42, отличающаяся тем, что инактивирующим рибосому протеином является сапорин.
45. Нитевидные фаговые частицы, имеющие лиганд на своих поверхностях, где фаговый геном кодирует терапевтический генный продукт под контролем промотора.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US08/920,396 US6054312A (en) | 1997-08-29 | 1997-08-29 | Receptor-mediated gene delivery using bacteriophage vectors |
US08/920396 | 1997-08-29 | ||
US08/920,396 | 1997-08-29 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2000107789A RU2000107789A (ru) | 2002-01-10 |
RU2209088C2 true RU2209088C2 (ru) | 2003-07-27 |
Family
ID=25443664
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2000107789/14A RU2209088C2 (ru) | 1997-08-29 | 1998-08-28 | Опосредованная рецепторами доставка генов с использованием векторов на основе бактериофагов |
Country Status (8)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US6054312A (ru) |
EP (1) | EP1005377A2 (ru) |
JP (1) | JP2001513577A (ru) |
AU (1) | AU738816B2 (ru) |
CA (1) | CA2302293A1 (ru) |
NO (1) | NO20000993L (ru) |
RU (1) | RU2209088C2 (ru) |
WO (1) | WO1999010014A2 (ru) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2493256C2 (ru) * | 2007-09-04 | 2013-09-20 | Куревак Гмбх | Комплексы на основе рнк и катионных пептидов для трансфекции и иммуностимуляции |
RU2569183C2 (ru) * | 2008-11-11 | 2015-11-20 | ЛОНДОН СКУЛ ОФ ХАЙДЖИН энд ТРОПИКАЛ МЕДСИН | Векторы |
RU2575620C2 (ru) * | 2011-08-19 | 2016-02-20 | Нэшнл Кэнсер Сентер | Рекомбинантный аденовирус, который содержит рибозим, опосредующий транс-сплайсинг, и противораковый терапевтический ген, и его применение |
RU2649368C2 (ru) * | 2007-10-30 | 2018-04-02 | Филоджен С.П.А. | Антиген, ассоциированный с ревматоидным артритом |
RU2661101C2 (ru) * | 2013-03-13 | 2018-07-11 | Дженевив Биосайнсис, Инк. | Нерепликативные трансдукторные частицы и основанные на трансдукторных частицах репортерные системы |
RU2747722C2 (ru) * | 2014-10-30 | 2021-05-13 | Темпл Юниверсити Оф Де Коммонвелт | Направляемое РНК уничтожение вируса JC человека и других полиомавирусов |
Families Citing this family (108)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6900053B2 (en) | 2001-09-14 | 2005-05-31 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of fibroblast growth factor receptor 2 expression |
US6321109B2 (en) | 1996-02-15 | 2001-11-20 | Biosense, Inc. | Catheter based surgery |
JP2002514075A (ja) * | 1997-03-03 | 2002-05-14 | セル ジェネシス,インコーポレイティド | 癌胎児性抗原を発現する細胞に特異的なアデノウイルスベクターおよびその使用方法 |
US6054312A (en) * | 1997-08-29 | 2000-04-25 | Selective Genetics, Inc. | Receptor-mediated gene delivery using bacteriophage vectors |
US20030148263A1 (en) * | 1997-08-29 | 2003-08-07 | Selective Genetics, Inc. | Methods and compositions using genetic package display |
US6723512B2 (en) * | 1997-08-29 | 2004-04-20 | Selective Genetics Inc. | Methods using genetic package display for detecting and identifying protein-protein interactions that facilitate internalization and transgene expression and cells or tissues competent for the same and methods for evolving gene delivery vectors |
EP1563866B1 (en) | 1998-02-05 | 2007-10-03 | Biosense Webster, Inc. | Intracardiac drug delivery |
US6541011B2 (en) * | 1998-02-11 | 2003-04-01 | Maxygen, Inc. | Antigen library immunization |
US7390619B1 (en) * | 1998-02-11 | 2008-06-24 | Maxygen, Inc. | Optimization of immunomodulatory properties of genetic vaccines |
AUPP249298A0 (en) * | 1998-03-20 | 1998-04-23 | Ag-Gene Australia Limited | Synthetic genes and genetic constructs comprising same I |
EP1073671A4 (en) * | 1998-04-24 | 2004-08-18 | Univ California | TARGETED GENES TRANSPORT TO CELLS THROUGH FILAMENTOUS BACTERIOPHAGES |
US6794128B2 (en) * | 1998-04-24 | 2004-09-21 | The Regents Of The University Of California | Methods of selecting internalizing antibodies |
US7244826B1 (en) * | 1998-04-24 | 2007-07-17 | The Regents Of The University Of California | Internalizing ERB2 antibodies |
US7157418B1 (en) | 1998-07-22 | 2007-01-02 | Osprey Pharmaceuticals, Ltd. | Methods and compositions for treating secondary tissue damage and other inflammatory conditions and disorders |
US20030215421A1 (en) * | 1999-07-21 | 2003-11-20 | Mcdonald John R. | Methods and compositions for treating secondary tissue damage and other inflammatory conditions and disorders |
WO2000006717A2 (en) | 1998-07-27 | 2000-02-10 | Genentech, Inc. | Improved transformation efficiency in phage display through modification of a coat protein |
IN190822B (ru) * | 1998-12-24 | 2003-08-23 | Council Scient Ind Res | |
GB9908195D0 (en) | 1999-04-09 | 1999-06-02 | Microbiological Res Authority | Treatment of intracellular infection |
US6472147B1 (en) | 1999-05-25 | 2002-10-29 | The Scripps Research Institute | Methods for display of heterodimeric proteins on filamentous phage using pVII and pIX, compositions, vectors and combinatorial libraries |
AU7572900A (en) * | 1999-08-26 | 2001-03-19 | Vion Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for delivery of an agent using attenuated salmonella containing phage |
CN1167662C (zh) * | 1999-08-31 | 2004-09-22 | 旭硝子株式会社 | 邻二氯酰基氟的制备方法 |
CA2328356A1 (en) * | 1999-12-22 | 2001-06-22 | Itty Atcravi | Recreational vehicles |
US7645743B2 (en) * | 1999-12-22 | 2010-01-12 | Altermune, Llc | Chemically programmable immunity |
US20040105871A1 (en) * | 2000-03-02 | 2004-06-03 | Robinson Harriet L. | Compositions and methods for generating an immune response |
US8623379B2 (en) | 2000-03-02 | 2014-01-07 | Emory University | Compositions and methods for generating an immune response |
EP2388015A1 (en) * | 2000-03-02 | 2011-11-23 | Emory University | DNA expression vectors and methods of use |
CA2407897A1 (en) | 2000-05-05 | 2001-11-15 | Cytos Biotechnology Ag | Molecular antigen arrays and vaccines |
GB0027328D0 (en) * | 2000-06-23 | 2000-12-27 | Aventis Pharma Inc | Bioengineered vehicles for targeted nucleic acid delivery |
US7655787B2 (en) * | 2000-08-23 | 2010-02-02 | Purdue Research Foundation | pRNA chimera |
WO2002018537A2 (en) * | 2000-08-29 | 2002-03-07 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Methods of isolating genes encoding proteins of specific function and of screening for pharmaceutically active agents |
US20040115659A1 (en) * | 2001-08-29 | 2004-06-17 | Benjamin Geiger | Methods of isolating genes encoding proteins of specific function and of screening for pharmaceutically active agents |
IT1318704B1 (it) * | 2000-09-22 | 2003-08-27 | Consorzio Interuniversitario P | Vettori chimerici e loro uso per il trasferimento di geni eterologhi. |
WO2002046208A2 (en) * | 2000-11-01 | 2002-06-13 | Elusys Therapeutics, Inc. | Method of producing biospecific molecules by protein trans-splicing |
US7320793B2 (en) * | 2001-01-19 | 2008-01-22 | Cytos Biotechnology Ag | Molecular antigen array |
US20020108132A1 (en) * | 2001-02-02 | 2002-08-08 | Avigenics Inc. | Production of a monoclonal antibody by a transgenic chicken |
WO2002072759A2 (en) * | 2001-03-07 | 2002-09-19 | Children's Medical Center Corporation | Method to screen peptide display libraries using minicell display |
DK1372710T3 (da) * | 2001-03-08 | 2010-01-18 | Us Gov Health & Human Serv | MVA der udtrykker modificeret HIV-kappe-, Gag- og Pol-gener |
US6936469B2 (en) | 2001-03-22 | 2005-08-30 | Chromos Molecular Systems Inc. | Methods for delivering nucleic acid molecules into cells and assessment thereof |
US7294511B2 (en) | 2001-03-22 | 2007-11-13 | Chromos Molecular Systems, Inc. | Methods for delivering nucleic acid molecules into cells and assessment thereof |
US20030186390A1 (en) * | 2001-03-22 | 2003-10-02 | De Jong Gary | Methods for delivering nucleic acid molecules into cells and assessment thereof |
GB0107319D0 (en) | 2001-03-23 | 2001-05-16 | Moredun Res Inst | Bacteriophage-mediated immunisation |
MXPA03010967A (es) * | 2001-05-30 | 2004-10-28 | Chromos Molecular Systems Inc | Cromosomas artificiales de plantas, usos de los mismos y metodos para preparar cromosomas artificiales de plantas. |
EP1399191A2 (en) * | 2001-06-07 | 2004-03-24 | Celator Technologies Inc. | Cell penetrating therapeutic agents |
WO2003000855A2 (en) * | 2001-06-21 | 2003-01-03 | Uab Research Foundation | Chimeric capsid proteins and uses thereof |
US20040002058A1 (en) * | 2001-06-21 | 2004-01-01 | Uab Research Foundation | Chimeric capsid proteins and uses thereof |
DE10132669B4 (de) * | 2001-07-05 | 2008-08-07 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Pharmakologische Zubereitung aus einem nanopartikulären mesomorphen Polyelektrolyt-Lipid-Komplex und mindestens einem Wirkstoff |
US7247297B2 (en) * | 2001-09-14 | 2007-07-24 | The University Of Chicago | Use of DF3/MUC1 regulated expression in gene therapy |
US20030219459A1 (en) * | 2002-01-18 | 2003-11-27 | Cytos Biotechnology Ag | Prion protein carrier-conjugates |
WO2003061596A2 (en) * | 2002-01-23 | 2003-07-31 | Gpc Biotech, Inc. | Methods and reagents for generating chimeric serum peptide carri ers |
US20040009146A1 (en) * | 2002-02-26 | 2004-01-15 | Osvaldo Podhajcer | Anti-tumor vaccine and method |
GB0205786D0 (en) * | 2002-03-12 | 2002-04-24 | Regma Bio Technologies Ltd | Novel Composition |
WO2003086276A2 (en) * | 2002-04-05 | 2003-10-23 | Selective Genetics, Inc. | Compositions and methods for portal specific gene delivery and treatment of infection |
RU2322257C2 (ru) * | 2002-06-20 | 2008-04-20 | Цитос Байотекнолоджи Аг | КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ CpG-ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ И ВИРУСОПОДОБНЫЕ ЧАСТИЦЫ, ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В КАЧЕСТВЕ АДЪЮВАНТОВ |
US20040009155A1 (en) * | 2002-07-12 | 2004-01-15 | Maria Palasis | Method for sustaining direct cell delivery |
AU2003246690B2 (en) | 2002-07-17 | 2010-03-11 | Cytos Biotechnology Ag | Molecular antigen arrays using a virus like particle derived from the AP205 coat protein |
NZ537003A (en) * | 2002-07-18 | 2008-03-28 | Cytos Biotechnology Ag | Hapten-carrier conjugates comprising virus like particles and uses thereof |
BR0312792A (pt) * | 2002-07-19 | 2005-05-03 | Cytos Biotechnology Ag | Composições de vacinas contendo séries antigênicas de amilóide beta1-6 |
US20050266416A1 (en) * | 2002-09-18 | 2005-12-01 | Purdue Research Foundation | Molecular nanomotor |
GB0222824D0 (en) * | 2002-10-02 | 2002-11-06 | Moredun Res Inst | Bacteriophage-mediated immunisation II |
US20060210588A1 (en) * | 2003-03-26 | 2006-09-21 | Cytos Biotechnology Ag | Hiv-peptide-carrier-conjugates |
US7330851B2 (en) * | 2003-08-18 | 2008-02-12 | Eaglehawk, Limited | Data security through dissembly of data elements or connections between elements |
CA2543257C (en) | 2003-10-24 | 2013-12-31 | Gencia Corporation | Methods and compositions for delivering polynucleotides |
US20090208478A1 (en) * | 2003-10-24 | 2009-08-20 | Gencia Corporation | Transducible polypeptides for modifying metabolism |
US8507277B2 (en) | 2003-10-24 | 2013-08-13 | Gencia Corporation | Nonviral vectors for delivering polynucleotides |
US8133733B2 (en) | 2003-10-24 | 2012-03-13 | Gencia Corporation | Nonviral vectors for delivering polynucleotides to target tissues |
US8062891B2 (en) | 2003-10-24 | 2011-11-22 | Gencia Corporation | Nonviral vectors for delivering polynucleotides to plants |
US20090123468A1 (en) | 2003-10-24 | 2009-05-14 | Gencia Corporation | Transducible polypeptides for modifying metabolism |
BRPI0507002A (pt) * | 2004-01-20 | 2007-06-05 | Cytos Biotechnology Ag | conjugados veìculos de grelina |
US20060292554A1 (en) * | 2004-05-18 | 2006-12-28 | Genentech, Inc. | Major coat protein variants for C-terminal and bi-terminal display |
KR20070073896A (ko) * | 2004-10-25 | 2007-07-10 | 사이토스 바이오테크놀로지 아게 | 위 억제 폴리펩티드(gip) 항원 어레이 및 그의 용도 |
US20080305119A1 (en) * | 2004-10-29 | 2008-12-11 | University Of Rochester | Modified Bacteriophage Vectors and Uses Thereof |
GB0424563D0 (en) | 2004-11-05 | 2004-12-08 | Novartis Ag | Organic compounds |
WO2006095345A2 (en) | 2005-03-08 | 2006-09-14 | Ramot At Tel-Aviv University Ltd. | Targeted drug-carrying bacteriophages |
PT1868642E (pt) * | 2005-03-18 | 2013-07-10 | Cytos Biotechnology Ag | Proteínas de fusão de alergénios de gato e suas utilizações |
CA2617561A1 (en) * | 2005-08-01 | 2007-02-08 | Purdue Research Foundation | Multivalent rna nanoparticles for delivery of active agents to a cell |
CN1990859B (zh) * | 2005-12-30 | 2011-06-22 | 中国科学院上海生命科学研究院 | 核受体配体结合区蛋白融合表达在噬菌体表面的方法 |
BRPI0710671B8 (pt) | 2006-04-07 | 2021-05-25 | Univ Texas | uso de um vetor de bacteriofágo viral adenoassociado (aavp) terapêutico para a fabricação de um medicamento para o tratamento e profilaxia de uma doença hiperproliferativa |
US20080124355A1 (en) | 2006-09-22 | 2008-05-29 | David Gordon Bermudes | Live bacterial vaccines for viral infection prophylaxis or treatment |
EP2966091B1 (en) * | 2008-07-16 | 2018-04-25 | Baylor Research Institute | Agonistic anti-cd40 antibodies |
US8647642B2 (en) | 2008-09-18 | 2014-02-11 | Aviex Technologies, Llc | Live bacterial vaccines resistant to carbon dioxide (CO2), acidic PH and/or osmolarity for viral infection prophylaxis or treatment |
US8241623B1 (en) | 2009-02-09 | 2012-08-14 | David Bermudes | Protease sensitivity expression system |
JP2012526130A (ja) | 2009-05-05 | 2012-10-25 | アルテルムネ テクフノロジエス,エルエルシー | 化学的にプログラム可能な免疫 |
BRPI1015424B1 (pt) | 2009-06-22 | 2022-01-18 | Burnham Institute For Medical Research | Composição compreendendo um elemento cendr e uma co-composição e composição para uso no reforço da internalização, penetração, ou ambas, de uma co-composição |
EP2470664A4 (en) | 2009-08-27 | 2013-01-16 | Synaptic Res Llc | NEW PROTEIN RELEASE SYSTEM FOR GENERATING INDUCED PLURIPOTENTAL STEM CELLS OR TISSUE-SPECIFIC CELLS |
US9556272B2 (en) | 2009-11-11 | 2017-01-31 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Anti-TEM1 antibodies and uses thereof |
US8771669B1 (en) | 2010-02-09 | 2014-07-08 | David Gordon Bermudes | Immunization and/or treatment of parasites and infectious agents by live bacteria |
US9597379B1 (en) | 2010-02-09 | 2017-03-21 | David Gordon Bermudes | Protease inhibitor combination with therapeutic proteins including antibodies |
US8524220B1 (en) | 2010-02-09 | 2013-09-03 | David Gordon Bermudes | Protease inhibitor: protease sensitivity expression system composition and methods improving the therapeutic activity and specificity of proteins delivered by bacteria |
WO2012118778A1 (en) | 2011-02-28 | 2012-09-07 | Sanford-Burnham Medical Research Institute | Truncated car peptides and methods and compositions using truncated car peptides |
CA2837588A1 (en) | 2011-05-31 | 2012-12-06 | Airware, Inc. | Re-calibration of ab ndir gas sensors |
US10179801B2 (en) | 2011-08-26 | 2019-01-15 | Sanford-Burnham Medical Research Institute | Truncated LYP-1 peptides and methods and compositions using truncated LYP-1 peptides |
CA2863658C (en) * | 2012-02-03 | 2023-03-14 | Emory University | Immunostimulatory compositions, particles, and uses related thereto |
US9783610B2 (en) | 2012-04-27 | 2017-10-10 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Anti-tumor endothelial marker-1 (TEM1) antibody variants and uses thereof |
SG11201502404WA (en) | 2012-10-03 | 2015-05-28 | Philogen Spa | Antigens associated with inflammatory bowel disease |
US9593339B1 (en) | 2013-02-14 | 2017-03-14 | David Gordon Bermudes | Bacteria carrying bacteriophage and protease inhibitors for the treatment of disorders and methods of treatment |
CA2907234A1 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Altria Client Services Llc | Bacteriophage and methods of making and using |
GB201308742D0 (en) * | 2013-05-15 | 2013-06-26 | Imp Innovations | Bacteriophage |
GB201308745D0 (en) * | 2013-05-15 | 2013-06-26 | Imp Innovations | Bacteriophage |
WO2016123425A1 (en) | 2015-01-29 | 2016-08-04 | Altria Client Services Llc | Endolysin from bacteriophage against geobacillus and methods of using |
US9781929B2 (en) | 2015-01-29 | 2017-10-10 | Altria Client Services Llc | Bacteriophage and methods of using |
CN105754958B (zh) * | 2016-03-07 | 2019-05-07 | 中国科学院广州生物医药与健康研究院 | 一种可投送自主发光元件的分枝杆菌噬菌体及其应用 |
US11180535B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-11-23 | David Gordon Bermudes | Saccharide binding, tumor penetration, and cytotoxic antitumor chimeric peptides from therapeutic bacteria |
US11129906B1 (en) | 2016-12-07 | 2021-09-28 | David Gordon Bermudes | Chimeric protein toxins for expression by therapeutic bacteria |
WO2018204392A1 (en) | 2017-05-02 | 2018-11-08 | Stanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute | Tumor associated monocyte/macrophage binding peptide and methods of use thereof |
CA3105381A1 (en) | 2018-07-11 | 2020-01-16 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods and compositions for delivery of agents across the blood-brain barrier |
CA3127985A1 (en) | 2019-02-04 | 2020-08-13 | University Of Tartu | Bi-specific extracellular matrix binding peptides and methods of use thereof |
AU2021206256A1 (en) | 2020-01-10 | 2022-07-28 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods and compositions for delivery of immunotherapy agents across the blood-brain barrier to treat brain cancer |
WO2024030432A1 (en) * | 2022-08-01 | 2024-02-08 | Gensaic, Inc. | Therapeutic phage-derived particles |
Family Cites Families (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU7906691A (en) | 1990-05-23 | 1991-12-10 | United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The | Adeno-associated virus (aav)-based eucaryotic vectors |
JPH06508511A (ja) | 1990-07-10 | 1994-09-29 | ケンブリッジ アンティボディー テクノロジー リミティド | 特異的な結合ペアーの構成員の製造方法 |
GB2268942B (en) * | 1992-07-24 | 1995-10-04 | Cistermiser Ltd | Control apparatus for flushing systems |
US5516637A (en) | 1994-06-10 | 1996-05-14 | Dade International Inc. | Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage |
US5856152A (en) | 1994-10-28 | 1999-01-05 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Hybrid adenovirus-AAV vector and methods of use therefor |
US5843742A (en) | 1994-12-16 | 1998-12-01 | Avigen Incorporated | Adeno-associated derived vector systems for gene delivery and integration into target cells |
US5736388A (en) * | 1994-12-30 | 1998-04-07 | Chada; Sunil | Bacteriophage-mediated gene transfer systems capable of transfecting eukaryotic cells |
US5773289A (en) | 1995-06-06 | 1998-06-30 | University Of Pittsburgh | AAV directed targeted integration |
AU6113396A (en) | 1995-06-14 | 1997-01-15 | Regents Of The University Of California, The | Novel high affinity human antibodies to tumor antigens |
GB9516138D0 (en) | 1995-08-05 | 1995-10-04 | Medical Res Council | Improvements in or relating to methods of screening substances |
WO1998005344A1 (en) * | 1996-08-05 | 1998-02-12 | Brigham And Women's Hospital, Inc. | Bacteriophage-mediated gene therapy |
AU6685698A (en) | 1997-03-07 | 1998-09-22 | Sunol Molecular Corporation | Fusion proteins comprising bacteriophage coat protein and a single-chain t cell receptor |
IT1291135B1 (it) | 1997-04-08 | 1998-12-29 | Angeletti P Ist Richerche Bio | Vettori ricombinanti utilizzabili in terapia genica |
WO1998048005A1 (en) | 1997-04-24 | 1998-10-29 | University Of Washington | Targeted gene modification by parvoviral vectors |
US6054312A (en) * | 1997-08-29 | 2000-04-25 | Selective Genetics, Inc. | Receptor-mediated gene delivery using bacteriophage vectors |
JP2001513995A (ja) | 1997-08-29 | 2001-09-11 | セレクティブ ジェネティックス, インコーポレイテッド | 遺伝子送達のためのインターナリゼーションリガンドを選択するためのファージディスプレイを使用する方法 |
US6190908B1 (en) | 1998-08-12 | 2001-02-20 | The Scripps Research Institute | Modulation of polypeptide display on modified filamentous phage |
-
1997
- 1997-08-29 US US08/920,396 patent/US6054312A/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-08-28 JP JP2000507403A patent/JP2001513577A/ja not_active Withdrawn
- 1998-08-28 AU AU91255/98A patent/AU738816B2/en not_active Ceased
- 1998-08-28 EP EP98943466A patent/EP1005377A2/en not_active Withdrawn
- 1998-08-28 WO PCT/US1998/017950 patent/WO1999010014A2/en active IP Right Grant
- 1998-08-28 CA CA002302293A patent/CA2302293A1/en not_active Abandoned
- 1998-08-28 RU RU2000107789/14A patent/RU2209088C2/ru not_active IP Right Cessation
-
1999
- 1999-02-26 US US09/258,584 patent/US6448083B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-02-28 NO NO20000993A patent/NO20000993L/no not_active Application Discontinuation
-
2002
- 2002-06-12 US US10/171,407 patent/US7148202B2/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
JESPERS L. et al. Surface expression... Biothechnology, v.13, 1995, p.378-382. * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2493256C2 (ru) * | 2007-09-04 | 2013-09-20 | Куревак Гмбх | Комплексы на основе рнк и катионных пептидов для трансфекции и иммуностимуляции |
RU2649368C2 (ru) * | 2007-10-30 | 2018-04-02 | Филоджен С.П.А. | Антиген, ассоциированный с ревматоидным артритом |
RU2569183C2 (ru) * | 2008-11-11 | 2015-11-20 | ЛОНДОН СКУЛ ОФ ХАЙДЖИН энд ТРОПИКАЛ МЕДСИН | Векторы |
RU2575620C2 (ru) * | 2011-08-19 | 2016-02-20 | Нэшнл Кэнсер Сентер | Рекомбинантный аденовирус, который содержит рибозим, опосредующий транс-сплайсинг, и противораковый терапевтический ген, и его применение |
RU2661101C2 (ru) * | 2013-03-13 | 2018-07-11 | Дженевив Биосайнсис, Инк. | Нерепликативные трансдукторные частицы и основанные на трансдукторных частицах репортерные системы |
RU2747722C2 (ru) * | 2014-10-30 | 2021-05-13 | Темпл Юниверсити Оф Де Коммонвелт | Направляемое РНК уничтожение вируса JC человека и других полиомавирусов |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
NO20000993D0 (no) | 2000-02-28 |
AU9125598A (en) | 1999-03-16 |
JP2001513577A (ja) | 2001-09-04 |
AU738816B2 (en) | 2001-09-27 |
EP1005377A2 (en) | 2000-06-07 |
US6448083B1 (en) | 2002-09-10 |
CA2302293A1 (en) | 1999-03-04 |
US7148202B2 (en) | 2006-12-12 |
US20030082143A1 (en) | 2003-05-01 |
WO1999010014A2 (en) | 1999-03-04 |
NO20000993L (no) | 2000-04-27 |
US6054312A (en) | 2000-04-25 |
WO1999010014A3 (en) | 1999-07-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2209088C2 (ru) | Опосредованная рецепторами доставка генов с использованием векторов на основе бактериофагов | |
US6613563B1 (en) | Viral vectors with modified tropism | |
RU2234530C2 (ru) | Способ идентификации бактериофага, способ выделения клеток млекопитающего, способ селекции бактериофага (варианты), способ идентификации подгруппы бактериофагов и интернализующий лиганд (варианты) | |
JPH08506239A (ja) | 標的細胞に対して特異的な、修飾された結合部分を有するウイルス | |
JP2001503250A (ja) | 束縛ペプチドモチーフを用いたターゲッティングアデノウイルス | |
BG98718A (bg) | Състав за въвеждане на комплекси на нуклеинови киселини в по-висши еукариотни клетки | |
JP2004502450A (ja) | ターゲッティング遺伝子送達のための二官能性分子およびそれと複合化されたベクター | |
US20080044386A1 (en) | Protamine-Adenoviral Vector Complexes and Methods of Use | |
JP2015051018A (ja) | キメラアデノウイルスキャプシドタンパク質 | |
US20110071214A1 (en) | Methods and compositions for the treatment of cancer | |
JP2003061693A (ja) | ウイルス様粒子、その製造方法およびその使用 | |
WO2003086276A2 (en) | Compositions and methods for portal specific gene delivery and treatment of infection | |
US20030040496A1 (en) | Methods for halting unwanted cell growth, such as using ligand-directed nucleic acid delivery vehicles | |
US6589730B1 (en) | Methods for identifying protein-protein interactions by selective transduction | |
MXPA00002076A (en) | Receptor-mediated gene delivery using bacteriophage vectors | |
JP2006510360A (ja) | 内皮細胞特異的結合ペプチド | |
AU771686B2 (en) | Adenoviral vectors with modified tropism | |
WO2009081154A1 (en) | Targeted delivery of macromolecules | |
Stoneham | Investigation into the entry and intracellular trafficking of a bacteriophage-derived gene therapy vector |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20040829 |