JP7680358B2 - 癌抗原を標的とするｄｎａコード化二重特異性ｔ細胞エンゲージャーおよび癌治療薬における使用方法 - Google Patents

癌抗原を標的とするｄｎａコード化二重特異性ｔ細胞エンゲージャーおよび癌治療薬における使用方法 Download PDF

Info

Publication number
JP7680358B2
JP7680358B2 JP2021543429A JP2021543429A JP7680358B2 JP 7680358 B2 JP7680358 B2 JP 7680358B2 JP 2021543429 A JP2021543429 A JP 2021543429A JP 2021543429 A JP2021543429 A JP 2021543429A JP 7680358 B2 JP7680358 B2 JP 7680358B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
seq
antibody
nucleic acid
cell
fold
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2021543429A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2022520163A (ja
Inventor
ムツマニ カー
ウェイナー デイビッド
ペラレス－プチャルト アルフレド
デュペレット エリザベス
Original Assignee
ザ ウィスター インスティテュート オブ アナトミー アンド バイオロジー
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ザ ウィスター インスティテュート オブ アナトミー アンド バイオロジー filed Critical ザ ウィスター インスティテュート オブ アナトミー アンド バイオロジー
Publication of JP2022520163A publication Critical patent/JP2022520163A/ja
Priority to JP2025031123A priority Critical patent/JP2025109201A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7680358B2 publication Critical patent/JP7680358B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/001103—Receptors for growth factors
    • A61K39/001106—Her-2/neu/ErbB2, Her-3/ErbB3 or Her 4/ErbB4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2866—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for cytokines, lymphokines, interferons
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2869—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against hormone receptors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/3069—Reproductive system, e.g. ovaria, uterus, testes, prostate
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/32—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Pregnancy & Childbirth (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年１月３０日に出願された米国仮出願第６２／７９８，６２６号、および２０１９年４月１日に出願された米国仮出願第６２／８２７，２６５号に対する優先権を主張し、それらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、インビボで１つ以上の合成ＤＮＡコード化二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）およびその機能的断片を生成するための組換え核酸配列を含む組成物、ならびに該組成物を投与することによって対象における癌を予防および／または治療する方法に関する。
モノクローナル抗体療法は、癌治療学におけるゲームチェンジャーとなっているが、この治療は、繰り返し投与の必要性、より限定された安定性、およびコストを含むいくつかの制限を有する。モノクローナル技術のさらなる進歩は、モノクローナル抗体の特異性とＴ細胞の細胞毒性の可能性を組み合わせた二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）の開発である。ＢｉＴＥは、白血病の臨床試験において有望な結果を示している（Ｖｉａｒｄｏｔ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｂｌｏｏｄ，１２７（１１）：１４１０－６、Ｇｏｅｂｅｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，３４（１０）：１１０４－１１）が、しかし、この療法は、１サイクル当たり４～８週間の継続的な静脈内注入を必要とし（Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ，５５（１０）：１２７１－８８）、その産生に制限がある可能性があるため、適用性が限られる。抗体ベースの産物のより長寿命でより単純な産生方法は、癌免疫療法のための重要な新しいツールであり得る。
したがって、当該技術分野において、癌免疫療法のための、より長寿命で、より単純な産生、抗体ベースの産物のニーズが存在する。本発明は、このニーズを満たす。
一実施形態において、本発明は、１つ以上の合成ＤＮＡコード化二重特異性免疫細胞エンゲージャーをコードする核酸分子に関し、合成ＤＮＡコード化二重特異性免疫細胞エンゲージャーは少なくとも１つ少なくとも１つの抗原結合ドメイン、および少なくとも１つの免疫細胞エンゲージドメインを含む。
一実施形態において、抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ３３、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ１２３またはＨｅｒ２を標的とする。
一実施形態において、免疫細胞エンゲージドメインは、Ｔ細胞、抗原提示細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、またはマクロファージを標的とする。
一実施形態において、免疫細胞エンゲージドメインは、ＣＤ３、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、Ｏｘ４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ４０、ＦｃｇＲ、ＦｃｅＲ、ＦｃａＲ、またはＣＤ９５を標的とする。一実施形態において、免疫細胞エンゲージドメインは、ＣＤ３を標的とする。
一実施形態において、核酸分子は、以下から選択される１つ以上の配列をコードするヌクレオチド配列を含む：ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４または配列番号７６から選択されるアミノ酸配列に対してアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列、ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４または配列番号７６から選択されるアミノ酸配列に対してアミノ酸配列の少なくとも６５％にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列、ｃ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４または配列番号７６のアミノ酸配列、およびｄ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４または配列番号７６から選択されるアミノ酸配列の少なくとも６５％を含むアミノ酸配列の断片。
一実施形態において、核酸分子は、以下を含む：ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、および配列番号７５から選択されるヌクレオチド配列に対して核酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、および配列番号７５から選択されるヌクレオチド配列に対して核酸配列の少なくとも６５％にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列の断片、ｃ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、および配列番号７５のヌクレオチド配列、またはｄ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、および配列番号７５から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも６５％を含むヌクレオチド配列の断片。
一実施形態において、ヌクレオチド配列は、ＩｇＥリーダー配列をコードする核酸配列に作動可能に連結している。
一実施形態において、核酸分子は、発現ベクターを含む。
一実施形態において、本発明は、１つ以上の合成ＤＮＡコード化二重特異性免疫細胞エンゲージャーをコードする核酸分子を含む組成物に関し、合成ＤＮＡコード化二重特異性免疫細胞エンゲージャーは少なくとも１つ少なくとも１つの抗原結合ドメイン、および少なくとも１つの免疫細胞エンゲージドメインを含む。一実施形態において、組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。
一実施形態において、本発明は、対象における疾患または障害を予防または治療する方法であって、１つ以上の合成ＤＮＡコード化二重特異性免疫細胞エンゲージャーをコードする核酸分子、または１つ以上の合成ＤＮＡコード化二重特異性免疫細胞エンゲージャーをコードする核酸分子を含む組成物を対象に投与することを含む方法に関し、合成ＤＮＡコード化二重特異性免疫細胞エンゲージャーは少なくとも１つ少なくとも１つの抗原結合ドメイン、および少なくとも１つの免疫細胞エンゲージドメインを含む。一実施形態において、疾患は、良性腫瘍、癌、または癌関連疾患である。
一実施形態において、本発明は、１つ以上の合成抗体をコードする核酸分子に関し、核酸分子は、抗ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）合成抗体をコードするヌクレオチド配列、抗ＨＥＲ２合成抗体の断片をコードするヌクレオチド配列、ＳｃＦｖ抗ＨＥＲ２合成抗体をコードするヌクレオチド配列、またはＳｃＦｖ抗ＨＥＲ２合成抗体の断片をコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、ヌクレオチド配列は、配列番号６２、配列番号６４、または配列番号６６に対してアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列をコードする。一実施形態において、ヌクレオチド配列は、配列番号６２、配列番号６４、または配列番号６６に対してアミノ酸配列の少なくとも６５％にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列の断片をコードする。一実施形態において、ヌクレオチド配列は、配列番号６２、配列番号６４、または配列番号６６のアミノ酸配列をコードする。一実施形態において、ヌクレオチド配列は、配列番号６２、配列番号６４、または配列番号６６の少なくとも６５％を含むアミノ酸配列の断片をコードする。
一実施形態において、核酸分子は、配列番号６１、配列番号６３、または配列番号６５の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、核酸分子は、配列番号６１、配列番号６３、または配列番号６５のヌクレオチド配列に対して核酸配列の少なくとも６５％にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列の断片を含む。一実施形態において、核酸分子は、配列番号６１、配列番号６３、または配列番号６５の選択されたヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、核酸分子は、配列番号６１、配列番号６３、または配列番号６５のヌクレオチド配列の少なくとも６５％を含むヌクレオチド配列の断片を含む。
一実施形態において、ヌクレオチド配列は、ＩｇＥリーダー配列をコードする核酸配列に作動可能に連結している。
一実施形態において、核酸分子は、発現ベクターを含む。
一実施形態において、本発明は、１つ以上の合成抗体をコードする核酸分子を含む組成物に関し、核酸分子は、抗ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）合成抗体をコードするヌクレオチド配列、抗ＨＥＲ２合成抗体の断片をコードするヌクレオチド配列、ＳｃＦｖ抗ＨＥＲ２合成抗体をコードするヌクレオチド配列、またはＳｃＦｖ抗ＨＥＲ２合成抗体の断片をコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。
一実施形態において、本発明は、対象における疾患を予防または治療する方法であって、１つ以上の合成抗体をコードする核酸分子を対象に投与することを含む方法に関し、核酸分子は、抗ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）合成抗体をコードするヌクレオチド配列、抗ＨＥＲ２合成抗体の断片をコードするヌクレオチド配列、ＳｃＦｖ抗ＨＥＲ２合成抗体をコードするヌクレオチド配列、またはＳｃＦｖ抗ＨＥＲ２合成抗体の断片をコードするヌクレオチド配列を含む。
一実施形態において、本発明は、対象における疾患を予防または治療する方法であって、１つ以上の合成抗体をコードする核酸分子を対象に投与することを含む方法に関し、核酸分子は、抗ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）合成抗体をコードするヌクレオチド配列、抗ＨＥＲ２合成抗体の断片をコードするヌクレオチド配列、ＳｃＦｖ抗ＨＥＲ２合成抗体をコードするヌクレオチド配列、またはＳｃＦｖ抗ＨＥＲ２合成抗体の断片をコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、疾患は、ＨＥＲ２発現に関連する癌である。一実施形態において、疾患は、卵巣癌または乳癌である。
一実施形態において、本発明は、対象における疾患を予防または治療する方法であって、１つ以上の合成抗体をコードする核酸分子を含む組成物を対象に投与することを含む方法に関し、核酸分子は、抗ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）合成抗体をコードするヌクレオチド配列、抗ＨＥＲ２合成抗体の断片をコードするヌクレオチド配列、ＳｃＦｖ抗ＨＥＲ２合成抗体をコードするヌクレオチド配列、またはＳｃＦｖ抗ＨＥＲ２合成抗体の断片をコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、疾患は、ＨＥＲ２発現に関連する癌である。一実施形態において、疾患は、卵巣癌または乳癌である。
ＢＣＭＡＤＢｉＴＥ、ＣＤ３３ＤＢｉＴＥ、およびＣＤ１２３ＤＢｉＴＥでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の上清の例示的なウェスタンブロットを示す。 ＥＧＦＲｖＩＩＩＤＢｉＴＥ、ＦＳＨＲＤＢｉＴＥ、ＰＳＭＡＤＢｉＴＥ、およびＣＤ１９ＤＢｉＴＥでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞の上清の例示的なウェスタンブロットを示す。 実験設計の図を示す。３つの独立したドナー由来のＰＢＭＣを、５μｌのＣＤ１９ＤＢｉＴＥまたは対照ＤＢｉＴＥ（ＥＧＦＲｖＩＩＩＤＢｉＴＥ）の上清の存在下で、三重で５時間培養した。インキュベーション後、細胞は、Ｂ細胞およびＴ細胞マーカーについて染色され、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋細胞）およびＴ細胞の早期活性化に対する潜在的な細胞溶解活性を決定した。 ３つ全てのドナーが、ＣＤ１９ＤＢｉＴＥの存在下でＢ細胞（ＰＢＭＣ混合物におけるＣＤ１９＋細胞）の枯渇を示し、対照ＤＢｉＴＥの存在下では示さなかったことを示す例示的な実験結果を示す。 ３つ全てのドナーが、ＣＤ１９ＤＢｉＴＥの存在下でＴ細胞における初期活性化マーカーＣＤ６９の増加を示し、対照ＤＢｉＴＥの存在下では示さなかったことを示す例示的な実験結果を示す。 図６Ａ～図６Ｆを含み、ＨＥＲ２ ＤＮＡコード化モノクローナル抗体（ＤＭＡｂ）の設計、発現および結合を示す。図６Ａは、ＨＥＲ２ＤＭＡｂをコードするＤＮＡ構築物の概略図を示す。図６Ｂは、２９３Ｔ細胞で発現したＨＥＲ２ＤＭＡｂまたはＦＳＨＲ構築物のウェスタンブロットを示す。図６Ｃは、ＤＮＡ注射およびエレクトロポレーションの６４日後にＨＥＲ２ＤＭＡｂまたはｐＶａｘ単独でエレクトロポレーションされたマウス血清由来のヒトＩｇＧのウェスタンブロットを示す（群あたりｎ＝５マウス）。図６Ｄは、ＨＥＲ２ＤＭＡｂでエレクトロポレーションされたヌードマウスの血清由来の、ＥＬＩＳＡによって定量されたヒトＩｇＧの発現レベルを示す（群あたりｎ＝５匹のマウス、２つの独立した実験）。図６Ｅは、プレートをヒトＨＥＲ２タンパク質でコーティングした後の、ＨＥＲ２ＤＭＡｂまたはｐＶａｘを発現するマウス由来の血清の結合ＥＬＩＳＡを示す。図６Ｆは、ヒトＨＥＲ２発現を伴う、および伴わないマウス乳癌細胞株へのＨＥＲ２ＤＭＡｂの結合を示すフローサイトメトリープロットを示す。 図７Ａ～図７Ｆを含み、ＨＥＲ２ＤＮＡコード化モノクローナル抗体（ＤＭＡｂ）のインビトロ発現および抗腫瘍活性を示す。図７Ａは、ＤＮＡトランスフェクションの４８時間後の２９３ＴまたはＲＤ細胞の上清由来の定量化されたＨＥＲ２ＤＭＡｂの発現レベルを示す（ｎ＝３／群）。図７Ｂは、ＨＥＲ２ＤＭＡｂまたはｐＶａｘ血清または陽性対照としてのＨｕ４Ｄ５抗体の存在下でのＯＶＣＡＲ３－ルシフェラーゼ（１０，０００）細胞でのヒトＰＢＭＣ（５０万）の培養から結果として生じるインビトロ細胞毒性を示す（三重）。図７Ｃは、ＨＥＲ２ＤＭＡｂまたはｐＶａｘ注射マウス由来の血清の存在下でのＨＥＲ２陰性細胞株ＭＤＡ－ＭＤ－２３１（１０，０００）細胞とヒトＰＢＭＣ（５０万）との共培養から結果として生じるインビトロ細胞毒性を示す（三重）。図７Ｄは、ＨＥＲ３ＤＭＡｂ、ｐＶａｘ血清存在下、または血清の添加なしで、マクロファージによって食作用されたＯＶＣＡＲ３細胞のパーセンテージおよび代表的なフローサイトメトリープロットを示す（三重）。図７Ｅは、ＨＥＲ２ＤＭＡｂまたはｐＶａｘ注射マウス由来の血清の存在下でのＯＶＣＡＲ３（１０，０００）細胞とＮｕ／Ｊマウス由来の脾細胞（５０万）との共培養から結果として生じるインビトロ細胞毒性を示す（三重）。図７Ｆは、Ｎｕ／Ｊ血清における０日目および２５２日目のマウス抗ＨＥＲ２ＤＭＡｂ ＩｇＧを表す（三重）。ＡＮＯＶＡ。Ｔ検定。＊＊＊ｐ＜０．００１。ｎｓ：有意ではない。 図８Ａ～図８Ｃを含み、卵巣癌においてＨＥＲ２ＤＭＡｂがＨＥＲ２に結合することを示す。図８Ａは、抗ＨＥＲ２抗体２４Ｄ２を使用したフローサイトメトリーによる卵巣癌細胞株ＯＶＣＡＲ３、ＳＫＯＶ３、ＣＡＯＶ３、ＴＯＶ－２１ＧおよびＲＮＧ１におけるＨＥＲ２発現を示す。図８Ｂは、ＨＥＲ２ＤＭＡｂを発現するマウス由来の血清におけるＨＥＲ２発現を示す。図８Ｃは、ＨＥＲ２ＤＭＡｂ発現マウス由来の血清で染色されたＯＶＣＡＲ３腫瘍の免疫蛍光イメージングを示す。スケールバー１０μｍ。 図９Ａ～図９Ｆを含み、ＨＥＲ２ＤＭＡｂがＨＥＲ２シグナル伝達をブロックし、ＡＤＣＣを誘導し、インビボで癌進行を遅延させることを示す。図９Ａは、ＨＥＲ２ＤＭＡｂまたは対照血清の存在下でＨＥＲ２－ＨＥＲ３アゴニストＨＲＧで処理されたＯＶＣＡＲ３細胞由来の総およびリン酸化Ａｋｔならびにβ－アクチンを示すウェスタンブロットを示す。図９Ｂは、ＯＶＣＡＲ３でのＨＥＲ２ＤＭＡｂまたは無関係なＩｇＧのＡＤＣＣアッセイを示すヒストグラムを示す。図９Ｃは、ＨＥＲ２ＤＭＡｂまたは空のベクターで処理されたヌードマウスに移植されたＯＶＣＡＲ３腫瘍の成長曲線を示す（群あたりｎ＝５匹のマウスの２つの独立した実験）。図９Ｄは、ＨＥＲ２ＤＭＡｂまたは空のベクターで処理されたＯＶＣＡＲ３を保有するマウスの血清におけるＨＥＲ２ＤＭＡｂのレベルを示す（群あたりｎ＝５匹のマウスの代表する２つの独立した実験）。図９Ｅは、ＯＶＣＡＲ３、Ｂｒｐｋｐ１１０、およびＢｒｐｋｐ１１０－ｈＨＥＲ２腫瘍細胞によるＨＥＲ２の発現を示すフローサイトメトリープロットを示す。図９Ｆは、ＨＥＲ２ＤＭＡｂまたは空のｐＶａｘプラスミドで処理されたＣ５７Ｂｌ／６マウスに移植されたＢｒｐｋｐ１１０－ｈＨＥＲ２腫瘍の成長曲線を示す（群あたりｎ＝５匹のマウスの代表する２つの独立した実験）。二元配置ＡＮＯＶＡ、ｔ検定、ログランク。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊＊ｐ＜０．００１。 図１０Ａ～図１０Ｊを含み、ＨＥＲ２ＤＢｉＴＥの結合、細胞毒性、活性化、およびインビボ有効性を示す。図１０Ａは、ＥＬＩＳＡの結合によって測定された組換えＨＥＲ２タンパク質へのＨＥＲ２ＤＢｉＴＥ結合を示す（三重）。図１０Ｂは、ＥＬＩＳＡの結合によって測定された組換えＣＤ３タンパク質へのＨＥＲ２ＤＢｉＴＥ結合を示す（三重）。図１０Ｃは、ＨＥＲ２ＤＢｉＴＥまたはｐＶａｘ血清の存在下でのＴ細胞とＯＶＣＡＲ３とのコインキュベーションの２４時間後にウェル中に存在するＴ細胞の数を示す（三重）。図１０Ｄは、ＯＶＣＡＲ３細胞の存在下でのＨＥＲ２ＤＢＩｉＴＥまたはｐＶａｘ血清でのＴ細胞の活性化の５日後のアポトーシス（アネキシンＶ＋）細胞の存在を示す。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズが陽性対照として使用された（三重）。図１０Ｅは、ＨＥＲ２ＤＢＩｉＴＥまたはｐＶａｘ血清およびＯＶＣＡＲ３細胞の存在下で２４時間培養したＴ細胞の上清におけるＩＦＮγとして測定されたＴ細胞活性化を示す。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズが陽性対照として使用され、Ｔ細胞単独が陰性対照として使用された（三重）。図１０Ｆは、ＨＥＲ２ＤＢＩｉＴＥまたはｐＶａｘ血清およびＯＶＣＡＲ３細胞の存在下で７２時間培養されたＴ細胞におけるＣＤ６９の発現として測定されたＴ細胞活性化を示す。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズが陽性対照として使用され、Ｔ細胞のみが陰性対照として使用された（三重）。図１０Ｇは、ＨＥＲ２ＤＢＩｉＴＥまたはｐＶａｘ血清およびＯＶＣＡＲ３細胞の存在下で７２時間培養されたＴ細胞におけるＰＤ－１の発現として測定されたＴ細胞活性化を示す。抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズが陽性対照として使用され、Ｔ細胞単独が陰性対照として使用された（三重）。図１０Ｈは、ＨＥＲ２ＤＢｉＴＥまたはｐＶａｘマウス由来の血清の存在下、異なる比率でのＴ細胞とＯＶＣＡＲ３細胞との共培養から結果として生じるインビトロ細胞毒性を示す（三重で２つの独立した実験）。図１０Ｉは、Ｎｕ／Ｊ血清における０日目および６４日目のマウス抗ＨＥＲ２ＤＢｉＴＥ ＩｇＧを示す（三重）。図１０Ｊは、ＨＥＲ２ＤＢｉＴＥ、またはＰＢＭＣなしの空のベクターおよびＰＢＭＣを伴うＨＥＲ２ＤＢｉＴＥで処理されたＮＳＧマウスに移植したＯＶＣＡＲ３腫瘍の平均成長曲線、および腫瘍の画像を示す（群あたりｎ＝５匹のマウス、Ｘは腫瘍なしを示す（完全拒絶））。Ｔ検定、ＡＮＯＶＡ、二元配置ＡＮＯＶＡ。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１＊＊＊ｐ＜０．００１。ｎｓ：有意ではない。 図１１Ａ～図１１Ｆを含み、ＨＥＲ２ＤＢｉＴＥの生成、発現、および抗腫瘍活性を示す。図１１Ａは、ＨＥＲ２ＤＭＡｂをコードするＤＮＡ構築物の概略図、ならびにＨＥＲ２およびＴＣＲをエンゲージするＢｉＴＥの漫画を示す。図１１Ｂは、ＤＮＡ注射およびエレクトロポレーションの２１日後および２８日後にＨＥＲ２ＤＢｉＴＥまたはｐＶａｘ空のベクターでエレクトロポレーションした１μｌのマウス血清由来のヒトＩｇＧのウェスタンブロットを示す（代表の群あたりｎ＝５匹のマウス）。図１１Ｃは、ＨＥＲ２ＤＢｉＴＥまたはｐＶａｘマウス由来の血清の存在下、異なる比率でＴ細胞とＯＶＣＡＲ３細胞との共培養から結果として生じるインビトロ細胞毒性を示す（三重で２つの独立した実験）。図１１Ｄは、標的としてＯＶＣＡＲ３を使用したエフェクター：標的の比が５：１で１００μｇの注射およびエレクトロポレーションの前およびその後の種々の時点でのＨＥＲ２ＤＢｉＴＥで処理されたマウス由来の血清のインビトロ細胞毒性を示す（三重）。図１１Ｅは、ＨＥＲ２ＤＢｉＴＥまたは空のベクターで処理されたＮＳＧマウスに移植されたＯＶＣＡＲ３腫瘍の平均成長曲線を示す（群あたりｎ＝１０匹のマウス）。図１１Ｆは、ＨＥＲ２ＤＢｉＴＥまたは空のベクターで処理されたＮＳＧマウスに移植されたＯＶＣＡＲ３腫瘍の個々の成長曲線を示す（群あたりｎ＝１０匹のマウス）。二元配置ＡＮＯＶＡ。＊＊＊ｐ＜０．００１。
本発明は、二重特異性免疫細胞エンゲージ抗体（ＤＩＣＥ）をコードする組換え核酸配列、二重特異性Ｔ細胞エンゲージ（ＤＢｉＴＥ）抗体をコードする組換え核酸配列、それらの断片、それらのバリアント、またはそれらの組み合わせを含む組成物に関する。組成物は、ＤＩＣＥまたはＤＢｉＴＥのインビボ発現および形成を促進するために、それを必要とする対象に投与され得る。
一実施形態において、ＤＩＣＥまたはＤＢｉＴＥは、少なくとも１つの抗原結合ドメイン、および少なくとも１つの免疫細胞エンゲージドメインを含む。一実施形態において、免疫細胞エンゲージドメインは、免疫細胞の表面上で発現される抗原に特異的である。免疫細胞は、Ｔ細胞、抗原提示細胞、ＮＫ細胞、好中球、およびマクロファージを含むが、これらに限定されない。
様々な実施形態において、免疫細胞エンゲージドメインは、免疫細胞特異的受容体分子への結合に特異的な抗体、その断片、またはそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、免疫細胞特異的受容体分子は、Ｔ細胞表面抗原である。一実施形態において、Ｔ細胞特異的受容体分子は、ＣＤ３、ＴＣＲ、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、Ｏｘ４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ４０、ＦｃｇＲ、ＦｃｅＲ、ＦｃａＲ、およびＣＤ９５のうちの１つである。
様々な実施形態において、抗原結合ドメインは、抗原への結合に特異的な抗体、その断片、またはそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、抗体またはその断片は、ＤＮＡコード化モノクローナル抗体（ＤＭＡｂ）またはその断片もしくはバリアントである。
一実施形態において、ＤＩＣＥまたはＤＢｉＴＥの抗原結合ドメインは、標的抗原への結合、およびＴ細胞を標的抗原に動員するのに特異的である。一実施形態において、標的抗原は、腫瘍抗原である。一実施形態において、抗原は、ＣＤ１９、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ３３、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ１２３、およびヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２）である。したがって、一実施形態において、本発明は、１つ以上のＤＩＣＥまたはＤＢｉＴＥを含む組成物、および対象における癌または癌に関連する疾患もしくは障害を治療または予防に使用するための方法を提供する。
定義
別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先するであろう。本発明の実施または試験において本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料を使用することができるが、好ましい方法および材料が以下に記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体において参照により組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、および例は、例示的のみであり、限定的であることを意図しない。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有すること」、「有する」、「できる」、「含有する」という用語およびそれらの変形は、本明細書で使用される場合、追加の行為または構造の可能性を妨げない、オープンエンドな移行句、用語、または語であることを意図する。「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」という単数形は、文脈が別段に明示しない限り、複数の参照物を含む。本開示はまた、明示的に記載されるか否かにかかわらず、本明細書で提示される実施形態またはエレメント「を含む」、「からからなる」、および「から本質的になる」他の実施形態を企図する。
「抗体」とは、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥの抗体、または断片、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄを含む、その断片もしくは誘導体、ならびに一本鎖抗体、およびそれらの誘導体を意味し得る。抗体は、哺乳動物の血清試料から単離された抗体、ポリクローナル抗体、親和性精製抗体、またはそれらの混合物であり得、これは、所望のエピトープまたはそれに由来する配列に対する十分な結合特異性を示す。
本明細書で互換的に使用される「抗体断片」または「抗体の断片」とは、抗原結合部位または可変領域を含む無傷の抗体の一部分を指す。部分は、無傷の抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（すなわち、抗体アイソタイプに応じて、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４）を含まない。抗体断片の例は、これらに限定されないが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’－ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、１つの軽鎖可変ドメインのみを含む一本鎖ポリペプチド、軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含む一本鎖ポリペプチド、１つの重鎖可変領域のみを含む一本鎖ポリペプチド、および重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含む一本鎖ポリペプチドを含む。
「抗原」とは、宿主において免疫応答を生成する能力を有するタンパク質を指す。抗原は、抗体によって認識され、結合され得る。抗原は、体内から、または外部環境が起源であり得る。
本明細書で使用される「コード配列」または「コード核酸」とは、本明細書に示されるように、抗体をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を指すことを意味し得る。コード配列は、プロモーターを含む制御エレメントに作動可能に連結した開始および終結シグナル、ならびに核酸を投与される個体または哺乳動物の細胞における発現を誘導することができるポリアデニル化シグナルをさらに含み得る。コード配列は、シグナルペプチドをコードする配列をさらに含み得る。
本明細書で使用される「補体」または「相補的」とは、核酸が核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体間のワトソン－クリック（例えば、Ａ－Ｔ／ＵおよびＣ－Ｇ）またはフーグスティーン塩基対合を意味し得ることを意味し得る。
本明細書で使用される「定電流」とは、組織、または当該組織を画定する細胞が、電気パルスが同組織に送達される期間にわたって受けるか、または経験する電流を定義する。電気パルスは、本明細書に記載されるエレクトロポレーションデバイスから送達される。本明細書で提供されるエレクトロポレーションデバイスは、好ましくは、即時フィードバックを有する、フィードバックエレメントを有するため、この電流は、電気パルスの寿命にわたって当該組織において定アンペア数に留まる。フィードバックエレメントは、パルスの持続期間を通して組織（または細胞）の抵抗を測定し、エレクトロポレーションデバイスにその電気エネルギー出力を変更させる（例えば、電圧を増加させる）ことができ、したがって同じ組織における電流は、電気パルス（マイクロ秒台）を通して、およびパルス間で一定のままである。いくつかの実施形態において、フィードバックエレメントは、コントローラを含む。
本明細書で使用される「電流フィードバック」または「フィードバック」とは、互換的に使用され得、提供されたエレクトロポレーションデバイスの活性応答を意味し得、これは、電流を一定のレベルで維持するために、電極間の組織における電流を測定し、適宜にＥＰデバイスによって送達されるエネルギー出力を変更することを含む。この一定のレベルは、パルス配列または電気処理の開始前にユーザによって予め設定される。その中の電気回路が、電極間の組織における電流を連続的に監視し、その監視された電流（または組織内の電流）を予め設定された電流と比較し、エネルギー出力調節を連続的に行って、監視される電流を予め設定されたレベルに維持することができるように、フィードバックは、エレクトロポレーションデバイスのエレクトロポレーション構成要素、例えば、コントローラによって達成され得る。フィードバックループは、アナログ閉ループフィードバックであるため、即時であり得る。
本明細書で使用される「分散電流」とは、本明細書に記載されるエレクトロポレーションデバイスの様々な針電極アレイから送達される電流のパターンを意味し得、パターンは、エレクトロポレートされる組織の任意の領域上でのエレクトロポレーション関連熱ストレスの発生を最小化するか、または好ましくは排除する。
本明細書で互換的に使用される「エレクトロポレーション」、「電気透過化」、または「電気運動向上」（「ＥＰ」）とは、生体膜において微視的経路（細孔）を誘導するための膜貫通電場パルスの使用を指し得、それらの存在は、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬物、イオン、および水などの生体分子が細胞膜の一方の側から他方へと通過することを可能にする。
本明細書で使用される「内因性抗体」とは、体液性免疫応答の誘導のために有効用量の抗原が投与される対象において生み出された抗体を指し得る。
本明細書で使用される「フィードバックメカニズム」とは、ソフトウェアまたはハードウェア（ファームウェア）のいずれかによって実行されるプロセスを指し得、そのプロセスは、（エネルギーのパルスの送達の前、その間、および／またはその後）所望の組織のインピーダンスを受け、現在値、好ましくは電流と比較し、予め設定された値を達成するために送達されるエネルギーのパルスを調節する。フィードバックメカニズムは、アナログ閉ループ回路によって実行され得る。
「断片」は、機能している、すなわち、所望の標的と結合し得、全長抗体と同じ意図される効果を有する抗体のポリペプチド断片を意味し得る。抗体の断片は、Ｎ末端および／またはＣ末端から少なくとも１つのアミノ酸が欠損している場合を除いて、完全長と１００％同一であってもよく、各場合において、１位にシグナルペプチドおよび／またはメチオニンが存在するかまたは存在しない。断片は、追加される任意の異種シグナルペプチドを除く、特定の完全長抗体の長さの２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上のパーセントを含み得る。断片は、抗体と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上同一であるポリペプチドの断片を含み得、加えて、同一性パーセントを計算する時に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドを含み得る。断片は、Ｎ末端メチオニンおよび／または免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをさらに含み得る。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドは、抗体の断片に連結され得る。
抗体をコードする核酸配列の断片は、５’末端および／または３’末端から少なくとも１つのヌクレオチドを欠損している場合を除いて、完全長と１００％同一であり得、各場合において、１位にシグナルペプチドおよび／またはメチオニンをコードする配列が存在するかまたは存在しない。断片は、追加される任意の異種シグナルペプチドを除く、特定の完全長コード配列の長さの２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上のパーセントを含み得る。断片は、抗体と９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上同一であるポリペプチドをコードする断片を含み得、加えて、任意に、同一性パーセントを計算する時に含まれないＮ末端メチオニンまたは異種シグナルペプチドをコードする配列を含み得る。断片は、Ｎ末端メチオニンおよび／または免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、ＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドのコード配列をさらに含み得る。Ｎ末端メチオニンおよび／またはシグナルペプチドをコードするコード配列は、コード配列の断片に連結され得る。
本明細書で使用される「遺伝子構築物」は、抗体などのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。コード配列は、核酸分子が投与される個体の細胞における発現を誘導することができるプロモーターおよびポリアデニル化シグナルを含む調節エレメントに作動可能に連結された開始および終結シグナルを含む。本明細書で使用される場合、「発現可能な形態」という用語は、個体の細胞に存在する時に、コード配列が発現されるように、タンパク質をコードするコード配列に作動可能に連結した必要な制御エレメントを含む遺伝子構築物を指す。
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において本明細書で使用される「同一」または「同一性」は、配列が特定された領域にわたって同じである残基の特定されたパーセントを有することを意味し得る。パーセンテージは、２つの配列を最適に整列させ、指定された領域で２つの配列を比較し、両方の配列で同一の残基が発生する位置の数を決定して、一致する位置の数を算出し、一致する位置の数を指定された領域内の位置の総数で割り、結果に１００を掛けて、配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算できる。２つの配列の長さが異なる場合、またはアラインメントが１つ以上の付着末端を生成し、指定された比較領域に単一の配列のみが含まれる場合、単一の配列の残基は、計算の分母に含まれるが分子には含まれない。ＤＮＡとＲＮＡを比較する時、チミン（Ｔ）とウラシル（Ｕ）は同等とみなされる場合がある。同一性は、手動で、またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを使用することによって、実行され得る。
本明細書で使用される「インピーダンス」とは、フィードバックメカニズムを議論する時に使用され得、オームの法則に従って電流値に変換することができ、したがって、予め設定された電流との比較を可能にする。
本明細書で使用される「免疫応答」は、１つ以上の核酸および／またはペプチドの導入に応答した、宿主の免疫系、例えば、哺乳動物の免疫系の活性化を意味し得る。免疫応答は、細胞性もしくは体液性応答、または両方の形態であり得る。
本明細書で使用される「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、一緒に共有結合した少なくとも２つのヌクレオチドを意味し得る。一本鎖の描写はまた、相補鎖の配列を定義する。したがって、核酸はまた、描写された一本鎖の相補鎖も包含する。核酸の多くのバリアントは、所与の核酸と同じ目的で使用することができる。したがって、核酸はまた、実質的に同一の核酸およびその相補体を包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズし得るプローブを提供する。したがって、核酸はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブを包含する。
核酸は、一本鎖または二本鎖であり得るか、または二本鎖と一本鎖配列の両方の部分を含み得る。核酸は、ＤＮＡ、ゲノムおよびｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ、またはハイブリッドであり得、核酸は、デオキシリボ－およびリボ－ヌクレオチドの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含み得る。核酸は、化学合成方法によって、または組換え方法によって得られ得る。
本明細書で使用される「作動可能に連結」とは、遺伝子の発現が、これによって空間的に接続される、プロモーターの制御下にあることを意味し得る。プロモーターは、その制御下で遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に配置され得る。プロモーターと遺伝子との間の距離は、プロモーターが由来する遺伝子においてそれが制御するプロモーターと遺伝子との間の距離とおよそ同じであり得る。当該技術分野で既知であるように、この距離における変動は、プロモーター機能の喪失なしに順応され得る。
本明細書で使用される「ペプチド」、「タンパク質」、または「ポリペプチド」は、アミノ酸の連結配列を意味することができ、天然、合成、または天然および合成の修飾もしくは組み合わせであり得る。
本明細書で使用される「プロモーター」は、細胞における核酸の発現を与え、活性化し、または向上させることができる合成または天然由来分子を意味し得る。プロモーターは、その発現をさらに向上させるため、ならびに／または空間的発現および／もしくは時間的発現を変更するために、１つ以上の特異的転写制御配列を含み得る。プロモーターはまた、転写の開始部位から数千塩基対ほどに配置することができる、遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含み得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む源に由来し得る。プロモーターは、構成的に、あるいは細胞、発現が起こる組織もしくは器官に対して、または発現が起こる発生段階に対して、または生理学的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤などの外部刺激に応答して差別的に、遺伝子構成要素の発現を制御し得る。プロモーターの代表的な例には、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータ－プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ－ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーター、およびＣＭＶ ＩＥプロモーターが挙げられる。
「シグナルペプチド」および「リーダー配列」は、本明細書で互換的に使用され、本明細書に記載されるタンパク質のアミノ末端で連結することができるアミノ酸配列を指す。シグナルペプチド／リーダー配列は、典型的には、タンパク質の局在化を誘導する。本明細書で使用されるシグナルペプチド／リーダー配列は、好ましくは、それが産生される細胞からのタンパク質の分泌を容易にする。シグナルペプチド／リーダー配列は、多くの場合、タンパク質の残部から開裂され、多くの場合、細胞からの分泌後、成熟タンパク質と称される。シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質のＮ末端で連結される。
本明細書で使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、第１の核酸配列（例えば、プローブ）が第２の核酸配列（例えば、標的）に、核酸の複合体混合物のようにハイブリダイズするであろう平均条件を意味し得る。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、異なる状況では異なるであろう。ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度ｐＨでの特定の配列についての熱融解点（Ｔm）よりも約５～１０℃低くなるように選択され得る。Ｔmは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下）であり得る（標的配列が過剰に存在するため、Ｔmでは、プローブの５０％は平衡状態で占められる）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０～８．３で約０．０１～１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）などの、約１．０Ｍナトリウムイオン未満であり、温度が、短いプローブ（例えば、約１０～５０ヌクレオチド）について少なくとも約３０°Ｃおよび長いプローブ（例えば、約５０ヌクレオチド超）について少なくとも約６０°Ｃであるものであり得る。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加で達成され得る。選択的または特異的ハイブリダイゼーションについて、正のシグナルは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２～１０倍であり得る。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下を含む：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベート、または５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベート、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で６５℃で洗浄。
本明細書で使用される「対象」および「患者」は、これらに限定されないが、哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、およびマウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルまたはアカゲザルなどのサル、チンパンジーなど）、ならびにヒト）を含む、任意の脊椎動物を互換的に指す。いくつかの実施形態において、対象は、ヒトまたは非ヒトであり得る。対象または患者は、他の形態の治療を受けていてもよい。
本明細書で使用される「実質的に相補的」とは、第１の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、またはそれ以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、第２の配列の補体に少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であること、または２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味し得る。
本明細書で使用される「実質的に同一」とは、第１の配列が、第２の配列の補体に実質的に相補的である場合、第１および第２の配列が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、または核酸に関して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であることを意味し得る。
本明細書で使用される「合成抗体」は、本明細書に記載される組換え核酸配列によってコードされ、かつ対象において生成される抗体を指す。
本明細書で使用される「治療」または「治療すること」は、疾患を予防、抑制、抑圧、または完全に排除する手段を通した疾患からの対象の保護を意味し得る。疾患を予防することは、本発明の抗体を、疾患の発症前に対象に投与することを含む。疾患を抑制することは、本発明の抗体を、疾患の誘発後だがその臨床的出現前に対象に投与することを含む。疾患を抑圧することは、本発明の抗体を、疾患の臨床的出現後に対象に投与することを含む。
核酸に関して本明細書で使用される「バリアント」は、（ｉ）参照されたヌクレオチド配列の部分もしくは断片、（ｉｉ）参照されたヌクレオチド配列もしくはその部分の補体、（ｉｉｉ）参照された核酸もしくはその補体に実質的に同一である核酸、または（ｉｖ）参照された核酸、その補体、もしくはそれに実質的に同一である配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を意味し得る。
アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるペプチドまたはポリペプチドに対する「バリアント」は、少なくとも１つの生物学的活性を保持する。バリアントはまた、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照されたタンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を類似の特性（例えば、親水性、荷電領域の程度および分布）の異なるアミノ酸で置き換えることは、典型的には小さな変更を含むものとして当該技術分野で認識される。これらの小さな変更は、当該技術分野で理解されるように、部分的に、アミノ酸のハイドロパシーインデックスを考慮することによって特定することができる。Ｋｙｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５－１３２（１９８２）。アミノ酸のハイドロパシーインデックスは、その疎水性および電荷の考慮に基づく。類似のハイドロパシーインデックスのアミノ酸は、置換され、依然としてタンパク質機能を保持し得ることが当該技術分野で既知である。一態様では、±２のハイドロパシーインデックスを有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性はまた、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらすであろう置換を明らかにするために使用することができる。ペプチドの文脈におけるアミノ酸の親水性の考慮は、そのペプチドの最も大きな局所平均親水性、抗原性および免疫原性と十分に相関することが報告されている有用な尺度の計算を可能にする。米国特許第４，５５４，１０１号は、参照によって本明細書に完全に組み込まれる。類似の親水性値を有するアミノ酸の置換は、当該技術分野で理解されるように、生物学的活性、例えば、免疫原性を保持するペプチドをもたらすことができる。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸で実行され得る。アミノ酸の疎水性インデックスおよび親水性値の両方は、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響される。その観察と一貫して、生物学的機能と適合性であるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、および他の特性によって明らかになるように、アミノ酸、および特にそれらのアミノ酸の側鎖の相対類似性に依存することが理解される。
バリアントは、完全遺伝子配列またはその断片の完全長にわたって実質的に同一である核酸配列であり得る。核酸配列は、遺伝子配列またはその断片の完全長にわたって８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。バリアントは、アミノ酸配列またはその断片の完全長にわたって実質的に同一であるアミノ酸配列であり得る。アミノ酸配列は、アミノ酸配列またはその断片の完全長にわたって８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。
本明細書で使用される「ベクター」は、複製起点を含む核酸配列を意味し得る。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに統合するベクターのいずれかであり得る。
本明細書における数値範囲の列挙について、同じ精度でその間に介在する各数が明示的に企図される。例えば、６～９の範囲について、６および９に加えて数７および８が企図され、６．０～７．０の範囲について、数６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０が明示的に企図される。
組成物
一実施形態において、本発明は、ＤＩＣＥまたはＤＢｉＴＥ、それらの断片、それらのバリアント、またはその組み合わせをコードする組換え核酸配列を含む組成物に関する。組成物は、それを必要とする対象に投与される場合、対象における合成ＤＮＡコード化二重特異性免疫細胞エンゲージャーの生成をもたらし得る。
一実施形態において、ＤＩＣＥまたはＤＢｉＴＥは、少なくとも１つの抗原結合ドメイン、および少なくとも１つの免疫細胞エンゲージドメインを含む。一実施形態において、免疫細胞エンゲージドメインは、免疫細胞の表面上で発現される抗原に特異的である。免疫細胞は、Ｔ細胞、抗原提示細胞、ＮＫ細胞、好中球、およびマクロファージを含むが、これらに限定されない。
様々な実施形態において、免疫細胞エンゲージドメインは、免疫細胞特異的受容体分子への結合に特異的な抗体、その断片、またはそのバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、免疫細胞特異的受容体分子は、Ｔ細胞表面抗原である。一実施形態において、Ｔ細胞特異的受容体分子は、ＣＤ３、ＴＣＲ、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、Ｏｘ４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ４０、ＦｃｇＲ、ＦｃｅＲ、ＦｃａＲ、およびＣＤ９５のうちの１つである。
様々な実施形態において、抗原結合ドメインは、抗原への結合に特異的な抗体、その断片、またはそのバリアントを含む。一実施形態において、抗原は、腫瘍抗原である。一実施形態において、抗原は、ＣＤ１９、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ３３、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ１２３、またはヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２）である。
一実施形態において、ＣＤ１９ＤＢｉＴＥをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６のアミノ酸配列、またはそれらの断片もしくはバリアントをコードする。一実施形態において、ＣＤ１９ＤＢｉＴＥをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５のヌクレオチド配列、またはそれらの断片もしくはバリアントを含む。
一実施形態において、ＢＣＭＡＤＢｉＴＥをコードするヌクレオチド配列は、配列番号８、配列番号１０、もしくは配列番号１２のアミノ酸配列、またはそれらの断片もしくはバリアントをコードする。一実施形態において、ＢＣＭＡＤＢｉＴＥをコードするヌクレオチド配列は、配列番号７、配列番号９、もしくは配列番号１１のヌクレオチド配列、またはそれらの断片もしくはバリアントを含む。
一実施形態において、ＣＤ３３ＤＢｉＴＥをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１４、配列番号１６、もしくは配列番号１８のアミノ酸配列、またはそれらの断片もしくはバリアントをコードする。一実施形態において、ＣＤ３３ＤＢｉＴＥをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１３、配列番号１５、もしくは配列番号１７のヌクレオチド配列、またはそれらの断片もしくはバリアントを含む。
一実施形態において、ＦＡＰＢｉＴＥをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２０、配列番号２２、もしくは配列番号２４のアミノ酸配列、またはそれらの断片もしくはバリアントをコードする。一実施形態において、ＦＡＰＤＢｉＴＥをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１９、配列番号２１、もしくは配列番号２３のヌクレオチド配列、またはそれらの断片もしくはバリアントを含む。
一実施形態において、ＦＳＨＲＤＢｉＴＥをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２６、配列番号２８、もしくは配列番号３０のアミノ酸配列、またはそれらの断片もしくはバリアントをコードする。一実施形態において、ＦＳＨＲＤＢｉＴＥをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２５、配列番号２７、もしくは配列番号２９のヌクレオチド配列、またはそれらの断片もしくはバリアントを含む。
一実施形態において、ＥＧＦＲＤＢｉＴＥをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３２、配列番号３４、もしくは配列番号３６のアミノ酸配列、またはそれらの断片もしくはバリアントをコードする。一実施形態において、ＥＧＦＲＤＢｉＴＥをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３１、配列番号３３、もしくは配列番号３５のヌクレオチド配列、またはそれらの断片もしくはバリアントを含む。
一実施形態において、ＰＳＭＡＤＢｉＴＥをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３８、配列番号４０、もしくは配列番号４２のアミノ酸配列、またはそれらの断片もしくはバリアントをコードする。一実施形態において、ＰＳＭＡＤＢｉＴＥをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３７、配列番号４１、もしくは配列番号４３のヌクレオチド配列、またはそれらの断片もしくはバリアントを含む。
一実施形態において、ＣＤ１２３ＤＢｉＴＥをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４４、配列番号４６、もしくは配列番号４８のアミノ酸配列、またはそれらの断片もしくはバリアントをコードする。一実施形態において、ＣＤ１２３ＤＢｉＴＥをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４３、配列番号４５、もしくは配列番号４７のヌクレオチド配列、またはそれらの断片もしくはバリアントを含む。
一実施形態において、ＨＥＲ２ＤＢｉＴＥをコードするヌクレオチド配列は、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５８、もしくは配列番号６０のアミノ酸配列、またはそれらの断片もしくはバリアントをコードする。一実施形態において、ＨＥＲ２ＤＢｉＴＥをコードするヌクレオチド配列は、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、もしくは配列番号６７のヌクレオチド配列、またはそれらの断片もしくはバリアントを含む。
一実施形態において、ＥＧＦＲｖＩＩＩ２ＤＩＣＥをコードするヌクレオチド配列は、配列番号７０もしくは配列番号７２のアミノ酸配列、またはそれらの断片もしくはバリアントをコードする。一実施形態において、ＥＧＦＲｖＩＩＩ２ＤＩＣＥをコードするヌクレオチド配列は、配列番号６９もしくは配列番号７１のヌクレオチド配列、またはそれらの断片もしくはバリアントを含む。
一実施形態において、ＨＥＲ２ＤＩＣＥをコードするヌクレオチド配列は、配列番号７４、もしくは配列番号７６のアミノ酸配列、またはそれらの断片もしくはバリアントをコードする。一実施形態において、ＨＥＲ２ＤＩＣＥをコードするヌクレオチド配列は、配列番号７３もしくは配列番号７５のヌクレオチド配列、またはそれの断片もしくはバリアントを含む。
一実施形態において、組成物は、抗Ｈｅｒ２抗体（ＨＥＲ２ＤＭＡｂ）をコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、ＨＥＲ２ＤＭＡｂをコードするヌクレオチド配列は、配列番号６２、配列番号６４、またはそれらの断片もしくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、ＨＥＲ２ＤＭＡｂをコードするヌクレオチド配列は、配列番号６１、配列番号６３、またはそれの断片もしくはバリアントを含む。
一実施形態において、組成物は、ｓｃＦｖ抗Ｈｅｒ２抗体を含む。一実施形態において、ｓｃＦｖ抗Ｈｅｒ２抗体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６６またはその断片もしくはバリアントをコードするヌクレオチド配列を含む。一実施形態において、ｓｃＦｖ抗Ｈｅｒ２抗体をコードするヌクレオチド配列は、配列番号６５、またはその断片もしくはバリアントを含む。
Figure 0007680358000001
Figure 0007680358000002
Figure 0007680358000003
Figure 0007680358000004
ある特定の実施形態において、組成物は、本発明の合成抗体（例えば、ＤＭＡｂ、ＳｃＦｖ抗体断片、ＤＩＣＥまたはＤＢｉＴＥ）が結合する抗原に関連する疾患または障害を治療、予防、および／またはそれに対して保護し得る。一実施形態において、本発明の組成物は、標的抗原の発現に関連する任意の疾患、障害、または状態を治療、予防、および／またはそれに対して保護し得る。ある特定の実施形態において、組成物は、癌を治療、予防、および／またはそれに対して保護し得る。
合成抗体（例えば、ＤＭＡｂ、ＳｃＦｖ抗体断片、ＤＩＣＥまたはＤＢｉＴＥ）は、組成物を投与された対象において疾患を治療、予防、および／またはそれに対して保護し得る。合成抗体（例えば、ＤＭＡｂ、ＳｃＦｖ抗体断片、ＤＩＣＥまたはＤＢｉＴＥ）は、組成物を投与された対象において疾患の生存期間を促進することができる。合成抗体（例えば、ＤＭＡｂ、ＳｃＦｖ抗体断片、ＤＩＣＥまたはＤＢｉＴＥ）は、組成物を投与された対象において疾患の少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％生存期間を提供し得る。他の実施形態において、合成抗体（例えば、ＤＭＡｂ、ＳｃＦｖ抗体断片、ＤＩＣＥまたはＤＢｉＴＥ）は、組成物を投与された対象において疾患の少なくとも約６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、または８０％の生存期間を提供することができる。
組成物は、組成物の対象への投与の少なくとも約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、４５時間、５０時間、または６０時間以内に、対象における合成抗体（例えば、ＤＭＡｂ、ＳｃＦｖ抗体断片、ＤＩＣＥまたはＤＢｉＴＥ）の生成をもたらし得る。組成物は、対象への組成物の投与の少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、または１０日以内に、対象における合成抗体（例えば、ＤＭＡｂ、ＳｃＦｖ抗体断片、ＤＩＣＥまたはＤＢｉＴＥ）の生成をもたらし得る。組成物は、対象への組成物の投与の約１時間～約６日、約１時間～約５日、約１時間～約４日、約１時間～約３日、約１時間～約２日、約１時間～約１日、約１時間～約７２時間、約１時間～約６０時間、約１時間～約４８時間、約１時間～約３６時間、約１時間～約２４時間、約１時間～約１２時間、約１時間～約６時間以内に、対象における合成抗体（例えば、ＤＭＡｂ、ＳｃＦｖ抗体断片、ＤＩＣＥまたはＤＢｉＴＥ）の生成をもたらし得る。
組成物は、それを必要とする対象に投与される場合、体液性免疫応答を誘導するために抗原を投与される対象における内因性抗体の生成よりも、対象における合成抗体（例えば、ＤＭＡｂ、ＳｃＦｖ抗体断片、ＤＩＣＥまたはＤＢｉＴＥ）の生成をより迅速にもたらし得る。組成物は、体液性免疫応答を誘導するために抗原を投与された対象における内因性抗体の生成の少なくとも約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、または１０日前に合成抗体（例えば、ＤＭＡｂ、ＳｃＦｖ抗体断片、ＤＩＣＥまたはＤＢｉＴＥ）の生成をもたらし得る。
本発明の組成物は、組成物が病気または死を引き起こさないように安全である、病気に対して保護的である、ならびに投与の容易さ、少ない副作用、生物学的安定性、および用量あたりの費用の低さを提供するなどの、有効な組成物に必要な特徴を有し得る。
組換え核酸配列
上に記載されるように、組成物は、組換え核酸配列を含み得る。組換え核酸配列は、合成抗体（例えば、ＤＭＡｂ、ＳｃＦｖ抗体断片、ＤＩＣＥまたはＤＢｉＴＥ）、その断片、そのバリアント、またはその組み合わせをコードし得る。抗体は、以下でより詳細に記載される。
組換え核酸配列は、異種核酸配列であり得る。組換え核酸配列は、少なくとも１つの異種核酸配列または１つ以上の異種核酸配列を含み得る。
組換え核酸配列は、最適化核酸配列であり得る。そのような最適化は、抗体の免疫原性を増加または変化させることができる。最適化はまた、転写および／または翻訳を改善することができる。最適化は、以下、転写を増加させるための低ＧＣ含量リーダー配列、ｍＲＮＡ安定性およびコドン最適化、増加した翻訳のためのｋｏｚａｋ配列（例えば、ＧＣＣＡＣＣ）の付加、シグナルペプチドをコードする免疫グロブリン（Ｉｇ）リーダー配列の付加、ならびに可能な限りのｃｉｓ作用配列モチーフ（すなわち、内部ＴＡＴＡボックス）の排除、のうちの１つ以上を含み得る。
組換え核酸配列は、１つ以上の組換え核酸配列構築物を含み得る。組換え核酸配列構築物は、以下でより詳細に記載される１つ以上の構成要素を含み得る。
組換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチド、その断片、そのバリアント、またはその組み合わせをコードする異種核酸配列を含み得る。組換え核酸配列構築物は、軽鎖ポリペプチド、その断片、そのバリアント、またはその組み合わせをコードする異種核酸配列を含み得る。組換え核酸配列構築物はまた、プロテアーゼまたはペプチダーゼ切断部位をコードする異種核酸配列も含み得る。組換え核酸配列構築物はまた、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）をコードする異種核酸配列も含み得る。ＩＲＥＳは、ウイルスＩＲＥＳまたは真核ＩＲＥＳのいずれかであり得る。組換え核酸配列構築物は、各リーダー配列がシグナルペプチドをコードする１つ以上のリーダー配列を含み得る。組換え核酸配列構築物は、１つ以上のプロモーター、１つ以上のイントロン、１つ以上の転写終結領域、１つ以上の開始コドン、１つ以上の終結もしくは停止コドン、および／または１つ以上のポリアデニル化シグナルを含み得る。組換え核酸配列構築物はまた、１つ以上のリンカーまたはタグ配列を含み得る。タグ配列は、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグをコードすることができる。
重鎖ポリペプチド
組換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチド、その断片、そのバリアント、またはその組み合わせをコードする異種核酸を含み得る。重鎖ポリペプチドは、可変重鎖（ＶＨ）領域および／または少なくとも１つの定常重鎖（ＣＨ）領域を含み得る。少なくとも１つの定常重鎖領域は、定常重鎖領域１（ＣＨ１）、定常重鎖領域２（ＣＨ２）、および定常重鎖領域３（ＣＨ３）、ならびに／またはヒンジ領域を含み得る。
いくつかの実施形態において、重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域およびＣＨ１領域を含み得る。他の実施形態において、重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含み得る。
重鎖ポリペプチドは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含み得る。ＣＤＲセットは、ＶＨ領域の３つの超可変領域を含み得る。重鎖ポリペプチドのＮ末端から進行すると、これらのＣＤＲはそれぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と表される。重鎖ポリペプチドのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗原の結合または認識に寄与し得る。
軽鎖ポリペプチド
組換え核酸配列構築物は、軽鎖ポリペプチド、その断片、そのバリアント、またはその組み合わせをコードする異種核酸配列を含み得る。軽鎖ポリペプチドは、可変軽鎖（ＶＬ）領域および／または定常軽鎖（ＣＬ）領域を含み得る。
軽鎖ポリペプチドは、相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含み得る。ＣＤＲセットは、ＶＬ領域の３つの超可変領域を含み得る。軽鎖ポリペプチドのＮ末端から進行すると、これらのＣＤＲはそれぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と表される。軽鎖ポリペプチドのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３は、抗原の結合または認識に寄与し得る。
プロテアーゼ切断部位
組換え核酸配列構築物は、プロテアーゼ切断部位をコードする異種核酸配列を含み得る。プロテアーゼ切断部位は、プロテアーゼまたはペプチダーゼによって認識され得る。プロテアーゼは、エンドペプチダーゼまたはエンドプロテアーゼ、例えば、これらに限定されないが、フリン、エラスターゼ、ＨｔｒＡ、カルパイン、トリプシン、キモトリプシン、トリプシン、およびペプシンであり得る。プロテアーゼは、フリンであり得る。他の実施形態において、プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、トレオニンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ、または内部ペプチド結合を切断する（すなわち、Ｎ末端またはＣ末端ペプチド結合を切断しない）任意のプロテアーゼであり得る。
プロテアーゼ切断部位は、切断の効率を促進または増加させる１つ以上のアミノ酸配列を含み得る。１つ以上のアミノ酸配列は、別個のポリペプチドを形成または生成する効率を促進または増加させることができる。１つ以上のアミノ酸配列は、２Ａペプチド配列を含み得る。
リンカー配列
組換え核酸配列構築物は、１つ以上のリンカー配列を含み得る。リンカー配列は、本明細書に記載される１つ以上の構成要素を空間的に分離または連結することができる。他の実施形態において、リンカー配列は、２つ以上のポリペプチドを空間的に分離または連結するアミノ酸配列をコードすることができる。一実施形態において、リンカー配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６８）のアミノ酸配列を有するＧ４Ｓリンカー配列である。
プロモーター
組換え核酸配列構築物は、１つ以上のプロモーターを含み得る。１つ以上のプロモーターは、遺伝子発現を駆動し、かつ遺伝子発現を調節することができる任意のプロモーターであり得る。そのようなプロモーターは、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを介した転写に必要なシス作用配列エレメントである。遺伝子発現を誘導するために使用されるプロモーターの選択は、特定の用途に依存する。プロモーターは、組換え核酸配列構築物における転写開始から、その天然設定における転写開始部位からのほぼ同じ距離に配置され得る。しかしながら、この距離における変動は、プロモーター機能の喪失なしに順応され得る。
プロモーターは、重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列に作動可能に連結され得る。プロモーターは、真核細胞における発現に有効であると示されるプロモーターであり得る。コード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０早期プロモーターおよびＳＶ４０後期プロモーターなどのシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）長鎖末端反復（ＬＴＲ）プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、モロニーウイルスプロモーター、鳥白血病ウイルス（ＡＬＶ）プロモーター、ＣＭＶ即時早期プロモーターなどのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、またはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターであり得る。プロモーターはまた、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、ヒトポリヘドリン、またはヒトメタロチオネインなどのヒト遺伝子由来のプロモーターであり得る。
プロモーターは、構成的プロモーターまたは宿主細胞が何らかの特定の外部刺激に曝露された時のみ転写を開始する誘導性プロモーターであり得る。多細胞生物の場合、プロモーターはまた、特定の組織または器官または発達段階に特異的であり得る。プロモーターはまた、天然または合成の筋肉または皮膚特異的プロモーターなどの組織特異的プロモーターであってもよい。そのようなプロモーターの例は、米国特許出願公開第２００４／０１７５７２７号に記載されており、その内容は、その全体が本明細書に組み込まれる。
プロモーターは、エンハンサーと関連し得る。エンハンサーは、コード配列の上流に位置することができる。エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチン、またはＣＭＶ、ＦＭＤＶ、ＲＳＶ、またはＥＢＶからの１つなどのウイルスエンハンサーであり得る。ポリヌクレオチド機能増強は、米国特許第５，５９３，９７２号、第５，９６２，４２８号、およびＷ０９４／０１６７３７に記載されており、各々の内容は、参照により完全に組み込まれる。
転写終結領域
組換え核酸配列構築物は、１つ以上の転写終結領域を含み得る。転写終端領域は、効率的な終結を提供するために、コード配列の下流にあり得る。転写終結領域は、上に記載されるプロモーターと同じ遺伝子から得ることができるか、または１つ以上の異なる遺伝子から得ることができる。
開始コドン
組換え核酸配列構築物は、１つ以上の開始コドンを含み得る。開始コドンは、コード配列の上流に位置することができる。開始コドンは、コード配列とフレーム内にあり得る。開始コドンは、効率的な翻訳開始に必要な１つ以上のシグナル、例えば、これらに限定されないが、リボソーム結合部位と関連し得る。
終結コドン
組換え核酸配列構築物は、１つ以上の終結または停止コドンを含み得る。終結コドンは、コード配列の下流であり得る。終結コドンは、コード配列とフレーム内にあり得る。終結コドンは、効率的な翻訳終結に必要な１つ以上のシグナルと関連し得る。
ポリアデニル化シグナル
組換え核酸配列構築物は、１つ以上のポリアデニル化シグナルを含み得る。ポリアデニル化シグナルは、転写産物の効率的なポリアデニル化に必要な１つ以上のシグナルを含み得る。ポリアデニル化シグナルは、コード配列の下流に位置することができる。ポリアデニル化シグナルは、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、ＬＴＲポリアデニル化シグナル、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化シグナル、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリアデニル化シグナル、またはヒトβ－グロビンポリアデニル化シグナルであり得る。ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルは、ｐＣＥＰ４プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのポリアデニル化シグナルであり得る。
リーダー配列
組換え核酸配列構築物は、１つ以上のリーダー配列を含み得る。リーダー配列は、シグナルペプチドをコードし得る。シグナルペプチドは、免疫グロブリン（Ｉｇ）シグナルペプチド、例えば、これらに限定されないが、ＩｇＧシグナルペプチドおよびＩｇＥシグナルペプチドであり得る。
組換え核酸配列構築物からの発現
上に記載されるように、組換え核酸配列構築物は、１つ以上の構成要素の中に、重鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列および／または軽鎖ポリペプチドをコードする異種核酸配列を含み得る。したがって、組換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドの発現を容易にすることができる。
上に記載されるような配置１が利用される時、第１の組換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチドの発現を容易にすることができ、第２の組換え核酸配列構築物は、軽鎖ポリペプチドの発現を容易にすることができる。上に記載されるような配置２が利用される時、組換え核酸配列構築物は、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの発現を容易にすることができる。
発現すると、例えば、これらに限定されないが、細胞、生物、または哺乳動物において、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドは、合成抗体（例えば、ＤＭＡｂ、ＳｃＦｖ抗体断片、ＤＩＣＥまたはＤＢｉＴＥ）に集合し得る。特に、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドは、集合が抗原に結合することができる合成抗体（例えば、ＤＭＡｂ、ＳｃＦｖ抗体断片、ＤＩＣＥまたはＤＢｉＴＥ）をもたすように互いに相互作用し得る。他の実施形態において、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドは、集合が本明細書に記載されるように集合していない抗体と比較してより免疫原性である合成抗体（例えば、ＤＭＡｂ、ＳｃＦｖ抗体断片、ＤＩＣＥまたはＤＢｉＴＥ）をもたらすように互いに相互作用し得る。さらに他の実施形態において、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドは、集合が抗原に対する免疫応答を誘発または誘導することができる合成抗体（例えば、ＤＭＡｂ、ＳｃＦｖ抗体断片、ＤＩＣＥまたはＤＢｉＴＥ）をもたらすように互いに相互作用することができる。
ベクター
上に記載される組換え核酸配列構築物は、１つ以上のベクターに配置することができる。１つ以上のベクターは、複製起点を含み得る。１つ以上のベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。１つ以上のベクターは、自己複製染色体外ベクター、または宿主ゲノムに統合するベクターのいずれかであり得る。
１つ以上のベクターは、異種発現構築物であり得、これは一般的には、特定の遺伝子を標的細胞に導入するために使用されるプラスミドである。発現ベクターが細胞内に入ると、組換え核酸配列構築物によってコードされる重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドが、細胞転写および翻訳機構リボソーム複合体によって産生される。１つ以上のベクターは、多量の安定したメッセンジャーＲＮＡ、およびしたがってタンパク質を発現することができる。
発現ベクター
１つ以上のベクターは、環状プラスミドまたは線状核酸であり得る。環状プラスミドおよび線状核酸は、適切な対象細胞における特定のヌクレオチド配列の発現を誘導することができる。組換え核酸配列構築物を含む１つ以上のベクターは、キメラであり得、その構成要素のうちの少なくとも１つが、その他の構成要素のうちの少なくとも１つに対して異種であることを意味する。
プラスミド
１つ以上のベクターは、プラスミドであり得る。プラスミドは、細胞を組換え核酸配列構築物でトランスフェクトするために有用であり得る。プラスミドは、組換え核酸配列構築物を対象に導入するために有用であり得る。プラスミドはまた、プラスミドが投与される細胞における遺伝子発現に十分に適し得る、制御配列を含み得る。
プラスミドはまた、プラスミドを染色体外に維持し、細胞においてプラスミドの複数のコピーを産生するために、哺乳動物の複製起点を含み得る。プラスミドは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのｐＶＡＸ１、ｐＣＥＰ４、またはｐＲＥＰ４であり得、これは、Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂａｒｒウイルス複製起点および核抗原ＥＢＮＡ－１コード領域を含み得、これは、統合なしに高コピーエピソーム複製を産生し得る。プラスミドの骨格は、ｐＡＶ０２４２であり得る。プラスミドは、複製欠損アデノウイルス５型（Ａｄ５）プラスミドであり得る。
プラスミドは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるタンパク質産生に使用され得る、ｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得る。プラスミドはまた、酵母のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株におけるタンパク質産生に使用され得る、ｐ ＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得る。プラスミドは、昆虫細胞におけるタンパク質産生に使用され得る、ＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）のものでもあり得る。プラスミドはまた、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞におけるタンパク質産生に使用され得る、ｐｃＤＮＡＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得る。
ＲＮＡ
一実施形態において、核酸は、ＲＮＡ分子である。一実施形態において、ＲＮＡ分子は、ＤＮＡ配列から転写される。したがって、一実施形態において、本発明は、本発明の合成抗体のうちの１つ以上をコードするＲＮＡ分子を提供する。ＲＮＡは、プラス鎖であり得る。したがって、いくつかの実施形態において、ＲＮＡ分子は、逆転写などの任意の介在複製ステップを必要とすることなく細胞によって翻訳することができる。本発明で有用なＲＮＡ分子は、５′キャップ（例えば、７－メチルグアノシン）を有し得る。このキャップは、ＲＮＡのインビボ翻訳を向上させることができる。本発明で有用なＲＮＡ分子の５′ヌクレオチドは、５′三リン酸基を有し得る。キャップＲＮＡでは、これは、５′－５′架橋を介して７－メチルグアノシンに連結され得る。ＲＮＡ分子は、３′ポリ－Ａテールを有し得る。それはまた、その３′末端近くにポリ－Ａポリメラーゼ認識配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）を含み得る。本発明で有用なＲＮＡ分子は、一本鎖であり得る。本発明で有用なＲＮＡ分子は、合成ＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態において、ＲＮＡ分子は、裸ＲＮＡ分子である。一実施形態において、ＲＮＡ分子は、ベクター内に含まれる。
一実施形態において、ＲＮＡは、５’および３’ＵＴＲを有する。一実施形態において、５’ＵＴＲは、０～３０００ヌクレオチド長である。コード領域に付加される５’および３’ＵＴＲ配列の長さは、これらに限定されないが、ＵＴＲの異なる領域にアニールするＰＣＲのプライマーを設計することを含む、異なる方法によって変更することができる。このアプローチを用いて、当業者は、転写ＲＮＡのトランスフェクション後の最適な翻訳効率を達成するために必要な５’および３’ＵＴＲ長を修飾することができる。
５’および３’ＵＴＲは、目的の遺伝子についての天然発生型、内因性５’および３’ＵＴＲであり得る。あるいは、目的の遺伝子に内因性ではないＵＴＲ配列は、ＵＴＲ配列をフォワードおよびリバースプライマーに組み込むことによって、またはテンプレートの任意の他の修飾によって付加することができる。目的の遺伝子に内因性ではないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を修飾するために有用であり得る。例えば、３’ＵＴＲ配列におけるＡＵ富化エレメントは、ＲＮＡの安定性を増加させることができることが知られている。したがって、３’ＵＴＲは、当該技術分野において周知であるＵＴＲの特性に基づいて転写されたＲＮＡの安定性を増加させるように選択または設計することができる。
一実施形態において、５’ＵＴＲは、内因性遺伝子のＫｏｚａｋ配列を含み得る。あるいは、目的の遺伝子に内因性ではない５’ＵＴＲが、上記のＰＣＲによって付加されている時、コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、５’ＵＴＲ配列を付加することによって再設計することができる。Ｋｏｚａｋ配列は、いくつかのＲＮＡ転写物の翻訳の効率を増加させることができるが、全てのＲＮＡについて効率的な転写を可能にするために必要とされるわけではないようである。多くのＲＮＡのＫｏｚａｋ配列の要件は、当該技術分野において既知である。他の実施形態において、５’ＵＴＲは、ＲＮＡウイルスに由来し得、このＲＮＡゲノムは、細胞において安定である。他の実施形態において、様々なヌクレオチド類似体は、ＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を妨げるために３’または５’ＵＴＲにおいて使用することができる。
一実施形態において、ＲＮＡは、５’末端および３’ポリ（Ａ）テールの両方にキャップを有し、これは、リボソーム結合、翻訳の開始、および細胞におけるＲＮＡの安定性を決定する。
一実施形態において、ＲＮＡは、ヌクレオシド修飾ＲＮＡである。ヌクレオシド修飾ＲＮＡは、例えば、安定性の増加、自然免疫原性の低さまたは不在、および翻訳の向上を含む、非修飾ＲＮＡに対する特定の利点を有する。
環状および線状ベクター
１つ以上のベクターは、細胞ゲノムへの統合によって標的細胞を形質転換するか、または染色体外に存在し得る、環状プラスミド（例えば、複製起点を有する自律複製プラスミド）であり得る。ベクターは、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、もしくはｐｒｏｖａｘであるか、または組換え核酸配列構築物によってコードされる重鎖ポリペプチドおよび／もしくは軽鎖ポリペプチドを発現することができる任意の他の発現ベクターであり得る。
エレクトロポレーションを介して対象に効率的に送達し、かつ組換え核酸配列構築物によってコードされる重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドを発現することができる、線状核酸、または線状発現カセット（「ＬＥＣ」）もまた本明細書に提供される。ＬＥＣは、リン酸骨格が全くない任意の線状ＤＮＡであり得る。ＬＥＣは、任意の抗生物質耐性遺伝子および／またはリン酸骨格を含まない場合がある。ＬＥＣは、所望の遺伝子発現に関連していない他の核酸配列を含まない場合がある。
ＬＥＣは、線状化することができる任意のプラスミドに由来し得る。プラスミドは、組換え核酸配列構築物によってコードされる重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドを発現することができる場合がある。プラスミドは、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／３４）またはｐＭ２（Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）であり得る。プラスミドは、ＷＬＶ００９、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、もしくはｐｒｏｖａｘであるか、または組換え核酸配列構築物によってコードされる重鎖ポリペプチドおよび／もしくは軽鎖ポリペプチドを発現することができる任意の他の発現ベクターであり得る。
ＬＥＣは、ｐｃｒＭ２であり得る。ＬＥＣは、ｐｃｒＮＰであり得る。ｐｃｒＮＰおよびｐｃｒＭＲは、それぞれ、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ Ｒｉｃｏ／３４）およびｐＭ２（Ｎｅｗ Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）に由来し得る。
ベクターを調製する方法
組換え核酸配列構築物が配置されている１つ以上のベクターを調製するための方法が本明細書に提供される。最終サブクローニングステップ後、ベクターは、当該技術分野における既知の方法を用いて、大規模発酵タンクにおける細胞培養物を接種するために使用することができる。
他の実施形態において、最終サブクローニングステップ後、ベクターは、１つ以上のエレクトロポレーション（ＥＰ）デバイスで使用することができる。ＥＰデバイスは、以下でより詳細に記載される。
１つ以上のベクターは、既知のデバイスおよび技法の組み合わせを用いて製剤化または製造することができるが、好ましくは、それらは、２００７年５月２３日に出願された、許諾され、同時係属中の米国仮特許出願第６０／９３９，７９２号に記載されるプラスミド製造技法を用いて製造される。いくつかの例では、本明細書に記載されるＤＮＡプラスミドは、１０ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で製剤化することができる。製造技法はまた、２００７年７月３日に発行された許諾対象特許である米国特許第７，２３８，５２２号に記載されるものを含む、米国特許出願第６０／９３９７９２号に記載されるものに加えて、当業者に一般に既知である様々なデバイスおよびプロトコルを含むか、または組み込む。上記の出願および特許、それぞれ米国特許出願第６０／９３９，７９２号および米国特許第７，２３８，５２２号は、それらの全体において本明細書に組み込まれる。
抗体
いくつかの実施形態において、本発明は、抗体、その断片、そのバリアント、またはその組み合わせをコードする組換え核酸配列に関する。抗体は、以下でより詳細に記載される抗原と結合または反応し得る。いくつかの実施形態において、抗体は、ＤＮＡコード化モノクローナル抗体（ＤＭＡｂ）、その断片、またはそのバリアントである。いくつかの実施形態において、断片は、ＳｃＦｖ断片である。いくつかの実施形態において、抗体は、ＤＮＡコード化二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、その断片、またはそのバリアントである。
いくつかの実施形態において、抗体は、重鎖および軽鎖相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含み得、それぞれ、ＣＤＲに支持を提供し、互いに対してＣＤＲの空間関係を画定する重鎖および軽鎖フレームワーク（「ＦＲ」）セットの間に挿入される。ＣＤＲセットは、重鎖Ｖ領域または軽鎖Ｖ領域の３つの超可変領域を含み得る。重鎖または軽鎖のＮ末端から進行すると、これらの領域は、それぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と表される。したがって、抗原結合部位は、重鎖Ｖ領域および軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを含み得る。
タンパク質分解酵素パパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断していくつかの断片を得、そのうちの２つ（Ｆ（ａｂ）断片）はそれぞれ、無傷の抗原結合部位を含む共有ヘテロ二量体を含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、両方の抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）2断片を含むいくつかの断片を提供し得る。したがって、抗体は、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2であり得る。Ｆａｂは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含み得る。Ｆａｂの重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域およびＣＨ１領域を含み得る。Ｆａｂの軽鎖は、ＶＬ領域およびＣＬ領域を含み得る。
抗体は、免疫グロブリン（Ｉｇ）であり得る。Ｉｇは、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＧであり得る。免疫グロブリンは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含み得る。免疫グロブリンの重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含み得る。免疫グロブリンの軽鎖ポリペプチドは、ＶＬ領域およびＣＬ領域を含み得る。
抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であり得る。抗体は、キメラ抗体、一本鎖抗体、親和性成熟抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であり得る。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望の抗原と結合する非ヒト種由来の抗体であり得る。
抗体は、以下でより詳細に記載される二重特異性抗体であり得る。抗体は、また以下でより詳細に記載される二機能性抗体であり得る。
上に記載されるように、抗体は、組成物を対象に投与すると、対象において生成され得る。抗体は、対象内で半減期を有し得る。いくつかの実施形態において、抗体は、対象内のその半減期を延長または短縮するように修飾されてもよい。そのような修飾は、以下でより詳細に記載される。
抗体は、以下でより詳細に記載されるように脱フコシル化され得る。
ＳｃＦｖ抗体
一実施形態において、本発明のＤＭＡｂは、ＳｃＦｖ ＤＭＡｂである。一実施形態において、ＳｃＦｖ ＤＭＡｂは、ＣＨ１およびＣＬ領域のものを含まないＦａｂ断片に関する。したがって、一実施形態において、ＳｃＦｖ ＤＭＡｂは、ＶＨおよびＶＬを含むＦａｂ断片ＤＭＡｂに関する。一実施形態において、ＳｃＦｖ ＤＭＡｂは、ＶＨとＶＬとの間にリンカーを含む。一実施形態において、ＳｃＦｖ ＤＭＡｂは、ＳｃＦｖ－Ｆｃ ＤＭＡｂである。一実施形態において、ＳｃＦｖ－Ｆｃ ＤＭＡｂは、ＶＨ、ＶＬ、ならびにＣＨ２およびＣＨ３領域を含む。一実施形態において、ＳｃＦｖ－Ｆｃ ＤＭＡｂは、ＶＨとＶＬとの間にリンカーを含む。一実施形態において、本発明のＳｃＦｖ ＤＭＡｂは、親ＤＭＡｂと比較して、修飾発現、安定性、半減期、抗原結合、重鎖－軽鎖対合、組織浸透、またはそれらの組み合わせを有する。
一実施形態において、本発明のＳｃＦｖ ＤＭＡｂは、親ＤＭＡｂより、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも最低２．８倍、最低２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超高い発現を有する。
一実施形態において、本発明のＳｃＦｖ ＤＭＡｂは、親ＤＭＡｂより、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも最低２．８倍、最低２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超高い抗原結合を有する。
一実施形態において、本発明のＳｃＦｖ ＤＭＡｂは、親ＤＭＡｂより、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも最低２．８倍、最低２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超長い半減期を有する。
一実施形態において、本発明のＳｃＦｖ ＤＭＡｂは、親ＤＭＡｂより、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも最低２．８倍、最低２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超高い安定性を有する。
一実施形態において、本発明のＳｃＦｖ ＤＭＡｂは、親ＤＭＡｂより、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも最低２．８倍、最低２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超の組織透過率を有する。
一実施形態において、本発明のＳｃＦｖ ＤＭＡｂは、親ＤＭＡｂより、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．１倍、少なくとも２．２倍、少なくとも２．３倍、少なくとも２．４倍、少なくとも２．５倍、少なくとも２．６倍、少なくとも２．７倍、少なくとも最低２．８倍、最低２．９倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５倍、少なくとも５倍、少なくとも５．５倍、少なくとも６倍、少なくとも６．５倍、少なくとも７倍、少なくとも７．５倍、少なくとも８倍、少なくとも８．５倍、少なくとも９倍、少なくとも９．５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、または５０倍超の重鎖－軽鎖対合を有する。
一実施形態において、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体は、配列番号６６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、または配列番号６６のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列の断片を含む。一実施形態において、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体は、配列番号６６のアミノ酸、または配列番号６６のアミノ酸配列の断片を含む。一実施形態において、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体は、配列番号６５によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、または配列番号６５のうちの１つによってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列の断片を含む。一実施形態において、抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ抗体は、配列番号６５によってコードされるアミノ酸配列、または配列番号６５によってコードされるアミノ酸配列の断片を含む。
モノクローナル抗体
一実施形態において、本発明は、抗ＨＥＲ２抗体を提供する。抗体は、完全なままのモノクローナル抗体、および免疫学的に活性な断片（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）2断片）、モノクローナル抗体重鎖、またはモノクローナル抗体軽鎖であり得る。
抗体は、重鎖および軽鎖相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含み得、それぞれ、ＣＤＲに支持を提供し、互いに対してＣＤＲの空間関係を画定する重鎖および軽鎖フレームワーク（「ＦＲ」）セットの間に挿入される。ＣＤＲセットは、重鎖Ｖ領域または軽鎖Ｖ領域の３つの超可変領域を含み得る。重鎖または軽鎖のＮ末端から進行すると、これらの領域は、それぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と表される。したがって、抗原結合部位は、重鎖Ｖ領域および軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを含み得る。
抗体は、免疫グロブリン（Ｉｇ）であり得る。Ｉｇは、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＧであり得る。免疫グロブリンは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含み得る。免疫グロブリンの重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含み得る。免疫グロブリンの軽鎖ポリペプチドは、ＶＬ領域およびＣＬ領域を含み得る。
一実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体は、ヒトにおける発現のために最適化される。一実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体は、配列番号６２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、または配列番号６２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列の断片を含む。一実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体は、配列番号６２のアミノ酸、または配列番号６２のアミノ酸配列の断片を含む。一実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体は、配列番号６１によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、または配列番号６１のうちの１つによってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列の断片を含む。一実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体は、配列番号６１によってコードされるアミノ酸配列、または配列番号６１によってコードされるアミノ酸配列の断片を含む。
一実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体は、マウスにおける発現のために最適化される。一実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体は、配列番号６４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、または配列番号６４のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列の断片を含む。一実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体は、配列番号６４のアミノ酸、または配列番号６４のアミノ酸配列の断片を含む。一実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体は、配列番号６１によってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列、または配列番号６３のうちの１つによってコードされるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％相同であるアミノ酸配列の断片を含む。一実施形態において、抗ＨＥＲ２抗体は、配列番号６３によってコードされるアミノ酸配列、または配列番号６３によってコードされるアミノ酸配列の断片を含む。
二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー
上に記載されるように、組換え核酸配列は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、その断片、そのバリアント、またはその組み合わせをコードし得る。ＢｉＴＥの抗原標的ドメインは、以下でより詳細に記載される抗原と結合または反応し得る。
ＢｉＴＥの抗原標的ドメインは、抗体、その断片、そのバリアント、またはその組み合わせを含み得る。ＢｉＴＥの抗原標的ドメインは、重鎖および軽鎖相補性決定領域（「ＣＤＲ」）セットを含み得、それぞれ、ＣＤＲに支持を提供し、互いに対してＣＤＲの空間関係を画定する重鎖および軽鎖フレームワーク（「ＦＲ」）セットの間に挿入される。ＣＤＲセットは、重鎖Ｖ領域または軽鎖Ｖ領域の３つの超可変領域を含み得る。重鎖または軽鎖のＮ末端から進行すると、これらの領域は、それぞれ、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、および「ＣＤＲ３」と表される。したがって、抗原結合ドメインは、重鎖Ｖ領域および軽鎖Ｖ領域の各々からのＣＤＲセットを含む６つのＣＤＲを含み得る。
タンパク質分解酵素パパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断していくつかの断片を得、そのうちの２つ（Ｆ（ａｂ）断片）はそれぞれ、無傷の抗原結合部位を含む共有ヘテロ二量体を含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、両方の抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）2断片を含むいくつかの断片を提供し得る。したがって、ＢｉＴＥの抗原標的ドメインは、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）2であり得る。Ｆａｂは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含み得る。Ｆａｂの重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域およびＣＨ１領域を含み得る。Ｆａｂの軽鎖は、ＶＬ領域およびＣＬ領域を含み得る。
ＢｉＴＥの抗原標的ドメインは、免疫グロブリン（Ｉｇ）であり得る。Ｉｇは、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＧであり得る。免疫グロブリンは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドを含み得る。免疫グロブリンの重鎖ポリペプチドは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ヒンジ領域、ＣＨ２領域、およびＣＨ３領域を含み得る。免疫グロブリンの軽鎖ポリペプチドは、ＶＬ領域およびＣＬ領域を含み得る。
ＢｉＴＥの抗原標的ドメインは、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体であり得る。抗体は、キメラ抗体、一本鎖抗体、親和性成熟抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、または完全ヒト抗体であり得る。ヒト化抗体は、非ヒト種由来の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）およびヒト免疫グロブリン分子由来のフレームワーク領域を有する所望の抗原と結合する非ヒト種由来の抗体であり得る。
一実施形態において、本発明のＤＢｉＴＥの抗原結合ドメインおよび免疫細胞エンゲージドメインのうちの少なくとも１つは、上に詳細に記載されるような、ＳｃＦｖ ＤＮＡコード化モノクローナル抗体（ＳｃＦｖ ＤＭＡｂ）である。
二重特異性抗体
組換え核酸配列は、二重特異性抗体、その断片、そのバリアント、またはその組み合わせをコードし得る。二重特異性抗体は、２つの抗原、例えば、以下でより詳細に記載される２つの抗原と結合または反応することができる。二重特異性抗体は、本明細書に記載される抗体のうちの２つの断片から構成され得、それによって、二重特異性抗体が、以下でより詳細に記載される抗原、受容体のためのリガンドを含むリガンド、受容体上のリガンド結合部位を含む受容体、リガンド受容体複合体、およびマーカーを含み得る２つの所望の標的分子と結合または反応することを可能にする。
本発明は、第１の標的に特異的に結合する第１の抗原結合部位と、第２の標的に特異的に結合する第２の抗原結合部位とを含む新規の二重特異性抗体を提供し、生産可能性、安定性、結合親和性、生物学的活性、ある特定のＴ細胞の特異的標的化、標的化効率、および毒性の低減などの特に有利な特性を有する。いくつかの例では、二重特異性抗体があり、二重特異性抗体は、高親和性で第１の標的と結合し、低親和性で第２の標的と結合する。他の例では、二重特異性抗体があり、二重特異性抗体は、低親和性で第１の標的と結合し、高親和性で第２の標的と結合する。他の例では、二重特異性抗体があり、二重特異性抗体は、所望の親和性で第１の標的と結合し、所望の親和性で第２の標的と結合する。
一実施形態において、二重特異性抗体は、ａ）第１の抗原と特異的に結合する抗体の第１の軽鎖および第１の重鎖、ならびにｂ）第２の抗原と特異的に結合する抗体の第２の軽鎖および第２の重鎖を含む二価抗体である。
本発明による二重特異性抗体分子は、任意の所望の特異性の２つの結合部位を有し得る。いくつかの実施形態において、結合部位のうちの１つは、腫瘍抗原を可能とする。いくつかの実施形態において、Ｆａｂ断片に含まれる結合部位は、腫瘍抗原に特異的な結合部位である。いくつかの実施形態において、一本鎖Ｆｖ断片に含まれる結合部位は、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ３３、ＦＡＰ、ＦＳＨＲ、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＣＤ１２３またはＨｅｒ２などの腫瘍抗原に特異的な結合部位である。
いくつかの実施形態において、本発明による抗体分子の結合部位のうちの１つは、Ｔ細胞特異的受容体分子および／またはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）特異的受容体分子と結合することができる。Ｔ細胞特異的受容体は、Ｔ細胞が、抗原提示細胞またはＡＰＣと称される別の細胞によって提示されるエピトープ／抗原に結合し、追加のシグナルが存在する場合、それによって活性化され、かつそれに応答することを可能にする、いわゆる「Ｔ細胞受容体」（ＴＣＲ）である。Ｔ細胞受容体は、天然発生型免疫グロブリンのＦａｂ断片に似ていることが知られている。一般に、アルファ鎖およびベータ鎖を包含する一価であり、いくつかの実施形態において、ガンマ鎖およびデルタ鎖（上記参照）を包含する。したがって、いくつかの実施形態において、ＴＣＲは、ＴＣＲ（アルファ／ベータ）であり、いくつかの実施形態において、ＴＣＲ（ガンマ／デルタ）である。Ｔ細胞受容体は、ＣＤ３ Ｔ細胞共受容体と複合体を形成する。ＣＤ３は、タンパク質複合体であり、４つの異なる鎖からなる。哺乳動物において、複合体は、ＣＤ３γ鎖、ＣＤ３６鎖、および２つのＣＤ３Ｅ鎖を含む。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）およびζ鎖として知られる分子と会合して、Ｔリンパ球内で活性化シグナルを生成する。したがって、いくつかの実施形態において、Ｔ細胞特異的受容体は、ＣＤ３ Ｔ細胞共受容体である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞特異的受容体は、Ｔ細胞上でも発現されるタンパク質ＣＤ２８である。ＣＤ２８は、Ｔ細胞活性化に必要とされる共刺激シグナルを提供することができる。ＣＤ２８は、Ｔ細胞増殖および生存、サイトカイン産生、ならびに２型Ｔヘルパー発生において重要な役割を果たす。Ｔ細胞特異的受容体のさらなる例は、Ｏｘ４０とも称されるＣＤ１３４である。ＣＤ１３４／ＯＸ４０は、活性化後２４～７２時間後に発現しており、二次共刺激分子を画定するために取ることができる。Ｔ細胞受容体の別の例は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）上の４－１ ＢＢ－リガンドと結合することができる４－１ ＢＢであり、それによってＴ細胞の共刺激シグナルが生成される。主にＴ細胞上に見出される受容体の別の例は、ＣＤ５であり、ＣＤ５は、Ｂ細胞上にも低レベルで見出される。Ｔ細胞機能を修飾する受容体のさらなる例は、他の細胞の表面に発現するＦａｓ－リガンドによるアポトーシスシグナル伝達を媒介する、Ｆａｓ受容体としても知られるＣＤ９５である。ＣＤ９５は、休止Ｔリンパ球におけるＴＣＲ／ＣＤ３駆動シグナル伝達経路を調節することが報告されている。
ＮＫ細胞特異的受容体分子の一例は、ＣＤ１６、低親和性Ｆｃ受容体、およびＮＫＧ２Ｄである。Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の両方の表面に存在する受容体分子の一例は、ＣＤ２およびＣＤ２－スーパーファミリーのさらなるメンバーである。ＣＤ２は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞上で共刺激分子として作用することができる。
いくつかの実施形態において、抗体分子の第１の結合部位は、腫瘍抗原と結合し、第２の結合部位は、Ｔ細胞特異的受容体分子および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞特異的受容体分子と結合する。
いくつかの実施形態において、抗体分子の第１の結合部位は、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ３３、ＦＡＰ、ＦＳＨＲ、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＣＤ１２３またはＨｅｒ２と結合し、第２の結合部位は、Ｔ細胞特異的受容体分子および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞特異的受容体分子と結合する。いくつかの実施形態において、抗体分子の第１の結合部位は、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ３３、ＦＡＰ、ＦＳＨＲ、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＣＤ１２３、またはＨｅｒ２と結合し、第２の結合部位は、ＣＤ３、ＴＣＲ、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、Ｏｘ４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ４０、ＦｃｇＲ、ＦｃｅＲ、ＦｃａＲ、およびＣＤ９５のうちの１つと結合する。いくつかの実施形態において、抗体分子の第１の結合部位は、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ３３、ＦＡＰ、ＦＳＨＲ、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＣＤ１２３、またはＨｅｒ２と結合し、第２の結合部位は、ＣＤ３と結合する。
いくつかの実施形態において、抗体分子の第１の結合部位は、Ｔ細胞特異的受容体分子および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞特異的受容体分子と結合し、第２の結合部位は、腫瘍抗原と結合する。いくつかの実施形態において、抗体の第１の結合部位は、Ｔ細胞特異的受容体分子および／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞特異的受容体分子と結合し、第２の結合部位は、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ３３、ＦＡＰ、ＦＳＨＲ、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＣＤ１２３、またはＨｅｒ２と結合する。いくつかの実施形態において、抗体の第１の結合部位は、ＣＤ３、ＴＣＲ、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、Ｏｘ４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ４０、ＦｃｇＲ、ＦｃｅＲ、ＦｃａＲ、およびＣＤ９５のうちの１つと結合し、第２の結合部位は、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ３３、ＦＡＰ、ＦＳＨＲ、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＣＤ１２３、またはＨｅｒ２と結合する。いくつかの実施形態において、抗体の第１の結合部位は、ＣＤ３と結合し、第２の結合部位は、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ３３、ＦＡＰ、ＦＳＨＲ、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＣＤ１２３、またはＨｅｒ２と結合する。
一実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、本明細書に記載される１つ以上のｓｃＦｖ抗体断片を含むＤＢｉＴＥを含み、それによって、ＤＢｉＴＥが所望の標的分子と結合または反応することを可能にする。
一実施形態において、ＤＢｉＴＥは、Ｔ細胞特異的受容体分子との結合に特異的な第２のｓｃＦｖと連結した標的疾患特異的抗原との結合に特異的な第１のｓｃＦｖをコードする核酸分子を含む。連結は、任意の順序で第１および第２のドメインを配置し得、例えば、一実施形態において、標的疾患特異的抗原への結合に特異的なｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列は、Ｔ細胞特異的受容体分子への結合に特異的なｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列に５’（または上流）配向される。別の実施形態において、標的疾患特異的抗原との結合に特異的なｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列は、Ｔ細胞特異的受容体分子への結合に特異的なｓｃＦｖをコードするヌクレオチド配列に３’（または下流）配向される。
二機能性抗体
組換え核酸配列は、二機能性抗体、その断片、そのバリアント、またはその組み合わせをコードし得る。二機能性抗体は、以下に記載される抗原と結合または反応し得る。二機能性抗体はまた、抗原の認識および抗原への結合を超えて抗体に追加の機能性を付与するように修飾され得る。そのような修飾は、これらに限定されないが、第Ｈ因子またはその断片に結合することを含み得る。第Ｈ因子は、補体活性化の可溶性調節因子であり、したがって、補体媒介性溶解（ＣＭＬ）を介して免疫応答に寄与し得る。
抗体半減期の延長
上に記載されるように、合成抗体（例えば、ＤＭＡｂ、ＳｃＦｖ抗体断片、ＤＩＣＥまたはＤＢｉＴＥ）は、対象における抗体の半減期を延長または短縮するように修飾され得る。修飾は、対象の血清中の抗体の半減期を延長または短縮し得る。
修飾は、抗体の定常領域に存在し得る。修飾は、１つ以上のアミノ酸置換を含まない抗体の半減期と比較して、抗体の半減期を延長する抗体の定常領域内の１つ以上のアミノ酸置換であり得る。修飾は、１つ以上のアミノ酸置換を含まない抗体の半減期と比較して、抗体の半減期を延長する抗体のＣＨ２ドメイン内の１つ以上のアミノ酸置換であり得る。
いくつかの実施形態において、定常領域内の１つ以上のアミノ酸置換は、定常領域内のメチオニン残基をチロシン残基で、定常領域内のセリン残基をトレオニン残基で、定常領域内のトレオニン残基をグルタミン残基で、またはこれらの任意の組み合わせで置き換え、それによって抗体の半減期を延長することを含み得る。
他の実施形態において、定常領域内の１つ以上のアミノ酸置換は、ＣＨ２ドメイン内のメチオニン残基をチロシン残基で、ＣＨ２ドメイン内のセリン残基をトレオニン残基で、ＣＨ２ドメイン内のトレオニン残基をグルタミン残基で、またはこれらの任意の組み合わせで置き換え、それによって抗体の半減期を延長することを含み得る。
脱フコシル化
組換え核酸配列は、フコシル化されていない抗体（すなわち、脱フコシル化抗体または非フコシル化抗体）、その断片、そのバリアント、またはそれらの組み合わせをコードし得る。フコシル化は、分子への糖フコースの添加、例えば、Ｎ－グリカン、Ｏ－グリカン、および糖脂質へのフコースの結合を含む。したがって、脱フコシル化抗体において、フコースは、定常領域の炭水化物鎖に結合されない。次いで、このフコシル化の欠如は、フコシル化抗体と比較して、抗体によるＦｃγＲＩＩＩａ結合および抗体指向性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）活性を改善し得る。したがって、いくつかの実施形態において、非フコシル化抗体は、フコシル化抗体と比較して増加したＡＤＣＣ活性を呈し得る。
抗体は、抗体のフコシル化を防止または阻害するように修飾され得る。いくつかの実施形態において、そのような修飾抗体は、非修飾抗体と比較して増加したＡＤＣＣ活性を呈し得る。修飾は、重鎖、軽鎖、またはこれらの組み合わせであり得る。修飾は、重鎖における１つ以上のアミノ酸置換、軽鎖における１つ以上のアミノ酸置換、またはこれらの組み合わせであり得る。
抗原
一実施形態において、合成抗体（例えば、ＤＭＡｂ、ＳｃＦｖ抗体断片、ＤＩＣＥまたはＤＢｉＴＥ）は、抗原またはその断片もしくはバリアントを対象とする。抗原は、核酸配列、アミノ酸配列、多糖類、またはこれらの組み合わせであり得る。核酸配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、それらのバリアント、それらの断片、またはそれらの組み合わせであり得る。アミノ酸配列は、タンパク質、ペプチド、それらのバリアント、それらの断片、またはそれらの組み合わせであり得る。多糖類は、核酸コード多糖類であり得る。
抗原は、腫瘍抗原であり得る。抗原は、癌発生または進行のリスクの増加に関連し得る。一実施形態において、抗原は、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ３３、ＦＡＰ、ＦＳＨＲ、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＣＤ１２３、またはＨｅｒ２であり得る。
一実施形態において、本発明の合成ＤＮＡコード化二重特異性免疫細胞エンゲージャーは、２つ以上の抗原を標的とする。一実施形態において、二重特異性抗体の少なくとも１つの抗原は、腫瘍抗原である。一実施形態において、二重特異性抗体の少なくとも１つの抗原は、Ｔ細胞活性化抗原である。
腫瘍抗原
本発明の合成抗体（例えば、ＤＭＡｂ、ＳｃＦｖ抗体断片、ＤＩＣＥまたはＤＢｉＴＥ）の抗原結合ドメインは、腫瘍抗原と相互作用し得る。本発明の文脈において、「腫瘍抗原」または「過剰増殖性障害抗原」または「過剰増殖性障害に関連する抗原」は、癌などの特定の過剰増殖性障害に共通の抗原を指す。
本発明で言及される腫瘍抗原の種類は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であり得る。ＴＳＡは、腫瘍細胞に固有であり、体内の他の細胞では発生しない。ＴＡＡ抗原は、腫瘍細胞に固有ではなく、代わりに、抗原に対する免疫学的耐性の状態を誘導することができない条件下で、正常細胞上でも発現される。腫瘍上の抗原の発現は、免疫系が抗原に応答することを可能にする条件下で生じ得る。ＴＡＡは、免疫系が未熟で応答できない時に胎児発達中に正常細胞上に発現される抗原であってもよく、または正常細胞上に通常極めて低いレベルで存在するが、腫瘍細胞上ではるかに高いレベルで発現される抗原であってもよい。
本明細書で論じられる抗原は、単に例として含まれる。リストは排他的であることを意図するものではなく、さらなる実施例は、当業者には容易に明らかになるであろう。
腫瘍抗原は、免疫応答、特にＴ細胞媒介免疫応答を誘発する腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。本発明の抗原結合部分の選択は、治療される癌の特定の種類に依存する。腫瘍抗原は当技術分野において周知であり、例えば、神経膠腫関連抗原、癌胚性抗原（ＣＥＡ）、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、チログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－１ａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原－１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦ－Ｉ受容体、およびメソセリンを含む。
腫瘍関連表面抗原の例示的な例は、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３、ＣＤ１３５）、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン４（ＣＳＰＧ４、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、ＩＧＦＲ、ＣＤ１３３、ＩＬ３Ｒ、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、ＣＤＣＰ１、Ｄｅｒｌｉｎ１、テネイシン、ｆｒｉｚｚｌｅｄ１－１０、血管抗原ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／ＦＬＫ１）、ＶＥＧＦＲ３（ＦＬＴ４、ＣＤ３０９）、ＰＤＧＦＲ－α（ＣＤ１４０ａ）、ＰＤＧＦＲ－ベータである。（ＣＤ１４０ｂ）エンドグリン、ＣＬＥＣ１４、Ｔｅｍ１－８、およびＴｉｅ２。さらなる例としては、Ａ３３、ＣＡＭＰＡＴＨ－１（ＣＤｗ５２）、癌胚性抗原（ＣＥＡ）、カルボアンヒドラーゼＩＸ（ＭＮ／ＣＡＩＸ）、ＣＤ２１、ＣＤ２５、ＣＤ３０、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、ｄｅ２－７ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥｐＣＡＭ、Ｅｐ－ＣＡＭ、葉酸結合タンパク質、Ｇ２５０、Ｆｍｓ様チロシンキナーゼ３（ＦＬＴ－３、ＣＤ１３５）、卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）、ｃ－Ｋｉｔ（ＣＤ１１７）、ＣＳＦ１Ｒ（ＣＤ１１５）、ＨＬＡ－ＤＲ、ＩＧＦＲ、ＩＬ－２受容体、ＩＬ３Ｒ、ＭＣＳＰ（黒色腫関連細胞表面コンドロイチン硫酸プロテオグリカン）、Ｍｕｃ－１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、およびＴＡＧ－７２を含み得る。腫瘍の細胞外マトリックスに発現される抗原の例は、テナシンおよび線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）である。
一実施形態において、腫瘍抗原は、特定の受容体を標的にするために使用することができるホルモンまたはその断片である。例には、ＦＳＨホルモン、ＬＨホルモン、ＴＳＨホルモン、またはそれらの断片を含むが、これらに限定されない。
ＴＳＡまたはＴＡＡ抗原の非限定的な例は、以下を含む：ＭＡＲＴ－１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ－Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ－１、ＴＲＰ－２、および腫瘍特異的多系統抗原、例えばＭＡＧＥ－１、ＭＡＧＥ－３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ－１、ＧＡＧＥ－２、ｐ１５など；過剰発現胚抗原、例えばＣＥＡ；過剰発現癌遺伝子および変異腫瘍抑制遺伝子、例えばｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ－２／ｎｅｕなど；染色体転座から生じる独自の腫瘍抗原；例えばＢＣＲ－ＡＢＬ、Ｅ２Ａ－ＰＲＬ、Ｈ４－ＲＥＴ、ＩＧＨ－ＩＧＫ、ＭＹＬ－ＲＡＲ；ならびにウイルス抗原、例えばエプスタインバーウイルス抗原ＥＢＶＡおよびヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７などの分化抗原。他の大きなタンパク質ベースの抗原は、ＴＳＰ－１８０、ＭＡＧＥ－４、ＭＡＧＥ－５、ＭＡＧＥ－６、ＲＡＧＥ、ＮＹ－ＥＳＯ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ－３、ｃ－ｍｅｔ、ｎｍ－２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ－７２、ＣＡ １９－９、ＣＡ ７２－４、ＣＡＭ １７．１、ＮｕＭａ、Ｋ－ｒａｓ、ベータ－カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ－１、ｐ １５、ｐ １６、４３－９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アルファ－フェトタンパク質、ベータ－ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ １２５、ＣＡ １５－３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ １９５、ＣＡ ２４２、ＣＡ－５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ－０２９、ＦＧＦ－５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ－１７５、Ｍ３４４、ＭＡ－５０、ＭＧ７－Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ－ＣＯ－１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ－９０＼Ｍａｃ－２結合タンパク質＼サイクロフィンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、およびＴＰＳを含む。
本発明の態様は、対象において免疫応答を生成することができる合成抗体（例えば、ＤＭＡｂ、ＳｃＦｖ抗体断片、ＤＩＣＥまたはＤＢｉＴＥ）、またはその生物学的機能的断片もしくはバリアントを含み、それを必要とする対象において抗原に対する免疫応答を増強するための組成物を含む。いくつかの実施形態において、抗原は、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ３３、ＦＡＰ、ＦＳＨＲ、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＣＤ１２３、またはＨｅｒ２である。いくつかの実施形態において、本発明の合成抗体は、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ３３、ＦＡＰ、ＦＳＨＲ、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＣＤ１２３またはＨｅｒ２を標的とするｓｃＦｖを含むＤＢｉＴＥである。
Ｔ細胞特異的受容体
一実施形態において、本発明のＤＢｉＴＥまたはＤＩＣＥは、Ｔ細胞特異的受容体のｓｃＦｖを含む。Ｔ細胞特異的受容体には、ＣＤ３、ＴＣＲ、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、Ｏｘ４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ４０、ＦｃｇＲ、ＦｃｅＲ、ＦｃａＲ、およびＣＤ９５を含むが、これらに限定されない。
組成物の賦形剤および他の構成成分
組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、担体、または希釈剤などの機能的分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤は、トランスフェクション促進剤であり得、これは、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）などの表面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、スクアレンおよびスクアレンなどの小胞、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の既知のトランスフェクション促進剤を含み得る。
トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリ－Ｌ－グルタミン酸（ＬＧＳ）を含むポリカチオン、または脂質である。トランスフェクション促進剤は、ポリ－Ｌ－グルタミン酸であり、ポリ－Ｌ－グルタミン酸は、組成物中に６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で存在し得る。トランスフェクション促進剤はまた、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）などの表面活性剤、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体ならびにスクアレンおよびスクアレンなどの小胞を含み得、ヒアルロン酸はまた、組成物とともに投与されて使用され得る。組成物はまた、脂質などのトランスフェクション促進剤、レシチンリポソームもしくは、ＤＮＡ－リポソーム混合物（例えば、Ｗ０９３２４６４０を参照されたい）として、当該技術分野において既知の他のリポソームを含む、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、またはナノ粒子、または他の既知のトランスフェクション促進剤を含み得る。トランスフェクション促進剤は、ポリアニオン、ポリ－Ｌ－グルタミン酸（ＬＧＳ）を含むポリカチオン、または脂質である。組成物中のトランスフェクション剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。
組成物は、参照により完全に組み込まれる、１９９４年４月１日に出願された米国特許出願第０２１，５７９号に記載される遺伝子促進剤をさらに含み得る。
組成物は、ＤＮＡを約１ナノグラム～１００ミリグラム、約１マイクログラム～約１０ミリグラム、または好ましくは約０．１マイクログラム～約１０ミリグラム、またはより好ましくは約１ミリグラム～約２ミリグラムの量で含み得る。いくつかの好ましい実施形態において、本発明による組成物は、約５ナノグラム～約１０００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態において、組成物は、約１０ナノグラム～約８００マイクログラムのＤＮＡを含み得る。いくつかの好ましい実施形態において、組成物は、約０．１～約５００マイクログラムのＤＮＡを含み得る。いくつかの好ましい実施形態において、組成物は、約１～約３５０マイクログラムのＤＮＡを含み得る。いくつかの好ましい実施形態において、組成物は、約２５～約２５０マイクログラム、約１００～約２００マイクログラム、約１ナノグラム～１００ミリグラム、約１マイクログラム～約１０ミリグラム、約０．１マイクログラム～約１０ミリグラム、約１ミリグラム～約２ミリグラム、約５ナノグラム～約１０００マイクログラム、約１０ナノグラム～約８００マイクログラム、約０．１～約５００マイクログラム、約１～約３５０マイクログラム、約２５～約２５０マイクログラム、約１００～約２００マイクログラムのＤＮＡを含み得る。
組成物は、使用される投与の様式に従って製剤化され得る。注射可能な薬学的組成物は、滅菌、パイロジェンフリー、および無粒子であり得る。等張性製剤または溶液が使用され得る。等張性のための添加剤は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含み得る。組成物は、血管収縮剤を含み得る。等張性溶液は、リン酸緩衝生理食塩水を含み得る。組成物は、ゼラチンおよびアルブミンを含む安定化剤をさらに含み得る。安定化剤は、ＬＧＳまたはポリカチオンもしくはポリアニオンを含む製剤が室温または周囲温度で長時間にわたって安定であることを可能にし得る。
合成抗体の生成方法
本発明はまた、合成抗体の生成方法に関する。方法は、組成物を、それを必要とする対象に、以下でより詳細に記載される送達方法を使用することによって投与することを含み得る。したがって、合成抗体は、対象に組成物を投与すると、対象においてまたはインビボで生成される。
方法はまた、組成物を１つ以上の細胞に導入することを含み得、したがって、合成抗体は、１つ以上の細胞内で生成または産生され得る。方法は、組成物を１つ以上の組織、例えば、これらに限定されないが、皮膚および筋肉に導入することをさらに含み得、したがって、合成抗体は、１つ以上の組織において生成または産生され得る。
組成物の送達方法
本発明はまた、組成物をそれを必要とする対象に送達する方法に関する。送達方法は、組成物を対象に投与することを含み得る。投与は、これらに限定されないが、インビボエレクトロポレーションを伴う、および伴わないＤＮＡ注入、リポソーム媒介送達、ならびにナノ粒子促進送達を含み得る。
組成物の送達を受ける哺乳動物は、ヒト、霊長類、非ヒト霊長類、ウシ（ｃｏｗ）、ウシ（ｃａｔｔｌｅ）、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、スイギュウ、バイソン、ウシ（ｂｏｖｉｄ）、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、およびニワトリであり得る。
組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、吸入を介した、口腔内投与を介した、胸腔内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、髄腔内および関節内、またはそれらの組み合わせを含む、異なる経路によって投与され得る。獣医学的使用のために、組成物は、通常の獣医学的診療に従って、適切に許容される製剤として投与され得る。獣医は、特定の動物に最も適切な投与レジメンおよび投与経路を容易に決定することができる。組成物は、従来のシリンジ、無針注射デバイス、「微粒子衝撃遺伝子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｇｏｎｅ ｇｕｎ）」、またはエレクトロポレーション（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」、または超音波などの他の物理的方法によって投与されてもよい。
エレクトロポレーション
エレクトロポレーションを介した組成物の投与は、可逆的な孔を細胞膜内に形成させるのに有効なエネルギーパルスを、哺乳動物の所望の組織に送達するように構成され得るエレクトロポレーションデバイスを使用して達成することができ、好ましくは、エネルギーパルスは、使用者による予め設定された電流入力と同様の定電流である。エレクトロポレーションデバイスは、エレクトロポレーション構成要素および電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを備え得る。エレクトロポレーション構成要素は、コントローラ、電流波形発生器、インピーダンステスタ、波形ロガー、入力エレメント、状態報告エレメント、通信ポート、メモリ構成要素、電源、および電源スイッチを含む、エレクトロポレーションデバイスの様々なエレメントのうちの１つ以上を含み、組み込み得る。エレクトロポレーションは、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを容易にするために、インビボエレクトロポレーションデバイス、例えば、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ ＥＰシステム（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）またはＥｌｇｅｎエレクトロポレータ（Ｉｎｏｖｉｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）を使用して達成され得る。
エレクトロポレーション構成要素は、エレクトロポレーションデバイスの１つのエレメントとして機能し得、他のエレメントは、エレクトロポレーション構成要素と通信する別個のエレメント（または構成要素）である。エレクトロポレーション構成要素は、エレクトロポレーションデバイスの２つ以上のエレメントとして機能し得、エレクトロポレーション構成要素とは別個のエレクトロポレーションデバイスのさらに他のエレメントと通信し得る。１つの電気機械デバイスまたは機械デバイスの一部として存在するエレクトロポレーションデバイスのエレメントは、エレメントが１つのデバイスとして、または互いに通信する別個のエレメントとして機能することができるため、限定されなくてもよい。エレクトロポレーション構成要素は、所望の組織内に定電流を生成するエネルギーパルスを送達することが可能であってもよく、フィードバックメカニズムを含む。電極アセンブリは、空間的に配置された複数の電極を有する電極配列を含んでよく、電極アセンブリは、エレクトロポレーション構成要素からエネルギーパルスを受信し、電極を通じて所望の組織にそれを送達する。複数の電極のうちの少なくとも１つは、エネルギーのパルスの送達中に中性であり、所望の組織のインピーダンスを測定し、そのインピーダンスをエレクトロポレーション構成要素に伝達する。フィードバックメカニズムは、測定されたインピーダンスを受信し得、エレクトロポレーション構成要素によって送達されるエネルギーパルスを調節して、定電流を維持することができる。
複数の電極は、分散パターンでエネルギーのパルスを送達し得る。複数の電極は、プログラムされたシーケンス下で電極の制御を通じて分散パターンのエネルギーパルスを送達し得、プログラムされたシーケンスは、使用者によってエレクトロポレーション構成要素に入力される。プログラムされた配列は、配列中に送達される複数のパルスを含んでもよく、複数のパルスの各パルスは、インピーダンスを測定する１つの中性電極を有する少なくとも２つの活性電極によって送達され、複数のパルスのその後のパルスは、インピーダンスを測定する１つの中性電極を有する少なくとも２つの活性電極のうちの異なる１つによって送達される。
フィードバックメカニズムは、ハードウェアまたはソフトウェアのいずれかによって実行され得る。フィードバックメカニズムは、アナログ閉ループ回路によって実行され得る。フィードバックは、５０μｓ、２０μｓ、１０μｓ、または１μｓ毎に発生するが、好ましくは、リアルタイムフィードバックまたは即時（すなわち、応答時間を決定するための利用可能な技法によって決定されるように実質的に即時）である。中性電極は、所望の組織内のインピーダンスを測定し、フィードバックメカニズムにインピーダンスを伝達し得、フィードバックメカニズムは、インピーダンスに応答し、定電流を予め設定された電流と同様の値に維持するためにエネルギーパルスを調節する。フィードバックメカニズムは、エネルギーのパルスの送達中に連続的かつ即時的に定電流を維持し得る。
本発明の組成物の送達を促進し得るエレクトロポレーションデバイスおよびエレクトロポレーション方法の例には、Ｄｒａｇｈｉａ－Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈらによって提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載されるものを含み、それらの内容は、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。組成物の送達を促進するために使用され得る他のエレクトロポレーションデバイスおよびエレクトロポレーション方法は、米国特許法第１１９条（ｅ）下で、２００６年１０月１７年に出願された、米国仮特許出願第６０／８５２，１４９号、および２００７年１０月１０日に出願された、同第６０／９７８，９８２号の優先権を主張する、２００７年１０月１７日に出願された、同時係属中の、共同所有される米国特許出願第１１／８７４０７２号に提供されるものを含み、これらの全ては、それらの全体において本明細書に組み込まれる。
Ｄｒａｇｈｉａ－Ａｋｌｉらによる米国特許第７，２４５，９６３号は、モジュラー電極システムと、生体または植物の選択された組織の細胞への生体分子の導入を促進するためのそれらの使用について記載している。モジュラー電極システムは、複数の針電極、皮下針、プログラム可能な定電流パルスコントローラから複数の針電極までの導電リンクを提供する電気コネクタ、および電源を含み得る。オペレータは、支持構造に取り付けられた複数の針電極をつかみ、それらを生体または植物の選択された組織にしっかりと挿入することができる。次いで、生体分子は皮下注射針を介して選択された組織に送達される。プログラム可能な定電流パルスコントローラが作動し、定電流電気パルスが複数の針電極に印加される。印加された定電流電気パルスは、複数の電極間の細胞への生体分子の導入を促進する。米国特許第７，２４５，９６３号の全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
Ｓｍｉｔｈらによって提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０号は、体内または植物内の選択された組織の細胞への生物分子の導入を効果的に容易にするために使用され得るエレクトロポレーションデバイスを記載している。エレクトロポレーションデバイスは、動作がソフトウェアまたはファームウェアによって指定される動電学的デバイス（「ＥＫＤデバイス」）を含む。ＥＫＤデバイスは、ユーザ制御とパルスパラメータの入力に基づいて、アレイ内の電極間に一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを生成し、電流波形データの保存と取得を可能にする。エレクトロポレーションデバイスはまた、針電極のアレイを有する交換可能な電極ディスク、注射針用の中央注射チャネル、および取り外し可能なガイドディスクを含む。米国特許公開第２００５／００５２６３０号の全体の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載される電極配列および方法は、筋肉などの組織だけでなく、他の組織または器官への深部浸透のために適合され得る。電極アレイの構成のため、注射針（選択した生体分子を送達するため）も標的器官中に完全に挿入され、注射は、電極によって予め線引きされた領域で標的組織に垂直に投与される。米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許第２００５／００５２６３号に記載される電極は、好ましくは長さ２０ｍｍおよび２１ゲージである。
加えて、エレクトロポレーションデバイスおよびその使用を組み込むいくつかの実施形態において、以下の特許：１９９３年１２月２８日に発行された米国特許第５，２７３，５２５号、２０００年８月２９日に発行された米国特許第６，１１０，１６１号、２００１年７月１７日に発行された米国特許第６，２６１，２８１号、および２００５年１０月２５日に発行された米国特許第６，９５８，０６０号、ならびに２００５年９月６日に発行された米国特許第６，９３９，８６２号に記載されるものであるエレクトロポレーションデバイスが存在することが企図される。さらに、様々なデバイスのうちのいずれかを用いるＤＮＡの送達に関する、２００４年２月２４日に発行された米国特許第６，６９７，６６９号、およびＤＮＡを注射する方法に注目した、２００８年２月５日に発行された米国特許第７，３２８，０６４号で提供される主題を包含する特許が、本明細書において企図される。上記の特許は、それらの全体が参照により組み込まれる。
治療方法
対象において合成抗体（例えば、ＤＭＡｂ、ｓｃＦｖ断片またはＤＢｉＴＥ）を生成することによって、それを必要とする対象における疾患を治療、それに対して保護、および／または予防する方法もまた本明細書に提供される。方法は、組成物を対象に投与することを含み得る。対象への組成物の投与は、上に記載される送達方法を使用して行われ得る。
ある特定の実施形態において、本発明は、癌を治療、それに対して保護、および／または予防する方法を提供する。一実施形態において、方法は、腫瘍成長を治療、それに対して保護、および／または予防する。一実施形態において、方法は、癌進行を治療、それに対して保護、および／または予防する。一実施形態において、方法は、癌転移を治療、それに対して保護、および／または予防する。
一実施形態において、本発明は、子宮筋腫などであるがこれに限定されない良性腫瘍の成長を防止するための方法を提供する。方法は、有効量の本発明の組成物のうちの１つ以上を、良性腫瘍と診断された対象に投与することを含む。
対象において合成抗体（例えば、ＤＭＡｂ、ｓｃＦｖ断片、またはＤＢｉＴＥ）が生成されると、合成抗体（例えば、ＤＭＡｂ、ｓｃＦｖ断片、またはＤＢｉＴＥ）は、抗原に結合または抗原と反応し得る。そのような結合は、抗原を中和し、別の分子、例えば、タンパク質または核酸による抗原の認識をブロックし、抗原に対する免疫応答を誘発または誘導し、それによって対象における抗原に関連する疾患を治療、それに対して保護、および／または予防することができる。
組成物用量は、１μｇ～１０ｍｇの活性成分／ｋｇ体重／回であり得、２０μｇ～１０ｍｇの成分／ｋｇ体重／回であり得る。組成物は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、または３１日毎に投与され得る。有効な治療のための組成物用量の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり得る。
癌治療
本発明は、癌を治療もしくは予防する方法、または腫瘍の成長もしくは転移を治療および予防する方法を提供する。本発明の関連する態様は、個体における過形成または腫瘍細胞の転移を予防、予防を補助、および／または低減する方法を提供する。
本発明の一態様は、それを必要とする個体において転移を阻害する方法であって、有効量の本発明の組成物を個体に投与することを含む方法を提供する。本発明は、それを必要とする個体において転移を阻害する方法であって、転移を阻害する有効な量の本明細書に記載の組成物のうちのいずれか１つを個体に投与することを含む方法をさらに提供する。
それを必要とする個体における癌を治療もしくは予防する、または腫瘍の転移を治療および予防するいくつかの実施形態において、抗腫瘍剤などの第２の薬剤が個体に投与される。いくつかの実施形態において、第２の薬剤は、プラスミノーゲンアンタゴニスト、またはアデノシンデアミナーゼアンタゴニストなどの第２の転移阻害剤を含む。他の実施形態において、第２の薬剤は、血管新生阻害剤である。
本発明の組成物は、ヒトおよび動物における癌を予防、減少（ａｂａｔｅ）、最小化、制御、および／または軽減（ｌｅｓｓｅｎ）するために使用され得る。本発明の組成物は、原発性腫瘍成長速度を遅らせるためにも使用され得る。本発明の組成物は、治療を必要とする対象に投与される場合、癌細胞の拡散を停止するために使用され得る。したがって、本発明の組成物は、１つ以上の薬物または他の薬剤との併用療法の一部として投与され得る。併用療法の一部として使用される場合、本発明の組成物によって得られる転移の減少および原発性腫瘍成長の減少は、患者を治療するために使用される任意の薬学的または薬物療法のより効果的かつ効率的な使用を可能にする。加えて、本発明の組成物による転移の制御は、対象に疾患を１つの場所に集中させるより大きな能力を与える。
一実施形態において、本発明は、悪性腫瘍または他の癌細胞の転移を予防するための方法、ならびに腫瘍成長速度を低減するための方法を提供する。方法は、有効量の本発明の組成物のうちの１つ以上を、悪性腫瘍もしくは癌性細胞と診断された対象、または腫瘍もしくは癌細胞を有する対象に投与することを含む。
以下は、本発明の方法および組成物によって治療され得る癌の非限定的な例である：急性リンパ芽球性；急性骨髄性白血病；副腎皮質癌；副腎皮質癌、小児期；虫垂癌；基礎細胞癌；胆管癌、肝外性；膀胱癌；骨癌；骨肉腫および悪性線維組織球腫；脳幹神経膠腫、小児期；脳腫瘍、成人期；脳腫瘍、脳幹神経膠腫、小児期；脳腫瘍、中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍、小児期；中枢神経系胚芽腫；小脳星状細胞腫；脳星状細胞腫／悪性神経膠腫；頭蓋咽頭腫；上衣芽細胞腫；上衣腫；髄芽細胞腫；髄上皮腫；中間分化の松果体実質腫瘍；テント上原始神経外胚葉性腫瘍および松果体芽細胞腫；視覚路および視床下部膠腫；脳および脊髄腫瘍；乳癌；気管支腫瘍；バーキットリンパ腫；カルチノイド腫瘍；カルチノイド腫瘍、胃腸性；中枢神経系非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍；中枢神経系胚芽腫；中枢神経系リンパ腫；小脳星状細胞腫脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、小児期；子宮頸癌；脊索腫、小児期；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性疾患；結腸癌；結腸直腸癌；頭蓋咽頭腫；皮膚Ｔ細胞リンパ腫；食道癌；腫瘍のユーイングファミリー；性腺外胚細胞腫瘍；肝外胆管癌；眼癌、眼内黒色腫；眼癌、網膜芽細胞腫；胆嚢癌；胃（Ｇａｓｔｒｉｃ）（胃（Ｓｔｏｍａｃｈ））癌；消化管カルチノイド腫瘍；消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）；胚細胞腫瘍、頭蓋外性；胚細胞腫瘍、性腺外性；胚細胞腫瘍、卵巣性；妊娠性絨毛腫瘍；神経膠腫；神経膠腫、小児脳幹；神経膠腫、小児脳星状細胞腫；神経膠腫、小児視覚路および視床下部性；有毛細胞白血病；頭頸部癌；肝細胞（肝臓）癌；組織球症、ランゲルハンス細胞；ホジキンリンパ腫；下咽頭癌；視床下部および視覚路神経膠腫；眼内黒色腫；島細胞腫瘍；腎臓（腎細胞）癌；ランゲルハンス細胞組織球症；喉頭癌；白血病、急性リンパ芽球性；白血病、急性骨髄性；白血病、慢性リンパ球性；白血病、慢性骨髄性；白血病、有毛細胞；口唇および口腔癌；肝臓癌；肺癌、非小細胞；肺癌、小細胞；リンパ腫、ＡＩＤＳ関連；リンパ腫、バーキット；リンパ腫、皮膚Ｔ細胞性；リンパ腫、ホジキン；リンパ腫、非ホジキン；リンパ腫、原発性中枢神経系；マクログロブリン血症、ワルデンストレーム；骨および骨肉腫の悪性線維性組織球腫；髄芽腫；黒色腫；黒色腫、眼内（眼）；メルケル細胞癌；中皮腫；潜在性原発性を伴う転移性頸部扁平上皮癌；口腔癌；多発性内分泌腺腫症症候群、（小児期）；多発性骨髄腫／形質細胞新生物；真菌症；菌状腫；骨髄異形成症候群；骨髄異形成／骨髄増殖性疾患；骨髄性白血病、慢性；骨髄性白血病、成人急性；骨髄性白血病、小児急性；骨髄腫、多発性；骨髄増殖性疾患、慢性；鼻腔および副鼻腔癌；鼻咽頭癌；神経芽細胞腫；非小細胞肺癌；口腔癌（Ｏｒａｌ Ｃａｎｃｅｒ）；口腔癌（Ｏｒａｌ Ｃａｖｉｔｙ Ｃａｎｃｅｒ）；中咽頭癌；骨肉腫および骨の悪性線維性組織球腫；卵巣癌；卵巣上皮癌；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性度腫瘍；膵臓癌；膵臓癌、島細胞腫瘍；乳頭腫症；副甲状腺癌；陰茎癌；咽頭癌；褐色細胞腫；中間分化の松果体実質腫瘍；松果体芽細胞腫およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍；下垂体腫瘍；血漿ケルト新生物／多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；原発性中枢神経系リンパ腫；前立腺癌；直腸癌；腎細胞（腎臓）癌；腎盂および尿管、移行細胞癌；染色体１５上のＮＵＴ遺伝子に関与する呼吸器系癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺癌；肉腫、腫瘍のユーイングファミリー；肉腫、カポジ；肉腫、軟部組織；肉腫、子宮；セザリー症候群；皮膚癌（非黒色腫）；皮膚癌（黒色腫）；皮膚癌、メルケル細胞癌；小細胞肺癌；小腸癌；軟部組織肉腫；扁平上皮癌、潜在性原発性を伴う頸部扁平上皮癌、転移性；胃（Ｓｔｏｍａｃｈ）（胃（Ｇａｓｔｒｉｃ））癌；テント上原始神経外胚葉性腫瘍；Ｔ細胞リンパ腫、皮膚性；精巣癌；咽喉癌；胸腺腫および胸腺癌；甲状腺癌；腎盂および尿管の移行細胞癌；絨毛性腫瘍、妊娠性；尿道癌；子宮癌、子宮内膜性；子宮肉腫；膣癌；外陰癌；ワルデンストレームマクログロブリン血症、ならびにウィルムス腫瘍。
一実施形態において、本発明は、本発明の組成物での治療の前、同時に、またはその後に、手術、化学療法、化学療法剤、放射線療法、またはホルモン療法、またはそれらの組み合わせなどの癌の補完療法で対象を治療することを含む、癌転移を治療するための方法を提供する。
化学療法剤としては、細胞毒性剤（例えば、５－フルオロウラシル、シスプラチン、カルボプラチン、メトトレキサート、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、オキソルビシン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シタラビンＵＳＰ、シクロホスファミド、エストラムシンリン酸ナトリウム、アルトレタミン、ヒドロキシ尿素、イホスファミド、プロカルバジン、マイトマイシン、ブスルファン、シクロホスファミド、ミトキサントロン、カルボプラチン、シスプラチン、インターフェロンアルファ－２ａ組換え体、パクリタキセル、テニポシド、およびストレプトゾシ）、細胞毒性アルキル化剤（例えば、ブスルファン、クロラムブシル、シクロホスファミド、メルファラン、またはエチルスルホン酸）、アルキル化剤（例えば、アサレー、ＡＺＱ、ＢＣＮＵ、ブスルファン、ビスルファン、カルボキシフタラトプラチナ、ＣＢＤＣＡ、ＣＣＮＵ、ＣＨＩＰ、クロラムブシル、クロロゾトシン、シスプラチナ、クロメソン、シアノモルホリノドキソルビシン、シクロジソン、シクロホスファミド、ジアンヒドロガラクチトール、フルオロドパン、ヘプスルファム、ヒカントン、イホスファミド、メルファラン、メチルＣＣＮＵ、マイトマイシンＣ、ミトゾラミド、ナイトロジェンマスタード、ＰＣＮＵ、ピペラジン、ピペラジンジオン、ピポブロマン、ポルフィロマイシン、スピロヒダントインマスタード、ストレプトゾトシン、テロキシロン、テトラプラチン、チオテパ、トリエチレンメラミン、ウラシルナイトロジェンマスタード、およびＹｏｓｈｉ－８６４）、抗有糸分裂剤（例えば、アロコルヒチン、ハリコンドリンＭ、コルヒチン、コルヒチン誘導体、ドラスタチン１０、マイタンシン、リゾキシン、パクリタキセル誘導体、パクリタキセル、チオコルヒチン、トリチルシステイン、硫酸ビンブラスチン、および硫酸ビンクリスチン）、植物アルカロイド（例えば、アクチノマイシンＤ、ブレオマイシン、Ｌ－アスパラギナーゼ、イダビシン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ミトラマイシン、マイトマイシン、ダウノルビシン、ＶＰ－１６－２１３、ＶＭ－２６、ナベルビンおよびタキソテール）、生物学的製剤（例えば、アルファインターフェロン、ＢＣＧ、Ｇ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦ、およびインターロイキン－２）、トポイソメラーゼＩ阻害剤（例えば、カンプトテシン、カンプトテシン誘導体、およびモルホリノドキソルビシン）、トポイソメラーゼＩＩ阻害剤（例えば、ミトキサントロン、アモナフィド、ｍ－ＡＭＳＡ、アントラピラゾール誘導体、ピラゾロアクリジン、ビサントレンＨＣＬ、ダウノルビシン、デオキシドキソルビシン、メノガリル、Ｎ，Ｎ－ジベンジルダウノマイシン、オキサントラゾール、ルビダゾン、ＶＭ－２６およびＶＰ－１６）、ならびに合成物（例えば、ヒドロキシ尿素、プロカルバジン、ｏ，ｐ’－ＤＤＤ、ダカルバジン、ＣＣＮＵ、ＢＣＮＵ、シス－ジアミンジクロロプラチナ、ミトキサントロン、ＣＢＤＣＡ、レバミゾール、ヘキサメチルメラミン、オールトランスレチノイン酸、グリアデルおよびポルフィマーナトリウム）が挙げられる。
抗増殖剤は、細胞の増殖を減少させる化合物である。抗増殖剤は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、酵素、生物学的応答修飾剤、その他の剤、ホルモンおよびアンタゴニスト、アンドロゲン阻害剤（例えば、フルタミドおよび酢酸ロイプロリド）、抗エストロゲン（例えば、クエン酸タモキシフェンおよびその類似体、トレミフェン、ドロロキシフェン、およびロロキシフェン）を含み、特定の抗増殖剤の追加の例には、レバミゾール、硝酸ガリウム、グラニセトロン、サルグラモスチム塩化ストロンチウム－８９、フィルグラスチム、ピロカルピン、デキストラゾキサン、およびオンダンセトロンが挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の化合物は、単独で、または細胞毒性／抗腫瘍剤および抗血管新生剤を含む他の抗腫瘍剤と組み合わせて投与され得る。細胞毒性／抗腫瘍剤は、癌細胞を攻撃して死滅させる薬剤として定義される。いくつかの細胞毒性／抗腫瘍剤は、腫瘍細胞の遺伝物質をアルキル化するアルキル化剤、例えば、シスプラチン、シクロホスファミド、ナイトロジェンマスタード、トリメチレンチオホスホルアミド、カルムスチン、ブスルファン、クロラムブシル、ベルスチン、ウラシルマスタード、クロマファジン、およびダカルバジンである。他の細胞毒性／抗腫瘍剤は、腫瘍細胞の代謝拮抗剤、例えば、シトシンアラビノシド、フルオロウラシル、メトトレキサート、メルカプトプリン、アザチオプライム、およびプロカルバジンである。他の細胞毒性／抗腫瘍剤は、抗生物質、例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ミトラマイシン、マイトマイシン、マイトマイシンＣ、およびダウノマイシンである。これらの化合物について市販されている多数のリポソーム製剤が存在する。さらに他の細胞毒性／抗腫瘍剤は、有糸分裂阻害剤（ビンカアルカロイド）である。これらは、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびエトポシドを含む。その他の細胞毒性／抗腫瘍剤は、タキソールおよびその誘導体、Ｌ－アスパラギナーゼ、抗腫瘍抗体、ダカルバジン、アザシチジン、アムサクリン、メルファラン、ＶＭ－２６、イホスファミド、ミトキサントロン、ならびにビンデシンを含む。
抗血管新生剤は、当業者に周知である。本発明の方法および組成物における使用に好適な抗血管新生剤は、ヒト化およびキメラ抗体を含む抗ＶＥＧＦ抗体、抗ＶＥＧＦアプタマー、ならびにアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。血管新生の他の既知の阻害剤としては、アンジオスタチン、エンドスタチン、インターフェロン、インターロイキン１（アルファおよびベータを含む）インターロイキン１２、レチノイン酸、およびメタロプロテイナーゼの組織阻害剤－１および－２（ＴＩＭＰ－１および－２）を含む。ラゾキサン、抗血管新生活性を有するトポイソメラーゼＩＩ阻害剤などのトポイソメラーゼを含む小分子もまた使用され得る。
本発明の組成物と組み合わせて使用することができる他の抗癌剤は、以下を含むが、これらに限定されない：アシビシン、アクラルビシン、塩酸アコダゾール、アクロニン、アドゼレシン、アルデスロイキン、アルトレタミン、アンボマイシン、酢酸アメタントロン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アントラマイシン、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ビカルタミド、塩酸ビサントレン、ジメシル酸ビスナフィド、ビゼレシン、硫酸ブレオマイシン、ブレキナルナトリウム、ブロピリミン、ブスルファン、カクチノマイシン、カルステロン、カラセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルムスチン、カルビシン塩酸塩、カルゼレシン、セデフィンゴル、クロラムブシル、シロレマイシン、シスプラチン、クラドリビン、メシル酸クリスナトール、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、デシタビン、デキソルマプラチン、デザグアニン、メシル酸デザグアニン、ジアジクオン、ドセタキセル、ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン、ドロロキシフェン、クエン酸ドロロキシフェン、プロピオン酸ドロモスタノロン、デュアゾマイシン、エダトレキサート、塩酸エフロルニチン、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロマート、エピプロピジン、塩酸エピルビシン、エルブロゾール、塩酸エソルビシン、エストラムスチン、エストラムスチンリン酸エステルナトリウム、エタニダゾール、エトポシド、エトポシドリン酸エステル、エトプリン、塩酸ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フロクスウリジン、フルダラビンリン酸エステル、フルオロウラシル、フルオロシタビン、ホスキドン、ホストリエシンナトリウム、ゲムシタビン、ゲムシタビン塩酸塩、ヒドロキシウレア、イダルビシン塩酸塩、イホスファミド、イルモホシン、インターロイキンＩＩ（組換えインターロイキンＩＩ、またはｒＩＬ２を含む）、インターフェロンアルファ－２ａ、インターフェロンアルファ－２ｂ、インターフェロンアルファ－ｎ１、インターフェロンアルファ－ｎ３、インターフェロンベータ－Ｉａ、インターフェロンガンマ－Ｉｂ、イプロプラチン、塩酸イリノテカン、酢酸ランレオチド、レトロゾール、酢酸リュープロリド、塩酸リアロゾール、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、塩酸ロソキサントロン、マソプロコール、メイタンシン、塩酸メクロレタミン、酢酸メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メトプリン、メツレデパ、ミチンドミド、ミトカルシン、ミトクロミン、ミトギリン、ミトマルシン、マイトマイシン、ミトスペル、ミトタン、塩酸ミトキサントロン、ミコフェノール酸、ノコダゾール、ノガラマイシン、オルマプラチン、オキシスラン、パクリタキセル、ペグアスパラガーゼ、ペリオマイシン、ペンタムスチン、硫酸ペプロマイシン、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、塩酸ピロキサントロン、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、塩酸プロカルバジン、ピューロマイシン、塩酸ピューロマイシン、ピラゾフリン、リボプリン、ログレチミド、サフィンゴール、サフィンゴール塩酸塩、セムスチン、シムトラゼン、スパルフォセートナトリウム、スパルソマイシン、塩酸スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、スロフェヌル、タリソマイシン、テコガランナトリウム、テガフール、塩酸テロキサントロン、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チアゾフリン、チラパザミン、クエン酸トレミフェン、酢酸トレストロン、リン酸トリシリビン、トリメトレキサート、トリメトレキサートグルクロネート、トリプトレリン、塩酸ツブロゾール、ウラシルマスタード、ウレデパ、バプレオチド、ベルテポルフィン、硫酸ビンブラスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、硫酸ビンデシン、硫酸ビネピジン、硫酸ビングリシナート、硫酸ビンロイロシン、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンロシジン、硫酸ビンゾリジン、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、塩酸ゾルビシン。他の抗癌剤は、以下を含むが、これらに限定されない：２０－エピ－１，２５ジヒドロキシビタミンＤ３、５－エチニルウラシル、アビラテロン、アクラルビシン、アシルフルベン、アデシペノール、アドゼレシン、アルデスロイキン、ＡＬＬ－ＴＫアンタゴニスト、アルトレタミン、アンバムスチン、アミドックス、アミホスチン、アミノレブリン酸、アムルビシン、アムサクリン、アナグレリド、アナストロゾール、アンドログラフォリド、血管新生阻害剤、アンタゴニストＤ、アンタゴニストＧ、アンタレリクス、抗背側化形態形成タンパク質－１、抗アンドロゲン、前立腺癌、抗エストロゲン、抗新生物薬、アンチセンスオリゴヌクレオチド、グリシン酸アフィジコリン、アポトーシス遺伝子調節物質、アポトーシス調節物質、アプリン酸、ａｒａ－ＣＤＰ－ＤＬ－ＰＴＢＡ、アルギニンデアミナーゼ、アスラクリン、アタメスタン、アトリムスチン、アキシナスタチン１、アキシナスタチン２、アキシナスタチン３、アザセトロン、アザトキシン、アザチロシン、バッカチンＩＩＩ誘導体、バラノール、バチマスタット、ＢＣＲ／ＡＢＬアンタゴニスト、ベンゾクロリン、ベンゾイルスタウロスポリン、ベータラクタム誘導体、ベータアレチン、ベータクラマイシンＢ、ベツリン酸、ｂＦＧＦ阻害剤、ビカルタミド、ビサントレン、ビスアジリジニルスペルミン、ビスナフィド、ビストラテンＡ、ビゼレシン、ブレフラート、ブロピリミン、ブドチタン、ブチオニンスルホキシミン、カルシポトリオール、カルホスチンＣ、カンプトテシン誘導体、カナリア痘ＩＬ－２、カペシタビン、カルボキサミド－アミノ－トリアゾール、カルボキシアミドトリアゾール、ＣａＲｅｓｔ Ｍ３、ＣＡＲＮ７００、軟骨由来阻害剤、カルゼレシン、カゼインキナーゼ阻害剤（ＩＣＯＳ）、カスタノスペルミン、セクロピンＢ、セトロレリックス、塩素、クロロキノキサリンスルホンアミド、シカプロスト、シス－ポルフィリン、クラドリビン、クロミフェン類似体、クロトリマゾール、コリスマイシンＡ、コリスマイシンＢ、コンブレタスタチンＡ４、コンブレタスタチン類似体、コナゲニン、クランベシジン８１６、クリスナトール、クリプトフィシン８、クリプトフィシンＡ誘導体、キュラシンＡ、シクロペンタントラキノン、シクロプラタム、シペマイシン、シタラビンオクホスフェート、細胞溶解因子、シトスタチン、ダクリキシマブ、デシタビン、デヒドロジムデニンＢ、デスロレリン、デキサメタゾン、デキシホスファミド、デキスラゾキサン、デキスベラパミル、ジアジクオン、ジデムニンＢ、ジドックス、ジエチルノルスペルミン、ジヒドロ－５－アザシチジン、ジヒドロタキソール，９－、ジオキサマイシン、ジフェニルスピロムスチン、ドセタキセル、ドコサノール、ドラセトロン、ドキシフルリジン、ドロロキシフェン、ドロナビノール、デュオカルマイシンＳＡ、エブセレン、エコムスチン、エデルホシン、エドレコロマブ、エフロルニチン、エレメン、エミテフル、エピルビシン、エプリステリド、エストラムスチン類似体、エストロゲンアゴニスト、エストロゲンアンタゴニスト、エタニダゾール、エトポシドリン酸エステル、エキセメスタン、ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フィルグラスチム、フィナステリド、フラボピリドール、フレゼラスチン、フルアステロン、フルダラビン、フルオロダウノルニシン塩酸塩、ホルフェニメクス、ホルメスタン、ホストリエシン、ホテムスチン、ガドリニウムテキサフィリン、硝酸ガリウム、ガロシタビン、ガニレリックス、ゼラチナーゼ阻害剤、ゲムシタビン、グルタチオン阻害剤、ヘプスルファム、ヘレグリン、ヘキサメチレンビスアセトアミド、ヒペリシン、イバンドロン酸、イダルビシン、イドキシフェン、イドラマントン、イルモホシン、イロマスタット、イミダゾアクリドン、イミキモド、免疫刺激ペプチド、インスリン様成長因子－１受容体阻害剤、インターフェロンアゴニスト、インターフェロン、インターロイキン、ヨーベングアン、ヨードドキソルビシン、イポメアノール，４－、イロプラクト（ｉｒｏｐｌａｃｔ）、イルソグラジン、イソベンガゾール、イソホモハリコンドリンＢ、イタセトロン、ジャスプラキノリド、カハラリドＦ、ラメラリン－Ｎトリアセテート、ランレオチド、レイナマイシン、レノグラスチム、レンチナン硫酸塩、レプトルスタチン、レトロゾール、白血病抑制因子、白血球アルファインターフェロン、リュープロリド＋エストロゲン＋プロゲステロン、リュープロレリン、レバミゾール、リアロゾール、直鎖ポリアミン類似体、親油性二糖化ペプチド、親油性白金化合物、リソクリナミド７、ロバプラチン、ロンブリシン、ロメトレキソール、ロニダミン、ロソキサントロン、ロバスタチン、ロキソリビン、ルートテカン、ルテチウムテキサフィリン、リソフィリン、溶解ペプチド、マイタンシン、マンノスタチンＡ、マリマスタット、マソプロコール、マスピン、マトリライシン阻害剤、マトリックスメタロプロテイナーゼ阻害剤、メノガリル、メルバロン、メテレリン、メチオニナーゼ、メトクロプラミド、ＭＩＦ阻害剤、ミフェプリストン、ミルテホシン、ミリモスチム、ミスマッチ二本鎖ＲＮＡ、ミトグアゾン、ミトラクトール、マイトマイシン類似体、ミトナフィド、ミトトキシン線維芽細胞増殖因子－サポリン、ミトキサントロン、モファロテン、モルグラモスチム、モノクローナル抗体，ヒト絨毛性ゴナドトロピン、モノホリル脂質Ａ＋ミオバクテリウム細胞壁ｓｋ、モピダモール、多剤耐性遺伝子阻害剤、複数の腫瘍抑制剤１ベース療法、マスタード抗癌剤、ミカペロキシドＢ、マイコバクテリア細胞壁抽出物、ミリアポロン、Ｎ－アセチルジナリン、Ｎ－置換ベンズアミド、ナファレリン、ナグレスチップ、ナロキソン＋ペンタゾシン、ナパビン、ナフテルピン、ナルトグラスチム、ネダプラチン、ネモルビシン、ネリドロン酸、中性エンドペプチダーゼ、ニルタミド、ニサマイシン、一酸化窒素調節物質、ニトロキシド酸化防止剤、ニトルリン、Ｏ６－ベンジルグアニン、オクトレオチド、オキセノン、オリゴヌクレオチド、オナプリストン、オンダンセトロン、オンダンセトロン、オラシン、経口サイトカイン誘導剤、オルマプラチン、オサテロン、オキサリプラチン、オキサウノマイシン、パクリタキセル、パクリタキセル類似体、パクリタキセル誘導体、パラウアミン、パルミトイルリゾキシン、パミドロン酸、パナキシトリオール、パノミフェン、パラバクチン、パゼリプチン、ペグアスパラガーゼ、ペルデシン、ペントサンポリサルフェートナトリウム、ペントスタチン、ペントロゾール、ペルフルブロン、ペルホスファミド、ペリリルアルコール、フェナジノマイシン、フェニルアセテート、ホスファターゼ阻害剤、ピシバニル、ピロカルピン塩酸塩、ピラルビシン、ピリトレキシム、プラセチンＡ、プラセチンＢ、プラスミノーゲンアクチベーター阻害剤、白金複合体、白金化合物、白金トリアミン複合体、ポルフィマーナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニゾン、プロピルビス－アクリドン、プロスタグランジンＪ２、プロテアソーム阻害剤、タンパク質Ａベース免疫調節物質、プロテインキナーゼＣ阻害剤、プロテインキナーゼＣ阻害剤，微細藻類、プロテインチロシンホスファターゼ阻害剤、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ阻害剤、プルプリン、ピラゾロアクリジン、ピリドキシル化ヘモグロビンポリオキシエチレンコンジュゲート、ｒａｆアンタゴニスト、ラルチトレキセド、ラモセトロン、ｒａｓファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、ｒａｓ阻害剤、ｒａｓ－ＧＡＰ阻害剤、脱メチル化レテリプチン、レニウムＲｅ１８６エチドロネート、リゾキシン、リボザイム、ＲＩＩレチナミド、ログレチミド、ロヒツカイン、ロムルチド、ロキニメックス、ルビギノンＢ１、
ルボキシル、サフィンゴール、サントピン、ＳａｒＣＮＵ、サルコフィトールＡ、サルグラモスチム、Ｓｄｉ１模倣物、セムスチン、老化由来阻害剤１、センスオリゴヌクレオチド、シグナル伝達阻害剤、シグナル伝達調節物質、一本鎖抗原結合タンパク質、シゾフラン、ソブゾキサン、ボロカプテートナトリウム、フェニル酢酸ナトリウム、ソルベロール、ソマトメジン結合タンパク質、ソネルミン、スパルフォシン酸、スピカマイシンＤ、スピロムスチン、スプレノペンチン、スポンジスタチン１、スクアラミン、幹細胞阻害剤、幹細胞分裂阻害剤、スチピアミド、ストロメリシン阻害剤、スルフィノシン、超活性腸管ペプチドアンタゴニスト、スラジスタ、スラミン、スワインソニン、合成グリコサミノグリカン、タリムスチン、タモキシフェンメチオダイド、タウロムスチン、タザロテン、テコガランナトリウム、テガフール、テルラピリリウム、テロメラーゼ阻害剤、テモポルフィン、テモゾロミド、テニポシド、テトラクロロデカオキシド、テトラゾミン、タリブラスチン、チオコラリン、トロンボポエチン、トロンボポエチン模倣物、チマルファシン、チモポイエチン受容体アゴニスト、チモトリナン、甲状腺刺激ホルモン、スズエチルエチオプルプリン、チラパザミン、チタノセン二塩化物、トプセンチン、トレミフェン、全能性幹細胞因子、翻訳阻害剤、トレチノイン、トリアセチルウリジン、トリシリビン、トリメトレキサート、トリプトレリン、トロピセトロン、ツロステリド、チロシンキナーゼ阻害剤、チルホスチン、ＵＢＣ阻害剤、ウベニメクス、尿生殖洞由来成長阻害因子、ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト、バプレオチド、バリオリンＢ、ベクター系、赤血球遺伝子療法、ベラレソール、ベラミン、ベルジン、ベルテポルフィン、ビノレルビン、ビンキサルチン、ビタキシン、ボロゾール、ザノテロン、ゼニプラチン、ジラスコルブ、およびジノスタチン刺激剤。一実施形態において、抗癌薬は、５－フルオロウラシル、タキソール、またはロイコボリンである。
インビトロおよびエクスビボでの合成抗体の生成
一実施形態において、合成抗体（例えば、ＤＭＡｂ、ＳｃＦｖ断片またはＤＢｉＴＥ）は、インビトロまたはエクスビボで生成される。例えば、一実施形態において、合成抗体（例えば、ＤＭＡｂ、ＳｃＦｖ断片またはＤＢｉＴＥ）をコードする核酸は、インビトロまたはエクスビボ細胞において導入および発現され得る。遺伝子を細胞に導入および発現するための方法は、当該技術分野で既知である。発現ベクターの文脈において、ベクターは、当該技術分野における任意の方法によって、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、または昆虫細胞に容易に導入され得る。例えば、発現ベクターは、物理的、化学的、または生物学的手段によって宿主細胞に導入され得る。
宿主細胞にポリヌクレオチドを導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、パーティクルボンバードメント、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどが挙げられる。ベクターおよび／または外来性核酸を含む細胞を産生するための方法は当該技術分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法としては、ＤＮＡベクターおよびＲＮＡベクターの使用が挙げられる。ウイルスベクター、および特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えば、ヒト細胞に遺伝子を挿入するための最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号および５，５８５，３６２号を参照されたい。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段としては、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフィア、ビーズ、ならびに水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質系などのコロイド分散系が挙げられる。インビトロおよびインビボで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
非ウイルス送達系が利用される場合では、例示的な送達ビヒクルはリポソームである。脂質製剤の使用は、（インビトロ、エクスビボ、またはインビボでの）宿主細胞への核酸の導入のために企図される。別の態様では、核酸は、脂質と関連し得る。脂質に関連する核酸は、リポソームの水性内部に封入され、リポソームの脂質二重層内に分散され、リポソームおよびオリゴヌクレオチドの両方に関連する連結分子を介してリポソームに結合され、リポソームに捕捉され、リポソームと複合体形成され、脂質を含有する溶液中に分散され、脂質と混合され、脂質と組み合わされ、脂質中に懸濁液として含有され、ミセルに含有されるか、またはミセルと複合体形成され、またはそれ以外の方法で脂質と関連し得る。脂質、脂質／ＤＮＡ、または脂質／発現ベクター関連組成物は、溶液中のいかなる特定の構造にも限定されない。例えば、それらは、ミセルとして二層構造に存在し得るか、または「崩壊」構造を有し得る。これらはまた、溶液中に単純に分散されてもよく、サイズまたは形状が均一ではない凝集体を形成する可能性もある。脂質は、天然発生型または合成脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質としては、細胞質内で天然に発生する脂肪滴、ならびに長鎖脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体、例えば、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、およびアルデヒドを含む化合物のクラスが挙げられる。
本発明は、以下の実施例においてさらに示される。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しながら、例示としてのみ与えられることが理解されるべきである。上記議論およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な使用および条件に適合するように本発明の様々な変更および修飾を行うことができる。したがって、本明細書に示され、記載されるものに加えて、本発明の様々な修飾は、前述の説明から当業者には明らかであろう。そのような修飾はまた、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。
実施例１
本明細書に提示される研究は、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ３３、ＦＡＰ、ＦＳＨＲ、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、またはＣＤ１２３を標的とするＤＮＡコード化二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＤＢｉＴＥ）の開発を実証する。ＤＢｉＴＥ構築物はインビボで、高レベルで発現する。図１は、ＢＣＭＡＤＢｉＴＥ、ＣＤ３３ＤＢｉＴＥ、およびＣＤ１２３ＤＢｉＴＥの発現を示す。図２は、ＥＧＦＲｖＩＩＩＤＢｉＴＥ、ＦＳＨＲＤＢｉＴＥ、ＰＳＭＡＤＢｉＴＥ、およびＣＤ１９ＤＢｉＴＥの発現を示す。これらの新規のＤＢｉＴＥは、癌の免疫療法のための新しいツールを表す。
図３～５は、ＣＤ１９ＤＢｉＴＥがＢ細胞枯渇およびＴ細胞活性化の両方に対して機能することを示すデータを提供する。３つの独立したドナーからのＰＢＭＣは、５μｌのＣＤ１９ＤＢｉＴＥまたは対照ＤＢｉＴＥ（ＥＧＦＲｖＩＩＩＤＢｉＴＥ）の上清の存在下で、三重で５時間培養された。インキュベーション後、細胞は、Ｂ細胞およびＴ細胞マーカーについて染色され、Ｂ細胞（ＣＤ１９＋細胞）およびＴ細胞の早期活性化に対する潜在的な細胞溶解活性を決定した。図４は、３つ全てのドナーが、ＣＤ１９ＤＢｉＴＥの存在下でＢ細胞（ＰＢＭＣ混合物におけるＣＤ１９＋細胞）の枯渇を示し、対照ＤＢｉＴＥの存在下では示さなかったことを示すデータを提供する。図５は、３つ全てのドナーが、ＣＤ１９ＤＢｉＴＥの存在下でＴ細胞における初期活性化マーカーＣＤ６９の増加を示し、対照ＤＢｉＴＥの存在下では示さなかったことを示すデータを提供する。
さらに、ＢＣＭＡＤＢｉＴＥの細胞毒性を実証するために実験が行われた。ＢＣＭＡＤＢｉＴＥ上清またはＣＤ３３ＤＢｉＴＥ上清は、ＲＰＭＩ８２２６細胞株とともに５時間インキュベートされ、由来のＴ細胞は、１：０、１：３、および１：７の腫瘍対Ｔ細胞比（ウェル当たり１０，０００個の腫瘍細胞）で１つのドナーを形成した。５時間インキュベーションすると、ＢＣＭＡｄＢｉＴＥは、１：１、１：３、および１：７の比率で細胞を溶解することができたが、Ｔ細胞の不在下では溶解することはできず、ＣＤ３３ＤＢｉＴＥの存在下では、いかなる条件下でも死滅は生じなかった。
実施例２
本明細書に提示される研究は、ＨＥＲ２（ＨＥＲ２ＤＭＡｂおよびＨＥＲ２ＤＢｉＴＥ）を標的とするＤＮＡモノクローナル抗体およびＢｉＴＥの開発、ならびに卵巣および乳癌の治療のための治療薬としてのそれらの使用を実証する。ＤＭＡｂおよびＤＢｉＴＥ構築物の両方は、約４ヶ月間インビトロおよびインビボで、高レベルで発現する。ＨＥＲ２ＤＭＡｂは、ＨＥＲ２に結合し、ＨＥＲ２シグナル伝達遮断および抗体依存性細胞毒性を誘導する。ＨＥＲ２ＤＢｉＴＥは、ＨＥＲ２＋腫瘍細胞に対するＴ細胞の細胞毒性を効果的に誘導する。これらの新規ＤＮＡ技術は、癌の免疫療法のためのさらなる研究のための新しいツールを表す。
材料および方法をここで説明する。
動物および細胞株
Ｃ５７Ｂｌ／６およびＮｕ／ＪマウスはＪａｃｋｓｏｎ ｌａｂｓから購入された。ＮＳＧマウスはＷｉｓｔａｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ａｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙから購入された。
ＯＶＣＡＲ３、ＳＫＯＶ３、およびＢｒｐｋｐ１１０細胞は、Ｊ．Ｒ．Ｃｏｎｅｊｏ－Ｇａｒｃｉａ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｍｏｆｆｉｔｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ，ＦＬ）によって提供された。ＴＯＶ－２１ＧおよびＲＮＧ１は、Ｒ．Ｚｈａｎｇ（Ｔｈｅ Ｗｉｓｔａｒ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）によって提供された。ＯＶＣＡＲ３腫瘍が、前述のように、ＰＢＳ／マトリゲル（５０／５０）中３００万個の細胞を脇腹に注射することによって生成された（Ｐｅｒａｌｅｓ－Ｐｕｃｈａｌｔ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２３（２）：４４１－５３）。ＲＤおよび２９３Ｔ細胞は、ＡＴＣＣから購入された。
マウスは、８０μｌの水に再懸濁した１００μｇのＤＮＡを、２００ＩＵ／ｍｌのヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）で前脛骨筋（脚当たり４０μｌ）に注入し、注射の１分後にＣＥＬＬＥＣＴＲＡデバイスでのエレクトロポレーションによって処理された。
ＨＥＲ２ＤＭＡｂおよびＨＥＲ２ＤＢｉＴＥの設計
抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体ペルツズマブの重および軽鎖のコドン最適化配列をコードするＨＥＲ２ＤＭＡｂが設計され、生成された。両方の抗体鎖は、Ｐ２Ａおよびフリン切断部位によって分離された配列で位置決めされた。ＩｇＥリーダー配列が、元のリーダー配列と置換された。ＨＥＲ２ＤＢｉＴＥは、ＨＥＲ２ＤＭＡｂのコドン最適化ｓｃＦｖ、続いてＯＫＴ３抗ヒトＣＤ３抗体のｓｃＦｖをコードし、ＩｇＥリーダー配列を添加することによって設計された。両方の構築物は、改変ｐＶＡＸ１発現ベクターにサブクローニングされた（図６Ａおよび図１１Ａ）。
空の改変ｐＶＡＸ１プラスミドが陰性対照として使用された。
インビトロＤＭＡｂ発現
１００万個の２９３Ｔ細胞が、６ウェルプレートの各チャンバーに播種された。翌日、細胞を、１μｇのＨＥＲ２ＤＭＡｂプラスミドをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクトされた。上清は、トランスフェクションの４８時間後に回収された。
フローサイトメトリー
使用した抗ヒト抗体は、直接蛍光色素コンジュゲートされた。ＨＥＲ２（２４Ｄ２）、ＣＤ４５（ＨＩ３０）、ＣＤ３（ＨＩＴ３Ａ）、ＣＤ６９（ＦＮ５０）、ＰＤ－１（ＥＨ１２．２Ｈ７）、および二次抗ヒトＩｇＧＡＰＣ（ポリクローナル）をＢｉｏｌｅｇｅｎｄから得た。生／死の除外は、７ＡＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で行われた。
免疫ブロット
タンパク質抽出、変性およびウェスタンブロットは、前述のように行われた（Ｐｅｒａｌｅｓ－Ｐｕｃｈａｌｔ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２３（２）：４４１－５３）。膜は、ポリクローナル抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｂｅｔｈｙｌ）および抗β－アクチン（ａ５４４１、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）でブロットされた。画像は、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔＬＡＳ４０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で捕捉された。
シグナル伝達遮断実験のために、２００，０００個のＯＶＣＡＲ３細胞が６ウェルプレートに播種され、無血清培地で一晩飢餓状態にされた。翌日、１０μｇの精製ＨＥＲ２ＤＭＡｂまたはＰＢＳが、適切なウェルに１時間添加され、続いて１０ｎｇ／ｍｌのＨＲＧ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）が３０分間添加された。
ＨＥＲ２結合ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートは、４℃で一晩、１μｇ／ｍｌのヒトＨＥＲ２組換えタンパク質（ａｂｃａｍ）でコーティングされた。ブロッキングは、ＰＢＳＴ－１０％ＦＢＳで１時間行われた。異なる希釈のＨＥＲ２ＤＭＡｂ発現マウスまたは対照（空のｐＶａｘプラスミドでエレクトロポレーションされた）由来の血清が、一次抗体として使用され、インキュベートは室温で１時間行われた。二次抗体は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ ＨＲＰコンジュゲート（Ｂｅｔｈｙｌ）であった。１時間のインキュベーション後、現像は、ＳＩＧＭＡＦＡＳＴ ＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で実施され、４５０ｎｍで読み取られた。
ＤＭＡｂ定量ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートは、４℃で一晩、１μｇ／ｍｌのヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃ断片抗体（Ｂｅｔｈｙｌ）でコーティングされた。翌日、それらは、室温で１時間、ＰＢＳＴ－１０％ＦＢＳでブロッキングされ、洗浄され、ＰＢＳＴ－１％ＦＢＳ中で希釈した試料とともに室温で１時間、インキュベートされ、洗浄され、ＨＲＰ共役ヤギ抗ヒトカッパ軽鎖抗体（Ｂｅｔｈｙｌ）とともに室温でインキュベートされた。１時間のインキュベーション後、それらはＳＩＧＭＡＦＡＳＴ ＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で現像され、４５０ｎｍで読み取られた。標準曲線は、精製されたヒトＩｇＧ／カッパ（Ｂｅｔｈｙｌ）を使用して生成された。
ＣＤ３およびＨＥＲ２結合ＥＬＩＳＡ（ＤＢｉＴＥ）
ＥＬＩＳＡプレートは、４℃で一晩、１μｇ／ｍｌのヒトＨＥＲ２組換えタンパク質（ａｂｃａｍ）またはヒトＣＤ３イプシロン（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）でコーティングされた。それらはＰＢＳＴ－１０％ＦＢＳで１時間、ブロッキングされた。ＨＥＲ２ＤＢｉＴＥ発現マウスまたは対照（空のｐＶａｘプラスミドでエレクトロポレーションされた）由来の血清が、一次抗体として使用された。それらは室温で１時間インキュベートされた。二次抗体は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｈ＋Ｌ ＨＲＰコンジュゲート（Ｂｅｔｈｙｌ）であった。１時間のインキュベーション後、プレートはＳＩＧＭＡＦＡＳＴ ＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で現像され、４５０ｎｍで読み取られた。
抗ＨＥＲ２ＤＭＡｂおよびＨＥＲ２ＤＢｉＴＥ抗体の検出
ＥＬＩＳＡプレートは、４℃で一晩、１μｇ／ｍｌの精製ＨＥＲ２ＤＭＡｂまたはＨＥＲ２ＤＢｉＴＥでコーティングされた。翌日、プレートは、室温で１時間、ＰＢＳＴ－１０％ＦＢＳでブロッキングされ、洗浄され、ＰＢＳＴ－１％ＦＢＳ中に希釈した試料とともに室温で１時間、インキュベートされ、洗浄され、ＨＲＰ共役ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（Ａｂｃａｍ）とともに室温でインキュベートされた。１時間のインキュベーション後、プレートはＳＩＧＭＡＦＡＳＴ ＯＰＤ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）で現像された。
ＨＥＲ２ＤＢｉＴＥによるＴ細胞活性化およびアポトーシスの検出
９６ウェルプレートは、５，０００個のＯＶＣＡＲ３を４℃で一晩播種された。翌日、ＨＥＲ２ＤＢｉＴＥ発現マウスまたはｐＶａｘ対照（ＰＢＳで１：２０希釈、１００μｌ）由来の血清および５０，０００個のＴ細胞が添加され、プレートは、３７℃でインキュベートされた。２４時間後、ＩＦＮγ ＥＬＩＳＡのために上清が取られ、新鮮な上清が添加された。７２時間後、フローサイトメトリーが実施され、Ｔ細胞アポトーシスおよび活性化（ＣＤ３、ＣＤ６９、ＰＤ－１、アネキシンＶ）を測定した。細胞数については、５，０００個のＯＶＣＡＲ３が１００，０００個のＴ細胞とともに播種され、生Ｔ細胞数は、死細胞排除染料Ｔｒｙｐａｎ Ｂｌｕｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）およびＣｏｕｎｔｅｓｓ ＩＩ自動細胞カウンタ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してカウントされた。
インターフェロンガンマ ＥＬＩＳＡ
上清由来のヒトインターフェロンガンマの決定は、製造業者の説明書に従って、ヒトＩＦＮｇ ＥＬＩＳＡ ＭＡＸ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用して行われた。
インビトロ細胞毒性
ウェル当たり１０，０００個のＯＶＣＡＲ３細胞が、９６ウェルプレートに播種され、１８時間後、ＨＥＲ２ＤＭＡｂの存在下または非存在下で、健康なドナー（ペンシルバニア大学ヒト免疫学コアによって提供された）由来の５００，０００個のヒトＰＢＭＣまたはヌードマウス由来の５００，０００個の脾細胞と４時間共インキュベートされた。４時間後、上清が回収され、細胞はトリプシン処理され、７ＡＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、アネキシンＶ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）および抗ヒトＣＤ４５（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）について染色され、フローサイトメトリベースの細胞毒性アッセイが、前述のように行われた（Ｐｅｒａｌｅｓ－Ｐｕｃｈａｌｔ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２３（２）：４４１－５３）。あるいは、ルシフェラーゼを発現するＯＶＣＡＲ３またはＭＤＡ－ＭＢ－２３１を使用し、共培養後にルシフェラーゼ発現を測定した。ＢｉＴＥ死滅アッセイのために、１０，０００個のＯＶＣＡＲ３－ルシフェラーゼ細胞が異なる比率のＴ細胞と５時間インキュベートされ、ＰＢＳで洗浄され、溶解され、ルシフェラーゼ発現が測定された。
抗体依存性細胞食作用
マクロファージは、Ｔ２５当たり１００万個の単球を５０ｎｇ／ｍｌのヒトＭ－ＣＳＦ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）で播種することによって、ヒト単球から分化させた。サイトカインを有する培地が、３日目および６日目に変更された。６日目に、マクロファージは、トリプシン処理され、製造業者の指示に従って細胞トレースバイオレット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色され、９６ウェルプレートに５万／ウェルで播種され、それらを２０ｎｇ／ｍｌのＭ－ＣＳＦで一晩放置した。７日目に、ＯＶＣＡＲ３細胞は、ＣＦＳＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色され、１０，０００個のＯＶＣＡＲ３細胞は、ＨＥＲ２ＤＭＡｂまたはｐＶａｘ血清を伴うマクロファージとともにウェル上に播種された。２４時間後、細胞はトリプシン処理され、フローサイトメトリーが実施された。食作用は二重陽性染色細胞として測定された。
免疫蛍光
マウス腫瘍は、ＯＣＴ（ＴｉｓｓｕｅＴｅｋ）中で凍結され、凍結切片を切断した。次いでスライドは、４％パラホルムアルデヒドで固定され、ＰＢＳ中０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００で透過された。切片は、５％の正常なヤギ血清を使用してブロッキングされ、続いてＨＥＲ２ＤＭＡｂ抗体および抗ヒトＡＦ４８８コンジュゲート二次（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した。
スライドは、Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５ ＩＩ共焦点顕微鏡およびＬＡＳソフトウェア（Ｌｅｉｃａ）を使用して観測された。
統計学
実験群の平均間の差は、両側の対応のないスチューデントのｔ検定または一元配置ＡＮＯＶＡを使用して計算され、ここでは、２つのカテゴリ変数が測定された。反復測定は、二元配置ＡＮＯＶＡを使用して分析された。エラーバーは平均値の標準偏差を表す。生存率は、ログランク検定を使用して比較された。全ての統計分析は、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ７．０を使用して行われた。ｐ＜０．０５は統計的に有意であるとみなされた。
実験の結果をここで記載する。
ＨＥＲ２ ＤＮＡコード化モノクローナル抗体（ＤＭＡｂ）の設計および発現
ＤＮＡコード化抗体（ＤＭＡｂ）は、従来のタンパク質抗体よりも一連の利点を有する。まず、ＤＮＡはタンパク質よりも安定している。このより高い安定性は、治療費を増加させ、生成物半減期を制限する、抗体の鎖を厳密に冷すこと維持する必要がない（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ ｅｔ ａｌ．，２０１８，Ａｍ Ｊ Ｍａｎａｇ Ｃａｒｅ，２４（２）：１０９－１２）。さらに、これらの抗体コードＤＮＡプラスミドの細胞内送達は、大幅な期間にわたって安定した血漿抗体濃度を達成し、複数回投与の必要性を制限し、癌の免疫療法のための新規ツールを提供する。
ＨＥＲ２ＤＭＡｂは、ペルツズマブの重および軽鎖のコドンおよびＲＮＡ最適化配列をｐＶＡＸ１プラスミド発現ベクターにコードすることによって生成された（図６Ａ）。これらの配列は、ＩｇＥシグナルペプチドが先行し、重および軽鎖はＰ２Ａおよびフリン切断部位によって分離された。抗体発現は、ＨＥＲ２ＤＭＡｂまたは無関係なタンパク質をコードするＤＮＡを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトすることによって、インビトロで試験された。４８時間後、上清が回収され、ウェスタンブロットが行われた。重および軽抗体鎖に対応するバンドが、ＨＥＲ２ＤＭＡｂトランスフェクト２９３Ｔ上清において同定されたが、無関係なタンパク質対照においては同定されなかった（図６Ｂ）。ヒトＩｇＧの量を決定するためにＥＬＩＳＡが使用され、ＨＥＲ２ＤＭＡｂが５～６μｇ／ｍｌで２９３Ｔによって発現されることが観測され、これはＲＤ細胞を使用して検証された（図７Ａ）。
インビトロ発現を確認した後、ＨＥＲ２ＤＭＡｂの発現はインビボで確認された。２００μｇのＨＥＲ２ＤＭＡｂまたは空のベクターがマウスの前脛骨筋に注射され、続いてＣＥＬＬＥＣＴＲＡ３Ｐシステムを使用して適応エレクトロポレーションが行われた（Ｔｅｂａｓ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ）。インビトロ系と同様に、ヒトＩｇＧの存在は、ＨＥＲ２ＤＭＡｂ注射マウス由来の血清において同定されたが、対照においては同定されず（図６Ｃ）、マウス血清における発現レベルは５０μｇ／ｍｌに達し、平均約２５μｇ／ｍｌであった（図６Ｄ）。
次に、ＤＮＡコード化ヒトＩｇＧのヒトＨＥＲ２に結合する能力が試験された。プレートは、ヒトＨＥＲ２タンパク質でコーティングされ、ＨＥＲ２ＤＭＡｂ処置マウス由来の血清または対照の血清とともにインキュベートされた。マウス血清由来のＨＥＲ２ＤＭＡｂは、用量依存的にヒトＨＥＲ２に結合した（図６Ｅ）。タンパク質が細胞表面に存在する場合のＨＥＲ２結合を確認するために、ヒトＨＥＲ２がマウス細胞株Ｂｒｐｋｐ１１０において過剰発現された。ＨＥＲ２ＤＭＡｂは、異所的に発現した場合にのみフローサイトメトリーによってヒトＨＥＲ２に結合した（図６Ｆ）。
ＨＥＲ２は、ヒト卵巣癌細胞株において発現される。
ペルツズマブは、トラスツズマブとは異なり、その抗腫瘍活性のために腫瘍細胞におけるＨＥＲ２過剰発現を必要としない（Ａｇｕｓ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，２（２）：１２７－３７）。卵巣癌において、ペルツズマブは、ゲムシタビンおよびパクリタキセルによる併用治療における無増悪生存率の増加傾向が示されている（Ｋｕｒｚｅｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，３４（２１）：２５１６－２５）。ＨＥＲ２は、卵巣癌のおよそ１１．４％において過剰発現される（組織学的スコア２＋／３＋）（Ｂｏｏｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２１（２）：２８３－９０）。ＨＥＲ２が卵巣癌細胞株においても発現されるかどうかを判断するために、市販の２４Ｄ２抗体を使用してフローサイトメトリーが行われた（図８Ａ）。ＨＥＲ２ＤＭＡｂの結合は、これらの同じ細胞に対するフローサイトメトリーを行うことによって検証された（図８Ｂ）。ＨＥＲ２ＤＭＡｂを使用して、卵巣癌細胞株のインビボ発現および潜在的標的化をさらに検証するために、マウスにおいてＯＶＣＡＲ３腫瘍が生成され、腫瘍凍結切片上で免疫蛍光が行われた。陽性結合は、ＨＥＲ２ＤＭＡｂトランスフェクトマウス由来の血清を使用して見られたが、対照血清では見られず、ＨＥＲ２のインビボ発現およびＨＥＲ２ＤＭＡｂの結合を確認した（図８Ｃ）。
ＨＥＲ２ＤＭＡｂは、ＨＥＲ２シグナル伝達遮断および抗体依存性細胞毒性を仲介する。
異なるメカニズムが、抗癌抗体の抗腫瘍効果に起因している。ペルツズマブは、ＨＥＲ２ヘテロ二量体化およびアゴニスト媒介シグナル伝達を防止することによって作用する（Ｆｒａｎｋｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ，５（４）：３１７－２８）。予想通り、ＨＥＲ２ＤＭＡｂは、ビヒクル対照と比較したときのＡｋｔリン酸化の減少によって証明されるように、ＯＶＣＡＲ３細胞におけるＨＥＲ２－ＨＥＲ３アゴニストのヘレグリン誘導（ＨＲＧ誘導）シグナル伝達を防止した（図９Ａ）。
ＭＡｂが抗腫瘍活性を有する別の機構は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）によるものである。ＨＥＲ２ＤＭＡｂのＡＤＣＣ電位を研究するために、ＯＶＣＡＲ３細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の有無とともに、ＨＥＲ２ＤＭＡｂ由来の血清の存在下で、または空のベクター処置マウス由来の血清を使用して共インキュベートされた。ＨＥＲ２ＤＭＡｂ血清は、ＰＢＭＣの存在下で卵巣癌細胞を効果的に死滅させたが、それらの不在下では死滅させなかった。加えて、対照血清条件（図９Ｂおよび図７Ｂ）において、またはＭＤＡ－ＭＢ－２３１（図７Ｃ）などのＨＥＲ２細胞株に対して、殺傷は観察されなかった。同様に、ＨＥＲ２ｄＭＡｂは、抗体依存性食作用活性を示した（図７Ｄ）。
ＨＥＲ２ＤＭＡｂはインビボで癌進行を遅延させる。
インビボでＨＥＲ２ＤＭＡｂの抗腫瘍効果を判断するために、マウスをＯＶＣＡＲ－３卵巣癌細胞株で挑戦した。ヌードマウスは、Ｔ細胞を有しないが、ＮＫおよびマクロファージ活性が増強されており、それらの脾細胞は、ＨＥＲ２ｄＭＡｂの存在下で、インビトロでＯＶＣＡＲ３を溶解し得る（図７Ｅ）。腫瘍が平均５０ｍｍ３に達したとき、１００μｇのＨＥＲ２ＤＭＡｂまたは空のベクターがＥＰによって筋肉に送達された。ＨＥＲ２ＤＭＡｂ注射動物は、腫瘍成長の著しい遅延を示し、生存の改善をもたらした（図９Ｃ）。ＨＥＲ２ＤＭＡｂ抗体レベルは、ＤＭＡｂ注射の２週間後に約２０μｇ／ｍｌのレベルでピークにし、実験の終了まで１ヶ月にわたって約５～１０μｇ／ｍｌのレベルを維持した（図９Ｄ）。臨床投与をよりよく模倣する免疫能のある宿主における抗腫瘍効果を検証するために、マウスヒトＨＥＲ２乳癌細胞株Ｂｒｋｐｋ１１０を使用して腫瘍が生成された。この細胞株は、ＯＶＣＡＲ３と同様のＨＥＲ２レベルを発現させるよう操作された（図９Ｅ）。腫瘍挑戦の５日後、マウスはＨＥＲ２ＤＭＡｂまたは空のベクターで処理された。ＨＥＲ２ＤＭＡｂはまた、この攻撃的な乳癌のモデルにおいて腫瘍進行を遅らせた（図９Ｆ）。
ＨＥＲ２ｄＭＡｂの動態を研究したところ、ほぼ３００日間にわたって抗体発現の減少があったことが注目された。この現象を調査するために、マウスにおいて発現されるこのヒト構築物に対する抗体の誘導が評価された。抗ＨＥＲ２ｄＭＡｂ抗体の発生は、ＨＥＲ２ｄＭＡｂでの処置後に血清において観察され（図７Ｆ）、これは、経時的にその低下に寄与し得る。
ＨＥＲ２ＢｉＴＥの生成、発現および細胞毒性
二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）は、２つの結合抗体断片（ｓｃＦｖ）を有し、その一方が腫瘍抗原にエンゲージし、他方がＣＤ３活性化を駆動するＴ細胞に結合することによって活性化する。抗腫瘍活性が高いにもかかわらず、これらの新しいツールは、およそ２．１時間のインビボ排除半減期に起因して大きな制限を有するため、ＢｉＴＥ療法はゆっくりと進行する。この短い半減期は、１サイクルあたり４～８週間にわたって点滴ポンプを使用して継続的な静脈内注入を投与すべきことをＢｉＴＥ療法に課す。ＲＮＡ発現ＢｉＴＥを用いた最近の実験は、ＩＶ注入後最大６日間の発現を示し、かなりの進歩を示している（Ｓｔａｄｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１７，Ｎａｔ Ｍｅｄ，２３（７）：８１５－７）。
ＨＥＲ２ＤＭＡｂのｓｃＦｖを刺激抗体抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）のｓｃＦｖと融合させることによって、最適化されたＨＥＲ２ＢｉＴＥが生成された（図１１Ａ）。ＨＥＲ２ＢｉＴＥは、マウス前脛骨筋への注射およびエレクトロポレーションするとインビボで効率的に発現される（図１１Ｂ）。新しいＨＥＲ２ＤＢｉＴＥは、ＨＥＲ２への結合を保持し、ＣＤ３に結合した（図１０Ａおよび１０Ｂ）。重要なことに、ＵＣＨＴ１が提供する刺激は、Ｔ細胞を死滅させることができると報告されているが、ＯＫＴ３細胞をＨＥＲ２ＤＢｉＴＥと共培養した場合、ＨＥＲ２＋細胞の存在下での単なる対照と比較して、増加したアポトーシスの割合またはＴ細胞数の差は観察されなかった（図１０Ｃおよび図１０Ｄ）。インビボで発現したＨＥＲ２ＤＢｉＴＥの機能を判断するために、ＨＥＲ２ＤＢｉＴＥまたは空のベクターを注射したマウス由来の血清とＨＥＲ２＋卵巣癌細胞およびＴ細胞とを培養した。ＨＥＲ２ＤＢｉＴＥ処理後のマウス由来の血清は、Ｔ細胞活性化（図１０Ｅ～図１０Ｇ）、ならびにＯＶＣＡＲ３およびＣＡＯＶ３細胞の効率的な用量依存的細胞毒性を示した。空のベクター処置マウス由来の血清とのインキュベーション時に細胞毒性は認められず、またはＴ細胞の不在下で細胞毒性は観察されなかった（図１１Ｃおよび図１０Ｈ）。処理したマウス由来の５％血清（１００μｌ中５μｌ）で、１：５の比率でのＴ細胞のＯＶＣＡＲ３とインキュベーションは、ＤＢｉＴＥがおよそ４ヶ月間強力な活性を示したことを示した（図１１ｄ）。ＨＥＲ２ＤＢｉＴＥのように、抗ＨＥＲ２ＤＢｉＴＥ抗体の生成が観察され、これは、経時的な循環レベルの部分的な原因であり得る（図１０Ｉ）。インビボでのＤＢｉＴＥ抗腫瘍活性を判断するために、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ－γ（ＮＳＧ）マウスがＯＶＣＡＲ３で挑戦された。マウスは、腫瘍移植の１日後に２００μｇのＨＥＲ２ＤＢｉＴＥまたは空のベクターの単回投与で処理された。腫瘍接種の２週間後、腫瘍がおよそ５０ｍｍ3であるとき、１０，０００，０００個のＰＢＭＣが各マウスに腹腔内注射された。ＨＥＲ２ＤＢｉＴＥ処置は、腫瘍進行に顕著に影響を及ぼし（図１１Ｅ）、１０個の腫瘍のうち８個において腫瘍退縮または腫瘍排除が観察されたが、対照群において腫瘍影響は観察されなかった（図１１Ｆ）。
ＨＥＲ２ＤＢｉＴＥのインビボ効果は、ＰＢＭＣの不在下で観察されなかった（図１０Ｊ）。わずか数秒間持続する単純注射によって送達されたＨＥＲ２ＤＢｉＴＥは、約４ヶ月間インビボで発現され、劇的な抗腫瘍活性を提示した。ＢｉＴＥの合成ＤＮＡ送達は、ＢｉＴＥ療法の短い半減期によって生成される負担を軽減し、癌免疫療法におけるこのツールのための新たな用途を提供し得る。
まとめると、データは、ＤＭＡｂがＨＥＲ２ＤＭＡｂおよびＨＥＲ２ＤＢｉＴＥをコードし得、それらが高レベルで、インビボで耐久的に発現され、強力な抗腫瘍活性を駆動することを可能にすることを実証する。このアプローチは、卵巣癌ならびに潜在的な他の癌の治療のための貴重な新しいツールを提供する。
実施例３
ＥＧＦＲｖＩＩＩ標的化ＤＮＡコード化免疫細胞エンゲージャー（ＤＩＣＥ）は、ＥＧＦＲｖＩＩＩ陽性腫瘍に対するＴ細胞媒介性細胞溶解活性を誘導し、ＧＢＭマウスモデルにおける腫瘍成長を制御する二重特異性抗体のインビボ発現を生成する。
Ｔ細胞および腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的とする二重特異性抗体の開発は、近年、前臨床および臨床の設定の両方で指数関数的に拡大している。２０１７年に、１つの二重特異性抗体が急性リンパ芽球性白血病を治療することが承認された。しかしながら、その低分子量のため、抗体の血清半減期はわずか約４時間である。その結果、治療は、数日間にわたる抗体の継続的なＩＶ注射を必要とし、これは数週間に及ぶ可能性がある。不十分な薬物動態プロファイルは、製造および分子安定性に関連する他の困難とともに、二重特異性抗体の開発において大きな課題を提示している。これらの問題に対処するために、インビボで二重特異性抗体を発現するように設計された最適化された合成ＤＮＡコード化免疫細胞エンゲージャー（ＤＩＣＥ）が開発された。ＨＥＲ２－ＤＩＣＥの単回投与を受けたマウスは、１２０日超間、二重特異性抗体の長期インビボ発現およびＨＥＲ２発現卵巣細胞株に対するＴ細胞媒介性細胞溶解活性を示す。同じ研究において、ＨＥＲ２－ＤＩＣＥは、腫瘍進行を制御するだけでなく、卵巣癌マウスモデルにおける多くの動物における腫瘍クリアランスを促進した。同様の戦略を用いて、多形性膠芽腫（ＧＢＭ）患者の３０～５０％で発現するＴＡＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩを標的とするＤＩＣＥが開発された。インビトロでＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＤＩＣＥでトランスフェクトした細胞由来の上清試料は、ＥＧＦＲｖＩＩＩおよびＣＤ３の両方に対して強力な標的特異的結合親和性を示し、ＥＧＦＲｖＩＩＩを過剰発現するＧＢＭ細胞株に対するＴ細胞媒介性細胞溶解活性を誘導した。ＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＤＩＣＥ上清の存在下での標的細胞および初代ヒトＴ細胞の共培養は、堅牢なＴ細胞応答を刺激し、細胞毒性Ｔ細胞集団において顕著なレベルのＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＣＤ１０７ａを示した。最後に、ＧＢＭマウス挑戦モデルにおいて、ヒトＴ細胞で再増殖されたＮＳＧマウスへのＥＧＦＲｖＩＩＩ－ＤＩＣＥの処理は、腫瘍成長の制御をもたらし、これは、空のベクター対照群では観察されなかった。これらの研究は、二重特異性抗体の合成ＤＮＡ送達が、細胞毒性Ｔ細胞機能を活性化し得、癌免疫療法のための二重特異性抗体の開発の代替アプローチとして研究され得る強力かつ機能的な抗体を生成することを支持する。
前述の詳細な説明および添付の例は、単に例示的であり、本発明の範囲に対する限定として解釈されるものではなく、これは、単独で添付の特許請求の範囲およびそれらの同等物によって定義されることが理解される。
開示される実施形態に対する様々な変更および修飾は、当業者には明らかであろう。限定なしに、化学構造、置換分、誘導体、中間体、合成物、組成物、製剤、または本発明の使用方法に関連するもの含む、そのような変更および修飾は、その趣旨および範囲から逸脱することなく行われ得る。
本発明の態様の一部を以下に記載する。
１．１つ以上の合成ＤＮＡコード化二重特異性免疫細胞エンゲージャーをコードする核酸分子であって、前記より合成ＤＮＡコード化二重特異性免疫細胞エンゲージャーが、少なくとも１つ少なくとも１つの抗原結合ドメイン、および少なくとも１つの免疫細胞エンゲージドメインを含む、核酸分子。
２．前記抗原結合ドメインが、ＣＤ１９、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、ＣＤ３３、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）、卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ１２３、およびヒト上皮成長因子受容体２（Ｈｅｒ２）からなる群から選択される少なくとも１つの抗原を標的とする、項目１に記載の核酸分子。
３．前記免疫細胞エンゲージドメインが、Ｔ細胞、抗原提示細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージからなる群から選択される細胞を標的とする、項目１に記載の核酸分子。
４．前記免疫細胞エンゲージドメインが、ＣＤ３、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、ＣＤ２８、ＣＤ１６、ＮＫＧ２Ｄ、Ｏｘ４０、４－１ＢＢ、ＣＤ２、ＣＤ５、ＣＤ４０、ＦｃｇＲ、ＦｃｅＲ、ＦｃａＲ、およびＣＤ９５からなる群から選択される少なくとも１つのＴ細胞特異的受容体分子を標的とする、項目１に記載の核酸分子。
５．前記免疫細胞エンゲージドメインが、ＣＤ３を標的とする、項目４に記載の核酸分子。
６．ａ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４または配列番号７６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対してアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列と、
ｂ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４または配列番号７６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対してアミノ酸配列の少なくとも６５％にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列の断片と、
ｃ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４または配列番号７６からなる群から選択されるアミノ酸配列と、
ｄ）配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６、配列番号４８、配列番号５０、配列番号５２、配列番号５４、配列番号５６、配列番号５８、配列番号６０、配列番号７０、配列番号７２、配列番号７４または配列番号７６からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも６５％を含むアミノ酸配列の断片と、からなる群から選択される１つ以上の配列をコードするヌクレオチド配列を含む、項目１に記載の核酸分子。
７．ａ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、および配列番号７５からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して核酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列と、
ｂ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、および配列番号７５からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して核酸配列の少なくとも６５％にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列の断片と、
ｃ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、および配列番号７５からなる群から選択されるヌクレオチド配列と、
ｄ）配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５、配列番号４７、配列番号４９、配列番号５１、配列番号５３、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６９、配列番号７１、配列番号７３、および配列番号７５からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも６５％を含むヌクレオチド配列の断片と、からなる群から選択される、項目１に記載の核酸分子。
８．前記ヌクレオチド配列が、ＩｇＥリーダー配列をコードする核酸配列に作動可能に連結されている、項目１～７のいずれかに記載の核酸分子。
９．前記核酸分子が、発現ベクターを含む、項目１～８のいずれかに記載の核酸分子。
１０．項目１～９のいずれかに記載の核酸分子を含む組成物。
１１．薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、項目１０に記載の組成物。
１２．対象における疾患または障害を予防または治療する方法であって、項目１～９のいずれかに記載の核酸分子または項目１０～１１のいずれかに記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
１３．前記疾患が、良性腫瘍、癌、および癌関連疾患からなる群から選択される、項目１２に記載の方法。
１４．１つ以上の合成抗体をコードする核酸分子であって、
ａ）抗ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）合成抗体をコードするヌクレオチド配列と、
ｂ）抗ＨＥＲ２合成抗体の断片をコードするヌクレオチド配列と、
ｃ）ＳｃＦｖ抗ＨＥＲ２合成抗体をコードするヌクレオチド配列と、
ｄ）ＳｃＦｖ抗ＨＥＲ２合成抗体の断片をコードするヌクレオチド配列と、からなる群から選択される少なくとも１つを含む、核酸分子。
１５．ａ）配列番号６２、配列番号６４、および配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対してアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列と、
ｂ）配列番号６２、配列番号６４、および配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列に対してアミノ酸配列の少なくとも６５％にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列の断片と、
ｃ）配列番号６２、配列番号６４、および配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列と、
ｄ）配列番号６２、配列番号６４、および配列番号６６からなる群から選択されるアミノ酸配列の少なくとも６５％を含むアミノ酸配列の断片と、からなる群から選択される１つ以上の配列をコードするヌクレオチド配列を含む、項目１４に記載の核酸分子
１６．ａ）配列番号６１、配列番号６３、および配列番号６５からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して核酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列と、
ｂ）配列番号６１、配列番号６３、および配列番号６５からなる群から選択されるヌクレオチド配列に対して核酸配列の少なくとも６５％にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列の断片と、
ｃ）配列番号６１、配列番号６３、および配列番号６５からなる群から選択されるヌクレオチド配列と、
ｄ）配列番号６１、配列番号６３、および配列番号６５からなる群から選択されるヌクレオチド配列の少なくとも６５％を含むヌクレオチド配列の断片と、からなる群から選択される、項目１４に記載の核酸分子。
１７．前記ヌクレオチド配列が、ＩｇＥリーダー配列をコードする核酸配列に作動可能に連結されている、項目１４～１６のいずれかに記載の核酸分子。
１８．前記核酸分子が、発現ベクターを含む、項目１４～１７のいずれかに記載の核酸分子。
１９．項目１４～１８のいずれかに記載の核酸分子を含む、組成物。
２０．薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、項目１９に記載の組成物。
２１．対象における疾患を予防または治療する方法であって、項目１４～１８のいずれかに記載の核酸分子または項目１９～２０のいずれかに記載の組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
２２．前記疾患が、ＨＥＲ２発現に関連する癌である、項目２１に記載の方法。
２３．前記疾患が、卵巣癌または乳癌である、項目２２に記載の方法。

Claims (7)

  1. 合成ＤＮＡコード化ＣＤ１９×ＣＤ３二重特異性免疫細胞エンゲージャー（ＢＩＴＥ）をコードする核酸分子であって、前記合成ＤＮＡコード化二重特異性免疫細胞エンゲージャーが、配列番号１、配列番号３、および配列番号５からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸分子。
  2. 前記ヌクレオチド配列が、ＩｇＥリーダー配列をコードする核酸配列に作動可能に連結されている、請求項１に記載の核酸分子。
  3. 前記核酸分子が、発現ベクターを含む、請求項１または２に記載の核酸分子。
  4. 請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸分子を含む組成物。
  5. 薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項４に記載の組成物。
  6. 疾患または障害を予防または治療するための、請求項１～３のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項４または５に記載の組成物。
  7. 前記疾患が、良性腫瘍、癌、および癌関連疾患からなる群から選択される、請求項６に記載の核酸分子または組成物。
JP2021543429A 2019-01-30 2020-01-30 癌抗原を標的とするｄｎａコード化二重特異性ｔ細胞エンゲージャーおよび癌治療薬における使用方法 Active JP7680358B2 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2025031123A JP2025109201A (ja) 2019-01-30 2025-02-28 癌抗原を標的とするｄｎａコード化二重特異性ｔ細胞エンゲージャーおよび癌治療薬における使用方法

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201962798626P 2019-01-30 2019-01-30
US62/798,626 2019-01-30
US201962827265P 2019-04-01 2019-04-01
US62/827,265 2019-04-01
PCT/US2020/015942 WO2020160310A1 (en) 2019-01-30 2020-01-30 Dna-encoded bispecific t-cell engagers targeting cancer antigens and methods of use in cancer theraputics

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2025031123A Division JP2025109201A (ja) 2019-01-30 2025-02-28 癌抗原を標的とするｄｎａコード化二重特異性ｔ細胞エンゲージャーおよび癌治療薬における使用方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2022520163A JP2022520163A (ja) 2022-03-29
JP7680358B2 true JP7680358B2 (ja) 2025-05-20

Family

ID=71841952

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021543429A Active JP7680358B2 (ja) 2019-01-30 2020-01-30 癌抗原を標的とするｄｎａコード化二重特異性ｔ細胞エンゲージャーおよび癌治療薬における使用方法
JP2025031123A Pending JP2025109201A (ja) 2019-01-30 2025-02-28 癌抗原を標的とするｄｎａコード化二重特異性ｔ細胞エンゲージャーおよび癌治療薬における使用方法

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2025031123A Pending JP2025109201A (ja) 2019-01-30 2025-02-28 癌抗原を標的とするｄｎａコード化二重特異性ｔ細胞エンゲージャーおよび癌治療薬における使用方法

Country Status (10)

Country Link
US (1) US20220098324A1 (ja)
EP (1) EP3917548A4 (ja)
JP (2) JP7680358B2 (ja)
KR (1) KR20210122268A (ja)
CN (1) CN113474458A (ja)
AU (1) AU2020214336A1 (ja)
BR (1) BR112021014255A2 (ja)
CA (1) CA3127645A1 (ja)
MX (1) MX2021009186A (ja)
WO (1) WO2020160310A1 (ja)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR112019012354A2 (pt) 2016-12-21 2019-11-26 Teneobio, Inc. anticorpos apenas de cadeia pesada anti-bcma
IL288024B2 (en) 2019-05-14 2025-12-01 Provention Bio Inc Methods and compositions for preventing type
US12006366B2 (en) 2020-06-11 2024-06-11 Provention Bio, Inc. Methods and compositions for preventing type 1 diabetes
KR20230175198A (ko) * 2021-03-18 2023-12-29 더 위스타 인스티튜트 오브 아나토미 앤드 바이올로지 IL13Rα2를 표적으로 하는 DNA 암호화 이중특이적 항체 및 이를 암 치료에 사용하는 방법
MX2023013851A (es) 2021-05-24 2023-12-08 Provention Bio Inc Metodos para el tratamiento de diabetes tipo 1.
JP7808306B2 (ja) * 2021-09-03 2026-01-29 蘇州近岸蛋白質科技股▲ふん▼有限公司 抗ｃｄ３ヒト化抗体
US20240409649A1 (en) * 2021-10-06 2024-12-12 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Novel Immune Cell Engagers For Immunotherapy
US20240398951A1 (en) * 2021-10-06 2024-12-05 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Bispecific t-cell engagers targeting fshr and methods of use in cancer theraputics
WO2023077061A1 (en) * 2021-10-28 2023-05-04 David Weiner Bispecific immune cell engagers targeting hiv and methods of use thereof
US20250249094A1 (en) * 2022-04-08 2025-08-07 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Combinations of Bispecific T cell Engagers and Methods of Use Thereof
US20250345354A1 (en) * 2022-06-01 2025-11-13 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Combination of dna-encoded bispecific t-cell engagers targeting cancer antigens and methods of use in cancer therapeutics
WO2024178414A2 (en) * 2023-02-24 2024-08-29 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Epitope editing and multi-specific immunce-cell engager therapy and methods of use
WO2025250826A1 (en) * 2024-05-29 2025-12-04 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Persistent t-cell engagers targeting fshr and methods of use in cancer therapeutics

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011516070A (ja) 2008-04-04 2011-05-26 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア チクングニヤウィルスタンパク質の共通配列、これをコードする核酸分子、並びにこれを使用する組成物および方法
JP2012507280A (ja) 2008-10-29 2012-03-29 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア 改良型ｈｃｖワクチンおよびその使用方法
JP2012508163A (ja) 2008-11-07 2012-04-05 マイクロメット アーゲー 小児急性リンパ芽球性白血病の新規治療
JP2012508164A (ja) 2008-11-07 2012-04-05 マイクロメット アーゲー 急性リンパ芽球性白血病の治療
JP2012509067A (ja) 2008-11-17 2012-04-19 イノビオ ファーマシューティカルズ，インコーポレイティド フラビウイルスに対する免疫反応を引き起こす抗原及びその使用方法
WO2018006005A1 (en) 2016-06-30 2018-01-04 Oncorus, Inc. Pseudotyped oncolytic viral delivery of therapeutic polypeptides

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2567116A1 (en) * 2004-06-04 2005-12-15 Wyeth Enhancing protein expression
CA2796180A1 (en) * 2010-04-15 2011-10-20 Alper Biotech, Llc Monoclonal antibodies against her2 antigens, and uses therefor
US20160015749A1 (en) * 2013-03-05 2016-01-21 Baylor College Of Medicine Engager cells for immunotherapy
LT3200815T (lt) * 2014-10-02 2021-07-26 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Būdai ir kompozicijos, skirti vėžio gydymui
EP3029068A1 (en) * 2014-12-03 2016-06-08 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA for use in the treatment of diseases
KR102548827B1 (ko) * 2014-12-22 2023-06-30 시스트이뮨, 인코포레이티드 이중특이적 4가 항체 및 이의 제조 및 사용방법
ES3043088T3 (en) * 2015-06-17 2025-11-24 Hoffmann La Roche Anti-her2 antibodies and methods of use
US11690919B2 (en) * 2017-01-17 2023-07-04 The Texas A&M University System Endolysosomal targeting conjugates for improved delivery of cargo molecules to the endolysosomal compartment of target cells
AU2018250695A1 (en) * 2017-04-14 2019-11-07 Kodiak Sciences Inc. Complement factor D antagonist antibodies and conjugates thereof

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011516070A (ja) 2008-04-04 2011-05-26 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア チクングニヤウィルスタンパク質の共通配列、これをコードする核酸分子、並びにこれを使用する組成物および方法
JP2012507280A (ja) 2008-10-29 2012-03-29 ザ トラスティーズ オブ ザ ユニバーシティ オブ ペンシルバニア 改良型ｈｃｖワクチンおよびその使用方法
JP2012508163A (ja) 2008-11-07 2012-04-05 マイクロメット アーゲー 小児急性リンパ芽球性白血病の新規治療
JP2012508164A (ja) 2008-11-07 2012-04-05 マイクロメット アーゲー 急性リンパ芽球性白血病の治療
JP2012509067A (ja) 2008-11-17 2012-04-19 イノビオ ファーマシューティカルズ，インコーポレイティド フラビウイルスに対する免疫反応を引き起こす抗原及びその使用方法
WO2018006005A1 (en) 2016-06-30 2018-01-04 Oncorus, Inc. Pseudotyped oncolytic viral delivery of therapeutic polypeptides

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Journal of Oncology Pharmacy Practice，Vol.22, No.4，p.639-645
LEUKEMIA & LYMPHOMA，Vol.57, No.5，p.1021-1032
Pharmacology & Therapeutics，2012年，Volume 136, Issue 3，p.334-342

Also Published As

Publication number Publication date
BR112021014255A2 (pt) 2022-01-18
WO2020160310A1 (en) 2020-08-06
EP3917548A4 (en) 2023-05-03
EP3917548A1 (en) 2021-12-08
JP2022520163A (ja) 2022-03-29
MX2021009186A (es) 2021-09-08
US20220098324A1 (en) 2022-03-31
JP2025109201A (ja) 2025-07-24
CA3127645A1 (en) 2020-08-06
KR20210122268A (ko) 2021-10-08
CN113474458A (zh) 2021-10-01
AU2020214336A1 (en) 2021-09-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7680358B2 (ja) 癌抗原を標的とするｄｎａコード化二重特異性ｔ細胞エンゲージャーおよび癌治療薬における使用方法
US20240189405A1 (en) DNA Monoclonal Antibodies Targeting Checkpoint Molecules
WO2023235805A2 (en) Dna-encoded bispecific antibodies targeting carbonic anhydrase 9 and methods of use in cancer therapeutics
US12195536B2 (en) DNA monoclonal antibodies targeting CTLA-4 for the treatment and prevention of cancer
US20220275065A1 (en) Multivalent dna antibody constructs and use thereof
US20240158521A1 (en) DNA-ENCODED BISPECIFIC ANTIBODIES TARGETING IL13Ra2 AND METHODS OF USE IN CANCER THERAPEUTICS
JP2024537214A (ja) Ｆｓｈｒを標的とする二重特異性ｔ細胞エンゲージャと、がん治療における利用法
US12473361B2 (en) DNA monoclonal antibodies targeting PD-1 for the treatment and prevention of cancer
US20250345354A1 (en) Combination of dna-encoded bispecific t-cell engagers targeting cancer antigens and methods of use in cancer therapeutics
US20250249094A1 (en) Combinations of Bispecific T cell Engagers and Methods of Use Thereof
US20250257131A1 (en) Bispecific T Cell Engagers Targeting Tumor Antigens
US20250250348A1 (en) Bispecific Binding Molecules That Target FSHR and CD3
HK40062326A (en) Dna monoclonal antibodies targeting pd-1 for the treatment and prevention of cancer

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20230130

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20240123

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20240422

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20240723

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20241029

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20250228

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20250304

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20250408

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20250508

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7680358

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150