JPH10501554A - 新規な止血剤組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 トロンビン、カゼインキナーゼII及びスフィンゴシン又はスフィンゴシン誘導体を含む止血剤組成物は、止血又は血液凝固活性だけでなく、組織縫合活性に優れる。

Description

【発明の詳細な説明】 新規な止血剤組成物 技術分野 本発明は、添加剤を含む新規な止血剤組成物に関し、より詳細には、迅速な止 血及び血液凝固を可能にする、トロンビンと、カゼインキナーゼII及びスフィン ゴシン又はスフィンゴシン誘導体を含む止血剤組成物に関する。 背景技術 止血剤は、３つの複合的なメカニズム、即ち凝塊の形成と、傷害された血管の 迅速な狭窄と、血管の傷口にプラグを形成する血小板の凝集とよりなる。 凝塊は、１０個以上の各種タンパク質と、カルシウム２価イオン及びトロンボ プラスチンが関与する一連のトランスフォーメーションにより形成される。 出血が生ずると、高可溶性のフィブリノーゲンがトロンビンのタンパク質分解 作用により不溶性のフィブリン単一体で転換され、かつ、フィブリン単一体は、 自発的に凝塊を形成するに関与し、ここに、因子ＸIIIａが作用して血小板を凝 集させ、血管の傷口にプラグを形成する。 フィブリノーゲンのタンパク質に結合されているリン酸塩基がトロンビンの ゲル化に影響を及ぼすと報告されている（Forsberg，P．O．Thromb．Res.，53， 1-9,1989）。また、フィブリノーゲンをリン酸化させることができる酵素として は、プロテインキナーゼＡ（Engstrom，L.，Edlund，B.，Rangnarsson，U.,Dahl qvist-Edberg，U.，and Humble，E.，Biochem．Biophys．Res．Commun.，96,150 7，1980）、プロテインキナーゼＣ、カゼインキナーゼＩ（Itarts，E.，Plana,M .，Guasch，M．D.，and Martos，C.，Biochem．Biophys，Res．Commun.，117,63 1-636，1983）、及びカゼインキナーゼII（Humble，E.，Heldin，P.，Forsberg, P．O.，and Engstrom，L.，Arch，Biochem．Biophys.，241，225-231，1985）の ような多様なプロテインキナーゼが挙げられている。 フィブリノーゲンのリン酸化がトロンビンのゲル化に与える影響は、フィブリ ノーゲンのリン酸基に用いられるキナーゼの種類によって異なる。また、リン酸 化されたフィブリノーゲンは、リン酸化に関連するキナーゼの種類に関わらず、 プラスミンによりほとんど分解されないと報告されている（Martin，S．C.，et al.，Thromb．Res.，61，243-252，1991）。 細胞の成長及び分化に重要な役割をするスフィンゴシンは、スフィンゴ脂質の 一種であって、カゼインキナーゼIIの活性を増加させる能力を有すると報告され ている（McDonald，O.Bradley;Hannun，Yusuf A.;Reynolds，E．Hugh and Sahyo un，Naji，Journal of BiologiCal Chem.，Vol．266，No．32，pp 21773-21776 ，1991）。 有効な止血剤として要求される特性は、手術による過多の出血又は出血部位に おける病原菌の感染を防ぐために、できるだけ早く出血を抑制することである。 トロンビン製剤は、商業的に利用されている各種の止血剤組成物のうち、止血剤 として最も広く使用されている。 本発明者らは、従来の止血剤組成物より早く止血させることができる有効な止 血剤組成物を開発するために、鋭意研究を行った結果、トロンビン含有止血剤組 成物が、タンパク質リン酸化酵素中の一つであるカゼインキナーゼIIと、スフィ ンゴシン又はスフィンゴシン誘導体を一緒に含有する場合、短時間に止皿活性を 示すことができることを見だし、本発明を完成することに至った。 発明の開示 従って、本発明の目的は、フィブリン凝塊の形成を促進させることができる特 定の添加剤を含む止血剤組成物を提供することにある。 本発明の上記目的は、トロンビン、カゼインキナーゼII及びスフィンゴシン又 はスフィンゴシン誘導体を含む止血剤組成物により達成することができる。 図面の簡単な説明 添付された図面を参照として、本発明をより詳細に説明する。 図１は、各種材料を含有する止血剤組成物の止血活性を示すグラフである。 ここで、−○−は、フィブリノーゲン溶液であり、−●−は、トロンビンを含 有するフィブリノーゲン溶液であり、−▽−は、トロンビン及びカゼインキナー ゼIIを含有するフィブリノーゲン溶液であり、−▼−は、スフィンゴシン、カゼ インキナーゼII及びトロンビンを含有するフィブリノーゲン溶液である。 図２は、各種材料を含有する組成物の血液凝固活性を示す。 ここで、試験管１は、緩衝溶液Ａを含有するものであり、試験管２は、緩衝溶 液Ａ（０．４ｍｌ）、緩衝溶液Ｂ（０．２ｍｌ）及びトロンビン溶液（０．２ｍ ｌ）の混合物を含有し、試験管３は、緩衝溶液Ａ（０．２ｍｌ）、緩衝溶液Ｂ（ ０．２ｍｌ）、トロンビン溶液（０．２ｍｌ）及びカゼインキナーゼII溶液（０ ．２ｍｌ）の混合物を含有し、試験管４は、緩衝溶液Ａ（０．２ｍｌ）、緩衝溶 液Ｂ（０．２ｍｌ）、トロンビン溶液（０．２ｍｌ）及びスフィンゴシン溶液（ ０．２ｍｌ）の混合物を含有し、試験管５は、緩衝溶液Ｂ（０．２ｍｌ）、トロ ンビン溶液（０．２ｍｌ）、カゼインキナーゼII溶液（０．２ｍｌ）及びスフィ ンゴシン溶液（０．２ｍｌ）の混合物を含有し、試験管６は、緩衝溶液Ａ（０． ４ｍｌ）、緩衝溶液Ｂ（０．２ｍｌ）及びスフィンゴシン溶液（０．２ｍｌ）の 混合物を含有し、試験管７は、緩衝溶液Ａ（０．２ｍｌ）、緩衝溶液Ｂ（０．２ ｍｌ）、カゼインキナーゼII溶液（０．２ｍｌ）及びスフィンゴシン溶液（０． ２ｍｌ）の混合物を含有する。各サンプルの量は、０．８ｍｌの量である。 本発明の上記目的、他の目的、特徴及び適用は、本技術分野において通常の知 識を有する者なら、下記の詳細な説明から明らかであろう。 発明の詳細な説明 本発明による止血剤組成物は、トロンビンと、カゼインキナーゼII及びスフィ ンゴシン又はスフィンゴシン誘導体を含む。 本発明において、タンパク質リン酸化酵素であるカゼインキナーゼIIは、フィ ブリノーゲンのアミノ酸をリン酸化させる。このリン酸化されたフィブリノーゲ ンは、トロンビンの作用により容易にフィブリンで転換される。 ところが、トロンビン及びカゼインキナーゼIIを含有する組成物に、スフィン ゴシン又はスフィンゴシン誘導体を添加する場合、スフィンゴシン又はスフィン ゴシン誘導体がトロンビン及びカゼインキナーゼIIの活性を増加させ、これによ り、スフィンゴシン又はスフィンゴシン誘導体を有しない組成物より短時間に出 血を阻止することかできる。 スフィンゴシン誘導体は、Ｏ−ホスホリルエタノールアミン、スフィンゴミエ リン、グリコシルスフィンゴシン、ガラクトシルスフィンゴシン、スフィンゴシ ンリン酸塩、エリトロスフィンゲニン、トレオスフィンゲニン、ステアロイル− スフィンゴミエリン、セラミド、セラミドジヘキソシド、セラミドテトラヘキソ シド、アシアルロガングリオシド、ジシアルロガングリオシド、トリシアルロガ ングリオシド、モノシアルロガングリオシド等を含むことができるが、これらに 限定されるものではない。これらのスフィンゴシン誘導体は、単独又は混合して 使用してもよい。 本発明による組成物に添加することができるトロンビンの量は、０．１ＮＩＨ Ｕ／ｍｌ以上であるとよい。トロンビンの単位″ＮＩＨＵ″は、アメリカ合衆国 （ＵＳ）の国際健康協会（National Institute of Health;NIH，Bethesda，USA ）標準単位であり、１ＮＩＨＵは、１．１乃至１．３ＩＵのトロンビンに相当す る。 本発明による組成物に添加することができるカゼインキナーゼIIの量は、組成 物の総量に対して、０．０１ｍＵ／ｍｌ乃至１ｍＵ／ｍｌ、好ましくは、約０． ０１ｍＵ／ｍｌである。カゼインキナーゼIIの１単位は、３７℃で１分間１μmo leのリン酸塩をＡＴＰから基質への伝達を促進する酵素活性として定義される。 本発明による組成物に添加することができるスフィゴシン又はその誘導体の量 は、組成物の総量に対して、０．０１μｇ／ｍｌ乃至０．１μｇ／ｍｌ、好まし くは、略０．０５μｇ／ｍｌである。 本発明による組成物は、製薬分野において公知された方法により、例えば、錠 剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁剤等の多様な剤形で使用することができる。 本発明による組成物は、目的、対象部位又は剤形の形態により多様な経路で投 与することができ、このような経路は、本技術分野における専門家なら容易に選 択することができる。 本発明の組成物は、人体の外表面において止血剤又は血液凝固剤として使用す ることができるとともに、胃潰瘍のような人体内の出血に対しても出血剤又は血 液凝固剤として使用することができる。また、血友病治療剤又はその補助剤とし て使用することができる。さらに、従来の止血剤組成物の補助剤たけでなく、止 血剤組成物として使用することができる。しかも、細菌、菌類又はビルスの成長 抑制剤だけでなく、傷害された血管の縫合剤としても使用することができる。 本発明の組成物の作用によるフィブリン凝塊の形成程度は、フィブリノーゲン 溶液と本発明の組成物との混合物における吸光度の変化を測定することにより、 確認することができる。吸収度は、UV/VIS分光光度計を用いて測定する。また、 組成物の凝集活性は、Lee-White法により本発明の組成物と人間の血漿とを混合 することにより、視覚により観察することができる。 発明の好ましい実施形態 本発明を下記の実施例により具体化するが、これらの実施例はただ本発明を例 示するためのものであって、請求範囲に記述された本発明の範囲を制限するもの ではない。実施例に記載されたパーセントや部は、別途に掲げない限り、重量に 基づくものである。 （実施例１） フィブリノーゲン（CalBiochem，USA）（２４ｍｇ）を、１００ｍＭのリン酸 塩緩衝液（ｐＨ７．４）と１２ｍＭのＭｇＣｌ₂との混合物（１００ｍｌ）に入 れて溶解した後、最終濃度が１．２ｍｇフィブリノーゲン／ｍｌになるように蒸 発させた。フィブリノーゲン溶液５ｍｌにＭｇＣｌ₂とＡＴＰを各々１２ｍＭと １ｍＭの濃度になるように添加し、基質溶液とした。 トロンビン（Sigma社，USA）及びカゼインキナーゼII（Boehringer Mannheim, Germany）は、各々１ＮＩＮＵ／ｍｌ、１ｍＵ／ｍｌの濃度になるように１００ ｍＭの緩衝溶液（ｐＨ７．４）で希釈させた。スフィンゴシン（Sima社、USA） は、最小量のエタノールに溶解した後、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度になるように１ ００ｍＭの緩衝溶液で希釈させた。 トロンビン又は本発明の組成物により形成されたフィブリン凝塊を測定するた めに、４つのサンプルを作製した。フィブリノーゲン溶液０．７ｍｌ：フィ ブリノーゲン溶液０．７ｍｌ＋トロンビン溶液０．１ｍｌ（最終農度は０．１Ｎ ＩＨＵ／ｍｌ）；フィブリノーゲン溶液０．７ｍｌ＋トロンビン溶液０．１ｍ １（最終農度は、０．１ＮＩＨＵ／ｍｌ）＋カゼインキナーセII溶液０．１ｍｌ （最終濃度は、０．１ｍＵ／ｍｌ）；フィブリノーゲン溶液０．７ｍｌ＋トロ ンビン溶液０．１ｍｌ（最終農度は０．１ｍＵ／ｍｌ）＋カゼインキナーゼII溶 液０．１ｍｌ（最終濃度は、０．１ｍＵ／ｍｌ）＋スフィンゴシン（最終濃度は 、１０μｇ／ｍｌ）。５０ｍＭのリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７．４）をこれらのサ ンプルに添加して、全てのサンプルの総嵩を各々１ｍｌになるように調整した。 これらのサンプルを３７℃で反応させ、ＵＶ／ＶＩＳ分光光度計（Beckemann 社、Model No．Du-70、USA）を用いて０、５、１０、１５、２０、２５、３０分 における６３３ｎｍの吸光度を測定した。 その結果を図１に示す。 図１において、−○−は、フィブリノーゲン溶液であり、−●−は、トロンビ ンを含有するフィブリノーゲン溶液であり、−▽−は、トロンビン及びカゼイン キナーゼIIを含有するフィブリノーゲン溶液であり、−▼−は、トロンビン溶液 、カゼインキナーゼII及びスフィンゴシンを含有するフィブリノーゲン溶液であ る。 図１から明らかなように、トロンビン、カゼインキナーゼII及びスフィンゴシ ンを含有するフィブリノーゲン溶液は、トロンビンを単独で含有するか、トロン ビン及びカゼインキナーゼIIを含有するフィブリノーゲン溶液よりもっと多い量 のフィブリン凝塊を形成する。 （実施例２） 本発明の組成物の血液凝固活性を評価するために、２種類の緩衝溶液を使用し た以外には、実施例１と同様の材料を使用した。即ち、緩衝溶液Ａは、５００ｍ Ｍのリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７．４）、緩衝溶液Ｂは、１ｍＭのＡＴＰと１２ｍ ＭのＭｇＣｌ₂を含有する５０ｍＭのリン酸塩緩衝溶液（ｐＨ７．４）である。 下記サンプル２乃至７は、各々ＡＴＰの最終濃度が０．０２ｍＭになるように調 整した。 サンプルの血液凝固活性は、変形されたLee-White方法により測定した。すな わち、７つの試験管に人間の血液１．５ｍｌを添加し、下記のサンプル１乃至７ から各々０．１ｍｌを取って各試験管に添加した。サンプル１、緩衝溶液Ａ；サ ンプル２、緩衝溶液Ａ（０．４ｍｌ）と緩衝溶液Ｂ（０．２ｍｌ）及びトロンビ ン溶液（０．２ｍｌ）の混合物；サンプル３、緩衝溶液Ａ（０．２ｍｌ）と緩衝 溶 液Ｂ（０．２ｍｌ）とトロンビン溶液（０．２ｍｌ）及びカゼインキナーゼII溶 液（０．２ｍｌ）の混合物；サンプル４、緩衝溶液Ａ（０．２ｍｌ）と緩衝溶液 Ｂ（０．２ｍｌ）とトロンビン溶液（０．２ｍｌ）及びスフィンゴシン溶液（０ ．２ｍｌ）の混合物、サンプル５、緩衝溶液Ｂ（０．２ｍｌ）とトロンビン溶液 （０．２ｍｌ）とカゼインキナーゼII溶液（０．２ｍｌ）及びスフィンゴシン溶 液（０．２ｍｌ）の混合物、サンプル６、緩衝溶液Ａ（０．４ｍｌ）とスフィン ゴシン溶液（０．２ｍｌ）の混合物、サンプル７、緩衝溶液Ａ（０．２ｍｌ）と 緩衝溶液Ｂ（０．２ｍｌ）とカゼインキナーゼII溶液（０．２ｍｌ）及びスフィ ンゴシン溶液（０．２ｍｌ）の混合物。 上記試験管らを室温に放置した。１０分後、血液の凝固を観察するために、試 験管を傾けた。 試験管１、６及び７は、凝固されていないが、トロンビンを含有する試験管２ 乃至５は凝固が示されていることが観察された。これらの試験管のうち、特に本 発明の組成物を含有する試験管５が早い血液凝固を示した。 上記試験管らを５分間１０００ｒｐｍで遠心分離した結果、試験管１、６及び ７は、沈殿された血球から血漿が完全に分離されたが、試験管２乃至５は、若干 分離されるか、分離されなかった。特に、本発明の組成物を含有する試験管５は 、全然分離されなかった。 その結果を図２に示す。 （実施例３） 本発明の組成物によるトロンビン凝血時間を測定するために、７つの試験管（ １０×７５ｍｍ）に血小板の豊かな血漿０．４ｍｌを入れ、実施例２の７つの各 サンプルから０．１ｍｌを取って添加した。試験管を充分に振った後、フィブリ ン凝塊が形成されるに必要な時間を測定した。その結果、試験管５は２分±２０ 秒内にフィブリン凝塊を形成する反面、試験管２は、１０分±３０秒内にフィブ リン凝塊を形成した。 従って、本発明の組成物が比較例の組成物より約５倍ほど早くフィブリン凝塊 を形成した。 （実施例４）急性毒性 実施例１で作製された本発明の組成物を、１０ｍｌ／ｋｇの量で１０匹のＩＣ Ｒねずみ（雄雌、各々５匹）の腹腔に投与した。投与後７日日、ねずみの致死数 及びねずみの行動を観察した。７日後、ねずみを犠牲させ剖検し、肉眼でねずみ の器官を観察した。実験結果を要約すると、次の通りである。 １）投与後７日間、死んだねずみはないし、ねずみの行動も正常であった。 ２）剖検意見 皮膚 ：正常 目 ：正常 肝臓 ：正常 脾臓 ：正常 腎臓 ：正常 消火器系：正常 生殖及び泌尿器系：正常 心臓 ：正常 肺臓 ：正常 胸線 ：正常 （実施例５） ２匹のねずみの管状動脈に、出血が生ずるように注射器を用いて傷つけ、各ね ずみの傷口を、実施例１の本発明の組成物又はトロンビン溶液（対照）を湿した 綿で２分間覆った。本発明の組成物を処理したねずみの傷口は、出血が止めるだ けでなく、傷害された動脈が縫合され動脈内に血液が流れることが観察された。 反対に、対照ねずみの傷口は出血し続けた。 （実施例６） 人間の血液１０ｍｌに１５４ｍＭのＮａＣｌを含有するリン酸塩緩衝溶液（ｐ Ｈ７．４）を同量添加し、この混合物を２０℃で２分間１８００ｒｐｍでショ糖 密度勾配（１．０７７ｇ／ｌ）遠心分離を行って、リンパ球を分離した。 前記リンパ球を、同一の緩衝溶液５０ｍｌに混合し、４℃で５分間遠心分離（ １６００ｒｐｍ）を行って不純物を除去した。リンパ球溶液（３×１０⁵ｃｅｌ ｌｓ／ｍｌ）１０μｌに、カゼインキナーゼII溶液（１０ｍＭ、１ｍＭ又は０． １ｍＭ）５０μｌ及び³Ｈ−チミジン５０μｌを添加した。この混合物を室温に ３日間放置した後、毎日放射能を測定した。比較例として、カゼインキナーゼII （ＣＫ−II）の代わりに、コンカナバリンＡ（″Ｃｏｎ Ａ″）（１０μｇ／ｍ ｌ）とインターロイキン−２（″ＩＬ−２″）（５０ＩＵ／ｍｌ）の混合物を使 用した。 その結果を表１に示す。 表１から明らかなように、カゼインキナーゼIIはリンパ球の増殖には影響を与 えない。 上述したように、トロンビン、カゼインキナーゼII及びスフィンゴシンを含有 する本発明による止血剤組成物は、トロンビンたけを含有する従来の止血剤組成 物より短時間にフィブリン凝塊を形成する。さらに、本発明による組成物は、止 血活性だけでなく、組織縫合活性も示す。 本発明の組成物は、人体の外表面において止血剤又は血液凝固剤として使用す ることができるとともに、胃潰瘍のような人体内の出血に対しても出血剤又は血 液凝固剤として使用することかできる。また、血友病治療剤又はその補助剤とし て使用することかできる。さらに、従来の止血剤組成物の補助剤だけでなく、止 血剤組成物として使用することができる。しかも、細菌、菌類又はビルスの成長 抑制剤だけでなく、傷害された血管の縫合剤としても使用することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 １９９５／３９４５８ (32)優先日 1995年11月２日 (33)優先権主張国 韓国（ＫＲ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＪＰ，ＵＳ (72)発明者 ムーン ヒ ハン 大韓民国、タエジョン 300―200、ドング −グ、ヨングジュン−ドング、シンドング −Ａ アパートメント ８―1003

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．トロンビン、カゼインキナーゼII及びスフィンゴシン又はスフィンゴシン誘 導体を含む止血剤組成物。 ２．トロンビン、カゼインキナーゼII及びスフィンゴシンを含む請求項１記載の 組成物。 ３．カゼインキナーゼIIの添加量が組成物の総量に対して０．０１ｍＵ／ｍｌ乃 至１ｍＵ／ｍｌであり、スフィンゴシン又はスフィンゴシン誘導体の添加量が組 成物の総量に対して１０ｎｇ／ｍｌ乃至１００ｎｇ／ｍｌであることを特徴とす る請求項１記載の組成物。 ４．カゼインキナーゼIIの添加量が組成物の総量に対して０．０１ｍＵ／ｍｌ乃 至１ｍＵ／ｍｌであり、スフィンゴシンの添加量が組成物の総量に対して１０ｎ ｇ／ｍｌ乃至１００ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項２記載の止血剤組 成物。 ５．トロンビン、カゼインキナーゼII及びスフィンゴシン又はスフィンゴシン誘 導体を含む、胃潰瘍治療用薬剤組成物。 ６．トロンビン、カゼインキナーゼII及びスフィンゴシン又はスフィンゴシン誘 導体を含む止血補助剤組成物。 ７．トロンビン、カゼインキナーゼII及びスフィンゴシン又はスフィンゴシン誘 導体を含む血管縫合剤組成物。 ８．トロンビン、カゼインキナーゼII及びスフィンゴシン又はスフィンゴシン誘 導体を含む血友病治療剤組成物又はその補助剤組成物。 ９．トロンビン、カゼインキナーゼII及びスフィンゴシン又はスフィンゴシン誘 導体を含む、微生物の成長抑制剤組成物。