RU2017110582A - Мутанты рекомбиназ - Google Patents

Claims (48)

1. Рекомбинантная UvsX, содержащая аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 1, причем рекомбинантная UvsX содержит заместительную аминокислотную мутацию в положении, функционально эквивалентном Pro256 в аминокислотной последовательности RB49 UvsX.

2. Рекомбинантная UvsX по п.1, где указанная заместительная мутация включает мутацию на заряженный остаток.

3. Рекомбинантная UvsX по п.1, где указанная заместительная мутация включает мутацию на основный остаток.

4. Рекомбинантная UvsX по п.1, где указанная заместительная мутация включает мутацию, гомологичную Pro256Lys в аминокислотной последовательности RB49 UvsX.

5. Рекомбинантная UvsX по любому из пп.1-4, где рекомбинантная UvsX дополнительно содержит заместительную мутацию в положении, функционально эквивалентном His63 в аминокислотной последовательности RB49 UvsX.

6. Рекомбинантная UvsX по п.5, где рекомбинантная UvsX содержит заместительную мутацию, гомологичную His63Ser в аминокислотной последовательности RB49 UvsX.

7. Рекомбинантная UvsX по любому из пп.1-6, где рекомбинантная UvsX дополнительно содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из: добавления одного или нескольких остатков глутаминовой кислоты на С-конце; добавления одного или нескольких остатков аспарагиновой кислоты на С-конце; и их комбинации.

8. Рекомбинантная UvsX по любому из пп.1-7, где рекомбинантную UvsX получают из миовирусного фага, выбранного из группы, состоящей из: Т4, Т6, Rb69, Aeh1, KVP40, фага Acinetobacter 133, фага Aeromonas 65, цианофага Р-SSM2, цианофага PSSM4, цианофага S-PM2, Rb32, фага Vibrio nt-1, Rb16, Rb43 и Rb49.

9. Рекомбинантная UvsX по любому из пп.1-7, где рекомбинантную UvsX получают из миовирусного фага, выбранного из группы, состоящей из: T2, Rb14, фага Aeromonas 25, phi-1, фага 31, фага 44RR2.8t, фага Rb3 и фага LZ2.

10. Рекомбинантная UvsX, содержащая аминокислотную последовательность из любой одной из SEQ ID NO: 2 и 22-35.

11. Рекомбинантная UvsX, содержащая заместительную мутацию в полуконсервативном домене, содержащем аминокислотную последовательность из любой из SEQ ID NO: 3-5, где заместительная мутация содержит мутацию, выбранную из замещения в положении 7 на любой остаток, кроме Phe, Pro, Asp, Glu или Asn.

12. Рекомбинантная UvsX по п.11, где мутация содержит мутацию на заряженный остаток.

13. Рекомбинантная UvsX по п.11, где мутация содержит замену в положении 7 на Lys.

14. Рекомбинантная UvsX, содержащая заместительную мутацию в полуконсервативном домене, содержащем аминокислотную последовательность из любой из SEQ ID NO: 6-7, где заместительная мутация содержит мутацию, выбранную из замещения в положении 12 на любой остаток, кроме Phe, Pro, Asp, Glu или Asn.

15. Рекомбинантная UvsX по п.14, где мутация содержит мутацию на заряженный остаток.

16. Рекомбинантная UvsX по п.14, где мутация содержит замену в положении 12 на Lys.

17. Рекомбинантная UvsX по любому из пп.10-15, где рекомбинантная UvsX дополнительно содержит заместительную мутацию в положении, функционально эквивалентном His63 в аминокислотной последовательности RB49 UvsX.

18. Рекомбинантная UvsX по п.17, где рекомбинантная UvsX содержит заместительную мутацию, гомологичную His63Ser в аминокислотной последовательности RB49 UvsX.

19. Рекомбинантная UvsX по любому из пп.10-18, где рекомбинантная UvsX дополнительно содержит мутацию, выбранную из группы, состоящей из: добавления одного или нескольких остатков глутаминовой кислоты на С-конце; добавления одного или нескольких остатков аспарагиновой кислоты на С-конце; и их комбинации.

20. Рекомбинантная UvsX по любому из пп.10-19, где рекомбинантную UvsX получают из миовирусного фага, выбранного из группы, состоящей из: Т4, Т6, Rb69, Aeh1, KVP40, фага Acinetobacter 133, фага Aeromonas 65, цианофага Р-SSM2, цианофага PSSM4, цианофага S-PM2, Rb32, фага Vibrio nt-1, Rb16, Rb43 и Rb49.

21. Рекомбинантная UvsX по любому из пп.10-19, где рекомбинантную UvsX получают из миовирусного фага, выбранного из группы, состоящей из: T2, Rb14, фага Aeromonas 25, phi-1, фага 31, фага 44RR2.8t, фага Rb3 и фага LZ2.

22. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая рекомбинантную UvsX по любому из пп.1-21.

23. Экспрессионный вектор, содержащий молекулу нуклеиновой кислоты по п.22.

24. Клетка-хозяин, содержащая вектор по п.23.

25. Способ рекомбиназной полимеразной амплификации для амплификации молекулы нуклеиновой кислоты-мишени, включающий следующие стадии: (а) контактирования рекомбинантной UvsX по любому из пп.1-21 с первым и вторым нуклеотидными праймерами с образованием первого и второго нуклеопротеинового праймера, где указанный нуклеотидный праймер содержит одноцепочечную область на своем 3'-конце; (b) контактирования первого и второго нуклеопротеиновых праймеров с указанной молекулой нуклеиновой кислоты-мишени, таким образом образуя первую двухцепочечную структуру на первом участке указанной первой цепи и образуя вторую двухцепочечную структуру на втором участке указанной второй цепи, так что 3'-концы указанного первого нуклеотидного праймера и указанного второго нуклеотидного праймера направлены друг на друга на одной двухцепочечной нуклеотидной матричной молекуле; (с) удлинения 3'-концов указанных первого и второго нуклеотидных праймеров с одной или несколькими полимеразами и dNTP, чтобы синтезировать первую и вторую двухцепочечную нуклеиновую кислоту, и первую и вторую вытесненные цепи нуклеиновой кислоты; и (d) продолжения реакции путем повторения стадий (b) и (с) до достижения желаемой степени амплификации.

26. Способ по п.25, в котором указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит двухцепочечную нуклеиновую кислоту.

27. Способ по п.25, где указанная молекула нуклеиновой кислоты содержит одноцепочечную адаптерную область.

28. Способ по п.25, где способ осуществляют в присутствии белка-загрузчика рекомбиназы.

29. Способ по п.28, где белок-загрузчик рекомбиназы выбран из группы, состоящей из Т4 UvsY, E.coli ReCo, E.coli Recr и их комбинации.

30. Способ по п.25, где способ осуществляют в присутствии стабилизирующего одноцепочечные нуклеиновые кислоты агента, выбранного из группы, состоящей из GP32, белка SSB из E.coli, белка GP32 из Т4 и их производных.

31. Способ по п.25, где способ осуществляют в присутствии концентрирующего агента, выбранного из группы, включающей полиэтиленгликоль, полиэтиленоксид, полистирол, фиколл, декстран, ПВП и альбумин, так что концентрирующий агент стимулирует амплификацию.

32. Способ по п.25, где способ осуществляется на массиве амплификационных сайтов.

33. Способ по п.32, где каждый амплификационный сайт содержит множество амплификационных праймеров для амплификации нуклеиновой кислоты-мишени.

34. Способ по п.32, где массив амплификационных сайтов содержит массив признаков на поверхности.

35. Способ по п.34, где признаки являются несмежными и отделены друг от друга промежуточными областями поверхности, на которых отсутствуют амплификационные праймеры.

36. Способ по п.32, где массив амплификационных сайтов содержит шарики в растворе или шарики на поверхности.

37. Способ по п.32, где массив амплификационных сайтов содержит эмульсию.

38. Способ по п.25, где способ происходит изотермически.

39. Набор для осуществления рекомбиназной полимеразной реакции, включающий: рекомбинантную UvsX по любому из пп.1-21 и одно или несколько из следующего:

связывающего одноцепочечную ДНК белка;

ДНК-полимеразы;

dNTP или смеси dNTP и ddNTP;

концентрирующего агента;

буфера;

восстанавливающего агента;

АТР или аналога АТР;

белка-загрузчика рекомбиназы;

первого праймера и, необязательно, второго праймера.