RS66032B1 - Kompozicija za lokalnu primenu koja sadrži kanabidiol - Google Patents

Description

Opis

OBLAST PRONALASKA

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na kompoziciju za lokalnu primenu koja sadrži kanabinoide. Konkretno, predmetni pronalazak se odnosi na kompoziciju za lokalnu primenu koja sadrži kanabidiol inkorporisan u niozome, poželjno veličine manje od 500 nm, i najmanje jedan lokalno prihvatljiv ekscipijens.

STANJE TEHNIKE

[0002] Cannabis sativa L. je jednogodišnja zeljasta biljka koja pripada porodici Cannabaceae, poznata od davnina po svojoj industrijskoj i terapijskoj upotrebi.

[0003] Cvasti kanabisa ili cvetovi (Lat. flos) sadrže najveću koncentraciju kanabinoida, karakterističnih i ekskluzivnih aktivnih sastojaka biljke kanabis, a dva glavna su delta-9-tetrahidrokanabinol (THC) i kanabidiol (CBD).

[0004] Trenutno, iz biljaka konoplje je izdvojeno više od 500 supstanci, među kojima je više od 120 kanabinoida, npr. tetrahidrokanabinol (THC), kanabidiol (CBD), kanabihromen (CBC), kanabigerol (CBG), kanabidivarin (CBDV), kanabinol (CBN) i drugi, koji su prisutni u različitim količinama u nadzemnim delovima biljke konoplje.

[0005] Kanabis i njegovi derivati su trenutno akreditovani za lečenje brojnih patoloških stanja, uključujući povraćanje izazvano hemioterapijom, mučninu i bol, spastičnost koja je u vezi sa multiplom sklerozom i neke epilepsije (Abrams, D.I., Evropski časopis za internu medicinu, mart 2018, tom 49, strane 7-11). Δ9-THC je jedan od glavnih kanabinoida u kanabisu odgovoran za njegove terapijske efekte i primene, ali njegov psihoaktivni potencijal i ovisnička priroda ograničili su njegov terapijski razvoj. Kanabidiol (CBD) je drugi glavni kanabinoid prisutan u biljci kanabisa koji je, za razliku od Δ9-THC, lišen psihotropne aktivnosti, lišen kanabimimetičkog efekta i lišen potencijala zavisnosti (Babalonis i sarad, Drug Alcohol Depend.01. mart 2017; 172: 9-13). Hemija i farmakologija CBD-a, kao i njegovi molekularni ciljevi, nedavno su pregledani. Zaista, dugo zanemaren, CBD trenutno privlači pažnju zbog svojih terapijskih svojstava (Pisanti i sarad., Cannabidiol: State of the art and new challenges for therapeutic applications, Pharmacology and Therapeutics, tom 175, jul 2017, strane 133-150) uključujući kožne poremećaje.

[0006] Kanabidiol se pretežno ekstrahuje iz nadzemnih delova kanabisa (Cannabis sativa L.), ali se proizvodi i sintetički. Kanabidiol može imati blagotvorne efekte na kožu i interaguje sa endokanabinoidnim sistemom kože, na primer regulacijom lučenja sebuma. Brojne naučne studije potvrdile su regenerativne sposobnosti kanabidiola, koji je takođe koristan kao antiinflamatorno, antioksidativno, sredstvo za zarastanje i antibakterijsko sredstvo za kožu i potkožna tkiva. Kanabidiol takođe može da potpomogne prirodnu obnovu ćelija i deluje kao zaštitni štit od štetnih uticaja okoline (efekat protiv zagađenja).

[0007] Međutim, poznato je i da kanabidiol nije pogodan za pripremu formulacija za lokalnu primenu, posebno kozmetičkih proizvoda i/ili medicinskih uređaja i/ili farmaceutskih preparata za nanošenje na kožu i sluzokože, zbog svoje slabe rastvorljivosti u vodi, i posledične nestabilnosti ili nekompatibilnosti sa visokim procentom vode koja je obično prisutna u kremi, losionu, gelu ili drugoj formulaciji za lokalnu upotrebu. Kanabidiol se stoga trenutno koristi u uljnim rastvorima/suspenzijama, kao na primer kompozicija opisana u WO2019/023668 A1, koji sadrži kanabidiol u smeši masnih kiselina, sa slabom sposobnošću prodiranja kroz kožu i epitel, što sprečava ili smanjuje efikasnost lokalne primene kanabidiola.

[0008] Upotreba niozoma za poboljšanje rastvorljivosti i stabilnosti u formulacijama za lokalnu primenu i prodiranje kanabidiola kroz kožu je predložena od strane E. Ripamonti i sarad, "Evaluation of the efficacy of proprietary niosomes as enhancers of skin permeability of plant extracts: an in vitro study", H&PC Today, tom 13(2) mart/april 2018, ali rezultati dobijeni sa modelom niozoma opisanim u WO 2017/168354 A1 nisu dali statistički značajne rezultate.

[0009] Do danas, kozmetička industrija još uvek traži kompoziciju koja bi omogućila formulaciju kanabidiola za lokalnu primenu i sposobnu da efikasno isporuči kanabidiol kroz kožu.

REZIME PRONALASKA

[0010] Podnosilac prijave se suočio sa problemom lokalne primene kanabidiola i iznenađujuće je otkrio formulaciju kanabidiola inkorporisanu u niozome sposobnu da prevaziđe nedostatke poznate u tehnici.

[0011] Naročito, podnosilac prijave se suočio sa problemom izrade kompozicije za lokalnu primenu koja sadrži kanabidiol u obliku emulzije na bazi vode koja je stabilna tokom vremena i ne dovodi do razdvajanja i/ili taloženja i/ili promene njenih komponenata.

[0012] U isto vreme, podnosilac prijave se suočio sa problemom izrade kompozicije za lokalnu primenu koja sadrži kanabidiol, koja je sposobna da rastvori veću količinu kanabidiola.

[0013] Konačno, podnosilac prijave se suočio sa problemom izrade kompozicije za lokalnu primenu koja sadrži kanabidiol, koja bi poboljšala prodiranje kanabidiola kroz kožu.

[0014] Nakon opsežnog eksperimentisanja, podnosilac prijave je otkrio da kompozicija za lokalnu primenu koja sadrži formulaciju kanabidiola inkorporisanog u niozome koja sadrži najmanje jedan linearan ili razgranat poliglicerol, esterifikovan zasićenim ili nezasićenim linearnim masnim kiselinama, (ii) najmanje jedan polisaharid odabran iz grupe koja se sastoji od pululana, glukana, alginata, amiloze, glikogena, i inulina, poželjno beta-glukana, i opciono, (iii) najmanje jedan glikol koji ima 4 do 16 atoma ugljenika, poželjno kaprilil glikol, omogućava da se do 5% ili više po masi kanabidiola rastvori i poboljšava prodiranje kanabidiola kroz kožu, čime se više kanabidiola čini raspoloživim i efikasnim za istu količinu primenjenog proizvoda.

[0015] Naročito, podnosilac prijave je otkrio da je kompozicija prema pronalasku ispoljila povećanu elastičnost, procenjenu ekstruzionim merenjima, potpomognutu prisustvom betaglukana koji daje niozomima poboljšanu plastičnost i deformabilnost u prelaženju međućelijskih prostora kože.

[0016] Podnosilac prijave je dalje otkrio da je dobijena kompozicija za lokalnu primenu stabilna tokom vremena, nije izazivala nikakvu iritaciju, i da je imala adekvatnu anti-mikrobnu otpornost.

[0017] Konačno, podnosilac prijave je otkrio da je tako dobijena kompozicija za lokalnu primenu, osim što obezbeđuje efikasnu zaštitu od atmosferskih zagađivača, kao što su čestice, takođe u stanju da poboljša vitalnost ćelija kože i ćelijski trofizam, i ispolji značajnu anti-inflamatornu sposobnost, delimično usled poboljšanog prodiranja kanabidiolne komponente, i delom usled prisustva beta-glukana.

[0018] Pored toga, podnosilac prijave je takođe otkrio da kompozicija prema pronalasku ima značajnu umirujuću i aktivnost protiv svraba kože, zajedno sa stimulacijom mitogeneze u ćelijama folikula dlake. S druge strane, preliminarne procene, koje su još u toku, sugerišu da kompozicija prema pronalasku ima značajnu aktivnost za ublažavanje bola u koži.

[0019] Podnosilac prijave takođe veruje da se rezultati dobijeni sa kanabidiolom, u pogledu stabilnosti i sposobnosti prodiranja, mogu proširiti na druge kanabinoide, kao što su, na primer, pomenuti kanabigerol (CBG) i kanabinol (CBN).

[0020] Prema tome, prvi predmet predmet pronalaska se odnosi na lokalnu kompoziciju koja sadrži kompoziciju na vodenoj bazi koja sadrži kanabinoide, posebno kanabidiol, u niozomima koji imaju veličinu manju od 500 nm, i najmanje jedan lokalno prihvatljiv ekscipijens, okarakterisanu time da navedeni niozomi sadrže (i) najmanje jedan linearni ili razgranati poliglicerol, esterifikovan sa zasićenim ili mononezasićenim linearnim masnim kiselinama, (ii) najmanje jedan polisaharid izabran iz grupe koja se satoji od pululana, glukana, alginata, amiloze, glikogena i inulina, i po izboru (iii ) najmanje jedan glikol koji ima 4 do 16 atoma ugljenika.

[0021] Drugi aspekt predmetnog pronalaska odnosi se na kompoziciju na vodenoj bazi, posebno na vodenu disperziju ili rastvor, koja sadrži kanabinoide, posebno kanabidiol, ugrađen u niozome, okarakterisanu time da navedeni niozomi sadrže (i) najmanje jedan linearni ili razgranati poliglicerol esterifikovan sa zasićenim ili mononezasićenim linearnim masnim kiselinama, (ii) najmanje jedan polisaharid izabran iz grupe koja se satoji od pululana, glukana, alginata, amiloze, glikogena i inulina, i po izboru (iii) najmanje jedan glikol koji ima 4 do 16 atoma ugljenika.

[0022] Treći aspekt predmetnog pronalaska se odnosi na postupak za pripremu kompozicije na vodenoj bazi koja sadrži niozome koji sadrže kanabinoide, posebno kanabidiol, koji obuhvata primenu tehnike ručnog mućkanja ili ultrazvučnog mućkanja, okarakterisanu time da navedeni niozomi sadrže (i) najmanje jedan linearni ili razgranati poliglicerol, esterifikovan sa zasićenim ili mononezasićenim linearnim masnim kiselinama, (ii) najmanje jedan polisaharid izabran iz grupe koja se sastoji od pululana, glukana, alginata, amiloze, glikogena i inulina, i po izboru (iii) najmanje jedan glikol koji ima 4 do 16 atoma ugljenika.

KRATAK OPIS SLIKA

[0023] Predmetni pronalazak će biti najbolje ilustrovan sledećim detaljnim opisom, koji je dat u nastavku sa pozivanjem na prateće slike nacrta, koji su predviđeni samo u ilustrativne svrhe i stoga nisu ograničavajući, na kojima:

Slika 1 prikazuje fotomikrografiju vezikula disperzije niozoma (CBD-S5) iz primera 1 posmatranih TEM transmisionom elektronskom mikroskopijom (JEM-1200EX, JEOL Co., Tokio, Japan) korišćenjem metode negativnog bojenja,

Slika 2 prikazuje grafik dinamičkog rasejanja svetlosti (DLS) dobijen analizom istog uzorka vezikula disperzije niozoma (CBD-S5) kao u primeru 1 sa instrumentom za analizu veličine čestica Brookhaven 90Plus,

Slika 3 prikazuje grafik relativne vitalnosti ćelija rekonstruisanog modela ljudskog epidermisa tretiranog disperzijom niozoma (CBD-S5) iz primera 1 u odnosu na pozitivnu kontrolu (PC) i negativnu kontrolu (NC) kao što je opisano u primeru 5A,

Slika 4 prikazuje grafik relativne vitalnosti ćelija rekonstruisanog modela ljudskog epidermisa tretiranog disperzijom niozoma (CBD-S5) iz primera 1, u prisustvu ili odsustvu PM2.5, u odnosu na pozitivnu kontrolu (PC) i negativnu kontrolu (NC) kao što je opisano u primeru 8, i Slika 5 prikazuje grafik relativnog procenta oslobađanja IL-1α rekonstruisanog modela ljudskog epidermisa tretiranog disperzijom niozoma (CBD-S5) iz primera 1, u prisustvu ili odsustvu PM2.5, u odnosu na pozitivnu kontrolu (PC) i negativnu kontrolu (NC) kao što je opisano u primeru 8.

DETALAJN OPIS PRONALASKA

[0024] Predmetni pronalazak se u prvom aspektu odnosi na lokalnu kompoziciju koja sadrži kompoziciju na vodenoj bazi koja sadrži kanabinoide, posebno kanabidiol, u niozomima koji imaju veličinu manju od 500 nm, i najmanje jedan lokalno prihvatljiv ekscipijens, okarakterisanu time da navedeni niozomi sadrže (i) najmanje jedan linearni ili razgranati poliglicerol esterifikovan sa zasićenim ili mononezasićenim linearnim masnim kiselinama, (ii) najmanje jedan polisaharid izabran iz grupe koja se sastoji od pululana, glukana, alginata, amiloze, glikogena i inulina, i po izboru (iii) najmanje jedan glikol koji ima 4 do 16 atoma ugljenika. Izraz "lokalno prihvatljiv" kako se ovde koristi ima za cilj da definiše supstance za koje je poznato da nemaju neželjene sporedne efekte (iritaciju, toksičnost, i tako dalje) kada se primenjuju na kožu, epitel i/ili sluzokoži.

[0025] Izraz "niozom" ili "niozomi" kako se ovde koristi ima za cilj da definiše hidrofilne vezikule formirane od nejonskog surfaktanta orijentisanog u dvosloju.

[0026] Povoljno, niozomi koji se primenjuju u predmetnom pronalasku imaju prečnike manje od 400 nm, poželjnije manje od 300 nm, a još poželjnije manje od 200 nm. Poželjno, niozomi koji se primenjuju u predmetnom pronalasku imaju prečnike veće od 10 nm, poželjnije veće od 20 nm, a još poželjnije veće od 40 nm. Povoljno, niozomi koji se primenjuju u ovpredmetnom pronalasku imaju prečnike između 50 nm i 180 nm, poželjno između 70 nm i 150 nm.

[0027] Linearni ili razgranati poliglicerol esterifikovan sa zasićenim ili mononezasićenim linearnim masnim kiselinama koristan u opredmetnom pronalasku dobija se esterifikacijom linearnog ili razgranatog poliglicerola sa zasićenim ili mononezasićenim linearnim masnim kiselinama.

[0028] Kanabidiol koristan u predmetnom pronalasku može biti prirodnog i/ili sintetičkog porekla, poželjno ima čistoću jednaku ili veću od 95%, jednaku ili veću od 96%, jednaku ili veću od 97%, jednaku ili veću od 98%, ili jednaku ili više od 99. Povoljno, kanabidiol koristan u predmetnom pronalasku ima čistoću od oko 100%.

[0029] Prirodno dobijen kanabidiol može sadržati manji procenat drugih kanabinoida, kao što su, na primer, kanabihromen, kanabigerol, i kanabinol, generalno u ukupnom iznosu jednakom ili manjem od 5%, jednakom ili manjem od 4%, jednakom ili manjem od 3 %, jednako ili manjem od 2%, ili jednakom ili manjem od 1%.

[0030] Poželjni primeri poliglicerola su triglicerol, tetraglicerol, heksaglicerol, oktaglicerol, dekaglicerol. Linearni ili razgranati poligliceroli korisni u predmetnom pronalasku su komercijalno dostupni.

[0031] Primeri komercijalnih proizvoda su poligliceroli koje distribuira American International Chemical LLC pod trgovačkim nazivom Polyglycerol-3, Spiga Nord S.p.A. pod trgovačkim nazivima Vegetable Polyglycerine-3, Vegetable Polyglycerine-4, Vegetable Polyglycerine-6, i Vegetable Polyglycerine-10, i Solvay Chemicals, Inc. pod trgovačkim nazivima Polyglycerol-3 i Polyglycerol-4.

[0032] Korisni primeri zasićenih linearnih masnih kiselina uključuju monokarboksilne kiseline sa 4 do 32 atoma ugljenika, kao što su buterna kiselina, valerinska kiselina, kaproinska kiselina, enantična kiselina, kaprilna kiselina, pelargonska kiselina, kaprinska kiselina, laurinska kiselina, miristinska kiselina, palmitinska kiselina, margarin kiselina, stearinska kiselina, arahidna kiselina, behenska kiselina, lignocerinska kiselina, cerotična kiselina, montanska kiselina, melisinska kiselina, i mlečna kiselina.

[0033] Poželjne zasićene linearne masne kiseline uključuju monokarboksilne kiseline koje imaju 12 do 22 atoma ugljenika, kao što su laurinska kiselina, miristinska kiselina, palmitinska kiselina, margarinska kiselina, stearinska kiselina, arahidna kiselina, i behenska kiselina.

[0034] Korisni primeri linearnih mononezasićenih masnih kiselina uključuju monokarboksilne kiseline koje imaju 14 do 24 atoma ugljenika, kao što su miristoleinska kiselina, palmitoleinska kiselina, oleinska kiselina, gadoleinska kiselina, i erukinska kiselina.

[0035] Korisni primeri smeša masnih kiselina su biljna ulja dobijena presovanjem ili ekstrakcijom semena ili voća, kao što su, na primer, maslinovo ulje, ulje od kikirikija, kokosovo ulje, palmino ulje, i ulje uljane repice. Zbog niskog sadržaja polinezasićenih kiselina, poželjniji su maslinovo ulje i kokosovo ulje, posebno maslinovo ulje.

[0036] Estri linearnih ili razgranatih poliglicerola sa linearnim zasićenim ili mononezasićenim masnim kiselinama, ili njihove smeše, korisni u opredmetnom pronalasku, su komercijalno dostupni. Primeri komercijalnih proizvoda su estri poliglicerola koje proizvodi i distribuira kompanija Lonza pod trgovačkim imenom Polyaldo, kao što su, na primer, Polyaldo<®>6-2-S [poligliceril-6 disterat], Polyaldo<®>10-1-S [poligliceril-10 stearat], Polyaldo<®>10-1-O [poligliceril-10 oleat], Polyaldo<®>10-2-P [poligliceril-10 dipalmitat], od kompanije Hydrior AG, Nemačka pod trgovačkim nazivom Hydriol, kao što je, na primer, HYDRIOL<®>PGO (polyglicerol-4-oleat), HYDRIOL<®>PGD (poliglicerol-3-diizostearat), od kompanije Naturalis s.r.l. pod trgovačkim nazivom Soavirol, kao što je, na primer, Soavirol OV6 (poligliceril-6 estar iz maslinovog ulja), Soavirol OV4 (poligliceril-4 estar iz maslinovog ulja), i od kompanije Nikko Chemicals Co, Ltd. pod trgovačkim nazivom Nikkol Hexaglyn, kao što je, na primer, Nikkol Hexaglyn 1-L (poligliceril-6 laurate) i Nikkol Hexaglyn PR-15 (poligliceril-6 polirikinoleat). Dodatni dobavljači poliglicerol estara za kozmetičke primene mogu se pronaći na thttps://cosmetics.specialchem.com/selectors?q=polyglyceryl.

[0037] Polisaharid koristan u predmetnom pronalasku je izabran iz grupe koja se sastoji od polisaharida prirodnog porekla, kao što su pululani, glukani alginati, amiloza, glikogen, i inulin.

[0038] Povoljno, polisaharid koristan u predmetnom pronalasku bira iz grupe koja se sastoji od alfa- i beta-glukana, poželjnije beta-glukana.

[0039] Beta-glukani su linearni polisaharidi koji sadrže molekule glukoze spojene β(1-3) glikozidnim vezama. Beta-glukani su prirodni proizvodi pronađeni u žitaricama, bakterijama i gljivama. Ovas i ječam su posebno bogati beta-glukanima, a njihova proizvodnja dolazi uglavnom od ekstrakcije iz ovih žitarica. Beta-glukani dobijeni iz gljiva su takođe široko dostupni komercijalno. Beta-glukani iz gljiva i kvasca sadrže razgranate veze sa glikozidnim i β(1-6) vezama, dok beta-glukani iz žitarica imaju glikozidne i β(1-3) i β(1-4) veze. Beta-glukani dobijeni iz žitarica su bolje rastvorljivi u vodi, i prema tome su poželjniji za svrhe predmetnog pronalaska.

[0040] Beta-glukani posebno korisni za svrhe predmetnog pronalaska su beta-glukani koje distribuira kompanija Ohly GmbH, Nemačka, pod trgovačkim nazivom Ohly-GOO Glucan, kompanija Maypro Industries LLC pod trgovačkim nazivom Chitoglucan®, kompanija Lesaffre Human Care pod trgovačkim nazivom Lynside® Wall Glucan, i kompanija HerbaKraft Inc. pod trgovačkim nazivom Beta Glucan. Dodatni dobavljači beta-glukana za kozmetičke primene mogu se naći na https://cosmetics.specialchem.com/inci/beta-glucan.

[0041] Glikol koji ima 4 do 16 atoma ugljenika koristan u ovpredmetnom pronalasku je poželjno izabran iz grupe koja se sastoji od 1,2-butandiola, 1,2-pentandiola, 1,2-heksandiola, 1,2-heptandiola, 1,2-oktandiola (kaprilil glikola), 1,2-dekandiola (kapril glikola), 1,2-dodekandiola (lauril glikola), i 1,2-heksadekandiola.

[0042] 1,2-heksandiol, 1,2-heptandiol, 1,2-oktandiol (kaprilil glikol), 1,2-dekandiol (kapril glikol) su posebno poželjni. Za svrhe predmetnog pronalaska, 1,2-oktandiol (kaprilil glikol) se povoljno koristi.

[0043] Komercijalne proizvode koji sadrže glikole korisne za svrhe predmetnog pronalaska distribuira kompanija CBW Chemie GmbH, Nemačka, kompanija Inolex Inc., SAD pod trgovačkim nazivom Lexgard®, kompanija Wintersun Chemical, SAD, i kompanija Chemos GmbH & Co. KG.

[0044] Dobavljači poliglicerola i njihovih estara, beta-glukana i glikola korisnih u predmetnom pronalasku takođe se mogu naći na Internetu, na primer na https://www.foodingredients.com/english/, na http://www.buyersguidechem.com/ i na https://cosmetics.specialchem.com/.

[0045] U proizvodnji niozoma koji se koriste za svrhe predmetnog pronalaska, poželjno je da se koriste dalje komponente pogodne za stabilizaciju i očuvanje vodenog rastvora/disperzije niozoma, kao što su na primer prirodni antioksidansi rastvorljivi u vodi kao što su askorbinska kiselina i njeni derivati, i polifenoli.

[0046] Kompozicija na bazi vode koja sadrži niozome predmetnog pronalaska može se pripremiti u skladu sa tehnikama poznatim u tehnici, na primer, tehnikom ručnog mućkanja ili ultrazvučnom tehnikom.

[0047] Tehnika ručnog mućkanja obuhvata prvi korak solubilizacije komponenti u isparljivom organskom rastvaraču, kao što je, na primer, etil etar, hloroform ili metanol, koji se sprovodi u staklenoj posudi, drugi korak isparavanja, koji se sprovodi u rotacionom isparivaču na sobnoj temperaturi (20°-25°C) ostavljajući tanak sloj komponenti tisaloženih na zidovima boce, i na kraju treći korak rehidratacije sa vodenom fazom koja sadrži biljne ekstrakate na temperaturi između 0° i 60°C pod blagim mešanjem.

[0048] Ultrazvučna tehnika obuhvata sonikaciju na temperaturi između 0° i 60°C disperzije dobijene mešanjem organske faze koja sadrži surfaktante i vodene faze koja sadrži biljne ekstrakte.

[0049] Ove i druge metode pripreme kompozicija koje sadrže niozome opisane su u literaturi, na primer u članku od Madhav i sarad., "Niosomes: a novel drug delivery system"; International journal of research in pharmacy and chemistry, IJRPC 2011, 1(3), 498-5.11.

[0050] Disperzija/rastvor niozoma predmetnog pronalaska poželjno sadrži količine komponenti koje su opisane u nastavku i izražene kao maseni procenat u odnosu na ukupnu masu disperzije/rastvora niozoma (% m/m).

[0051] Kanabidiol je uključen u disperziju/rastvor niozoma do količine od 10% m/m. Poželjno, kanabidiol je prisutan u količini u rasponu od 1% do 8% m/m, poželjnije u rasponu od 2% do 7% m/m, a još poželjnije u rasponu od 3% do 6% m/m. Povoljno, količina kanabidiola u rasponu je od 4% do 5% m/m.

[0052] Disperzija/rastvor niozoma sadrži količinu estara poliglicerola u rasponu od 40% do 90% m/m, poželjno u rasponu od 50% do 80% m/m.

[0053] Količina beta-glukana uključena u disperziju/rastvor niozoma u rasponu je od 1% do 5% m/m, poželjno od 1% do 3% m/m.

[0054] Količina glikola uključena u disperziju/rastvor niozoma u rasponu je od 0.1% do 5% m/m, poželjno od 0.5% do 3% m/m.

[0055] Dobijena disperzija/rastvor niozoma sadrži vodu u količini od 10% do 40% m/m, poželjno od 20% do 30% m/m.

[0056] Disperzija/rastvor niozoma može da sadrži druge komponente, kao što su na primer stabilizatori i konzervansi, do količine od 1% m/m.

[0057] Kompozicija za lokalnu primenu predmetnog pronalaska može biti tečna ili polučvrsta.

[0058] Posebno, kompozicija za lokalnu primenu predmetnog pronalaska je kozmetička kompozicija i/ili medicinski uređaj i/ili farmaceutski preparat, za primenu na kožu, epitelu i sluzokoži.

[0059] Kompozicija za lokalnu primenu predmetnog pronalaska povoljno sadrži tečne ili polučvrste kompozicije unutar kojih je kompozicija niozoma na vodenoj bazi dispergovana u količini od 0.5% do 10% po masi, poželjno od 1% do 5% po mase, u odnosu na ukupnu masu kompozicije za lokalnu primenu.

[0060] Tečne kompozicije predmetnog pronalaska uključuju rastvore, emulzije, mikroemulzije, losione, gelove, pene, mleka, micelarne vode, ulja, tenziolite ili suspenzije sa velikim varijacijama u viskoznosti.

[0061] Tečne kompozicije uključuju, na primer, vodene rastvore, hidro-alkoholne rastvore, uljne rastvore, emulzije dobijene disperzijom uljne faze u vodenoj fazi (ulje u vodi) ili, obrnuto, vodene faze u uljnoj fazi (voda-u-ulju), i suspenzije, dobijene disperzijom dispergovane faze, koja se sastoji od čvrstih čestica, u disperzionom medijumu generalno predstavljenom vodenom ili uljnom tečnošću određenog viskoziteta.

[0062] Polučvrste kompozicije predmetnog pronalaska uključuju kreme, gelove, balzame, masti, paste, krem-gel, štapiće i voskove.

[0063] Pored toga, kompozicije za lokalnu primenu predmetnog pronalaska mogu da sadrže različite lokalno prihvatljive aditive ili nosače koji su korisni u pripremi kozmetičkih proizvoda i/ili medicinskih uređaja i/ili farmaceutskih preparata poznatih stručnjacima u tehnici, kao što su, na primer, emulgatori, ovlaživači, rastvarači, emolijensi, stabilizatori, viskozifikatori, konzervansi, lubrikansi, agensi za sekvestriranje ili heliranje, punioci, puderi, mirisi, parfemi, apsorbenti, boje i sredstva za zamućenje, antioksidansi, vitamini, prirodni ekstrakti, polisahari, polisahari, zaštitne supstance, UV filteri, eterična ulja, keratin-aktivne supstance, i aminokiseline.

[0064] Pogodni aditivi rastvarači uključuju, na primer, vodu, alkohole, ketone (kao što su aceton i metil izobutil keton), glikole (kao što su etilen glikol, propilen glikol i butilen glikol), polietilen glikole (kao što su PEG-40, PEG-50, PEG-50, PEG-60), alkil acetate (kao što su amil acetat, izopropil acetat, butil acetat), parafine i izoparafine, cikloalkile (kao što je cikloheksan), glicerin, prirodna i sintetička ulja, prirodne i sintetičke trigliceride, eterična ulja.

[0065] Pogodno, kompozicije za lokalnu primenu predmetnog pronalaska su vodene kompozicije.

[0066] U vodenim kompozicijama, voda predstavlja glavnu komponentu kompozicije koja dostiže čak i količinu do 99% masenih u odnosu na masu cele kompozicije. Vodene kompozicije poželjno sadrže količinu vode u rasponu od 25% do 99%, poželjno u rasponu od 35% do 95%, a poželjnije u rasponu od 50% do 90% masenih u odnosu na masu cele kompozicije.

[0067] Vodene kompozicije predmetnog pronalaska mogu poželjno da sadrže ukupnu količinu nevodenih rastvarača u rasponu od rasponu oko 0.1% do oko 60%, poželjnije u rasponu od 1% do 40%, a još poželjnije u od 5% do 35% masenih u odnosu na masu cele kompozicije.

[0068] Primeri pogodnih aditiva za emulgovanje su nejonski, katjonski, anjonski i amfoterni surfaktanti, ili njihova kombinacija. Primeri korisnih emulgatora u predmetnom pronalasku su sorbitani, etoksilovani alkoholi dugog lanca, alkil poliglikozidi, sapuni, alkil sulfati, kao što su, na primer, natrijum cetilstearil sulfat, monoalkil i dialkil fosfati, alkil sulfonati, hidrogenizovano ricinusovo ulje, acil izotionati, estri saharoze, betaini, lecitini, kvaternarne amonijum soli, alkiloleati, gliceridi, kao što su, na primer, kaprilokaproil polioksilgliceridi i emulgatori iz maslinovog ulja.

[0069] Poželjno, kompozicija predmetnog pronalaska sadrži ukupnu količinu emulgatora u rasponu od oko 0.1% do oko 60%, poželjnije u rasponu od 0.5% do 25%, a još poželjnije u rasponu od 0.5% do 10% masenih u odnosu na masu cele kompozicije.

[0070] Tipični aditivi za viskozitet korisni u predmetnom pronalasku su, na primer, ksantanska guma, hidroksipropilceluloza, hidroksietilceluloza, karbopol, karagenani, polioksameri i guma akacija.

[0071] Povoljno, kompozicija predmetnog pronalaska sadrži ukupnu količinu viskozifikatora u rasponu od oko 0.1% do oko 25%, poželjnije u rasponu od 0.5% do 10%, a još poželjnije u rasponu od 0.5% do 5% masenih u odnosu na macu cele kompozicije.

[0072] Primeri aditiva sa hidratantnim dejstvom korisnih u predmetnom pronalasku su, na primer, urea, alantoin, hijaluronska kiselina i njihovi derivati, glicerin, aminokiseline, acetilmonoetanolamid, butoksipropanol, butil glikol, polietilen glikoli niske molekulske mase (kao što je PEG-40 PEG-50, PEG-60), aloja, slez, trehaloza i sorbitol.

[0073] Poželjno, kompozicija predmetnog pronalaska sadrži ukupnu količinu hidratantnih sredstava u rasponu od oko 0.05% do oko 25%, poželjnije u rasponu od 0.5% do 10%, a još poželjnije u rasponu od 0.1% do 5% masenih cele kompozicije.

[0074] Primeri pogodnih aditiva za omekšavanje korisnih u predmetnom pronalasku uklučuju, na primer, lanolin, bademovo ulje, maslinovo ulje, biljna ulja, jojobino ulje, arganovo ulje, hidrogenizovano ricinusovo ulje, prirodne lipofilne ekstrakte, mikrokristalni vosak, polidimetilsiloksan (dimetikon), polimetilfenilsiloksan, polimere glikola i silikona, mineralna ulja, parafin, ozokerit, cerezin, estre triglicerida, acetilovane monogliceride, etoksilovane gliceride, alkil estre masnih kiselina, masne kiseline, alkohole dugog lanca, sterole, pčelinji vosak, polihidrične alkohole, polihidrični alkoholi, poliestre, i amide masnih kiselina.

[0075] Poželjno, kompozicija predmetnog pronalaska sadrži ukupnu količinu emolijenata u rasponu od oko 0.1% do oko 25%, poželjnije u rasponu od 0.5% do 10%, a još poželjnije u rasponu od 0.5% do 5% pmasenih u odnosu na masu cele kompozicije.

[0076] Primeri korisnih mirisa u predmetnom pronalasku su, na primer, prirodna eterična ulja ili frakcije ili koncentrati eteričnih ulja, kao što su, na primer, ulje limuna, ulje bergamota, ulje lavande, limonen, linalol. Poželjno, kompozicija predmetnog pronalaska sadrži ukupnu količinu mirisa u rasponu od oko 0.001% do oko 0.1%.

[0077] Primeri pogodnih aditiva za konzerviranje korisnih u predmetnom pronalasku uključuju, na primer, alkohole, kao što su etanol, fenoksietanol i benzil alkohol, metil i propil parahidroksibenzoat, butilovani hidroksianizol (BHA), sorbate, derivate uree, i izotiazolinone, prirodne konzervanse, kao što su, na primer, askorbinska kiselina i derivati, tokoferol i derivati, polifenoli. Dalji primeri boja koje se mogu koristiti u kompoziciji za lokalnu primenu predmetnog pronalaska mogu se naći u Aneksu V Uredbe (EZ) br.1223/2009 od 30. novembra 2009.

[0078] Poželjno, kompozicija predmetnog pronalaska sadrži ukupnu količinu konzervansa u rasponu od oko 0.01% do oko 2.00%, poželjnije u rasponu od 0.05% do 1.00%, a još poželjnije u rasponu od 01% do 0.5% masenih u odnosu na masu cele kompozicije.

[0079] Primeri sekvestrant ili helatnih aditiva korisnih u predmetnom pronalasku su EDTA, HEDTA, alkil oksalati, litijum ili kalijum oksalat, natrijum ili kalijum pirofosfat. Poželjno, kompozicija predmetnog pronalaska sadrži ukupnu količinu sekvestrirajućih ili helatnih aditiva u rasponu od oko 0.01% do oko 20%, poželjnije u rasponu od 0.05% do 10%, a još poželjnije u rasponu od 0.1% do 5% masenih u odnosu na masu cele kompozicije.

[0080] Primeri pogodnih stabilizujućih aditiva korisnih u predmetnom pronalasku su alkoholi dugog lanca (kao što je cetil alkohol, stearil alkohol) i njihove smeše, polietilen glikoli visoke molekulske mase (kao što su PEG-9000 i PEG 14000) i polivinilpirolidoni (kao što je povidon).

[0081] Poželjno, kompozicija predmetnog pronalaska sadrži ukupnu količinu stabilizatora u rasponu od oko 0.1% do oko 25%, poželjnije u rasponu od 0.5% do 15%, a još poželjnije u rasponu od 1% do 10% masenih u odnosu na masu cele kompozicije.

[0082] Primeri pogodnih aditiva u prahu korisnih u predmetnom pronalasku su elastomerni silikoni kao što su umreženi polimeri dimetikon/vinildimetikon (DC 9506, Dow-Corning), smeše umreženih polimera ciklometikona i dimetikona (DC 9040, Dow Corning), umreženi polimeri dimetikona i vinil dimetikona tretirani silicijumom (DC 9701, Dow Corning), smeše umreženih polimera ciklometikona i dimetikon/vinildimetikona (SFE 839, GE Bayer Silicones).

[0083] Poželjno, kompozicija predmetnog pronalaska sadrži ukupnu količinu aditiva u prahu u rasponu od oko 0.1% do oko 5%, poželjnije u rasponu od 0.2% do 1%, masenih u odnosu na masu cele kompozicije.

[0084] Primeri agenasa za zamućenje korisnih u predmetnom pronalasku su cink ili aluminijum oksid, titanijum ili cink dioksid, glinica, liskun, soli masnih kiselina sa aluminijumom, i gips.

[0085] Primeri boja koje se poželjno koriste u predmetnom pronalasku su lako perive boje rastvorljive u vodi koje ne boje kožu i ne ostavljaju ostatke kao što su, na primer, Acid Blue 3 C.1.42051, Acid Blue 9 C.I.42090, Acid Blue 74 C.1.73015, Pigment Blue 15 C.1.74160, Acid Yellow 3 C.I.47005, Food Yellow 3 C.1.15985, Acid Yellow 23 C.I.19140, Acid Yellow 73 C.I.45350, Acid Red 14 C.1.14720, Acid Red 18 C.1.16255, Acid Red 27 C.1.16185, Acid Red 51 C.I.45430, Acid Green 1 C.1.10020, Acid Green 25 C. 1.61570, i smeše istih. Dalji primeri boja koje se mogu koristiti u kompoziciji za lokalnu primenu predmetnog pronalaska mogu se naći u Aneksu IV Uredbe (EZ) br.1223/2009 od 30. novembra 2009.

[0086] Poželjno, kompozicija predmetnog pronalaska sadrži ukupnu količinu agenasa za zamućenje i boja u rasponu od oko 0.01% do oko 15%, poželjnije u rasponu od 0.05% do 5% masenih u odnosu na masu cele kompozicije.

[0087] Poželjno, kompozicija predmetnog pronalaska može da sadrži UV filtere koji mogu da štite kožu od dejstva ultraljubičastog zračenja. Primeri UV filtera su, na primer, akrilati kao što su 2-etilheksil 2-cijano-3,3-difenilakrilat (PARSOL 340) i etil 2-cijano-3,3-difenilakrilat, derivati kamfora kao što je kamfor 4-metil benziliden (PARSOL 5000) i kamfor 3-benziliden, cinamati kao što je oktil metoksicinamat (PARSOL MCX), etoksietil metoksicinamat, dietanolamin metoksicinamat (PARSOL Hydro), derivati triazona kao što je etilheksil triazon (UVINUL T-150), dietilheksil butamido triazon (UVASORB HEB), derivati dibenzoilmetana kao što su 4-terc-butil4'-metoksidibenzoilmetan (PARSOL 1789), dimetoksidibenzoilmetan, derivati benzotriazola kao što je 2,2'-metilen-bis-(6-(2H-benzotriazol-4-(1)- 1,1,3,-tetrametilbutil)-fenol (TINOSORB M), derivati triazina kao što je bis-etilheksiloksifenol metoksifenil triazin (TINOSORB S). Mogu se naći i drugi primeri UV filtera koji se mogu koristiti u kompoziciji za lokalnu primenu predmetnog pronalaska u Aneksu VI Uredbe (EZ) br.1223/2009 od 30. novembra 2009.

[0088] Poželjno, kompozicija predmetnog pronalaska sadrži ukupnu količinu UV filtera u rasponu od oko 0.1% do oko 20%, poželjnije u rasponu od 0.5% do 15% masenih u odnosu na masu cele kompozicije.

[0089] Sledeći eksperimentalni deo ilustruje najmanje jedno tehničko rešenje pronalaska, ali ni na koji način ne ograničava obim zaštite kao što je definisano u zapatentnim htevima priloženim ovom opisu.

EKSPERIMENTALNI DEO

PRIMER 1 - Priprema niozoma

[0090] Disperzija niozoma (CBD-S5) koja sadrži kanabidiol (CBD) je pripremljena sa kompozicijom prikazanom u sledećoj tabeli 1. Dobijena kompozicija imala je izgled uniformnog bledo žutog viskoznog gela. Procenat mase u odnosu na masu cele kompozicije je izražen za svaku komponentu.

TABELA 1

PRIMER 2

[0091] Morfologija vezikula disperzije niozoma (CBD-S5) iz primera 1 je ispitana TEM transmisionom elektronskom mikroskopijom (JEM-1200EX, JEOL Co., Tokio, Japan) korišćenjem metode negativnog bojenja.

[0092] Mali alikvot (5.0 ml) disperzije CBD-S5 je centrifugiran na 4°C tokom 30 minuta brzinom koja je mogla da razvije približno 80000xg. Peleta je osušena i zatim razblažena sa 1% rastvorom uranil acetata. Kap suspenzije je direktno korišćena za punjenje ekrana elektronskog mikroskopa obloženog ugljenikom. Uzorak u višku je uklonjen apsorpcijom korišćenjem običnog filter papira. Ovako pripremljen ekran je inkubiran na 30°C tokom 10 minuta da se temeljno osuši i posmatran pomoću TEM na 80 kV. Mikrofotografija posmatranih vezikula je prikazana na slici 1. Numerisani vezikuli su imali prečnik kao što je prikazano u sledećoj tabeli 2.

TABELA 2

[0093] Ultrastrukturna analiza transmisijskom elektronskom mikroskopijom pokazala je prisustvo sferoidnih vezikularnih struktura prosečne veličine oko 200 nm.

[0094] Slika 2 prikazuje grafik dinamičkog rasejanja svetlosti (DLS) dobijen analizom istog uzorka CBD-S5 pomoću analizatora veličine čestica Brookhaven 90Plus. Merenje je potvrdilo prosečni prečnik od 190.4 nm sa indeksom polidisperznosti od 0.137.

PRIMER 3

[0095] Elastičnost je jedna od najvažnijih karakteristika niozoma. Elastičnost se procenjuje merenjem ekstruzije. Vezikule disperzije niozoma (CBD-S5) iz primera 1 su ekstrudirane kroz polikarbonatni filter sa prečnikom pora od 100 nm pod konstantnim pritiskom. Elastičnost je izražena indeksom deformabilnosti (D) izračunatim korišćenjem sledeće formule:

gde je J odnos suspenzije ekstrudirane za 5 minuta, rv je veličina vezikula nakon prolaska kroz filter kao što je izmereno pomoću DLS, a rp je prečnik pora filtera.

[0096] Dobra deformabilnost je demonstrirana kada je indeks deformabilnosti veći od 80. Test je sproveden sa Avestin LiposoFast instrumentom merenjem čestica pomoću analizatora veličine čestica Brookhaven 90Plus.

[0097] Rezultati su pokazali 5-minutni odnos ekstrudirane suspenzije (J) od 87% sa veličinom vezikula rv od 141 nm. Indeks deformabilnosti (D) je prema tome bio 172.96, potvrđujući odličnu deformabilnost niozoma, karakterističan pokazatelj odlične sposobnosti prodiranja kroz kožu, epitel i tvorevine kože. Karakteristike elastičnosti i deformabilnosti su od suštinskog značaja za interakciju sa površinskim slojevima kože i tvorevinama kože, promovišući apsorpciju i prodiranje ne samo kroz hemijske interakcije.

PRIMER 4

[0098] Vezikule disperzije niozoma (CBD-S5) iz primera 1 i 5% rastvor kanabidiola u MCT (CBD-5%) procenjeni su na njihovu sposobnost da difunduju kroz veštačku membranu, korišćenjem fosfatnog pufera sa dodatkom soli (PBS) kao negativne kontrole. Ulja triglicerida srednjeg lanca (MCT) korišćena za poređenje su među najpopularnijim sistemima solubilizacije kanabidiola čak i za lokalnu upotrebu.

[0099] Test je uključivao procenu difuzije kanabidiola sa Franz-ovim ćelijama kroz Strat-M<®>veštačku membranu (Sigma-Aldrich) korišćenu za testove transmembranske difuzije, koji simuliraju difuziju u ljudskom epidermisu različitih tipova jedinjenja i formulacija.

[0100] Veštačka Strat-M<®>membrana se sastoji od dva sloja polietar sulfona (PES, otporniji na difuziju) postavljena na površinu i sloja poliolefina (difuzniji). Ovi polimerni slojevi stvaraju poroznu strukturu sa difuzionim gradijentom. Pored toga, ova porozna struktura je impregnirana smešom sintetičkih lipida, dajući joj svojstva poput kože.

[0101] Difuziona ćelija se sastoji od donorske komore i receptorske komore između kojih je postavljena membrana. U receptorskoj komori nalazi se fosfatni pufer sa 5% goveđeg serumskog albumina (BSA) i magnet za adekvatno mešanje rastvora. Površina dostupna za nanošenje uzorka je 0.2 cm<2>.

[0102] Uzorci CBD-S5 i CBD-5% su naneti na membranu (1g/cm<2>) korišćenjem posebne Gilson P100 pipete sa pozitivnim pomeranjem za guste tečnosti. Negativna kontrola su bile membrane tretirane samo fosfatnim puferom sa dodatkom soli (PBS).

[0103] Uzorci i kontrole su inkubirani na 32°C, 5% CO2i izlaganje je izvršeno tokom 16, 24 i 48 sati. Uzorak je testiran u tri primerka. U različitim vremenima izlaganja, deo tečnosti receptora je povučen špricem. Tako dobijeni uzorci su odmah zamrznuti na -20°C i zatim odmrznuti za kvantitativnu hromatografsku analizu.

[0104] Alikvot količine difundovane ispod membrana u svakom trenutku evaluacije je razblažen rastvorom metanola zakiseljenim sa 0.3% fosforne kiseline (v/v). Subnatant je analiziran pomoću HPLC-DAD sa instrumentom WATERS 2695, uz sledeće analitičke uslove.

Talasna dužina : 212 nm

Ubrizgavanje : 10 µl

Kolona : Eclipse XDB-C18 3.5µm 3,0x150mm

Temperatura u koloni : 35°C

Brzina protoka : 0,6 ml/min

Mobilna faza A : 0.3% H3PO4u H2O milliQ

Mobilna gfaza B : 0,3% H3PO4u ACN

Gradijent: prema tabeli 3

TABELA 3

[0105] Rezultati su sumirani u tabeli 4 koja sledi.

TABELA 4

[0106] Rezultati iz tabele 4 su pokazali značajno povećanje difuzije kanabidiola u uzorku CBD-S5 predmetnog pronalaska u poređenju sa uzorkom CBD-5%.

[0107] Rezultati testa omogućavaju predviđanje povećane sposobnosti prodiranja i oslobađanja aktivnog sastojka u kožu.

PRIMER 5

[0108] Iritirajuća moć disperzije niozoma (CBD-S5) iz primera 1 procenjena je in vitro testom na rekonstituisanom epidermisu i in vivo testom na grupi od dvadeset ispitanika. Utvrđivanje da li su proizvodi za lokalnu primenu i kozmetički proizvodi iritanti važna je procena za uspostavljanje procedura za ispravnu i bezbednu primenu.

A. In vitro test

[0109] In vitro test se sastoji od lokalnog izlaganja ispitivane supstance na rekonstituisanom ljudskom epidermisu (RHE) nakon čega sledi test vitalnosti ćelija.

[0110] Vijabilnost ćelije je određena konverzijom MTT (3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolijum bromid) u plavu so formazana, koja se kvantitativno meri nakon ekstrakcije iz tkiva. Konverzija se dešava preko mitohondrijalnog enzima sukcinat dehidrogenaze, koji je aktivan samo u živim ćelijama, uzrokujući otvaranje MTT tetrazolnog prstena i formiranje formazana. Za predviđanje potencijala iritacije kože korišćena je procena vitalnosti tkiva izloženih ispitivanoj supstanci u poređenju sa negativnom kontrolom (tretiranom Dulbeccovim fosfatnim puferom sa dodatkom soli - DPBS) i pozitivnom kontrolom (tretiranom natrijum dodecil sulfatom - SDS).

[0111] Model rekonstruisanog ljudskog epidermisa sastoji se od normalnih epidermalnih keratinocita dobijenih od ljudi koji su kultivisani da bi se ponovo stvorio visoko diferenciran višeslojni ljudski epidermis. Sastoji se od bazalnog sloja, spinoznog i granularnog sloja i višeslojnog stratum corneuma koji sadrži međućelijske lamelarne lipidne slojeve raspoređene na način sličan onima prisutnim in vivo.

[0112] Rekonstruisani uzorak kože pokriva površinu od 0.63 cm<2>. Test se izvodi u tri primerka. Svaki uzorak je tretiran sa 25 µg CBD-S5. Paralelno, test pozitivne kontrole (PC) se izvodi nanošenjem 30 µL 5% rastvora SDS na uzorak kože a test negativne kontrole (NC) nanošenjem 30 µL DPBS-a na uzorak kože. Tretman traje 60 minuta, zatim se uzorci isperu da bi se uklonile ispitivane supstance i inkubiraju tokom 24 sata pre izvođenja MTT testa.

[0113] MTT test se izvodi prenosom uzoraka na ploče sa 24 bunarića koje sadrže rastvor MTT (1 mg/ml). Plava so formazana proizvedena u ćelijskim mitohondrijama ekstrahuje se sa 2.0 ml izopropanola po uzorku.

[0114] Optička gustina ekstrahovanog formazana je određena spektrofotometrijski na talasnoj dužini od 570 nm korišćenjem µQUANT BIO TEK spektrofotometra sa mikropločama. Relativna vitalnost ćelije se izračunava za svako tkivo kao % srednje optičke gustine tkiva negativne kontrole. Rezultati su sumirani u sledećoj tabeli 5 i na slici 3.

TABELA 5

[0115] Stoga je utvrđeno da disperzija niozoma (CBD-S5) iz primera 1 nije iritantna.

B. In vivo test

[0116] In vivo test se sastojao od primene disperzije niozoma (CBD-S5) iz primera 1 korišćenjem Finn Chambers-a (ćelije zapremine 20 mikrolitara) na leđa i/ili podlakticu odabranih ispitanika. Potencijal iritacije proizvoda je procenjen testiranjem u tri različita vremena. Potencijal trenutne iritacije kože je procenjen nanošenjem proizvoda tokom 60 minuta (T1). Potencijal iritacije kože je procenjen primenom proizvoda tokom 48 sati (T2) i 24 sata nakon uklanjanja proizvoda (T3). Procena je podeljena na četiri nivoa iritacije kao što je opisano u sledećoj tabeli 6.

TABELA 6

[0117] Tabela 7 koja sledi sumira rezultate dobijene na ispitanicima na kraju testa.

TABELA 7

[0118] In vivo test potvrdio je neiritabilnost disperzije niozoma (CBD-S5) iz primera 1.

PRIMER 6 - Test antimikrobne otpornosti (test izazova)

[0119] Test se sastoji od "izazivanja" preparata određenim inokulumom odgovarajućih mikroorganizama, ostavljajući inokulisani preparat na propisanoj temperaturi i povlačenja uzoraka iz kontejnera u određenim vremenskim intervalima i brojanjem broja organizama prisutnih u uzetim uzorcima.

[0120] Test je sproveden u skladu sa preporukama Italijanske farmakopeje - izdanje IX i ekvivalentne Evropska farmakopeja 5.1.3. i korišćenjem bakterijskih kultura sledećih sojeva mikroorganizam.

● Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027

● Escherichia coli ATCC 8739

● Staphylococcus aureus ATCC 6538

● Candida albicans ATCC 10231

● Aspergillus brasiliensis ATCC 16404

[0121] Disperzija niozoma (CBD-S5) iz primera 1 je inokulisana različitim mikroorganizmima sa inokulumom koji se sastoji od broja bakterija između 10<5>i 10<6>i broja gljiva ili kvasca između 10<4>i 10<5>. Inokulisani proizvod je čuvan na sobnoj temperaturi ( 20°-25°C) daleko od svetlosti. Uzorak proizvoda je uzet u vreme t0 (osnovnaa vrednost) i u intervalima od 2 (t2), 7 (t7), 14 (t14) i 28 (t28) dana, za određivanje broja prisutnih mikroorganizama.

[0122] Rezultati su sumirani u tabeli 8 koja sledi, gde su prikazane pronađene vrednosti, izražene na logaritamskoj osnovi, za svaki mikroorganizam u različitim vremenima posmatranja. Podaci izražavaju jedinice koje formiraju kolonije (cfu) u odnosu na 1 g proizvoda.

TABELA 8

Na osnovu dobijenih rezultata, disperzija niozoma (CBD-S5) iz primera 1 prošla je test izazova, pokazujući inhibitornu aktivnost u odnosu na sve mikroorganizme prema kriterijumima prihvatljivosti koji obezbeđuju smanjenje bakterija za 99.9% i plesni ili gljive za 90% inokulisanim u okviru 7 dana od inokulacije, i dalje smanjenje u narednom periodu (CTFA M-3 i M4, ISO 11930:2012, i Ph Eu 5.3.1).

PRIMER 7 - Ispitivanje stabilnosti ubrzanim starenjem

[0123] Disperzija nizozoma (CBD-S5) primera je 1 je podvrgnut nizu testova stabilnosti i ubrzanog starenja pod različitim uslovima:

(A) Sobna temperatura (25°C) uz izlaganje svetlosti 90 dana

(B) Temperatura od 40°C tokom 90 dana

(C) Temperatura od 4°C tokom 90 danana

(D) Toplotni šok: 15 dana na 4°C i 15 dana na 40°C (3 ciklusa)

[0124] Parametri od interesa (izgled, boja, pH, gustina) praćeni su svake dve nedelje u ukupnom periodu od 90 dana.

[0125] Rezultati su sumirani u tabeli 9 koja sledi.

TABELA 9

[0126] Nakon 90 dana ubrzanog starenja u različitim uslovima stresa, parametri proizvoda se nisu značajno promenili, a posebno gustina kao indeks stabilnosti niozomalnog vezikula, sa izuzetkom boje koja je prešla iz žute u crvenu. Ova promena je zbog poznate nestabilnosti kanabidiola na toplotu i svetlost. Uslovi skladištenja niozomalnog preparata obuhvataju pakovanje koje je nepropusno za svetlost i vazduh i čuva se na sobnoj temperaturi.

PRIMER 8 - Otpornost na čestice i test vitalnosti ćelija

[0127] Test uključuje tretiranje tkiva rekonstituisanog ljudskog epidermisa (RHE), bez obzira da li je zaštićeno disperzijom niozoma (CBD-S5) iz primera 1, sa uzorkom čestica sa aerodinamičkim prečnikom manjim od 2.5 µm (PM2.5) odabranim da bude predstavnik ambijentalnog zagađenja česticama. Paralelno, tkivo rekonstituisanog ljudskog epidermisa je tretirano Dulbeccovim puferovanim fosfatom sa dodatkom soli (DPBS - negativna kontrola NC), natrijum dodecil sulfatom (SDS - pozitivna kontrola PC), i samo disperzijom niozoma (CBD-S5) iz primera 1.

[0128] Konkretno, bunarići koji sadrže RHE (EpiDerm<™>EPI-200, MakTek Corporation) u sopstvenom medijumu za kulturu (EpiDerm<™>EPI-100-NMM, MakTek Corporation) tretirani sa (1) 30µl DPBS (NC), (2) 30µl SDS 5% (PC), (3) 20µg PM2.5 rastvorenog u 30µl PBS, (4) 30µl CBD-S5, i (5) 30µl CBD-S5 sa 20µg PM2.5 postavljeni su u tri primerka.

[0129] Nakon inkubacije na 37°C tokom 24 h u kontrolissanoj atmosferi 5% CO2, procenjena je vijabilnosz ćelija uzorka RHE pomoću MTT testa, kao što je opisano u primeru 5A, dok je medijum za kulturu sakupljen i analiziran na oslobađanje IL-1α pomoću ELISA testa, korišćenjem kompleta EMIL1ALPHA kit (Invitrogen-Thermo Scientific) sa sledećom proceduro.

[0130] 100 µl medijuma iz svakog tretmana je prebačeno u bunariće obložene sa anti-humanim IL-1α i inkubirano 2 sata na sobnoj temperaturi. Na kraju inkubacije, medijum je uklonjen i bunarići su isprani 4 puta sa 1X puferom za ispiranje. 100µl biotinilovanog antitela je dodato u svaki bunarić i inkubiran je 1 sat na sobnoj temperaturi. Na kraju, bunarići su isprani 4 puta sa 1X puferom za ispiranje, tretirani sa 100 µl rastvora Streptavidin-HRP tokom 45 minuta na sobnoj temperaturi i na kraju isprani 4 puta sa 1X puferom za ispiranje.100 µl TMB supstrata je dodato u svaki bunarić i inkubiran je 10 minuta u mraku. Konačno, 100 µl stop rastvora je dodato u svaki bunarić i spektrofotometrijska očitavanja su uzeta na talasnim dužinama od 450nm i 550nm korišćenjem spektrofotometarskog instrumenta sa mikropločama µQUANT BIO TEK.

[0131] Promene u nivoima IL-1α oslodoženim iz tkiva RHE nakon svakog tretmana su izražena kao % vrednosti u poređenju sa netretiranim RHE (NC) korišćenim kao kontrola (100%).

[0132] Tabela 10 koja sledi sumira rezultate testova, kao što je rikazano na slikama 4 i 5.

TABELA 5

[0133] In vitro MTT test je pokazao da je PM2.5 smanjio vitalnost ćelija na 28.51%, dok je zajednički tretman sa CBD-S5 zaštitio rekonstituisani ljudski epidermis (RHE) od toksičnog efekta PM2.5. Podaci su pokazali da je CBD-S5 bio u stanju da poveća vitalnost ćelija sa 28.5% na 71.25%. Istovremeno, rezultati testa samo za CBD-S5 iznenađujuće su pokazali povećanje vitalnosti ćelija u odnosu na kontrolu na 110.86%, što ukazuje na iznenađujuću regenerativnu aktivnost. Veruje se da ovo povećanje može biti posledica revitalizirajućeg dejstva izazvanog prisustvom polisaharida beta-glukana.

[0134] ELISA test je pokazao da (i) PM2.5 u koncentraciji od 20 pg/bunariću izaziva povećanje oslobađanja IL-1α, i (ii) tretman sa CBD-S5 je bio u stanju da smanji oslobađanje IL-1α u netretiranom i tretiranom tkivu sa 20 pg/bunariću PM2.5. Opet, uočeno je iznenađujuće smanjenje oslobađanja IL-1α u uzorku tretiranom samo sa CBD-S5, što ukazuje na značajnu antiinflamatornu aktivnost.

PRIMER 9 - In vitro procena umirujuće efikasnosti

[0135] Test je kvantitativno procenio efekte uzorka u zaštiti ćelija kože i u inhibiciji umirujuće reakcije izazvane umerenim iritantnim agensima kao što je natrijum lauril sulfat (SLS) pomoću višeslojnog in vitro modela ćelija kože.

[0136] Inhibicija oslobađanja IL-1α citokina izazvanog SLS-om je ispitivana (putem specifičnog ELISA testa) nakon izlaganja ispitivanoj supstanci i u odnosu na netretirane uzorake kože. Vijabilnost ćelija je određena MTT testom.

[0137] Oba testa su koristila rekonstruisani model veštačke ljudske kože koji se sastoji od normalnih ljudskih epidermalnih keratinocita, koji rastu kao integrisani trodimenzionalni model ćelijske kulture, savršeno oponašajući ljudsku kožu in vitro. Model pokazuje normalne funkcije barijere (prisustvo dobro diferenciranog stratum corneuma). Model je obezbeđen od Episkin (Lion, serija 20-RHE-041).

[0138] Epidermis je tretiran tokom 70 minuta sa SLS pri 0.30% kako bi se indukovala sinteza i oslobađanje IL-1α. Kasnije je 40 µl disperzije niozoma (CBD-S5) iz primera 1 (razblaženo pri 2% u sterilnoj vodi) naneto na dva epidermisa i izlaganje je sprovedeno 24 sata na 37°C, 5% CO2. Kao negativna kontrola, dve jedinice epidermisa su tretirane fosfatnim puferom, dok su jedinice epidermisa tretirane 70 minuta sa SLS 0.30% korišćene kao pozitivna kontrola. Test je izveden u dve ponavljanja.

[0139] Na kraju perioda izlaganja, uzorak je uklonjen ispiranjem fosfatnim puferom (PBS) i MTT test je izveden da bi se procenilo preživljavanje ćelija.

[0140] Jedinice epidermisa su tretirane sa 1 mg/ml MTT rastvora (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazolijum bromid) tokom 3 h na 37°C. Rastvor je zatim uklonjen i zamenjen izopropanolom, uz dodatna 2 h inkubacije na sobnoj temperaturi. Dva alikvota svakog uzorka su prebačena na ploču sa 96 bunarića za očitavanje. Absorbanca (OD) je očitana na talasnoj dužini od 570 nm kolorimetrom (Tecan model Infinite F200) opremljenim čitačem mikroploča.

[0141] Rezultati su izraženi u vidu procenta vitalnosti ćelija i % relativne zaštite dobijenih sledećim formulama:

[0142] Rezultati su sumirani u tebeli 6 koja sledi.

TABELA 6

[0143] Za IL-1α test, medijum za kulturu je sakupljen 6 i 24 sata. Kao negativna kontrola, korišćen je medijum za kulturu jedinica tretiranih sa PBS; dok je medijum za kulturu od 2 jedinice tretiran sa SLS 0.30% korišćen kao pozitivna kontrola. IL-1α je određen u medijumu za kulturu tretiranog i netretiranog epidermisa, korišćenjem direktnog ELISA testa (enzimski-povezan imunosorbentni test). Kolorimetrijski signal je bio direktno proporcionalan količini citokina u medijumu za kulturu. Uzorci su očitani na 450 nm. Granica osetljivosti bila je manja od 10 pg/ml.

[0144] Koncentracija citokina je određena korišćenjem standardne krive. Rezultati su izraženi u smislu procenta inhibicije oslobađanja IL-1α dobijenog sledećom formulom:

[0145] Rezultati su sumirani u tebeli 7 koja sledi.

TABELA 7

[0146] Podaci sumirani u tabelama 6 i 7 pokazuju da je CBD-S5 bio u stanju da zaštiti ćelije kože i inhibira oslobađanje IL-1α, pokazujući tako in vitro umirujuću aktivnost.

PRIMER 10 – Mitogeneza u ćelijama bulbusa dlake

[0147] Svrha ovog testa je bila da se kvantitativno procene efekti CBD-S5 na stimulaciju ćelijskog ciklusa i na ukupnu sintezu proteina u fibroblastima dermalne papile ljudske dlake putem testa vitalnosti ćelija (MTT) nakon gladovanja i ukupne ekstrakcije proteina i kvantifikaciju u različitim vremenima izlaganja pri subtoksičnim i serijskim dozama. Kada je kompozicija u stanju da poveća ćelijsku proliferaciju i sintezu proteina, to će sugerisati njegovu ulogu u stimulisanju rasta folikula i ranoj fazi anageneze.

[0148] Test se izvodi na ćelijama dermalne papile ljudske dlake (HHDPC) sa morfologijom sličnom fibroblastu. Ćelije su kultivisane u MEM koji sadrži 10% FBS i antibiotike.

[0149] Ćelije su zasejane u ploče sa 24 bunarića i ostavljene da rastu tokom 24 h na 37°C i 5% CO2. Ćelije su bile podvrgnute gladovanju u medijumu bez seruma 6 sati pre tretmana. Zatim je ćelijama dodat svež medijum bez seruma i dopunjen serijskim razblaženjima disperzije niozoma (CBD-S5) iz primera 1 (0.006 i 0.003 mg/ml). Disperzija niozoma je rastvorena direktno u medijumu za kulturu. Test je izveden u tri ponavljanja.

[0150] Nakon 24- i 48-časovnog izlaganja, vitalnost ćelija i ukupan sadržaj ćelijskih proteina su procenjeni na odvojenim pločama. Netretirane ćelije su korišćene kao negativne kontrole (NC); ćelije tretirane ljudskim insulinom korišćene su kao pozitivna kontrola (PC).

[0151] Vijabilnost ćelija je procenjena inkubacijom tkiva tokom 2 sata sa rastvorom MTT (3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil tetrazolijum bromid). Istaloženi formazan je zatim ekstrahovan korišćenjem DMSO i kvantifikovan spektrofotometrijski. Apsorbancija na 570 nm (OD570) je merena čitačem mikroploča (Tecan, Infinite 200 PRO), oduzimajući pozadinska očitavanja na 650 nm (OD650).

[0152] Vijabilnost ćelija je izražena u procentima prema sledećoj formuli:

[0153] Rezultati su sumirani u tabeli 8 koja sledi.

TABELA 8

[0154] Ukupan sadržaj ćelijskih proteina je testiran prema Bradford metodi. Ćelije na kraju tretmana su dva puta isprane sa PBS i lizirane tretmanom sa prečišćenom vodom na 4°C. U svaki uzorak je dodat reagens za boju. Standardna kriva sa titrovanjem je postavljena sa opsegom koncentracije od 2 do 12 µg/ml.200 µl svakog uzorka, kontrola i standarda je prebačeno na ploču sa 96 bunarića. Očitavanje je obavljeno na 595 nm kolorimetrom opremljenim čitačem ploča.

[0155] Da bi se kvantifikovali proteini, dizajniran je standardni grafikon sa albuminom i koncentracije uzorka su određene na osnovu vrednosti njihove apsorpcije korišćenjem formule interpolacionog grafikona. Izračunate su srednje vrednosti svakog skupa podataka, a za svaki uzorak je određen procenat povećanja sinteze proteina poređenjem sa negativnom kontrolom (NC) prema sledećoj formuli:

[0156] Rezultati su sumirani u tabeli 9 koja sledi.

TABELA 9

[0157] Podaci sumirani u tabelama 8 i 9 pokazali su da je CBD-S5 bio u stanju da stimuliše proliferaciju ćelija i sintezu proteina u fibroblastima dermalne papile ljudske dlake u poređenju sa netretiranim kontrolnim ćelijskim kulturama (negativna kontrola) pri koncentraciji od 0.003 mg/ml nakon 48 sati perioda izlaganja.

PRIMER 11 - Aktivnost protiv svraba

[0158] In vivo, degranulacija bazofilnih ćelija posredovana IgE izaziva trenutnu alergijsku reakciju okarakterisanu brzim oslobađanjem prethodno uskladištenih inflamatornih medijatora (histamin, leukotrieni, tromboksan, bazofilni enzimi, heksosaminidaze), izazivajući crvenilo, osip, svrab i lokalnu inflamatornu reakciju. Sposobnost kompozicije da inhibira degranulaciju bazofilnih ćelija je pokazatelj njene sposobnosti da inhibira gore opisane simptome a nad njima uglavnom svrab.

[0159] Test je izveden na ćelijskoj liniji transfektovanih bazofilnih ćelija pacova (RBL-2H3 ATCC<®>CRL-2256<™>) koje eksprimiraju IgE humani receptor (FcRI). Ćelije su držane u RPMI koji sadrži 10% FCS i 2 mM glutamina.

[0160] Netretirane ćelije su korišćene kao negativna kontrola za spontanu degranulaciju.

[0161] Za procenu maksimalnog nivoa degranulacije korišćena je pozitivna kontrola koja se sastoji od ćelija izloženih anti-humanim IgE receptorskim antitelima.

[0162] Takođe su analizirani ćelijski lizati u 1% tritona da bi se procenilo najveće moguće oslobađanje analiziranih molekula.

[0163] Da bi se procenio efekat disperzije niozoma (CBD-S5) iz primera 1 na degranulaciju bazofila, uzorak je prethodno inkubiran sa ćelijskom linijom transfektovanih bazofilnih ćelija pacova (RBL) koje eksprimiraju IgE humani receptor (FcRI).

[0164] Oslobađanje β-heksosaminidaze tokom degranulacije je praćeno na RBL-SX38 ćelijskom supernatantu sa dodatkom p-nitrofenil-N-acetil-β-D-glukozamina (Sigma-Aldrich) u 0.1 M citratnom puferu (pH 6.2) i inkubiranom na 37°C tokom 120 min. Reakcija je prekinuta korišćenjem 0.1 M karbonatnog pufera (pH 10), a apsorbanca je očitana na 405 nm (OD405).

[0165] Supernatant netretiranih ćelija je korišćen kao negativna kontrola. Maksimalna stimulacija RBL-SX38 je procenjena na 1% triton X-100 lizatu ćelijskog monosloja.

[0166] Optička gustina negativne i pozitivne kontrole i triton X-100 lizata je prikazana u tabeli 10 koja sledi.

TABELA 10

[0167] Disperzija niozoma (CBD-S5) iz primera 1 je rastvorena u medijumu za ćelijsku kulturu u različitim koncentracijama, kao što je naznačeno u tabeli 11 koja sledi.

[0168] Natrijum hijaluronat u serijskim razblaženjima, kao što je naznačeno u tabeli 11 koja sledi, takođe je korišćen kao kontrola inhibicije degranulacije bazofila.

[0169] Merena optička gustina na 405 nm (OD405) prijavljena je u tabeli 11 koja sledi.

TABELA 11

[0170] Procenat inhibicije degranulacije aktiviranog bazofila sa IgE receptorom je izračunat sa sledećom formulom:

[0171] Rezuiltati su ilustrovani u tabeli 12 koja sledi.

TABELA 12

[0172] Disperzija niozoma (CBD-S5) je bila u stanju da inhibira degranulaciju bazofila na dozno zavisan način. Najveći efekat je istaknut kod najviših testiranih koncentracija. Interferencija na spontanu degranulaciju nije bila uočljiva.

[0173] Gore navedeni rezultati su pokazali da disperzija niozoma (CBD-S5) ima aktivnost protiv svraba.

Claims (13)

Patentni zahtevi

1. Kompozicija za lokalnu primenu koja sadrži kompoziciju na vodenoj bazi koja sadrži kanabinoide u niozomima veličine manje od 500 nm i najmanje jedan lokalno prihvatljiv ekscipijens naznačena time da navedeni niozomi sadrže (i) najmanje jedan linearni ili razgranati poliglicerol esterifikovan linearnim zasićenim ili mononezasićenim masnim kiselinama, i (ii) najmanje jedan polisaharid izabran iz grupe koja se sastoji od pululana, glukana, alginata, amiloze, glikogena i inulina.

2. Kompozicija za lokalnu primenu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu su navedeni kanabinoidi prirodnog ili sintetičkog porekla.

3. Kompozicija za lokalnu primenu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu su navedeni kanabinoidi odabrani iz grupe koja se sastoji od kanabidiola, kanabigerola i kanabinola.

4. Kompozicija za lokalnu primenu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je navedeni polisaharid odabran iz grupe koja se sastoji od alfa-glukana i beta-glukana, poželjno beta-glukana.

5. Kompozicija za lokalnu primenu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu je navedeni linearni ili razgranati poliglicerol odabran iz grupe koja se sastoji od triglicerola, tetraglicerola, heksaglicerola, oktaglicerola, dekaglicerola.

6. Kompozicija za lokalnu primenu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu su navedene linearne zasićene ili mononezasićene masne kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od monokarboksilnih kiselina koje imaju od 4 do 32 atoma ugljenika.

7. Kompozicija za lokalnu primenu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu su navedene linearne zasićene masne kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od buterne kiseline, valerinske kiseline, kapronske kiseline, enantinske kiseline, kaprilne kiseline, pelargonske kiseline, kaprinske kiseline, laurinske kiseline, miristinske kiseline, palmitinske kiseline, margarinske kiseline, stearinske kiseline, arahidne kiseline, behenske kiseline, lignocerinske kiseline, cerotične kiseline, montanske kiseline, melisinske kiseline i lakceroinske kiseline.

8. Kompozicija za lokalnu primenu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu su navedene linearne mononezasićene masne kiseline odabrane iz grupe koja se sastoji od miristoleinske kiseline, palmitoleinske kiseline, oleinske kiseline, gadoleinske kiseline i erukinske kiseline.

9. Kompozicija za lokalnu primenu prema patentnom zahtevu 1, pri čemu navedeni niozomi sadrže (iii) najmanje jedan glikol koji ima od 4 do 16 atoma ugljenika.

10. Kompozicija za lokalnu primenu prema patentnom zahtevu 9, pri čemu je navedeni glikol koji ima od 4 do 16 atoma ugljenika odabran iz grupe koja se sastoji od 1,2-butandiola, 1,2-pentandiola, 1,2-heksandiola, 1,2-heptandiola, 1,2-oktandiola (kaprilil glikola), 1,2-dekandiola (kapril glikola), 1,2-dodekandiola (lauril glikola), i 1,2-heksadekandiola.

11. Kompozicija na bazi vode koja sadrži kanabidiol inkorporisan u niozome, naznačena time da navedeni niozomi sadrže (i) najmanje jedan linearni ili razgranati poliglicerol esterifikovan linearnim zasićenim ili mononezasićenim masnim kiselinama, i (ii) najmanje jedan polisaharid izabran iz grupe koja se sastoji od pululana, glukana, alginata, amiloze, glikogena i inulina, i opciono, (iii) najmanje jedan glikol koji ima od 4 do 16 atoma ugljenika.

12. Kompozicija prema patentnom zahtevu 11, pri čemu je pomenuta kompozicija vodeni rastvor ili disperzija.

13. Postupak za proizvodnju kompozicije na bazi vode kako je definisana u patentnom zahtevu 11 ili 12, koji obuhvata primenu tehnika ručnog mućkanja ili tehnika ultrazvučnog mućkanja.