ES2573133T3

ES2573133T3 - Conjunto de sondas oligonucleotídicas y métodos para realizar el perfil de microbiota

Info

Publication number: ES2573133T3
Application number: ES11804757.0T
Authority: ES
Inventors: Heidi VEBØ; Knut Rudi; Monika Sekelja
Original assignee: Genetic Analysis AS
Current assignee: Genetic Analysis AS
Priority date: 2010-12-16
Filing date: 2011-12-16
Publication date: 2016-06-06
Anticipated expiration: 2031-12-16
Also published as: US9909191B2; US20160068891A1; EP2652145B1; AU2011342983A1; PL2652145T3; RU2013132761A; CA2821884C; MX2013006669A; EP2652145A2; BR112013015082A2; GB201021399D0; US9243297B2; WO2012080754A3; WO2012080754A2; CA2821884A1; NZ612010A; US20130303397A1; ZA201304546B; AU2011342983B2; DK2652145T3

Abstract

Un conjunto de sondas oligonucleotídicas, comprendiendo dicho conjunto: (a) un oligonucleótido que consiste en (ai) una secuencia de nucleótidos seleccionada de ACGCTTGCACCCT (SEQ ID NO 1), opcionalmente con hasta tres bases sustituidas, y AGGGTGCAAGCGT (SEQ ID NO 27), opcionalmente con hasta tres bases sustituidas, y (aii) 0-5 nucleótidos además de (ai), en el que el oligonucleótido (a) es capaz de hibridar con una SEQ ID NO 27 o SEQ ID NO 1, respectivamente, en condiciones de alta rigurosidad; (b) un oligonucleótido que consiste en (bi) una secuencia de nucleótidos seleccionada de CGATCCGAAAACCTTCTTCACT (SEQ ID NO 2), opcionalmente con hasta tres bases sustituidas, y AGTGAAGAAGGTTTTCGGATCG (SEQ ID NO 28), opcionalmente con hasta tres bases sustituidas, y (bii) 0-5 nucleótidos además de (bi), en el que el oligonucleótido (b) es capaz de hibridar con una SEQ ID NO 28 o SEQ ID NO 2, respectivamente, en condiciones de alta rigurosidad; (c) un oligonucleótido que consiste en (ci) una secuencia de nucleótidos seleccionada de GGACAACGCTTGCCAC (SEQ ID NO 3), opcionalmente con hasta tres bases sustituidas, y GTGGCAAGCGTTGTCC (SEQ ID NO 29), opcionalmente con hasta tres bases sustituidas, y (cii) 0-5 nucleótidos además de (ci), en el que el oligonucleótido (c) es capaz de hibridar con una SEQ ID NO 29 o SEQ ID NO 3, respectivamente, en condiciones de alta rigurosidad; (d) un oligonucleótido que consiste en (di) una secuencia de nucleótidos seleccionada de CGTAGGCGGTTCGTCGCGT (SEQ ID NO 4), opcionalmente con hasta tres bases sustituidas, y ACGCGACGAACCGCCTACG (SEQ ID NO 30), opcionalmente con hasta tres bases sustituidas, y (dii) 0-5 nucleótidos además de (di), en el que el oligonucleótido (d) es capaz de hibridar con SEQ ID NO 30 o SEQ ID NO 4, respectivamente, en condiciones de alta rigurosidad; y (e) uno o más oligonucleótidos que consisten en (ei) una secuencia de nucleótidos seleccionada de las enumeradas como SEQ ID NO 5-8 y 31-34 en la Tabla 1, opcionalmente con hasta tres bases sustituidas, y (eii) 0-5 nucleótidos además de (ei), en el que el oligonucleótido (e) es capaz de hibridar con la secuencia de nucleótidos complementaria a SEQ ID NO 5-8 y 31-34, respectivamente, en condiciones de alta rigurosidad; y opcionalmente (f) uno o más oligonucleótidos que consisten en (fi) una secuencia de nucleótidos seleccionada de las enumeradas como SEQ ID NO 9-26 y 35-52 en la Tabla 2 y Tabla 3, opcionalmente con hasta tres bases sustituidas y (fii) 0-5 nucleótidos además de (fi), en el que el oligonucleótido (f) es capaz de hibridar con la secuencia de nucleótidos complementaria a SEQ ID NO 9-26 y 35-52, respectivamente, en condiciones de alta rigurosidad.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

imagen8

5

15

25

35

45

55

65

La cantidad de cada sonda oligonucleotídica marcada es indicativa de la cantidad de la secuencia diana para ese oligonucleótido marcado en dicha muestra.

En algunas realizaciones, la etapa (iv) comprende hibridación de las sondas oligonucleotídicas de la etapa de marcaje con secuencias de nucleótidos complementarias de esos oligonucleótidos.

En una realización adicional la cantidad de cada secuencia de nucleótidos diana presente en la muestra se determina por marcaje de los ácidos nucleicos en la muestra antes de la etapa de poner en contacto la muestra con el conjunto de sondas oligonucleotídicas de la invención. Simplemente evaluando la cantidad de hibridación de ácido nucleico marcado con las sondas del conjunto de sondas puede determinarse la cantidad de la secuencia de nucleótidos diana para cada sonda oligonucleotídica que está presente en dicha muestra. En estas realizaciones se marca ARNr 16S o ADNr 16S bacteriano, particularmente las regiones que contienen las secuencias diana para los oligonucleótidos del conjunto de sondas, o ácidos nucleicos que comprenden dichas secuencias antes del contacto con el conjunto de sondas. Se han analizado anteriormente marcadores adecuados. Convenientemente el marcaje se produce cuando los ácidos nucleicos en la muestra se amplifican y/o transcriben de forma inversa antes del contacto con el conjunto de sondas como se analiza en más detalle posteriormente. Convenientemente, los ácidos nucleicos se marcan por incorporación de nucleótidos marcados durante una reacción de amplificación de ácido nucleico y/o una reacción de transcripción inversa.

En realizaciones adicionales tanto los oligonucleótidos del conjunto de sondas como los ácidos nucleicos en la muestra como se ha descrito anteriormente se marcan con restos que proporcionan una señal solamente cuando están en proximidad estrecha, por ejemplo cuando las sondas se hibridan con sus secuencias diana en el ácido nucleico.

En otra realización la cantidad de cada secuencia de nucleótidos diana presente en la muestra se determina usando los oligonucleótidos del conjunto de sondas de la invención como cebadores en una o más reacciones de amplificación de ácido nucleico, por ejemplo una reacción de amplificación múltiple. Si se seleccionan las condiciones apropiadas, dicha reacción puede realizarse de modo que la cantidad de producto de amplificación obtenido para cada oligonucleótido del conjunto de sondas sea proporcional a la cantidad de cada secuencia de nucleótidos diana presente en la muestra. Por lo tanto, la cantidad de producto que la reacción de amplificación proporciona para cada oligonucleótido del conjunto de sondas es una medida de la cantidad de ese oligonucleótido que hibrida con la muestra del sujeto que se investiga y es a su vez proporcional a la cantidad de secuencia diana para ese oligonucleótido en la muestra y por tanto es proporcional a la cantidad de bacterias a las que se ha diseñado que se dirija el oligonucleótido en la muestra. En consecuencia, la cantidad de producto de amplificación puede usarse para determinar los niveles de estas bacterias en el tracto GI de un sujeto.

Como se ha mencionado anteriormente, dependiendo de las condiciones empleadas, esta puede ser una medición parcialmente, semi o completamente cuantitativa, pero también puede ser una medida cualitativa (o relativa) en la que los resultados para cada secuencia diana se comparan sencillamente entre sí sin fijarse valores numéricos.

Puede conseguirse amplificación por cualquier reacción de amplificación de ácido nucleico dependiente de cebador conveniente. Más convenientemente se usará la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), aunque el experto en la materia conocería otras técnicas. Por ejemplo, puede usarse LAR/LCR, SDA, amplificación isotérmica mediada por bucle y amplificación basada en secuencias de ácido nucleico (NASBA)/3SR (replicación de secuencia autosostenible).

Se han desarrollado muchas variaciones de PCR, por ejemplo PCR en tiempo real (también conocida como PCR cuantitativa, qPCR), PCR de arranque en caliente, PCR competitiva, y así sucesivamente, y todas estas pueden emplearse según sea apropiado para las necesidades del experto.

En una realización básica de la invención usando una amplificación basada en PCR los oligonucleótidos del conjunto de sondas de la invención se ponen en contacto con una mezcla de reacción que contiene la muestra, un conjunto adecuado de segundos cebadores para formar un conjunto de pares de cebadores de trabajo y nucleótidos libres en un tampón adecuado en condiciones que permiten la hibridación. La termociclación de la mezcla resultante en presencia de una ADN polimerasa da como resultado amplificación de las secuencias diana para cada oligonucleótido, es decir secuencias características de las bacterias a las que se ha diseñado que se dirijan los oligonucleótidos del conjunto de sondas de la invención.

El rendimiento óptimo del proceso de PCR está influido por la elección de temperatura, el tiempo a esa temperatura, y la longitud del tiempo entre temperaturas para cada etapa en el ciclo. Un perfil de ciclación típico para amplificación por PCR es (a) 15 minutos de fusión de ADN a 95 °C; (b) 30 segundos de hibridación de cebadores a 50-65 °C; (c) 90 segundos de extensión de cebadores a 68-72 °C; (d) 30 segundos fusión de ADN a 95 °C; y las etapas (b)-(d) se repiten tantas veces como sea necesario para obtener el nivel deseado de amplificación.

Se han desarrollado modificaciones del método de PCR básico tal como qPCR (PCR en tiempo real) que pueden proporcionar información cuantitativa sobre el molde que se amplifica. Se han elaborado varios enfoques aunque las

imagen9

imagen10

imagen11

5

15

25

35

45

55

65

La secuencia de nucleótidos diana para amplificar en esta realización está presente por lo tanto en ARNr de 16S y el gen de ARNr 16S correspondiente (ADNr). Por lo tanto, la referencia a la amplificación de esta secuencia de nucleótidos diana es una referencia a un aumento del número de ácidos nucleicos que contienen esa secuencia de nucleótidos sin limitación en el tipo de ácidos nucleicos que contiene la secuencia de nucleótidos. Preferentemente estos ácidos nucleicos estarán marcados. Típicamente, el ácido nucleico que se forma como el producto de amplificación es ADN, aunque la secuencia de nucleótidos contenida en ese ácido nucleico aún será la misma que la de la secuencia de nucleótidos diana, o el complemento de la misma.

Convenientemente, esta realización de la invención se realizará con ADNr 16S, por ejemplo un gen de ARNr 16S, como el molde.

En otras realizaciones ARNr 16S puede ser la fuente de la secuencia de nucleótidos diana para amplificar. Cuando una secuencia de nucleótidos diana de ARNr 16S se amplifica en esta realización del método de la invención habrá una etapa en la que una ADN polimerasa dependiente de ARN cataliza la formación de una molécula de ADN complementaria del molde de ARNr 16S (ADNc). Este proceso se denomina “transcripción inversa”. Más específicamente la ADN polimerasa dependiente de ARN cataliza la polimerización de desoxirribonucleósido trifosfatos en una secuencia que es complementaria (es decir siguiendo las reglas de formación de pares de bases de Watson-Crick) de una secuencia de ARNr de molde con cebador.

Se han identificado numerosas enzimas que tienen la capacidad de catalizar esta reacción y los ejemplos incluyen, pero sin limitación transcriptasa inversa de VIH, transcriptasa inversa de AMV, transcriptasa inversa de M-MLV, polimerasa de C. therm. y polimerasa Tth. En su nivel más básico una mezcla de reacción de transcripción inversa completa contendrá una enzima de transcripción inversa, el molde de ARNr, cebadores adecuados que pueden unirse con el molde y a partir de los que la transcriptasa inversa puede comenzar la polimerización, dNTP y un tampón adecuado. La incubación de la mezcla a la temperatura de trabajo de la transcriptasa inversa da como resultado producción de ADNc.

Tras completar la reacción de transcripción inversa el ADNc puede usarse como el molde en la realización del método de la invención descrito anteriormente. El ADNc por lo tanto tiene una secuencia de nucleótidos que es complementaria de la molécula de ARNr que era su molde. Además el ADNc tiene una secuencia de nucleótidos que es igual que una secuencia de nucleótidos contenida en una cadena del gen del molde de ARNr y el ADNc es complementario con una secuencia de nucleótidos contenida en la otra cadena del gen del molde de ARNr.

Como se ha mencionado anteriormente, en realizaciones del método de la invención en las que se amplifica ácido nucleico en una etapa precedente, si se usa ARNr 16S como la fuente de la secuencia de nucleótidos diana (a diferencia de ADNr 16S, por ejemplo un gen de ARNr 16S) se requiere una etapa de transcripción inversa inicial. Las reacciones de amplificación ligadas a transcripción inversa, en particular PCR, pueden ser procesos de “una etapa”

o “dos etapas”. En un proceso de una etapa los componentes de la reacción de transcripción inversa y la reacción de amplificación de ácido nucleico están presentes en un único recipiente de reacción y típicamente las condiciones de reacción temprana se seleccionan para permitir que la reacción de transcripción inversa continúe hasta completarse y las condiciones de reacción se cambian después a condiciones adecuadas para permitir que continúe la reacción de amplificación de ácido nucleico.

En un proceso de dos etapas los componentes de la reacción de transcripción inversa se combinan en primer lugar y se realiza la reacción de transcripción inversa. El producto de transcripción inversa se combina después con los componentes de la reacción de amplificación y se somete a la reacción de amplificación. En un protocolo de dos etapas “en un tubo” los componentes de la reacción de amplificación se añaden al mismo recipiente de reacción en el que se realizó la reacción de transcripción inversa. En un protocolo de dos etapas en “dos tubos” la reacción de amplificación se realiza en un recipiente de reacción nuevo.

Se cree que muchas enfermedades y afecciones, o estadios de las mismas, están ligadas a perfiles característicos de la microbiota del tracto GI o la microbiota de las regiones/partes del mismo, por ejemplo los descritos anteriormente. En algunos casos la enfermedad o afección puede estar provocada por, o empeora por, perturbaciones en el perfil de la microbiota del tracto GI o de regiones/partes del mismo. En otros casos la enfermedad o afección provoca, o por algún mecanismo da como resultado, la presentación de un perfil particular de la microbiota del tracto GI o regiones/partes del mismo. En consecuencia, analizando perfiles de microbiota en muestras del tracto GI, puede proporcionarse información que permite el diagnostico de una enfermedad o afección,

o que permite una evaluación del riesgo de desarrollar una enfermedad o afección, que se ha determinado que se caracteriza por un perfil de microbiota particular. El conjunto de sondas de la invención puede usarse por lo tanto para preparar perfiles de microbiota convencionales del tracto GI que son característicos de una enfermedad o afección, o estadio de la misma, o el riesgo de desarrollar una enfermedad o afección. El perfil también puede usarse en pronóstico de enfermedad y la supervisión de enfermedad.

Por lo tanto en otro aspecto la invención proporciona un método para preparar un perfil de microbiota convencional del tracto GI que es característico de una enfermedad o afección o un estadio de la misma o el riesgo de desarrollar una enfermedad o afección, comprendiendo dicho método:

5

15

25

35

45

55

65

(i): identificar un sujeto con dicha enfermedad o afección o estadio de la misma o que está en riesgo de desarrollar dicha enfermedad o afección y poner en contacto una muestra del tracto GI de dicho sujeto con un conjunto de sondas oligonucleotídicas como se define en las reivindicaciones 1-7;

(ii): someter la muestra y el conjunto de sondas a condiciones que permiten la hibridación de las sondas con sus secuencias de nucleótidos diana dentro de moléculas de ácido nucleico en dicha muestra; y

(iii) para cada oligonucleótido en dicho conjunto de sondas, determinar la cantidad de su secuencia de nucleótidos diana que está presente en dicha muestra.

Un perfil de la microbiota del tracto GI del sujeto se genera por lo tanto a partir de las cantidades de la secuencia diana para cada oligonucleótido presente en dicha muestra y el perfil es característico de dicha enfermedad o afección (o estadio de la misma) o el riesgo de desarrollar dicha enfermedad o afección.

Una vez que se ha obtenido un perfil convencional para una enfermedad o afección particular o riesgo de desarrollarla, típicamente después de la realización del perfil de una pluralidad de muestras de una pluralidad de sujetos con la misma enfermedad o afección o estadio de la misma, este perfil puede usarse como la base de un proceso de diagnóstico para determinar si un sujeto adicional padece, o está en riesgo de desarrollar, dicha enfermedad o afección, o para determinar el progreso o alcance de la aparición de dicha enfermedad o afección para fines de pronóstico. El perfil convencional puede proporcionarse digitalmente, por ejemplo en medio digital o mediante transferencia electrónica al usuario. En otras realizaciones puede establecerse un sistema en el que el perfil obtenido del sujeto que se ensaya contribuye al desarrollo del perfil convencional.

En un aspecto adicional la invención proporciona un método para diagnosticar o supervisar una enfermedad o afección en un sujeto o predecir o evaluar el riesgo de un sujeto de desarrollar una enfermedad o afección, comprendiendo dicho método:

(a): realizar el perfil de la microbiota del tracto GI de un sujeto con un método como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 17 (b1) comparar dicho perfil con un perfil de microbiota convencional del tracto GI que es característico de una enfermedad o afección o un estadio de la misma o el riesgo de desarrollar una enfermedad o afección y/o (b2) comparar dicho perfil con un perfil de microbiota anterior del tracto GI del sujeto; y

(c): determinar el grado de correlación entre dichos perfiles.

En esta realización dicho grado de correlación es indicativo de la presencia o ausencia de dicha enfermedad o afección, o el riesgo de desarrollar dicha enfermedad o afección, o el progreso de la enfermedad o afección.

En un aspecto adicional la invención también proporciona un método para diagnosticar o supervisar una enfermedad

: o afección en un sujeto o predecir o evaluar el riesgo de un sujeto de desarrollar una enfermedad o afección, comprendiendo dicho método:

(a): comparar los resultados de un método como se describe en una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 17 con un perfil de microbiota convencional del tracto GI que es característico de una enfermedad o afección o un estadio de las misma o el riesgo de desarrollar una enfermedad o afección y/o (a2) comparar los resultados de un método como se ha descrito anteriormente con un perfil de microbiota anterior del tracto GI del sujeto, y

(b): determinar el grado de correlación entre dichos perfiles,

en el que el grado de correlación es indicativo de la presencia o ausencia de dicha enfermedad o afección, o el riesgo de desarrollar dicha enfermedad o afección, o el progreso de la enfermedad o afección.

Preferentemente el perfil con el que se compara el perfil del sujeto que se ensaya será un perfil preparado de acuerdo con la invención. Este puede ser un perfil preparado previamente, o podría ser un perfil preparado al mismo tiempo o sustancialmente al mismo tiempo que se analiza la muestra que se investiga.

"Diagnóstico” se refiere a la determinación de la presencia o existencia de una enfermedad o afección o estadio de la misma en un organismo. “Supervisión” se refiere al establecimiento del alcance de, o posibles cambios en, una enfermedad o afección, particularmente cuando se sabe que un individuo padece una enfermedad o afección, por ejemplo supervisar los efectos del tratamiento o el desarrollo de una enfermedad o afección, por ejemplo determinar la idoneidad de un tratamiento, proporcionar un pronóstico y/o determinar si un paciente está en remisión o recaída.

"Evaluar el riesgo de un sujeto de desarrollar una enfermedad o afección" se refiere a la determinación de la probabilidad o verosimilitud de que el sujeto desarrolle la enfermedad o afección. Esto puede expresarse como una probabilidad numérica en algunas realizaciones. La evaluación del riesgo puede ser en virtud del grado en que se ve una correlación entre el perfil de una muestra de un sujeto que se investiga y el perfil de una enfermedad o afección,

o la correlación entre el perfil de una muestra de un sujeto que se investiga y el perfil que se considera característico de una muestra de un sujeto determinado como con un nivel particular de riesgo de desarrollar una enfermedad o afección.

imagen12

imagen13

Tabla 1

Secuencia de sonda: SEQ ID NO Bacterias diana (descripción general)

TTGCGGCTCAACCGTAAAATTG: SEQ ID NO 5 Bacteroides

CAATTTTACGGTTGAGCCGCAA: SEO ID NO 31 Bacteroides

GCACTCAAGACATCCAGTATCAACTG: SEO ID NO 6 Bacteroides (dorei, fragilis, thetaiotaomicron, vulgatus)

CAGTTGATACTGGATGTCTTGAGTGC: SEQ ID NO 32 Bacteroides (dorei, fragilis, thetaiotaomicron, vulgatus)

AGGGCAGTCATCCTTCACG: SEQ ID NO 7 Bacteroides (dorei, fragilis, thetaiotaomicron, vulgatus)

CGTGAAGGATGACTGCCCT: SEQ ID NO 33 Bacteroides (dorei, fragilis, thetaiotaomicron, vulgatus)

CAATCGGAGTTCTTCGTGATATCTAAG: SEQ ID NO 8 Bacteroides

CTTAGATATCACGAAGAACTCCGATTG: SEO ID NO 34 Bacteroides

Tabla 2 5

Secuencia de sonda: SEQ ID NO Bacterias diana (descripción general)

TGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAATTGA: SEQ ID NO 9 Salmonella, Enterobacter, Citrobacter, Cronobacter

TCAATTGCTGCGGTTATTAACCACAACA: SEQ ID NO 35 Salmonella, Enterobacter, Citrobacter, Cronobacter

TCCAATGACCCTCCC: SEQ ID NO 10 Enterococcus, Listeria

GGGAGGGTCATTGGA: SEQ ID NO 36 Enterococcus, Listeria

CACTCTCACACCCGTT: SEQ ID NO 11 Streptococcus sanguinis

AACGGGTGTGAGAGTG: SEQ ID NO 37 Streptococcus sanguinis

GTTGCTCGGTCAGACTT: SEQ ID NO 12 Streptococcus, Enterococcus

AAGTCTGACCGAGCAAC: SEQ ID NO 38 Streptococcus, Enterococcus

CGTGGCTTTCTGATTAGGTA: SEQ ID NO 13 Staphylococcus

TACCTAATCAGAAAGCCACG: SEQ ID NO 39 Staphylococcus

TGCTTATTCAACGGGTAAACT: SEQ ID NO 14 Bifidobacterium longum

AGTTTACCCGTTGAATAAGCA: SEQ ID NO 40 Bifidobacterium longum

CCGTCACTCGGCTACCATTTC: SEQ ID NO 15 Clostridium ramosum

GAAATGGTAGCCGAGTGACGG: SEQ ID NO 41 Clostridium ramosum

GATTTTCCACTCCCACCAT: SEQ ID NO 16 Streptococcus pyogenes

ATGGTGGGAGTGGAAAATC: SEQ ID NO 42 Streptococcus pyogenes

CCGTCAAGGGACAAG: SEQ ID NO 17 Listeria monocytogenes

CTTGTCCCTTGACGG: SEQ ID NO 43 Listeria monocytogenes

CGGTGCTTATTCGAAAGGTACACT: SEQ ID NO 18 Bifidobacterium breve

AGTGTACCTTTCGAATAAGCACCG: SEQ ID NO 44 Bifidobacterium breve

10

15

20

25

30

35

Tabla 3

Secuencia de sonda: SEQ ID NO Bacteria diana (descripción general)

CGCCTGCCTCAAACATA: SEQ ID NO 19 Parabacteroides

TATGTTTGAGGCAGGCG: SEQ ID NO 45 Parabacteroides

CAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGAT: SEQ ID NO 20 Gamma-proteobacteria

ATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTG: SEQ ID NO 46 Gamma-proteobacteria

ACGCTCGCACC: SEQ ID NO 21 Haemophilus

GGTGCGAGCGT: SEQ ID NO 47 Haemophilus

CGGGGATTTCACATCTGA: SEQ ID NO 22 Subgrupo de Gamma-proteobacteria

TCAGATGTGAAATCCCCG: SEQ ID NO 48 Subgrupo de Gamma-proteobacteria

TGCCAGTTTCGAATGCAGTT: SEQ ID NO 23 Subgrupo de Gamma-proteobacteria

AACTGCATTCGAAACTGGCA: SEQ ID NO 49 Subgrupo de Gamma-proteobacteria

GTGCTTCTTCTGCGGGTAA: SEQ ID NO 24 Subgrupo de Gamma-proteobacteria

TTACCCGCAGAAGAAGCAC: SEQ ID NO 50 Subgrupo de Gamma-proteobacteria

GCTACACATGGAGTTCCA: SEQ ID NO 25 Subgrupo de Lactobacillus

TGGAACTCCATGTGTAGC: SEQ ID NO 51 Subgrupo de Lactobacillus

CGTAGTTAGCCGTGG: SEQ ID NO 26 Clostridium neonatale

CCACGGCTAACTACG: SEQ ID NO 52 Clostridium neonatale

Ejemplo 1

El objetivo del presente trabajo fue comparar de forma prospectiva el desarrollo de la microbiota dominante en niños sensibilizados y niños no sensibilizados a IgE durante los primeros dos años de vida. Para conseguir esto y otras tareas relacionadas con la microbiota del intestino, era necesaria una herramienta para explorar rápidamente la complejidad y composición de la bacteria en muestras de heces. Se desarrolló por lo tanto una micromatriz de gen de ARNr 16S de alto rendimiento de lactante, denominado ensayo de lactantes de GA-map. Los análisis de micromatrices se realizaron en un subconjunto seleccionado de la cohorte de IM-PACT. Se seleccionó IgE específico como un marcador de atopia, ya que se mostrado previamente que este marcador está correlacionado con las bacterias del intestino (resultados no publicados).

La diferencia principal entre la matriz de lactantes de GA-map y enfoques de matriz de gen de ARNr 16S alternativos es el uso de sondas de extensión de cebadores de un único nucleótido (SNuPE) altamente específicas para diferenciación de diana/no diana. La alta especificidad del ensayo de SNuPE se obtiene por incorporación basada en ADN polimerasa de un didesoxinucleótido marcado con fluorescencia. Las sondas de SNuPE se construyen de modo que las sondas hibriden adyacentes a posiciones génicas diferenciadoras. Para reducir la complejidad y para aumentar el rendimiento, el ensayo de lactantes de GA-map se dirigió a bacterias que se esperaba que colonizaran el intestino del lactante. Las sondas se seleccionaron basándose en el criterio del número mínimo de sondas que abarcan la diversidad esperada de bacterias en el intestino del lactante.

Materiales y métodos

Cohorte

El Estudio de Prevención de la Alergia Entre Niños en Trondheim (PACT) es un estudio de intervención basado en población grande en Noruega centrado en la alergia infantil. Las muestras incluidas aquí son un subconjunto del estudio de PACT, en el que se tomaron medidas de inmunología y microbiología. Para la familia de subestudio participaron doctores y matronas en Trondheim en el reclutamiento de una población no seleccionada de mujeres durante comprobaciones de embarazo temprano ordinarias hasta que se habían aprobado 720 para su participación. Las mujeres rellenaron cuestionarios sobre factores de riesgo durante el embarazo, a las seis semanas después del parto, al año y a los dos años después de dar a luz. Las preguntas fueron sobre alergia en la familia, condiciones de alojamiento, dieta y estilo de vida, y después del nacimiento sobre lactancia, complementos alimentarios, dieta, infecciones, vacunas, antibióticos, estancias en guarderías y exposición a nicotina. Cuando los lactantes cumplieron dos años, se presentó otro cuestionario sobre salud y enfermedad. Se evaluó la sensibilización atópica como IgE específico elevado (> 0,35 kU/ml) en suero usando un ensayo para una serie de alérgenos (sistema de IgE

5

10

15

20

25

30

35

40

específico de alérgenos Immulite 2000, Siemens Medical Solutions Diagnostics). La cohorte se analizó inicialmente con respecto a doce bacterias específicas por PCR cuantitativa (resultados no publicados). Aquí, se seleccionó una serie de lactantes para ensayos de matriz de lactante de GA-map en profundidad en varias muestras, y estado de sensibilización. Se seleccionó un total de 16 niños sensibilizados y 31 no sensibilizados, que representan un total de 216 muestras fecales.

Preparación de muestras y amplificación por PCR

Se recogieron heces del pañal y se transfirieron a un medio de transporte Carry Blair por los padres, se almacenó inmediatamente a -18 °C en casa antes de transportarse a almacenamiento permanente a -80 °C hasta su análisis posterior. Se usó lisis mecánica para rotura celular, y se usó un método basado en perlas magnéticas automáticas para purificación de ADN.

Se combinó el uso de un cebador directo que se dirigía a la región conservada entre V2 y V3 (Nadkarni et al., 2002. Microbiology 148, 257-266) con un cebador inverso que se dirigía al extremo 3’ del gen de ARNr 16S (Weisburg et al., 1991, J Bacteriol 173, 697-703). Se usaron 1,5 U de HotFirePol (Solis Biodyne, Tartu, Estonia), tampón B2 1 x (Solis Biodyne), MgCl2 2,5 mM (Solis Biodyne), dNTP 200 µM (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Estados Unidos), 0,2 µM de cada cebador directo e inverso y aproximadamente 10 a 50 ng de molde en un volumen total de 25 µl. Se amplificó una de las muestras tres veces para examinar la reproducibilidad de la reacción de PCR (descrita en más detalle en la sección de electroforesis capilar). El protocolo de la amplificación incluyó un estadio de activación de 15 min a 95 °C, seguido de 30 ciclos con 30 s de desnaturalización a 95 °C, 30 s de hibridación a 55 °C y 90 s de extensión a 72 °C. Se incluyó una elongación final durante 7 min a 72 °C para completar todos los productos de PCR.

Para los ensayos iniciales de la matriz, se realizó PRC de gen de ARNr 16S en ADN bacteriano a partir de cultivos puros de 26 cepas enumeradas en la Tabla 4, y los productos de PCR se ensayaron en el ensayo de lactantes de GA-map corriente abajo. Las cepas se secuenciaron para confirmar su identidad y posibles mutaciones (se enumeran números de referencia de secuencia en la Tabla 4). Se incluyó un control positivo que consistía en una mezcla de ADN de cultivos puros de 8 cepas bacterianas relevantes así como un control negativo que consiste en H2O durante la reacción de PCR de gen de ARNr 16S y el ensayo de lactantes de GA-map corriente abajo. Los controles positivos se usaron como un control de calidad de la reacción de marcaje e hibridación de las matrices (resultados no mostrados)

Diseño del ensayo de lactante de GA-map

El ensayo de GA-map se basa en el principio de extensión de un único nucleótido (SNupE) en combinación con hibridación de micromatriz (Rudi et al., 1998, Appl Environ Microbiol 64, 2639-2643).

Las cepas bacterianas mostradas en la Tabla 4 se usaron para validación de sondas. Para la construcción de sondas se usó un conjunto de datos combinado que consistía en un total de 3580 secuencias génicas de ARNr 16S (Palmer et al., 2007, PLoS Biology 5, e177; Rudi et al., 2007, Appl Environ Microbiol 73, 2727-2734), además de un conjunto de patógenos conocidos.

Tabla 4. Cepas bacterianas usadas para evaluación de sondas

Clase: Especies Cepa N.º de referencia

Actinobacteria: Bifidobacterium breve DSM20213 HQ012023

Bifidobacterium longum subsp. infantis: DSM20088 HQ012021

Bifidobacterium longum subsp. longum: DSM20219 HQ012022

Bacteroidetes: Bacteroides dorei DSM17855 HQ012025

Bacteroides fragilis: DSM2151 HQ012027

Bacteroides thetaiotaomicron: DSM2079 HQ012026

Bacteroides vulgatus: DSM1447 HQ012024

Parabacteroides distasonis: DSM 20701 N/D

Firmicutes: Clostridium periringens DSM756 HQ012013

Clostridium ramosum: DSM1402 HQ012012

Enterococcus faecalis: DSM20478 HQ012029

Enterococcus faecium: DSM20477 HQ012007

Clase: Especies Cepa N.º de referencia

Lactobacillus acidophilus: DSM20079 HQ012028

Lactobacillus rhamnosus: DSM20021 HQ012008

Listeria monocytogenes: DSM20600 HQ012006

Staphylococcus aureus subsp. aureus: DSM20231 HQ012011

Streptococcus pneumoniae: DSM20566 HQ012009

Streptococcus pyogenes: DSM20565 HQ012030

Streptococcus sanguinis: DSM20567 HQ012010

Veillonella atípica: DSM20739 HQ012015

Veillonella dispar: DSM20735 HQ012014

Proteobacteria: Escherichia coli DSM30083 HQ012019

Haemophilus parainfluenzae: DSM8978 HQ012020

Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae: DSM30104 HQ012018

Salmonella bongori: DSM13772 HQ012016

Salmonella enterica subsp. enterica: DSM17058 HQ012017

Se usó un proceso de cuatro etapas en el diseño de las sondas. 1) En primer lugar, se definió un conjunto de grupos diana y no diana basándose en un sistema de clasificación de coordenadas. 2) La segunda etapa fue identificar sondas que satisfagan los criterios de detección de diana y exclusión no de diana. Esto se basó en un criterio 5 combinado de hibridación y marcaje. Todas las sondas se diseñaron con Tm mínima de 60 °C para el grupo diana, mientras que el no diana debería tener una Tm de < 30 °C, o la ausencia de una citosina como el nucleótido adyacente al extremo 3’ de la sonda. Se identificaron todas las sondas que satisfacían los criterios. 3) Después se evaluaron las sondas de automarcaje o marcaje cruzado potenciales, además del potencial para hibridación cruzada en la matriz. 4) Finalmente, combinando el conocimiento acerca de grupos diana/no diana y la compatibilidad para

10 cada una de las sondas se diseñaron matrices finales usando un enfoque jerárquico.

Se incluyó una sonda génica de ARNr 16S universal (UNI01) en los conjuntos de sondas para medir la abundancia total de ADN bacteriano en la muestra. Se añadió una sonda adicional en la etapa de hibridación: una mezcla 1:4 de sonda de control de hibridación premarcada y no marcada (HYC01). Se usa HYC01 para medir la eficacia de la 15 etapa de hibridación en el portaobjetos y para normalizar las señales de sonda entre portaobjetos. Las micromatrices usadas en el ensayo de lactantes de GA-map se produjeron por Arraylt (Arraylt, Sunnyvale, Estados Unidos). Un portaobjetos de vidrio contiene 24 micromatrices idénticas separadas, y las sondas (complementarias de las sondas enumeradas en la Tabla 5) se aplicaron puntualmente por triplicado en cada matriz. Además, las matrices también incluían dos sondas de control sin unión (NBC01, NBC02) (Sanguin et al., 2006, Environmental Microbiology 8, 289

20 307).

imagen14

imagen15

imagen16

5

15

25

35

45

55

65

Terminator v1.1 (Applied Biosystems). Se usaron 0,32 µM de los mismos cebadores directos e inversos usados para la PCR de ARNr 16S descrita anteriormente en dos reacciones de secuenciación separadas. Se usó el kit de purificación BigDye XTerminator® (Applied Biosystems. Warrington, Reino Unido) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante para limpiar las reacciones de secuenciación. Las muestras se analizaron en una matriz capilar 3130xl de 36 cm (Applied Biosystems) en el secuenciador ABI Genetic Analyzer 3130xl (Applied Biosystems), que contenía el polímero de rendimiento optimizado 7 (POP-7, Applied Biosystems). El tiempo de inyección fue de 3 s y las condiciones fueron: tiempo de procesamiento 2780 s a 8.500 V, corriente de procesamiento 5,0 µA y temperatura de procesamiento de 60 °C. Se determinaron las bases de las secuencias por el software explorador de secuencias v1.0 (Applied Biosystems). Las secuencias se han depositado en GenBank y los números de referencia respectivos de las cepas se enumeran en la Tabla 4.

Preprocesamiento y análisis de datos

Las señales de sonda se corrigieron con respecto a variaciones de hibridación no deseadas que se observan entre portaobjetos. En cada experimento, se añade una sonda que ya está marcada (HYC01) a la mezcla de sondas para evaluar la etapa de hibridación. Para corregir con respecto a hibridación variante entre portaobjetos, se dividieron todas las señales de muestra en la señal promedio de todas las réplicas de esta sonda. Además, se retiró la señal de fondo de cada sonda individual restando las señales promedio de una muestra de control negativo incluida en todos los portaobjetos usados en este experimento.

Se construyó un árbol de unión de vecinos de las 26 cepas bacterianas para evaluar las sondas usando el programa Mega 4 y su fiabilidad se infirió usando bootstrapping.

Análisis estadísticos

La especificidad de sonda se evaluó comparando los valores diana / no diana teóricos con los resultados experimentales en cepas individuales, usando un valor de umbral de señal de fondo determinado de forma empírica de 50.

Los datos de micromatrices habitualmente contienen valores tanto de umbral como de saturación y por lo tanto se distribuyen de forma normal muy pocas veces. Por lo tanto, para ensayar la significación de datos de micromatrices, es habitual usar enfoques basados en permutación en lugar de ensayos estadísticos convencionales tales como ANOVA y ensayos de t (que requieren distribución normal). El ensayo de permutación es un ensayo estadístico exacto, incluso para datos con una estructura de distribución compleja. Por lo tanto, los p valores para diferencias de grupo dentro de cada categoría de edad se calcularon por ensayo de permutación (Langsrud, 2002, Journal Of The Royal Statistical Society Series D 51,305-317) usando 50 como el valor umbral de fondo.

Resultados

Construcción y evaluación de sondas

Se construyó un conjunto de 88 sondas basándose en los criterios descritos en Materiales y Métodos. Seis sondas para los filos principales abarcaron 88 % de los clones en el conjunto de datos de los inventores. Las evaluaciones de sondas individuales usando electroforesis de gel capilar y las cepas en la Tabla 4 como moldes mostraron que el 76 % de las sondas satisfacían el criterio de detección de diana, lo que indica una tasa de éxito relativamente alta. Basándose en estos resultados y un conjunto de criterios bioinformáticos se identificaron 10 conjuntos de sondas. Cada conjunto de sondas consistía en 25 sondas que se seleccionaron basándose en su compatibilidad informática entre sí. Las estimaciones de compatibilidad se basaron en cálculos de la temperatura de fusión y termodinámica de la sonda, autohibridación, hibridación con otras sondas en el conjunto de sondas o sus bacterias diana. La validación experimental por electroforesis de gel capilar mostró que el conjunto de sondas 3 proporcionó la reacción cruzada más baja, como se determina marcando sin molde (resultados no mostrados). Este conjunto de sondas se seleccionó por lo tanto para construcción de matrices (Tabla 5).

Especificidad, reproducibilidad e intervalo cuantitativo de la matriz de lactantes de GA-map

La primera evaluación de la matriz fue en cepas puras. La evaluación se basó en la comparación por ordenador de determinadas dianas / no dianas con la de señales experimentales. Este análisis mostró buena concordancia entre las especificidades de sonda teóricas y experimentales. Usando un valor de punto de corte de señal de 50 ufr se descubrió que no hubo falsos negativos, mientras que el número de falsos positivos era más bien variable (Tabla 5).

La siguiente etapa en la evaluación fue determinar la precisión de clasificación de muestras mixtas. Esto se realizó analizando un conjunto de mezclas definidas. La evolución de estos datos mostró que la mayoría de las sondas identificaban con precisión sus bacterias diana. Aquí, se usó una señal de umbral de 50. En total, hubo 96,5 % de correctos con 9,0 % de falsos positivos y 1,6 % de falsos negativos. El intervalo cuantitativo de las sondas seleccionadas se evaluó posteriormente por diluciones de molde. En general, estos análisis mostraron que hubo una saturación de la señal de sonda cuando la concentración diana fue > 10 % en relación con el producto de PCR no

imagen17

Claims

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4