PT98514A - Elemento de analise e processo para a sua producao - Google Patents

Description

Descrição da patente de invenção de BOEHRIHGER MAOT-HEIM GMBH, alemã, industria, e comercial, com sede em 6800 Mannheim 31, República Federal Alemã, (inventores: Rolf Deeg, Eberhard Maurer, Sigmar Klose, Bernbard Kopfer e Reiner Babiel, residentes na República Federal Alemã, para "ΕΠΕΜΕΙΤ0 DE ANALISE E PROCESSO PARA A SUA PRODUÇÃO”

Descrição A presente invenção refere-se a um elemento de análise para a determinação de um produto a analisar numa amostra líquida caracterizado por possuir uma camada de suporte que contém, num domínio de reagentes, um reagente aplicado num padrão definido por um processo de jacto de tinta. São frequentes as observaçães analíticas em amostras líquidas, especialmente em fluídos biológicos como sejam sangue e urina, efectuadas com o auxílio de elementos de análise que são também designados por elementos de análise sólidos. Estes elementos podem existir sob várias formas, especialmente sob a forma de tiras de ensaio longas e de pequenas placas quadrangulares. Em - 1 - τ

qualquer caso possuem ;unp ou mais camadas de ensaio que contém os reagentes necessários para a ana£]ise. As camadas de ensaio são feitas contactar com a amostra líquida e a reacção do produto analisar com os reagentes produz um sinal detectavel que pode ser medido por meios físicos, especialmente uma mudança de cor que pode ser medida visual ou fotometricamente. São exemplos de outros sinais detec-táveis conhecidos a fluorescência éptiea, a luminescência e, no caso de elementos de análise electroquimica, sinais de potencial e de corrente eléctrica.

Recentemente tem sido dada particular importância a elementos de análise que funcionam com "base numa reacção específica de ligação entre dois parceiras de reacção biorreactivos. leste sentido, as reacçães especificas de ligação são especialmente interacçães imunoldgi-cas, isto é, interacçães entre antigénios ou heptenos por um lado e anticorpos pelo outro. Io entanto, é também possível usar outras interacções biorreactivas específicas, como por exemplo uma interacção lectina-açdcar, uma inter-acção entre uma substância activa e um receptor, a ligação específica entre a biotina e a estreptavidina ou certos tipos de reacção de ligação enzima-substracto, por exemplo inibidores ou substratos suicidas.

Os reagentes são geralmente incorporados em camadas de ensaio, sendo o Gaso normal o de uma matriz de suporte porosa (por exemplo feita de papel ou de plástico) impregnada com um reagente ou o de um processo em várias camadas em que se produz uma película de um reagente que contém os reagentes dissolvidos ou dispersos num reagente de formação de pelíoula. Gomo regra, na produção de elementos de análise, ê necessário acomodar diferentes agentes mutuamente incompatíveis separados por um intervalo. lormalmente atinge-se este objectivo reunindo em conjunto (por exemplo por soldadura ou por ligação adesiva) elementos de suporte de reagentes preparados indi- 2

vidualmente. Este processo é muito caro, causa frequentes defeitos de produção e apenas permite uma miniaturizaçao limitada.

Foi proposto recentemente a utilização da tecnologia de jacto de tinta originalmente desenvolvida para as impressoras de computador (impressoras de jacto de tinta) na produção de elementos de análise.

Weste contexto, podem referir-se as publicações de pedidos de Patente EP-A-119573 e EP-A-268237 (US 4 877 745). As memórias descritivas destes dois pedidos de Patentes contêm explanações mais pormenorizadas do estado da técnica anteriormente conhecido, incluindo em especial a tecnologia do jacto de tinta, que se dão como transcritas na presente memória descritiva. A característica que distingue a técnica do jacto de tinta reside no facto de que se aplicam quantidades discretas muito pequenas (quantidades parciais) de um líquido sob a forma de gotículas a uma camada de suporte com uma precisão elevada, precisão esta relacionada tanto com o posicionamento exacto da rodela produzida pela gota do reagente no domínio dos reagentes como com o volume do reagente. As gotas podem ser ejectadas sucessivamente a alta frequência.

Os padrões de reagentes produzidos por um processo de jacto de tinta diferem sem qualquer ambiguidade dos padrões que é possível obter por outras técnicas de impressão, Em particular não é possível obter rodelas de reagentes tão finas por quaisquer outra técnica com uniformidade semelhante.

Uma variante especial da técnica do jacto de tinta que é também particularmente apropriado para a presente invenção é a técnica da "gota a pedido", segundo a qual é possível produzir gotas separadas do lí- -w3 - 1

quido em qualquer ponto que se pretenda num dado momento e aplicá-lo a uma camada de suporte. Até agora apenas a técnica descrita nas memérias descritivas das Patentes mencionadas foi utilizada em relação com a quantificação de líquidos biológicos analíticos, em especial de reagentes, sendo neste caso o volume de uma câmara de geração de jactos comprimido cada vez que se pretende ejectar uma gota. Para este fim usa-se em particular uma alteração piezoeléctrica do volume da câmara de jactos. No Pedido de Patente Alemã "Verfahren und ?orrichtung zum dosierten Zufuhren einer biochemischen Analyseflussigkeit auf ein Target” ("Processo e dispositivo para a aplicação quantificada de um líquido analítico bioquímico a um alvo") Referência do Agente de Patentes BM 3240/00/DE), depositado simultaneamente, descreve-se a utilização de uma tecnologia de jacto formado por bolha para a aplicação de reagen tes líquidos a um domínio de reagentes que é também adequado para a presente invenção. 0 referido pedido de Patente é dado como reproduzido na presente memória descritiva. A expressão "jacto de tinta" deve ser compreendido na presente memória descritiva como abrangendo os dois procedimentos. A técnica do jacto de tinta torna possível a aplicação de reagentes a um domínio de reagentes de um elemento de análise com elevada precisão e uniformidade sob a forma de uma camada de reagente de e spes-sura excepcionalmente reduzido. Os Pedidos de Patente referidos mencionam igualmente a possibilidade de se aplicar o reagente a uma camada de suporte segundo um padrão determinado, por exemplo a fim de permitir uma comparação directa entre um subdomínio revestido com reagentes e um subdomínio sem reagente, ou a fim de tornar o resultado da análise mais nítido, em virtude de a formação de cor aparecer por exemplo sob a forma de um sinal mais ou menos. - 4 -

As Patentes DE-A-27 27 347 e DE--0-27 29 233 descreveram um arranjo alternativo de gotas (era especial rodelas circulares) de diferentes reagentes que são aplicados por meio de uma técnica de impressão por redg de sede (serigrafia). lo entanto este processo é muito caro. Para além disso, as quantidades de reagente aplicado não podem ser quantificadas com precisão, As rodelas são relativamente grandes e sd podem ser miniatu-rizadas até cerfco limite. Muitos reagentes não podem ser processados para formarem massas adequadas à impressão de modo que este processo, que já é conhecido h.á muito tempo, não atingiu qualquer significado prático.

De acordo com a presente invenção, um elemento de análise do tipo indicado no início é carac-terizado por o padrão aplicado no domínio dos reagentes compreender vários conjuntos de eomparticmentos, tendo os compartimentos do mesmo conjunto a mesma composição química, tendo os compartimentos de conjuntos diferentes reagentes diferentes e estando os compartimentos de conjuntos diferentes dispostos em alternância de modo que os compartimentos que contém reagentes diferentes estão em posição adjacente mas separados entre si por um intervalo. A distân cia média entre os limites exteriores dos compartimentos de conjuntos diferente é normalmente inferior a 1 mm e de preferência inferior a 0,5 mm. A comMnação das medidas de acordo com a presente invenção é em seguida também designada por "micro-oompartimentalização". 0 termo "compartimento" refere-se a um suMomínio delimitado. Um compartimento pode ser cons-tit.uido por uma rodela ou por várias rodelas mutuamente sobrepostas em parte, Os compartimentos que contém reagentes diferentes (e que portanto pertencem a conjuntos diferentes de compartimentos no domínio dos reagentes) estão pelo menos em alguns casos separados entre si por um intervalo e estão dispostos em posiçães adjacentes uns - 5 - em relação aos outros (se bem que não necessariamente no mesmo plano) no domínio dos reagentes, estando os compartimentos que contém reagentes diferentes em posição alternadas, isto é, os compartimentos de conjuntos diferentes são adjacentes alternadamente. Por razães práticas, é conveniente ter uma alternância regular quando, por exemplo, os compartimentos de três conjuntos A, 33 e 0 estão presentes num padrão que se repete ciclicamente A, B, C, A, B, 0, A, B, etc., Em casos excepcionais, no entanto, pode ser também conveniente ter um padrão alternado sem repetição cíclica.

Os compartimentos podem também estar dispostos uns por cima dos outros em alguns casos. A separação por meio de um intèrvalo dos compartimentos na direcção perpendicular da sua dimensão planar (compar-timentação vertical) e possível neste caso se se aplicar uma camada de i solamento intermediário de uma substância isolante solúvel (por exemplo uma proteina inerte ou uma substância que tome a forma de uma película).

Ho processo de acordo com a presente invenção, o volume de uma quantidade discreta de reagente líquido ejectado por uma cabeça de jacto de tinta situa-se normalmente entre 20 e 2000 picolitros e de prefrên cia entre 100 e 800 picolitros, A área de rodela produzida por esta quantidade na camada de suporte depende em alto grau das propriedades do reagente líquido e da camada p de suporte. Situa-se aproximada menteentre 500 um e 0,2 2 2 2 mm e de preferência entre 3000 um e 0,1 mm . As quantidades de reagente líquido são normalmente ejectadas a uma frequência de mais de 1000 S1 e de preferência entre 2000 e 20 000 S1.

Em função do procedimento de análise para o qual se pretenda usar o elemento de análise de acordo com a presente invenção, os compartimentos podem 6

conter reagentes que podem ser eluidos e reagentes que se encontram ligados firmemente à fase sólida na camada de suporte, sendo possível que o domínio dos reagentes contenha exclusivamente compartimentos com reagentes que podem ser eluidos ("compartimentos eluíveis"), exclusivamente compartimentos com reagentes ligados à fase sólida, ("compartimentos fjx;os ou uma mistura de compartimentos eluíveis e fixos, sendo obtidas entre outras as seguintes vantagens de acordo com a presente invenção.

Os reagentes nos compartimentos eluíveis são rapidamente dissolvidos pela amostra líquida misturando-se entre si. Por adição ao reagente líquido de constituintes que modificam a solubilidade é possível modificar as propriedades de solubilidade dos reagentes individuais nos compartimentos de conjuntos diferentes a fim de permitir uma determinada sequência de reacção. # também possível influenciar as propriedades de dissolução de modo a permitir uma adaptação flexível à sequência de reacção em questão variando a espessura da camada de compartimentos diferentes. São exemplos de reagentes que podem ser usados predominantemente sob forma eluível as enzimas, os substractos, as coenzimas e os componentes indicadores, especialmente reagentes corados.

Os reagentes ligados à fase sólida podem ser ligados por adsorção ou por uma ligação co^alente, lo caso de ligação por adsorção, é vantajoso se (em contraste com a técnica da serigrafia) se puderem usar soluçóes de revestimento aquosas que não contenham qualquer aditivo hidrofóbico que interfira com a ligação por adsorção. Os reagentes que se destinam a ser ligados à fase fixa na camada de suporte podem ser posicionados com precisão, sendo possível em especial determinar as distâncias de difusão a outros reagentes (ligados à fase fixa ou eluíveis) noutros conjuntos de compartimento de acordo com as necessidades de cada caso individual. - 7 -

Em geral, a presente invenção permite distâncias de difusão muito curtas entre os reagentes contidos em conjuntos de compartimentos diferentes e por conseguinte permite tempos de reacção relativamente curtos e uma mistura completa dos reagentes sem outras medidas especiais.

Io âmbito da presente invenção foi estabelecido que a microoompartimentalização tornada possível pela tecnologia do jacto de tinta sbre o caminho a procedimentos de análise completamente novos,

Conforme já se referiu, a presente invenção é de especial significado para métodos homogéneos e heterogéneos de determinação baseados na capacidade de ligação específica de dois parceiros de ligação biorreac-tivos. leste caso, pelo menos um conjunto de compartimentos contém um primeiro parceiro de ligação com capacidade para a ligação de modo específico a um segundo parceiro de ligação que pode estar conti.no na amostra líquida ou ser um reagente. Erequentemente pelo menos um dos parceiros de ligação encontra-se ligado à fase sólida sobre a camada de suporte.

Ia preparação dos componentes fixos é frequentemente vantajoso que o parceiro de ligação que se pretende fixar seja aplicado numa concentração (por unidade de área) que seja inferior à capacidade de ligação (po3? unidade de área) da superfície a que se pretende fixar. Deste modo é possível evitar as fases de preparação adicionais, especialmente a remoção do excesso por lavagem, que caso contrário são necessárias na fixação dos reagentes aos suportes. A presente invenção é ilustrada mais em pormenor com o auxílio dos Exemplos que são representados esquematicamente nas Figuras: 8

A Figura 1 é uma vista superior mostrando parte de um elemento de análise de acordo com a presente invenção, A Figura 2 é um diagrama básico em perspectiva do domínio dos reagentes num elemento de análise imunoldgico, e A Figura 3 mostra uma forma de concretização alternativa do domínio dos reagentes de um elemento de análise imunológioa. 0 domínio dos reagentes 1 apresentado na Figura 1 contém dez filas de compartimentos de reagentes 11 e 20 que são aplicados adjacentes uns aos outros numa camada de suporte 2. Cada um dos compartimentos é constituído por um grande número de rodelas 3 que são aplicadas no domínio dos reagentes 1 com uma cabeça de impressão por jacto de tinta. 0 procedimento é de preferência o seguintes A camada de suporte 2 é uma película de plástico (especialmente feita de poliestireno) que foi previamente irradiada com raios gama sob condiçães normalizadas (EP-B1-0 061 167). Em seguida é posicionada debaixo de uma cabeça de impressão por jacto de tinta que pode realizar movimentos precisos em relação à camada de suporte 2, e é impressa com as rodelas 3.

Usa-se uma técnica especial para conseguir uma aplicação uniforme do reagente que cubra de forma continua a área de cada um dos compartimentos 11 a 20, luma primeira fase do processo aplica-se apenas uma de cada duas rodelas alternadas (uma sim, uma não) no compartimento, formando as quantidades discretas de reagente líquido aplicadas nesta fase do processo rodelas separadas por intervalos. Depois de o reagente ter secado - 9 -

(cerca de 60 s à temperatura ambiente), aplicam-se quantidades discretas do reagente líquido numa segunda fase, num momento diferente, aos espaços entre as rodelas produzidas na primeira fase, de modo a formar um compartimento continuo. Este procedimento é espacialmente vantajoso quando se pretende aplicar um reagente líquido aquoso sobre uma superfície relativamente hidrofóbica da camada de suporte 2. Erequentemente, no entando, é também possível evitar a necessidade do procedimento descrito em duas fases influenciando as propriedades de superfície do material da camada de suporte ou modificando a composição do reagente líquido.

Io caso ilustrado, os compartimentos 11 a 20 são idênticos na sua forma externa e na sua estrutura física (que é preferida embora não necessário), mas diferem no que diz respeito à respectiva composição química, Eodem ser divididos em conjuntos, que são designados pelas letras A, B e 0 na figura 1. Os compartimentos dum mesmo conjunto contém a mesma composição de reagentes, enquanto que os compartimentos de conjuntos diferentes diferem no que se refere à composição do reagente, estando os compartimentos de conjuntos diferentes dispostos de modo alternado de modo que os compartimentos que contém reagentes diferentes se encontram adjacentes mas de qualquer modo separados por um intervalo.

Io caso ilustrado, um compartimento alternado em cada dois pertence ao conjunto A, 0 número de compartimentos em cada ume dos conjuntos B e C é apenas metade e encontram-se colocados de modo alternado nos espaços entre os compartimentos do conjunto A.

As dimensães dos compartimentos e as distâncias entre èles são excepcionalmente pequenos. lum caso avaliado na prática, a distância entre as rodelas que pertencem a um compartimento era apenas de 0,14 mm, a distân - 10 -

cia de centro a centro entre os compartimentos era de cerca de 0,26 mm neste exemplo e a distância média entre os limites dos compartimentos era inferior a 0,15 mm.

Os compartimentos de conjunto diferentes podem ser com vantagem produzidos numa passagem única com o auxílio de uma cabeça multicanal ou numa impressora equipada com várias cabeças de impressão, Foram desenvolvidas impressoras destes tipos, trabalhando pelo processo do jacto de tinta, para a impressão a cores. O padrão dos compartimentos apresentado na Figura 1 pode ser produzida por exemplo usando conjuntos dispostos linearmente de uma cabeça de impressão multicanal para compartimentos diferentes e movendo a cabeça de impressão sobre a camada de suporte 2 numa direcção perpendicular à disposição linear dos jactos (flecha 7). Deste modo é possível preparar elementos de análise de acordo com a presente invenção dum modo preciso e ao mesmo tempo económico. 0 movimento da cabeça de impressão relativamente à camada de suporte pode ser efectuado com as construçSes normalmente usadas para as impressoras de jacto de tinta. Ho âmbito da presente invenção é vantajoso operar a cabeça de impressão unidireccionalmente a fim de permitir um posicionamento especialmente preciso das rodelas. A Figura 2 é um diagrama muito esquemático que postra a estrutura em camadas do domínio dos reagentes de um elemento de análise para determinaçSes imu-nológicas.

Srês conjuntos de compartimentos - A (compartimento 11, 13, 15, 17 e 19), B (compartimentos 12 e 16) e C (oompartimentos 14 e 18) - são apresentados novamente na camada de suporte 2. A representação tri-dimensio-nal revela outra medida preferida, nomeadamente de que cada - 11 -

compartimento está separado dos outros por uma camada de separação 5 que contem uma substância inerte solúvel em água, em particular uma proteína solúvel em água, como por exemplo albumina do soro de bovino. A camada de separação é aplicada por um processo em que, apds aplicação dos compartimentos que pertencem ao conjunto A, a ASB é aplicada em várias passagens da cabeça de impressão, estando não sé os jactos dirigidos para os compartimentos 11 a 20 mas também sendo jactos intermediários da cabeça de pressão activados a fim de formar a camada de ASB contínua.

Os compartimentos 11 a 19 e a camada separadora de ASB 5 formam no seu conjunto uma camada de reagente 4 sobre a camada de suporte 2. Ha prática, a forma dos compartimentos não é tão uniforme e rectan-gular como se apresenta na Figura 2. Ho entanto, é uma característica da presente invenção os compartimentos serem separados por intervalos uns dos outros, estando pelo menos alguns dos compartimentos pertencentes a conjuntos diferentes dispostos lado a lado sobre a camada de suporte 2 (compartimentalização horizontal).

Huma forma de concretização preferida, os compartimentos do conjunto A contém um primeiro parceiro de ligação fixo ao suporte (Bp(b) (parceiro de ligação, lagado = binding partner, bound). 35 vantajoso neste caso que os compartimentos que contém o primeiro parceiro de ligação estejam cobertos por uma camada protecto-ra 5a de uma substancia protectora inerte. ]S especialmente adequada uma proteína solúvel que não reaja com os outros componentes do conjunto de análise. Frequentemente usa-se em mistura com um açúcar. A camada protectora assegura a estabilidade necessária durante a armazenagem do parceiro de ligação fixo ao suporte Bp(b).

Pelo menos um outro conjunto de compartimentos B ou 0 contém um segundo parceiro de liga- - 12 -

ção livre, Bp(f) (parceiro de ligação, livre = binding partner, free) com capacidade de entrar em ligação específica com o Bp(b), significando “livre" que se pode facilmente dissolver na amostra líquida. 0 Bp(f) é de preferência marcado por um método convencional usado em imunolo-gia (por exemplo por conjugação com uma substância marcadora M, por exemplo uma enzima ou um marcador fluorescente) Neste caso, bem como com outros compartimentos eluíveis, é vantajoso que uma camada'de bloqueamento 5b, cobrindo a camada de suporte 2, esteja disposta sob os compartimentos 12 e 16. A camada de bloqueamento 5b pode também ser de modo conveniente baseado numa proteína inerte solúvel e serve para evitar a ligação inespecífica do reagente eluí-vel (neste caso Bp(s) à camada de suporte 2 e em consequência para melhorar a capacidade de eluição do Bp(f).

Na forma de concretização apresentada na Figura 2, as camadas proteotoras 5a» que cobrem os compartimentos 11, 13, 17 e 19, e as camadas de bloqueamento 5b, que estão dispostas por debaixo dos compartimentos 12, 14, 16 e 18, dirigem-se uma em direc$ão à outra e no seu conjunto formam a camada de separação 5. Esta disposição é egpecialmente vantajosa se bem que não necessária, As camadas de protecção e de bloqueamento também podem estar separadas.

Outros pormenores dependem do principio da análise imunológica segundo o qual o elemento de análise funciona. Por exemplo, se o produto a analisar é um antigénio Ag(s) (antigénio. amostra = antigene, sample, o Bp(f) pode ser um antigénio (Ag(f) análogo ao Ag(s) se se usar um principio de análise competitiva. 0 Bp(b) neste caso é um anticorpo Ab(b) (anticorpo, ligado = = antibody, bound) com capacidade de ligação específica ao Ag(f). 0 procedimento analítico neste caso baseia-se no facto de que o Ag(s) compete com o Ag(f) em relação aos locais de ligação sobre o Ab(b), sendo a quantidade do - 13

Ag(f) ligado ao ATo(To), que é detectável devido à marcação do Ag(f), uma medida da concentração do produto a analisar. Por meio da marcação, pode determinar-se a concentração do Ag(f) de preferência na fase ligada, mas em principio também na fase livre.

De acordo com outro principio de reacção imunológica ("one-step sandwich" = sanduíche numa única fase), os compartimentos B ou C (novamente para determinação de um antigénio Ag(s)) podem conter um anticorpo Ab(f) com capacidade para a ligação especifica com o Ag(s). Neste caso, o conjunto de compartimentos A contém um anticorpo Ab(b) fixo ao suporte, o qual possui capacidade de ligação específica ao Ag(s) por meio dum segundo epítopo. 0 método de análise baseia-se neste caso no facto de que o Ag(s) promove a ligação entre o Ab(b) e o Ab(f).

Se se pretende determinar um anticorpo e não um antigénio, os componentes da reacção ligado e livre tem de ser permutados entre si nos compartimentos (antigénio por anticorpo e vice-versa).

Este e outros princípios de análise imunológica adequados para a presente invenção são conhecidos já desde hl muito tempo. Pode referir-se, por exemplo, Patente US 4 861 711 e numerosas outras publicaçães que descrevem a aplicação de reacçães imunoldgicas heterogéneas para elementos de análise em diferentes variantes. 0 Quadro 1 mostra a disposição dos conjuntos de compartimentos para os referidos princípios de reacção bem como para alguns outros; - 14 -

Quadro 1:

Bp(s) Bp(P) ' em A Bp(f) em B e/ou 0 sanduiohe Ag AP AP-M AP Ag Ag-M competitiva Ag AP Ag-M AP Ag AP-M Bm comparação com os elementos de análise conhecidos, a presente invenção consegue uma simplificação significativa da produção e da estrutura de um elemento de análise imunológica por aplicação da técnica do jacto de tinta a fim de dar origem a compartimentos de diferentes componentes de reacção imunológica dispostos em alternância e separados por intervalos, mas adjacentes e próximos.

Verifica-se que o parceiro de ligação solúvel contido num primeiro conjunto de compartimentos é dissolvido muito rapidamente pela amostra, de modo que a reacção deste parceiro de ligação com o produto a analisar começa imediatamente após o contacto com a amostra. Ao mesmo tempo toda a amostra está em contacto com o parceiro de ligação fixo no suporte. A microcompartimentalização dos reagentes permite que as reacçães de ligação em questão procedem rapidamente e de modo homogéneo com quantidades muito pequenas de amostra e de reagente a uma alta velocidade de reacção. ÍTeste caso a reacção com o parceiro de ligação livre tem lugar de preferência em primeiro lugar, enquanto que a reacção com o parceiro de ligação ligado à fase sólida procede suPstancialmente mais lentamente por ser uma reacção heterogénea e, na prática, não tem lugar de forma significativa até que a reacção de ligação do Bp(f) esteja terminada. 15 - 4

De acordo com uma forma de concretização preferida da presente invenção, aplicam-se pelo menos três conjuntos diferentes de compartimentos ao domínio dos reagentes de um elemento de análise: um primeiro parceiro de ligação Bp(b), fixo ao suporte, no conjunto A, um segundo parceiro de ligação livre Bp(f)l, com capacidade de ligação específica ao último, no conjunto B, e um terceiro parceiro de ligação Bp(f)2, que também se encontra livre mas que contém também um marcador, no conjunto 0 Nestecaso o segundo parceiro de ligação Bp(f) 1, possui a capacidade de se ligar tanto ao primeiro parceiro de ligação Bp(b) como ao terceiro parceiro de ligação Bp(f) com especificidades diferentes. De preferencia o primeiro parceiro de ligação Bp(b) é o mesmo para diferentes elementos de análise, enquanto que os dois parceiros de ligação livres são seleccionados de acordo com o produto a analisar (parâmetro) e ser determinado e com o método seleccio-nado. 0 primeiro parceiro de ligação contém de preferência estreptavidina (SA) ou avidina e o segundo parceiro de ligação contém de preferência biotina (B). A biotina é conjugada com um antigénio ou com um anticorpo, em função do procedimento de análise, obtendo-se Ag-B ou Ab-B, 0 Quadro 2 mostra a disposição dos conjuntos de compartimentos para dois principios de análise diferentes, supondo-se em cada caso que se pretende determinar um antigénio na amostra. Se se pretende determinar um anticorpo, torna-se necessário trocar o antigénio e o anticorpo. - 16 -

Quadro 2:

Para determinar um Ag

Bp(b) Bp(f)l Bp(f)2 competitiva (a) SA B-Ag Ab-M (b) SA B-Ab Ag-M Sanduíche SA B-Ab Ab-M

Oom cada um destes princípios, após dissolução dos parceiros de ligação livres, o Bp(f)l liga-se ao Bp(b) por meio de uma ligação avidina-biotina.

Io ensaio competitivo do tipo (a), a ligação do Ab-M ao B-Ag é determinado por competição com o antigénio da amostra Ag(s). Ho ensaio competitivo do tipo (b), o Ag(s) compete com o Ag-M para locais de ligação no anticorpo B-Ab. Io ensaio do tipo sanduich, o antigénio da amostra promove igualmente a ligação entre o anticorpo do B-Ab e o anticorpo de Ab-M.

Segundo esta forma de concretização, a estreptavidina (ou a avidina), que se encontra fixa ao suporte, e a biotina, que se encontra ligada por meio de uma ligação covalente a outras reagentes, formam um sistema designado por sistema de captura. A utilização do sistema de captura torna possível a ligação fácil de componentes constituídos por reagentes diferentes a uma fase fixa que tenha sido pré-tratada de modo homogéneo (com um único componente de ligação, neste caso a estreptavidina). Io âmbito da presente invenção esta operação pode ser realizada de forma a obter um posicionamento preciso. Por outro lado, é também possível aplicar coppartimento solúveis (reagentes não tratados com biotina) a uma camada de suporte que tenha sido pré-tratada de modo homogéneo, por exemplo com estreptavidina, sem que se respectivas propoieda- - 17 - des de solubilidade sejam substancialmente afectadas. Podem encontrar-se outros pormenores em ΞΡ-Α-0 269 092 e EP-A-0 344 578. A Pigura 3 mostra uma forma de concretização alternativa de um suporte de ensaio com três conjuntos que contem três parceiros de ligação diferentes. A composição de ensaio é essencialmente a mesma da forma de concretização anterior, excepto que neste caso o segundo parceiro de ligação constitui um revestimento directo sobre o primeiro parceiro de ligação e se encontra deste modo ligado a ele. Os dois parceiros de ligação são por conseguinte designados por Bp(b)l e Bp(b)2. Encontram-se posicionados em compartimentos duplos 20, 22, 24, 26 e 28 do conjunto A. 0 terceiro parceiro de ligação ê um parceiro de ligação livre Bp(f) nos compartimentos 21, 23, 25 e 27 do conjunto B.

Os exemplos que se seguem destinam--se a elucidar mais completamente a presente invenção. Sempre que nada em contrário seja indicado, todos os dados em fo referem-se a percentagens em peso.

Exemplo 1:

Utilizou-se uma impressora de jacto de tinta Epson SQ-2550 para a aplicação dos compartimentos. Em vez do reservatório de tinta, ligou-se ao sistema de tubos que conduz à cabeça de impressão um reservatório de reagente separado contendo a solução de reagente que se pretende quantificar, Pôs-se a impressora em funcionamento em modo gráfico (movimentação individual do jacto) por meio de um computador pessoal). 0 material de suporte usado foi uma folha de formado DIN A4 de 0,1 mm de espessura feita de película de poliestireno. A película foi submetida a irra- - 18 - diação gama normalizada antes de ser usada

Oaracterísticas da cabeça de impressão: 24 jactos dispostos em duas filas (deslocação de meia linha) diâmetro da gota : cerca de 90 um menor volume quantificável (1 gota): cerca de 420 picolitros densidade de impressão por cada passagem: 71 x 71 2 ~2 gotas/cm (180 x 180 gotas/polegada )

Os compartimentos são aplicados pelo processo descrito em relação com a Figura 1. Cada um dos compartimentos de reagentes é constituído por 24 gotas individuais de cerca de 400 picolitros cada. As dimensães dum compartimento são de cerca de 3,2 mm de altura por cerca de 0,06 a 0,08 mm de largura, A distância entre os centros dos compartimentos ê de cerca de 0,26 mm. A camada de separação com base em albumina de soro de bovino (seguidamente designado por "camada de separação de ASB") foi aplicada com um total de quatro passagens de impressão, sendo a distânciá entre as gotas de 0,14 mm horizontalmente e de 0,14 mm verticalmente. A disposição dos compartimentos no domínio dos reagentes foi 0 correspondente à Figura 2. Usaram-se as seguintes soluçQes para os vários conjuntos de compartimentos. a) Conjunto de compartimento A: Bp(b) (nomeadamente SA): SA fixa ao suporte. - 19 - i

Solução de revestimento; 0,025 mg/ml TASB-SA 40 mM tampão de fosfato ae sódio (NaPB) de pH 7,4 5 % vol isopropanol TASB-SA significa termo-albumina de soro de bovino-estreptavidina de acordo com EP-A-0 267 092 e EP-A-0 344 578. Este composto é especialmente adequado para a fixação por adsorção por unidade de área foi marginalmente menor do que a capacidade de ligação por adsorção da película de suporte, evitando d este modo fases processuais adicionais para assegurir a ligação quantitativa e estável à fase fixa.

b) Camada protectora 5; camada de separação de ASB

Solução de revestimento; 0,6% de albumina de soro de bovino (ASB) 4,0% de sucrose 1,8% de cloreto de sódio (NaCl) 5,0% vol de isopropanol c) Conjunto de compartimentos B: Bp(f) 1 (nomeadamente B-Ag);

Conjugado solúvel constituido por T3 e biotina (T3-biotina), preparado por acoplamento de biotina com N-butoxicarbonil-triiodotironina (T3) por meio de pentametilenodiamina (Eur.J. Biodhem. 131 (1980, 333-338)).

Solução de revestimentos 200 ng/ml de T3-biotina

barbiturato de sódio 120 mM

NaPB 21,8 mM de pH 8,35 0.04% de ácido 8-anilinonaftaleno-l- -sulfónico (ANS) 20

0,02% de 4-aminoantipirina 0.01% de mertiolato 0.25% de IgG bovino (B-IgG) 1.0% de Pluronic<< F68 d) Conjunto de compartimentos C: Bp(f)2 (nomeadamente

Ab-M)s

Conjugado eluível constituído por um anticorpo poli-clonal dirigido contra T3 e peroxidase (PAB < T3 > -pod).

Solução de revestimento; 2,2 U/ml de PAB “n T3 > -POD

barbiturato de sódio 120 mM NaPB 21,8 mM de pH 8,35 0,04% de ANS 0.02% de 4-aminoantipirina 0,01% de mertiolato

0, 25% de B-IgG 1,0 % de Pluronic ^ F68

Cortaram-se tiras de ensaio de 3, 2 mm de altura e 15 mm de comprimento de uma película revestida de poliestireno, dispondo-se os compartimentos ao longo de toda a altura perpendicularmente à direcção longitudinal. As quantidades molares de reagentes presentes nesta tira de ensaio nos vários compartimentos eram:

No conjunto de compartimentos C: 0,05 femtomol de PAB < D3 ^ -POD ( = 1,4 ,uU)

No conjunto de compartimentos B: 23,0 femtomol de T3-biotina No conjunto de compartimentos A: cerca de 500,0 femtomol de locais de ligação de biotina (através de TASB-SA) 21 -

Efectuou-se uma análise de T3 como se seguei - Aplicaram-se 50 p.1 de cada amostra contendo T3 a uma tira de análise e incubou-se durante 2,5 h à temperatura ambiente numa câmara húmida.

Lavou-se a tira de análise 4 vezes com 1 ml da solução de ASB usada para a camada protectora.

Aplicou-se um substrato para a enzima de marcação, nomeadamente 50 jul de reagente de coloração de diaminobenzidina (DAB) (0,5 mg/ml de DAB, NaPB 40 mM de pH 7,4, 0,025% de cloreto de cobalto, 0,02% de sulfato de níquel e 0,01 % de peróxido dehidrogé-nio) e incubou-se durante uma hora à temperatura ambiente numa câmara húmida.

Lavou-se em seguida a tira com água. 0 ensaio baseia-se no principio de competitividade exposto anteriormente: 0 T3 compete com ο T3 biotinilado em relação aos locais do conjugado PAB < T3 > --POD.

Foi produzido uma coloração reconhecível visualmente do conjunto de compartimentos A, de intensidade variável, em função da concentração por uma técnica quantitativa permite a calibração e a avaliação quantitativa.

Exemplo 2s 0 processo de elaboração e de preparação foram correspondentes ao Exemplo 1 com a excepção da composição das soluções usadas para os conjuntos de compartimentos B e C. Estes tinham a composição seguintes 22 -

a) Conjunto de compartimentos B: Bp(f)l (nomeadamente B-Ab)í

Conjugado eluível constituido por um anticorpo mono-clonal dirigido contra TSH (ECACC 87122201) e bioti-na (MAB < TSH > -biotina). 0 tratamento com biotina do anticorpo foi efectuado de acordo com JACS 100 (1978, 3585-3590) por reacção com N-hidroxisuccini-midobiotina numa proporção de 10:1.

Solução de revestimento: NaPB 80 mM de pH 7.4 65 ug/ml de MAB K TSH > -biotina

0,6 % de ASB 0,3 % de IgG bovina d) Conjunto de compartimentos C: Bp(f)2 (nomeadamente

Ab-E):

Conjugado eluível constituido por peroxidase e um anticorpo monoclonal dirigido contra TSH (ECACC 87122201) (MAB < TSH > -POD).

Solução de revestimento: NaBB 50 mM de pH 7,4

9 U/ml de MAB < TSH > -POD 0 procedimento de análise correspondente ao do ensaio numa única fase heterogéneo do tipo sanduich com um sistema de captura estreptavidina-biotina para ligação do complexo imunológico â fase fixa.

Prepararam-se novamente tiras de analise com as mesmas dimensães do Exemplo 1. Cada tira de análise corji-tém 18 compartimentos do conjunto A e 9 compartimentos de cada um dos conjuntos B e C. A análise foi levada a efeito como no Exemplo 1, excepto em que na primeira fase se aplicam 100 ul de cada uma das amostras contendo TSH e a incubação foi efectuada durante 3 h â temperatura ambiente e numa câmara 23

Claims (1)

1. húmida Como no Exemplo 1, foi produzida uma coloração nitidamente reconhecível visualmente de intensidade variável dos compartimentos do conjunto A. REIVINDICAÇÕES _ 1« - Elemento de análise para a determinação de um produto a analisar numa amostra líquida que contém uma camada de suporte (2) que contém, numa região para um reagente (4), um reagente aplicado num padrão definido por um processo de jacto de tinta, caracterizado por o padrão conter vários conjuntos (A, B e C) de compartimentos (11, 20) de tal modo que os compartimentos (por exemplo 11, 13, 15, 17 e 19) do mesmo conjunto (por exemplo A) tem a mesma composição química, os compartimentos (por exemplo 11, 13, 15, 17 e 19 ou 12, 16 e 20) de diferentes conjuntos (A ou b) contém reagentes diferentes e os compartimentos de conjuntos diferentes estão dispostos alternadamente de modo que os compartimentos que contém reagentes diferentes se encontram próximos mas separados por um intervalo. _ 2δ - Elemento de análise de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por pelo menos um conjunto (A) de compartimentos conter um primeiro parceiro de ligação com capacidade para se ligar por uma reacção biológica e especifica a um segundo parceiro de ligação que está contido na amostra líquida ou é um reagente. 24 -

   - 3S - Elemento de análise de acordo com a reivindicação 2 caracterizado por o primeiro parceiro de ligação estar ligado a uma fase sólida. - 4a - Elemento de análise de acordo com a reivindicação 3 caracterizado por a concentração do primeiro parceiro de ligação ligado a uma fase sólida ser inferior à capacidade de ligação da superfície â qual se encontra fixado. - 5a _ Elemento de análise de acordo com qualquer das reivindicações 3 ou 4 caracterizado por o conjunto (A) de compartimentos que contem o primeiro parceiro de ligação estar coberto por uma camada protectora (5a) baseada numa proteisoluvel. -62- Eiemento de análise de acordo com qualquer das reivindicações 3 a 5 caracterizado por o segundo parceiro de ligação ser um reagente contido num outro conjunto (B; C) de compartimentos (12, 16; 14, 18) sob forma solável. _ 7ê _ Elemento de análise de acordo com qual-• quer das reivindicações 1 a 6 caracterizado por existir uma 25 -

   camada de bloqueamento (5b) baseado numa proteína solúvel cobrindo a camada de suporte (2) sob um compartimento (12, 16) que contém um reagente solúvel. -8§_ Eiemento de análise de acordo com qualquer das reivindicações 5 e 7 caracterizado por a camada de bloqueamento (5b) e a camada protectora (5a) estarem combinadas para a formar uma camada de separação contínua (5). - 9β - Elemento de análise de acordo com qualquer das reivindicações 6 a 8 caoacterizado por um terceiro parceiro de ligação estar contido noutro conjunto (C) de comprimentos (14, 18) e o segundo parceiro de ligação ter a capacidade de se ligar de modo específico tanto ao primeiro como ao terceiro parceiros de ligação com especificidade diferentes. - 10 S - Elemento de análise de acordo com a reivindicação 9 caracterizado por conter um sistema de captura de preferência baseado em avidina ou em estreptavidina e biotina. - lie - Processo para a produção de um elemento de análise de acordo com qualquer das reivindicações anteriores caracterizado por se ejectarem numerosas quantidades discretas de um reagente líquido de uma cabeça de jacto de 26

   tinta na região do reagente da camada de suporte θ se mover a cabeça de jactos e a camada de suporte relativamente um ao outro de tal modo que as gotas produzidas pelas quantidades discretas do reagente líquido formam um conjunto de compartimentos na região do reagente. - 12S - Processo de acordo com a reivindicação 11 caracterizado por, a camada de suporte ser feita de plástico e ser irradiada com raios gama antes da aplicação do reagente líquido. - 13a - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 11 ou 12 caracterizado por, para se obter um compartimento, se aplicarem as quantidades discretas de reagente líquido, numa primeira fase, de modo a formar gotas na região do reagente que estão separadas umas das outras por intervalos e incluir pelo menos uma outra fase não simultânea em que se aplicam quantidades discretas de reagente líquido aos intervalos entre as primeiras gotas de modo a formar um compartimento contínuo. - 14a - Processo de acordo com qualquer das reivindicações 11 a 13 caracterizado por se produzirem simultaneamente vários compartimentos de conjuntos diferentes 27 - com uma cabeça de jactos multicanal A réquerente reivindica a prioridade do pedido de patente alemão apresentado em 2 de Agosto de 1990/ sob oN2. P 40 24 544. 31 de Julho de 1991 Lisboa, 0 AGEJK -Síí

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