KR100187394B1

KR100187394B1 - 지혈제 조성물

Info

Publication number: KR100187394B1
Application number: KR1019950039458A
Authority: KR
Inventors: 김승호; 이진영; 한문희
Original assignee: 김은영; 한국과학기술연구원
Priority date: 1995-02-25
Filing date: 1995-11-02
Publication date: 1999-05-01
Also published as: KR960030949A

Abstract

본 발명은 외상, 혈우병, 수술 또는 출혈시에 지혈제로서 이용되고 있는 트롬빈(thrombin)과 그의 지혈 혹은 혈액 응고 능력을 탁월하게 증진시켜주는 카제인 키나제-II(casein kinase-II) 및 스핑고신(Sphingosine, 2-amino-4-octadecene-1, 3-diol) 또는 스핑고신 유도체(Sphingosine derivatives)를 포함하는 지혈제 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 지혈제 조성물은 우수한 지혈효과를 나타낼 뿐만 아니라 조직봉합의 효과까지 나타낸다.

Description

지혈제 조성물(NOVEL HEMOSTATIC COMPOSITION)

제1도는 기존 지혈제인 트롬빈과 본 발명의 지혈제인 혈액 응고 능력을 비교한 흡광도이다.

○는 A용액, ●는 A와 D, ▽는 A, C, D의 혼합물.

▼는 A, B, C, D의 혼합물이다.

A : 피브리노겐, B : 스핑고신

C : 카제인 키나제-II, D : 트롬빈

제2도는 리-화이트(Lee-White) 방법에 따라 본 발명의 지혈제와 트롬빈에 의한 사람 혈액의 응고력을 비교하여 나타낸 것이다.

1. 완충용액만 가한것.

2. 완충용액 및 트롬빈을 가한것.

3. 완충용액, 트롬빈 및 카제인 키나제-II를 가한것.

4. 완충용액, 트롬빈 및 스핑고신을 가한것.

5. 완충용액, 트롬빈, 카제인 키나제-II 및 스핑고신을 가한것.

6. 완충용액 및 스핑고신을 가한것.

7. 완충용액, 카제인 키나제-II 및 스핑고신을 가한것.

본 발명은 트롬빈 및 그의 지혈 혹은 혈액 응고 능력을 탁월하게 증진시켜 주는 첨가제를 포함하는 신규 지혈제 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 외상, 혈우병, 수술 또는 출혈시에 지혈제 또는 치료 복합제로서 이용되고 있는 트롬빈, 그의 지혈 혹은 혈액 응고 능력을 탁월하게 증진시켜 주는 신호 전달 물질인 카제인 키나제-II(casein kinase-II)와 지질인 스핑고신(Sphingosine, 2-amino-4-octadecene-1, 3-diol) 또는 스핑고신 유도체(Sphingosine derivatives)를 포함하는 신규지혈제 조성물에 관한 것이다.

인간의 생명에 직접 관련되는 혈액이 인체내에서 응고되는 기작에는 단백질로 이루어진 많은 인자(factor)들이 효소 혹은 조효소로서 작용하고, 칼슘 2가 이온, 트롬보플라스틴(thromboplastin) 등 여러 물질들이 관여하고 있는데, 최종적으로 트롬빈(thrombin)이 피브리노겐(fibrinogen)에 작용하여 피브리노겐의 펩타이드(peptide) 일부를 절단시켜 피브린(fibrin)이라는 단일체를 생성하고, 이 피브린 단일체가 생성됨과 동시에 정전기적 인력에 의하여 피브린 크로트(clot)를 형성하여, 여기에 인자 X IIIa가 관여하여 혈관밖으로 노출되어진 혈액을 응고시켜 지혈이 이루어지게 된다.

피브리노겐의 단백질에 결합되어 있는 인산기가 트롬빈의 겔화에 영향을 미친다고 보고되고 있으며(Forsberg, P. O. Thromb. Res., 53, 1-9, 1989), 피브리노겐을 인산화시킬 수 있는 효소에는 프로테인 키나제 A(protein kinase A; Engstrom, L., Edlund, B., Ragnarsson, U., Dahlqvist-Edberg, U., 와 Humble, E., Biochem. Biophys. Res. Commun., 96, 1507, 1980), 프로테인 키나제 C(Papanikolaou, P., Humble, E., 와 Engstrom, L., FEBS Lett., 143, 199-204, 1982), 카제인 키나제-I(casein kinase-I; Itarte, E., Plana, M., Guasch, M. D., 와 Martos, C., Biochem, Biophys, Res. Commun., 117, 631-636, 1983), 카제인 키나제-II(casein kinase-II; Humble, E., Heldin, P., Forsberg, P. O., 와 Engstrom, L., Arch, Biochem. Biophys., 241, 225-231, 1985)들이 가능하며, 이와 같이 인산화된 피브리노겐은 인산화에 이용한 키나제에 관계없이 플라스민(Plasmin)에 의해서 잘 분해되지 않는다고 보고되었다(Marth, S. C., 등, Thromb, Res., 61, 243-252, 1991).

세포의 성장, 분화, 암세포화 등에 중요한 역할을 하고 있는 스핑고신(Sphingosine)은 스핑고리피드(Sphingolipids)의 일종으로서 스핑고마이엘린(Sphingomyelin)의 대사 산물이며, 세포증식, 분화, 수용체 기능 등 생물학적인 기능면에서 중요한 역할을 하고 있다(Ballou, L, R., Immnunol, Today, 13, 339-507, 1992; Hannun, Y. A., 와 Bell, R. M., Science, 243, 500-507, 1989). 또한 스핑고신은 피브리노겐의 분해과정에서 카제인 키나제-II의 활성을 증가시킨다고 알려져 있다(Seydewitz, H. H., 와 Witt, I., Thromb. Res., 40, 29-39, 1985).

지혈제로서 중요한 요소는 혈액을 응고시키는 능력으로서, 상처나 수술등 여러 원인에 의하여 과다의 출혈과 외부로부터의 감염을 막기 위하여서도 되도록 빠른 시간에 혈액을 응고시킬 수 있어야 한다. 지혈제로서는 현재 여러 종류가 사용되고 있으며 그 중에서 트롬빈 제제는 탁월한 지혈효과를 나타낸다.

본 발명자들은 보다 빨리 응고시킬 수 있는 지혈제를 개발하기 위해 연구를 계속한 결과, 단백질 인산화 효소중의 하나인 카제인 키나제-II와 스핑고신 또는 스핑고신 유도체를 함께 트롬빈 제제에 첨가할 경우, 피브린 형성 과정이 활성화되어 트롬빈에 의한 지혈 효과가 현재보다 훨씬 빠른 속도로 진행됨을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 트롬빈의 피브린 크로트 형성을 촉진시킬 수 있는 첨가제들을 포함하는 개량된 지혈제 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 트롬빈, 카제인 키나제-II 및 스핑고신(Sphingosine) 또는 스핑고신 유도체르 포함하는 신규 지혈제 조성물이 제공된다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 지혈제는 트롬빈에 카제인 키나제-II 및 스핑고신 또는 스핑고신 유도체를 첨가함으로써 제조할 수 있으며, 그 외에도 혈액 응고제 또는 지혈제에 통상 첨가되는 성분들을 포함할 수 있다.

단백질 인산화 효소인 카제인 키나제-II는 피브리노겐의 아미노산을 인산화시킴으로서 피브리노겐을 피브린으로 분해시키는 트롬빈의 활성을 증가시킨다.

그런데 트롬빈제제에 카제인 키나제-II와 스핑고신 또는 스핑고신 유도체를 함께 첨가할 경우 스핑고신 또는 스핑고신 유도체가 트롬빈과 카제인 키나제-II의 활성을 증가시켜 줌으로서, 지혈과정이 트롬빈을 단독으로 사용할 경우 또는 트롬빈과 카제인 키나제-II를 함께 사용할 경우보다 훨씬 빠른 속도로 진행된다.

본 발명의 지혈제를 제조할 때 카제인 키나제-II는 트롬빈에 대하여(또는 지혈제 총량에 대하여) 0.01mU/ml 내지 1mU/ml의 양으로 첨가할 수 있고 0.1mU/ml 의 양으로 첨가하는 것이 바람직하다. 스핑고신은 0.01㎍/ml 내지 0.1㎍/ml의 양으로 첨가할 수 있고, 0.05㎍/ml의 양으로 첨가하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 조성물의 약제학적인 이용에서는 제약분야에서 공지된 방법에 의해 제조될 수 있으며, 적절한 부형제를 사용하여 정제, 캡슐제, 산제, 액제, 현탁제 등의 제형으로 이용될 수 있다.

본 발명의 발명에 따라 제조된 지혈제의 피브린 크로트 형성 정도는 피브리노겐 용액과 본 발명의 지혈제를 혼합한 후 시간에 따른 흡광도의 변화를 UV/VIS 분광광도계로 측정함으로서 확인할 수 있으며 혈액 응고 능력은 리-화이트(Lee-White) 방법으로 시험관 내에서 본 발명의 지혈제를 사람의 혈장과 직접 혼합하여 혈액의 응고 정도를 육안으로 측정함으로서 확인할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명하고자 하나, 하기 실시예는 본 발명을 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

[실시예 1]

피브리노겐(칼바이오켐, 미국) 24mg을 100mM 인산염완충액(pH 7.4) 100ml와 12mM MgCl₂용액에 녹여 완전히 용해한 다음 1.2mg/ml 되도록 농축하였다. 농축 용액 5ml에 MgCl₂와 ATP가 각각 12mM과 1mM 되도록 첨가한 피브리노겐 용액을 기질로서 준비하였다.

표준 물질로서 지혈제인 트롬빈(시그마사, 미국)은 기질에 사용한 동일 완충용액으로 1NIHU/ml가 되도록 희석하고, 카제인 키나제-II(casein kinase-II, Boehringer Mannheim사, 독일)은 동일 완충액으로 1mU/ml 되도록 희석하여 준비하였다. 스핑고신(Sphingosine, 시그마사, 미국)은 최소량의 에탄올에 녹인 다음 동일 완충용액으로 0.1mg/ml 되도록 희석하여 준비하였다.

트롬빈과 본 발명의 제제에 의한 피브린 크로트 형성 정도를 측정하기 위하여 피브리노겐 용액 0.7ml : 피브리노겐 용액 0.7ml 및 트롬빈 용액 0.1ml(최종농도 0.1 NIHU/ml) ; 피브리노겐 용액 0.7ml, 트롬빈 용액 0.1ml(최종농도 0.1 NIHU/ml) 및 카제인 키나제-II 용액 0.1ml(최종농도 0.1mU/ml) ; 피브리노겐 용액 0.7ml, 트롬빈 용액 0.1ml(최종농도 0.1 mU/ml), 카제인 키나제-II 용액 0.1ml(최종농도 0.1 mU/ml) 및 스핑고신(최종농도 10㎍/ml)을 각각 혼합한 후 50mM 인산염 완충용액(pH 7.4)으로 총 부피를 각각 1ml이 되도록 조정하고 UV/VIS 분광광도계(Beckmann사 모델 DU-70 spectrophotometer, 미국)를 사용하여 37℃에서 시간에 따른 633nm의 흡광도 변화를 각각 측정하였다(제1도 참조).

제1도에서 -○-는 피브리노겐 용액 0.7ml, -●-는 피브리노겐 용액 0.7ml와 트롬빈 용액 0.1ml, -▽-는 피브리노겐 용액 0.7ml, 트롬빈 용액 0.1ml와 카제인 키나제-II 용액 0.1ml, -▼-는 피브리노겐 용액 0.7ml, 트롬빈 용액 0.1ml, 카제인 키나제-II 용액 0.1ml와 스핑고신0.1ml에 각각 완충용액을 첨가하여 1ml 로 만든 용액으로 측정한 결과이다.

상기 실험 결과 트롬빈, 카제인 키나제-II 및 스핑고신의 조성물이 트롬빈 단독으로 사용하거나 트롬빈 및 카제인 키나제-II 조성물을 사용한 경우보다 더 많은 양의 피브린 크로트가 형성되었음을 알 수 있다.

[실시예 2]

실시예 2에서 이용한 제제는 실시예 1에서 사용한 동일한 농도의 제제를 이용하였으며 사용한 완충용액은 50mM 인산염(pH 7.4) 완충용액과 완충용액에 1mM ATP 와 12mM MgCl₂농도로 첨가된 50mM 인산염(pH 7.4) 완충용액을 사용하여 ATP의 최종농도가 0.02mM되도록 조절하였다. 리-화이트(Lee-White) 방법을 변형한 것으로 0.8ml로 조제한 실험 제제에서 0.1ml를 취하여 사람의 혈액 1.5ml에 첨가한 후 관찰하였다. 1번 시험관에는 완충용액만 0.1ml를, 2번 시험관에는 완충용액 0.6ml 와 표준물질로 트롬빈 0.2ml를 혼합한 용액에서 0.1ml를, 3번 시험관에는 완충용액 0.4ml, 트롬빈 0.2ml 와 카제인 키나제-II 0.2ml를 혼합한 용액에서 0.1ml를, 4번 시험관에는 완충용액 0.4ml, 트롬빈 0.2ml, 스핑고신 0.2m1, 트롬빈 0.2ml, 카제인 키나제-II 0.2ml, 스핑고신 0.2ml 를 혼합한 용액에서 0.1ml 를, 그대로 6번 시험관에는 완충용액 0.6ml, 스핑고신 0.2ml 를 혼합한 용액에서 0.1ml 를, 7번 시험관에는 완충용액 0.4ml, 카제인 키나제-II 0.2ml, 스핑고신 0.2ml 를 혼합한 용액에서 0.1ml 를 취하여 각 시험관에 넣은 후 시험관을 기울여 보아 응혈을 확인하였다.

그 결과 약 10분 후 정상의 혈액인 1번 시험관과 6번, 7번 시험관은 응고되지 않는 반면에 트롬빈, 카제인 키나제-II 또는 본 발명의 지혈제가 첨가되어 있는 시험관인 2버 내지 5번 시험관은 응혈되어 있음이 관찰되었으며, 특히 본 발명의 지혈제를 첨가한 5번 시험관의 혈액이 2, 3, 4번 시험관의 혈액보다 빠르게 응고됨을 확인하였다.

상기 시험관들을 10분동안 실온에 방치한 후 원심분리기로 1,000rpm 에서 5분간 원심분리한 결과 1번, 6번과 7번 시험관의 혈액은 혈장이 혈구 등의 침전물로부터 현저히 분리되었으나 2번, 3번, 4번, 특히 본 발명의 지혈제를 첨가한 5번 시험관은 혈장과 혈구의분리가 잘 이루어지지 않아 혈장 부분에 적혈구 등의 물질이 남아있는 것이 관찰되었다(제2도 참조).

[실시예 3]

본 발명의 제제에 의한 트롬빈 크로팅 타임(thrombin clotting time)을 측정하기 위하여 10×75mm 유리관에 혈소판 풍부혈장(platelet rich plasma) 0.4ml를 넣고 여기에 본 발명의 제제를 실시예 2에서 제조하여 사용한 최종 용액 0.8ml에서 0.1ml를 취하여 잘 섞어준 다음 피브린이 형성되는 시간을 측정하여 비교한 결과, 본 발명의 제제가 트롬빈만에 의한 경우보다도 훨씬 빠르게 피브린 크로트(fibrin clot)가 형성되었다.

[실시예 4]

급성독성 시험으로서 마우스(ICR)의 복강에 본 발명의 조성물을 투여하였다. 실시예 1에서 사용한 본 발명 조성물의 용액을 10ml/kg 체중으로 환산하여 해당되는 용량을 인산염 완충용액으로 제조한 다음 암컷, 수컷 각각 5마리씩 복강에 투여한 후 7일간 치사수 및 임상 증상을 관찰하고, 7일후 부검하여 육안으로 병변 관찰하였다. 시험 결과를 요약하면 아래와 같다.

1) 투여후 7일간 특별한 관찰 소견은 없음

2) 부검시 육안 소견

1. 피부 : 정상

2. 눈 : 정상

3. 간장 : 정상

4. 비장 : 정상

5. 신장 : 정상

6. 소화기계 : 정상

7. 생식 및 비뇨기계 : 정상

8. 심장 : 정상

9. 폐장 : 정상

10. 흉선 : 정상

종합 부검 소견으로 이상없는 것으로 사료됨.

[실시예 5]

마우스의 하대동맥에 주사바늘을 이용하여 동맥으로부터 출혈이 되도록 상처를 준 후에 실시예 1에서 사용한 본 발명 조성물의 용액을 적셔둔 솜을 상처부위에 가만히 2분간 놓아둔 후 표준물질로서 동일 방법으로 사용한 트롬빈 용액과 비교하였다. 2분간 본 발명의 조성물을 처리한 동맥의 상처는 조직봉합으로 출혈이 정지됨은 물론 상처난 동맥을 통하여 혈액이 흐르고 있음을 관찰하였으나, 트롬빈을 사용한 대조 마우스의 혈관에서는 심장의 혈압으로 여겨지는 출혈이 계속 지속되고 있음을 관찰하였다.

[실시예 6]

사람 혈액 10ml에 154mM NaCl을 포함하는 인산염 완충용액(pH 7.4)을 동량 넣어 잘 섞어준 다음 1,800rpm, 20℃에서 슈크로스(sucrose) 용액속에서 밀도에 따른 원심분리를 20분간 하여 임파구(lymphocyte)를 분리하였다. 분리한 세포는 다시 동일한 인산염 완충용액 50ml에 섞어준 후에 1,600rpm, 4℃에서 5분간 원심분리하여 불순물을 제거하였다. 임파구(lymphocyte)가 3×10⁵cell/ml 되도록 한 용액 100μ1를 취하고 여기에 카제인 키나제-II 용액 50μ1와³H-티미딘(Thymidine) 50μ1를 넣어준 후 3일 동안 방치한 후³H-티미딘(Thymidine)의 양을 측정하였다. 표준물질로서 콘카나발린 A(Concanavalin A)와 인터루킨-2(interleukin-2)을 동시에 사용하였다. 표 1에서 나타난 바와 같이 카제인 키나제-II는 혈액중의 임파구 세포에 대해서는 영향을 미치지 않고 있다는 결과를 얻었다.

상기 실험 결과 본 발명의 트롬빈, 카제인 키나제-II 및 스핑고신 또는 스핑고신 유도체를 포함하는 지혈제 조성물은 기존의 트롬빈 제제보다 더 빠른 시간내에 더 많은 양의 피브린 크로트를 형성하는 우수한 지혈효과를 갖고 있다. 또한 이러한 지혈효과외에 조직봉합의 효과까지 나타내고 있다.

따라서 본 발명의 지혈제 조성물은 인체 밖에서 지혈제로 사용할 수 있을 뿐만 아니라 위궤양 등 인체내 출혈에 대한 지혈제로서도 우수한 효과를 나타낸다.

Claims

트롬빈, 카제인 키나제-II(casein kinase-II) 및 스핑고신 유도체(Sphingosine derivatives)를 포함하는 것을 특징으로 하는 지혈제 조성물.
제1항에 있어서, 스핑고신 유도체는 스핑고신(Sphingosine, 2-amino-4-octadecene-1, 3-diol) 인 것을 특징으로 하는 지혈제 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 카제인 키나제-II의 첨가량이 0.01mU/ml 내지 1mU/ml 이고, 스핑고신의 첨가량이 10ng/ml인 지혈제 조성물.
제1항의 조성물을 유효성분으로 하는 지혈 보조제.
제1항의 조성물을 유효성분으로 하는 혈관의 조직봉합 보조제.
제1항의 조성물을 유효성분으로 하는 혈우병 치료제 혹은 보조제.