JP2019213545A - リコンビナーゼ変異体 - Google Patents
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- C12Y306/01008—ATP diphosphatase (3.6.1.8)
Abstract
Description
例えば、リコンビナーゼモデル及びモデル予測に従って、又はランダム若しくは半ランダムな変異アプローチを使用して、例えば、リコンビナーゼを改変して変異株を生成するために、任意選択で、様々な種類の変異誘発が本開示で使用される。一般に、リコンビナーゼ変異体を作製するために、利用可能な任意の変異誘発方法を使用することができる。そのような変異誘発方法は、任意選択で、目的の1種又は複数の活性(例えば、増強されたシーディング及び/又は固体支持体上での増幅)について変異体核酸及びポリペプチドを選択すること含む。使用することができる方法としては、限定されないが、部位特異的点変異誘発、ランダム点変異誘発、in vitro又はin vivo相同組換え(DNAシャッフリング及びコンビナトリアルオーバーラップPCR)、ウラシル含有鋳型を使用する変異誘発、オリゴヌクレオチド指定変異誘発、ホスホロチオエート修飾DNA変異誘発、ギャップを有する二本鎖DNAを使用する変異誘発、点ミスマッチ修復、修復欠損性宿主系統を使用する変異誘発、制限選択及び制限精製、欠失変異誘発、全遺伝子合成による変異誘発、縮重PCR、二本鎖切断修復並びに当業者に知られている多くの他のものが挙げられる。変異のための出発リコンビナーゼは、例えばその全体が参照により組み込まれる米国特許出願公開第2009/0029421号で特定されたものなどの利用可能なリコンビナーゼ変異体を含めた、本明細書で言及されるもののうちのいずれかでもよい。
rate oligonucleotide gene shuffling(DOGS):a method for enhancing the frequency of recombination with family shuffling”Gene 271:13〜20;並びにHiraga及びArnold(2003)”General method for sequence−independent site−directed chimeragenesis:J.Mol.Biol.330:287〜296。上記の方法の多くに関するさらなる詳細は、Methods in Enzymology第154巻に見出すことができ、これは、様々な変異誘発方法にともなうトラブルシューティング問題についての有用なコントロールも記載している。
一般に、本明細書で提供するリコンビナーゼをコードする核酸は、クローニング、組換え、in vitro合成、in vitro増幅及び/又は他の利用可能な方法によって作製することができる。本明細書で提供するリコンビナーゼをコードする発現ベクターを発現させるために、様々な組換え方法を使用することができる。組換え核酸の作製、発現及び発現産物の単離のための方法は本技術分野でよく知られており、説明されている。いくつかの例示的な変異及び変異の組み合わせ並びに望ましい変異を設計するためのストラテジーが、本明細書に記載される。
本明細書で提供される改変リコンビナーゼは、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅(RPA)技法などのリコンビナーゼ媒介性増幅方法で使用することができる。簡潔に言えば、標的核酸をリコンビナーゼ及び標的核酸分子に対して特異的な一本鎖核酸プライマーに接触させることによって、RPAが開始され得る。次いで、ポリメラーゼ、例えばdNTPsの存在下で鎖置換ができるポリメラーゼによって、ハイブリダイズしたプライマーが伸長され、二本鎖標的核酸分子及び核酸分子の置換鎖が生成され得る。核酸分子の置換鎖に対するプライマーのリコンビナーゼ媒介性標的化及びプライマーの伸長によって、二本鎖核酸分子を生成することにより、さらなる増幅が起こり得る。RPA方法は、例えば、リコンビナーゼローディング因子、特定の鎖置換ポリメラーゼ及び頑強なエネルギー再生システムとの上記の成分の組み合わせによって、調整され得る。本開示の組換えUvsXタンパク質を用いる使用に容易に適合させることができる例示的なRPAの方法、システム及び成分は、例えば、米国特許第8,071,308号、第7,399,590号、第7,485,428号、第7,270,981号、第8,030,000号、第7,666,598号、第7,763,427号、第8,017,399号、第8,062,850号及び第7,435,561号に記載されており、これらのそれぞれは、参照によって本明細書に組み込まれる。
用語「同一」又は「同一性パーセント」は、2つ以上の核酸配列又はポリペプチド配列の文脈において、最大一致について比較し、整列させた場合、以下に記載の配列比較アルゴリズムのうちの1つ(若しくは当業者が利用可能な他のアルゴリズム)を使用して、又は目視検査によって測定した際に、同一であるか特定のパーセンテージの同一であるアミノ酸残基又はヌクレオチドを有する2つ以上の配列又はサブ配列を指す。
本明細書で提供される改変リコンビナーゼ酵素をコードする核酸分子が本明細書でさらに提供される。アミノ酸配列、好ましくはリコンビナーゼをコードする野生型ヌクレオチド配列も知られている変異体バージョンのリコンビナーゼである、任意の所与の改変リコンビナーゼについては、分子生物学の基本原理に従って、変異体をコードするヌクレオチド配列を得ることが可能である。例えば、RB49 UvsXリコンビナーゼをコードする野生型ヌクレオチド配列が知られているとすれば、標準的な遺伝暗号を使用して、1つ又は複数のアミノ酸置換を有する、任意の所与の変異体バージョンのRB49 UvsXをコードするヌクレオチド配列を推定することが可能である。同様に、変異体バージョンの他のリコンビナーゼ、例えば、T4、T6、Rb69、Aeh1、KVP40、アシネトバクターファージ133、エロモナスファージ65、シアノファージP−SSM2、シアノファージPSSM4、シアノファージS−PM2、Rb32、ビブリオファージnt−1、Rb16、Rb43、T2、Rb14、エロモナスファージ25、phi−1、ファージ31、ファージ44RR2.8t、ファージRb3及びファージLZ2などについて、ヌクレオチド配列を容易に得ることができる。次いで、当技術分野で知られている標準的な分子生物学的技法を使用して、必要とされるヌクレオチド配列を有する核酸分子を構築することができる。
本実施例は、クラスター増幅の向上の、パターン化されたフローセル表面へのPCRフリーライブラリーのシーディング方法を提供する。一実施形態では、本発明の方法は、上記で示された変異を含むUvsX、例えば、Pro256Lysを含むRB49 UvsX変異体(配列番号2として本明細書に示され、「RB49 P256K」と本明細書で言及される)を含むシーディング配合物を使用する。驚くべきことに、これを使用するリコンビナーゼ媒介性増幅が、パターン化されたフローセル表面への一本鎖アダプター領域を有するPCRライブラリーのシーディングを実質的に向上させることが発見された。別の実施形態では、本発明の方法は、RB49 P256Kリコンビナーゼとともに比較的高濃度のDNAポリメラーゼ(例えば、eBsuポリメラーゼ)を含むシーディング配合物を使用する。
RB49 P256K変異体を使用した、増幅の向上
本実施例は、本明細書に記載のP256K変異を有するリコンビナーゼとこの変異を有さないリコンビナーゼの間の増幅能力の比較を記載する。本実施例において、「コントロール」のRB49 UvsX(配列番号1に示す)は、H63S変異をさらに含む。P256K変異体は、配列番号2で本明細書に記載されるように、位置256にLys残基を有するようにコントロールをさらに変異させることによって生成した。
P256Kに相同な変異を有する変異体を使用した、増幅の向上
実施例2で上述した能力比較を、他のリコンビナーゼについて繰り返した。本実施例では、「コントロール」リコンビナーゼは、以下の表の「コントロール」の列に示されるように、RB49のH63Sに相同な変異を含むように野生型リコンビナーゼを改変することによって生成した。「P256Kホモログ」変異体は、以下の表の「P256Kホモログ」の列に示されるように、RB49のP256Kに相同な変異を有するようにコントロールをさらに改変することによって生成した。
Claims (39)
- 配列番号1と少なくとも60%、70%、80%、90%、95%、99%同一のアミノ酸配列を含む組換えUvsXであって、RB49 UvsXのアミノ酸配列のPro256と機能的に同等である位置にアミノ酸置換変異を含む、組換えUvsX。
- 前記置換変異が、荷電した残基に対する変異を含む、請求項1に記載の組換えUvsX。
- 前記置換変異が塩基性残基に対する変異を含む、請求項1に記載の組換えUvsX。
- 前記置換変異がRB49 UvsXのアミノ酸配列のPro256Lysに相同な変異を含む、請求項1に記載の組換えUvsX。
- RB49 UvsXのアミノ酸配列のHis63と機能的に同等である位置にさらに置換変異を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組換えUvsX。
- RB49 UvsXのアミノ酸配列のHis63Serと相同な置換変異を含む、請求項5に記載の組換えUvsX。
- C末端における1つ又は複数のグルタミン酸残基の付加、C末端における1つ又は複数のアスパラギン酸残基の付加、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される変異をさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組換えUvsX。
- T4、T6、Rb69、Aeh1、KVP40、アシネトバクターファージ133、エロモナスファージ65、シアノファージP−SSM2、シアノファージPSSM4、シアノファージS−PM2、Rb32、ビブリオファージnt−1、Rb16、Rb43及びRb49から成る群から選択されるミオウイルス科のファージに由来する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組換えUvsX。
- T2、Rb14、エロモナスファージ25、phi−1、ファージ31、ファージ44RR2.8t、ファージRb3及びファージLZ2から成る群から選択されるミオウイルス科のファージに由来する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組換えUvsX。
- 配列番号2及び22〜35のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含む、組換えUvsX。
- 配列番号3〜5のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む半保存的ドメインに対する置換変異を含む組換えUvsXであって、前記置換変異が、Phe、Pro、Asp、Glu又はAsn以外の任意の残基に対する位置7における置換から選択される変異を含む、組換えUvsX。
- 前記変異が、荷電した残基に対する変異を含む、請求項11に記載の組換えUvsX。
- 前記変異がLysに対する位置7における置換を含む、請求項11に記載の組換えUvsX。
- 配列番号6又は7のいずれかのアミノ酸配列を含む半保存的ドメインに対する置換変異を含む組換えUvsXであって、前記置換変異が、Phe、Pro、Asp、Glu又はAsn以外の任意の残基に対する位置12における置換から選択される変異を含む、組換えUvsX。
- 前記変異が、荷電した残基に対する変異を含む、請求項14に記載の組換えUvsX。
- 前記変異がLysに対する位置12における置換を含む、請求項14に記載の組換えUvsX。
- RB49 UvsXのアミノ酸配列のHis63と機能的に同等である位置に置換変異をさらに含む、請求項10〜15のいずれか一項に記載の組換えUvsX。
- RB49 UvsXのアミノ酸配列のHis63Serと相同な置換変異を含む、請求項17に記載の組換えUvsX。
- C末端における1つ又は複数のグルタミン酸残基の付加、C末端における1つ又は複数のアスパラギン酸残基の付加、及びこれらの組み合わせから成る群から選択される変異をさらに含む、請求項10〜18のいずれか一項に記載の組換えUvsX。
- T4、T6、Rb69、Aeh1、KVP40、アシネトバクターファージ133、エロモナスファージ65、シアノファージP−SSM2、シアノファージPSSM4、シアノファージS−PM2、Rb32、ビブリオファージnt−1、Rb16、Rb43及びRb49から成る群から選択されるミオウイルス科のファージに由来する、請求項10〜19のいずれか一項に記載の組換えUvsX。
- T2、Rb14、エロモナスファージ25、phi−1、ファージ31、ファージ44RR2.8t、ファージRb3及びファージLZ2から成る群から選択されるミオウイルス科のファージに由来する、請求項10〜19のいずれか一項に記載の組換えUvsX。
- 請求項1〜21のいずれか一項に記載の組換えUvsXをコードする核酸分子。
- 請求項22に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
- 請求項23に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 標的核酸分子を増幅するリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法であって、(a)請求項1〜21のいずれか一項に記載の組換えUvsXを第1及び第2の核酸プライマーと接触させて、第1及び第2の核タンパク質プライマーを形成するステップであり、前記核酸プライマーがその3’末端に一本鎖領域を含む、ステップと、(b)前記第1及び前記第2の核タンパク質プライマーを前記標的核酸分子に接触させ、それによって、前記第1鎖の第1の部分において第1の二本鎖構造を形成し、前記第2鎖の第2の部分において第2の二本鎖構造を形成し、その結果、前記第1の核酸プライマーと前記第2の核酸プライマーの3’末端が同じ二本鎖の鋳型核酸分子上で互いに向かい合うステップと、(c)1種又は複数のポリメラーゼ及びdNTPsを使用して前記第1及び第2の核酸プライマーの3’末端を伸長させて、第1及び第2の二本鎖核酸並びに第1及び第2の核酸置換鎖を生成するステップと、(d)所望の程度の増幅に達するまで(b)及び(c)を繰り返して反応を続けるステップとを含む、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
- 前記標的核酸分子が二本鎖核酸を含む、請求項25に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
- 前記標的核酸分子が一本鎖のアダプター領域を含む、請求項25に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
- リコンビナーゼローディングタンパク質の存在下で行われる、請求項25に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
- 前記リコンビナーゼローディングタンパク質が、T4 UvsY、大腸菌recO、大腸菌recR及びこれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項28に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
- gp32、大腸菌SSBタンパク質、T4 gp32タンパク質及びこれらの誘導体から成る群から選択される一本鎖安定化剤の存在下で行われる、請求項25に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
- ポリエチレングリコール、ポリエチレンオキシド、ポリスチレン、フィコール、デキストラン、PVP及びアルブミンを含む群から選択される密集化剤の存在下で行われ、その結果、前記密集化剤が増幅を促進する、請求項25に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
- 増幅部位のアレイ上で行われる、請求項25に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
- 各増幅部位が、前記標的核酸を増幅するための複数の増幅プライマーを含む、請求項32に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
- 増幅部位の前記アレイが、表面にフィーチャーのアレイを含む、請求項32に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
- 前記フィーチャーが、不連続であり且つ前記増幅プライマーを欠く前記表面の介在領域によって分離している、請求項34に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
- 増幅部位の前記アレイが、溶液中にビーズを含む又は表面上にビーズを含む、請求項32に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
- 増幅部位の前記アレイがエマルジョンを含む、請求項32に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
- 等温で行われる、請求項25に記載のリコンビナーゼポリメラーゼ増幅方法。
- 請求項1〜21のいずれか一項に記載の組換えUvsX並びに以下の1つ又は複数:
一本鎖DNA結合タンパク質、
DNAポリメラーゼ、
dNTPs又はdNTPsとddNTPsの混合物、
密集化剤、
緩衝液、
還元剤、
ATP又はATP類似体、
リコンビナーゼローディングタンパク質、
第1のプライマー及び任意選択で第2のプライマー
を含む、リコンビナーゼポリメラーゼ反応を行うためのキット。
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