BR112013015082A2

BR112013015082A2 - conjunto de sonda de oligonucleotídeo e métodos de traçar o perfil de microbiota

Info

Publication number: BR112013015082A2
Application number: BR112013015082A
Authority: BR
Inventors: Vebo Heidi; Rudi Knut; Sekelja Monika
Original assignee: Genetic Analysis As
Priority date: 2010-12-16
Filing date: 2011-12-16
Publication date: 2019-09-17
Also published as: US9909191B2; US20160068891A1; EP2652145B1; AU2011342983A1; PL2652145T3; RU2013132761A; CA2821884C; ES2573133T3; MX2013006669A; EP2652145A2; GB201021399D0; US9243297B2; WO2012080754A3; WO2012080754A2; CA2821884A1; NZ612010A; US20130303397A1; ZA201304546B; AU2011342983B2; DK2652145T3

Abstract

conjunto de sonda de oligonucleotídeo e métodos de traçar o perfil de microbiota. a presente invenção proporciona um conjunto de sonda de oligonucleotídeo, o referido conjunto compreende: (a) um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de nu cleotídeo selecionada a partir de seq id no 1, seq id no 27 ou uma sequência capaz de hibridização em qualquer sequência sob condições de alto rigor; (b) um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de seq id no 2, seq id no 28 ou uma sequência capaz de hibridização em qualquer sequência sob condições de alto rigor; (c) um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de seq id no 3, seq id no 29 ou uma sequência capaz de hibridização em qualquer sequência sob condições de alto rigor; (d) um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de seq id no 4, seq id no 30 ou uma sequência capaz de hibridização em qualquer sequência sob condições de alto rigor; e (e) um ou mais oligonucleotídeos compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das mencionadas na tabela 1 ou uma sequência capaz de hibridização em qualquer sequência de nucleotídeo mencionada na tabela 1 sob condições de alto rigor; e opcional mente (f) um ou mais oligonucleotídeos compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das mencionadas na tabela 2 e tabela 3 ou uma sequência capaz de hibridização em qualquer sequência de nucleotídeo mencionada na tabela 2 e tabela 3 sob condições de alto rigor. métodos de traçar o perfil do microbiota do trato gl de um indivíduo e métodos de diagnóstico ou monitoramento de uma doença ou condição em um indivíduo ou prever ou avaliar o risco de um indivíduo desenvolver uma doença ou condição na qual o c;onjunto de sonda de oligonucleotídeo da presente invenção é usado são também proporcionados. kits compreendendo o conjunto de sonda de oligonucleotídeo da presente invenção são também proporcionados .

Description

“CONJUNTO DE SONDA DE OLIGONUCLEOTÍDEO E MÉTODOS DE TRAÇAR Ο

PERFIL DE MICROBIOTA”

A presente invenção se refere a conjuntos de sonda de oligonucleotídeo e o uso das mesmas para traçar o perfil do microbiota do trato gastrointestinal (Gl). Perfis de microbiota do trato Gl característicos de uma doença ou condição ou o risco de desenvolver uma doença ou condição podem ser identificados então. Os referidos perfis característicos de microbiota podem então ser usados no diagnóstico ou monitoramento das referidas doenças e condições. O conjunto de sonda pode ser proporcionado na forma de um kit.

O trato Gl, também referido como o trato digestivo ou canal alimentar (e cujos termos podem ser usados intercambiavelmente com o trato Gl) é a série contínua de órgãos que se iniciam na boca e terminam no ânus. Através de seu comprimento o trato Gl é colonizado por microorganismos de uma variedade de diferentes espécies. Juntos o conteúdo de microorganismos do trato Gl é o microbiota do trato Gl e as quantidades relativas dos microorganismos constituintes podem ser considerados ser o perfil do microbiota. Microbiota e perfis de microbiota de diferentes regiões do trato Gl podem também ser determinados.

Acredita-se que muitas doenças e condições, ou estágios dos mesmos, estejam ligadas a perfis característicos do microbiota do trato Gl, ou regiões dos mesmos. Em alguns casos a doença ou condição pode ser causada por, ou é exacerbada por, perturbações no perfil do microbiota do trato Gl. Em outros casos a doença ou condição causa, ou por algum mecanismo resulta em, o surgimento de um perfil particular do microbiota do trato Gl. Assim sendo, ao analisar os perfis de microbiota no amostras do trato de Gl, informação pode ser proporcionada que permite o diagnóstico ou o monitoramento de uma doença ou condição, ou que permite uma avaliação do risco de desenvolver uma doença ou condição, que foi determinada ser caracterizada por um perfil particular de microbiota.

Doenças e condições que afetam o trato Gl são muito prováveis de resultar em perfis característicos de microbiota, por exemplo, Doença Inflamatória Intestinal (IBD), doença de Crohn (CD), colite ulcerativa (UC), Síndrome do Intestino Irritável (IBS) e cânceres do trato Gl (por exemplo, câncer de boca, farínge, esôfago, estômago, duodeno, jejuno, íleo, ceco, cólon, reto ou ânus) e também existe evidência de ligações entre microbiota do trato Gl e as doenças e condições que são consideradas não estar relacionadas ao trato gastrointestinal, por exemplo, as doenças atópicas, por exemplo, eczema, asma, dermatite atópica, rinite conjuntivite alérgica e alergias alimentares, distúrbios metabólicos, por exemplo, diabetes mellitus (tipo 1 e tipo 2), obesidade e síndrome metabólica, desordens neurológicas, por exemplo, depressão, esclerose múltipla, demência e doença de Alzhiemer e autismo.

Um conjunto de sonda foi agora identificado o qual pode analisar com um alto grau de sensibilidade e precisão as quantidades relativas de bactéria constituinte chave do microbiota do trato Gl e desse modo proporcionar perfis do trato Gl microbiota que são sufici2/44 entemente detalhados e precisos para serem característicos de várias doenças ou condições ou do risco de desenvolver várias doenças ou condições. Consequentemente o conjunto de sonda recentemente identificado é uma potente ferramenta de diagnóstico de alta sensibilidade e precisão.

Assim, em um aspecto é proporcionado um conjuntos de sonda de oligonucleotídeo, o referido conjunto compreende:

(a) um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de ACGCTTGCACCCT (SEQ ID NO 1), a sequência complementar à mesma (AGGGTGCAAGCGT; SEQ ID NO 27) ou a sequência capaz de hibridização em qualquer sequência sob condições de alto rigor;

(b) um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de CGATCCGAAAACCTTCTTCACT (SEQ ID NO 2), a sequência complementar à mesma (AGTGAAGAAGGTTTTCGGATCG; SEQ ID NO 28) ou a sequência capaz de hibridização em qualquer sequência sob condições de alto rigor;

(c) um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de GGACAACGCTTGCCAC (SEQ ID NO 3), a sequência complementar à mesma (GTGGCAAGCGTTGTCC; SEQ ID NO 29) ou a sequência capaz de hibridização em qualquer sequência sob condições de alto rigor;

(d) um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de CGTAGGCGGTTCGTCGCGT (SEQ ID NO 4), a sequência complementar à mesma (ACGCGACGAACCGCCTACG; SEQ ID NO 30) ou a sequência capaz de hibridização em qualquer sequência sob condições de alto rigor; e (e) um ou mais oligonucleotídeos compreendem uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das mencionadas na Tabela 1 ou a sequência capaz de hibridização em qualquer sequência de nucleotídeo mencionada na Tabela 1 sob condições de alto rigor; e opcionalmente (f) um ou mais oligonucleotídeos compreendem uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das mencionadas na Tabela 2 e Tabela 3 ou a sequência capaz de hibridização em qualquer sequência de nucleotídeo mencionada na Tabela 2 e Tabela 3 sob condições de alto rigor.

Em modalidades preferidas o componente (f) está presente no conjunto de sonda e é um ou mais oligonucleotídeos compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir das mencionadas na Tabela 2.

Qualquer e todas as combinações das várias opções individuais para cada componente são especificamente contemplados e aqui descritos.

Assim, em determinadas outras modalidades o conjunto de sonda de oligonucleotídeo compreende componentes (a) a (d) e opcionalmente componente (f) todos como defini3/44 dos acima e pelo menos um de (i) um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de SEQ ID NO 5, SEQ ID NO 31 ou a sequência capaz de hibridização em qualquer sequência sob condições de alto rigor, (ii) um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de SEQ ID NO 6, SEQ ID NO 32 ou a sequência capaz de hibridização em qualquer sequência sob condições de alto rigor, (iii) um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de SEQ ID NO 7, SEQ ID NO 33 ou a sequência capaz de hibridização em qualquer sequência sob condições de alto rigor, (iv) um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de SEQ ID NO 8, SEQ ID NO 34 ou a sequência capaz de hibridização em qualquer sequência sob condições de alto rigor.

O conjunto de sonda pode, e tipicamente irá, compreender mais do que uma cópia de cada espécie de sonda de oligonucleotídeo selecionada.

Sondas de oligonucleotídeo adicionais podem estar presentes no conjunto de sonda. Preferivelmente as sondas de oligonucleotídeo adicionais contribuirão para a informação do conteúdo de microbiota do trato Gl que o conjunto de sonda pode proprocionar. Isso pode ser pelas sondas adicionais proporcionarem informação positiva no microbiota do trato Gl ou por proporcionar informação que pode agir como um controle para uma ou mais de outras sondas no conjunto de sonda ou informação padronizada que possa permitir a quantificação de uma informação obtida a partir de um ou mais de outras sondas no conjunto de sonda. As sondas adicionais podem ser objetivadas para a mesma bactéria ou bactéria diferente que a uma ou mais das sondas do conjunto de sonda definido acima.

A presente invenção também proporciona uma sonda de oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de qualquer um de SEQ ID NOs 1-52 ou uma sequência de nucleotídeo capaz de hibridização na referida sequência de nucleotídeo sob condições de alto rigor. O uso das referidas sondas nos produtos da presente invenção e na preparação dos mesmos, e o uso das referidas sondas nos métodos da presente invenção são aspectos adicionais da presente invenção.

No a seguir, referências a a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO X, também inclui referência a sequência de nucleotídeos capaz de condições de hibridização sob alto rigor em SEQ ID NO X a não ser que o contexto indique de outro modo.

Os oligonucleotídeos do conjunto de sonda da presente invenção podem variar em tamanho dependendo de qual sequência de nucleotídeo os mesmos compreendem. Em geral, os oligonucleotídeos podem compreender até 100 nucleotídeos, preferivelmente até 80, 60, 50, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20,

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19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 ou até 10 nucleotídeos. Os oligonucleotídeos do conjunto de sonda da presente invenção podem compreender pelo menos 9, preferivelmente pelo menos 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 60, ou pelo menos 80 nucleotídeos. Em determinadas modalidades, os oligonucleotídeos do conjunto de sonda da presente invenção podem compreender pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 40, 60, ou pelo menos 80 nucleotídeos além do número de nucleotídeos em qualquer sequência de SEQ ID NOs 1 a 52 que está presente no oligonucleotídeo.

Os nucleotídeos dos oligonucleotídeos do conjunto de sonda podem ser qualquer tipo de nucleotídeo desde que a especificidade ou a eficiência da hibridização e, se necessário, a eficiência da polimerização de ácido nucleico ou a eficiência da amp'lificacao do acido nucleico dependente de primer não seja afetada prejudicialmente. Os oligonucleotídeos podem portanto ser deoxiribonucleotídeos, ribonucleotídeos, modificações dos mesmos (por exemplo, PNA, morfolino-, LNA) e misturas dos mesmos. Oligonucleotídeos de DNA e oligonucleotídeos de DNA modificados a LNA são preferidos.

Os nucleotídeos que correspondem a SEQ ID NOs 1 a 52 podem ser encontrados em qualquer parte das sondas de oligonucleotídeo desde que os oligonucleotídeos possam hibridizar na sequência alvo complementar da SEQ NO sob consideração e, se necessário, pode efetuar uma reação de extensão de ácido nucleico. Em algumas modalidades o nucleotídeo 3’ de qualquer sequência de SEQ ID NOs 1 a 52 que está presente no oligonucleotídeo é o nucleotídeo 3’ do oligonucleotídeo.

Em outras modalidades os oligonucleotídeos consistem essencialmente da sequência selecionada a partir de SEQ ID NOs 1 a 52. Assim, os oligonucleotídeos terão uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de SEQ ID NOs 1 a 52 e 1, 2, 3, 4, ou 5 nucleotídeos adicionais. Em outras modalidades os oligonucleotídeos consistirão da sequência selecionado a partir de SEQ ID NOs 1 a 52.

A não ser que de outro modo determinado, ou ditado por contexto específico, todas as sequências de nucleotídeos são mencionadas aqui 5' a 3' em linha com convenção nesse campo técnico.

Condições de alto rigor para hibridização são definidas como 2x SSC/50% de formamida a 50 °C para condições de ligação e 2 x SSC a 65 °C para condições de lavagem (onde SSC = 0,15 M NaCI, 0,015 M de citrato de sódio, pH 7.2).

Em modalidades preferidas a sequência de nucleotídeos que pode hibridizar a uma de SEQ ID NOs. 1 a 52 sob condições de alto rigor irá hibridizar em todos, ou substancialmente todos, os nucleotídeos nas sequências de SEQ ID NOs 1 a 52, por exemplo, uma série de nucleotídeos contíguos com um número de nucleotídeos que equivalem a pelo menos 50% preferivelmente pelo menos 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 ou 95% do número total

5/44 de nucleotídeos na sequência da SEQ ID NO sob consideração.

Visto alternativamente, a sequência de nucleotídeos que pode hibridizar na sequência de nucleotídeos de uma de SEQ ID NOs. 1 a 26 ou 27 a 52 sob condições de alto rigor pode ser a sequência de nucleotídeos que corresponde à sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOs. 27 a 52 ou 1 a 26, respectivamente mas com até 40% das bases (adenina, timina/uracil, guanina, ou citosina) na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NOs. 27 a 52 ou 1 a 26, sendo substituída com uma base diferente. Preferivelmente até 35, 30, 25, 20, 15, 10 ou 5% das bases serão substituídas. Posto de outro modo, a sequência de nucleotídeos que pode hibridizar na sequência de nucleotídeos de uma de SEQ ID NOs. 1 a 26 ou 27 a 52 sob condições de alto rigor pode ser a sequência de nucleotídeos que corresponde à sequência de nucleotídeo de SEQ ID NOs. 27 a 52 ou 1 a 26, respectivamente mas com até 5, 4, 3 ou 2 de base substituída ou apenas uma única substituição de base. A base sendo substituída na sequência pode ser qualquer padrão ou não padrão, de ocorrência natural ou base sintética.

Sequência de nucleotídeos que pode hibridizar em SEQ ID NOs. 1 a 26 ou 27 a 52 sob condições de alto rigor será preferivelmente 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 ou 28 nucleotídeos em comprimento, e consiste de uma parte contígua da sequência de nucleotídeo de SEQ ID 27 a 52 ou 1 a 26, respectivamente, com as substituições acima descritas.

Preferivelmente a substituição de base(s) ocorre em ou próximo da terminação 5’ da sequência de nucleotídeo, por exemplo, na final 15, 10 ou 5 5' nucleotídeos na sequência . Posto de modo diferente, a substituição de base(s) preferivelmente não ocorre em ou próximo da terminação 3’ da sequência de nucleotídeo, por exemplo, na final 2, 3, 4, 5, 10 ou 15 3' nucleotídeos. Em outras modalidades o nucleotídeo 3’ não terá a base substituída.

Em determinadas modalidades qualquer um dos oligonucleotídeos do conjunto de sonda compreendendo uma sequência de nucleotídeo de qualquer um de SEQ ID NOs 1 a 26 pode ter um resíduo C imediatamente 3' da referida sequência de nucleotídeo ou qualquer dos oligonucleotídeos compreendendo uma sequência de nucleotídeo de qualquer um de SEQ ID NOs 27 a 52 pode ter um resíduo G imediatamente 5' da referida sequência de nucleotídeo.

Os oligonucleotídeos do conjunto de sonda podem ser marcados com uma fração para ajudar com a detecção ou manipulação. Um grande número de frações adequadas e métodos de marcação são conhecidos na técnica e descritos na literatura. Muitas frações podem realizar ambas as funções. Qualquer molécula geradora de sinal ou detectável ou molécula reportadora pode ser usada. Marcações convenientes incluem, marcações colorimétricas, quimioluminescentes, cromogênicas, radioativas e fluorescentes, mas enzimática (por exemplo, colorimétrica, luminescente, cromogênicas) ou métodos de marcação com

6/44 base em anticorpo ou sistemas de geração de sinal podem também ser usados. Assim o termo marcação como usado aqui inclui não só frações passivas ou de doação de sinal diretamente detectáveis, mas também qualquer fração que gere um sinal ou que tome parte em uma reação de geração de sinal ou que pode ser detectada indiretamente de algum modo. Por exemplo, a fração pode ser biotina e a detecção pode ser indireta via estreptavidina que porta uma racao colorimétrica, quimioluminescente, cromogênica, radioativa ou fluorescente.

A marcação pode, em algumas modalidades, compreender uma pluralidade de frações que contribuem para a emissão detectável geral da marcação. Ao se variar a identidade e/ou as proporções relativas das referidas frações, uma grande gama de marcações únicas pode ser construída. Por exemplo, uma pluralidade de corantes, por exemplo, luminescente (por exemplo, bioluminescente, quimioluminescentes, fotoluminescente, radioluminescente, sonoluminescente, etc.) que se combinam para prorpocionar uma única assinatura espectral eletromagnética com a excitação pode ser usada. Ao variar as proporções dos corantes selecionados uma diferenciação adicional na assinatura espectral pode ser alcançada. Assinaturas com base na absorção de determinadas comprimentos de onda de radiação eletromagnética são também previstos.

Fluoresceina ou outros nucleotídeos marcados fluorescentemente são particularmente adequados para incorporação nos primers, e permitir a detecção diretamente por fluorescência ou indiretamente por interações de anticorpo. Os referidos são comercialmente oferecidos. Primers podem ser marcados, por exemplo, por [³⁵S], [³H] ou [³²P] como descrito em Syvãnen, A.C. et al. Genomics 8, [1990], 684 - 692. Qualquer fração de ligação pode ser usada como a marcação, por exemplo, um fragmento de anticorpo, His-tag, biotina ou estreptavidina. Os referidos podem ser incorporados na forma de nucleotídeos marcados.

Alguns ou todos os oligonucleotídeos do conjunto de sonda podem ser proporcionados imobilizados em um ou mais suportes sólidos para uso na presente invenção. Em outras modalidades os oligonucleotídeos do conjunto de sonda podem ser imobilizados em um ou mais suportes sólidos antes de uso. Cópias simples ou preferivelmente múltiplas das sondas de oligonucleotídeo são fixadas aos referidos suportes sólidos, por exemplo, 10 ou mais, por exemplo, pelo menos 100 cópias de cada sonda única são presentes.

Uma ou mais sondas de oligonucleotídeo do conjunto de sonda, cada uma de uma determinada sequência, pode ser associada com suportes sólidos separados os quais juntos formam um conjuntos de sonda imobilizados em múltiplos suportes sólidos, por exemplo, uma ou mais sondas de oligonucleotídeo do conjunto de sonda pode ser imobilizada em múltiplas contas, membranas, filtros, biochips etc. Os suportes sólidos de diferentes partes do conjunto de sonda são convenientemente fisicamente associadas embora os sinais associados com cada sonda (gerado como descrito daqui adiante) deve ser separadamente

7/44 determinável.

Alternativamente, as sondas podem ser imobilizadas em porções distintas do mesmo suporte sólido, por exemplo, cada sonda de oligonucleotídeo de uma determinada sequência, tipicamente em múltiplas cópias, pode ser imobilizada em uma porção ou região distinta e discreta de um único chip, placa, filtro ou membrana, por exemplo, para gerar uma estrutura.

Uma combinação das referidas técnicas podem também ser usada, por exemplo, diversos suportes sólidos podem ser usados os quais cada um porta diversas sondas de diferentes sequências imobilizadas nos mesmos.

A expressão suporte sólido deve significar qualquer material sólido capaz de ligar oligonucleotídeos, por exemplo, por interação hidrófoba, iônica ou covalente.

Imobilização como usado aqui se refere a associação reversível ou irreversível das sondas ao referido suporte sólido. Se reversíveis, as sondas permanecem associadas com o suporte sólido por um tempo suficiente para os métodos da presente invenção serem realizados.

Suportes de imobilização adequados aos quais os oligonucleotídeos podem ser fixados são conhecidos na técnica e incluem qualquer um dos suportes bem conhecidos ou matrizes que são atualmente amplamente usados ou propostos para imobilização, separação etc. de oligonucleotídeos. Os referidos materiais incluem, mas não são limitados a, qualquer polímero orgânico sintético tal como polistireno, cloreto de polivinil, polietileno; ou nitrocelulose e acetato de celulose; ou agarose, celulose, alginate, teflon ou latex; ou superfícies ativadas a tosila; ou vidro ou náilon ou qualquer superfície portando um grupo adequado para acoplamento covalente de ácidos nucleicos. Os referidos podem adotar a forma de partículas, folhas, géis, filtros, membranas, fibras, capilares, chips ou tiras de microtitulação, lâminas, tubos, placas ou cavidades etc. Métodos de imobilizar ou fixar oligonucleotídeos a suportes sólidos são da mesma forma conhecidos na técnica. Particularmente preferidos são chips de DNA (microchips, chips de vidro) agora comum emprocedimentos de biologia molecular. Em outras modalidades tiras de membrana nas .quais os oligonucleotídeos podem ser ponteados e então reticulados a UV podem ser usadas. Alternativamente, a fixação pode ser realizada indiretamente pelo uso de uma fracao de fixação portada nas sondas de oligonucleotídeo e/ou suporte sólido. Assim, por exemplo, um par de parceiros de ligacoa por afinidade pode ser usado, tal como avidina, estreptavidina ou biotina, DNA ou proteína de ligação a DNA (por exemplo, seja a proteína repressora de lac I ou a sequência operadora de lac à qual a mesma se liga), anticorpos (que pode ser mono- ou policlonal), fragmento de anticorpos ou os epítopos ou haptenos de anticorpos. Nos referidos casos, um parceiro do par de ligação é fixado a (ou é inerentemente parte de) o suporte sólido e o outro parceiro é fixado a (ou é inerentemente parte de) as moléculas de ácido nucleico.

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Como usado aqui um par de ligação por afinidade se refere a dois componentes que reconhecem e se ligam um ao outro especificamente (isto é, em preferencia à ligação a outras moléculas).

A fixação de grupos funcionais apropriados ao suporte sólido pode ser realizada por métodos bem conhecidos na técnica, que incluem, por exemplo, fixação através de grupos hidroxila, carboxila, aldeído ou amino que podem ser proporcionados ao tratar o suporte sólido para proporcionar adequados revestimentos de superfície. Suportes sólidos que apresentam frações apropriadas para fixação do parceiro de ligação podem ser produzidos por métodos de rotina conhecidos na técnica.

Fixação de grupos funcionais apropriados a sondas de oligonucleotídeo da presente invenção pode ser realizada por ligação ou introduzida durante a síntese ou amplificação, por exemplo, usando primers portando uma fração apropriada, tal como biotina ou uma sequência particular para captura.

Em determinadas modalidades, cada sonda de oligonucleotídeo de uma determinada sequência pode ser associada com um suporte sólido separado, por exemplo, uma conta ou a microesfera, tendo uma marcação particular de modo que a população, ou a pluralidade de populações, de partículas tendo a mesma marcação e a mesma sonda imobilizada na mesma é formada. A detecção do evento de hibridização ocorrendo em uma partícula com uma marcação particular irá proporcionar a informação na sequência da sonda envolvida naquele evento.

As partículas podem ser marcadas em qualquer modo conveniente, por exemplo, usando uma ou mais das marcações descritas acima. Em uma modalidade a marcação de partícula não será ou compreende um oligonucleotídeo, ou um ácido nucleico, ou um oligonucleotídeo marcado ou ácido nucleico marcado. De modo conveniente o suporte sólido particulado das referidas modalidades será marcado com um corante, por exemplo, um corante luminescente (por exemplo, bioluminescente, quimioluminescentes, fotoluminescente, radioluminescente, sonoluminescente, etc.), ou uma pluralidade de corantes (ou proporções dos mesmos) que se combinam para proporcionar uma única assinatura espectral eletromagnética com excitação. Assinaturas com base na absorção de determinados comprimentos de onda de radiação eletromagnética são também previstas.

De modo conveniente o corante será fluorescente, por exemplo, compreendendo fluoróforos vermelhos ou infravermelhos, por exemplo, ficoeritrina.

A marcação pode ser imobilizada em e/ou na partícula, por exemplo, por ligação colvalente direta ao substrato da partícula ou a mesma pode ser ligada a outra molécula que é por sua vez imobilizada em e/ou na partícula. A marcação pode também ser incorporada em e/ou na partícula por meios não covalentes, por exemplo, por captura, absorção ou adsorção das moléculas que constituem a marcação em ou no substrato da partícula, ou por

9/44 captura em espaço(s) dentro do substrato e/ou em sua superfície.

Em outras modalidades a partícula compreende nanopartículas nas quais e/ou nas quais a marcação foi imobilizada ou incorporada.

A marcação pode ser aplicada à partícula após a mesma ser produzida, ou a marcação pode ser incorporada ou imobilizada em e/ou na partícula durante a sua produção, por exemplo, durante a reticulação de um substrato polimérico.

Preferivelmente a marcação da(s) sonda(s) será distinguível a partir da marcação da(s) partícula(s). Em modalidades preferidas a marcação das partículas será detectável ao mesmo tempo que a marcação da(s) sonda(s). Preferivelmente the partículas marcadas também serão magnéticas, por exemplo, paramagnéticas ou superparamagnéticas.

Suportes sólidos particulados adequados são fabricados por Luminex Corp. Vide, por exemplo, WO 01/13120, WO 01/13119, WO 97/14028 e WO 99/19515, os conteúdos das quais se encontram aqui incorporados por referência. Partículas adicionais que podem ser usadas no trabalho na presente invenção são proporcionadas em US 4267234, US 4267235, US 4552812, US 4677138, US 5194300, US 4774189, US 5073498, US 4717655, US 5723218, US 5326692, US 5716855, US 5573909 e US 5786219, os conteúdos das quais se encontram aqui incorporados por referência. Outros suportes sólidos adequados são fabricados por Illumina, Inc. Vide, por exemplo, WO 00/39587, WO 01/18524, WO 01/59432 e WO 02/00336 os conteúdos das quais se encontram aqui incorporados por referência.

Preferivelmente o suporte é magnético (preferivelmente paramagnético ou superparamagnético), por exemplo, partículas magnéticas, por exemplo, contas magnéticas.

Em outras modalidades nenhum dos oligonucleotídeos é usado na forma imobilizada, e em geral esta é a preferida.

Em uma modalidade preferida o conjunto de sonda de oligonucleotídeo definido aqui compreende:

(a) um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de SEQ ID NO 1 ou uma sequência capaz de hibridização em SEQ ID NO 27 sob condições de alto rigor;

(b) um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de SEQ ID NO 2 ou uma sequência capaz de hibridização em SEQ ID NO 28 sob condições de alto rigor;

(c) um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de SEQ ID NO 3 ou uma sequência capaz de hibridização em SEQ ID NO 29 sob condições de alto rigor;

(d) um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de SEQ ID NO 4 ou uma sequência capaz de hibridização em SEQ ID NO 30 sob

10/44 condições de alto rigor; e (e) um ou mais oligonucleotídeos compreendem uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de SEQ ID NOs 5 a 8 ou uma sequência capaz de hibridização em SEQ ID NOs 31 a 34 sob condições de alto rigor; e opcionalmente (f) um ou mais oligonucleotídeos compreendem uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de SEQ ID NOs 9 a 18, a sequência capaz de hibridização em SEQ ID NOs 35 a 44 sob condições de alto rigor, uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de SEQ ID NOs 19 a 26 ou uma sequência capaz de hibridização em SEQ ID NOs 45 a 52 sob condições de alto rigor. Preferivelmente, na referida modalidade, nenhuma das sondas de oligonucleotídeo é imobilizada em um suporte sólido.

Em outras modalidades preferidas o conjunto de sonda de oligonucleotídeo definido aqui compreende:

(a) um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de SEQ ID NO 27 ou uma sequência capaz de hibridização em SEQ ID NO 1 sob condições de alto rigor;

(b) um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de SEQ ID NO 28 ou uma sequência capaz de hibridização em SEQ ID NO 2 sob condições de alto rigor;

(c) um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de SEQ ID NO 29 ou uma sequência capaz de hibridização em SEQ ID NO 3 sob condições de alto rigor;

(d) um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de SEQ ID NO 30 ou uma sequência capaz de hibridização em SEQ ID NO 4 sob condições de alto rigor, e (e) um ou mais oligonucleotídeos compreendem uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de SEQ ID NOs 31 a 34 ou uma sequência capaz de hibridização em SEQ ID NOs 5 a 8 sob condições de alto rigor; e opcionalmente (f) um ou mais oligonucleotídeos compreendem uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de SEQ ID NOs 35 a 44, a sequência capaz de hibridização em SEQ ID NOs 9 a 18 sob condições de alto rigor, SEQ ID NOs 45 a 52 ou uma sequência capaz de hibridização em SEQ ID NOs 19 a 26 sob condições de alto rigor. Preferivelmente, na referida modalidade, todas das sondas de oligonucleotídeo são imobilizados em um suporte sólido, ou uma pluralidade de suportes sólidos.

Em uma outra modalidade adicional preferida, o conjunto de sonda de oligonucleotídeo da presente invenção é uma combinação das duas modalidades precedentes preferidas, em particular em que o primeiro conjuntos de sonda preferido não é imobilizado em um suporte sólido. Em outras palavras, um kit é proporcionado que compreende, em duas par11/44 tes distintas, os dois conjuntos de sonda preferidos definidos acima.

As sondas de oligonucleotídeo do conjunto de sonda da presente invenção são capazes de hibridização em sequências em rRNA e rDNA bacteriano 16S que são específicos para bactéria particular ou grupos de bactérias. SEQ ID NOs 1 e 27 são designadas para objetivar sequências no rRNA e rDNA 16S de Proteobactéria. SEQ ID NOs 2 e 28 são designadas para objetivar sequências no rRNA e rDNA 16S de Firmicutes (Lactobacillales, Clostridium perfringens, Staphilococcus). SEQ ID NOs 3 e 29 são designadas para objetivar sequências no rRNAe rDNA 16S de Firmicutes (Clostridia, Bacillales, Enterococcus, Lactobacillus). SEQ ID NOs 4 e 30 são designadas para objetivar sequências no rRNA e rDNA 16S de Actinobacteria. Os organismos que exibem as sequências alvo de SEQ ID NOs 5 a 26 e 31 a 52 são mencionados nas Tabelas 1, 2 e 3. As referidas bactérias são bactérias encontradas tipicamente no trato Gl.

O conjunto de sonda de oligonucleotídeo da presente invenção pode portanto ser usado para analisar as amostras a partir do trato Gl e proporciona um perfil do microbiota do trato Gl.

Assim em outro aspecto a presente invenção proporciona um método de traçar o perfil do microbiota do trato Gl de um indivíduo, o referido método compreende:

(i) colocar em contato a amostra a partir do trato Gl do referido indivíduo com um conjunto de sonda de oligonucleotídeo como definido acima;

(ii) submeter a amostra e o conjunto de sonda a condições que permitem a hibridização das sondas em suas sequências de nucleotídeos alvos dentro de moléculas de ácido nucleico na referida amostra; e (iii) para cada oligonucleotídeo no referido conjunto de sonda, determinar a quantidade de sua sequência de nucleotídeo alvo que está presente na referida amostra.

O perfil do microbiota do trato Gl do indivíduo pode então ser preparado a partir das quantidades relativas da referida sequência alvo.

Nesse aspecto da presente invenção as sequências de nucleotídeo alvo para SEQ ID NOs 1 a 26 são as sequências completamente complementares às mesmas, isto é, SEQ ID NOs 27 a 52, respectivamente. Da mesma forma, as sequências de nucleotídeo alvo para SEQ ID NOs 27 a 52 são as sequências completamente complementares às mesmas, isto é, SEQ ID NOs 1 a 26, respectivamente. Em determinadas modalidades as sequências de nucleotídeo alvo para SEQ ID NOs 1 a 26 são as sequências de SEQ ID NOs 27 a 52, respectivamente, com um resíduo G imediatamente 5' da referida sequência de nucleotídeo. Da mesma forma, as sequências de nucleotídeo alvo para SEQ ID NOs 27 a 52 são as sequências de SEQ ID NOs 1 a 26, respectivamente com um resíduo C imediatamente 3' da referida sequência de nucleotídeo.

A quantidade de sequência alvo pode ser determinada por qualquer meio conveni

12/44 ente e muitos dos referidos meios serão familiares para aqueles versados na técnica. Esse pode ser uma medição parcial, semi- ou completamente quantitativa, mas pode também ser uma medição qualitativa (ou relativa) na qual os resultados para cada alvo são simplesmente comparados um ao outro sem valores numéricos sendo fixados. Como será discutido posteriormente, em algumas modalidades a medição quantitativa é realizada e os dados obtidos são analisados com técnicas estatísticas de modo a determinar as características estatisticamente significantes do perfil de microbiota.

Em uma modalidade a quantidade de cada sequência alvo é determinada ao se usar os oligonucleotídeos do conjunto de sonda da presente invenção com marcações fixadas à mesma que permitirão a detecção por meios diretos ou meios indiretos. Em outras palavras as sondas de oligonucleotídeo da presente invenção são usadas simplesmente como sondas convencionais de oligonucleotídeo. Marcações adequadas são descritas acima. Após o contaro das referidas sondas com a amostra, sob condições que permitem a hibridização das sondas em suas sequências alvo, e tipicamente seguindo a etapa (ou etapas) para remover oligonucleotídeo marcados não ligados e/ou oligonucleotídeos não especificamente ligados, a resistência do sinal a partir da marcação de cada sonda emanando a partir da amostra sob investigação (isto é, a quantidade de marcação ligada à amostra) será proprocional a quantidade de oligonucleotídeo hibridizado, e portanto a sua sequência alvo. Em modalidades preferidas a marcação é selecionada de modo que a mesma seja detectável apenas quando a sonda é hibridizada em seu alvo. Nas referidas modalidades, a necessidade para remover a sonda não ligada é diminuída.

Qualquer meio conveniente pode ser usado para remover qualquer sonda não ligada ou não especificamente ligada, por exemplo, com uma ou mais etapas de lavagem (por exemplo, com água ou uma solução tamponada que pode conter formamida e/ou um detergente), eletroforese, centrifugação, captura em suportes sólidos, cromatografia ou qualquer combinação dos mesmos. Suportes sólidos adequados são descritos acima. Em outra modalidade as sondas podem portar uma fração de ligação, ou a marcação pode ser a fração de ligação, que permitirá manipulação das sondas e qualquer parte da amostra hibridizada à mesma. Frações de ligação adequadas são discutidas acima.

Assim, a presente invenção proporciona um método de traçar o perfil do microbiota do trato Gl de um indivíduo, o referido método compreende:

(i) colocar em contato a amostra a partir do trato Gl do referido indivíduo com um conjunto de sonda de oligonucleotídeo como definido acima, em que cada oligonucleotídeo tem uma marcação fixada ao mesmo;

(ii) submeter a amostra e o conjunto de sonda a condições que permitem a hibridização das sondas em suas sequências de nucleotídeos alvos dentro de moléculas de ácido nucleico na referida amostra; e

13/44 (iii) para cada oligonucleotídeo marcado no referido conjunto de sonda, determinar a quantidade da referida marcação ligada à referida amostra por determinar a resistência do sinal a partir da marcação emanando a partir da amostra. A quantidade de marcação ligada à amostra é indicativa da quantidade da sequência alvo para aquele oligonucleotídeo marcado na referida amostra.

Em uma modalidade preferida o método irá compreender uma etapa entre etapas (i) e (ii) na qual oligonucleotídeo não ligado e/ou oligonucleotídeo não especificamente ligado é removido.

Em outra modalidade a quantidade de cada sequência de nucleotídeo alvo presente na amostra é determinada ao se usar um conjunto de sonda de oligonucleotídeo da presente invenção, em particular os referidos conjuntos compreendem sondas de oligonucleotídeo que compreendem sequência de nucleotídeos selecionado a partir de SEQ ID NOs 1 a 26, como um conjunto de sondas que são marcadas apenas quando hibridizadas em suas sequências alvo. Em algumas modalidades os oligonucleotídeos do conjunto de sonda podem já portar uma marcação que é diferente da marcação usada para seletivamente marcar as sondas. A resistência do sinal a partir das sondas seletivamente marcadas emanando a partir da amostra sob investigação (isto é, a quantidade de marcações ligadas à amostra) será proprocional à quantidade de oligonucleotídeo hlbridizado e por sua vez a quantidade de sequência alvo.

Como mencionado anteriormente, dependendo das condições empregadas, isso pode ser uma medição parcial, semi- ou completamente quantitativa, mas pode também ser uma medição qualitativa (ou relativa) na qual os resultados para cada sequência alvo são simplesmente comparados um ao outro sem valores numéricos sendo fixados.

De modo conveniente, a marcação seletiva pode ser alcançada usando nucleotídeos marcados, isto é, por incorporação em uma sonda de oligonucleotídeo de um nucleotídeo portando a marcação. Em outras palavras, a marcação seletiva pode ocorrer por extensão de cadeia da sonda de oligonucleotídeo usando uma enzima de polimerase que incorpora o nucleotídeo marcado, preferivelmente um dideoxinucleotídeo marcado (por exemplo, ddATP, ddCTP, ddGTP, ddTTP, ddUTP) mais preferivelmente ddCTP marcado, mais preferivelmente um fluorescentemente marcado, por exemplo, TAMRA marcado, ddCTP ou uma biotina ddCTP marcado. A referida abordagem para a detecção de sequências específicas de nucleotídeos é algumas vezes referida como análise de extensão de primer. Técnicas adequadas de análise de extensão de primer são bem conhecidas para aqueles versados na técnica, por exemplo, as técnicas descritas em WO 99/50448, os conteúdos das quais se encontram aqui incorporados por referência. Marcações adequadas são descritas acima. Marcações fluorescentes e biotina são mencionados em particular.

No caso de sondas de oligonucleotídeo terminando com SEQ ID NOs. 1 a 26 em

14/44 suas 3', a marcação será preferivelmente um ddCTP marcado, por exemplo, um TAMRA ou biotina ddCTP marcado. Mais preferivelmente na referida modalidade o conjunto de sonda da presente invenção compreenderá oligonucleotídeos consistindo de SEQ ID NOs 1 a 26 e a marcação será um ddCTP marcado, por exemplo, um TAMRA ou biotina ddCTP marcado.

A detecção de sondas marcadas pode ser por quaisquer meios convenientes para a marcação sendo usada. Aquele versado na técnica seria capaz de desenvolver métodos adequados com base em sua seleção de marcações. Em modalidades preferidas, the marcações são fluorescentes marcações (por exemplo, TAMRA) e nas referidas modalidades as sondas marcadas fluorescentemente podem ser detectadas e, se necessário, quantificadas usando um dispositivo que pode medir a intensity (ou resistência) de sinais fluorescentes. A marcação de biotina pode ser detectada indiretamente por exposição da marcação a estreptavidina, ou outra molécula de ligação a biotina, que porta a fração detectável, por exemplo, uma marcação colorimétrica, quimioluminescentes, cromogênicas, radioativas ou fluorescentes. Em algumas modalidades, a detecção irá ocorrer após as sondas marcadas terem sofrido manipulação para remover, pelo menos parcialmente, contaminantes (por exemplo, sondas não marcadas, marcação excessiva, e outros reagentes usados na reação de marcação). Mais uma vez, aquele versado na técnica estaria bem familiarizado com as técnicas que podem alcançar isso, por meio de exemplo menção é feita a eletroforese (por exemplo, gel, por exemplo, eletroforese de gel capilar), centrifugação, cromatografia e tecicas com base em filtragem, captura em suportes sólidos, ou qualquer combinação dos mesmos.

Em outras modalidades preferidas as sondas seletivamente marcadas de oligonucleotídeo são detectadas após uma etapa na qual as sondas de oligonucleotídeo a partir da etapa de marcação seletiva (isto é, marcados e não marcados), ou as sondas seletivamente marcadas de oligonucleotídeo apenas, são hibridizadas em sequência de nucleotídeos que são parcialmente, ou preferivelmente completamente, complementares às sondas de oligonucleotídeo.

De modo conveniente, a sequência de nucleotídeos complementar pode ser proporcionada em um ou mais suportes sólidos, por exemplo, os descritos anteriormente.

Em modalidades particularmente preferidas o conjunto de sonda de oligonucleotídeo que sofre a marcação seletiva compreende:

(c) um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo seleciona-

15/44 da a partir de SEQ ID NO 3 ou uma sequência capaz de hibridização em SEQ ID NO 29 sob condições de alto rigor;

(d) um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de SEQ ID NO 4 ou uma sequência capaz de hibridização em SEQ ID NO 30 sob condições de alto rigor; e (e) um ou mais oligonucleotideos compreendem uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de SEQ ID NOs 5 a 8 ou uma sequência capaz de hibridização em SEQ ID NOs 31 a 34 sob condições de alto rigor; e opcionalmente (f) um ou mais oligonucleotideos compreendem uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de SEQ ID NOs 9 a 18, a sequência capaz de hibridização em SEQ ID NOs 35 a 44 sob condições de alto rigor, SEQ ID NOs 19 a 26 ou uma sequência capaz de hibridização em SEQ ID NOs 45 a 52 sob condições de alto rigor.

Em seguida da marcação seletiva do conjunto de sonda acima, as sondas seletivamente marcadas são aplicadas a um conjunto de sonda ligado a suporte sólido compreende:

(d) um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de SEQ ID NO 30 ou uma sequência capaz de hibridização em SEQ ID NO 4 sob condições de alto rigor; e (e) um ou mais oligonucleotideos compreendem uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de SEQ ID NOs 31 a 34 ou uma sequência capaz de hibridização em SEQ ID NOs 5 a 8 sob condições de alto rigor; e opcionalmente (f) um ou mais oligonucleotideos compreendem uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de SEQ ID NOs 35 a 44, a sequência capaz de hibridização em SEQ ID NOs 9 a 18 sob condições de alto rigor, SEQ ID NOs 45 a 52 ou uma sequência capaz de hibridização em SEQ ID NOs 19 a 26 sob condições de alto rigor. Preferivelmente, na referida modalidade, todas das sondas de oligonucleotídeo são imobilizados em um ou mais suportes sólidos.

Preferivelmente, os componentes (e) e (f) de cada conjunto de sonda são selecio16/44 nados para corresponderem um ao outro (isto é, cada sonda nos componentes (e) e (f) de cada conjunto de sonda tem uma sequência complementar nos componentes (e) e (f) do outro conjunto de sonda).

A presente invenção portanto proporciona um método de traçar o perfil do microbiota do trato Gl de um indivíduo, o referido método compreendendo:

(i) colocar em contato a amostra a partir do trato Gl do referido indivíduo com um conjunto de sonda de oligonucleotídeo como definido acima, (ii) submeter a amostra e o conjunto de sonda a condições que permitem a hibridização das sondas em suas sequências de nucleotídeos alvos dentro de moléculas de ácido nucleico na referida amostra:

(iii) marcar de modo seletivo as sondas de oligonucleotídeo do conjunto de sonda quando hibridizado em suas sequências de nucleotídeo alvo; e (iv) determinar a quantidade de cada sonda de oligonucleotídeo marcada produzida na etapa (iii).

A quantidade de cada sonda de oligonucleotídeo marcada é indicativa da quantidade da sequência alvo para aquele oligonucleotídeo marcado na referida amostra

Em algumas modalidades, etapa (iv) compreende hibridização das sondas de oligonucleotídeo a partir da etapa de marcação em sequência de nucleotídeos complementar aos referidos oligonucleotídeos.

Em uma modalidade adicional a quantidade de cada sequência de nucleotídeo alvo presente na amostra é determinada por marcar os ácidos nucleicos na amostra antes da etapa de colocar em contato a amostra com o conjunto de sonda de oligonucleotídeo da presente invenção. Simplesmente ao se avaliar a quantidade de ácido nucleico marcado que hibridiza nas sondas do conjunto de sonda, a quantidade da sequência de nucleotídeo alvo para cada sonda de oligonucleotídeo que está presente na referida amostra pode ser determinada. Nas referidas modalidades rRNA 16S ou rDNA 16S bacteriano, particularmente as regiões contendo as sequências alvo para os oligonucleotídeos do conjunto de sonda, ou ácidos nucleicos compreendendo as referidas sequências são marcados antes do contato com o conjunto de sonda. Marcações adequadas são discutidas acima. De modo conveniente marcações ocorrem quando os ácidos nucleicos na amostra são amplificados e/ou transcritos invertidamente antes do contato com o conjunto de sonda como discutido em mais detalhes abaixo. De modo conveniente os ácidos nucleicos são marcados pela incorporação de nucleotídeos marcados durante uma reação de amplificação de ácido nucleico e/ou uma reação de transcrição invertida.

Em modalidades adicionais não só os oligonucleotídeos do conjunto de sonda mastambém os ácidos nucleicos na amostra como descritos acima são marcados com frações que proporcionam um sinal apenas quando em proximidade, por exemplo, quando as son17/44 das são hibridizadas em suas sequências alvo no ácido nucleico.

Em outra modalidade a quantidade de cada sequência de nucleotídeo alvo presente na amostra é determinada ao se usar os oligonucleotídeos do conjunto de sonda da presente invenção como primers em uma ou mais reações de amplificação de ácido nucleico, por exemplo, a reação de amplificação multiplex. Se as condições apropriadas são selecionadas, a referida reação pode ser realizada de modo que a quantidade do produto de amplificação obtido para cada oligonucleotídeo do conjunto de sonda será proprocional à quantidade de cada sequência de nucleotídeo alvo presente na amostra. Assim, a quantidade de produto da reação de amplificação proporcionada para cada oligonucleotídeo do conjunto de sonda é uma medida da quantidade daquele oligonucleotídeo que hibridiza em uma amostra a partir do indivíduo sob investigação e é por sua vez proprocional à quantidade de sequência alvo para aquele oligonucleotídeo na amostra e assim é proprocional à quantidade de bactéria que aquele oligonucleotídeo é designada para objetivar na amostra. Assim sendo, a quantidade de produto de amplificação pode ser usada para determinar os níveis das referidas bactérias no trato Gl de um indivíduo.

A amplificação pode ser alcançada por qualquer reação de amplificação dependente de primer de ácido nucleico conveniente. A maior das reações de cadeia de polimerase mais convenientes (PCR) será usada, embora aqueles versados na técnica estejam cientes de outras técnicas. Por exemplo, LAR/LCR, SDA, amplificação isotemrica mediada a ciclo e amplificação baseada em sequência ácido nucleico (NASBA)/3SR (Self-Sustaining Sequence Replication) pode ser usada.

Muitas variações de PCR foram desenvolvidas, por exemplo, PCR de Tempo Real (também conhecidos como PCR quantitativo, qPCR), PCR hot-start, PCR competitiva, e assim por diante, e as referidas podem todas ser empregadas onde apropriado ás necessidades daqueles versados na técnica.

Em uma modalidade básica da presente invenção usando uma amplificação copm base em PCR os oligonucleotídeos do conjunto de sonda da presente invenção são contactados com a mistura de reação contendo a amostra, um conjunto adequado de segundos primers para formar um conjunto de pares de primers de trabalho e nucleotídeos livres em um tampão adequado sob condições que permitem hibridização. A ciclagem térmica da mistura resultante na presença de uma DNA polimerase resulta em amplificação das sequências alvo para cada oligonucleotídeo, isto é, sequências características da bactéria a qual os oligonucleotídeos do conjunto de sonda da presente invenção são designados a

18/44 objetivar.

O desempenho ótimo do processo de PCR é influenciado por escolha da temperatura, tempo em temperatura, e extensão de tempo entre temperaturas para cada etapa no ciclo. Um perfil de ciclagem típico para a amplificação por PCR é (a) 15 minutos de fusão de DNA a 95 °C; (b) 30 segundos de recozimento do primer a 50 °C - 65 °C; (c) 90 segundos de primer se estendendo a 68 °C - 72 °C; (d) 30 segundos de fusão de DNA a 95 °C; e as etapas (b) - (d) são repetidas quantas vezes forem necessárias para se obter o nível desejado de amplificação.

Modificações do método PCR básico tal como qPCR (PCR em Tempo Real) foram desenvolvidas as quais podem proprocionar informação quantitativa na matriz sendo amplificada. Numerosas abordagens foram adotadas embora as duas técnicas mais comuns usam corantes fluorescentes de ligação de DNA de dupla fita ou sondas reportadoras fluorescentes seletivas.

Corantes fluorescentes de ligação de DNA de dupla fita, por exemplo, SYBR verde, associados com o produto de amplificação como é produzido e quando associado o corante fluoresce. Assim sendo, ao medir a fluorescência após cada ciclo de PCR, a quantidade relativa do produto de amplificação pode ser monitorada em tempo real. Através do uso de padrões e controles internos, a referida informação pode ser traduzida em dados quantitativos em uma quantidade de matriz no início da reação.

As sondas reportadoras fluorescentes usadas em qPCR são seoligonucleotídeos específicos de sequência, tipicamente RNA ou DNA, que têm uma molécula reportadora fluorescente em uma terminação e uma molécula de resfriamento na outra (por exemplo, a molécula reportadora está na terminação 5’ e a molécula de resfriamento na terminação 3’ ou vice versa). A sonda é designada de modo que o reportador é resfriado pelo resfriador. A sonda é também designada para hibridizar seletivamente em regiões de sequência complementar particulares que devem estar na matriz. Se as referidas regiões estão entre os primers de PCR recozidos a polimerase, se tiver atividade de exonuclease, irá degradar (despolimerizar) a sonda ligada na medida em que a mesma estende a cadeia de ácido nulceico nascente que a mesma está polimerizando. Isso irá liberar o resfriamento e fluorescência surgirá. Assim sendo, ao medir a fluorescência após cada ciclo de PCR, a quantidade relativa de produto de amplificação pode ser monitorada em tempo real. Através do uso de padrão e controles internos, a referida informação pode ser traduzida em dados quantitativos.

Assim, em outro aspecto a presente invenção proporciona um método de traçar o perfil do microbiota do trato Gl de um indivíduo, o referido método compreende:

19/44 (ii) submeter a amostra e o conjunto de sonda a condições que permitem a hibridização das sondas em suas sequências de nucleotídeos alvos dentro de moléculas de ácido nucleico na referida amostra;

(iii) realizar uma reação de amplificação de ácido nucleico dependente de primer; e (iv) para cada oligonucleotídeo no conjunto de sonda determinar a quantidade de produto de amplificação produzida a partir da mesma na referida reação de amplificação de ácido nucleico dependente de primer.

A quantidade do referido produto para cada oligonucleotídeo é indicativa da quantidade da sequência alvo para cada oligonucleotídeo na amostra.

Em uma modalidade preferida etapa (i) também irá compreender colocar em contato a amostra com um conjunto de oligonucleotídeos que são capazes de funcionar com o conjunto de oligonucleotídeo da presente invenção em uma reação de amplificação de ácido nucleico, por exemplo, PCR, para produzir um produto de amplificação para cada oligonucleotídeo do conjunto de sonda, assumindo que uma matriz adequada está presente na amostra. Na referida modalidade, quando pareados com um segundo conjunto de primers de amplificação adequados, os oligonucleotídeos compreendendo SEQ ID NOs 1 a 26 irão agir como primers diretos e os oligonucleotídeos compreendendo SEQ ID NOs 27 a 52 irão agir como primers reversos.

Na referida modalidade o método pode envolver uma pluralidade de amplificações de ácido nucleico dependente de primer sendo rodadas em paralelo, com cada reação envolvendo uma única sonda, ou uma ou mais amplificações de ácido nucleico dependente de primer multiplex sendo rodadas com duas ou mais sondas sendo usadas na mesma reação.

O produto de amplificação a partir de cada oligonucleotídeo pode ser detectado, e quantidades de produto de amplificação podem ser determinadas, por qualquer meio conveniente. A alguma extensão técnicas possíveis serão ditadas pelo número de oligonucleotídeos do conjunto de sonda que são usados em cada reação de amplificação (por exemplo, se a reação é uma reação multiplex ou não ou a extensão de multiplexação). Aquele versado na técnica seria capaz de selecionar técnicas apropriadas.

Um vasto número de técnicas é rotineiramente empregado como as técnicas laboratoriais padrão e a literatura tem descrições de abordagens mais especializadas. Como é mais simples a quantidade de produto de amplificação pode ser detectada ou determinada por inspeção visual da mistura de reação no final da reação ou no ponto do tempo desejado. Tipicamente o produto de amplificação será resolvido com a ajuda da marcação que pode ser preferivelmente ligada ao produto de amplificação. Tipicamente uma substância corante, por exemplo, um corante colorimétrico, fluorescentes cromoméricos ou luminescentes (por exemplo, brometo de etidínio ou verde SYBR) é usado. Em outras modalidades a sonda de oligonucleotídeo marcada que preferivelmente se liga ao produto de amplificação, em

20/44 particular a sonda que se liga preferivelmente a substancialmente todos os ácidos nucleicos amplificados individuais no produto de amplificação, é usada. Uma sonda adequada deve ser com base em uma sequência de nucleotídeo de um ou mais de SEQ ID NOs 1 a 52. Marcações adequadas para a sonda são discutidas acima. Em algumas modalidades a sonda pode ser proporcionada em uma forma não marcada com a marcação ocorrendo após a ligação preferencial ao produto de amplificação, ou ligação preferencial a substancialmente todos os ácidos nucleicos amplificados individuais no produto de amplificação.

Entretanto, em alguns casos um precipitante de ácido nucleico (por exemplo, sal e/ou álcool) pode simplesmente ser usado para fazer com que o produto de amplificação saia da solução e seja visível sem marcar.

Para ajudar a visualização dos componentes, produto de amplificação pode ser dispersado em ou em um suporte sólido, por exemplo, por eletroforese (por exemplo, usando agarose ou géis de poliacrilamida), cromatografia (por exemplo, HPLC, TLC, afinidade, filtragem de gel) ou filtragem, ou uma combinação dos mesmos, antes de ou após contato com a marcação.

Dependendo da marcação usada detecção pode ser produzida mais precisa ao se usar tecnologias de detecção amplamente disponíveis, por exemplo, filmes sensíveis a radiação e tecnologias de imagem digital em combinação com análises de imagem auxiliadas a computador, fotômetros, fluorômetros, colorimetros, contadores de cintilação, e semelhante

Preferivelmente o produto de amplificação é separado a partir do restante da reação de amplificação antes de ser colacada em contato pela marcação, por exemplo, em uma forma de sonda de oligonucleotídeo marcada. Isso pode ser por qualquer meio conveniente, por exemplo, com uma ou mais etapas de lavagem (por exemplo, com água ou uma solução tamponada que pode conter formamida e/ou a detergente), eletroforese, centrifugação, captura em suportes sólidos de ligação a ácido nucleico, cromatografia ou qualquer combinação dos mesmos. De modo conveniente, a sonda pode ser proporcionada em um suporte sólido desse modo efetuando a separação do produto de amplificação a partir do restante da reação de amplificação em uma única etapa. Em outra modalidade a sonda pode portar uma fração de ligação, ou a marcação pode ser uma fração de ligação, que permitirá a manipulação da sonda e qualquer produto de amplificação hibridizado à mesma. Frações de ligação adequadas são discutidas acima.

Preferivelmente qualquer marcação não ligada, por exemplo, na forma de uma sonda de oligonucleotídeo marcada, será separada a partir do produto de amplificação antes da etapa de detecção. Isso pode ser por qualquer meio conveniente, por exemplo, com uma ou mais etapas de lavagem (por exemplo, com água ou uma solução tamponada que pode conter formamida e/ou a detergente), eletroforese, centrifugação, captura em suportes sólidos, cromatografia ou qualquer combinação dos mesmos. Suportes sólidos adequados são des21/44 critos acima.

Se o método de amplificação usado for em si quantitativo, por exemplo, método de amplificaçãos no qual padrões e controles internos são incorporados (por exemplo, qPCR) o método desse aspecto da presente invenção pode também proporcionar dados quantitativos. Nas referidas modalidades o método pode mesmo fixar um valor numérico à quantidade de sequência alvo presente na amostra e assim a quantidade da bactéria contendo a sequência alvo na amostra. Um referido padrão interno seria de amplificar uma ou mais (por exemplo, pelo menos 2, 3, 5, ou 10) amostras que têm quantidades conhecidas da bactéria objetivada pelos oligonucleotídeos do conjunto de sonda ou de quantidades conhecidas de sequência alvo sob as mesmas condições que da amostra de teste para proporcionar uma curva padrão traçando a quantidade do produto de amplificação contra o número de organismos ou quantidade de sequência alvo. A quantidade de produto de amplificação obtida na amostra de teste pode então ser traduzida em um valor numérico para a quantidade de sequência alvo e/ou bactéria contendo a sequência alvo dos oligonucleotídeos do conjunto de sonda na amostra.

Em outras modalidades, o progresso da reação de amplificação pode ser seguido em tempo real e o perfil de amplificação pode ser comparado com os perfis de amplificação a partir das amostras que têm conhecidas quantidades da bactéria objetivada pelos oligonucleotídeos do conjunto de sonda ou de quantidades conhecidas de sequência alvo. Em outras modalidades o limiar do ciclo (C_T) pode ser usado para calcular a quantidade de sequência alvo e portanto as quantidades da bactéria objetivadas pelos oligonucleotídeos do conjunto de sonda na amostra. Em todas qPCRs há um limiar no qual a fluorescência do produto de amplificação é detectada acima do background. O ciclo no qual esse limiar é cruzado é o Ct- na fase exponencial da reação a quantidade de DNA teoricamente dobra a cada ciclo e assim as quantidades relativas de DNA podem ser calculadas entre as amostras ao comparar os valores Ct que se insiram na fase exponencial. Se a comparação é produzida com amostras com uma quantidade conhecida de matriz, a quantidade de matriz na amostra de teste pode ser calculada e a quantidade de sequência alvo dos oligonucleotídeos do conjunto de sonda presente na amostra e assim a quantidade de bactéria contendo a sequência alvo dos oligonucleotídeos do conjunto de sonda na amostra pode ser determinada.

A combinação de uma ou mais das técnicas acima descritas para determinar a quantidade de sequência de nucleotídeo alvo pode ser usada na prática da presente invenção.

O indivíduo pode ser qualquer indivíduo human ou animal não humano, mas mais particularmente pode ser um vertebrado, por exemplo, um mamífero, incluindo animais de fazenda e animais de estimação. Preferivelmente o indivíduo é um ser humano. O indiví22/44 duo pode ser de qualquer idade, por exemplo, um bebê, uma criança, um jovem, um adolescente ou um adulto, preferivelmente um adulto. Em seres humanos, um adulto é considered ser de pelo menos 16 anos de idade e um bebê ser até 2 anos de idade. Em determinadas modalidades o indivíduo será um bebê, em outras ele será uma criança ou um adulto.

Os métodos da presente invenção são métodos in vitro realizados usando qualquer amostra obtida a partir do trato Gl. O trato Gl, também referido como o trato digestivo ou canal alimentar (e cujos termos podem ser usados intercambiavelmente com o trato Gl) é a série contínua de órgãos que se inicia na boca e termina no ânus. Especificamente a referida sequência consiste da boca, a faringe, o esôfago, o estômago, o duodeno, o intestino delgado, o intestino grosso e o ânus. Os referidos órgãos podem ser subdivididos em o trato Gl superior, consistindo da boca, faringe, esôfago, estômago, e duodeno, e o trato Gl inferior, consistindo do jejuno, o íleo (junto com o intestino delgado), o ceco, o cólon, o reto (junto com the intestino grosso) e o ânus.

Uma amostra de trato Gl de uso na presente invenção pode incluir, mas não é limitada a qualquer fluido ou sólido obtido a partir da luz ou superfície do trato Gl ou qualquer amostra de qualquer um dos tecidos que forma os órgãos do trato Gl. Assim a amostra pode ser qualquer conteúdo luminal do trato Gl (por exemplo, conteúdos do estômago, conteúdos intestinais, muco e fezes/excremento, ou combinações dos mesmos) assim como amostras obtidas mecanicamente a partir do trato Gl, por exemplo, por swab, enxágue, aspiração ou raspagem de uma cavidade ou superfície do trato Gl ou por biopsia de um tecido/órgão do trato Gl. Amostras fecais são preferidas. A amostra pode também ser obtida a partir de parte de um tecido/órgão do trato Gl que foi removido cirurgicamente. A amostra pode ser uma porção de tecido/órgão seccionado. Em modalidades onde a amostra é uma amostra de um tecido/órgão do trato Gl a amostra pode compreender uma parte da, a submucosa, a musculatura externa, a adventitia e/ou a serosa do tecido/órgão do trato Gl. As referidas amostras de tecido podem ser obtidas por biópsia durante um procedimento endoscópico. Preferivelmente a amostra é obtida a partir do trato Gl inferior, isto é, a partir do jejuno, do íleo, do ceco, do cólon, do reto ou do ânus. Mais preferivelmente a amostra é uma amostra de mucosa ou luminal. Amostras fecais podem ser coletadas por swab, enxágue, aspiração ou raspagem do reto ou do ânus ou, mais simplesmente, a coleta de fezes após a defecação.

A amostra pode ser usada nos métodos da presente invenção na forma na qual a mesma foi inicialmente coletada. A amostra pode também ter sofrido algum grau de manipulação, refinamento ou purificação antes de ser usada nos métodos da presente invenção. Assim o termo amostra também inclui preparações das mesmas, por exemplo, materiais de partida relativamente puros ou parcialmente purificados, tal como preparações semipuras das amostras acima mencionadas. O termo amostra também inclui preparações de amos23/44 tras acima mencionadas nas quais o RNA da qual, incluindo o rRNA 16S, sofreu transcrição reversa.

A purificação pode ser leve, por exemplo, equivalente a não mais do que a concentração dos sólidos, ou células, da amostra em um menor volume ou a separação de células a partir de alguma ou de todo o restante da amostra. Técnicas de isolamento de célula representativas são descritas em WO 98/51693 e WO 01/53525.

Em outras modalidades a presente invenção usa uma preparação do ácido nucleico a partir das amostras acima mencionadas, preferivelmente uma preparação na qual os ácidos nucleicos foram marcados. As referidas preparações incluem os produtos de transcrição reversa e/ou amplificação de produtos das referidas amostras ou preparações de ácido nucleico dos mesmos. Preferivelmente o ácido nucleico predominante da preparação de ácido nucleico é DNA.

Técnicas para o isolamento de ácido nucleico a partir de amostras, incluindo amostras complexas, são numerosas e bem conhecidas na técnica e descritas extensamente na literatura. As técnicas descritas em WO 98/51693 e WO 01/53525 podem também ser empregadas para preparar ácidos nucleicos a partir das amostras acima mencionadas. As referidas preparações incluem preparações de ácido nucleico relativamente puras ou parcialmente purificadas.

Preferivelmente a reação de amplificação realizada na amostra será universal, ou substancialmente universal, em que o ácido nucleico a ser amplificado, isto é, a região de rRNA 16S ou rDNA 16S incorporando as sequências alvo acima discutidas, é amplificada a partir de todas, ou pelo menos substancialmente todas, células procarióticas that deve ser presente na amostra. O termo amplificação a partir de substancialmente todas células procarióticas presente na amostra se refere a o número de diferente espécies de células procarióticas na amostra que terão o ácido nucleico a ser amplificado, amplificados. Assim, na referida modalidade o ácido nucleico a ser amplificado é amplificado a partir de pelo menos uma representativa de substancialmente todas as espécies de células procarióticas na amostra.

Por célula procariótica se quer dizer que qualquer organismo que seja desprovido de células de núcleo, isto é, qualquer organismo a partir dos domínios Bactéria e Archaea.

De modo conveniente a referida amplificação universal pode ser realizada usando a primer direto objetivando a região conservada entre V2 e V3 (por exemplo, como descrito em Nadkarni et al., 2002. Microbiology 148, 257-266) com um primer reverso objetivando a terminação 3’ do gene de rRNA 16S (por exemplo, os descritas em Weisburg et al., 1991, J Bacteriol 173, 697-703). Em outras modalidades a referida amplificação universal pode ser realizada usando um par de primer tendo as sequências TCC TAC GGG AGG GAG CAG (SEQ ID NO 53), também referido como MangalaF-1, e CGG TTA CGT TGT TAG GAC TT

24/44 (SEQ ID NO 54), também referido como 16SU1510R. O referido par de primer é descrito em mais detalhes em US 2011/0104692.

A sequência de nucleotídeo alvo a ser amplificada na referida modalidade é portanto presente em rRNA 16S e no correspondente gene de rRNA 16S (rDNA). Assim, referên5 cia à amplificação da referida sequência de nucleotídeo alvo é a referência a um aumento no número de ácidos nucleicos que contêm aquela sequência de nucleotídeos sem limitação no tipo de ácidos nucleicos contendo a sequência de nucleotídeo. Preferivelmente os referidos ácidos nucleicos serão marcados. Tipicamente, o ácido nucleico que é formado como o produto de amplificação é DNA, embora a sequência de nucleotídeo contida naquele ácido 10 nucleico ainda será a mesma que aquela da sequência de nucleotídeo alvo, ou o complemento do mesmo.

De modo conveniente, essa modalidade da presente invenção será realizada com rDNA 16S, por exemplo, um gene de rRNA 16S, as the matriz.

Em outras modalidades rRNA 16S pode ser a fonte da sequência de nucleotídeo 15 alvo a ser amplificada. Quando a sequência de nucleotídeo alvo a partir de rRNA 16S é amplificada na referida modalidade do método da presente invenção haverá uma etapa na qual uma Polimerase de DNA dependente de RNA catalisa a formação de uma molécula de DNA complementar à matriz de rRNA 16S (cDNA). O referido processo é denominado transcrição reversa. Mais especificamente a polimerase de DNA dependente de RNA ca20 talisa a polimerização de deoxiribonucleosídeo trifosfatos na sequência que é complementar (isto é, em seguida das regras de pareamento de base de Watson-Crick) a uma sequência de rRNA de matriz iniciada.

Numerosas enzimas foram identificadas que têm a capacidade de catalisar a referida reação e exemplos incluem, mas não são limitados a, transcriptase reversa de HIV, 25 transcriptase reversa de AMV, transcriptase reversa de M-MLV, C. therm, polimerase, e Tth polimerase. No seu sentido mais básico a completa mistura de reação de transcrição invertida conterá a enzima de transcrição reversa, a matriz de rRNA, primers adequados que podem se ligar a matriz e a partir dos quais a transcriptase reversa pode iniciar a polimerização, dNTP's e um tampão adequado. A incubação da mistura na temperatura de trabalho 30 da transcriptase reversa resulta na produção de cDNA.

Com a conclusão da reação de transcrição invertida o cDNA pode ser usado como a matriz na modalidade do método da presente invenção descrito acima. O cDNA portanto tem uma sequência de nucleotídeo que é complementar à molécula de rRNA que foi a sua matriz. Ademais o cDNA tem uma sequência de nucleotídeo que é a mesma que a sequên35 cia de nucleotídeo contida em um filamento do gene da matriz de rRNA e o cDNA é complementar a uma sequência de nucleotídeo contida no outro filamento do gene da matriz de rRNA.

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Como mencionado acima, em modalidades do método da presente invenção na qual ácido nucleico é amplificado em uma etapa precedente, se rRNA 16S é usado como a fonte da sequência de nucleotídeo alvo (diferente de rDNA 16S, por exemplo, um gene de rRNA 16S) uma etapa inicial de transcrição reversa é necessária. Reações de amplificação 5 ligadas a transcrição reversa, em particular PCR, podem ser processos em uma etapa ou duas etapas. Em um processo de uma etapa os componentes da reação de transcrição invertida e a reação de amplificação de ácido nucleico estão presentes em um único frasco de reação e tipicamente as condições de reação precoces são selecionadas para permitir que a reação de transcrição invertida prossiga para a conclusão e as condições de reação 10 são então mudadas para as condições adequadas para permitir que a reação de amplificação de ácido nucleico prossiga.

Em um processo de duas etapas os componentes da reação de transcrição invertida são primeiro combinados e a reação de transcrição invertida é realizada. O produto de transcrição reversa é então combinado com os componentes da reação de amplificação e 15 submetido a uma reação de amplificação. Em um protocolo de duas etapas um tubo os componentes da reação de amplificação são adicionados ao mesmo frasco de reação no qual a reação de transcrição invertida foi realizada. Em um protocolo de duas etaoas e dois tubos” a reação de amplificação é realizada em um frasco de reação fresco.

Muitas doenças e condições, ou estágios das mesmas, acredita-se que estejam li20 gadas a perfis característicos do microbiota do trato Gl ou o microbiota de the regiões/partes dos mesmos, por exemplo, os descritos acima. Em alguns casos a doença ou condição pode ser causada por, ou é exacerbada por, perturbações no perfil do microbiota do trato Gl ou de regiões/partes dos mesmos. Em outros casos a doença ou condição ocasiona, ou por algum mecanismo resulta em, exibição de um perfil particular do microbiota do trato Gl ou 25 de regiões/partes do mesmo. Assim sendo, ao analisar os perfis de microbiota em amostras do trato de Gl, informação pode ser proporcionada a qual permite o diagnóstico de uma doença ou condição, ou que permite uma avaliação do risco de desenvolver uma doença ou condição, que foi determinada ser caracterizada por um perfil particular de microbiota. O conjunto de sonda da presente invenção pode portanto ser usado para preparar perfis pa30 drões de microbiota do trato Gl que são característicos de uma doença ou condição, ou estágio dos mesmos, ou o risco de desenvolver uma doença ou condição. O perfil pode também ser de uso em prognóstico de doenças e o monitoramento de doença.

Assim em outro aspecto a presente invenção proporciona um método de preparar um perfil padrão de microbiota do trato Gl que é característico de uma doença ou condição 35 ou um estágio da mesma ou o risco de desenvolver uma doença ou condição, o referido método compreendendo:

(i) identificar um indivíduo com a referida doença ou condição ou estágio da mesma

26/44 ou estando em risco de desenvolver a referida doença ou condição e colocar em contato a amostra a partir do trato Gl do referido indivíduo com um conjunto de sonda de oligonucleotídeo como definido acima;

Um perfil do microbiota do trato Gl do indivíduo é desse modo gerado a partir das quantidades da sequência alvo para cada oligonucleotídeo presente na referida amostra e o perfil é característico da referida doença ou condição (ou estágio da mesma) ou o risco de desenvolver a referida doença ou condição.

Once a perfil padrão foi obtido para uma doença particular ou condição ou risco de ser desenvolvida, tipicamente após se traçar o perfil de uma pluralidade de amostras a partir de uma pluralidade de indivíduos com a mesma doença ou condição ou estágio da mesma, o referido perfil pode ser usado como a base de um processo de diagnóstico para determinar se um indivíduo adicional está sofrendo a partir de, ou em risco de desenvolver, a referida doença ou condição, ou para determinar o progresso ou extensão do início da referida doença ou condição para fins de prognóstico. O perfil padrão pode ser proporcionado digitalmente, por exemplo, em meio digital ou via transferência eletrônica ao usuário. Em outras modalidades um sistema pode estssar em um lugar no qual o perfil obtido a partir do indivíduo em teste contribui para o desenvolvimento do perfil padrão.

Em um aspecto adicional a presente invenção proporciona um método de diagnóstico ou monitoramento de uma doença ou condição em um indivíduo ou de prever ou avaliar o risco de um indivíduo desenvolver uma doença ou condição, o referido método compreende:

(a) traçar o perfil do microbiota do trato Gl de um indivíduo como descrito acima (b1) comparar o referido perfil a um perfil padrão de microbiota do trato Gl que é característico de uma doença ou condição ou a estágio da mesma ou o risco de desenvolver uma doença ou condição e/ou (b2) comparar o referido perfil a um perfil de microbiota do trato Gl anterior do indivíduo; e (c) determinar o grau de correlação entre os referidos perfis.

Na referida modalidade o referido grau de correlação é indicativo da presença ou ausência da referida doença ou condição, ou do risco desenvolver a referida doença ou condição, ou do progresso da doença ou condição.

Em um aspecto adicional a presente invenção também proporciona um método de

27/44 diagnóstico ou monitoramento de uma doença ou condição em um indivíduo ou prever ou avaliar o risco de um indivíduo desenvolver uma doença ou condição, o referido método compreendendo:

(a) comparar os resultados de um método como descrito acima a um perfil padrão de microbiota do trato Gl que é característico de uma doença ou condição ou a estágio da mesma ou o risco de desenvolver uma doença ou condição e/ou (a2) comparar os resultados de um método como descrito acima a um perfil anterior de microbiota do trato Gl do indivíduo, e (b) determinar o grau de correlação entre os referidos perfis, em que o grau de correlação é indicativo de the presença ou ausência da referida doença ou condição, ou o risco de desenvolver a referida doença ou condição, ou o progresso da doença ou condição.

Preferivelmente o perfil ao qual o perfil do indivíduo sob teste é comparado a será um perfil preparado de acordo com a presente invenção. Esse pode ser um perfil preparado, ou pode ser a perfil preparado ao mesmo ou substancialmente ao mesmo tempo em que a amostra sob investigação está sendo analisada.

Diagnose se refere à determinação da presença ou existência de uma doença ou condição ou estágio da mesma em um organismo. Monitoramento se refere a estabelecimento da extensão de, ou de possíveis mudanças em. Uma doença ou condição, particularmente quando um indivíduo é conhecido por sofrer de uma doença ou condição, por exemplo, para monitorar os efeitos do tratamento ou do desenvolvimento de uma doença ou condição, por exemplo, para determinar a sua adequadabilidade a um tratamento, para proporcionar um prognostico, e/ou para determinar se um paciente está em remissão ou relapso.

Avaliar o risco de um indivíduo desenvolver uma doença ou condição se refere a determinação da chance ou probabilidade do indivíduo desenvolver a doença ou condição. Isso pode ser expresso como uma probabilidade numérica em algumas modalidades. A avaliação de risco pode ser em virtude da extensão na qual a correlação é vista entre o perfil da amostra a partir de um indivíduo sob investigação e o perfil de uma doença ou condição, ou a correlação entre o perfil da amostra a partir de um indivíduo sob investigação e o perfil considerado ser característico da amostra a partir de um indivíduo determinado como tendo um nível particular de risco de desenvolver uma doença ou condição.

Doença se refere a um estado de distúrbio patológico relativo ao normal que pode resultar, por exemplo, de infecção ou de uma imperfeição adquirida ou genética congênita.

A condição se refere a um estado da mente ou do corpo de um organismo que não ocorreu através de doença, por exemplo, a presença de an agente no corpo tal como uma toxina, fármaco ou poluente, ou gravidez.

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Estágio da mesma se refere a diferentes estágios de uma doença ou condição que pode ou não exibir mudanças fisiológicas ou metabólicas particulares, mas exibem mudanças no perfil do trato Gl microbiota. Em algumas modalidades as diferenças observadas no perfil de microbiota do trato Gl pode levar a uma classificação do progresso anteriormente não observada de uma doença ou condição.

Os dados gerados usando os métodos acima mencionados podem ser analisados usando várias técnicas, a partir da representação visual mais básica (por exemplo, relativa a intensidade do sinal) a dados de manipulação mais complexos, que podem ser quantificados e expressos matematicamente, para preparar os perfis de microbiota do trato Gl que refletem a interrelação dos níveis relativos de cada sequência alvo a qual as várias sondas se ligam (e desse modo os níveis relativos de bactéria contendo a sequência alvo à qual as várias sondas se ligam). De modo conveniente, os ddados brutos assim gerados podem ser manipulados por métodos de processamento de dados e estatísticos, particularmente normalisação e padronização de dados, e interrogar os dados estatisticamente para determinar se os referidos dados refletem o perfil da doença particular, condição ou estágio da mesma. Aquele versado na técnica observará as técnicas estatísticas adequadas a usar. Preferivelmente a técnica estatística irá proporcionar um valor P como uma indicação de que a tendência sendo observada não é uma tendência aleatória. Um resultado estatisticamente significante, isto é, um resultado que não é atribuível a uma variação aleatória quando comparado ao seu controle, terá um valor P de < 0,05, preferivelmente < 0,01, < 0,005 ou < 0,001. Meramente como exemplo, técnicas adequadas para medir a significância estatística nos métodos da presente invenção são os testes ANOVA, Mann-Whitney-Wilcoxon (MWW), Kruskal-Wallis Test e Tuke/s Honestly Significant Differences (HSD). Muitos outros serão familiares para aqueles versados na técnica. Em algumas modalidades um teste de permutação deve ser apropriado, por exemplo, o descrito por Langsrud (2002, Journal of The Royal Statistical Society Series D 51, 305-317).

As doenças e condições que podem ser investigadas usando os métodos da presente invenção não são limitadas, embora os aspectos de diagnóstico da presente invenção se baseiam em ter a presença de um perfil consistente de microbiota do trato Gl que é característico da doença ou condição sob investigação. Doenças e condições que afetam o trato Gl são muito propensas em resultar em perfis característicos de microbiota, por exemplo, Doença Inflamatória Intestinal (IBD), doença de Crohn (CD), colite ulcerativa (UC), Síndrome do Intestino Irritável (IBS) e cânceres do trato Gl (por exemplo, câncer de boca, faringe, esôfago, estômago, duodeno, jejuno, íleo, ceco, cólon, reto ou ânus) e também existe evidência de ligações entre microbiota do trato Gl e as doenças e condições que são consideradas não estar relacionadas ao trato gastrointestinal, por exemplo, as doenças atópicas, por exemplo, eczema, asma, dermatite atópica, rinite conjuntivite alérgica e alergias alimen29/44 tares, distúrbios metabólicos, por exemplo, diabetes mellitus (tipo 1 e tipo 2), obesidade e síndrome metabólica, desordens neurológicas, por exemplo, depressão, esclerose múltipla, demência e doença de Alzhiemer e autismo. Qualquer uma das referidas doenças ou condições pode ser diagnostica ou monitorada de acordo com a presente invenção.

O método de diagnóstico pode ser usado isoladamente como uma alternativa a outras técnicas de diagnóstico ou além das referidas técnicas. Por exemplo, os métodos da presente invenção podem ser usados como uma alternativa ou medica adicional de diagnóstico ao diagnóstico usando técnicas de imageamento tal como Imagens por Ressonância Magnética (MRI), imagens por ultrassom, imagens nucleares, imagens de raio-X ou endoscopia.

Assim, em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona um método de obter informação relevante ao diagnóstico ou monitoramento de uma doença ou condição ou a avaliação do risco de desenvolver uma doença ou condição que compreende um método de traçar o perfil do microbiota do trato Gl de um indivíduo como definido acima.

Em um aspecto adicional a presente invenção proporciona kits que compreendem o conjunto de sonda como definido aqui.

Em um aspecto adicional a presente invenção proporciona o uso do conjunto de sonda definido aqui na fabricação dis kits como definidos aqui.

Os kits da presente invenção podem ser designados para uso nos métodos da presente invenção e podem compreender componentes adicionais. Cada componente pode ser proporcionado em um compartimento ou recipiente separado. Onde conveniente e prático, misturas de componentes podem ser proporcionadas. Os componentes podem ser proporcionados em forma seca, por exemplo, cristalizada, seca por congelamento ou liofilizada, ou em solução, tipicamente as referidas composições líquidas serão aquosas e tamponadas com um tampão padrão tal como Tris, HEPES, etc.

O kit pode também ser proporcionado com instruções para uso do kit, ou com direções de como as instruções podem ser obtidas.

Os componentes adicionais podem ser qualquer um de vários componentes que podem ser usados para por os métodos da presente invenção em efeito, por exemplo, qualquer componente discutido acima. Em uma modalidade preferida o kit compreende adicionalmente meios para a marcação seletiva das sondas de oligonucleotídeo. Em uma modalidade preferida o kit compreende adicionalmente suportes sólidos adequados nos quais os oligonucleotídeos do conjunto de sonda da presente invenção podem ser imobilizados, por exemplo, qualquer um dos referidos suportes sólidos descritos aqui. Em outras modalidades alguns ou todos os oligonucleotídeos do conjunto de sonda da presente invenção são fornecidos no kit em forma imobilizada.

Componentes adicionais devem opcionalmente ser qualquer ou todos os meios, por

30/44 exemplo, tampões, enzimas etc., para realizar uma amplificação e/ou reação de extensão de primer com os oligonucleotídeos da presente invenção. Por exemplo, os kits podem opcionalmente conter um tampão de reação de PCR, nucleotídeo trifosfatos, primers de oligonucleotídeos adicionais, ou DNA polimerases, preferivelmente uma polimerase termoestável tal como Taq polimerase.

Componentes adicionais devem opcionalmente ser qualquer ou todos os meios, por exemplo, tampões, enzimas etc. para realizar a reação de transcrição invertida. Por exemplo, uma transcriptase reversa, primeris específicos de RNA, um tampão de reação de RT, e nucleotídeo trifosfatos.

Componentes adicionais devem opcionalmente ser qualquer ou todos os meios para obter a amostra. Por exemplo, o referido meio deve incluir varetas de medição, aparelho de biópsia, dispositivos de swab, bolsos ou recipientes. Preferivelmente os referidos meios serão proporcionados na forma estéril.

Componentes adicionais devem opcionalmente ser qualquer ou todos os meios para purificar ou refinar a amostra. Por exemplo, meios para isolar ou concentrar as células na amostra, por exemplo, suportes sólidos de ligacoa de célula ou dispositivo de filtragem. Em outras modalidades os meios para purificar ou refinar a amostra devem ser qualquer ou todos os meios para extrair ácido nucleico a partir da amostra. Por exemplo, reagentes de lise celular (por exemplo, sais caotrópicos, álcoois, detergentes, compostos de alteração de membrana), suportes sólidos de ligação de ácido nucleico (por exemplo, como descrito acima) ou agentes de precipitação de ácido nucleico (por exemplo, sais, álcoois)

Componentes adicionais devem opcionalmente ser qualquer ou todos os meios para detectar ácido nucleico amplificado. Por exemplo, as marcações descritas aqui (por exemplo, corantes de ligacoa a DNa de dupla fita, sondas marcadas de oligonucleotídeo), aparelhos para detectar as referidas marcações, materiais e aparelho de eletroforese, ou materiais e aparelho de cromatografia.

Componentes adicionais devem opcionalmente ser oligonucleotídeos adicionais que seletivamente hibridizam para objetivar ácidos nucleicos indicativos de qualquer outra doença ou condição médica, particularmente condições associadas com o microbiota gastrointestinal (por exemplo, CD, IBS, UC, IBD) e que pode assim ser usado em um modo similar aos oligonucleotídeos da presente invenção para proporcionar informação relevante para um diagnóstico de qualquer outra doença ou condição médica, particularmente condições associadas com o microbiota gastrointestinal (por exemplo, CD, IBS, UC, IBD). Os referidos oligonucleotídeos podem ser considerados uma parte do conjunto de sonda da presente invenção.

A presente invenção será adicionalmente descrita com referência aos exemplos não limitantes a seguir, nos quais:

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A figura 1 mostra o desenvolvimento no tempo do filo bacteriano em crianças sensibilizadas e não sensibilizadas. Sinal de Log médio para cada sonda é mostrado como uma linha completa, enquanto o sinal de log de todos os pontos de tempo medidos é mostrado como pontos (níveis acima de um limiar de sinal de 50, denotado por linhas pontilhadas).

Linhas e pontos cinza escuro são para crianças sensibilizadas, enquanto linhas e pontos cinza claro são para crianças não sensibilizadas. Valores < 0 são ajustados em 0,001 antes da transformação de log.

A figura 2 mostra o desenvolvimento no tempo de gênero/espécies bacteriana em crianças sensibilizadas e não sensibilizadas. Sinal de Log médio para cada sonda é mostra10 do como uma linha completa, enquanto o sinal de log de todos os pontos de tempo medidos é mostrado como pontos (níveis acima de um limiar de sinal de 50 são denotados por linhas pontilhadas). Linhas e pontos cinza escuro são para crianças sensibilizadas, enquanto linhas e pontos cinza claro são para crianças não sensibilizadas. Valores < 0 são ajustados em 0,001 antes da transformação de log. Sondas com sinal máximo abaixo do limiar não 15 são mostradas.

Tabela 1

Sequência de sonda	SEQ ID NO	Bactéria alvo (descrição geral)
TTGCGGCTCAACCGTAAAATTG	SEQ ID NO 5	Bacteroides
CAAI I I IACGGTTGAGCCGCAA	SEQ ID NO 31	Bacteroides
GCACTCAAGACATCCAGTATCAACTG	SEQ ID NO 6	Bacteroides (dorei, fragilis, thetaiotaomicron, vulgatus)
CAGTTGATACTGGATGTCTTGAGTGC	SEQ ID NO 32	Bacteroides (dorei, fragilis, thetaiotaomicron, vulgatus)
AGGGCAGTCATCCTTCACG	SEQ ID NO 7	Bacteroides (dorei, fragilis, thetaiotaomicron, vulgatus)
CGTGAAGGATGACTGCCCT	SEQ ID NO 33	Bacteroides (dorei, fragilis, thetaiotaomicron, vulgatus)
CAATCGGAGTTCTTCGTGATATCTAAG	SEQ ID NO 8	Bacteroides
CTTAGATATCACGAAGAACTCCGATTG	SEQ ID NO 34	Bacteroides

Tabela 2

Sequência de sonda	SEQ ID NO	Bactéria alvo (descrição geral)
TGTTGTGGTTAATAACCGCAGCAATTGA	SEQ ID NO 9	Salmonella, Enterobacter, Citrobacter, Cronobacter
TCAATTGCTGCGGTTATTAACCACAACA	SEQ ID NO 35	Salmonella, Enterobacter, Citrobacter, Cronobacter

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TCCAATGACCCTCCC	SEQ ID NO 10	Enterococcus, Listeria
GGGAGGGTCATTGGA	SEQ ID NO 36	Enterococcus, Listeria
CACTCTCACACCCGTT	SEQ ID NO 11	Streptococcus sanguinis
AACGGGTGTGAGAGTG	SEQ ID NO 37	Streptococcus sanguinis
GTTGCTCGGTCAGACTT	SEQ ID NO 12	Streptococcus, Enterococcus
AAGTCTGACCGAGCAAC	SEQ ID NO 38	Streptococcus, Enterococcus
CGTGGCTTTCTGATTAGGTA	SEQ ID NO 13	Staphilococcus
TACCTAATCAGAAAGCCACG	SEQ ID NO 39	Staphilococcus
TGCTTATTCAACGGGTAAACT	SEQ ID NO 14	Bifidobacterium longum
AGTTTACCCGTTGAATAAGCA	SEQ ID NO 40	Bifidobacterium longum
CCGTCACTCGGCTACCATTTC	SEQ ID NO 15	Clostridium ramosum
GAAATGGTAGCCGAGTGACGG	SEQ ID NO 41	Clostridium ramosum
GAI 1 1 1CCACTCCCACCAT	SEQ ID NO 16	Streptococcus pyogenes
ATGGTGGGAGTGGAAAATC	SEQ ID NO 42	Streptococcus pyogenes
CCGTCAAGGGACAAG	SEQ ID NO 17	Listeria monocytogenes
CTTGTCCCTTGACGG	SEQ ID NO 43	Listeria monocytogenes
CGGTGCTTATTCGAAAGGTACACT	SEQ ID NO 18	Bifidobacterium, breve
AGTGTACCTTTCGAATAAGCACCG	SEQ ID NO 44	Bifidobacterium, breve

Tabela 3

Sequência de sonda	SEQ ID NO	Bactéria alvo geral)	(descrição
CGCCTGCCTCAAACATA	SEQ ID NO 19	Parabacteroides
TATGTTTGAGGCAGGCG	SEQ ID NO 45	Parabacteroides
CAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGAT	SEQ ID NO 20	Gama-proteobacteria
ATCTCTACGCATTTCACCGCTACACCTG	SEQ ID NO 46	Gama-proteobacteria
ACGCTCGCACC	SEQ ID NO 21	Haemophilus
GGTGCGAGCGT	SEQ ID NO 47	Haemophilus
CGGGGATTTCACATCTGA	SEQ ID NO 22	Subgrupo proteobacteria	Gama-
TCAGATGTGAAATCCCCG	SEQ ID NO 48	Subgrupo proteobacteria	Gama-
TGCCAGTTTCGAATGCAGTT	SEQ ID NO 23	Subgrupo proteobacteria	Gama-
AACTGCATTCGAAACTGGCA	SEQ ID NO 49	Subgrupo proteobacteria	Gama-

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GTGCTTCTTCTGCGGGTAA	SEQ ID NO 24	Subgrupo proteobacteria	Gama-
TTACCCGCAGAAGAAGCAC	SEQ ID NO 50	Subgrupo proteobacteria	Gama-
GCTACACATGGAGTTCCA	SEQ ID NO 25	Lactobacillus subgroup
TGGAACTCCATGTGTAGC	SEQ ID NO 51	Lactobacillus subgroup
CGTAGTTAGCCGTGG	SEQ ID NO 26	Clostridium neonatale
CCACGGCTAACTACG	SEQ ID NO 52	Clostridium neonatale

EXEMPLO 1

O objetivo do presente trabalho foi de se comparar prospectivamente o desenvolvimento do microbiota dominante em crianças sensibilizadas a IgE e crianças não sensibilizadas durante os dois primerios anos de vida. De modo a realizar isso e outras tarefas relacionadas a microbiota do intestino, uma ferramenta para rapidamente ler a complexidade e a composição da bactéria em amostras de excremento foi necessária. Portanto foi desenvolvida uma microestrutura de gene rRNA 16S de alta produtividade para criança, chamada teste GA-map para criança. As análises de microestrutura foram realizadas em um subconjunto selecionado da coorte de IM-PACT. IgE específicos foram escolhidos como um marcador de atopia, uma vez que foi anteriormente mostrado que o referido marcador está correlacionado a bactéria intestinal (resultados não publicados).

A diferença principal entre as abordagens de GA-map para crianças e a alternativa de gene de rRNA 16S é o uso de sondas de extensão de primer de um único nucleotídeo altamente específico (SNuPE) para discriminação de alvo/não alvo. A alta especificidade do teste SNuPE é obtida por DNA polimerase com base em incorporação de um dideoxinucleotídeo fluorescentemente marcado. As sondas SNuPE são construídas de modo que as sondas hibridizam adjacente as posições de gene discriminativas. Para reduzir a complexidade e para aumentar produtividade, o teste GA-map para crianças foi objetivado para bactéria que se espera colonizar o intestino de uma criança. As sondas foram selecionadas com base em critérios de número mínimo de sondas cobrindo a diversidade eesperada de bactérias no intestinod e uma criança.

Materiais e métodos

Coorte

O estudo de Prevenção de Alergia Entre Crianças em Trondheim (PACT) é uma grande população com base em um estudod e intervenção em Norway focado em alergia infantil. As amostras incluídas aqui são um subconjunto a partir do estudo de PACT, onde foram obtidas medições de imunologia e microbiologia. Para as famílias de subestudo médicos e parteiras em Trondheim participaram no recrutamento de uma população não selecionada de mulheres durante as consultas de acompanhamento comum em estágio precoce de

34/44 gravidez até que 720 concordaram em participar. As mulheres preencheram um questionário em fatores de risco durante a gravidez, em seis semanas após o parto, em um e dois anos após ter dadoa a luz. As perguntas foram relativas a alergia em família, condições de alojamento, dieta e estilo de vida, e após o nascimento em amamentação, suplementos alimentares, dieta, infecções, vacinas, antibióticosestadia em centros de cuidados e exposição a nicotina. Quando as crianças completaram dois anos, outro questionário sobre saúde e doença foi realizado. A sensibilização atópica foi avaliada como elevada específicas IgE (> 0.35 kU/mL) em soro usando um teste para uma faixa de alergenos (Immulite 2000 Allergenspecific IgE system, Siemens Medicai Soluçãos Diagnostics). O coorte foi inicialmente analisado para doze bactérias específicas por PCR quantitativo (resultados não publicados). Aqui, foi selecionada uma faixa de crianças para o teste de GA-map em crianças em profundidade com base no número de amostras, e estado de sensibilização. Um total de 16 chancas sensibilizadas e 31 chancas não sensibilizadas foi selecionado, representando um total de 216 amostras fecais.

Preparação da Amostra e amplificação por PCR

As fezes foram coletadas a partir de um guardanapo e transferidas a um meio de transporte Carry Blair pelos pais, armazenadas imediatamente a -18 °C em casa antes de serem transportadas para um armazenamento permanente a -80 °C até análise posterior. A lise mecânica foi usada para o rompimento celular, e um método automatizado magnético com base em conta foi usado para a purificação do DNA.

Foi combinado o uso de um primer direto objetivando a região conservada entre V2 e V3 (Nadkarni et al., 2002. Microbiology 148, 257-266.) com a primer reverso objetivando a terminação 3’ do gene de rRNA 16S (Weisburg et al., 1991, J Bacteriol 173, 697-703). Foi usado 1.5 U HotFirePol (Solis Biodyne, Tartu, Estonia), tampão 1 χ Β2 (Solis Biodyne), 2,5 mM de MgCI₂ (Solis Biodyne), 200 μΜ de dNTP (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA), 0,2 μΜ de cada primer direto e reverso e aproximadamente 10 a 50 ng de matriz em um volume total de 25 μΙ_. Uma das amostras foi amplificada três vezes para examinar a reprodutibilidade da reação de PCR (descrita em detalhes adicionais sob a seção de Eletroforese Capilar). O protocolo de amplificação incluído em um estágio de ativação a 15 min a 95 °C, seguido por 30 ciclos com 30 sec de desnaturação a 95 °C, 30 sec de recozimento a 55 °C e 90 sec de extensão a 72 °C. Um alongamento final por 7 min a 72 °C foi incluído para a conclusão de todos os produtos PCR.

Para os testes iniciais da estrutura, gene de rRNA 16S PCR foi realizado em DNA bacteriano a partir de culturas puras de 26 cepas listadas na Tabela 4, e os produtos PCR foram testados no teste de GA-map para crianças a jusante. As cepas foram sequenciadas para confirmar a identidade das mesmas e possíveis mutações (números de acesso de sequência são listados na Tabela 4). Um controle positivo consistindo de uma mistura de DNA

35/44 a partir de culturas puras de 8 cepas bacterianas relevantes assim como um controle negativo consistindo de H₂O foi incluído durante a reação de gene de rRNA 16S PCR e o teste de

GA-map de crianças à jusante. Os controles positivos foram usados como um controle de qualidade da reação de marcação e hibridização dos testes (resultados não mostrados).

Desenho de um teste de GA-map para crianças

O teste de GA-map é com base no princípio de uma única extensão de nucleotídeo (SNupE) em combinação com microestrutura de hibridização (Rudi et al., 1998, Appl Environ Microbiol 64, 2639-2643)

As cepas bacterianas mostradas na Tabela 4 foram usadas para a validação da 10 sonda. Para a construção da sonda foi usada um conjunto de dados combinados consistindo de um total de 3580 sequências de gene de rRNA 16S (Palmer et al., 2007, PLoS Biology 5, e177; Rudi et al., 2007, Appl Environ Microbiol 73, 2727-2734), além de um conjunto de patógenos conhecidos.

Tabela 4. Cepas bacterianas usadas para avaliação da sonda

Classe	Espécies	Cepa	Acesso #
Actinobacteria	Bifidobacterium breve	DSM20213	HQ012023
	Bifidobacterium longum subsp. infantis	DSM20088	HQ012021
	Bifidobacterium longum subsp. longum	DSM20219	HQ012022
Bacteroidetes	Bacteroides dorei	DSM17855	HQ012025
	Bacteroides fragilis	DSM2151	HQ012027
	Bacteroides thetaiotaomicron	DSM2079	HQ012026
	Bacteroides vulgatus	DSM 1447	HQ012024
	Parabacteroides distasonis	DSM 20701	N/A
Firmicutes	Clostridium perfringens	DSM756	HQ012013
	Clostridium ramosum	DSM 1402	HQ012012
	Enterococcus faecalis	DSM20478	HQ012029
	Enterococcus faecium	DSM20477	HQ012007
	Lactobacillus acidophilus	DSM20079	HQ012028
	Lactobacillus rhamnosus	DSM20021	HQ012008
	Listeria monocytogenes	DSM20600	HQ012006
	Staphilococcus aureus subsp. aureus	DSM20231	HQ012011
	Streptococcus pneumoniae	DSM20566	HQ012009
	Streptococcus pyogenes	DSM20565	HQ012030
	Streptococcus sanguinis	DSM20567	HQ012010
	Veillonella atypical	DSM20739	HQ012015
	Veillonella dispar	DSM20735	HQ012014

36/44

Proteobacteria	Escherichia coli	DSM30083	HQ012019
	Haemophilus parainfluenzae	DSM8978	HQ012020
	Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae	DSM30104	HQ012018
	Salmonella bongori	DSM13772	HQ012016
	Salmonella enterica subsp. enterica	DSM17058	HQ012017

Foram usados um processo de quatro etapas para o projeto das sondas. 1) primeiro, foi definido um conjunto de grupos alvo e não alvo com base em um sistema de classificação de coordenadas. 2) a próxima etapa foi de identificar as sondas que satisfazem os critérios de detecção de alvo e exclusão de não alvo. Isso foi com base em uma combinação de critérios de hibridização e marcação. Todas as sondas foram designadas com um mínimo

Tm de 60 °C para o grupo alvo, enquanto o grupo não alvo deve ter um Tm de < 30 °C, ou a ausência de uma citosina como o nucleotídeo adjacente à terminação 3’ da sonda. Todas as sondas que satisfizeram o critério foram identificadas. 3) então as sondas de marcação cruzada potencial ou sondas de auto marcação foram avaliadas, além do potencial para hibridização cruzada em uma estrutura. 4) Finalmente, ao se combinar o conhecimento sobre grupos alvo/não alvo e compatibilidade para cada uma das sondas estruturas finais foram designadas usando uma abordagme hierárquica.

Um gene universal de sonda rRNA 16S sonda (UNI01) foi incluído no conjunto de sonda para medir a abundância total de DNA bacteriano na amostra. Uma sonda adicional foi adicionada na etapa de hibridização: uma mistura de 1:4 de sonda de controle de hibridização pré-marcada e não marcada (HYC01). HYC01 é usado para medir a eficiência da etapa de hibridização na lâmina e para normalizar os sinais da sonda entre as lâminas. As microestruturas usadas no teste GA map para criança foram produzidas por Arraylt (Arraylt, Sunnyvale, USA). Uma lâmina de vidro contém 24 microestruturas idênticas separadas, e as sondas (complementares às sondas listadas na Tabela 5) foram ponteadas em triplicata em cada estrutura. Ademais, as estruturas também incluíram duas sondas de controle de não ligação (NBC01, NBC02) (Sanguin et al., 2006, Environmental Microbiology 8, 289-307).

Tabela 5. Sondas incluídas no Conjunto de sonda 3

Sonda ID	Grupos taxonômicos detectados	Sequência de sonda	Falso +ve/ falso -ve	SEQ NO	ID	Sinai correto médio	Sinal correto Std
1_1	Bacteroides	TTGCGGCTCAA CCGTAAAATTG	0% / 0%	5		1723.54	245.51
1_1_3	Parabacteroides	CGCCTGCCTCA AACATA	0% / 0%	19		733.62	N/A
1_2_2	Bacteroides (do-	GCACTCAAGAC	0% / 0%	6		1261.71	435.04

37/44

	rei, fragilis, thetaiotaomicron, vulgatus)	ATCCAGTATCAA CTG
1_3_3	Bacteroides (dorei, fragilis, thetaiotaomicron, vulgatus)	AGGGCAGTCAT CCTTCACG	0% 1 0%	7	1157.96	391.09
2_1_min 1b	Gamaproteobacteria	CAGGTGTAGCG GTGAAATGCGTA GAGAT	14% / 0%	20	270,16	N/A
2_1_1	Haemophilus	ACGCTCGCACC	0% 1 0%	21	1711.24	201.24
2_3_2	Subgrupo Gamaproteobacteria	CGGGGATTTCA CATCTGA	8% / 0%	22	141.42	N/A
2_4_1	Subgrupo Gamaproteobacteria	TGCCAGTTTCGA ATGCAGTT	4% / 0%	23	1677.81	251.28
2_5_1	Subgrupo Gamaproteobacteria	GTGCTTCTTCTG CGGGTAA	0% / 0%	24	611.51	155.12
2_7_1	Salmonella, Enterobacter, Citrobacter, Cronobacter	TGTTGTGGTTAA TAACCGCAGCA ATTGA	4% / 0%	9	1527.71	N/A
3_2	Proteobacteria	ACGCTTGCACC CT	5% 10%	1	809.64	278.90
4_1	Firmicutes (Lactobacillales, Clostridium pert., Staphiiococcus)	CGATCCGAAAA CCTTCTTCACT	6% / 0%	2	1799.51	538.14
4_2_3	Lactobacillus subgroup	GCTACACATGG AGTTCCA	29% 10%	25	278.64	14.67
4_3_1	Clostridium ramo- sum	CCGTCACTCGG CTACCATTTC	0% / 0%	15	2429.10	N/A
4_4_2	Enterococcus, Listeria	TCCAATGACCCT CCC	0% / 0%	10	640,06	125.05
4_5_2	Streptococcus pyogenes	GATTTTCCACTC CCACCAT	0% 10%	16	1556.65	N/A
4_6_1	Streptococcus sanguinis	CACTCTCACACC CGTT	0% / 0%	11	978.28	N/A
4_7_2	Listeria	CCGTCAAGGGA	0% / 0%	17	678.60	N/A

38/44

		CAAG				_____________________
4_8_1	Streptococcus Enterococcus	GTTGCTCGGTC AGACTT	12%/0%	12	1593.28	N/A
5_1	Firmicutes (Clostridia, Bacillales, Enterococcus, Lactobacillus)	GGACAACGCTT GCCAC	6% / 0%	3	1315.09	417.36
5_1_2	Staphilococcus	CGTGGCTTTCTG ATTAGGTA	0% / 0%	13	654.06	N/A
5_2_1	Clostridium neonatale	CGTAGTTAGCC GTGG	0% / 0%	26	0,00	0,00
6_1_4	Bifidobacterium longum	TGCTTATTCAAC GGGTAAACT	0% / 0%	14	2071.50	492.05
6_2	Actinobacteria	CGTAGGCGGTT CGTCGCGT	0% / 0%	4	1417.55	243.38
6_2_2	Bifidobacterium, breve	CGGTGCTTATTC GAAAGGTACACT	0% / 0%	18	1928.16	N/A
UNI01	16S Universal	CGTATTACCGC GGCTGCTGGCA	N/A	55	N/A	N/A
HYC01	Hibridização control	GTAGCATTCGAT TCGGGCAA	N/A	56	N/A	N/A

Extensão de Primer e hibridização em estrutura

Antes da reação de marcação os produtos PCR 16S (amplificados como descrito acima) foram tratados com 3U Exonuclease I (New England Biolabs, Ipswich, USA) e 8U de fosfatase alcalina de camarão (USB, Cleveland, USA) a 37 °C por 2 horas e inativados a 80 5 °C por 15 min. Os produtos PCR tratados com ExoSAP foram então quantificados usando Kodak Molecular Imaging Software (Version 4.0) com base em fotos de gel eletroforese. A 1kB DNA Ladder (N3232, New England Biolabs) com concentrações especificadas foi incluído em todos os géis. Com base na quantificação a partir das imagens de gel os produtos PCR foram diluídos em uma concentração igual de 50 ng/pL por amostra e aproximadamen10 te 100 ng de matriz foi usado na reação de marcação a seguir: Em um volume de reação total de 10 pL 2.5 U HOT TERMIPol (Solis Biodyne), 1x tampão C (Solis Biodyne), 4 mM de MgCI₂ (Solis Biodyne), 0,4 pM de ddCTP-tamra (Jena Bioscience, Jena, Germany) e 2.9 pM de conjunto de sonda 3 (Tabela 5). O protocolo de marcação incluído a 12 min de estágiod e ativação a 95 °C, seguido por 10 ciclos com 20 sec de desnaturação a 96 °C e 35 sec de 15 recozimento a 60 °C. Quarenta e quatro amostras foram aleatoriamente obtidas para examinar a capacidade de reprodução. As referidas 44 amostras foram processadas duas vezes

39/44 iniciando a partir da reação de marcação. Adicionalmente, como um teste de faixa quantitativo o teste de produtos PCR a partir de culturas puras a partir de 5 diferentes espécies (listadas na Tabela 4) foi diluído a partir de 10^10^-4 e incluído em uma reação de marcação e análise de estrutura à jusante.

As estruturas foram pré-hibridizadas para evitar sinal de fundo ao embeber as lâminas de vidro em Blocklt (Arraylt) a temperatura ambiente. Após duas horas as lâminas foram lavadas por 2 min em um tampão de lavagem contendo 2x SSC (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) + 0,1% Sarkosil (RT) (VWR, International Ltd., Poole, United Kingdom) e então por 2 min em 2 x SSC (Sigma-Aldrich). As lâminas foram então dispostas em uma proveta com H₂O ultra pura (100 °C) por 2 min e imediatamente transferidas para uma proveta contendo 100% de etanol (-20 °C) por 20 see, antes as mesmas foram secas por centrifugação a 91 G em uma centrífuga Multifuge 3 S-R (Heraeus, Buckinghamshire, United Kingdom) por 12 min e usadas dentro de uma hora.

Imediatamente antes da hibridização da estrutura atual 60 pL de tampão de hibridização contendo 7.2 % de Polietileno glicol 8000 (Sigma—Aldrich), 1.2 x SSC (Sigma—Aldrich) e 0,17 μΜ de mistura HYC01 de controle de hibridização (1:4 mix de HYC01 marcados tamra e HYC01 não marcado) foram adicionados às amostras. As amostras foram desnaturadas a 95 °C por 2 min e então deixadas a 45 °C por 2 min. As lâminas de vidro foram dispostas em uma câmara de hibridização de 96 cavidades (Arraylt) antes das amostras serem abastecidas nas estruturas. Duas estruturas por lâmina foram usadas para as amostras de controle positivo e negativo. A câmara de hibridização foi disposta em uma câmara úmida e hibridizada por 16 horas em uma agitadora incubadora Innova 4000 (New Brunswick Scientific, Champaign, USA) at 45 °C e 60 rpm.

Após a hibridização as estruturas foram lavadas por 5 minutos no tampão de lavagem contendo 2x SSC (Sigma-Aldrich) e 0,1% de Sarkosil (VWR, International Ltd.), então por 5 min em 2xSSC (Sigma-Aldrich) e finalmente por 10 see em 0.2x SSC (Sigma-Aldrich), antes as mesmas foram secas por centrifugação a 91 G por 12 min em uma centrífuga Multifuge 3 S-R (Heraeus). As estruturas hibridizadas foram lidas a comprimento de onda 532 nm com um scanner Tecan LS reloaded (Tecan, Mãnnedorf, Austria). As intensidades fluorescentes e as morfologias de ponto foram analisadas usando Axon GenePix Pro 6.0.

Eletroforese capilar

Para testar a especificidade da sonda, sondas únicas foram testadas contra suas bactérias alvo (DNA a partir de culturas puras) por realizar 16S amplificação por PCR e reações de marcação como descrito acima (com 1 μΜ de sondas únicas em vez de Conjunto de sonda 3) e o desempenho das sondas foi avaliado usando eletroforese capilar. A capacidade de reprodução do gene de rRNA 16S PCR foi examinada em uma das amostras (amplificadas em três reações de PCR separadas) usando eletroforese capilar. Duas sondas

40/44 (6_1_4 e 5_1_2) foram escolhidas para examinar o sinal para cada um dos três podutos PCR, e também uma rodada em triplicata em um grupo de três podutos PCR foi examinado usando a mesma sonda. Após a marcação, as amostras foram tratadas com 8U SAP (USB) e incubadas a 37 °C por 1 hora e inativadas a 80 °C por 15 min. então 1 pl_ das sondas tratadas com SAP e sondas marcadas foram misturadas com 9 pl_ de Hi-Di formamida (Applied Biosystems, Warrington, United Kingdom) e 0.5 μΙ_ de GeneScan 120 Liz Size Standard (Applied Biosystems), e a amostras foram incubadas a 95 °C por 5 min, e imediatamente postas em gelo. As amostras foram então abastecidas em uma estrutura capilar de 50 cm 3130x1 (Applied Biosystems) no ABI Genetic Analyzer 3130x1 sequencer (Applied Biosystems), contendo o polímero de desempenho otimizado 7 (POP-7, Applied Biosystems). Tempo de injeção foi 16-22 s e as condições eletroforéticas foram: tempo de rodada 1,500 s at 15,000 V, rodada atual 100 μΑ e 60 °C temperatura de rodada. O software GeneMapper 4.0 foi usado para analisar os resultados.

O gene de rRNA 16S dos podutos PCR a partir das 26 cepas bacterianas usadoa para avaliar as sondas foi sequenciado para confirmar a identidade das mesmas e para examinar se houveram quaisquer mutações em suas sequências de gene comparadas às sequências usadas para projetar as sondas. Os podutos PCR tratados com ExoSAP foram diluídos 10 vezes e 1 pL foi usado na reação de sequenciamento usando o kit de sequenciamento de iclo BigCorante® Terminator v1.1 (Applied Biosystems). 0.32 μΜ dos msmos primer direto e reverso usados para o rRNA 16S PCR descrito acima foram usados em duas reações de sequenciamento separadas. O kit de purificação BigCorante XTerminator® (Applied Biosystems. Warrington, United Kingdom) foi usado de acordo com as recomendações do fabricante para limpar as reaçãos de sequenciamento. As amostras foram analisadas em uma estrutura capilar de 36 cm 3130x1 (Applied Biosystems) no ABI Genetic Analyzer 3130x1 sequencer (Applied Biosystems), contendo o polímero de desempenho otimizado 7 (POP-7, Applied Biosystems). Tempo de injeção fol 3 s e as condições eletroforéticas foram: tempo de rodada 2780 s a 8,500 V, rodada atual 5.0 μΑ e 60 °C temperatura de rodada. As sequências foram chamadas base pelo Sequence Scanner Software v1.0 (Applied Biosystems). As sequências foram depositadas no GenBank e os números de acesso respectivos das cepas são listados na Tabela 4.

Processametno e Análise de Dados

Os sinais das sondas foram corrigidos para as variações de hibridização indesejada que são observadas a partir de lâmina em lâmina. Em cada experimento, a sonda que já é marcada (HYC01) é adicionada à mistura de sonda para avaliar a etapa de hibridização. Para corrigir a variação da hibridização entre as lâminas, foram divididos todos os sinais de amostra no sinal médio de todas as replicas a partir da referida sonda. Ademais, o sinal de fundo a partir de cada sonda individual sonda foi removido por subtração dos sinais médios

41/44 a partir de uma amostra de controle negativo incluída em todas as lâminas usadas nesse experimento.

Uma árvore Neighbour Joining de todas 26 cepas bacterianas usadas para avaliar as sondas foi construída usando o programa Mega 4 e a sua confiabilidade foi auferida usando autocarregamento.

Análises Estatísticas

A especificidade da sonda foi avaliada ao comparar os valores de alvo/não-alvo teórico com os resultados experimentais em uma única cepa, usando um valor de limiar de sinal de fundo determinada empiricamente de 50.

Os dados de microestrutura em geral contêm não só os valores limiares mas também o de saturação e são portanto muito raramente normalmente distribuídos. Assim, de modo a testar a significância de dados de microestrutura, é comum se usar permutação com base em abordagens em vez de testes estatísticos padrão tal como ANOVA e t-testes (que necessitssam de distribuição normal). Teste de permutação é um teste estatístico exato, mesmo para dados com uma complexa estrutura de distribuição. Assim, os p-valores para diferenças de grupo dentro de cada categoria de idade foram calculados por teste de permutação (Langsrud, 2002, Journal de The Royal Statistical Society Series D 51, 305-317) usando 50 como o valor limiar de fundo.

Resultados

Construção e avaliação de sonda

Um conjunto de 88 sondas foi construído com base nos critérios descritos em Materiais e Métodos. Seis sondas para o filo principal cobriral 88% dos clones em nosso conjunto de dados. Avaliações de sonda única usando eletroforese de gel capilar e as cepas na Tabela 4 como matrizes mostraram que 76% das sondas satisfazem os critérios de detecção de alvo, indicando um coeficiente de sucesso relativamente alto. Com base nos referidos resultados e em um conjunto de critérios de bioinformática foram identificados 10 conjuntos de sonda. Cada conjunto de sonda consistiu de 25 sondas que foram selecionadas com base em suas capacidades in silico um com o outro. As estimativas de compatibilidade foram com base nos cálculos de temperatura de fusão e termodinâmicas da sonda - autohibridização, hibridização em outras sondas no conjunto de sonda ou suas bactérias alvo. A validação experimental por eletroforese de gel capilar mostrou que o Conjunto de sonda 3 proporcionou a menor reação cruzada, como determinado pela marcação sem matriz (resultados não mostrados). Esse conjunto de sonda foi portanto selecionado para construção de estrutura (Tabela 5).

Especificidade, capacidade de reprodução e faixa quantitativa da estrutura GA-map para criança

A primeira avaliação da estrutura foi em cepas puras. A avaliação foi com base em

42/44 comparação de alvos / não alvos determinados em silica com aquela dos sinais experimentais. A referida análise mostrou boa concordância entre as especificidades de sonda teórica e experimental. Usando um valor de corte de sinal de 50 rfu foi observado que não houveram falsos negativos, enquanto o número de falsos positivos foi relativamente variável (Tabela 5).

A próxima etapa na avaliação foi para determinar a precisão da classificação das amostras misturadas. Isso foi realizado ao se analisara um conjunto de misturas definidas. A avaliação dos referidos dados mostrou que a maioria das sondas identificou com precisão as suas bactérias alvo. Aqui, fioi usado um limiar de sinal de 50. No total, foram 96.5 % de correto com 9.0 % de falsos positivos e 1.6 % de falsos negativos. A faixa quantitativa das sondas selecionadas foi subsequentemente avaliada por diluições da matriz. Em geral, as referidas análises mostraram que houve uma saturação do sinal da sonda quando a concentração alvo foi > 10 % com relação ao produto PCR não diluído. Todas as sondas avaliadas também proprocionaram o mesmo limite de detecção aproximado entre 0,1 e 0,01 %. A precisão quantitativa foi também muito alta com uma R² > 0.9 para todas as sondas testadas. A capacidade de reprodução do teste foi avaliada por analises em duplicata de 43 amostras. O percentual médio de variação e R² para cada sonda individualmente foram determinados e confirmaram a capacidade de reprodução do teste.

Desenvolvimento do nível de filo do microbiota de intestino

Foi observado que Actinobacteria (sonda 6_2) e Firmicutes (sonda 5_1) foram significantemente superexpressas em 4 mêses e um ano, respectivamente, nas crianças sensibilizadas em IgE (Tabela 6 e figura 1). Houve também um padrão de colonização específico para idade geral consistente a nível de filo, independente do estado de sensibilização. O padrão geral foi uma dominância inicial de Firmicutes e Proteobacteria em dez dias. Em quatro meses a dominância Proteobacteria/Firmicutes foi redisposta com Bacteroides/Actinobacteria, enquanto após um e dois anos os filos de colonização inicial foram aparentemente se tornando de menor abundância.

Tabela 6. Diferenças de nível de Filo entre crianças sensibilizadas e não sensibilizadas em diferentes idades¹

Sonda	10 dias	120 dias	360 dias	720 dias
1_1	0.640	0.868	1.00	0.903
2 1 min1b	0.760	0.220	0.801	0.542
3_2	0.922	0.3126	0,126	0.465
4 1	0,164	0,190	0.360	0.599
5_1	0.486	0,127	0,049	0.556
6_2	0,152	0,042	0,196	0.989
UNI01	0.450	0.867	0.917	0.216

43/44 ¹ Significância de diferenças foram determinadas por teste de permutação. Diferenças significantes (p < 0,05) são negrito.

Desenvolvimento do nível de gênero e espécies do microbiota do intestino

A principal diferença entre o grupo sensibilizado e não sensibilizado foi que B. lon5 gum (sonda 6_1_4) foi significativamente superexpresso no grupo sensibilizado, em comparação ao grupo não sensibilizado em um ano. Foi também observado que Enterococcus (sonda 4_4_2) foi significativamente superexpressa em quatro mêses. Também pareceu que como os estreptococos estão associados com a sensibilização, com Streptococcus sanguinis (sonda 4_6_1) sendo significativamente superexpressa em um ano, e S. pneumonia 10 (sonda 4_8_1) na borda de significância em 10 dias (Tabela 7 e figura 2).

Os grpos bacterianos com os padrões de colonização mais consistentes se correlacionando com a idade foram Staphilococcus (sonda 5_1_2) e Bifidobacterium breve (sonda 6_2_2). Staphilococcus dominaram inicialmente, enquanto B. breve teve um pico de dominância em 4 mêses.

Tabela 7. Diferenças de gênero / espécies entre crianças sensibilizadas e não sensibilizadas em diferentes idades¹

Sonda	10 dias	120 dias	360 dias	720 dias
1_1_3	1	0.866	1.000	1.000
1_2_2	1	0.884	1.000	1.000
1_3_3	0.756	0.488	0.206	0.741
2_1_1	0.783	1.000	1.000	1.000
2_3_2	0.668	0.347	1.000	0.494
2_4_1	0,182	0.622	1.000	1.000
2_5_1	0.695	0.913	0.870	0.949
2_7_1	0.754	1.000	1.000	1.000
4_2_3	0.938	0.909	1.000	0.405
4_3_1	0.786	0.765	0.828	0.537
4_4_2	0.9736	0,020	1.000	1.000
4_6_1	1.000	1.000	0,038	0.689
4_8_1	0,084	0,169	1.000	0.935
5_1_2	0.847	1.000	1.000	0.399
6_1_4	0,097	0,066	0,016	0.837
6_2_1	0.933	0.741	0.863	0.857
6_2_2	0.711	0.679	0.844	0.784

¹ Significância de diferenças foram determinadas por teste de permutação. Diferenças significantes (p < 0,05) são marcadas em negrito, enquanto as diferenças na faixa de 0,05 < p < 0,1 são em itálico.

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Discussão

Com o teste SNuPE com base em GA-map foi obtido uma microestrutura de gene de rRNA 16S de alta especificidade e sensibilidade com apenas poucas sondas. O benefício óbvio disso é que o teste permite aplicações de alta produtividade.

O achado biológico mais surpreendente em nossos dados foi que B. longum foi significativamente superexpresso no grupo sensibilizado com IgE em 360 dias, além dos baixos p-valores para 10 dias e 120 dias. Esse achado foi também independentemente confirmado por q-PCR para os dados IM-PACT data (resultados não publicados). Tomados juntos, as múltiplas correlações independentes suportam a validade das observações. A surpresa foi pelo fato de que o trabalho mais anterior de fato sugeriu que B. longum é protetor com relação a sensibilização. Experimentos com modelos de rato, entretanto, mostraram que o tempo e a ordem de colonização bifidobacteriana são importantes parqa os efeitos imunomodulatórios. Isso pode explicar as diferenças nos efeitos entre os diferentes estudos.

Foi também observado que o subgrupo Firmicutes contendo estreptococos e enterococos foi significativamente superexpresso pelo grupo sensibilizado a IgE. Relativamente pouco é descrito sobre os referidos grupos bactgerianos com relação a sensibilização. Entretanto, tem sido sugerido que infecções por S. pneumonia podem estar correlacionadas ao aumento dos níveis de IgE em bronquite crônica. Assim, podem haver mecanismos subjacentes comuns para criança e sensibilização de bronquite.

Em suma, o presente estudo demonstra a utilidade do teste de GA-map para criança em determinar as variações na composição do microbiota de intestino. A referida informação pode levar a um diagnóstico precoce da doença e um melhor tratamento profilático ou terapêutico das várias doenças relacionadas ao intestino.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Conjunto de sondas de oligonucleotídeo, o referido conjunto CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:

(a) um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de ACGCTTGCACCCT (SEQ ID NO 1), a sequência complementar à mesma (AGGGTGCAAGCGT; SEQ ID NO 27) ou a sequência capaz de hibridização em qualquer sequência sob condições de alto rigor;

(b) um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de CGATCCGAAAACCTTCTTCACT (SEQ ID NO 2), a sequência complementar à mesma (AGTGAAGAAGGTTTTCGGATCG; SEQ ID NO 28) ou a sequência capaz de hibridização em qualquer sequência sob condições de alto rigor;

(c) um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de GGACAACGCTTGCCAC (SEQ ID NO 3), a sequência complementar à mesma (GTGGCAAGCGTTGTCC; SEQ ID NO 29) ou a sequência capaz de hibridização em qualquer sequência sob condições de alto rigor;

(d) um oligonucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de CGTAGGCGGTTCGTCGCGT (SEQ ID NO 4), a sequência complementar à mesma (ACGCGACGAACCGCCTACG; SEQ ID NO 30) ou a sequência capaz de hibridização em qualquer sequência sob condições de alto rigor; e (e) um ou mais oligonucleotídeos compreendem uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID Nos 5 a 8 ou 31 a 34 ou a sequência capaz de hibridização em qualquer uma das SEQ ID Nos 5 a 8 ou 31 a 34 sob condições de alto rigor; e opcionalmente (f) um ou mais oligonucleotídeos compreendem uma sequência de nucleotídeo selecionada a partir de qualquer uma das SEQ ID Nos 9 a 18, 35 a 44, 19 a 26 ou 45 a 52 ou a sequência capaz de hibridização em qualquer uma das SEQ ID Nos 9 a 18, 35 a 44, 19 a 26 ou 45 a 52 sob condições de alto rigor.
2. Conjunto de sonda de oligonucleotídeo, de acordo com a reivindnicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais dos referidos oligonucleotídeos é marcado com uma fração para ajudar com a detecção ou a manipulação., preferivelmente em que a referida fração é colorimétrica, quimioluminescente, cromogênica, radioativa, fluorescente, uma enzima, um fragmento de anticorpo, uma His-tag, biotina ou estreptavidina.
3. Conjunto de sonda de oligonucleotídeo, de acordo com qualquer uma das reivindnicações 1 ou 2, CARACTERIZADO pelo fato de que um ou mais dos referidos oligonucleotídeos é imobilizado em um ou mais suportes sólidos, preferivelmente marcados com um corante ou uma pluralidade de corantes preferivelmente um corante luminescente, em que o referido suporte sólido preferivelmente selecionado a partir de:

2/4 (i) partículas, folhas, géis, filtros, membranas, fibras, capilares, chips, tiras de microtitulação, lâminas, tubos, placas ou cavidades; ou (ii) uma partícula magnética, preferivelmente uma conta magnética.
4. Método de traçar o perfil do microbiota do trato Gl de um indivíduo, o referido método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:

(i) colocar em contato a amostra a partir do trato Gl do referido indivíduo com um conjunto de sonda de oligonucleotídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 3;

(ii) submeter a amostra e o conjunto de sonda a condições que permitem a hibridização das sondas em suas sequências de nucleotídeos alvos dentro de moléculas de ácido nucleico na referida amostra; e (iii) para cada oligonucleotídeo no referido conjunto de sonda, determinar a quantidade de sua sequência de nucleotídeo alvo que está presente na referida amostra.
5. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que cada oligonucleotídeo tem uma marcação fixada ao mesmo, e etapa (iii) compreende determinar, para cada oligonucleotídeo marcado, a quantidade da referida marcação ligada à referida amostra por determinar a resistência do sinal a partir da marcação emanando a partir da amostra.
6. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa (iii) compreende (a) marcar de modo seletivo as sondas de oligonucleotídeo do conjunto de sonda quando hibridizada em suas sequências de nucleotídeo alvo; e (b) determinar a quantidade de cada sonda de oligonucleotídeo marcada produzida na etapa (a).
7. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato de que a marcação seletiva ocorre por extensão da cadeia da sonda de oligonucleotídeo com um nucleotídeo marcado, preferivelmente a dideoxinucleotídeo marcado.
8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que o referido nucleotídeo marcado é um ddCTP marcado, preferivelmente ddCTP marcado com biotina.
9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa (b) compreende hibridização dos oligonucleotídeos a partir de marcar etapa (a) em sequência de nucleotídeos complementares às sondas de oligonucleotídeo.
10. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que uma ou mais da referida sequência de nucleotídeos complementares às sondas de oligonucleotídeo é imobilizada em um ou mais suportes sólidos, preferivelmente marcados com um

3/4 corante ou uma pluralidade de corantes, preferivelmente um corante luminescente, em que o referido suporte é preferivelmente selecionado a partir de:

(i) partículas, folhas, géis, filtros, membranas, fibras, capilares, chips, tiras de microtitulação, lâminas, tubos, placas ou cavidades; ou (ii) uma partícula magnética, preferivelmente uma conta magnética.
11. Método, de acordo com a reivindicação 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a etapa (iii) compreende (a) realizar uma reação de amplificação de ácido nucleico dependente de primer; e (b) para cada oligonucleotídeo no conjunto de sonda determinar a quantidade de produto de amplificação produzida a partir da mesma na referida reação de amplificação de ácido nucleico dependente de primer.
12. Método de preparar um perfil padrão de microbiota do trato Gl que é característico de uma doença ou condição ou a estágio da mesma ou o risco de desenvolver uma doença ou condição, o referido método CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:

(i) identificar um indivíduo com a referida doença ou condição ou estágio da mesma ou estando em risco de desenvolver a referida doença ou condição e (ii) realizar o método de qualquer uma das reivindicações 4 a 11 na amostra a partir do trato Gl do referido indivíduo.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 12, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida amostra a partir do trato Gl é selecionada a partir de (a) conteúdo luminal do trato Gl, preferivelmente conteúdo do estômago, conteúdos intestinais, muco e fezes/excremento, ou combinações dos mesmos, (b) partes da mucosa, da submucosa, da musculartura externa, da adventitia e/ou da serosa de um tecido/órgão do trato Gl, (c) ácido nucleico preparado a partir de (a) ou (b), preferivelmente por transcrição reversa e/ou ácido nucleico amplificação, e preferivelmente em que a referida amostra do trato Gl é obtida a partir do jejuno, do íleo, do ceco, do cólon, do reto ou do ânus.
14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a referida doença ou condição é selecionada a partir de Doença Inflamatória Intestinal, doença de Crohn, colite ulcerativa, Síndrome do Intestino Irritável e cânceres do trato Gl preferivelmente câncer de boca, faringe, esôfago, estômago, duodeno, jejuno, íleo, ceco, cólon, reto ou ânus e as doenças atópicas, preferivelmente eczema, asma, dermatite atópica, rinite conjuntivite alérgica e alergias alimentares, distúrbios metabólicos, preferievelmente diabetes mellitus (tipo 1 e tipo 2), obesidade e síndrome metabólica, desordens neurológicas, preferivelmente depressão, esclerose múltipla, demência

4/4 e doença de Alzhiemer e autismo.
15. Kit, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o conjunto de sonda de oligonucleotídeo, de acordo com as reivindnicações 1 a 3., preferivelmente adicionalmente compreendendo pelo menos um de

5 (a) meios para a marcação seletiva de um ou mais dos oligonucleotídeos do conjunto de sonda, (b) suportes sólidos nos quais um ou mais dos oligonucleotídeos do conjunto de sonda podem ser imobilizados, (c) meios para realizar uma amplificação e/ou reação de extensão de primer com

10 um ou mais dos oligonucleotídeos do conjunto de sonda, (d) meios para realizar a reação de transcrição invertida, (e) meios para obter a amostra a partir do trato Gl, (f) meios para purificar ou refinar a amostra a partir do trato Gl, (g) meios para extrair ácido nucleico a partir da amostra a partir do trato Gl,

15 (h) meios para detectar ácido nucleico amplificado, (i) um ou mais oligonucleotídeos que seletivamente hibridizam para objetivar ácidos nucleicos indicativos de qualquer outra doença ou condição médica associada com o microbiota gastrointestinal, preferivelmente doença de Crohn, doença inflamatória do intestino, colite ulcerativa e síndrome deintestino irritável.