RS66070B1 - Bispecifična tetravalentna antitela i metode njihovog dobijanja i upotrebe - Google Patents

Description

OBLAST TEHNIKE

[0001] Predmetno otkriće se uopšteno odnosi na tehničku oblast terapeutskih agenasa antitela, a preciznije se odnosi na bispecifična tetravalentna antitela protiv dva različita člana porodice EGFR.

STANJE TEHNIKE

[0002] Pokazalo se da prekomerna ekspresija i/ili deregulacija članova porodice ErbB/HER receptora kao što su EGFR, HER2, HER3, HER4 igraju važnu ulogu u tumorigenezi kod kancera. Mutacija i amplifikacija EGFR ili HER2 proizvode aberantni signal rasta koji aktivira nizvodni signalni put doprinoseći tumorigenezi. Terapeutska antitela i inhibitori malih molekula usmereni protiv EGFR i HER2 odobreni su za upotrebu u lečenju raka (Arteaga et al., Nature Reviews Clinical Oncology 916-32, Januar 2012). Monoklonska antitela protiv članova porodice EGFR kao što su EGFR i HER2, pokazala su dobre kliničke odgovore kod raka debelog creva (Price et al., The Lancet Oncology 15(6), Stranice 569-579, Maj 2014), karcinoma skvamoznih ćelija glave i vrata (Cohen, Cancer Treatment Reviews (2014) 567-577), karcinoma dojke i želuca (Arteaga et al., Nature Reviews Clinical Oncology 916-32, Januar 2012). Nekoliko terapeutskih anti-EGFR antitela, uključuju ći cetuksimab, panitumumab i nimotuzumab, su odobreni terapeutici za nekoliko karcinoma uključujući metastatski kolorektalni karcinom, karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata i gliom (Price and Cohen, Curr Treat Options Oncol.2012 Mar; 13(l):35-46; Bode et al., Expert Op in Biol Ther.2012 Dec; 12(12):1649-59). Nažalost, mnogi tumori koji u početku reaguju na ove terapeutske agense na kraju napreduju zbog stečene otpornosti na agense (Jackman et al. J Clin Oncol 2010; 28:357-60). Stoga, postoji potreba za boljim terapijskim sredstvima protiv raka. Dhimolea et al World Bispecific Antibody Summit, Septembar 27-28, 2011, Boston, MA. S. Hu et al opisuje četiri u jednom antitela koja imaju superiornu inhibitornu aktivnost protiv EGFR, HER2, HER3 i VEGF putem prekida HER/MET unakrsnog preslušavanja. US 2014/056895 A1 opisuje vezujuće proteine nalik antitelu sa dvostrukim varijabilnim regionom koji imaju orijentaciju unakrsnog regiona vezivanja. US 2010/256338 A1 opisuje multispecifična antitela koja sadrže antitela pune dužine i jednolančane Fab fragmente. WO 2014/144357 A1 opisuje tetravalentna bispecifična antitela. US 2012/134993 A1 opisuje kompozicije i metode za korišćenje multispecifično vezujućih proteina koji sadrže kombinaciju antitelo-receptor. US 2014/135482 A1 opisuje bispecifična anti ErbB3/ anti cMet antitela.

KRATAK OPIS PRONALASKA

[0003] Pronalazak obezbeđuje bispecifično tetravalentno antitelo, pri čemu navedeno bispecifično tetravalentno antitelo sadrži: prvi IgGl teški lanac, konektor i jednolančani polipeptid Fv (scFv) domena koji sadrži SEQ ID NO: 136; drugi polipeptid teškog lanca IgGl, konektora i scFv domena koji sadrži SEQ ID NO: 136; polipeptid prvog kapa lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 131; i drugi polipeptid kapa lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 131; pri čemu prvi i drugi teški lanci IgGl i prvi i drugi kapa laki lanci formiraju IgG deo sa specifičnošću vezivanja za EGFR; i pri čemu svaki prvi i drugi scFv domen imaju specifičnost vezivanja za HER3. Ciljevi i prednosti pronalaska će postati očigledni iz sledećeg detaljnog opisa njegovih poželjnih izvođenja u vezi sa priloženim crtežima.

KRATAK OPIS SLIKA

[0004] Predmetni pronalazak će sada biti opisan sa referencom na FIG., na kojima slični referentni brojevi označavaju slične elemente.

FIG.1 je dijagram koji prikazuje strukture domena primera bivalentnog monospecifičnog antitela imunoglobulina G (IgG).

FIG.2 je dijagram koji prikazuje strukturu domena primera tetravalentnog bispecifičnog antitela koje sadrži IgG deo i dva scFv dela.

FIG.3 prikazuje dijagrame strukture domena primera tetravalentnih bispecifičnih antitela 1X1, 1X2, 1X3, 1X4, 1X4.2, 1X5 i 1X6.

FIG.4 prikazuje poređenje sekvence VH domena između SI-1X4 i SI-1X4.2 pokazujući razlike od 5 aminokiselina.

FIG.5 i 6 su grafikoni koji prikazuju monomerno vezivanje EGFR pomoću BLI.

FIG.7, 8 i 9 su grafikoni koji pokazuju bispecifično ELI vezivanje.

FIG.10 je grafik koji prikazuje dimerni EGFR ELISA.

FIG 11 prikazuje kinetiku vezivanja SI-1C5.2 i SI-1X4.2 sa monomernim EGFR kako je analizirao Octet.

FIG.12 prikazuje protočnu citometrijsku analizu SI-1X antitela koja se vezuju za A431 ćelije. FIG.13 prikazuje protočnu citometrijsku analizu SI-1X antitela koja se vezuju za BxPC3 ćelije.

FIG.14 prikazuje protočnu citometrijsku analizu vezivanja antitela SI-1X4.2 za Fad u ćelije. FIG.15 prikazuje protočnu citometrijsku analizu vezivanja antitela SI-1X4.2 za ćelije A431. FIG.16 pokazuje efekat SI-1X antitela na proliferaciju ćelija A431.

FIG.17 pokazuje efekat SI-1X antitela na proliferaciju ćelija A431.

FIG.18 pokazuje efekat SI-1X antitela na proliferaciju ćelija ȼɯɊɋɁ.

FIG.19 pokazuje efekat SI-1X antitela na proliferaciju ćelija ȼɯɊɋɁ.

FIG.20 pokazuje efekat SI-1X4.2 antitela na proliferaciju Fadu ćeliji.

FIG.21 pokazuje efekat SI-1X4.2 antitela na proliferaciju ćelija A431.

FIG.22 pokazuje ADCC aktivnost SI-1X antitela na Fadu ćeliji.

FIG.23 pokazuje ADCC aktivnost SI-1X antitela na NCI-H1975 ćelijama.

FIG.24 prikazuje termičko topljenje SI-1X antitela kako bi se demonstrirala njihova stabilnost.

FIG.25 pokazuje stabilnost seruma SI-1 antitela tokom perioda od 7 dana.

FIG.26 je grafikon koji prikazuje rezultate ELISA obložene EGFR za PK studiju na pacovima.

FIG.27 je grafik koji prikazuje rezultate ELISA obložene HER3 za PK studiju na pacovima. FIG.28 je grafikon koji prikazuje rezultate sendvič ELISA za PK studiju na pacovima.

FIG.29 je grafik koji prikazuje dijagram srednje zapremine tumora u odnosu na dane u studiji ksenotransplantata na mišu

FIG.30 je grafikon koji prikazuje relativnu telesnu težinu u odnosu na nedelje u studiji ksenotransplantata na mišu.

DETALJAN OPIS

[0005] Predmetni pronalazak obezbeđuje bispecifična tetravalentna antitela sa superiornim terapeutskim svojstvima ili efikasnošću u odnosu na trenutno poznata anti-EGFR antitela.

[0006] Bispecifična tetravalentna antitela mogu istovremeno da inhibiraju i EGFR i HER3 posredovanu signalizaciju, pa stoga prevazilaze rezistenciju kod EGFR inhibitora ili tretmana monoklonskim antitelima.

[0007] Mora se napomenuti da kako se koristi ovde i u priloženim zahtevima, oblici jednine "a", "i" i "the" u U celom ovom opisu i patentnim zahtevima, reč "sadrži" ili varijacije kao što su "sadrži" ili "koji sadrži", podrazumevaće se uključivanje navedenog celog broja ili grupe celih brojeva, ali ne i isključivanje bilo kog drugog celog broja ili grupe celih brojeva koji uključuju množinu, osim ako kontekst jasno ne nalaže drugačije.

[0008] "Fragmenti antitela" obuhvataju deo intaktnog antitela, poželjno antigen-vezujući ili varijabilni region intaktnog antitela. Primeri fragmenata antitela uključuju Fv, Fab, Fab', F(ab')2, Fab'-SH; 5 dijatela; linearna antitela (videti US patent br.5,641,870, Primer 2;

Zapata et al., Protein Eng.8(10): 1057-1062 (1995)); jednolančani molekuli antitela (npr. scFv). Dok se u ovom opisu, i u celom opisu, pozivaju na antitela i različita svojstva antitela, isto otkriće se takođe primenjuje na funkcionalne fragmente antitela, npr. dual akcija Fab 10 fragmenta.

[0009] U jednom aspektu, obezbeđeno je bispecifično tetravalentno antitelo, pri čemu navedeno bispecifično tetravalentno antitelo sadrži: prvi IgGl teški lanac, konektor i jednolančani polipeptid Fv (scFv) domena koji sadrži SEQ ID NO: 136; drugi polipeptid teškog lanca IgGl, konektora i scFv domena koji sadrži SEQ ID NO: 136; polipeptid prvog kapa lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 131; i drugi polipeptid kapa lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 131; pri čemu prvi i drugi teški lanci IgGl i prvi i drugi kapa laki lanci formiraju IgG deo sa specifičnošću vezivanja za EGFR; i pri čemu svaki prvi i drugi scFv domen imaju specifičnost vezivanja za HER3. IgG deo može da obezbedi stabilnost scFv grupi.

Bispecifično tetravalentno antitelo može blokirati signalizaciju i za AKT i MAPK/ERK puteve i može posredovati ćelijski posredovanu citotoksičnost (ADCC) zavisnu od antitela prema ćelijama koje eksprimiraju jedan ili oba antigena. U jednom aspektu, bispecifično tetravalentno antitelo je sposobno da veže oba antigena istovremeno. U nekim primerima izvođenja, bispecifično tetravalentno antitelo obezbeđuje jaču inhibiciju tumora u testovima proliferacije in vitro i in vivo nego roditeljska kontrola mono-specifičnih antitela ili kombinacija roditeljske kontrole mono-specifičnih antitela.

[0010] članovi EGFR porodice mogu uključivati EGFR, HER2, HER3, fragment ili njihov derivat.

[0011] Bispecifična tetravalentna antitela imaju aktivnost inhibiranja rasta ćelija raka. Antitelo može imati konstantu disocijacije (Kd) od 80 nM, 50 nM, 30 nM, 20nM, 10 nM, ili 0.1 nM za svoje mete EGFR ili HER3. Antitelo se može vezati za obe mete istovremeno. Antitelo se može vezati za EGFR i HER3 sa Kd manjim od 50 nM. Antitelo se može vezati za EGFR i/ili HER3 sa Kd manjim od 40, 30, 25, 20, 19, 18 ili 10 nM. U jednom aspektu, antitelo se vezuje za EGFR sa Kd manjim od 30 nM i vezuje se za HER3 sa Kd manjim od 30 nM. U jednom aspektu, antitelo se vezuje za EGFR sa Kd manjim od 50 nM i vezuje se za HER3 sa Kd manjim od 50 nM istovremeno.

[0012] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje izolovane nukleinske kiseline koje kodiraju bispecifična tetravalentna antitela prema zahtevima.

[0013] U daljem aspektu, pronalzak obezbeđuje ekspresione vektore koji imaju izolovane nukleinske kiseline koje kodiraju bispecifično tetravalentno antitelo prema zahtevu. Vektori mogu da se eksprimiraju u ćeliji domaćinu. ćelija domaćin može biti prokariotska ili eukariotska.

[0014] U daljem aspektu, pronalzak obezbeđuje ćelije domaćina koje imaju izolovane nukleinske kiseline koje kodiraju bispecifična tetravalentna antitela prema zahtevima ili ekspresione vektore uključujući takve sekvence nukleinskih kiselina.

[0015] Ovde je opisan postupak za proizvodnju bispecifičnih tetravalentnih antitela. Metoda može uključivati kultivisanje gore opisanih ćelija domaćina tako da se antitelo proizvodi.

[0016] U daljem aspektu, pronalzak obezbeđuje imunokonjugate uključujući bispecifična tetravalentna antitela prema zahtevima i citotoksični agens.

[0017] U daljem aspektu, pronalazak obezbeđuje farmaceutske kompozicije koje sadrže bispecifična tetravalentna antitela prema zahtevima ili imunokonjugate opisane ovde i farmaceutski prihvatljiv nosač. U nekim primerima izvođenja, kompozicija može dalje da sadrži radioizotop, radionuklid, toksin, terapeutski agens, hemoterapeutski agens ili njihovu kombinaciju.

[0018] Bispecifično tetravalentno antitelo može biti za upotrebu u postupku lečenja subjekta sa kancerom. Postupak može uključiti korak davanja subjektu efikasne količine bispecifičnog tetravalentnog antitela opisanog ovde. Kancer može uključivati ćelije koje eksprimiraju najmanje dva člana porodice EGFR uključujući, na primer, EGFR, HER2, HER3, njihov fragment ili derivat. Kancer može biti rak dojke, kolorektalni karcinom, rak pankreasa, rak glave i vrata, melanom, rak jajnika, kancer prostate i kancer nemalih ćelija pluća, gliom, rak jednjaka, rak nazofarinksa, analni rak, rak rektuma, rak želuca , rak mokraćne bešike, rak grlića materice i rak mozga.

[0019] Metoda može dalje uključivati istovremenu primenu efikasne količine terapeutskog agensa. Terapeutski agens može biti, na primer, antitelo, agens za hemoterapiju, citotoksični agens, enzim ili njihova kombinacija. Terapeutski agens može biti antiestrogen agens, inhibitor receptora tirozina ili njihova kombinacija.

[0020] Terapeutski agens može biti biološki lek.

[0021] Terapeutski agens može biti inhibitor kontrolne tačke.

[0022] Terapeutski agens može uključivati PD1, PDL1, CTLA4, 4-1BB, OX40, GITR, TIM3, LAG3, TIGIT, CD40, CD27, HVEM, BTLA, VISTA, B7H4, derivat, konjugat ili njegov fragment. Terapeutski agens može biti kapecitabin, cisplatin, trastuzumab, fulvestrant, tamoksifen, letrozol, eksemestan, anastrozol, aminoglutetimid, testolakton, vorozol, formestan, fadrozol, letrozol, erlotinib, dagenifitinib, imatipinib, lagenifitinib, lapatinib, sunitinib, nilotinib , sorafenib, nab-palitaksel ili njihov derivat. Subjekat kome je potrebno takvo lečenje može biti čovek.

[0023] Bispecifično tetravalentno antitelo može biti za upotrebu u postupku za lečenje subjekta davanjem subjektu efikasne količine bispecifičnog tetravalentnog antitela da inhibira biološku aktivnost HER receptora.

[0024] Dijagram opšte strukture IgG je prikazan na FIG.1.

[0025] Dijagram bispecifičnog tetravalentnog antitela je prikazan na FIG.2. U ovom primeru, bispecifično tetravalentno antitelo uključuje dva humana teška lanca IgG1, dva humana kapa laka lanca i dva jednolančana Fv (scFv) domena. Dva teška lanca IgG1 i humani laki lanci kapa formiraju IgG deo sa specifičnošću vezivanja za jednog člana porodice EGFR, a svaki od dva scFv domena je povezan sa C-terminalnim ostatkom bilo kog od teških lanaca humanog IgG1 preko konektora sa aminokiselinskom sekvencom gly-gly-gly-gly-ser-gly-glygly-gly-ser ((G4S)2). Svaki scFv domen je u redosledu: N terminus-varijabilni teški-linkervarijabilni laki-C terminus. Linker se sastoji od aminokiselinske sekvence gly-gly-gly-gly-sergly-gly-gly-gly-ser-gly-gly-gly-gly-ser, takođe poznate kao (G4S)3.

[0026] Sekvence aminokiselina CH1, CH2, CH3, CL, Konektor i Linker mogu biti identične. Svako bispecifično tetravalentno antitelo ima dvovalentnu specifičnost vezivanja anti-HER3 na jednom kraju antitela i bivalentnu specifičnost vezivanja anti-EGFR na drugom kraju. Jedan par anti-HER3 varijabilnog teškog lanca i varijabilnog lakog lanca označen je kao 1C1, a četiri para anti-EGFR varijabilnih teških lanaca i varijabilnih lakih lanaca su označeni kao 1C3, 1C5, 1C5.2, 1C6 i 1C6.4, respektivno. Bispecifična tetravalentna antitela su označena kao 1X1, 1X2, 1X3, 1X4, 1X4.2, 1X5, 1X5.2, 1X6, i 1X6.4

[0027] Pored toga, u nekim studijama je korišćen kontrolni molekul 1C4 (takođe označen kao SI-1C4).1C4 je bispecifično antitelo protiv EGFR i HER3 izgrađeno na dva u jednoj platformi opisunoj od strane Schaefer et. al., 2011 (Schaefer et al., Cancer Cell.2011 Oct 18; 20(4):472-86). IC4 ima sličnu strukturu kao monoklonsko antitelo. Molekul se može vezati za EGFR ili HER3 na svakom Fab kraku, ali ne može istovremeno da angažuje obe mete na svakom Fab kraku.

[0028] Fragmenti DNK varijabilnog lakog lanca, varijabilnog teškog lanca i Fv (scFv) sa jednim lancem su generisani sintezom gena preko spoljnog asistenta. Fragmenti DNK teškog lanca gama-1 i humanog kapa lakog lanca generisani su sintezom gena preko spoljnog asistenta. Fragmenti su sastavljeni zajedno ligacijom DNK korišćenjem restrikcionih mesta i klonirani u vektor koji je dizajniran za prolaznu ekspresiju u ćelijama sisara. Vektor sadrži snažan promoter izveden iz CMV i druge elemente koji su potrebni za prolaznu ekspresiju. Dobijeni plazmidi ekspresije IgG su verifikovani da sadrže očekivane DNK sekvence sekvenciranjem DNK.

[0029] Prolazna ekspresija konstrukata antitela je postignuta korišćenjem transfekcije ćelija HEK293F prilagođenih suspenziji sa linearnim PEI kao što je opisano na drugom mestu (videti CSH Protocols; 2008; doi:10.1101/pdb.prot4977). Antitela su prečišćena iz dobijenih transfekcionih supernatanata korišćenjem proteinske afinitetne hromatografije i hromatografije isključivanja veličine ako je potrebno. Kvalitet proteina se analizira pomoću Superdex 200 kolone. Proteini koji se koriste za sve testove imaju čistoću veću od 90%.

[0030] Bispecifično antitelo se može koristiti za lečenje tipova karcinoma sa istovremenom ekspresijom EGFR i HER3, uključujući bez ograničenja kancer debelog creva, karcinom skvamoznih ćelija glave i vrata, rak pluća, gliom, rak pankreasa, rak nazofarinksa i druge tipove raka.

[0031] Bispecifično antitelo je tetravalentne dvostruke specifičnosti. Primer antitela može uključivati IgG i dva scFv, što obezbeđuje dve različite specifičnosti vezivanja u poređenju sa mono-specifičnim antitelom IgG. IgG komponenta obezbeđuje stabilnost i poboljšan poluživot u serumu u odnosu na druga bispecifična antitela koja su koristila samo scFv kao što je BiTE tehnologija (Lutterbuese et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 107.28 (2010): 12605-12610. PMC. Web.2 Dec.2014) i drugi (na primer, US7332585B2). Takođe je sposoban da posreduje ADCC dok oni bez Fc komponente ne mogu (na primer, US7332585B2). Priroda tetravalentne dvostruke specifičnosti obezbeđuje bispecifičnom antitelu sposobnost istovremenog vezivanja u odnosu na neka druga bispecifična antitela, koja mogu da vezuju samo jedan po jedan antigen (Schanzer et al, Antimicrob. Agents Chemother.2011, 55(5):2369; EP272942A1).

[0032] Radi pogodnosti naracije, sekvence ili povezane sa bispecifičnim antitelima su sumirane u TABELI 1 u nastavku.

TABELA 1. Rezime nukleotidnih i aminokiselinskih sekvenci ili povezanih sa bispecifičnim antitelima.

1

1

1

PRIMERI

[0033] Dok su sledeći primeri dati samo kao ilustracija, a ne kao ograničenje. Stručnjaci će lako prepoznati niz nekritičnih parametara koji bi mogli biti promenjeni ili modifikovani da bi dali u suštini iste ili slične rezultate.

Primer 1: Sekvencne razlike između SI-1X4 i SI-1X4.2

[0034] SI-1X4.2 je modifikacija SI-1X4 molekula i sadržao je 5 promena aminokiselina na sledeći način: V71A, T75S, N76S, A93T i S107T koristeći Kabat sistem brojanja. Neke od ovih promena, posebno pozicije 75, 76 i 93, potencijalno mogu da dovedu do interakcije sa antigenom, iako one nisu u CDR petljama i neophodne su za vezivanje i aktivnost. FIG.4 pokazuje 5 aminokiselinskih razlika između SI-1X4.2 i SI-1X4.

Primer 2: Karakterizacija Antitela protiv Receptora Epidermalnog Faktora Rasta korišćenjem BLI

[0035] Vezivanje monomernog EGFR ekstracelularnog domena je mereno u testu vezivanja bioslojne interferometrije (BLI) na BLItz instrumentu (ForteBio, Inc.).25 µg/mL SI-1C3, SI-1C4, SI-1C6, SI-1X1, SI-1X2, SI-1X5, i SI-1X6 su razblaženi u PBS i uhvaćeni na anti-hulgG Fc BLItz biosenzorskim vrhovima tokom 120 sekundi. Vrhovi su isprani 30 sekundi u PBS i premešteni u uzorak EGFR (ProSpec Bio, PKA-344) za vezivanje na 588 nM. Vezivanje EGFR ECD za vrhove je zabeleženo kao signali interferometrije biosloja (ǻnm) tokom

1

vremena povezivanja od 120 sekundi. Vrhovi su premešteni u PBS i disocijacija je primećena tokom 240 sekundi (* SI-1C6 vreme disocijacije od samo 120 sekundi). FIG.5 i 6 prikazuju podatke počevši od koraka povezivanja EGFR sa biosenzorom napunjenim antitelom. Svaka slika prikazuje poređenje sa SI-1C4 kao referentnim antitelom.

[0036] Pošto SI-1C3 i SI-1X2 dele svoj domen vezivanja za EGFR prikazan kao Fab, njihovi profili vezivanja su slični i jači od scFv oblika prikazanog na SI-1X1 (FIG.6). Svaki od njih ima veoma sporu brzinu isključenja EGFR u poređenju sa SI-1C4 i na njih ne utiče njihova brzina uključenja. SI-1X1 može pokazati slabije vezivanje za EGFR, ali ostaje veoma snažno vezan. Isti trend je primećen na FIG.5, gde se Fab verzije EGFR vezujućih domena prikazane na SI-1C6 i SI-1X6 vezuju brže od njihovog reprezentativnog scFv prikazanog na SI-1X5. ýini se da se EGFR vezujući domen na Fab strani bispecifičnih antitela vezuje sa bržim brzinama uključivanja nego scFv verzije, ali pokazuju slične stope isključenja. SI-1X3 i SI-1X4 ne pokazuju monomerno vezivanje EGFR u ovom testu (podaci nisu prikazani) i dimerno EGFR vezivanje je ispitano u ELISA testu ispod.

Primer 3: Karakterizacija antitela protiv EGFR i Her3 korišćenjem BL1

[0037] Bispecifično vezivanje za EGFR i Her3 ekstracelularne domene je izmereno u testu vezivanja bioslojne interferometrije (BLI) na BLItz instrumentu (ForteBio, Inc.).200 nM SI-1C1, SI-1C3, SI-1C4, SI-1C6, SI-1X1, SI-1X2, SI-1X3, SI-1X4, SI-1X5 i SI-1X6 razblaženo je u 1X Kinetičkom puferu (ForteBio , Inc.) i snimljeno na anti-huIgG Fc BLItz biosenzorskim vrhovima u trajanju od 120 sekundi. Vrhovi su ispirani u KB tokom 30 sekundi i premešteni u uzorak EGFR (ProSpec Bio, PKA-344) za vezivanje na 200 nM. Vezivanje EGFR ECD za vrhove je zabeleženo kao signali interferometrije biosloja (ǻnm) tokom vremena povezivanja od 120 sekundi. Vrhovi su premešteni u KB i disocijacija je primećena tokom 60 sekundi. Proces je ponovljen sa Her3 ECD uzorkom (Sino Biological, 10201-H08H-10) na 200 nM tokom 120 sekundi i sličan korak disocijacije od 60 sekundi u KB. FIG.8-107-9 prikazuju podatke počevši od koraka povezivanja EGFR sa biosenzorom napunjenim antitelom.

Antitela su u stanju da ispolje istovremeno bispecifično vezivanje EGFR i Her3 dok su vezana Fc za senzor. Kao što je primećeno na FIG.7 i Sl.8, prikaz domena vezivanja EGFR kao Fab (SI-1X2, SI-1X6) ima jače vezivanje u odnosu na njihove scFv forme (SI-1X1, SI-1X5, respektivno). Ovde i EGFR i Her3 pokazuju isti trend brzine Fa>>scFv. SI-1X3 i SI-1X4 ne pokazuju vezivanje za monomerni EGFR, ali svaki ima sposobnost da veže Her3, kao što se i očekivalo, pošto svaki molekul koristi isti domen vezivanja aHer3 kao SI-1X1, SI-1X2, SI-1X5 i SI -1X6. SI-1X3 i SI-1X4 su ispitani na vezivanje dimernog EGFR u ELISA testu ispod.

1

Primer 4: Dimerična EGFR ELISA Analiza

[0038] Kao što je ranije primećeno, SI-1X3 i SI-1X4 nisu bili u stanju da vežu monomerni oblik EGFR u BLI testu (FIG.9). Predloženo je da je u rodesledu za vezujući domen ĮEGFR koji se koristi u SI-1C5, SI-1X3 i SI-1X4 za vezivanje za EGFR in vitro, potrebno dvovalentno vezivanje (Perez et al, Chin Clin Oncol 2014;3(1):5). Da bi se ovo primetilo, koristila se ELISA za vezivanje antitela u odnosu na druga antitela koja vezuju EGFR koristeći dimerni oblik EGFR.

[0039] ELISA je izvedena korišćenjem dimernog EGFR ECD reagensa, SI-2C1, fuzionisanog sa zečjim Fc stvorenim u kući. EGFR je obložen na Maxisorp imunopločama (Nunc) pri 3 µg/mL u PBS na 4°C preko noći. Ploče su blokirane u PBS sa 3% BSA i 0.05% Tween20 tokom 2 sata na sobnoj temperaturi. Antitela su uhvaćena pri početnoj količini od 10 ug/mL osim za SI-1C5, SI-1X3 i SI-1X4 koji su počeli sa 50 mg/mL za (prijavljeno u nM), sve sa 3X razblaženjima u PBST (1% BSA) za 1 sat na sobnoj temperaturi. Kozje Įhumano IgG-HRP antitelo (Jackson ImmunoResearch, 109-035-098) je korišćeno za detekciju Fc dela antitela u razblaženju 1:2000 u PBST (1% BSA) i razvijeno u TMB (Thermo Scientific) tokom 5 minuta sa 2M H2SO4kao stop rastvorom.3 ispiranja sa PBST (1% BSA) su obavljena između svakog koraka. Sve tačke podataka su izvedene u tri primerka i sakupljene na 450 nm (FIG.10). SI-1C5, SI-1X3 i SI-1X4 svi su vezani za dimerni EGFR ECD u ovom ELISA formatu u visokim koncentracijama u poređenju sa drugim molekulima.

Primer 5: Vezujuća Kinetika 1C5.2 i 1X4.2 koristeći Octet

[0040] Kinetika određena korišćenjem instrumenta ForteBio Octet Red96 sa anti-humanim Fc senzorima (ForteBio, AHC #18-5060). Eksperimenti vezivanja izvedeni na 30°C uz mešanje od 1000 RPM. EGFR protein je ekstracelularni domen (Met 1-Ser 645) humanog EGFR sa C-terminalnom polihistidinskom oznakom. Svi uzorci su razblaženi u 10X Kinetičkim puferom (ForteBio #18-5032).1C5.2, 1X6 i 1X4.2 su stavljeni na 8 senzora pri 10 µg/ml svaki u trajanju od 300 sekundi, nakon čega je usledila osnovna linija tokom 60 sekundi u 10X Kinetičkom puferu. Povezivanje sa EGFR proteinom je vršeno tokom 300 sekundi sa svakim senzorom u jednoj koncentraciji EGFR proteina (300, 100, 33.33, 11.11, 3.705, 1.235, 0.4116 i 0 nM). Disocijacija je zatim izvedena u 10X Kinetičkom puferu tokom 900 sekundi. Tipičan trag asocijacije i disocijacije za 1C5.2 i 1X4.2 je prikazan na FIG.11.

[0041] Analiza podataka je izvršena korišćenjem ForteBio Data Analisis Softvera v9.0. Izvršeno je softversko prilagođavanje krive i četiri najoptimalnija uklapanja krive za svaki

1

1C5.2 (TABELA 2), 1X4.2 (TABELA 3) i 1X6 (TABELA 4) korišćena su i usrednjena za određivanje KD, k(on) i k(dis). Prosečan KD za SI-1C5.2 i SI-1X4.2 je bio 19.2 nM i 18.4 nM respektivno. Prosečan KD za SI-1C6 je bio 3.04 nM 1C5.2 i 1X4.2 je sadržao pet promena aminokiselina u poređenju sa 1C5 i 1X4 kao što je opisano u Primeru 1. Ove promene su doprinele poboljšanom vezivanju za EGFR ECD u poređenju sa podacima generisanim za 1C5 i 1X4 na FIG.10.

TABELA 2. Rezime KD, KON i KDIS za 1C5.2

TABELA 3. Rezime KD, KON i KDIS za 1X4.2

TABELA 4. Rezime KD, KON i KDIS za 1X6

1

Primer 6: Testovi vezivanja na primer bispecifišnih antitela za ćelijske linije tumora

[0042] Bispecifična antitela SI-1X1, SI-1X2, SI-1X3, SI-1X4, SI-1X5, i SI-1X6, kao i kontrola izotipa testirani su na vezivanje za ćelijske linije tumora, A431 (epidermoidni karcinom, ATCC CRL-1555) i BxPC3 (adenokarcinom pankreasa, ATCC CRL-1687) protočnom citometrijom. Ćelije su uzgajane u medijumu RPMI-1640 koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma i sakupljene su za analizu u fazi eksponencijalnog rasta. Alikvoti od 5 x 10<6>ćelija su jednom isprani u PBS, zatim resuspendovani u 250 µl PBS 1% goveđeg serumskog albumina (BSA) i inkubirani na 4°C tokom 15 minuta kako bi se membrane blokirale od nespecifičnog vezivanja.250 µl antitela, razblaženog do 10 µg/ml u PBS/1% BSA, dodato je svakom uzorku do konačne koncentracije antitela od 5 µg/ml. Ćelije su inkubirane u primarnom antitelu 1 sat na 4°C uz mešanje. Ćelije su zatim isprane dva puta sa 1ml PBS/1% BSA i zatim resuspendovane u 500 µl PE-konjugovanog miš-anti-humanog IgG-Fc i inkubirane na 4°C uz mešanje 45 minuta. Uzorci su ponovo dva puta isprani sa 1ml PBS/1% BSA, resuspendovani u 300 ml PBS i analizirani korišćenjem FACScalibur protočnog citometra. Za svaki uzorak, 10000 događaja je prikupljeno u FL-2 kanalu. Histogrami su generisani korišćenjem FCS Ekspres softvera i SI-1X histogrami su prekriveni histogramima iz kontrolnog bojenja izotipa. Svih šest bispecifičnih antitela pokazalo je pomeranje histograma u odnosu na kontrolno bojenje što ukazuje na vezivanje ćelije. Ovi podaci su prikazani na FIG.12 (vezivanje ćelije A431) i FIG.13 (vezivanje ćelije BxPC3).

Primer 7: Karakterizacija SI-1C5.2 i SI-1X4.2 testovima vezivanja ćelija

[0043] Bispecifično antitelo, SI-1X4.2, monospecifična antitela, SI-1C5.2 i SI-1C1, kao i kontrolni izotip su testirani na vezivanje za ćelijske linije tumora, A431 (epidermoidni karcinom, ATCC CRL-1555) (FIG.14) i FaDu (karcinom hipofaringealnih skvamoznih ćelija, ATCC HTB-43) (FIG.15) od strane protočne citometrije. Ćelije su uzgajane u medijumu RPMI-1640 koji sadrži 10% fetalnog goveđeg seruma i sakupljene su za analizu u fazi eksponencijalnog rasta. Ćelije su jednom isprane u PBS, zatim resuspendovane u PBS 5% fetalnog goveđeg serumskog albumina (FBS) u koncentraciji od 5 x 10<6>ćelija/ml i inkubirane na 4°C tokom 15 minuta kako bi se membrane blokirale od nespecifičnog vezivanja.100 µl alikvota ćelija je dodato u 100 µl alikvota antitela (takođe razblaženih u PBS 5% FBS) u ploči sa 96 bunarčLća. Uzorci su inkubirani u primarnom antitelu 45 minuta na ledu. Ćelije su potom isprane dva puta sa 200 µl PBS 5% FBS i zatim resuspendovane u 100 µl PE-konjugovanog miš-anti-humanog IgG-Fc i inkubirane na ledu 30 minuta. Uzorci su ponovo dva puta isprani sa 200 µl PBS 5% FBS, resuspendovani u 200 µl PBS i analizirani korišćenjem FACScalibur protočnog citometra. Za svaki uzorak, 10000 događaja

2

je prikupljeno u FL-2 kanalu. Histogrami su analizirani korišćenjem FCS Ekspres softvera i određen je srednji geometrijski intenzitet fluorescencije (GMFI) za svaki skup podataka. EC50 vrednosti vezivanja su određene grafikom GMFI u odnosu na koncentraciju antitela korišćenjem softvera Graphpad Prism. Bispecifično antitelo, SI-1X4.2, pokazalo je sličan profil vezivanja kao monospecifično anti-EGFR antitelo, SI-1C5.2 sa sličnim EC50 u obe ćelijske linije. Drugo monospecifično anti-Her3 antitelo, SI-1C1, slabo se vezuje za dve ćelijske linije verovatno zbog niskog nivoa ekspresije Her3 na površini ćelija.1C5.2 i 1X4.2 sadržali su pet promena amino kiselina u poređenju sa 1C5 i 1X4 kao što je opisano u primeru 1. Ove promene su doprinele poboljšanom vezivanju za cialjne ćelije u poređenju sa roditeljskim molekulom, 1X4.

Primer 8: Anti-proliferativni efekat SI-1X antitela na ćelijske linije tumora

[0044] Kako bi se procenio potencijal inhibicije rasta anti-Her3/EGFR bispecifičnih antitela, testiran je efekat na proliferaciju ćelija A431 (ATCC CRL-1555, Manassas, Va.) koje su tumorska linija epidermoidnog karcinoma. Takođe je testiran efekat na proliferaciju BxPC3 (ATCC CRL-1687, Manassas, Va.), linije tumora adenokarcinoma pankreasa. Za svaku liniju, ćelije su zasejane u ploče za kulturu tkiva sa 96 bunarčLća u gustini od 6000 ćelija/bunariću u 100 µl RPMI-1640 medijuma koji sadrži 1% fetalnog goveđeg seruma. Posle 4 sata, dodata su test antitela u različitim koncentracijama, u rasponu od 0.0015 nM do 100 nM. Ćelije su kultivisane u prisustvu test antitela tokom 72 sata. U svaki bunar je dodato 20 ml MTS reagensa (Promega, Madison, VI) i ćelije su inkubirane na 37°C tokom 2 sata. MTS se lako preuzima od ćelija koje se aktivno razmnožavaju, redukuje se u formazan (koji lako apsorbuje svetlost na 490 nm), a zatim se izlučuje u medijum kulture. Posle inkubacije, vrednosti OD490 su merene korišćenjem BioTek (Winooski, VT) ELx800 čitača apsorbancije. Vrednosti OD490 za kontrolne ćelije (tretirane samo medijumom) su takođe dobijene na ovaj način u vreme dodavanja antitela u cilju kako bi se uspostavila osnovna metabolička aktivnost. Proliferacija se može izračunati oduzimanjem kontrolne osnovne linije OD490 od OD490 od 72 sata. Podaci iz titracije antitela izraženi su u % kontrolne populacije prema sledećoj formuli: % kontrolne proliferacije = (test proliferacija /kontrolna proliferacija) *100.

[0045] Efekti različitih bispecifičnih anti-Her3/anti-EGFR antitela na proliferaciju ćelija A431 prikazani su na FIG.16 i FIG.17. SI-1X2 je pokazao efikasniji antiproliferativni efekat od kontrolnih antitela SI-1C1 (anti-Her3), SI-1C3 (anti-EGFR) ili SI-1C1 i SI-1C3 primenjenih zajedno. SI-1X1 je pokazao antiproliferativne efekte, mada ne u meri u kojoj se vidi kod SI-1C3 i kombinacije SI-1C1 i SI-1C3. Grafikoni inhibicije kao i vrednosti IC50 su prikazane na SI. 17. Slični rezultati su primećeni za SI-1X5 i SI-1X6, gde je SI-1X6 snažniji od SI-1X5 i kontrolnog antitela SI-1C1 (anti-Her3), ali je pokazalo sličan antiproliferativni potencijal kao kontrolno antitelo SI -1C6 (anti-EGFR) i kombinacija SI-1C1 i SI-1C6. Ovo se može videti zajedno sa vrednostima IC50 na FIG.17.

[0046] Ovi molekuli su takođe testirani na antiproliferativne efekte u ćelijskoj liniji BxPC3 (FIG.18 i FIG.19). Opet, SI-1X2 je pokazao efikasniji antiproliferativni efekat od kontrolnih antitela SI-1C1 (anti-Her3), SI-1C3 (anti-EGFR) ili SI-1C1 i SI-1C3 primenjenih zajedno. SI-1X1 je bio efikasniji od SI-1C1, ali slabiji od SI-1C3 i kombinacije SI-1C1 i SI-1C3. Krive inhibicije i IC50 vrednosti su prikazane na FIG.19. Proliferacija BxPC3 bila je jače inhibirana i SI-1X5 i SI-1X6 nego sa kontrolnim antitelima SI-1C1 (anti-Her3), SI-1C6 (anti-EGFR) ili SI-1C1 i SI-1C6 u kombinaciji. Ovi podaci zajedno sa vrednostima IC50 prikazani su u FIG.19.

Primer 9: Anti-proliferativni efekat SI-1C5.2 i SI-1X4.2 na tumorske ćelijske linije

[0047] Kako bi se procenio potencijal inhibicije rasta anti-Her3/EGFR bispecifičnog antitela, ispitivan je efekat na proliferaciju ćelija FaDu (linija nazofaringealnog skvamoznog karcinoma, ATCC HTB-43) i A431 (epidermoidni karcinom, ATCC CRL-1555). Ćelije su zasejane u ploče za kulturu tkiva sa 96 bunarčLća u gustini od 6000 ćelija/bunariću u 100 µl RPMI-1640 medijuma koji sadrži 1% fetalnog goveđeg seruma. Posle 4 sata, dodata su test antitela u različitim koncentracijama, u rasponu od 0.0015 nM do 100 nM. Ćelije su kultivisane u prisustvu test antitela tokom 72 sata. U svaki bunarčLć je dodato 11 µl alamar plavog reagensa (Thermo Scientific) i ćelije su inkubirane na 37°C tokom 2 sata. Alamar plavo lako preuzimaju ćelije koje se aktivno razmnožavaju, redukuje se, a zatim se izlučuju u medijum kulture. Redukovani oblik alamar plave je jako fluorescentna. Nakon inkubacije, fluorescencija je merena korišćenjem Molekulskih Uređaja (Sunnyvale, CA) FilterMax F5 multimodnog čitača ploča korišćenjem talasne dužine ekscitacije od 535 nm i talasne dužine emisije od 595 nm. Vrednosti fluorescencije za kontrolne ćelije (tretirane samo medijumom) su takođe dobijene na ovaj način u vreme dodavanja antitela u cilju da bi se uspostavila osnovna metabolička aktivnost. Proliferacija se može izračunati oduzimanjem kontrolne osnovne fluorescencije od 72-časovnih vrednosti fluorescencije. Podaci iz titracije antitela izraženi su u % kontrolne populacije prema sledećoj formuli: % kontrolne proliferacije = (test proliferacija /kontrolna proliferacija)*100.

[0048] Efekti SI-1C5.2 i SI-1X4.2 na proliferaciju ćelija Fadu i A431 prikazani su na FIG.20 i FIG.21 respektivno. U obe ćelijske linije, SI-1X4.2 je pokazao poboljšani efikasan antiproliferativni efekat od kontrolnih antitela, SI-1C5.2 (anti-EGFR Mab), SI-1C1 (anti-Her3 Mab) ili SI-1C1 i SI- 1C7 primenjeni zajedno.

Primer 10: ADCC aktivnosti SI-1X bispecifičnih antitela

[0049] Ispitana je sposobnost SI-1X antitela da posreduju u ćelijskoj citotoksičnosti protiv nekoliko tumorskih ćelijskih linija. Puna krv je dobijena od normalnih, zdravih dobrovoljaca. Krv je razblažena sa jednakom zapreminom fiziološkog rastvora puferovanog fosfatom (PBS). Alikvoti od 20 ml razblažene krvi pažljivo su naneseni na 15 ml Ficol Packue PLUS (GE Life Sciences cat# 17-1440-02; Pittsburgh, PA). Epruvete su centrifugirane na 300 g tokom 40 minuta bez prekida. Nakon centrifugiranja većina sloja plazme je pažljivo aspirirana, a sloj trombocita i leukocita (buffy coat) (koji sadrži PBMC) je pažljivo uklonjen pipetom u najmanjoj mogućoj zapremini. PBMC su spojeni u epruvete od 50 ml i dodat je PBS da bi se svaka epruveta dovela do 50 ml. Epruvete su centrifugirane na 1300 RPM tokom 10 minuta i supernatant je pažljivo aspiriran. Ćelije su resuspendovane u 40 ml PBS i ponovo centrifugirane. Proces je ponovljen za ukupno 2 ispiranja. Nakon završnog ispiranja, ćelije su resuspendovane u 30 ml RPMI-1630 10% FBS i inkubirane preko noći na 37°C, 5% CO2.

[0050] Ciljane ćelije koje su testirane bile su linija skvamoznog karcinoma glave i vrata, FaDu (ATCC HTB-43, Manassus, VA) i ćelijska linija ne-malih ćelija adenokarcinoma pluća, NCI-H1975 (ATCC CRL-5908, Manassus, VA). Ciljane ćelije su obeležene kalceinom na sledeći način. Ćelije su uzgajane kao monoslojevi i odvojene su inkubacijom sa akutazom. Ćelije su dva puta isprane u RPMI bez seruma.1 ml ćelija pri 4 x 10<6>ćelija/ml je pomešan sa 1 ml RPMI (bez seruma) 20 µM kalceina AM (Sigma cat# C1359; St. Louis, MO). Ćelije su inkubirane na 37°C tokom 30 minuta, uz lagano mešanje svakih 10 minuta. Posle obeležavanja, ćelije su isprane dva puta sa 14 ml RPMI 10% FBS 2.5 mM probenecida (medijum za ispitivanje). Probenecid (Sigma cat# P8761; St. Louis, MO) je inhibitor anjonskog transportera i poznato je da smanjuje spontano oslobađanje intracelularnog kalceina. Ćelije su resuspendovane u 20 ml medijuma za ispitivanje i ostavljene da se oporave 2 sata na 37°C, 5% CO2. Ćelije su zatim jednom isprane sa medijumom za ispitivanje i razblažene do 200.000 ćelija/ml. Alikvoti od 50 µl (10.000 ćelija) ćelija obeleženih kalceinom su alikvoti na ploči sa okruglim dnom sa 96 bunarčLća.50 µl antitela (u 3X krajnjoj koncentraciji) je dodato ćelijama i ostavljeno da se veže 40 minuta na ledu.

PBMC od prethodnog dana su centrifugirani na 300 g tokom 5 minuta, resuspendovani u 20 ml svežeg medijuma za ispitivanje, izbrojani i razblaženi do 6 x 10<6>ćelija/ml.50 µl PBMC (300.000) je dodato u svaki bunar i ploče su inkubirane na 37°C, 5% CO2tokom 4 sata.

2

Svako antitelo je titrirano u tri primerka preko 10-strukih serijskih razblaženja, počevši od 50 nM i sve do 0.00005 nM. Takođe su postavljeni kontrolni bunarčLći koji sadrže obeležene ciljane ćelije u odsustvu antitela i efektorskih ćelija u cilju kako bi se izmerilo maksimalno i spontano oslobađanje kalceina.

[0051] Na kraju 4-časovne inkubacije, 50 µl medijuma za analizu koji sadrži 8% IGEPAL CA-630 (Sigma cat# I8896; St. Louis, MO) je dodato u kontrolne bazene koji sadrže samo obeležene ciljane ćelije (kako bi se izmerio maksimalni oslobođeni kalcein).50 ml medijuma za ispitivanje je dodato u sve ostale bazenčLće kako bi se ukupna zapremina dovela do 200 ml po bunarčLću. Ploče su centrifugirane na 2000 RPM tokom 10 minuta i 150 µl supernatanta je pažljivo prebačeno na ploče sa 96 bunarčLća sa V-dnom. Ove ploče su centrifugirane na 2000 obrtaja u minuti dodatnih 10 minuta i 100 ml supernatanta je pažljivo prebačeno u crne ploče sa 96 bunarčLća sa bistrim dnom. Kalcein u supernatantu je kvantifikovan merenjem fluorescencije svakog uzorka korišćenjem talasne dužine ekscitacije od 485 nM i talasne dužine emisije od 535 nM. Procenat specifične lize je izračunat na sledeći način:

% specifične lize = [(vrednost testnog uzorka - spontano oslobađanje)/(maksimalno oslobađanje - spontano oslobađanje)]*100

[0052] Podaci su prikazani na FIG.22 i FIG.23. Za obe ćelijske linije, SI-1X6.4 je posredovao ćelijskoj citotoksičnosti, ali nije bio naročito efikasniji od kontrolnih antitela, SI-1C6.2, SI-1C7 ili kombinacije SI-1C6.2 SI-1C7. SI-1X6.4 je posredovao u citotoksičnosti sa nižim EC50 od našeg referentnog antitela, SI-1C4. Za obe ćelijske linije, SI-1X4.2 je posredovao ćelijskoj citotoksičnosti u približno istom stepenu kao i kontrolna antitela.

Međutim, nije bio tako efikasan kao posredovanje ćelijske citotoksičnosti kao referentna vrednost, SI-1C4. Ovo je verovatno zbog nižeg afiniteta SI-1X4.2.

Primer 11: Termalna stabilnost SI-1X bispecifičnih antitela

[0053] Protein Thermal Shift Studi je izveden za analizu termičke stabilnosti proteina.

Reakcije topljenja proteina su postavljene korišćenjem Protein Thermal Shift Buffer™ i Protein Thermal Shift Die™ (Applied Biosistems). Ukratko, reakciona smeša od 20 ul sadrži 5 ug proteina, 5 ul Protein Thermal Shift Buffer™ i 2.5 µ 8X razblažene Protein Thermal Shift™ boje. Za negativnu kontrolu, umesto toga je korišćen PBS. Reakciona smeša je dodata u MicroAmp optičku reakcionu ploču i zapečDćena MicroAmp optičkim lepljivim filmom. Svaki uzorak se sastojao od 4 ponavljanja. Reakcije topljenja proteina su izvedene na Applied Biosistem PCR sistemu u realnom vremenu od 25 - 90 °C u inkrementu od 1%, a zatim analizirane pomoću Protein Thermal Shift Softvare™. FIG.24 prikazuje termičku krivu SI-1X2, SI-1X4.2, SI-1X6.4, SI-1C3, SI-1C3, SI-1C6.2, SI-1C5.2 i SI-1C7. TABELA 5 pokazuje Tm za ove molekule. Tm se definiše kao temperatura potrebna da se razvije 50% proteina. Bispecifični molkeuli, 1X2, 1X4.2 i 1X6 imaju Tm od oko 66 °C koje su uporedive sa svim MAbs (1C3, 1C6.2, 1C5.2) i Fc-scFv (1C7) molekulima.

TABELA 5

Primer 12: Stabilost seruma SI-1X bispecifičnih antitela

[0054] Stabilnost seruma molekula SI-1C5.2, SI-1C6.2, SI-1X4.2 i SI-1X6.4 određena je uporednim vezivanjem za monomerni EGFR ECD pomoću ELISA nakon inkubacije na 100 µg/mL u 95% humanom serumu (Atlanta Biologics, S40110) na 37°C tokom dana 0, 3 i 7 vremenskih tačaka sa dodatnom vremenskom tačkom od 55°C 7. dana kako bi se obezbedilo poznato stanje gde dolazi do degradacije. ELISA ploče su obložene monomernim EGFR ECD (SI-2R4) pri 3 ug/mL u PBS na 4°C preko noći. Obložene ELISA ploče su blokirane sa 3% BSA PBST tokom 2 sata na 25°C i zatim isprane 3 puta sa PBST. SI-1C6.2 i SI-1X6.4 su razblaženi 1:10 sa 1% BSA PBST i razblaženi 4x preko ploče. SI-1C5.2 i SI-1X4.2 su razblaženi 1:2 sa 1% BSA PBST i razblaženi 4x preko ploče i inkubirani na 25°C tokom 1 sata. Izvedena su još 3 ispiranja sa PBST pre hvatanja antigena sa 1 mg/mL Her3 ECD zečjeg IgG1 (SI-1R1) tokom 1 sata na 25°C u 1% BSA PBST. Još 3 ispiranja sa PBST su obavljena pre nego što je primenjeno sekundarno antitelo kozjeg antizečjeg IgG-HRP (Bio-Rad 172-1019) u razblaženju 1:5000 u 1% BSA PBST na 25°C tokom 1 sata.3 poslednja ispiranja sa PBST pre razvoja sa 100 µl Pierce Ultra TMB ELISA u 1 koraku (Pierce, 34028) tokom 10 minuta uz konačno gašenje od 100 µl 2M H2SO4. Ploče su Rčitane na 450 nm. ELISA podaci su ucrtani i krive su napravljene korišćenjem GraphPad Prism 6.

2

[0055] Rezultati ELISA su prikazani od strane EC50 na FIG.25 i ukazuju na povoljan profil manje degradacije kada se drže na 37°C. Kada se postavi na 55°C, EC50 pomera otprilike logaritam dok su molekuli podvrgnuti uslovima degradacije. Vrednosti EC50 za SI-1C5.2 pomeraju se sa 589.7 pM 0. Dana na 755.2 pM 7. Dana na 37°C (ǻ165.5 pM) sa pomeranjem na 6.522 nM 7. dana na 55°C (ǻ5932.3 pM). Vrednosti EC50 za SI-1C6 pomeraju se sa 218.2 pM 0 Dana 0 na 226.6 pM 7. dana na 37°C (ǻ8.4 pM) sa pomeranjem na 1.322 nM 7. dana na 55°C (ǻ1103 pM). Vrednosti EC50 za SI-1X4.2 pomeraju se sa 429.3 pM 0. dana na 466.7 pM 7. dana na 37°C (ǻ37.4 pM) sa pomeranjem na 4.248 nM 7. dana na 55°C (ǻ3818.7 pM). EC50 vrednosti za SI-1X6 pomeraju se sa 209.3 pM 0. dana na 237.3 pM 7. dana na 37°C (ǻ28 pM) sa pomeranjem na 4.112 nM 7. dana na 55°C ǻ3902.7 pM).

Primer 13: PK polu život SI-1X molekula

[0056] Kako bi se testirao njihov poluživot in vivo, farmakokinetički eksperimenti su izvedeni na SD pacovima. Pojedinačna, intravenozna injekcija u repnu venu bispecifičnih Abs (1C6 10 mg/kg, 1X610 mg/kg, 1X210 mg/kg, 1C432 mg/kg) data je grupama od 4 ženke pacova randomizirane prema telesnoj težini 12 g (190-212 g opseg). Krv (~150 µL) je uzeta iz orbitalnog pleksusa u svakoj vremenskoj tački, obrađena za serum i čuvana na -80°C do analize. Studija je trajala 28 dana.

[0057] Koncentracije antitela su određene korišćenjem tri ELISA testa. U testu 1 (ELISA obložen EGFR ECD), rekombinantni EGFR-zečji Fc je obložen na ploču, bunarčLči su isprani sa PBST (fosfatnim puferom fiziološkim rastvorom sa 0.05% Tween) i blokirani sa 1% BSA u PBST. Zatim su dodati serum ili standardi razređeni u serumu, nakon čega je usledilo ispiranje PBST, dodavanje HRP obeleženog zečjeg anti-humanog IgG (BOSTER) i dodatno ispiranje PBST. Zatim je dodat TMB i ploče su inkubirane 2.5 minuta u mraku. Reakcija boje je zaustavljena dodavanjem 2M sumporne kiseline. Ploča je očitana na talasnoj dužini od 450 nm. Za test 2 (ELISA obložen Her3), serum je detektovan korišćenjem slične ELISA testa, ali je rekombinantni HER3-His korišćen kao reagens za hvatanje. Za test 3 (Sendvič ELISA), rekombinantni HER3-His je obložen, dodat je serum ili standard razređen u serumu, nakon čega je usledilo ispiranje PBST, dodavanje EGFR-zečjeg Fc u PBST i dodatno ispiranje PBST. Zatim je dodat kozji anti-zečji IgG (BOSTER) obeležen HRP. PK parametri su određeni nekompartmentalnim modelom.

[0058] FIGS 26-28 pokazuju podatke o koncentraciji u serumu za četiri antitela sa tri različita testa. Prilagođeni PK parametri iz in vivo PK studija dati su u TABELI 6. PK podaci uključuju

2

poluživot, koji predstavlja beta fazu koja karakteriše eliminaciju antitela iz seruma i Cmax, koji predstavlja maksimalnu uočenu koncentraciju u serumu, AUC, koja predstavlja površinu ispod krive koncentracije vremena.

TABELA 6

Primer 14: Studije ksenograft miša

[0059] Primer je testirao aktivnost SI-1X2, SI-1X4.2 i SI-1X6 istovremene blokade EGFR, HER3 u pretkliničkim modelima Fadua (model ksenografta karcinoma skvamoznih ćelija glave i vrata) i uporedio njihovu moć sa cetuksimabom i cetuksimabom u kombinacija sa anti-HER3 antitelom.

[0060] Sve studije na miševima su sprovedene kroz institucionalnu negu životinja i korišćene su protokole za životinje koje je odobrila komisija u skladu sa institucionalnim smernicama. Šestonedeljne ženke Balb/c golih miševa kupljene su od Beijing Vital River Laboratories i smeštene u kabinete sa laminarnim protokom sa filterom vazduha sa svetlosnim ciklusom od 12 sati i hranom i vodom ad libitum. Veličina grupa životinja je izračunata da bi se izmerila razlika između placeba i grupa za lečenje od 25% sa snagom od 80% i P vrednošću od 0.01. Miševi domaćini koji su nosili ksenograft bili su nasumično i podjednako raspoređeni u kontrolne ili tretmanske grupe. Eksperimenti na životinjama su sprovedeni na kontrolisan i nezaslepljen način. Za studije ksenografta izvedene iz ćelijske linije, miševima je subkutano ubrizgano 2 x 10<6>Fadu suspendovanih 150 µl medijuma za kulturu po mišu.

2

[0061] Kada su tumori dostigli prosečnu zapreminu od 100-250 mm<3>, miševi su nasumično podeljeni u 9 grupa, sa 6 miševa po grupi. Kontrolni Nosač, 1C6 ( 25mg/kg), 1C4 (25 mg/kg), 1C6 1C1 ( 25 mg/kg+50 mg/kg), SI-1X2 (25 mg/kg), SI-1X6 (10 mg/kg), SI-1X6 (25 mg/kg), i SI-1X4.2 (10 mg/kg) , SI-1X4 (25 mg/kg). Svi testovi su davani jednom nedeljno putem intravenske injekcije. Tumori su mereni digitalnom kaliperom tokom celog perioda lečenja svaka 3 dana, a zapremina je određena korišćenjem sledeće formule:

1/23lenth3vidth2. Telesna težina miševa je zabeležena pre prve doze, a zatim svake nedelje tokom perioda lečenja i perioda oporavka.

[0062] Sve test grupe kombinacije SI-1X2, SI-1X6 i SI-1X4.2 i SI-1X6 su dale značajnu inhibiciju rasta tumora u poređenju sa pozitivnom kontrolom SI-1C6, isključujući grupu sa niskom dozom SI-1X4.2 od 10 mg/kg ( FIG.29-30). Štaviše, 2 nedelje nakon prestanka lečenja nisu primećeni recidivi, isključujući nisku dozu SI-1X4.2 od 10 mg/kg group.

Farmaceutske Kompozicije

[0063] Izraz "efikasna količina" se odnosi na količinu leka koja je efikasna da postigne željeni efekat, npr., za ublažavanje bolesti kod subjekta. Kada je bolest kancer, efikasna količina leka može inhibirati (na primer, usporiti do neke mere, inhibirati ili zaustaviti) jednu ili više od sledećih karakteristika prajmera uključujući, bez ograničenja, rast ćelija raka, proliferaciju ćelija raka, rak pokretljivost ćelija, infiltracija ćelija raka u periferne organe, metastaze tumora i rast tumora. Kada je bolest kancer, efikasna količina leka može alternativno učiniti jedno ili više od sledećeg kada se daje subjektu: usporiti ili zaustaviti rast tumora, smanjiti veličinu tumora (za prajmer, zapreminu ili masu), ublažiti donekle jedan ili više simptoma povezanih sa rakom, produžavaju preživljavanje bez progresije, rezultiraju objektivnim odgovorom (uključujući, za prajmer, delimičan ili potpun odgovor) i povećavaju ukupno vreme preživljavanja. U meri u kojoj lek može sprečiti rast i/ili ubiti postojeće ćelije kancera, on je citostatičan i/ili citotoksičan.

[0064] Što se tiče formulacije pogodnih kompozicija za davanje subjektu kao što je humani pacijent kome je potrebno lečenje, ovde otkrivena antitela mogu da se mešaju ili kombinuju sa farmaceutski prihvatljivim nosačima poznatim u tehnici u zavisnosti od izabranog načina primene. Ne postoje posebna ograničenja za načine primene ovde otkrivenih antitela, a izbor odgovarajućih puteva primene i odgovarajućih kompozicija je poznat u tehnici bez nepotrebnog eksperimentisanja.

2

[0065] Iako su mogući mnogi oblici primene, primer oblika primene bi bio rešenje za injekcije, posebno za intravensku ili intraarterijalnu injekciju. Obično, pogodna farmaceutska kompozicija za injekcije može uključivati farmaceutski pogodne nosače ili ekscipijense kao što su, bez ograničenja, pufer, površinske aktivne supstance ili stabilizator. Primer pufera mogu uključivati, bez ograničenja, acetatni, fosfatni ili citratni pufer. Primer površinski aktivnih supstanci mogu uključivati, bez ograničenja, polisorbat. Primer stabilizatora može uključivati, bez ograničenja, humani albumin.

[0066] Slično, osobe sa iskustvom u ovoj oblasti tehnike imaju sposobnost da odrede efikasnu količinu ili koncentraciju antitela koja su ovde otkrivena za efikasno lečenje stanja kao što je kancer. Druge parametre, kao što su proporcije različitih komponenti u farmaceutskoj kompoziciji, način primene i učestalost, može da dobije osoba sa iskustvom u tehnici bez nepotrebnog eksperimentisanja. Na primer, pogodan rastvor za injekciju može da sadrži, bez ograničenja, od oko 1 do oko 20, od oko 1 do oko 10 mg antitela po ml. Primerna doza može biti, bez ograničenja, od oko 0.1 do oko 20, od oko 1 do oko 5 mg/kg telesne težine. Učestalost primerne primene može biti, bez ograničenja, jednom dnevno ili tri puta nedeljno.

[0067] Iako je ovo pronalazak opisan u vezi sa određenim primerima izvođenja ili primerima, može se razumeti da su primeri izvođenja ilustrativni i da obim otkrivanja nije toliko ograničen. Alternativni primeri izvođenja predmetnog pronalaksa mogu postati očigledni onima koji imaju uobičajene veštine u oblasti na koju se ovaj pronalazak odnosi. Shodno tome, obim predmetnog pronalaska je definisan priloženim zahtevima i podržan je prethodnim opisom.

2

Claims (8)

Patentni zahtevi

1. Bispecifično tetravalentno antitelo, navedeno bispecifično tetravalentno antitelo koje sadrži:

prvi polipeptid teškog lanca IgG1, konektor i jednolančani Fv (scFv) domen polipeptida koji sadrži SEQ ID NO: 136;

drugi polipeptid teškog lanca IgG1, konektora i scFv domena koji sadrži SEQ ID NO: 136;

polipeptid prvog kapa lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 131; i

drugi kapa polipeptid lakog lanca koji sadrži SEQ ID NO: 131;

pri čemu prvi i drugi teški lanci IgG1 i prvi i drugi kapa laki lanci formiraju IgG deo sa specifičnošću vezivanja za EGFR; i

pri čemu svaki prvi i drugi scFv domen imaju specifičnost vezivanja za HER3.

2. Izolovana nukleinska kiselina koja kodira bispecifično tetravalentno antitelo prema zahtevu 1.

3. Ekspresioni vektor koji sadrži izolovanu nukleinsku kiselinu prema zahtevu 2.

4. Ćelija domaćina koja sadrži: izolovanu nukleinsku kiselinu prema zahtevu 2; ili ekspresioni vektor prema zahtevu 3, poželjno gde je ćelija domaćina prokariotska ili eukariotska ćelija.

5. Imunokonjugat koji sadrži antitelo prema zahtevu 1 i citotoksični agens.

6. Farmaceutska kompozicija, koja sadrži bispecifično tetravalentno antitelo prema zahtevu 1 i farmaceutski prihvatljiv nosač.

7. Farmaceutska kompozicija prema zahtevu 6, koja dalje sadrži radioizotop, radionuklid, toksin, terapeutski agenst, hemoterapeutski agens ili njihovu kombinaciju.

8. Farmaceutska kompozicija, koja sadrži imunokonjugat prema zahtevu 5 i farmaceutski prihvatljiv nosač.