PT89534B - Processo para a preparacao de composicoes farmaceuticas anticoagulantes contendo como ingrediente activo proteina c ou proteina c activada combinada com heparina - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO
Antecedentes da invenção
1. Domínio da invenção
A presente invenção diz respeito a anticoagulantes que contêm como ingredientes activos proteína C ou proteína C activada e heperina, ou proteína C ou proteína C acti vada, heparina e antitrombina III (denominada AT III daqui em diante).
2. Técnica anterior
A proteína C foi isolada por Stenflo a partir do plasma de bovino (The Journal of Biological Chemistry, 251(2), 355-363 (1976) e mais tarde por Kisiel a partir do plasma humano (The Journal of Clinicai Investigation 64, 761-769 (1979)). Actualmente pode ser também preparada por engenharia ge nêtica.
t
Está descrito em Biochemistry 19, 401 -410 (1980), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79, 7200-7204 (1982) e em J. Biol. Chem. 258, 1914-1920 (1983) que a proteína C ê activada in vivo pela trombina e pela trombomodulina ou in vitro por Protec' ', um veneno de cobra, dando origem a proteína C activada que inactiva o factor VIII de coagulação sanguínea e o factor V da coagulação sanguínea, fosfolípido e Ca papel do factor V nas reacções de activação da protrombina no fosfolípido têm sido estudado desde a ultima metade dos anos 70. A velocidade da conservação da protrombina em trombina pelo factor X activado ê muito acelerada pe
2+ lo factor V activado, fosfolípido e Ca . Tomando a velocidade ~ 2de conversão com o sistema protrombina - factor X activado - Ca como 1, a velocidade ê 22 quando se adiciona o fosfolípido â com posição, 356 quando se adiciona o factor V activado no lugar do fosfolípido e 278000 quando se adiciona tanto o fosfolípido como o factor V activado. Conforme descrito atrás, o factor V activado como um cofactor de proteína desempenha um papel importante na activação de percursores de factores de coagulação. Ê a proteína C activada que decompõe o factor V activado inibindo desse modo a sua actividade de cofactor e o progresso da cascata de coagulação. O factor VIII activado também possui uma actividade de cofactor-proteína e participa intensamente na activação do factor X pelo factor IX activado. 0 efeito do factor VIII activa do na reacção de activação é evidenciado por um aumento da velocidade da activação de cerca de 200000 vezes na presença do factor VIII activado, Ca e fosfolípido quando comparado com a ausência do factor VIII e fosfolípido. A proteína C activada também inactiva o factor VIII inibindo desse modo o progresso da cascata de coagulação.
A heparina foi encontrada por Mclean no fígado de cães como uma substância que inibe a coagulação do sangue (Am. J. Physiol. 41, 250-257, 1916). Passaram-se setenta anos desde a descoberta da heparina. Agora ê largamente usada co mo um anticoagulante que ê preparado por separação e purificação . a partir do fígado e de intestinos de bovinos e de baleia. É sa* bido que a actividade de inibição da coagulação do sangue da he1
— .·:.—lE. J, parina ê produzida de tal modo gue a presença da heparina acelera a acção de AT III ao inibir a trombina ou o factor X de coagu lação do sangue activado.
Miller-Andersen et al. publicaram o método de purificação específico de AT III pela assim chamada cromatografia de afinidade com a heparina fixada em agarose (Thromb. Res. j>, 439-452 (1974)). Desde então, a purificação de AT III tornou-se muito mais fácil, e a AT III está agora disponí vel por todo o mundo como um anticoagulante sob a forma de prepa rações farmacêuticas que são principalmente usadas para a terapêutica da coagulação intravascular disseminada (DIC). Sabe-se que a AT III inibe in vitro as actividades da trombina, do factor IX activado e do factor X activado na coagulação do sangue.
factor X activado, contudo, não é inibido pela AT III se ele 2+ forma um complexo com o factor V activado, Ca e fosfolípido. Acredita-se que o efeito inibidor da AT III in vivo ê principalmente voltado para a trombina gerada no sangue. 0 efeito ê muito reforçado pela heparina.
A coagulação do sangue inclui a coagu lação do sangue intrínseca e a coagulação do sangue extrínseca causada por meio de factores de tecido extravascular e fosfolípi. do.
Cada um destes factores não actua independentemente. De facto ocorre hemorragia quando há insuficiên cia do factor VIII de coagulação ou do factor IX que ê um factor intrínseco, mesmo se o sostema extrínseco ê normal; também ocorre hemorragia na insuficiência do factor VII mesmo se o sistema intrínseco é normal. Quando se produz uma pequena quantidade de um factor de tecido, o factor de tecido forma um complexo com o factor VII, Ca e fosfolípido, o qual activa um factor intrínse co, o factor IX. Isto quer dizer que sem a activação do factor IX pelo complexo, a coagulação não ocorre eficientemente.
sistema intrínseco é activado pelo contacto do factor XII com os tecidos conjunctivos, particularmente com o colagénio, e através duma cascata, activa o factor X Por outro lado, o sistema extrínseco, enquanto activa o factor X pela formação de um complexo de um factor de tecido gerado por
tor IX intrínseco acelerando a formação do factor X activado.
Para além disso, o factor X activado por ambos os sistemas intrínseco e extrínseco forma um complexo com o factor V que ê um cofactor, Ca e fosfolipido, o qual actua como um activador para a protrombina para resultar na conver são de protrombina em trombina. A trombina converte o fibrinogênio em fibrina. No sistema extrínseco, os processos a partir do factor XII são contornados e por conseguinte, os processos têm lugar dentro de dez segundos aproximadamente. Uma muito pequena quantidade de trombina que se formou no estágio anterior actua sobre o factor V e o factor VIII, os quais por sua vez são activados deste modo acelerando mais a coagulação. É sabido que a muito pequena quantidade de trombina actua também sobre plaquetas e promove a libertação de fosfolipido. Assim, desempenha um papel de agente desencadeante para a coagulação intrínseca em combinação com a activação pela acção do factor XII.
No sistema de coagulação a fibrina ê finalmente formada com a participação de muitos factores de coagulação. Como descrito anteriormente, as inibições durante os processos anteriores têm lugar principalmente por acção de AT III sobre a trombina e pela acção da proteína C sobre o factor V activado e sobre o factor VIII activado. A AT III ê actualmente usada para o tratamento de DIC, contudo o mecanismo da sua ac ção não indica inibição do próprio processo de activação e por conseguinte ê desejado o desenvolvimento de anticoagulantes mais eficazes que inibam não somente o processo de activação mas também a actividade da trombina.
Descrição Pormenorizada da Invenção
Tendo em vista a situação descrita atrãs fizemos extensos estudos sobre anticoagulantes eficazes. Surpreendentemente, as actividades de anticoagulante muito altas que não se obtiveram com proteína C activada isolada ou com hepa rina-AT III foram obtidas de acordo com a presente invenção. A invenção está relacionada com anticoagulantes que contêm como in gredientes activos proteína C humana ou proteína C activada e he
parina ou proteína C humana ou proteína C activada, heparina e AT III.
Os anticoagulantes da invenção são ad ministrados de preferência por injecção ou por perfusão. Ao preparar a preparação farmacêutica injectável deve adicionar-se aos ingredientes activos um agente de acordo de pH, um agente tampão, um estabilizador, um agente para estabelecer a isotonieidade e semelhantes. Pode aplicar-se posteriormente a liofilização pelos procedimentos convencionais a fim de preparar preparações injectãveis liofilizadas. Por exemplo, um ou mais dos aditivos tais como manitol, sucrose, lactose, maltose, glucose, ácidos aminados e albumina podem ser adicionados aos ingredientes activos; dissolve-se a mistura em ãgua, e a solução ê dividida por frascos ou ampolas, que sao em seguida liofilizadas e hermeticamente selados para preparar a preparação para injecção intravenosa.
A proteína C como um ingrediente acti vo está presente no veículo numa concentração na gama de cerca de 2 jag/ml ate 20 jug/ml, a AT III na gama de 140 a 300 pg/ml e heparina na gama de 0,1 a 1,0 unidades usp/ml. A quantidade total de proteína no ingrediente activo a ser dada por dose situa-se na gama de 5 mg a 1 g para um adulto pesando 60 kg. Podem ser necessárias ocasionalmente multidoses.
A proteína C ou a proteína C activada e a AT III que são usadas como ingredientes activos nas preparações farmacêuticas da invenção são proteínas de plasma humano e são de muito baixa toxicidade. A heparina ê correntemente empregue em uso clínico e não provoca absolutamente qualquer problema de toxicidade conquanto seja usada convenientemente.
A presente invenção asrã descrita com mais pormenor em referência a Exemplos de ensaios e Exemplos.
Exemplo de ensaio 1
Prolongamento do tempo de protrombina em plasma com insuficiência em proteína C.
Como proteína C usou-se um produto pu rificado pelo método de Kisiel (J. Clin. Invest. 64, 761-769). A activação da vitamina C foi realizada pelo método que usa Protac^ (Thromb. Res. 43, 253-264, 1986).
A heparina e a proteína C activada fo ram adicionadas ao plasma com insuficiência de proteína C. Depois de incubação a 372 C adicionou-se tromboplastina de tecido e solução de CaCl2 θ mediu-se o tempo de coagulação de acordo com a determinação habitual do tempo de protrombina (Scan. J. Clin. Lab.. Invest. 1, 81, 1949). Os resultados são apresentados na Fig. 1. Vê-se a partir da Fig. 1 que apesar de quase não se observar prolongamento no tempo de coagulação no caso de proteína C activada na presença de heparina ( - ), observa-se um prolonga mento na presença de heparina e proteína C activada (o-o).
Exemplo de ensaio 2
Prolongamento do tempo de protrombina por combinação de heparina, AT III e proteína C activada na presença de protrombina, factor VII, factor X, factor IX e fibrinogênio.
A uma solução agitada de protrombina, factor VII, factor IX e factor X preparada de modo a conter cada um destes compostos a uma concentração de uma unidade/ml adicionou-se fibrinogênio (4 mg/ml), adicionando-se em seguida uma solução de heparina, AT III e proteína C activada em varias combinações. Depois de incubar a 379 C durante 2 minutos, adicionaram -se tromboplastina de tecido e solução de CaC^ e mediu-se o tem po de coagulação de acordo com a determinação habitual do tempo de protrombina (Scan. J. Invest. 1, 81, 1949). Os resultados da experiência são apresentados no Quadro 1. Vê-se a partir do Quadro 1 que o tempo de coagulação ê mais prolongado na presença de AT III, heparina e proteína C activada.
Tempo de protrombina
Aditivo Tempo de coagulação
| Experiência 1 | Experiência 2 | |
| - | 14,8 | 14,7 |
| AT III | 15,1 | 15,2 |
| Heparina | 17,3 | 17,1 |
| APC | 21,4 | 21,2 |
| AT III + heparina | 24,9 | 23,4 |
| APC + heparina | 25,0 | 24,2 |
| APC + AT III | 21,6 | 21,6 |
| APC + heparina | 76,4 | 102,5 |
APC: Proteína C activada
EXEMPLO 1
No sentido de obter uma preparação de 10 ml, encheu-se um frasco ou uma ampola com 1,5 mg de proteína C ou proteína C activada, 50 unidades usp de heparina, 22,5 mg de ãcido aminoacêtico, 25 mg de albumina de soro humano, 100 mg de D-manitol e 90 mg de cloreto de sódio, efectuando-se em segui da liofilização e fecho hermético.
EXEMPLO 2
Preparou-se uma preparação de 10 ml enchendo um frasco ou uma ampola com 1,5 mg de proteína C ou pro teína C activada, 50 mg de AT III, 50 unidades usp de heparina, 22,5 mg de ãcido aminoacêtico, 25 mg de albumina de soro humano, 100 mg de D-manitol e 90 mg de cloreto de sodio, efectuando-se em seguida liofilização e fecho hermético.
Breve Descrição do Desenho
A Fig. 1 ê um grãfico que mostra a re lação entre a concentração da proteína C e o tempo de coagulação.
Claims (1)
- R Ε I V I N D I G A Ç Õ E SProcesso para a preparação de uma composição farmacêutica anticoagulante caracterizado por se incorpo rar com ingrediente activo proteína C ou proteína C activada com binada com heparina, em veículos farmaceuticamente aceitáveis com uma concentração no veículo de proteína C na gama de cerca de 2 ug/ml atê 20 ug/ml e de heparina na gama de 0.1 atê 1,0 uni dades usp/ml.Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por se incorporar adicionalmente antitrombina III com uma concentração na gama de 140 ug/ml atê 300 ug/ml.A requerente declara que o primeiro pe dido desta patente foi apresentado no Japão em 28 de Janeiro de 1988, sob o numero Sho-63-15761.Lisboa, 26 de Janeiro de 1989RESUMOPROCESSO PARA A PREPARAÇAO DE COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICASANTICOAGULANTES CONTENDO COMO INGREDIENTE ACTIVO PROTEÍNA C OU PROTEÍNA C ACTIVADA COMBINADA COM HEPARINAA invenção refere-se a um processo para a preparação de uma composição farmacêutica anticoagulante que compreende incorporar-se com ingrediente activo proteína C ou proteína C activada combinada com heparina, em veículos farma ceuticamente aceitáveis com uma concentração no veículo de proteína C na gama de eerca de 2 ug/ml até 20 ug/ml e de heparina na gama de 0.1 atê 1,0 unidades usp/ml.
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