RU2013132761A - Набор олигонуклеотидных зондов и способы профилирования микробиоты - Google Patents

Abstract

1. Набор олигонуклеотидных зондов, где указанный набор включает:(a) олигонуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из ACGCTTGCACCCT (SEQ ID NO: 1), последовательности, комплементарной ей (AGGGTGCAAGCGT; SEQ ID NO: 27), или последовательности, способной гибридизоваться с обеими последовательностями в строгих условиях гибридизации;(b) олигонуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из CGATCCGAAAACCTTCTTCACT (SEQ ID NO: 2), последовательности, комплементарной ей (AGTGAAGAAGGTTTTCGGATCG; SEQ ID NO: 28), или последовательности, способной гибридизоваться с обеими последовательностями в строгих условиях гибридизации;(c) олигонуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из GGACAACGCTTGCCAC (SEQ ID NO: 3), последовательности, комплементарной ей (GTGGCAAGCGTTGTCC; SEQ ID NO: 29), или последовательности, способной гибридизоваться с обеими последовательностями в строгих условиях гибридизации;(d) олигонуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из CGTAGGCGGTTCGTCGCGT (SEQ ID NO: 4), последовательности, комплементарной ей (ACGCGACGAACCGCCTACG; SEQ ID NO: 30), или последовательности, способной гибридизоваться с обеими последовательностями в строгих условиях гибридизации; и(e) один или несколько олигонуклеотидов, содержащих нуклеотидную последовательность, выбранную из приведенных в таблице 1, или последовательность, способную гибридизоваться с любой из нуклеотидных последовательностей, приведенных в таблице 1, в строгих условиях гибридизации; и необязательно(f) один или несколько олигонуклеотидов, содержащих нуклеотидную последовательность, выбранную из приведенных в таблице 2 и таблице 3, или последовательность, способную гибридизоваться с л�

Claims (27)

1. Набор олигонуклеотидных зондов, где указанный набор включает:

(a) олигонуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из ACGCTTGCACCCT (SEQ ID NO: 1), последовательности, комплементарной ей (AGGGTGCAAGCGT; SEQ ID NO: 27), или последовательности, способной гибридизоваться с обеими последовательностями в строгих условиях гибридизации;

(b) олигонуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из CGATCCGAAAACCTTCTTCACT (SEQ ID NO: 2), последовательности, комплементарной ей (AGTGAAGAAGGTTTTCGGATCG; SEQ ID NO: 28), или последовательности, способной гибридизоваться с обеими последовательностями в строгих условиях гибридизации;

(c) олигонуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из GGACAACGCTTGCCAC (SEQ ID NO: 3), последовательности, комплементарной ей (GTGGCAAGCGTTGTCC; SEQ ID NO: 29), или последовательности, способной гибридизоваться с обеими последовательностями в строгих условиях гибридизации;

(d) олигонуклеотид, содержащий нуклеотидную последовательность, выбранную из CGTAGGCGGTTCGTCGCGT (SEQ ID NO: 4), последовательности, комплементарной ей (ACGCGACGAACCGCCTACG; SEQ ID NO: 30), или последовательности, способной гибридизоваться с обеими последовательностями в строгих условиях гибридизации; и

(e) один или несколько олигонуклеотидов, содержащих нуклеотидную последовательность, выбранную из приведенных в таблице 1, или последовательность, способную гибридизоваться с любой из нуклеотидных последовательностей, приведенных в таблице 1, в строгих условиях гибридизации; и необязательно

(f) один или несколько олигонуклеотидов, содержащих нуклеотидную последовательность, выбранную из приведенных в таблице 2 и таблице 3, или последовательность, способную гибридизоваться с любой из нуклеотидных последовательностей, приведенных в таблице 2 и таблице 3, в строгих условиях гибридизации.

2. Набор олигонуклеотидных зондов по п.1, где компонент (f) включен в набор зондов и представляет собой один или несколько олигонуклеотидов, содержащих нуклеотидную последовательность, выбранную из приведенных в таблице 2.

3. Набор олигонуклеотидных зондов по п.1 или 2, где один или несколько из указанных олигонуклеотидов мечены фрагментом для обеспечения обнаружения или манипуляций.

4. Набор олигонуклеотидных зондов по п.3, где указанный фрагмент является колориметрической, хемилюминесцентной, хромогенной, радиоактивной, флуоресцентной, ферментом, фрагментом антитела, His-меткой, биотином или стрептавидином.

5. Набор олигонуклеотидных зондов по п.1, где один или несколько из указанных олигонуклеотидов иммобилизованы на одной или нескольких твердых подложках, предпочтительно выбранных из частиц, полосок, гелей, фильтров, мембран, волокон, капилляров, чипов, микротитровальных полосок, стекол, трубочек, пластинок или камер.

6. Набор олигонуклеотидных зондов по п.5, где указанная твердая подложка представляет собой магнитную частицу, предпочтительно магнитный микроноситель.

7. Набор олигонуклеотидных зондов по п.5, где указанная твердая подложка мечена красителем или множеством красителей, предпочтительно люминесцентным красителем.

8. Способ профилирования микробиоты ЖКТ индивидуума, где указанный способ включает:

(i) взаимодействие образца из ЖКТ указанного индивидуума с набором олигонуклеотидных зондов, как указано в любом из п.п.1-7;

(ii) воздействие на образец и набор зондов условиями, обеспечивающими гибридизацию зондов с их нуклеотидными последовательностями-мишенями в составе молекул нуклеиновой кислоты в указанном образце; и

(iii) для каждого олигонуклеотида в указанном наборе зондов определение количества его нуклеотидной последовательности-мишени в указанном образце.

9. Способ по п.8, где каждый олигонуклеотид несет прикрепленную к нему метку, а этап (iii) включает определение для каждого меченого олигонуклеотида количества указанной метки, связанной с указанным образцом, посредством определения силы сигнала метки, исходящего от образца.

10. Способ по п.8, где этап (iii) включает

(а) селективное мечение олигонуклеотидных зондов из набора зондов при гибридизации с их нуклеотидной последовательностью-мишенью; и

(b) определение количества каждого меченого олигонуклеотидного зонда, полученного на этапа (а).

11. Способ по п.10, где селективное мечение проводят посредством удлинения цепи олигонуклеотидного зонда меченым нуклеотидом, предпочтительно меченым дидезоксинуклеотидом.

12. Способ по п.11, где указанный меченый нуклеотид мечен ддЦТФ, предпочтительно ддЦТФ, меченным биотином.

13. Способ по п.10, где этап (b) включает гибридизацию олигонуклеотидов, полученных на этапе мечения (а), с нуклеотидными последовательностями, комплементарными олигонуклеотидным зондам.

14. Способ по п.13, где одна или несколько указанных нуклеотидных последовательностей, комплементарных олигонуклеотидным зондам, иммобилизованы на одной или нескольких твердых подложках, предпочтительно выбранных из частиц, полосок, гелей, фильтров, мембран, волокон, капилляров, чипов, микротитровальных полосок, стекол, трубочек, пластинок или камер.

15. Способ по п.14, где указанная твердая подложка представляет собой магнитную частицу, предпочтительно магнитный микроноситель.

16. Способ по п.14, где указанная твердая подложка помечена красителем или множеством красителей, предпочтительно люминесцентным красителем.

17. Способ по п.8, где этап (iii) включает

(а) проведение реакции амплификации нуклеиновой кислоты с применением праймеров; и

(b) для каждого олигонуклеотида из набора зондов определение количества продукта амплификации, полученного в ходе указанной реакции амплификации нуклеиновой кислоты с применением праймеров.

18. Способ по п.17, где указанная реакция амплификации нуклеиновой кислоты с применением праймеров представляет собой ПЦР.

19. Способ по п.17, где указанная реакция амплификации нуклеиновой кислоты с применением праймеров представляет собой множество реакций амплификации нуклеиновой кислоты с применением праймеров, которые проводят параллельно, где в каждой параллельной реакции амплификации применяют один олигонуклеотидный зонд, или одну или несколько мультиплексных реакций амплификации нуклеиновой кислоты с применением праймеров, которые проводят с применением двух или более олигонуклеотидных зондов, применяемых в одной мультиплексной реакции амплификации.

20. Способ получения стандартного профиля микробиоты ЖКТ, характерного для заболевания или состояния или их этапов или риска развития заболевания или состояния, где указанный способ включает:

(i) идентификацию индивидуума с указанным заболеванием или состоянием или их этапами или характеризующегося риском развития указанного заболевания или состояния, и

(ii) осуществление способа по любому из п.п.8-19 с применением образца из ЖКТ указанного индивидуума.

21. Способ по любому из п.п.8-20, где указанный образец из ЖКТ выбран из

(a) содержимого полости ЖКТ, предпочтительно содержимого желудка, содержимого кишечника, слизи и фекалий/кала или их сочетания,

(b) участков слизистой оболочки, подслизистой оболочки, наружного мышечного слоя, адвентициальной оболочки и/или серозной оболочки ткани/органа ЖКТ,

(c) нуклеиновой кислоты, полученной из (а) или (b), предпочтительно посредством обратной транскрипции и/или амплификации нуклеиновой кислоты.

22. Способ по любому из п.п.8-20, где указанный образец из ЖКТ получен из тонкой кишки, подвздошной кишки, слепой кишки, толстой кишки, прямой кишки или анального канала.

23. Способ диагностики или мониторинга заболевания или состояния у индивидуума или прогнозирования или оценки риска развития у индивидуума заболевания или состояния, где указанный способ включает:

(а) профилирование микробиоты ЖКТ индивидуума способом, указанным в любом из п.п.8-22;

(b1) сравнение указанного профиля со стандартным профилем микробиоты ЖКТ, характерным для заболевания или состояния или их этапов или риска развития заболевания или состояния; и/или

(b2) сравнение указанного профиля с более ранним профилем микробиоты ЖКТ индивидуума; и

(с) определение степени корреляции указанных профилей.

24. Способ диагностики или мониторинга заболевания или состояния у индивидуума или прогнозирования или оценки риска развития у индивидуума заболевания или состояния, где указанный способ включает:

(а1) сравнение результатов способа, указанного в любом из п.п.8-22, со стандартным профилем микробиоты ЖКТ, характерным для заболевания или состояния или их этапов или риска развития заболевания или состояния, и/или

(а2) сравнение результатов способа, указанного в любом из п.п.8-22, с более ранним профилем микробиоты ЖКТ индивидуума, и

(b) определение степени корреляции указанных профилей,

где степень корреляции является показателем наличия или отсутствия указанного заболевания или состояния или риска развития указанного заболевания или состояния или прогресса заболевания или состояния.

25. Способ по любому из п.п.8-20, 23 и 24, где указанное заболевание или состояние выбраны из воспалительного заболевания кишечника, болезни Крона, язвенного колита, синдрома раздраженного кишечника, злокачественных опухолей ЖКТ, предпочтительно злокачественной опухоли ротовой полости, глотки, пищевода, желудка, двенадцатиперстной кишки, тонкого кишечника, подвздошной кишки, слепой кишки, толстого кишечника, прямой кишки или анального канала, аллергических заболеваний, например, экземы, астмы, атопического дерматита, аллергического конъюнктивита, аллергического ринита и пищевых аллергий; нарушений обмена веществ, например, сахарного диабета (типа 1 и типа 2), ожирения и метаболического синдромома; нейрологических нарушений, например, депрессии, рассеянного склероза, деменции и болезни Альцгеймера; и аутизма.

26. Набор, включающий набор олигонуклеотидных зондов по п.п.1-7.

27. Набор по п.26, где указанный набор дополнительно включает, по меньшей мере, одно из следующего:

(a) средства для селективного мечения одного или нескольких олигонуклеотидов из набора зондов,

(b) твердые подложки, на которых можно иммобилизовать один или несколько олигонуклеотидов из набора зондов,

(c) средства для проведения амплификации и/или реакции удлинения праймера для одного или нескольких олигонуклеотидов из набора зондов,

(d) средства для проведения реакции обратной транскрипции,

(e) средства для получения образца из ЖКТ,

(f) средства для очистки или модификации образца из ЖКТ,

(g) средства для выделения нуклеиновой кислоты из образца из ЖКТ,

(h) средства для обнаружения амплифицированной нуклеиновой кислоты,

(i) один или несколько олигонуклеотидов, которые селективно гибридизуются с нуклеиновыми кислотами-мишенями, которые служат индикаторами любого другого заболевания или медицинского состояния, ассоциированного с желудочно-кишечной микробиотой, предпочтительно болезни Крона, воспалительного заболевания кишечника, язвенного колита и синдрома раздраженного кишечника.