PT97584B

PT97584B - Processo para a preparacao de composicoes farmaceuticas que contem eritropolietina

Info

Publication number: PT97584B
Application number: PT97584A
Authority: PT
Inventors: Dieter Brazel; Bernhard Siebold; Dorothee Krumwieh; Thomas Brune
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1990-05-08
Filing date: 1991-05-07
Publication date: 1998-08-31
Also published as: NO911788D0; EP0456153B1; IE65925B1; ATE120646T1; ES2073063T3; PT97584A; KR100203546B1; DE4014654A1; ZA913435B; IE911549A1; NO301805B1; KR910019636A; JPH04225923A; AU652361B2; AU7618391A; CA2041989C; EP0456153A1; DE59105075D1; DK0456153T3; NO911788L

Description

A presente invenção refere-se a composições galénicas aquosas que contêm eritropoietina purificada, especialmente eritropoietina natural humana a eritropoietina recomninante humana (rh EPO). As composições farmacêuticas de acordo com a presente invenção - sem proteínas estranhas, açúcar, aminoácidos ou outros agentes estabilizadores usuais - quando guardadas a uma temperatura de 4 a 8° C, mantêm pelo menos cerca de 782 da sua actividade original durante um ano.

A eritropoietina (EPO) é uma glicoproteína com cento e sessenta e seis aminoãcidos, três posições de glicosilação nas posições de aminoácidos 24, 38 e 83 e uma massa molecular igual a cerca de 34 000. A EPO pode quer ser preparada a partir de fontes naturais como, por exemplo, urina humana (veja-se, por exemplo, MiyaKe e col., J, Biol. Chem., Vol. 252 (1977), 5558 - 5564) quer ser preparada por processos de tecnologia genética (veja-se, por exemplo, as Patentes Europeias EP—A 0148 605 e 0 267 678). Às soluçoes aquosas • de eritropoietina são instáveis âs temperaturas compreendidas

entre cerca de 3° C e a temperatura ambiente.

Os pacientes coa insuficiência renal não podea produzir EPO e, portanto» sofrem de anemia. Os ensaios para complementar essa falta de EPO por administração de EPO e atenuar os sintomas de anemia obtiveram êxito. Outras utilizações clínicas consistem na administração de hEPO no caso de anemia iatrogúnica depois de quimioterapia ou de terapia com raios X de doenças malignas.

Uma dose individual de EPO é de apenas alguns microgramas. Em virtude dos curtos tempos de semi-transformação depois de administração por via intravenosa, não podem detectar-se teores fisiolúglcos no plasma após as injecções subcutâneas.

As formulações galénicas de erítropoietina ate agora reivindicadas e disponíveis têm aditivos constituídos por detergentes e/ou proteínas, açúcares e poli-ãlcoois, os quais, por um lado, estabilizam a EPO e, por outro lado, evitam a absorção da EPO pela parede interna do recipiente de armazenagem (isto é, nas ampolas) (EP-B-0 178 576? EP-A-0 178 655;

6. Xrystal e col., Blood, Vol. 67 (1986), 1, 71 - 79).

A administração subcutânea ou intramuscular da EPO estabilizada dessa forma origina inflamações locais com formação de granulomas. A EPO de elevada pureza preparada de acordo com processos conhecidos patentes de invenção (EP-A-G 236 059; US-A 4 667 159, FCT/OS 86/01342 («MG 86/07594)) perde mais de 25X da sua actividade durante uma semana em armazenagem a 24° C, A partir da Patente Europeia EP-B-0 178 576» conhece-se ainda uma solução de erítropoietina humana « z que foi metilada por redução com ⁴C-formaldeído em PBS; vejam-se ensaios 1 e 2»

A invenção tem como objectivo proporcionar composições farmacêuticas galénicas de erítropoietina purificada que são isentas dos aditivos de estabilização usuais e, nao obstante, possuem uma estabilidade suficiente ãs temperaturas compreendidas entre cerca de 3°C e a temperatura ambiente e são especialmente apropriadas para a administração por vias subcutânea ou intramuscular.

Supreendentemente, a Requerente descobriu que a eritropoietina purificada (com cerca de 99% de grau de pureza), e, especialmente, a eritropoietina humana natural ou recombinante purificada, no seio de uma solução-tampão de fosfato aquosa fisiologicamente aceitável de pH compreendido entre 6 e 8, que contém um halogeneto de metal alcalino fisiologicamente aceitável, mas não contém aditivos estabilizantes, é estável em recipientes de vidro ou ampolas de vidro fechados, durante longos intervalos de tempo, a temperaturas compreendidas entre 4 e 8°C.

A invenção refere-se, portanto, a composições farmacêuticas galénicas aquosas de eritropoietina purificada num tampão aquoso de fosfato fisiologicamente aceitável com um valor de pH compreendido entre 6 e 8, que contém um halogeneto de metal alcalino fisiologicamente aceitável mas que não contém outros aditivos estabilizantes. Ê especialmente preferido um tampão constituído por fosfato de sódio 50 mm e por NaCl 100 mM de pH 7,8. A concentração de eritropoietina na solução da tampão aquoso é igual a 50 a 1000 microgramas por mililitro de solução de tampão.

São exemplos de soluções de tampao aquosas de fosfato fisiologicamente aceitáveis o tampão de fosfato de sódio e o tampao de fosfato de potássio, de preferência o tampão de fosfato de sódio. Os exemplos de hologenetos de metais alcalinos fisiologicamente aceitáveis são o cloreto de sódio e o cloreto de potássio, de preferência, o cloreto de sódio. Um tampão de fosfato preferido é um tampão de fosfato de sódio 50 mM e NaCl 100 mM, de pH 7,8. Este tampão é abreviadamente designado como PBS. As soluções aquosas de eritropoietina em PBS são muito apropriadas para a administração por via subcutânea e intramuscular.

A invenção refere-se ainda à utilização das formulações aquosas galénicas para a preparação de composiçoes para injecções para administração subcutânea ou intramuscular. Ê especíalaente preferida a administração subcutânea porque, em relação às formulações conhecidas, que são estabili- 3 -

zadas com proteínas, não origina irritação nem dores provocadas por inflamação; os ensaios clínicos demonstraram este efeito.

Os Exemplos seguintes esclarecem a presente invenção.

EXEMPLO

Exemplo 1

Purificasse de rh EPO

A purificação de rh EPO realizou-se a partir de meio que contém soro ou isento de soro, que foi condicionado por células animais que produzem rh EPO, de acordo com o processo descrito na Patente de Invenção EP-Â 0 267 678, página 6, linha 45 até página 9, linha 5. 0 processo compreende:

1) a clarificação, a concentração e a diálise do meio de cultura,

2) a cromatografia com permuta de ioes,

3) a cromatografia e» fase líquida de alto rendimento ea fase inversa preparativa e

4) a cromatografia por filtração através de gel.

Para a cromatografia através de gel, equilibrou-se a coluna com PBS, isto é, tampão de fosfato de sódio 50 mM e EaCl 100 mM, pH 7,8. Com esta solução de tampão, eluíu-se a rh EPO num pico único simétrico (determinação do eluído a 280 nm). A rh EPO assim obtida era pelo menos 99% pura de acordo com o ensaio de SDS-PAGE.

5) Diluição

As fracções de rh EPO pura obtidas na fase de filtração em gel 4) tinham um teor de 0,1 - 0,8 mg de EPO por mililitro e foram embaladas com o tampão de fosfato de sódio-cloreto de sódio (PBS) de pH 7,8, em doses

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individuais de 100 microgramas/raililitro.

Exemplo 2

Ensaio da Estabilidade

Ensaiou-se a estabilidade da solução de rh EPO em PBS obtida de acordo com o Exemplo 1 depois da armazenagem das doses individuais em tubos de ensaio esterilizados em comparação com diferentes estabilizadores· A actlvidade da rh EPO foi medida por inserção de T em células de baço de rato com fenil-hidrazina, procedendo de acordo com a maneira de proceder geral·

Os dados reunidos na Tabela seguinte referem-se â actividade de partida da rh EPO inicial igual a 100Z«

a) Armazenagem a 4 - 8° C

Agente estabilizador Quantidade de agente esta- % de activibilizador (peso/peso rela- dade depois tivo de EPO) em relação a de 12 meses de EPO/ml de PBS

PBS sozinho	-	78,5
PBS + Sorbite	5000	51
PBS + Glicerina	6150	0
PBS + Haemacel^	100	68

b) Armagenagem a 37-^C (Ensaio Acelerado)

Agente estabilizador Quantidade de agente % de activiestabilizador dade depois de meses

3 6

PBS sozinho - 86,3 39 11,2 9,9

PBS + Sorbite 5000 33,5 10,7 5,1 0

PBS + Haemacel^R 100 42 14,8 6,0 5,1

NOTA: Haemacelⁿ e uma gelatina degradada

A partir dos valores indicados nas Tabelas, verifica-se obviamente a surpreendentemente melhor estabilização de rh EPO em PBS (pH 7,8) sem adição de estabilizador.

R Ε I V I ff D I C A Ç δ E S

- 1® Processo para a preparação de composições farmacêuticas aquosas estáveis que contém eritropoietina (EPO), apropriadas para injecções, caracterizado por se dissolver EPO com uma pureza maior do que ou igual a 99% numa solução aquosa de tampão com o valor de pH de 6 a 8, fisiologicamente aceitável a qual contêm um fosfato de metal alcalino fisiologicamente aceitável e um halogeneto de metal alcalino mas mais nenhuns outros aditivos estabilizadores.

- 2^a Processo de acordo com a reivindlcaçao 1, caracterizado pelo facto de a solução aquosa de tampao ser uma solução 50 mM fosfato de sÕdio e 100 mM de ffaCl de pH igual a 7,8.

- 3» -

Claims

Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo facto de a EPO ser EPO humana natural ou recombinante.

- 4a Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo facto de a concentração de EPO estar compreendida entre 50 a 1000 mlcrogramas por mililitros de solução de tampão*

A requerente reivindica a prioridade do pedido alemão apresentado em 8 de Maio de 1990, sob o N». P 40 14 654.5,

Lisboa, 7 de Maio de 1991

RESUMO

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS AQUOSAS QUE CONTÊM ERITROPIETINA”

A invenção refere-se ao processo para a preparação de composições farmacêuticas aquosas que contêm eritropoietina humana natural ou recombinante, que compreende dissolver eritropoietina com um grau de pureza 99% numa solução aquosa 50 mM de fosfato de sõdio e 100 mM de NaCl de pH igual a 7,8, fisiologicamente aceitável de modo a obter-se uma concentração de eritropoietina, compreendida entre 50 e 1000 microgramas por mililitro de solução de tampão»