PT97539B - Estabilizacao de somatotropinas e outras proteinas por modificacao dos residuos sw cisteina - Google Patents

Estabilizacao de somatotropinas e outras proteinas por modificacao dos residuos sw cisteina Download PDF

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Description

ANTECEDENTES DO INVENTO
O presente invento refere-se a novas proteínas e/ou polipéptidos naturais ou recombinantes, derivados, em que se a referida proteína e/ou polipéptido contém um ou mais resíduos cisteína, α referida resídua é derivado coro substituintes como aqui definidos» Adicionalmente, proteínas que não contenham a cisteína nas suas formas naturais podem ser alteradas, via técnicas de mutagénese específica de sítio, por exemplo, de modo a introduzir cisteínas em sítios vantajosos s, posteriorments, derivar aCs) referidaCs) cisteínaCs)=
Embora as técnicas de biologia molecular tenham aumentado dramaticamente a disponibilidade de muitas proteínas e/ou polipéptidos (a seguir referidos como proteínas), a utilização terapêutica das referidas proteínas é muitas vezes impedida por outros factores» tais como agregação» degradação proteolítica, baixa biodisponibilidade e propriedades físicas que impossibilitam formulações eficazes» No presente invento os grupos sulfidri lo altamente reactivos dos resíduos de cisteína, quer nas protsí nas naturalments derivadas qusr nas recombinanteissnte derivadas, são derivados para modificar a carga eficaz na superfície da proteína, e por conseguinte o ponto isosléctrico, ou para ligar um polimero modificador de superfície à. proteína»
A vantagem da modificação da carga do ponto isosléctri co é bem conhecida devido á minimizaçio da agregação da proteína ss o pH de uma formulação de proteína for siqnificativamente diferente do do ponto isoeléctrico» Por conseguinte, a manipulação do ponto isosléctrico fornece uma técnica para minimizar a agregação»
Um outro mecanismo para melhorar, também, a formulação de proteína é por conjugação da proteína com compostos de derivação, que incluem, «as não estão limitados a, polietilenoglicol e propilenog1icol. Alguns destes benefícios reconhecidos incluemκ inferior imunogenicidade s antigenícidade, duração da acção aumentada, e propriedades farmacocinéticas alteradas. EF.M. Veronese, Chimicac?ggi <1989) 533.
Até agora, a ligação de moléculas polimáricas a proteínas era principalmente através de lisina ou outros aminoácidos básicos. Isto era realizado com agentes de alquilação tais como derivados de triasina, sais de diazónio ou agentes de acilação sctivss tais como derivados do ácido succínico,. Estas reacçSes eram difíceis de controlar e ocorriam, frequer?temente, perdas significativas da actividade biológica devido ás reacções com aminoácidos, essenciais, nas proteínas Evsr F. F, Davis et al Polymsr <1979) 2® 3571»
Fm contraste, o presente invento proporciona um processo sslsctivo para modificar os resíduos de cistsina menos abundantes quer ocorrendo nsturaimsnte na proteína quer incorporados na proteína por processos tais como outagéness específica de sítio.
é um objectivo do presente invento proporcionar composições de proteínas derivadas, proteínas qus incluem mas não estão limitadas a somatotropinas (mamíferos, aves e peixes),
IGF—í s IGF—2 de mamífero, interleuquinas e interferSes, pró—uroquinass, factor de necrose de tumor e anti-trombina III que são biologicamente eficazes e ainda estáveis para se administrarem. Além disso, como anteriormente indicado, as referidas proteínas não estão limitadas àquelas proteínas que π-a sua forma natural contêm resíduoCs) da cistsina, uma vbz que são usadas técnicas de mutagénese específica de sítio para introduzir a cisteína em sítios vantajosos nas referirias proteínas, é um outro objectivo do presente invento proporcionar composições de proteínas naturais e/ou recombinantes, biologicamente activas, que são adequadas para administração parentérica, compreendendo as referidas composições uma quantidade biologicamente activa de uma somatotropina (forma humana ou animal) derivada ou outra proteína ou seu sal farmacológica e farmaceuticamente aceitável num veiculo liquido ou sólido farmacológica e farmaceuticamente aceitável, é um outro objectivo do presente invento proporcionar novas composições que irão permitir a modificação de quaisquer proteínas contendo cisteína. Por selecção judiciosa da natureza e número de grupos funcionais ionizáveis e/ou o tamanho e natureza do polímero modificador de superfície é produzida uma gama de proteínas derivadas com propriedades físicas distintamente diferentes»
Estes s outros objectivos do invento tornar-se-ão mais evidentes pela descrição mais detalhada do invento proporcionada abaixo»
SUMÁRIO DO INVENTO presente invento rsfsrs-se a novas proteínas naturais ou recombinantes, derivadas, que incluem, mas não estão limitadas a somatotropinas, IGF-i e IGF-2, interleuquinas, interferSes, pró-uroquinase, factor de necrose de tumor e anti-trombins III, em qus pelo menos um resíduo de cisteína incorporado ou que ocorre naturalmente na proteína ê derivado com substituintes seleccionados a partir de CCH^CO^R-, ), íCH^CONHR» ),
2» * .-À.
l CH C COR?) (CH9)( COR7s) 3 , ECH--CONHCH í COR?) < CH2) χ (COB-) 3 ou
CCH^CONHÍCH^COR^Iis em que R, é CH^CH^-CQCH^CKJ. ,ΟΜ©? FU e FU aÍ. .£. íi J. aU Z. .-t Z. y Z. r.'« são H ou R.,? R, é NHCí-UCfU(OCH^QU>.,QMe ou QCHnCH^<0CHoCH^)tí0M®5 X é um número inteiro de 1 a. 3 e Y & ua número inteiro de 1® a 3ô®s lbos a condição de que E.~ e R_. não possam ser simultaneamente Hg desde que se o(s) rssiduoís) de cisteína, derivado(s)da referida proteína ou polipéptido formaCm) uma ligação dissulfureto antes da derivação, ambas as cisteínas possuem o mesmo derivado sulfidrilo após o procedimento ds derivação estar completo. Adicionalmente, coei algumas proteínas contendo mais do que uma ligação dissulfureto, ê possivel clivar selectivaroente uroa ou mais das referidas ligaçSss. dissulfureto e aquelas ligaçSes dissulfureto que são clivadas selectivaroente podem ser derivadas sea afectar os restantes resíduos de cisteína. Quando os dissulfuretos são clivados sequencialments © possivel derivar diferentes cisteínas coo mais do que uma composição» Adicionalmente, quando a referida proteína possui uma cisteíns deseroparelhada, esses resíduos são derivados sem um passo redutor, presente invento proporciona também novos compostos de derivação, compreendendo os referidos compostos o seguintes ZCrUCCUR.,, 2CH^CQNHCHCCOR„)ECCH._.) ÍC0R.J3, ZCHíCOFtJ E <O~u> CCOR.UJ
Z. Z. X Z, aí. Z. ·.? Z. £, ou ZCH^COÍMHiCH,) vCOR,j5 em que Ri é CH^CH^ í OCH^CH^) wOMes Ft, e RT são H ou Ra§ R., é NHCH«a-UCOCH,^CH^)..OMs ou OCH~CH~íOCH~C’rUh.OMe?
* *i· z. z. z. y .·/„ z, z z. y
Z é Br ou Is X ê um número inteiro de 1 a 3 e Y é um número inteiro de 1® a 3©®§ com a condição de que e R^ não possam ser si mu1taneamente H,
Este invento refere—se adicionalmente a um processo para inibir a agregação d© uma sosatotropina animal recombinante, per redução de pelo menos uma das duas pontes dissulfureto entre os resíduos de aminoácido cistsína nas posiçfiíss 55 e 166 ou nas posiçoes 183 e 191 das referidas somatotropinas e em seguida derivação de cada uma das cisteínas da ponte ou pontes reduzidas nas posiçSes 55 e 166 ε/cu nas posiçSes 1Θ3 s 191 cos o ínesmo derivado, desde que os derivados nas cistsinss nas posiçSes? 55 e 166 sejam substituintes iguais ou diferentes aos substituintes nas cisteínas nas posiçSes 183 e 191. Os substituintes empregues na preparação das novas somatotropinas de animal recombinantss, derivadas-, deste invento, incluem o seguintes íCH^CO^R,), ~ jO í.
C CH^CONHR, ) tCH C COR^ 5 C CHO) v C COR^) 3 , ECH^CQNHCH C COR^) C Ci~L· > v í COR.,.) 3 , ou CCH„CONHCCH^> COR.35 em oue R., é CH„Ci-UCOCH„CH^). OMe = R„ e R., z. ;·; ·=-> λ z. λ·;. z. y * z.
são H ou Ra; R.„ é NHCH„CH^COCH^CH^) One ou OCiUCrMOCH.,CrUÍ. OMe;
“í·' *£ z z z y z. z z z y
X é um número inteiro de 1 a 3 e Y é um número inteiro de 10 a 300; com a condição ds que R.~ e R._. não possam ser simultaneamente H»
Este invento refers--ss adicionalmente a um processo para aumentar a semi-vida da interleuquina-2 por derivação da cisteína livre na posição 127 com os derivados acima mencionados»
Da acordo com o presente invento, as novas sc-mstatrapinas de animal preferidas são somatotropinas de porcino, bovino, ovino, humano, ave e peixe, recombinantes, em que a ponte dissulfureto no laço (“loop) pequeno da somatotropina é reduzida e as cistsínas nas posições 183 a 191 derivadas com um substituinte seleccionado a partir de CCH„COR,),
ECH^CDNHCH<COR^ ? C CR.,).. CCOR.y) 3 , ou EChUCONH< CH^ í..CORn 3 ; <sm que R,,
X- -ο. Λ» -4. .-í I-t χ
Fb·,, R--r, e X são como descritos»
z. ·.> ‘
Além disso, una outra nova proteína do presente invento é um derivado de somatotropina animal no qual os resíduos de cisteína são substituídos pelos resíduos Ser a Tyr nas posiçSes 102 e 112, rsspectivamente, s no qual foi substituído o ácido glutSmico paio resíduo de cisteína que ocorre normalmente nas posiçSes 1S3 e 191» Esta proteína é produzida por técnicas ds mutagénese específica de sítio que são bem conhecidas daqueles
peritos na arte. Além disso, estas técnicas são utilizadas coo outras proteínas para introduzir um sítio ds travamento para polímeros que não interfira com ou altere a capacidade da hormona de interagir com um sítio ds ligação ou induzir um efeito biológico.
I
Todos os plasmídeos, sequências de DNA e microorganis™ mos depositados em ligação com o presente Pedido de Patente, excepto quando referido sm contrário, são depositados na American Cyanansid Company Culturs Collection mantida em Princeton, Naw | Jersey e são depositados com a American Type Cultura Collection CATCC) em Roekville, Maryland 20952, E.U.A.,
DESCRIÇffiO DETALHADA DO INVENTO
As proteínas de animal, recombinantes, modificadas, preferidas, deste invento incluem mas não estão limitadas a somatotropinas ds animal e humano, interleuquinas e irterfsrSes, como ilustrado abaixo. As somatotropinas recombinantsmente derivadas sem as substituições adicionais Asp-Gln ou com outras substituições são também preparadas de acordo com o presente invento» As outras proteínas de animal com delecçSes no comprimento da cadeia ds aminoácidos, adiçães ao comprimento da cadeia de aminoácidos, substituição de aminoácidos, Ccisteínas adicionais para derivação), fragmentos com a porção activa s semelhantes, estão todos no âmbito do presente invento.
i
-£3f3ÍFsâ de p=—»rF ino Recombinante
H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Ala-Met-Pro-Leu-Ser-SerLeu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-LeuHis-Gln-Leu-Ala-Ala-Asp-Thr-Tyr-Lys-Glu-Phe-GluArg-Ala-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile55
Gln-Asn-Ala-Gln-Ala-Ala-Phe-Cys-Phe-Ser-Glu-ThrIle-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asp-Glu-Ala-Gln-GlnArg-Ser-Asp-Val-Glu-Leu-Leu-Arg-Phe-Ser-Leu-LeuLeu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-Val-Gln-Phe-LeuSer-Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phe-Gly-ThrSer-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-GluGlu-Gly-Ile-Gln-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-AspGly-Ser-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-ThrTyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Leu-Arg-Ser-Asp-Asp166
Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-Cys-PheLys-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Ala-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg183 191
Val-Met-Lys-Cys-Arg-Arg-Phe-Val-Glu-Ser-Ser-CysAla-Phe-OH.
i
de Bovino Reconibi .nte
H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Ala-Met-Ser-Leu-Ser-GlyLeu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-LeuHis-Gln-Leu-Ala-Ala-Asp-Thr-Phe-Lys-Glu-Phe-GluArg-Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-Ile55
Gln-Asn-Thr-Gln-Val-Ala-Phe-Cys-Phe-Ser-Glu-ThrIle-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asn-Glu-Ala-Gln-GlnLys-Ser-Asp-Leu-Glu-Leu-Leu-Arg-Ile-Ser-Leu-LeuLeu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-Leu-Gln-Phe-LeuSer-Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Ser-Leu-Val-Phe-Gly-ThrSer-Asp-Arg-Val-Tyr-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-GluGlu-Gly-Ile-Leu-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-AspGly-Thr-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-ThrTyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Met-Arg-Ser-Asp-Asp166
Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-Cys-PheArg-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Thr-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg183 191
Val-Met-Lys-Cys-Arg-Arg-Phe-Gly-Glu-Ala-Ser-CysAla-Phe-OH.
191 atotropina de Poro no Cy=.'
Recombinant
H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Ala-Met-Pro-Leu-Ser-SerLeu-Phe-Ala-Asn-Ala-Val-Leu-Arg-Ala-Gln-His-LeuHis-Gln-Leu-Ala-Ala-Asp-Thr-Tyr-Lys-Glu-Phe-GluArg-Thr-Tyr-Ile-Pro-Glu-Gly-Gln-Arg-Tyr-Ser-IleGln-Asn-Ala-Gln-Ala-Ala-Phe-Cys-Phe-Ser-Glu-ThrIle-Pro-Ala-Pro-Thr-Gly-Lys-Asp-Glu-Ala-Gln-GlnArg-Ser-Asp-Val-Glu-Leu-Leu-Arg-Phe-Ser-Leu-LeuLeu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Gly-Pro-Val-Gln-Phe-Leu112
Ser-Arg-Val-Phe-Thr-Asn-Cys-Leu-Val-Phe-Gly-Thr122
Ser-Asp-Arg-Val-Cys-Glu-Lys-Leu-Lys-Asp-Leu-GluGlu-Gly-Ile-Gln-Ala-Leu-Met-Arg-Glu-Leu-Glu-AspGly-Ser-Pro-Arg-Ala-Gly-Gln-Ile-Leu-Lys-Gln-ThrTyr-Asp-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Leu-Arg-Ser-Asp-AspAla-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Ser-Cys-PheArg-Lys-Asp-Leu-His-Lys-Thr-Glu-Thr-Tyr-Leu-Arg183 191
Val-Met-Lys-Glu-Arg-Arg-Phe-Val-Glu-Ser-Ser-GluAla-Phe-OH.
Somatotropins de Humane- Rece-mbinante
H-Met-Asp-Gln-Phe-Pro-Thr-Ile-Pro-Leu-Ser-ArgLeu-Phe-Asp-Asn-Ala-Met-Leu-Arg-Ala-His-Arg-LeuHis-Gln-Leu-Ala-Phe-Asp-Thr-Tyr-Gln-Glu-Phe-GluGlu-Ala-Tyr-Ile-Pro-Lys-Glu-Gln-Lys-Tyr-Ser-Phe56
Leu-Gln-Asn-Pro-Gln-Thr-Ser-Leu-Cys-Phe-Ser-GluSer-Ile-Pro-Thr-Pro-Ser-Asn-Arg-Glu-Glu-Thr-GlnGln-Lys-Ser-Asn-Leu-Glu-Leu-Leu-Arg-Ile-Ser-LeuLeu-Leu-Ile-Gln-Ser-Trp-Leu-Glu-Pro-Val-Gln-PheLeu-Arg-Ser-Val-Phe-Ala-Asn-Ser-Leu-Val-Tyr-GlyAla-Ser-Asp-Ser-Asn-Val-Tyr-Asp-Leu-Leu-Lys-AspLeu-Glu-Glu-Gly-Ile-Gln-Thr-Leu-Met-Gly-Arg-LeuGlu-Asp-Gly-Ser-Pro-Arg-Thr-Gly-Gln-Ile-Phe-LysGln-Thr-Tyr-Ser-Lys-Phe-Asp-Thr-Asn-Ser-His-AsnAsp-Asp-Ala-Leu-Leu-Lys-Asn-Tyr-Gly-Leu-Leu-Tyr167
Cys-Phe-Arg-Lys-Asp-Met-Asp-Lys-Val-Glu-Thr-Phe184
Leu-Arg-Ile-Val-Gln-Cys-Arg-Ser-Val-Glu-Gly-Ser191
Cys-Gly-Phe-OH.
IL—2 Kscoíiíí3in«fcn ts
H-Ala-Pro-Thr-Ser-Ser-Ser-Thr-Gly-Asn-Thr-Met-LysGlu-Val-Lys-Ser-Leu-Leu-Leu-Asp-Leu-Gln-Leu-LeuLeu-Glu-Lys-Val-Lys-Asn-Pro-Glu-Asn-Leu-Lys-LeuSer-Arg-Met-His-Thr-Phe-Asp-Phe-Tyr-Val-Pro-LysVal-Asn-Ala-Thr-Glu-Leu-Lys-His-Leu-Lys-Cys-LeuLeu-Glu-Glu-Leu-Lys-Leu-Leu-Glu-Glu-Val-Leu-AsnLeu-Ala-Pro-Ser-Lys-Asn-Leu-Asn-Pro-Arg-Glu-IleLys-Asp-Ser-Met-Asp-Asn-Ile-Lys-Arg-Ile-Val-LeuGlu-Leu-Gln-Gly-Ser-Glu-Thr-Arg-Phe-Thr-Cys-GluTyr-Asp-Asp-Ala-Thr-Val-Asn-Ala-Val-Glu-Phe-LeuAsn-Lys-Trp-Ile-Thr-Phe-Cys-Gln-Ser-Ile-Tyr-SerThr-Met-Thr.
Proteínas Derivadas
As proteínas derivadas são preparadas por dissolução ou dispersão da proteína sai água ou numa solução aquosa de hidroclorsto de guanidina, bicarbonato de sódio ou semelhante, que è ajustada a pH 8,4 com uma base aquosa, tal como hidróxido de sódio ou amónio. Se for requerida a redução de uma ligação riissulfureto é então adicionado lantamente, a esta solução, um ditiotreitol, i.e. (DL-treo-l ,4-dimercapto-2,3--butanodiol DTT), A adição é gsralmente realizada sob uma atmosfera de azoto ã temperatura ambiente» À solução resultante ê adicionado o agente de derivação» A mistura s agitada durante cerca ds uma a quatro horas» 0 progresso da reacção ê monitorizado por titulação Ellman da grupos tiol não modificados ou por electroforese em gele» Após a reacção estar completa, é dessalinizada por ultrafiltração» A solução é concentrada e depois submetida a vários ciclos ds rediluição com água, hidrocloretc de guanidina aquoso ou ssiasIhante, seguida por ultrafi1 tração» 0 resíduo da filtração final é depois lioíilizado para render a proteína derivada»
A preparação de dois dos agentes ds derivação parte do N-Fmoc-Aspí bulOH e é descrito na carta de fluxo i a carta de fluxo 2» A amina derivada de um monometiléter de polietilenogli··col CrES-OHs) está rapidamente disponível utilizando metodologia padrão» Esta amina é condensada com W-Fmoc—Aspí ~bu)OH utilizando diciclo-hexilcarbodiimitis (DCC) ou outro agente de desidratação relacionado» A remoção do grupo protector Fmoc utilizando protocolos padrão dá Cl). A condensação de (15 com ácido iodoacético é efectuada coa DCC seguida por remoção do éster terc-butílico dando o agente ds alquilação» é facilmente ©vidente que os derivados similares, nos quais o polímero só está ligado ao b~carboxilc ou a ambos os grupos a- e b-earboxilo, são preparados dependendo do material de partida utilizado»
I
CARIAJ£.„FLyXO_l.
U.O(CH2CH20)„CH2CH2NH2 + Fmoe KHCHCO2H
CH2C02*bu
DCC ch2ci2
Fmoe NHCHC0NHCH2CH2(0CH2ÇH2)yOM«
CH2C02 bu plporldlno- H2NCHC0NHCH2CH2(0CH2CH2)y0M· ICH2C02l
CH2CO2’bu
DCC 2 hr (»)
I ch2conhchconhch2ch2(och2ch2) you. CH2C02‘bu
TFA
ICH2C0NHCHC0NHCH2CH2(0CH2CH2) y0M· ch2co2h (i!)
O derivado do ácido succínico (Carta de Fluxo 2) ê também preparado a partir ds N-Fmoc~AspC ^bu)0H.: 0 ácido livre é convertido no éster tíe p-níirobenzoato CPNB) com DCC e o grupo amino desprotegido com piperidina»
CARTA„DE,.£LBX0„.2, oh + Fmoc NHCHC02H JL££> Fmoc NHÇHCO^PNB CH2C02 ,bu CH2CO2*bu plp.rldlnó H2NCHCO2PNB
CH2C02*bu HOAc
OHO
M,-CHCO,PNB 2 I ch2co2h
N,-CCOHH-PEG-OM · H ch2co2h
ICHCONH-PEG-OU·
I
CH2C02H (Hl)
O grupo araino è convertido no sal do diasónio (nitrato ds i-amilo/HOAc) „ A deslocação do éster de PNB activo com H„N-PEB-DMs introduz a cadeia lateral polimérica. 0 tratamento
-i.
com Hl resulta no deslocamento simultâneo da ligação diazo com iodo e hidrólise do grupo protector ds éster terc-hutílico para dar o resultado final.
Ss for utilizado o ácido 3-aminohu.tírico M protegido (carta de fluxo 3) em vsz ds Fmoc-N-AspC 'buíOA, é preparado o deri vades ds iodoacetamida monofuncíonal correspondente,: Do mesmo modo, os PEB-iodoacetatos são directamente preparados por acopla mento mediado por DCC„
Devia ser evidente que a ligação do polímero pode ser através quer ds uma amida quer ds um éster. Estes dois grupos funcionais têm susceptibilidades diferentes à hidrólise e o modo preferido ds ligação variará coík a aplicação especifica,, Além disse, cís polímeros de PES estão disponíveis numa, variedade de gamas de peso molécular as quais são todas potsncialmente úteis. A natureza do polímero não precisa de estar, também, limitada ao polietilenoglicol ou propilenoglícol. Outros polímeros potencial mente úteis incluem, mas não estão limitados a, álcool ooliviní— lico, dextranas e hidratos de carbono, polipirrolidona.
CARTA_I)EJiLyXO^.
DCC
Fmec HH(CH2)3C02H+NH2CH2CH2(0CH2CH2)r0M«
TFA
Fmoc NH(CH2)3C0NHCH2CH2(CH2CH2)r0U« |plp.r.d.^ h2h(ch2)3conhch2ch2(och2ch2)you· ich2co2h
DCC
TFA
ICH2CONH(CH2)3CONHCH2CH2(OCH2CH2)yOM·
M«0-(CH2CH2Q)yH+ICH2C02H
DCC CH2CI2 py rI d Inv |ch2co2ch2ch2(och2ch2)y0U·
A preparação de somatotropinas ou outras proteínas de animal <ou humano) rscombinante, modificadas (substituídas) deste .invento pode ser alcançada por mutagénese dirgida ao sítio» As técnicas normalmente utilizadas para a alteração ds sequência de DNA de ué segmento clonado de DNA nu® sítio específico, definido requerem a produção de usa forma em cadeia simples daquele DNA. 0 DNA cie cadeia simples é condensado com um oligonucleótido sintético que é complementar a uma porção dele, com a excepção de que o oligonucleótido contêm dentro de si uma região de desemparelhamento» A região de desemparelhamento está localizada normalmente na porçlo central do oligonucleótido. A mistura desnaturada/renaturada é então tornada em cadeia dupla e covalentemente fechada pela adição de DNA-polimerase I de E. coli, fragmento grande e desoxinucleótidos-trifosfato na presença de DMA-ligase T4 e adenosina-5'-trifosfato. D DNA de cadeia dupla é então transformado numa estirpe ds E» coli apropriada onde a região da desemparelhamento do DNA é reparada e replicada. São obtidas duas populações de clones. Dependendo da cadeia que é escolhida coíbo a matriz para a sintese de reparação, um clone ou contêm a sequência ds tipo selvagem ou a alterada (matada). Os clones que contêm a sequência mutada, i.e. â qual corresponde a sequência do oligonucleótido, são seleccionados por hibridação para o oligonucleótido radioactivaments marcado. Devido ao desemparelhamento entre o oligonucleótido s a sequência de tipo selvagem, o oligonucleótido radioactivaments marcado é ligado de modo mais estável aos clones que contêm a sequência mutada. Por conseguinte, a incubação a uma temperatura apropriada diferencia os clones mutados dos do tipo selvagem. As alterações nos clones identificados são então confirmadas pela sequênciação do DNA das regiões pertinente.
Um objsctivo da mutagénese é α ds gsrar uma soisatotropina de porcino5 de preferência, recombinsntemente derivada (rpST), molécula de somatotropina incapaz da formação da ligação dissulfurete- do laço pequenc. 0 dissulfureto do laço pequeno está localizado entre as cisteínas em 183 a- 191» Um objsctivo adicional ê o de incorporar dois resíduos de cisteína no laço omega localizado nos resíduos 102-112 que foi identificado como um sítio de clivagem proteolítica. Estas cisteínas recentemente incorporadas são adicionalmente modificadas utilizando os processos aqui descritos. 0 sistema de numeração é como descrito. 0 protocolo básico utilizado para obter o mutante requerido é em seguida descrito.
A substituição dos resíduos ds Ssríô2 a Tyril2 é alcançada por utilização do dois oligonucleótidos» Os dois oligonucleótidos têm a seguinte sequências
5' TTC ACC AAC ΤΘΤ CTS 6TS TTT 3' Ser102
5' GAC CSC QTC TST SAS ΑΑΘ CTS 3' Tyrll2
DNA de cadeia simples matriz é o DNA pSEM3sCf-Η pST-SX Este DNA de cadeia simples jà foi modificado para substituir as cisteínas normalmente encontradas nas posições 1S3 e 191 por dois resíduos de Slu (Este DNA é depositado num vector de expressão PR0211, como indicado abaixo)» São misturados 2000 ng de DNA pBEN3zCH->pST-SX ds cadeia simples com 5© ng da oligonucleótido AA1, que tinha sido préviamente 5'-fosforilado com adenosina-5'-trifosfato e polinucleótidoquinase» A mistura ® aquecida a 65 C durante 7 minutos e depois mantida à temperatura ambiente durante Ι® minutos. Este protocolo desnatura/rena.tura o oligonucleótido ao DNA ds cadeia simples» 0 DNA desnaturado/rensturado é então convertido numa forma ds cadeia dupla covalentemente fechada por
adição ds ATP, dMTP (uma mistura des quatro desoxirrihonucleófcitíGs-5'-trifosfato) = DNA-ligas© T4 e fragmento grande da DNA-poliserase I. A mistura é incubada durante 1 hora á temperatura ambiente» A mistura, é então transformada em células competentes HBÍ01 por procedimentos padrão. Após incubação durante a noite a 37 C9 ss colonias são transferidas para filtros de nitrocelulose e processadas para hibridação por protocolos padrão. As colonias transformadas foram identificadas utilizando uma sonda ds oligonucleótido ratíiomarcada. 0 DNA plasmátíoo é preparado a partir destas colónias, introduzido em células competentes HBl©i como descrito anteriormente e resnalisado com a sonda de oligonucleótido radiomarcada, 0 DNA plasmídio è d® novo preparado a partir de colónias qua hibridizam com a sonda. 0 DNA plasmídio ds um clone contendo a mutação S1®2C, designado por pGEM~3z(f+)pST-SXE-S102C ê introduzido em células competentes JM101 por transformação e o DNA de cadeia simples preparado a partir de um fago purificada derivado de um único transformante.
Para mutar a tirosina na posição 112, é utilizado um segundo oligonucleótido com a seguinte sequência?
5’ BAC CSC STC TBT BAB AA© CTB 3' processo ds mutagénese é idêntico àquele descrito acima com a excepção de que o DNA matriz é p6M~3z(f+>pST-SXE-S102C (este é o clone isolada a partir da mutagénese que tem a serina na posição 1®2 convertida es cisteína) e cisteínas nas posições 183 e 191 substituídas por ácidos glutâmicos» A temperatura final de lavagem é de 56 C» A sequtneiação do DNA revela que os clones identifiçados têm a sequência esperada. 0 clone mutado é designado por pSEM-3zCf*)pST-SXE-S102C, Y112C.
Os clones alterados Cmutantes) são então reconstruídos no plasmídio ds expressão bacteriana pROSlí CATCC Número de acesso 40483= depositada em 23 ds Agosto ds 1988) como descrito na figura 5 da publicação EPO nS 173 28®» □ clone pGEM é curtado com EcoRI e HindIII e o fragmente ds gene pST isolado. 0 pRQ2íí é digerido com as mesmas enzimas, tratado com fosfatase alcalina de intestino de vitelo e o fragmento grande isolado, As duas porções são ligadas entre si com DNA-ligase T4 e transformadas numa estirpe bacteriana apropriada, por exemplo, E, coli N99cl deposi··· tad«>.
Nesta estirpe está presente um repressor g do tipo selvagem. Este evita a expressão do promotor P, no pR0211. Assim que a construção apropriada é isolada, é então transferida para estirpes bacterianas que contêm um repressor g sensível â temperatura, por exemplo, E„ coli 42®® CATCC Número de Acesso 87768, depositado em 23 de Agosto ds 1988)= Nestas estirpes, a expressão da pST está dependente da temperatura, A 42 C, o repressor está inaotivo s ocorre a expressão, Nesta fase, é preparada a pST por procedimsntos contidos na EF:s nS 173 29® onde ocorre a expressão Caqui incorporada por referência a ela), A expressão da pST não está limitada a estas estirpes particulares de E, coli. São substituídas outras estirpes com propriedades apropriadas. Os vectores de expressão plasmídia são depositados com a ATCC. As estirpes bacterianas são depositadas separadamente.
□utras substituições ds aminoácidos podem ser feitas pelos procedimentos acima utilizando os codões e oligonucleótidos apropriados, Similarmente, estes procedimentos sao empregues para modificar uma variedade ds somatotropinas ds animal ou humano.
E£fi£ÊS.sfí_.de._UtlU.as£lfi
Vantajossmsnte, as novas proteínas ds animal do presente invento são úteis para aliviar estados de doença em animais? aumentando a velocidade ds crescimento ds animais, especial:mente animais produtores de carnes e aumentando a eficácia da sua utilização como alimento» Alguns destes compostos são também eficazes para melhorar a qualidade da carcaça dos referidos animais, i.s. aumentar a relação de carne magra para gordura dos referidos animais» Além disso, alguns dos compostos do presente invento são eficazes para aumentar a produção ds leite em animais produtores de leite e melhorar a produção ds lã em ovelhas ε outros animais criadas para produção ds casacos»
Enquanto que as somatotropinas derivadas deste invento são eficazes para o tratamento de animais, para alcançar as melhorias biológicas descritas acima, essa melhoria da eficácia e utilidade das somatotropinas de animal derivadas, do invento, são atribuídas, em parte, à inibição da agregação da somatotropina produzida pela derivação das referidas somatotropina« Tal inibição permite a preparação de sistemas de distribuição de libertação prolongada nitidamente melhorados, os quais não são pronta ou eficazmente alcançados com as somatotropinas nativas ou as somatotropinas recombinantes que não são derivadas, como descrito pelo presente invento»
Verificou-se também que as somatotropinas derivadas do presente invento são altamente estáveis e essencialmente livres de agregação devido â formação de dímero» Além disso, as somatotropinas derivadas do invento prestam-se para utilização na preparação de composições de libertação prolongada significativamente melhoradas»
Onde as somatotropinas ds animal, nativas se mostraram agregar num só dia, as composições parentéricas contendo as somatotropinas derivadas ou modificadas deste invento continuam a libertar a somatotropina derivada ou modificada durante i® ou íb a .t s βa s a
Composições
Na prática, as composições do presente invento são geralmente administradas aos animais por injecção na forma de composições parentéricas biologicamente activas» Entre as composições parentéricas úteis para administração das proteínas animais recombinantes deste invento estão os geles, pastas, microesferas, microcépsulas, implantes e semelhantes» Como tal, existe um considerável interesse em proporcionar formas ds dosagem ds substâncias biologicamente activas que libertam a substância de uma maneira controlada e reduzem assim a frequência ds administração.
desenvolvimento de composições de libertação prolongada de macromuléculas biologicamente activas apresenta problemas especiais devido aos seus complexos modos cie acção e estruturas complexas das macromulêculas» Assim, é requerido o desenvolvimento ds composições de libertação prolongada eficazes que contêm a somatotropina biologicamente activa»
As composições úteis para este tipo ds administração são preparadas por dissolução da somatotropina animal derivada ou modificada em hidroxido de amónio diluído e depois adição de uma solução de benzoato,· laurato, carbonato tis metal alcalino ou semelhantes a eles» Um tsnsioactivo não iónico é em seguida misturado com a solução s a mistura resultante seca por pulverização»
Os sólidos assim formados são então misturados cos» gordura ou cs~ ra fundida ou uma sua mistura & a mistura fundida resultante pulverizada através de uma cabeça de pulverização de ar/líquido equi pado com uma camisa aquecida para manter o ar que entra e a fase fundida a uma temperatura acima ds do ponto da fusão. As microes-feras são formadas è medida, que as gotículas fundidas arrefecem. Estas são recolhidas numa série de peneires na gama ds tamanho desejado de cerca de 45 a 113® micra & retidas para utilização. As microesferas que não são da gama ds tamanha desejado, são recicladas, Alternativamente, a mistura homogênia ê introduzida num disco de centrífuga e as microesferas assim formadas recolhidas como acima, ou a mistura fundida è arrefecida e moída até à gama da tamanho médio de partícula desejada.
As microesferas biologicamente activas são então disper sas num veículo líquido farmacêutica s farmacoiogicamente aceitável para injecção no animal. A composição de microesfera-líquido ê administrada geralmente por injecção subcutânea sob a pele do animal usualmente na proximidade da cabeça, pescoço ou orelhas.
As proteínas ds animal derivadas do presente invento são também preparadas como implantes biocompatíveis que são injectados sob a pele do animal, utilizando usa pistola de implante de pelotas convencional. As composições são preparadas por mistura de uma somatotropina derivada em pó com uma cera tal como cera de rícino ou com uma mistura de um copoli(glicólido/láctido), hidróxido ds magnésio, a um condensado tís óxido de etileno preparado com uma base hidrofóbica formada por condensação de óxido ds propileno com propilencglicol» As composições assim formadas são então introduzidas numa prensa de formação de pelotas e formadas sa pelotas cilíndricas de 0,3175 cm de diâmetro. As pelotas assim formadas são administradas com uma pistola de implante de pelota convencional.
presente ir»vento é ilustrado adicionalmente pelos exemplos descritos abaixo.
A solução de 1,24 g <3mn3 ds Fmoc~Asp<bu)OH e 4® mL ds CH^C1„ ê adicionado ©,3 g íís5mM) de diciclo-hexilcarbodiimida e a mistura reaccional agitada à temperatura ambiente durante uma hora. A diciclo-hexilureis, precipitada á filtrada, e são adicionados 3 g de amina de polietilenoglicol CPEB3 com peso molecular médio <PM3 tís 2@©®« A mistura reaccional & agizada durante a noite à temperatura ambiente. 0 cloreto de metileno é evaporado e o resíduo dissolvida en ύ&& mL de H^O. Esta solução foi filtrada, depois ultrafiltrada através d© uma membrana Amicon VM-2 s liofilizada para dar 3 g de produto.
São adicionados 3 g ds Fmoc-WHAspC bu>NH-PE8--0Ms do exemplo 1 a 3© mL. ds piperidina cloreto de metileno ílsl v/v) â temperatura ambiente e agitados durante 3© minutos. 0 cloreto de metileno é evaporado a o resíduo ê dissolvido em 2®® mL de H.-,Ο e ultraf.iltrada através d® uma membrana Amicon Yrl-2, A solução aquosa restante é liofilizada para render 2,5 g ds produto,
B^aâ£a£lS dg JCHTCQhtfBsfi<2^^
A uma solução ds 0,427 g d© ácido iodoacético © 20 mL do cloreto de metiieno, é adicionado 0,237 g ds DCC s a mistura reaccional é agitacla ã temperatura ambiente duran te uma hora, A diciclo-hexilureia precipitada é filtrada e são adicionados 2,5 g de H^N-Aspí Ubu íNH-PES-OSfe © a mistura agitada durante 3 horas à temperatura ambiente (até o teste com ninidrina ser negativo)„ □ cloreto de meti leno foi evaporado e o residuo dissolvido em água o ultrafi 1 trado através ds uma membrana Amieon YH-2» A solução é então 1iofilizada para render 2,6 g de produto, &XS&0..1
Preparação de ICtUCONHAsp(QH?MK-PE5-QMe
São dissolvidos 2,6 g de ÍCH^CONH-Asp<^fou>MH-PEB-GMs em 40 mL os ácido trifluoroacético/cloreto ds mstileno C i sl v/v) e a mistura é agitada á temperatura ambiente durante uma hora» Os solventes são evaporados e o resídua dissolvido em cerca ds 200 mL. ds Η„0· A solução è ultrafiltrada através d© uma membrana .li.
Amicon YM-2 © neutralizada a O can hidróxido do amónio, A liofilização dá 2 g de ICH^CONHAspíOH)ΝΗ-ΡΕΘ-OMe.
OSFLCL5
AA uma solução tís 4®® mg do r-pST em 2®® mL do NH^HCO^. ©,5 M ípH”S,4) são adicionados 2S,® /no de ditiotrsitol s a mistura reaccional agitada durante 1 hora» A esta r-pST reduzida é adicionado 1 g de MeO-PES-NHCOAspíOH>NHCOCH^I e a mistura deixada agitar durante 3 horas» 0 teste de Ellman indica tióis livres, r-sstanies, e por consequência foi adicionado um grama adicional do derivado de iodoacetamida e a mistura reaccional agitada à temperatura ambiente durante 18 horas» A mistura reaccional é diluida, ultraíiltrada através do uma membrana Amicon YM-l® e lioíilizada para render 4©® mg de produto»
EXEMPLO 6
Preparação de Fmoc-MH-Asp(,bu)CQPNB
A uma solução do 8 g de Fmoc-Asp<fbu>QH e 2Ξ© mL de cloreto da metileno são adicionados 2,©í q da DCC e a solução resultante agitada ã temperatura, ambiento durante 1,5 horas. A diciclo-hexilureia precipitada foi filtrada e são adicionados 1,35 g de 4-nitrofenol e a mistura reaccional agitada durante 1B horas» A solução é arrefecida & lavada com Na^CO^ a 5% frio o «•1·· ’ft·' água, salgada» Após secagem» a solução é evaporada para renfsr 4,27 g de produto.
EXEMPLO 7 λ£. -·-- -<► «<
Foraín adicionados 2 g ds Fmoc-NHCHCCO^Pr®)CK^CO,./”bu & 3® fliL de uma mistura galada de piperidina e cloreto de metileno < 1 s; :l v/v> e agitados durante 2 horas a © C. Os solventes foram evaporados e o resídua redissolvido em cloreto de metilsno e lavado com HC1 ©,1 N frio, água e água salgada. A solução resultante foi seca e evaporada para render @,S3 g cie produto.
EXEMrLD„8 teSsraçlsLJÍ^
Uma solução de 2,@ g de H,JMCH<CO,.PNB5CHCO^'hu, ô.vl q de nitri to de i-amilo, 3 gotas de HOAc e i©0 mL cie CH^Cl^ foi refluxada durante 2 horas. Os solventes voláteis foram evaporados e o resíduo redissol vido em 5® mL de s foram adicionados 5 g de MsD-PEQ-WI-U. A mistura é agitada durante a noite à temperatura ambiente. Ds solventes foram evaporados e o resíduo dissolvido em Η,-,ΰ s ultrafiltrado através de uma membrana Amicon YM-2.
A liofilização rendeu 1,48 g de produto» obelo,„2.
ΕΓ5ΒδΓδ£ΐο.....^..ICHiCLMtPEG-DMgií^CUH
Ã-. X..
Uma solução de 0,5 g de N^CíCONH-F-EB-OMelCH^CO^H έ .ò. ,£.
dissolvida eai 50 mL de CHCL^ e arrefecida a © C. São adicionados cuidadosamente 2 mL. de Hl e a mistura reaccional agitada durante 3© minutos a 0 C e depois deixada aquecer até 28 C durante 2 horas» A solução é evaporada, dissolvida era 3© mL. ds H„0 e ultrafil irada através tíe uma membrana Amicon YM---2,, Após liofiliz&Çi&x restam ©,3 g da produto»
EXEMPLO-iâ
Ersss&asl^^
A uma solução de 50© mg de rpST em 25© mL de IMaHCCU ©?5 W CpH=8,4) são adicionados 35 mg tíe ditiotreitol e a mistura reaccional agitada durante 1 hora» A rpST reduzida são adicionados 2,0 g tíe MeO-PES-NKCOCHIíCF-uCO„H) e a mistura reaccional agitada durante a noite á temperatura ambiente» A mistura reaccional é diluída com H.^0 e ultrafiltrada através ds uma membrana Amicon Yif-l© e liofilizada para render oí© mg de produto»
EXSELS...1Í
Preparação, ds ;4eQH£B-QC0CH,? I
A uí!m solução ds 5 g ds ácido iodoacético em 25® rnL ds metileno são adicionados 2,76 g de DCC» A mistura reaccional é agitada à temperatura ambiente durar»ts 2 horas e a diciclo-hexilureia precipitada removida por filtração, À solução restante são adicionados 2® q de MeO-PES-OH e a mistura reaccional agitada durante a noite à temperatura ambiente» A solução é então arrefecida e transferida para um funil de separação e extractada co® 15 x 1® mL de NaHCO„r saturado, frio, A solução de cloreto de meti leno restante ê evaporada e o resíduo dissolvido em 3® mL de H,,Q» Esta solução foi ultrafi1trada através de uma membrana ftmicon YM--2 e final mente liofilizada para render 5,4 g de produto»
SIMPLOJJ.
Introdução de çisteínas no laço omeoa da somatotropina, ds porcino uUlÍSlf3dto dois oliaonucleáfcido^^
Lta oligonucleótido sintético designado por S1A2C tem a seguinte sequâncias
3: TTC ACC AAC TET CTE STB TTT 3'
Este oiiganucieótido difere da sequãncia análoga de DNA do gene rpST visto que o DNA que codifica o codão serina na posição í®2 é substituído por DNA que codifica a cisteína, Por conseguinte, a serina presente na posição 102 é substituída por cisteína»
DNA pGEM-Scí f*)pST-SX de cadeia' simples & o substrato para a mutagénes®. Este SNA é composto por um gene rpST modificado contido no fagomídeo comercialmente disponível, pG'EM-3z(f+) =
As modificações do gene rpST resultam na alteração da sequência ds DNA que permite a introdução de um sítio de clivagem de endonuclease de restrição Sac I nas posições 225-23® da região de codificação e a introdução de um sítio ds clivagem ds entionuclsa--se de restrição Xba 1 nas posições 285-29®= Estas alterações ns sequência de DNA não mudam a sequência de aminoácidos da proteína rpST» Duas outras modificações do gsns rpST resultam na alteração da sequência de DNA que permite a substituição ds cada um dos resíduos de cisteína nas posições 163 e 191 por ácido glutêmico. Um fragmento EcoRI/HindiII contendo este gene rpST-SXE modificado ê clonado em DNA pSEM-3s(f+) clivado com estas endonucleases de restrição utilizando procedimentos padrão, resultando em fagomídeo pSEM“3c CF-f·) pST-SX = D DNA pGEM-3zCF·?·) de cadeia simples é preparado a partir ds fago purificado por protocolos padrão. São misturados 2®®® n-g deste DNA com 1®® ng do oligonucleótido CiSSdsl, o último dos quais foi previamente fosforilado no seu terminal 5' com adenosina-5'-trifosfato <s polinucleótido-quinase. A mistura está contida num volume total de 1® mL em tampão cie têmpera IX Co tampão d® têmpera é KC1 75 mH e Tris—Cl 5 mM, pH 3,0)= A mistura é aquecida a 65 C durante 7 minutos seguidos por uma incubação de 1® minutos ã temperatura ambiente. Este procedimento permite que o oligonucleótido se dssnaturs/renature ao DNA substrato de cadeia simples. As moléculas desnaturadas/renaturadas são estendidas e convertidas a DNA de cadeia dupla, covalentemente fechado, pela adição de 22 ml ds H^O, 1 ml de ATP 2® mM, z, unidades de cada uma das DNA™ligase T4 e o fragmento grande da DNA- -polimerase I (para a definição ds unidade, ver o catálogo Me?™ Engxand Biolabs, 1986), 2 ml de tíMTP 2®X Cuma mistura dos quatro desoxírríbonucleótidos-S1-trifosfato cada um a uma concentração de 2 mM) e 4 ml de enchimento em tampão Í®X (enchimento ©m tampão IX é Tris-Cl 27,5 mM pH 7,5, MgCló 15'mM, DTT 2mM>» ftpós u.ma incubação de uma hora ã temperatura ambiente, metade da mistura reaecional é introduzida em células competentes HB101 por um protocolo de transformação padrão» Após incubação durante a noite a 37 C, as colónias são transferidas para filtros de nitrocelulose e processadas para hibridação por procedimentos padrão» 0 oligonucleótido S102C é utilizado para a detecção da mutação desejada por radiomarcação do seu terminal 5 com q-32P-ATP © polinucleótido-quinase» ftpós uma pré-hibridação de três horas a 37 C em SSC 5X» Denhart IX & ISO mg/ml ds tARN de levedura, o oligonucleótido radiomarcado ê adicionado s deixado hibridar com o DNA nos filtros durante a noite s. 37 C» Os filtros são lavados durante 30 minutos a 37 C em SSC 5X, seguido por uma lavagem de 3Θ minutos em TftC a SS,© C„ Durante esta última lavagem, só aquelas colónias cujo DIMA plasmídeo continha a mutação desejada continuaram a hibritíar com a sonda de oligonucleótido radiomarcado» Estas colónias são detectadas após exposição dos filtros lavados a filme de raio X» O DNA plasmídeo é preparado a partir de muitas destas colónias da placa de petri original, introduzidas as células competentes HBIOÍ, como previamente descrito, e recrivado com a sonda de oligonucleótido radiomarcado, como acima» 0 DNA plasmídeo & preparado a partir de colónias cujo DNA hibrida com a sonda e analisado quanto à sequência desejada de DNA» 0 DNA plasmídeo de um clone contenda a mutação S102C, designado por pSEM--3z<f*)pST--SXE~S:l02C, é introduzido nas células competentes JMlôl por transformação © o DNA ds cadeia simples preparado a partir de fago purificado derivado de um único transformsnte.
Para substituir o DNA que codifica a tirosina na posição 112 por DNA que codifica a cisteina, é sintetizado o seguinte oligonucleótido, designado por Yii2Cs
5' SAC CSC 8TC TST GAG AAG CTG 3'
Este oligonucleótido difere do DNA análogo no gene rpST visto que o DNA que codifica o codão tirosina na posição 112 s substituído por um DNA que codifica cisteina,
DNA ds cadeia simples matriz ds pGEN-3z C í-HpST-SXE-S102C e o oligonucleótido YÍ12C são dasnaturados/reisturadosj estendidos e ligados como anteriormente. A mistura é introduzida em células competentes HB101 e os transformantes são analisados quanto â presença da mutação exactamente como descrito para S102C. 0 oligonucleótido Y1Í2C é utilizado como a sonda ds detecção radiomarcada» As condições de hibridação e lavagem são exactamente como descritas para S102C. Os vários clones contendo a mutação Y112C são identificados a partir da análise da sequência ds DNA. 0 DNA plasmídeo contendo as mutações S1©2C e Y112C ê designada por pSEM“3zCf+)pST-SXE-S'l®2Cj, Y112C.
OSEUX ..lã
Bg£m§ÍDá£l9_eni_£Ía§íaídeos_Je_^xfí?^ãslo_b^t®o1anaJ_^firofíriâdgs
Os cíones alterados (mutantes) são reconstruídos no plasmídeo de expressão bacteriana pR021i (descrito na EP 1732S0), aqui incorporados por referência a ele» Os clones M13 são cortados com EcoRl e HindiII e o fragmento ds? gene pST & isolado, 0 pR02íi é clonsdo com as mesmas enzimas tratadas com fcsfatase alcalina do intestino ds vitelo e o fragmento grande ê isolado.
As duas porções são ligadas, em conjunto, coo DNA-ligase T4 e transformadas numa estirpe bacteriana apropriada, por exemplo N9?cl = Nesta, estirpe está presente um repressor g de tipo selvagem. Isto evita a expressão do promotor F„ em pRO2íi» Uma vez isolada a construção apropriada, ela é transferida para estirpes bacterianas que contêm um reprsssor g sensível á temperatura, per exemplo 42@ô» Nestas estirpes, a expressão da rpST ê dependente da temperatura. A 42 C, o repressor é inactivo e ocorre a expressão. Nesta fase, a rpST pode ser preparada por procedimentos contidos na EP 17328©, aqui incorporada por referência a ela, A estirpe de E. coli que é utilizada para expressão de produto do gene pST não está limitada à E. coli 42Θ©= Pode ser utilizada uma qualquer estirpe de E„ coli apropriada»
Seguindo os procedimentos dos Exemplos 1, 2 e 3 acima, mas substituindo os codãos para a cisteína peles codãos apropriados para a alanina, serina, ácido glutâmico, arginina, triptofano ou asparaqina nas posiçSes 183 s 191 converte-ss o TST para a cisteína em TCT, ABC ou AÍ3T para a serina, BAE ou GAA para o ácido glutãmico, CGW» ASA ou AGG para a arginina, AAT ou AAC para a asparagina, BCB para a alanina ou TBB para o triptofano, na referida posição»
EXEMPLO 14
HeO:fWrQmi:^.lCvs.l02 Ãfí £.G 1 u1 1913 r pST
A uma solução ds 20© mg tís Cys^^^^^.Glu.*^5* ‘rpST sn 150 mL de NaH„O~ 0,5 N CpH=8,4> são adicionados 28 mg de ditiotreitol e a solução agitada durante 1 hora» A solução foram adicionados 5O0 mg ds MeO“PEG-O„CCH„I CPM-550? s a mistura .ιλ. rti reaccional agitada durante 8 horas à temperatura ambiente» A mistura reaccional ã ultrafiltrada através de uma membrana Amicon YM-1.0 para render 135 mg de produto»
EXSSSUS
E£saã£a£iâ deJUjaeQ2£Êj^^
A uma solução de 25 mg ds Intsrlsuquina—2 dissolvida em 25 mL de NaH^O.,. 0,S N <pH=S,4) são adicionados 20 mo de MeO-PES~NHCOCH„.l (PM-2©00) e a mistura reaccional agitada durante 48 horas até não ser detestado qualquer tiol livre. A mistura reaccional é ulfcrsf.il trada através de uma membrana Amicon YM-10 para render 16 mg de produto»
EXEMELQ..16
Preparação de t CHeQ-PgS-QCQCH7>Cysl8óy3r-pST
A uma solução do 4®0 mg ds rpST em 230 mL do NsHCO.,. ©,5 ÍM CpH-8,4) são adicionados 28 mg ds ditiotreitol e & solução agitada durante i hora» A solução é adicionado 1,0 y ds MeO-PEB-CUCCrbjI CPM“2®00) e a .mistura reaccional agitada durante é horas >s>m jI» à temperatura ambiente. A mistura reaccional é ultrafíltrada através de uma membrana Amicon YM-1® e finalmente liofiiisada para render 42® mg de produto»
ΟΕΗΜ,ΑΖ
L±S£g^fi.Jlg..._tSãts_sm_xatazanas.MEe3.-_SâEâ.„JÍ.„...ÉsteuffiÂQã£le._do_auz fflãlta...Aki.JS.uêS£Afl^te..díi...âHÍffiâis..iiys^sçsbsr^j^!natrotpgina_.animal.recombinante derivada
A eficácia das várias somatrotopinas de animal recoisbinantss, derivadas, do presente invento na alteração da velocidade de crescimento de animais é determinada utilizando o ensaio com ratazanas hipófise-sectomizadas Chipox), padrão. A ratazana hipó~ fise-ssctamisada não produz a sua própria hormona do crescimento e é sensível á hormona do crescimento de bovino, injectada. A resposta medida é aumentada durante um período ds tempo, tal como 10 dias»
Cada uma cias ratazanas al binas hypox CTaconic Faros, derivada da Sprague Dawley) & injectada com uma quantidade suficiente das composições preparadas de acordo com os Exemplos para proporcionar uma dose, no dia 1®, de Θ®© microgramas C8® microgramas/dia) de rpST em ®,2 ml da formulação registada. Alternati-
vaiTsente, cada uma das ratazanas albinas hypcx é injectada, diariaissnts, com 8€> micrograsas de derivado de rpST.
E£S£Sá«atSS_de_Teste
Antes do teste, os animais st o pesados e os animais a ser utilizadas para o teste são seleccionada·» com base no peso corporal» Só são sslscoionados aqueles animais cujos pesos corporais apresentam um desvia padrão do peso corporal médio do grupo» 0 grupo resultante è então dividido aleatoriamente em grupas de tratamento que consistem em oito ratazanas/grupo5 por uia procedimento aleatório gerado por computador» Os animais de teste são então transferidos para jaula limpa ® alojados era quatro ratazanas/jaula» No dia do início do estudo os animais de tssts são pesados o síao substituídos quaisquer animais com ganho ou penda d® peso, excessivo, <4-7-5 gramas). Ds animais são então transferidos para grupos de teste e tratados.
No fim do período de teste de dez dias, o peso total ganho por cada animal & registado e determinado o peso médio ganho por ratazana, para cada tratamento, Os resultados destas experiências, que estão sumariados na Tabela I abaixo, demonstram a bioactividade destes derivados»
TESTE EM RATAZANAS HYPOX
Dados das Ratazanas Hypox gramas (crescimento)
PM do d ias dias -2 2-4 dias 4-7 dias 7-10 total
CE(MeO-PES-O^CCH- (CH^CO^Na+)!MHCD'· 'Ι 55‘í· 1<31 a-UlCys^'-5- l·-· 200® ti 5 6 Ò 5 ó 9,0 “7 εζ X i 4
r-pST
C íMeO-PES-O„CCH„>- ,. 183,191/ Oys · ar-pbi 500Θ 8,8 5,0 10,3 7,3 31,3
t(NeO-PES-O^CCFU)- 183,191. oys · .ir-pbi 200® 9.8 4,8 a,9 5,9 29 , :Í
r-pST 6,9 5,3 a,a Ύ n 0 za,y
A partir dos dados acima observa-se que cada uma das
somatotropinas d© porcino recombinantes, derivadas, avaliada s biologicamente activa e proporciona um crescimento excelente dos animais.
exe:nplo„w derivadas ou modificadas é preparada uma solução concentrada do derivado ds somatotropina animal recombinante (até l®®mg/ml) sm solução salina tamponada com fosfato pH 7,4 CNaH^PCL. «Ho0 3,45 g, Ns^HPG.» 3,55 g,. NaCl 9,5 g dissolvidos em âgua destilada até i®@® ml?» Esta é filtrada através de uma unidade de filtração Millex de »3,22um estéril de mi li poros e são colocadas nos tubos alíquotas de @,1 ml» Estes são colocados numa estufa s 45 Ce removidos nos intervalos requeridos» Gs conteúdos são então diluídos com solução salina tamponada com fosfato» 0 sobrenadante é avaliado quanto ao teor em monómero s dímsro» por HPLC» é feito um balanço de massa? é registado qualquer material precipitada» Gs resultados são comparados com as concentrações iniciais e um perfil ds estabiI idade documentado.
Alternativamente, um derivado de somatotropina que exibe uma baixa solubilidade a pH 7,4 & dissolvido a um pH menos preferido (4-10) ou é avaliado como uma suspensão (ver Tabela ΪΪ)»
AiYiO*» *h Γ 3, 7 dias '14 dias 21 dias
Fracção Fracção Fracção
Solúvel Solúvel Solúvel
(.Os. mero 5 (Dímero5 (Dímero)
C(Me0-PE©~0C0oCH^)Cys151Ύ13r-pST
-ΰ.
PM-500® - 19
E (MeO-PES-WHCO) (CO^Ns’· sCHNHCna-UlCys18·55 IV1r-pST àL r-pSi técnica
85,9(29,45 89,5(31,0)
65,4(45,55 59,3(51,7)
64„@Í44,9) 57,9(49,2) mM£LQ._lS.
a^™s.._svsn^^.....£ms_.r^ertej^.,imte^te^^ãr_.di;s^glucao.„in.. vitro
Um conjunto ds implantes è preparado a partir ds 96 mg ds cera ds rícino de 27© mesh s 64 mg ds C(MsO-PEG•ΐ g5’ ·: Q i ~O.-,CCH^)Cyss “ “3rpST e rpST, em pó. 0 peso molecular médio do z. z.
PEG ê 20@0» A mistura é agitada, deitada sobre um disco de petri ds qrands superfície e o CH^Cl^ deixado evaporar ã temperatura z. z.
ambiente e depois seco por secagem sob vácuo» 0 resíduo seco & recolhido e transformado em implantes cilíndricos de 0,3175 cm de diâmetro utilizando um Carvar Press a cerca de 6894,7 KPa» Os implantes assim formados pesara», cada um, 60 a 7® mg. Os implantes assim preparados são então submetidos a uma avaliação de dissolução in vitro. Cada um dos implantes ê colocado num tubo de plástico, separado, contendo 10 ml de uma solução tampão de fosfato (pH 7,4 com asida de Na a 0,05%) e os tubos colocados numa prateleira ds agitação de água, onde os tubos são agitados enquanto que a temperatura da água na unidade ê mantida a 39 C. Os tubos são agitados durante um dia, depois as soluções são removidas tíe cada tubo e analisadas quanto â rpST por HPLC e a solução rejeitada» é adicionada a cada tubo uma nova solução tampão de fosfato e os tubos agitados, em seguida, durante trâs dias adicionais» As soluções ds cada tubo são de novo analisadas quanto â rpST por HPLC e Ca solução é de novo rejeitada), é de novo adicionado a cada tubo um tampão de fosfato novo e o tubo é de novo agitado durante trâs dias e depois voltado a analisar quanto á rpST.
A solução tampão de fosfato é NaH.-PO^»H^D 3,45 g.
Ma2^90» 3,55 g, NaCl 9,5 g dissolvidos em água destilada atê 1@®0 ml (ver Tabela ΪΪΙ)»
Libertação de Implantes
Os implantes comprimidos a partir de uma mistura de cera de rícino a 60a e r-pST a 40X e revestidos com tubos de silicone í-’ii do X Libertada
Lê;.?. u x ~ i. u x a s r-pST
L C nsu-PE3-DCCH^)- 200©

Claims (20)

  1. REIVINDICAÇÕES:
    Ia. - Processo para a formação de derivados de proteína ou polipéptido, em que por pelo menos um resíduo de cisteína da referida proteína ou polipéptido é ser sujeito a derivação com substituintes, compreendendo os referidos substituintes: (CH^O^), (CH2CONHR1), [CH(COR2) (ch2 )x(cor3 ) ] , [CH2CONHCH(COR2)(CH2)x(COR3)] ou [CH2CONH(CH2)XCOR4]; em que Rx é
    CH CH_(OCH_CH ) OMe; R_ e R são H ou R ; R. é z z z z Z «3
    NHCH2CH2(OCH2CH2)yOMe ou OCH2CH2(OCH2CH2)yOMe; em que x é um número inteiro de 1 a 3 e y é um número inteiro de 10 a 300; com a condição de que R2 e R3 não possam ser simultaneamente H; desde que quando o(s) resíduo(s) de cisteína que foram sujeitos a derivação, da referida proteína ou polipéptido forme(m) uma ligação dissulfureto antes da derivação, ambas as cisteínas possuam o mesmo derivado sulfidrilo; e quando a proteína é a somatotropina, o referido substituinte na cisteína não seja CH2CONHR^, caracterizado por compreender a dissolução ou dispersão de referida proteína na solução aquosa, adicionar o agente de derivação, misturar, dessalificar e aumentar novamente o volume a solução concentrada resultante.
  2. 2a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida proteína ou polipéptido conter, pelo menos, um resíduo de cisteína na sua forma natural.
  3. 3a. - Processo ou polipéptido de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida proteína ou polipéptido ter tido um resíduo cisteína adicionado ou substituído na forma natural da proteína ou polipéptido.
  4. 4a. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por a referida proteína ou polipéptido compreender:
    somatotropinas, interleuquinas, ínterferões, pró-uroquinases, IGF-ls, IGF-2s, factores de crescimento, tal como factor de crescimento do fibroblasto, e anti-trombina III.
  5. 5a. - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado por a referida proteína ou polipéptido compreender: somatotropinas, interleuquinas, Ínterferões, pró-uroquinases, IGF-ls, IGF-2s, factores de crescimento e anti-trombina III.
  6. 6a. - Processo de acordo qom a reivindicação 4, caracterizado por a referida proteína ser somatotropina.
  7. 7a. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a referida proteína ser somatotropina.
  8. 8a. - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a referida proteína ser Cis1'02' ^12 Glu183' ^^^pST ou
    183,191 Glu ' pST.
  9. 9a. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a referida proteína ser interleuquina-2.
  10. 10a. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado por a referida proteína ser interleuquina-2.
  11. 11a. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por poros compostos de derivação consistirem em: ZCH2CO2R1Z ZCH2CONHCH(COR2)[(CH2)X(COR3)],
    ZCH(COR )[(CH„) (COR )] ou ZCH_CONH(CH_) COR„; em que R é CH2CH2(OCH2CH2)yOMe; R2 e R3 são H ou R4; R4 é
    NHCH2CH2(OCH2CH2)yOMe ou OCH2CH2(OCH2CH2)yOMe; Z é Br ou I; x é um número inteiro de l a 3 e y é um número inteiro de 10 a 300; com a condição de que R2 e R3 não possam ser simultaneamente H.
  12. 12a. - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o referido composto ser KH2CO2R e Y ser de cerca de 10 a 100.
  13. 13a. - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o referido composto ser KHCOR2 e Y ser um número inteiro de 10 a 100.
  14. 14a. - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o referido composto ser KH2OONH(COR2)[(CCH2)XCOR3] e x ser um número inteiro de cerca de 1 a 2 e Y ser de cerca de 10 a 100.
  15. 15a. - Processo de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por o referido composto ser ICH CONHfCH ) COR e x ser um número inteiro de cerca de 1 a 3 e y ser um número inteiro de cerca de 10 a 100.
  16. 16a. - Processo para a preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se misturar: uma quantidade farmacologicamente eficaz de uma proteína ou polipéptido modificado ou que foi sujeito a derivação ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável; e um veículo líquido ou sólido farmaceuticamente aceitável para esse fim, em que a referida composição é eficaz no incremento da taxa de crescimento de um animal durante um período de tempo prolongado.
  17. 17a. - Processo de acordo com a reivindicação 16, cáfactériáádó por a referida composição ser administrada parenéêrícametttfe ao peferido animal.
  18. 18a - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a referida proteína ser o factor de crescimento do fibroblasto (FGF), factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF).
  19. 19a - Processo de acordo com a reivindicação 18, carac terizado por o referido factor de crescimento ser FGF.
  20. 20a - Processo de acordo com a reivindicação 19, carac . . 3 5 terizado por o referido FGFf ser FGF glu ' .
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