KR100213455B1 - 유도체화된 단백질 또는 폴리펩티드 및 이를 포함하는 제약학적 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생리학적으로 활성인 유도체화된 자연적인 그리고 재조합의 포유류 및 사람의 단백질 및 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명은 자연적으로 또는 부위 특이 돌연변이 유발을 통하여 시스테인 잔기를 함유하는 자연적인 그리고 재조합으로 유도된 단백질 또는 폴리펩티드를 유도체하기 위한 화학적인 방법을 제공한다.
상지 유도체화된 단백질 및/또는 폴리펩티드를 함유하는 제약학적 조성물은 배합되어 예전에는 달성하기 어려웠던 안정하고, 오랫동안 활성인 상기 단백질 및/ 또는 폴리펩티드의 조성물을 제공한다.

Description

유도체화된 소마토트로핀 및 이를 포함하는 제약학적 조성물
본 발명은 단백질 및/또는 폴레핍티드가 하나 이상의 시스테인 잔기를 함유할 경우 상기 잔기가 여기에서 정의되는 치환체로 유도체화되는, 신규 유도체화된 재조합 또는 천연 단백질 및/또는 폴리펩티드에 관한 것이다. 또한, 천연 형태에서 시스테인을 함유하지 않은 단백질은, 예를 들어 유리한 부위에 시스테인을 도입하고 그 후 상기 시스테인을 유도체화시키기 위하여, 부위 특이 돌연변이 유발 기술을 통하여 변형될 수 있다.
비록 분자 생물학적 기술이 많은 단백질 및/또는 폴레펩티드(이후 단백질로 칭함)의 이용성을 극적으로 증가시켰지만, 단백질의 치료학적 용도는 다른 요인들, 예컨대 응집, 단백질 분해, 빈약한 생물학적 활성 및 효과적인 배합을 방해하는 물리적 성질에 의해서 종종 방해받는다. 본 발명에 있어서 재조합적으로-유도된 단백질 및 자연발생적-유도된 단백질 내의 시스테인 잔기상의 매우 반응성이 큰 설프히드릴기는 유도체화되어 단백질 표면상의 유효전하, 및 그로 인하여 등전점을 변화시키거나, 또는 표면-개질 중합체를 단백질에 결합시킨다.
전하 등전점을 변화시키는 잇점은 단백질 배합물의 pH가 등전점과 상당히 다를 경우 단백질의 최소화되기 때문이라는 것이 공지되어 있다. 따라서 등전점의 조절은 응집을 최소화하는 기술을 가능하게 한다.
또한, 단백질 배합을 증진시키기 위한 다른 기전은 단백질을 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아닌 유도체화 화합물과 공역화시키는 것에 의한다. 인식된 잇점들의 일부는, 감소된 면역원성 및 항원성 증가된 활성지속 시간 및 변형된 약물운동학적 성질을 포함한다[F.M. Veronese, Chimicaoggi (1989) 53].
지금까지, 단백질에 중합 분자를 부착시키는 것은 주로 리신 또는 다른 염기성 아미노산을 통해서였다. 이는 알킬화제, 예컨대 트리아진 유도체, 디아조늄염 또는 활성 아실화제, 예컨대 숙신산 유도체로 실행되었다. 이들 반응은 조절하기 어려웠으며, 단백질내 필수아미노산과의 반응으로 인해 생물학적 활성의 상당한 손실이 자주 발생했다 [F.F. Davis et al Polymer (1979) 20 357 참조].
대조적으로, 본 발명은 단백질내에서 자연 발생하거나 부위 특이 돌연변히 유발과 같은 방법에 의해 단백질내로 함입된 보다 덜 풍부한 시스테인 잔기를 개질시키는 선택적 방법을 제공한다.
본 발명의 목적은 생물학적으로 효과적이면서 투여하기에 안정한 (포유류, 조류 및 물고기의) 소마토트로핀, 포유류 IGF-1 및 IGF-2, 인터루킨 및 인터페론, 프로우로키나제(prourokinase), 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor) 및 안티트롬빈 Ⅲ을 포함하지만 이에 제한되지 않는 유도체화된 단백질의 조성물을 제공하는 것이다. 또한, 앞에서도 언급했듯이, 상기 단백질은 그들의 천연 형태에서 시스테인 잔기를 함유하는 단백질에만 제한되지 않는데, 이는 부위 특히 돌연변이 유발 기술을 사용하여 상기 단백질내 유리한 부위에 시스테인을 도입하도록 하기 때문이다. 본 발명의 또 다른 목적은 비경구적으로 투여하기에 적합한 생물학적으로 활성인 재조합 및/또는 천연 단백질의 조성물을 제공하는 것인데, 상기 조성물은 제약학적 및 약리학적으로 허용가능한 고체 또는 액체 담체내의, 생물학적으로 활성량의 유도체화된 소마토트로핀 (동물 또는 사람의 유형)또는 다른 단백질 또는 제약학적 및 약리학적으로 허용가능한 그들의 염으로 구성된다.
본 발명의 또 다른 목적은 임의의 시스테인-함유 단백질을 개질시킬 수 있는 신규한 조성물을 제공하는 것이다. 이온화 가능한-관능기의 성질 및 수 및/또는 표면-개질 중합체의 크기 및 성질을 신중하게 선택함으로써 현저하게 다른 물리적 성질을 갖는 유도체화된 단백질이 생산된다.
본 발명의 이들 및 다른 목적들은 하기에 기술된 본 발명의 보다 상세한 설명에 의해서 명백해질 것이다.
본 발명은 소마토트로핀, IGF-1 및 IGF-2, 인터루킨, 인터페론, 프로우로키나제, 종양 괴사 인자 및 안티트롬빈 Ⅲ를 포함하지만 이에 제한되지 않는 신규 유도체화된 재조합 또는 천연 단백질에 관한 것으로서, 여기서 단백질내의 적어도 하나의 자연-발생 또는 합입된 시스테인 잔기는 (CH2CO2R1), (CH2CONHR1), [CH(COR2)(CH2)x(COR3)], [CH2-CONHCH(COR2)(CH2)x-(COR3)] 또는 [CH2CONH(CH2)xCOR4]로부터 선택된 치환체로 유도체화되고; 상기에서 R1은 CH2CH2-(OCH2CH2)yOMe이고; R2및 R3는 H 또는 R4이고; R4는 NHCH2CH2(OCH2CH2)yOMe 또는 OCH2CH2(OCH2CH2)yOMe 이고; x는 1 내지 3의 정수이고 y는 10내지 300의 정수이며; 단 R2및 R3는 동시에 H 일 수 없고; 단 상기 단백질의 유도체화된 시스테인 잔기(들)가 유도체화되기 전에 디설파이드 결합을 형성한다면, 두개의 시스테인 모두는 유도체화 공정이 완결된 후에 동일한 설프히드릴 유도체를 함유할 것이다. 또한, 하나 이상의 디설파이드 결합을 함유하는 몇몇 단백질에 있어서, 상기 디설파이드 결합의 하나 이상을 선택적으로 분해할 수 있으며 선택적으로 분해된 이들 디설파이드 결합은 나머지 시스테인 잔기에 영향을 미침이 없이 유도체화될 수 있다. 디설파이드가 연속적으로 분해될 경우 하나 이상의 조성물로 서로 다른 시스테인들을 유도체화할 수 있다. 또한, 상기 단백질이 쌍을 이루지 않은(unpaired) 시스테인을 가질 경우, 이 잔기는 환원 단계 없이 유도체화된다.
본 발명은 또한 하기를 포함하는 신규 유도체화 화합물을 제공한다 : ZCH2CO2R1, ZCH2CONHCH(COR2)[(CH2)x(COR3)], ZCH(COR2)[(CH2)x-(COR3)] 또는 ZCH2CONH(CH2)xCOR4(여기에서 R1은 CH2CH2(OCH2CH2)y-OMe 이고, R2및 R3는 H 또는 R4이고; R4는 NHCH2CH2(OCH2CH2)yOMe 또는 OCH2CH2(OCH2CH2)yOMe 이고; Z는 Br 또는 I 이고; x는 1 내지 3의 정수이고 y는 10내지 300의 정수이며; 단 R2및 R3는 동시에 H 일 수 없다)
본 발명은 또한 상기 소마토트로핀의 55 및 166의 위치 또는 183 및 191 위치에서 시스테인 아미노산 잔기 사이의 두개의 디설파이드 가교 중 적어도 하나를 환원시키고, 그 후 55 및 166 위치 및/또는 183 및 191 위치에서 환원된 가교 또는 가교들을 갖는 시스테인 각각을 동일한 유도체로 유도체화시킴으로써, 재조합 동물 소마토트로핀의 응집을 저해하는 방법에 관한 것으로, 단 55 및 166 위치에서 시스테인 상의 유도체는 183 및 191 위치에서의 시스테인상의 치환체와 같거나 다른 치환체이다. 본 발명의 신규 유도체화된 재조합동물 소마토트로핀의 제조에 사용되는 치환체는 하기를 포함한다; (CH2CO2R1), (CH2CONHR1), [CH(COR2)(CH2)x(COR3)], [CH2CONH-CH(COR2)(CH2)x(COR3), 또는 [CH2CONH(CH2)xCOR4]; 여기에서 R1은 CH2CH2(OCH2CH2)yOMe이고; R2및 R3는 H 또는 R4이고; R4는 NHCH2CH2(OCH2CH2)yOMe 또는 OCH2CH2(OCH2CH2)yOMe 이고; x는 1 내지 3의 정수이고 y는 10내지 300의 정수이고; 단, R2및 R3는 동시에 H 일 수 없다.
본 발명은 또한 127 위치의 유리 시스테인을 상기 유도체로 유도체화 시킴으로써 인터루킨-2의 반감기를 증가시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 바람직한 신규 동물 소마토트로핀은 재조합 돼지, 소, 양, 사람, 조류 및 물고기의 소마토트로핀으로서, 소마토트로핀의 작은 고리내의 디설파이드 가교는 환원되고 183 및 191 위치에서의 시스테인은 (CH2CO2R1), [CH(COR2)(CH2)x(COR3)], [CH2CONHCH(COR2)(CH2)x(COR3)] 또는 [CH2CONH(CH2)xCOR4] (여기에서 R1, R2, R3,및 x는 상기 정의한 바와 같다)로부터 선택된 치환체로 유도체화된다.
또한, 본 발명의 또 다른 신규 단백질은 시스테인 잔기가 102 및 112 위치에서 Ser 및 Tyr 잔기 대신 치환되고, 글루탐산이 183 및 191 위치에서 정상적으로 발생하는 시스테인 잔기 대신 치환되는 동물 소마토트로핀 유도체이다. 이 단백질은 당분야의 숙련인에게 공지되어 있는 부위 특이 돌연변이 유발 기술에 의해 생산된다. 또한 이들 기술은 결합부위와 상호작용하거나 생물학적 효과를 유도하는 호르몬의 활성을 방해하거나 변경시키지 않는, 중합체에 대한 결합 부위를 도입하기 위해 다른 단백질과 함께 이용된다.
본 발명과 관련된 모든 플라스미드, DNA 서열 및 기탁된 미생물은, 달리 언급되는 경우를 제외하고, 뉴우저지주 프린스톤시에 위치하는 아메리칸 사이아나밋드 캄파니 배양물 수집소 및 미합중국 메릴랜드주 20952, 록크빌시에 위치하는 American Type Culture Collection (ATCC)에 기탁되어 있다.
본 발명의 바람직하게 개질된 재조합 동물 단백질은 전술한 바대로 동물 및 사람의 소마토트로핀, 인터루킨 및 인터페론을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 추가의 Asp-Gln 추가 치환체가 없거나 다른 치환체를 가지는 재조합적으로 유도된 소마토트로핀 또한 본 발명에 따라 제조된다. 아미노산 사슬 길이가 삭제되고, 아미노산 사슬 길이가 첨가되고, 아미노산이 교체되고(유도체화를 위한 추가의 시스테인), 활성 부위를 갖는 단편을 갖는 등의 또 다른 동물 단백질은 모두 본 발명의 영역내이다.
재조합 돼지 소마토트로핀
재조합 소 소마토트로핀
재조합 사람 소마토트로핀
재조합 IL-2
유도체화된 단백질
유도체화된 단백질은 수산화나트륨 또는 수산화암모늄과 같은 수성 염기로 pH 8.4로 조절된 구아니딘 히드로클로라이드, 중탄산나트륨 등의 수성 용액 또는 물에 단백질을 용해 또는 분산시킴으로써 제조된다. 디설파이드 결합의 환원이 요구된다면, 디티오트레이톨, 즉 (DL-트레오-1, 4-다이머-캡토-2, 3-부탄디올 DTT)를 상기 용액에 천천히 첨가한다. 첨가는 일반적으로 실온에서 질소 분위기하에서 실행된다. 결과 용액에 유도체화제를 첨가한다.
혼합물을 한시간 내지 4시간 동안 휘저어 섞는다. 반응 과정을 개질되지 않은 티올기의 엘만 적정(Ellman titration) 또는 겔 전기영동에 의해 관찰한다. 반응이 완결된 후, 한외여과에 의해 탈염시킨다. 이 용액을 농축시킨다음, 물, 수성 구아니딘 히드로클로라이드 등으로 수회 재희석하고 한외여과시킨다. 최종 여과물로부터의 잔사를 동결건조시켜서 유도체화된 단백질을 얻는다.
유도체화제 중 두가지의 제조는 N-Fmoc-Asp(tbu)OH 로부터 진행되며 반응 흐름도 1 및 2에 나타내었다. 폴리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르(PEG-OMe)로 부터 유도된 아민은 표준 방법을 사용하여 쉽게 얻을 수 있다. 이 아민은 디시클로헥실 카보디이미드(DCC) 또는 다른 관련된 탈수제를 사용하여 N-Fmoc-Asp(tbu)OH로 축합된다. 표준 실험 계획안(protocols)을 이용한 Fmoc 보호기의 제거는(Ⅰ)을 제공한다. (Ⅰ)을 요오도아세트산으로 축합하는 것은 DCC로 실행하고, 그 후 삼차-부틸 에스테르를 제거하여 알킬화제를 제공하게 됨으로써 실행된다. 중합체가 b-카르복실기에만 부착되거나 또는 a 및 b 카르복실기 모두에 부착된 유사한 유도체들이 사용된 출발 물질에 의존하여 제조될 수 있음이 명백하다.
흐름도 Ⅰ
숙신한 유도체 (흐름도 Ⅱ)는 또한 N-Fmoc-Asp(tbu)OH로부터 제조된다. 유리산은 DCC 및 피페리딘으로 탈보호된 아미노기와 함께 p-니트로벤조에이트(PNB)로 전환된다.
아미노기는 디아조늄염(i-아밀 니트레이트/HOAc)으로 전환된다. 활성 PNB 에스테르를 H2N-PEG-OMe 로 치환하면 중합성 측쇄가 도입된다. HI 로 처리하면 동시에 디아조 결합이 요오드로 치환되고 삼차-부틸 에스테르 보호기가 가수분해되어 최종 결과를 얻는다.
흐름도 2
N-보호된 3-아미노부티르산(흐름도 3)이 Fmoc-Asp(tbu)OH 대신 사용된다면, 대응하는 일가 관능기의 요오도아세트아미드 유도체가 제조된다.
마찬가지로, PEG-요오도아세테이트는 DCC-중개된 커플링에 의해 직접 제조된다.
중합체의 가교는 아미드 또는 에스테르를 경유할 수 있음이 명백하다. 이들 두개의 관능기는 가수분해에 대해 다른 적용성을 가지며, 바람직한 부착의 형태는 특정 적용에 따라 다를 것이다. 또한, PEG 중합체는 잠재적으로 유용한 다양한 분자량 범위에서 이용가능하다. 또한 중합체의 성질은 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리프로필렌 글리콜 만으로 한정될 필요는 없다. 다른 잠재적으로 유용한 중합체는, 폴리비닐 알콜, 덱스트란 및 탄수화물, 폴리피롤리돈을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
흐름도 3
부위 배향 돌연변이 유발
본 발명의 개질된 (치환된) 재조합 동물 (또는 사람) 소마토트로핀 또는 다른 단백질의 제조는 부위 배향 돌연변이 유발에 의해 달성된다. 특정부위에서 DNA의 클로닝된 부분의 DNA 서열을 변경하기 위한 통상적으로 이용되는 기술은 DNA의 단일 가닥 형태를 제조할 것을 요한다. 단일 가닥 DNA는, 올리고뉴클레오티드가 잘못 결합된(mismatch) 영역을 함유하는 경우를 제외하고는, DNA의 부분과 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드에 어니일링(annealing)된다. 잘못 결합된 영역은 통상적으로 올리고뉴클레오티드의 중심부에 위치한다. 어니일링된 혼합물은 그 다음 이중 가닥으로 만들어지고, T4 DNA 리가제 및 아데노신 5' 트리포스페이트의 존재하에 E. coli DNA폴리머라제 Ⅰ, 큰 단편 및 디옥시뉴클레오티드 트리포스페이트를 첨가함으로서 공유결합적으로 폐쇄된다. 이중 가닥 DNA는 적절한 E. coli 균주로 형질전환되는데, 여기에서 DNA의 잘못 결합된 영역은 수선되고 복제된다. 두개의 클론 집단이 얻어진다. 수선 합성을 위한 주형으로서 선택되는 가닥에 따라서, 클론은 야생형 또는 변형된(돌연변이된) 서열을 함유한다. 돌연변이된 서열을 함유하는 클론, 즉 올리고뉴클레이티드의 서열에 대응하는 클론은 방사성 동위원소-표시된 올리고뉴클레오티드에 대한 교잡화에 의해 선택된다. 올리고뉴클레오티드와 야생형 서열 사이의 잘못된 결합으로 인해, 방사성 동위원소-표시된 올리고뉴클레오티드는 돌연변이된 서열을 함유하는 클론에 보다 안전하게 결합된다. 따라서 적절한 온도에서의 배양은 야생형 및 돌연변이된 클론을 식별한다. 식별된 클론에 있어서의 변형은 관련 부분의 DNA 서열화에 의해 확인된다.
돌연변이 유발의 한가기 목적은 작은 고리의 디설파이드 결합을 형성할 수 없는 바람직하게-재조합적으로-유도된 돼지 소마토트로핀(rpST) 소마토트로핀 분자를 산출하는 것이다. 작은 고리 디설파이드는 183 및 191의 시스테인 사이에 위치한다. 또 다른 목적은 단백질 분해 부위로서 식별된 잔기 102 내지 112에 위치하는 오메가 고리내의 두개의 시스테인 잔기를 통합하는 것이다. 이와 같이 새롭게 통합된 시스테인은 여기에 기술된 방법을 이용하여 더 개질될 수 있다. 번호 부여 시스템은 기술된 바와 같다. 요구되는 변이주를 얻기 위해 사용되는 기본적인 방법은 하기와 같다.
Ser 102 및 Try 112 잔기의 치환은 두개의 올리고뉴클레오티드를 사용함으로써 달성된다. 두개의 올리고뉴클레오티드는 하기 서열을 갖는다 :
5' TTC ACC AAC TGT CTG GTG TTT 3' Ser102
5' GAC CGC GTC TGT GAG AAG CTG 3' Try112
단일 가닥 DNA의 주형은 pGEM3z-(f+)pST-SX DNA이다. 이러한 단일 가닥 DNA는 183 및 191 위치에서 보통 발견되는 시스테인 대신 두개의 Glu 잔기로 치환하도록 이미 개질되었다 (이러한 DNA는 하기 지시되는 바와 같이 발현 벡터 PR0211로 기탁됨). 2000ng의 단일 가닥 PGEM3z-(f+)pST-SX DNA를 아데노신 5' 트리포스페이트 및 폴리뉴클레오티드 키나제로 이미 5' 포스포릴화된, 50ng의 AA1 올리고뉴클레오티드와 혼합한다. 이 혼합물을 65℃에서 7분간 가열한 다음 10분간 실온에서 유지시킨다. 이 방법은 올리고뉴클레오티드를 단일 가닥 DNA에 어니일링시킨다. 어니일링된 DNA는 ATP, dNTP (4개의 데옥시리보뉴클레오티드 5' 트리포스페이트의 혼합물), T4 DNA 리가제 및 DNA 폴리머타제 Ⅰ 큰 단편을 첨가함으로써 공유 결합적으로 폐쇄된 형태의 이중 가닥으로 전환된다. 상기 혼합물을 실온에서 1시간 동안 배양한다. 그 다음 혼합물을 표준 절차에 의해서 HB101의 적당한 세포로 형질전환시킨다. 37℃에서 하룻밤 동안 배양 후,콜로니를 니트로셀룰로오즈 여과기 상으로 이동시키고 표준 방법에 의해 교잡시킨다. 형질 전환된 콜로니는 방사성 동위원소로 표시된 올리고뉴클레오티드 탐침을 이용하여 식별되었다. 플라스마 DNA는 이들 콜로니로부터 제조되어 전술한 바와 같은 HB101 적당한 세포내로 도입되고 방사성 동위원소로 표식된 올리고뉴클레오티드 탐침으로 재스크리닝된다. 플라스미드 DNA는 다시 탐침으로 교잡화된 콜로니로부터 제조된다. pGEM3z-(f+)pST-SXE로 지정된, S102C 돌연변이를 함유하는 하나의 클론으로부터의 플라스미드 DNA를 형질전환에 의해서 JM101 적당한 세포 및 단일 형질 전환체로부터 유도된 정제된 파이지로부터 제조된 단일 가닥 DNA 내로 도입시킨다.
112 위치에서 티로신을 돌연변이시키기 위하여 하기 서열의 제2올리고뉴클레오티드를 사용한다.
5' GAC CGC GTC TGT GAG AAG CTG 3'
돌연변이 유발 방법은, 주형 DNA가 pGEM3z-(f+)pST-SXE-S102C (이는 102 위치에서 세린이 시스테인으로 전환된 돌연변이로부터 분리된 클론임) 및 183 및 191 위치에서 시스테인 대신 치환된 글루타민산이라는 것을 제외하고는 상기 기술된 바와 동일하다. 최종 세척온도는 56℃이다. DNA 서열은 식별된 클론이 기대되는 서열을 가짐으로 나타낸다. 돌연변이된 클론은 pGEM3z-(f+)pST-SXE-S102C, Y112C로 지정된다.
변경된(돌연변이된) 클론은 EPO 공고 제173,280호의 제5도에 기술된 바대로 세균의 발현 플라스미드 pR0211 (1988년 8월 23일 ATCC 기탁번호 제40483호로 기탁됨)내로 재구성된다. pGEM 클론을 EcoRI 및 HindⅢ 로 자르고 pST 유전자 단편을 분리했다. pR0211은 송아지 장의 알칼리 포스파타제 및 분리된 큰 단편으로 처리된 동일한 효소로 소화된다. 두개의 조각은 T4 DNA 리가제로 함께 결합되고, 적절한 세균 균주, 예컨대 기탁된 E. coli N99cI 로 형질전환된다.
이 균주에는 야생형 g 억제제가 존재한다. 이것은 pR0211 내의 PL촉진제로부터의 발현을 막는다. 적절한 구조가 분리되면, 이는 온도 민감 g 억제제를 함유하는 세균 균주, 예컨대 E. coli 4200 (1988년 8월 23일 ATCC 기탁번호 제67766호로 기탁됨)로 형질전환시킨다. 이들 균주내에서 pST의 발현은 온도에 의존한다. 42℃에서, 억제제는 불활성이고 발현이 발생한다. 이 단계에서, 발현이 발생하는 EP 공고 173,280호(참고로 여기에 통합됨)에 함유된 절차에 따라 pST가 제조된다. pST의 발현은 이들 특정의 E. coli 균주들에 제한되지는 않는다. 적절한 성질을 갖는 다른 균주들로 치환될 수도 있다. 이 플라스미드 발현 벡터는 ATCC에 기탁되어 있다. 세균 균주들은 별도로 기탁되어 있다.
적절한 코돈 및 올리고뉴클레오티드를 이용하여 다른 아미노산 치환체들이 상기 방법에 의해 제조될 수 있다. 유사하게, 이들 절차들은 다양한 동물 또는 인간의 소마토트로핀을 개질시키기 위해 사용할 수 있다.
사용 방법
본 발명의 신규한 동물 단백질은 동물의 질병을 완화하고; 동물, 특히 고기 생산 동물의 성장속도를 개선하고; 그로 이하여 먹이 이용의 효율을 증가시키는데 유용하다. 이들 화합물의 일부는 또한 상기 동물의 사체 품질을 증진시키는데, 즉 상기 동물의 지방이 적은 식용육 대 지방의 비율을 증진시키는데 효과적이다. 또한, 본 발명의 화합물들의 일부는 우유를 생산하는 동물에 있어서 우유 생산량을 증가시키고 양 및 가죽으로 인해 사육되는 다른 동물에 있어서 모 생산을 증진시키는데 효과적이다.
본 발명의 유도체화된 소마토트로핀이 상기의 생물학적 개선점을 달성하기 위한 동물의 처리에 유용한 반면에, 본 발명의 유도체화된 동물 소마토트로핀의 개선된 효율성 및 유용도는 상기 소마토트로핀의 유도체화에 의해 생산되는 소마토트로핀의 응집 저해에 부분적으로 기여한다. 이러한 저해는 기술된 바와 같이 본 발명에 의해 유도체화되지 않는 본래의 소마토트로핀 또는 재조합 소마토트로핀으로는 용이하게 또는 효과적으로 달성되지 않는 현저하게 개선된 지속 방출 조달 시스템이 제조될 수 있도록 한다.
본 발명의 유도체화된 소마토트로핀은 이량체의 형성으로 인하여 실질적으로 응집이 생기지 않으며 매우 안정하다는 것이 또한 발견되었다. 또한, 본 발명의 유도체화된 소마토트로핀은 매우 개선된 지속 방출 조성물의 제조에 사용될 수 있다.
본래의 동물 소마토트로핀이 하루만에 응집되는 것으로 밝혀진데 반해, 본 발명의 개질되거나 유도체화된 소마토트로핀을 함유하는 비경구용 조성물은 10일 이상 동안 개질되거나 유도체화된 소마토트로핀을 계속해서 방출한다.
조성물
실제로, 본 발명의 조성물은 생물학적으로 활성인 비경구용 조성물 형태로 동물에 주사함으로써 일반적으로 투여된다. 본 발명의 재조합 동물 단백질의 투여에 유용한 비경구용 조성물에는 겔, 페이스트, 미소구, 마이크로캡슐, 주입물(implants) 등이 있다. 이와 같이, 조절되는 방식으로 물질을 방출하여 투여 빈도를 감소시키는 생물학적으로 활성인 물질의 제형을 제공하는 것은 상당히 흥미롭다.
생물학적으로 활성인 거대분자의 지속 방출 조성물의 개발은 그들의 복잡한 작용 방식 및 거대분자의 복잡한 구조 때문에 특이한 문제점을 야기한다. 그러므로, 생물학적으로 활성인 소마토트로핀을 함유하는 효과적인 지속방출 조성물의 개발이 요구된다.
이러한 유형의 투여에 유용한 조성물은 개질 또는 유도체화된 동물 소마토트로핀을 묽은 수산화암모늄에 용해시킨 다음 거기에 알칼리 금속 벤조에 이트, 라우레이드, 카보네이트 등의 용액을 첨가시킴으로써 제조된다. 그 다음 비이온성 계면활성제를 용액과 혼합하고 결과 혼합물을 분무건조시킨다. 이렇게 형성된 고체를 용융 지방 또는 왁스 또는 그의 혼합물과 혼합하고, 결과의 용융 혼합물을, 유입 공기 및 용융상을 용융점 이상의 온도에서 유지하기 위해 가열 자켓이 장착된 공기/액체 분무 노즐을 통해 분무시킨다. 미소구는 용융 방울이 냉각되면서 형성된다. 미소구는 약 45 내지 180 미크론 범위의 원하는 크기로 일련의 체(sieves)상에 수집되어 사용하기 위해 보관된다. 바람직한 크기 범위가 아닌 미소구는 재순환시킨다. 대안적으로, 균질한 혼합물을 원심분리 디스크 및 상기와 같이 수집되어 형성된 미소구 위로 공급하고, 또는 용융 혼합물을 냉각시켜 바람직한 평균 입자 크기 범위로 분쇄시킨다.
그 다음 생물학적으로 활성인 미소구를 동물내로 주입하기 위해 제약학적 및 약리학적으로 허용가능한 액체 부형제 내에 분산시킨다. 미소구-액체 조성물은 일반적으로 동물의 머리, 목 또는 귀 주위의 피부 밑으로 피하주사함으로써 투여된다.
본 발명의 유도체화된 동물 단백질은 또한 통상적인 펠릿 주입 건(gun)을 사용하여 동물의 피부 밑으로 주사되는 생물학적으로 양립 가능한 주입물로서 제조된다. 조성물은 분말의 유도체화된 소마토트로핀을 캐스터 왁스와 같은 왁스와 혼합하거나 또는 공중합(글리콜리드/락티드), 마그네슘 히드록사이드, 및 프로필렌 옥사이드와 프로필렌 글리콜의 축합에 의해 형성된 소수성 염기와 함께 제조되는 에틸렌 옥사이드의 축합물의 혼합물과 함께 혼합함으로써 제조된다. 이렇게 제조된 조성물은 펠릿화 프레스 내로 도입되어 직경 1/8인치의 원통형 펠릿으로 성형된다. 이렇게 형성된 펠릿은 통상적인 펠릿 주입 건에 의해 투여된다.
본 발명은 하기의 실시예에 의해 더 설명될 것이다.
[실시예 1]
N-Fmoc-Asp(tbu)NH-PEG-OMe의 제조
1.24g (3mM)의 Fmoc Asp(tbu)OH 및 40mL의 CH2Cl2의 용액에 0.3g (1.5mM)의 디시클로헥실카보디이미드를 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 한시간 동안 휘저어 섞는다. 침전된 디시클로헥실우레아를 여과하여 버리고 평균분자량(Mw) 2000의 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 아민 3g을 첨가한다. 반응물을 실온에서 하룻밤 동안 휘저어 섞는다. 염화메틸렌을 증발시키고 잔사를 300mL의 H2O에 용해시킨다. 이 용액을 여과한 다음, YM-2 아미콘 막을 통해 한외여과시키고 동결건조시켜 3g의 생성물을 수득한다.
[실시예 2]
H2N-Asp(tbu)NH-PEG-OMe의 제조
실시예 1로부터의 3g Fmoc-NHAsp(tbu)NH-PEG-OMe를 실온에서 30mL의 피레리딘-염화메틸렌 (1:1 v/v)에 첨가하고 30분간 휘저어 섞는다. 염화메틸렌을 증발시키고 잔사를 200mL의 H2O에 용해시키고 아미콘 YM-2 막을 통해 한외여과시킨다. 잔류 수성 용액을 동결건조시켜 2.5g의 생성물을 수득한다.
[실시예 3]
ICH2CONHAsp(tbu)NH-PEG-OMe의 제조
0.427g의 요오도아세트산 및 20mL의 염화메틸렌의 용액에 0.237g의 DCC를 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 한시간 동안 휘저어 섞는다. 침전된 디시클로헥실우레아를 여과하고 2.5g H2N-Asp(tbu)NH-PEG-OMe를 첨가하며, 혼합물을 실온에서 3시간 동안 휘저어 섞는다 (닌히드린 테스트가 음성이 될 때까지). 염화메틸렌을 증발시키고 잔사를 물에 용해시키고 아미콘 YM-2 막을 통해 한외여과시킨다. 이 용액을 동결건조시켜 2.6g의 생성물을 수득한다.
[실시예 4]
ICH2CONHAsp(OH)NH-PEG-OMe의 제조
2.6g의 ICH2CONHAsp(tbu)NH-PEG-OMe를 40mL의 트리플루오로 아세트산/염화메틸렌 (1:1 v/v)에 용해시키고 혼합물을 실온에서 한시간 동안 휘저어 섞는다. 용매를 증발시키고 잔사를 200mL의 H2O에 용해시킨다. 용액을 아미콘 YM-2 막을 통해 한외여과시키고 0℃에서 수산화암모늄으로 중화시킨다. 동결건조시켜 2g의 ICH2CONHAsp(OH)NH-PEG-OMe를 수득한다.
[실시예 5]
[MeO-PEG-NHCOAsp(OH)NHCOCH2)Cys183,191]-rpST의 제조
200mL의 0.5M NH4HCO3(pH=8.4)내 400mg r-pST의 용액에 28.0mg의 디티오트레이톨을 첨가하고, 반응 혼합물을 1시간 동안 휘저어 섞는다. 이렇게 환원된 r-pST에 1g의 MeO-PEG-NHCOAsp(OH)NHCOCH2I를 첨가하고 혼합물을 3시간 동안 휘저어 섞는다. 엘만(Ellman) 시험은 유리 티올이 잔존한다는 것을 나타내며, 따라서 추가 1g의 요오도아세트아미드 유도체를 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 18시간 동안 휘저어 섞는다. 반응 혼합물을 희석하고, 아미콘 YM-10 막을 통해 한외여과하고 동결건조시켜 400㎎의 생성물을 수득한다.
[실시예 6]
Fmoc NH Asp(tbu)COPNB의 제조
8g의 Fmoc NH Asp(tbu)OH 및 250mL의 염화메틸렌의 용액에 2.01mg 의 DCC 를 첨가하고 결과 용액을 실온에서 1.5시간 동안 휘저어 섞는다. 침전된 디시클로헥실우레아를 여과하고 1.35g의 4-니트로페놀을 첨가하며 반응혼합물을 18시간 동안 휘저어 섞는다. 용액을 냉각시키고 차가운 5% Na2Co3및 염수로 세척한다. 건조한 후에, 용액을 증발시켜 4.27g의 생성물을 수득한다.
[실시예 7]
H2NCH(CO2PNB)CH2CO2 tbu 의제조
2g의 Fmoc NHCH(CO2PNB)CH2CO2 tbu 를 피페리딘 및 염화메틸렌(1:1 v/v)의 얼음 냉각 혼합물 30mL에 첨가하고 0℃에서 2시간 동안 휘저어 섞는다. 용매를 증발시키고 잔사를 염화메틸렌에 재용해시키고 차가운 0.1N HCl, 물 및 염수로 세척한다. 결과 용액을 건조시키고 증발시켜 0.83g의 생성물을 수득한다.
[실시예 8]
N2CH(CONH-PEG-OMe)CH2CO2 tbu 의제조
2.0g의 H2NCH(CO2PNB)CHCO2 tbu, 0.91g의 i-아밀 니트리트(i-amylnitrite), 3방울의 HOAc 및 100mL의 CH2Cl2의 용액을 2시간 동안 환류시킨다. 휘발성 용매를 증발시키고 잔사를 50mL의 CH2Cl2에 재용해시키고 5g의 MeO-PEG-NH2를 첨가한다. 혼합물을 실온에서 하룻밤 동안 휘저어 섞는다. 용매를 증발시키고 잔사를 H2O에 용해시키고 아미콘 YM-2 막을 통해 한외여과시킨다. 동결건조시켜 1.48g의 생성물을 얻었다.
[실시예 9]
ICH(CONH-PEG-OMe)CH2CO2H의 제조
0.5g의 N2C(CONH-PEG-OMe)CH2CO2H 용액을 50mL의 CHCl3에 용해시켜 0℃까지 냉각시킨다. 2mL의 HI를 조심스럽게 첨가하고 반응물을 0℃에서 30분간 휘저어 섞은 다음 2시간 동안 28℃로 데운다. 용액을 증발시키고, 30mL H2O에 용해시키고, 아미콘 YM-2 막을 통해 한외여과시킨다. 동결건조시키면 0.3g의 생성물이 남는다.
[실시예 10]
[(MeO-PEG-NHCOCH(CH2CO2H)Cys183, 191)]의 제조
250mL의 0.5N NaHCO3(pH 8.4) 내 500mg rpST 의 용액에 35mg의 디티오트레이톨을 첨가하고 반응 혼합물을 1시간 동안 휘저어 섞는다. 환원된 rpST 에 2.0g의 MeO-PEG-NHCOCH(CH2CO2H)를 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 밤새도록 휘저어 섞는다. 반응 혼합물을 H2O로 희석하고 아미콘 YM-10 막을 통해 한외여과시키고 동결건조시켜 510㎎의 생성물을 수득한다.
[실시예 11]
MeO-PEG-OCOCH2I의 제조
250mL의 메틸렌내 5g 요오도아세트산의 용액에 2.76g의 DCC를 첨가한다. 반응 혼합물을 주위 온도에서 2시간 동안 휘저어 섞고 침전된 디시클로헥실우레아를 여과시켜 제거한다. 잔류 용액에 20g의 MeO-PEG-OH를 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 하룻밤 동안 휘저어 섞는다. 그 다음 용액을 냉각시키고 분별 깔때기로 이동시켜 차가운 포화 NaHCO315x 10mL로 추출한다. 잔류 염화메틸렌 용액을 증발시키고 잔사를 30mL 의 H2O 에 용해시킨다. 이 용액을 아미콘 YM-2 막을 통해 한외여과시키고 최종적으로 동격건조시켜 5.4g의 생성물을 수득한다.
[실시예 12]
두개의 합성 올리고뉴클레오티드를 이용한 시스테인의 돼지 소마토트로핀의 오메가 고리내로의 도입
S102C 로 지정된 합성 올리고뉴클레오티드는 하기 서열을 갖는다 :
5' TTC ACC AAC TGT CTG GTG TTT 3'
이러한 올리고뉴클레오티드는 102 위치에서 세린 코돈을 암호화하는 DNA가 시스테인을 암호화하는 DNA로 교체되었다는 점에서 rpST 유전자의 유사 DNA 서열과 다르다. 따라서 102 위치에 존재하는 세린은 시스테인으로 교체된다.
단일 가닥의 pGEM-3z(f+)pST-SX DNA 는 돌연변이 유발을 위한 기질이다. 이 DNA는 상업적으로 구입가능한 파지미드(phagemid), pGEM-3z(f+)에 함유된 개질된 rpST 로 구성된다. rpST 유전자의 개질은 DNA 서열의 변형을 일으켜, 암호 영역의 225-230 위치에 Sac I 제한 엔도뉴클레아제(endonuclease) 절단 부위가 도입되도록 하며, 285-290 위치에 Xba I 제한 엔도뉴클레아제 절단 부위가 도입되도록 한다. DNA 서열에 있어서 이러한 변경은 rpST 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는다. rpST 유전자의 두개의 기타 개질은 DNA 서열을 변경시켜 183 및 191 위치에서 시스테인 잔기를 글루타민산으로 각각 교체시킨다. 이렇게 개질된 rpST-SXE 유전자를 함유하는 EcoRI/Hind III 단편을 표준 방법을 이용하여 이들 엔도뉴클레아제로 절단된 pGEM-3z(f+) DNA 내로 클로닝시키면, 파지미드 pGEM-3z(F+)-pST-SX 가 초래된다. 단일 가닥은 표준 방법에 의해 정제된 파아지로부터 제조된다. 2000ng 의 이러한 DNA는 100ng의 C183del 올리고뉴클레오티드와 혼합되는데, C183del 올리고뉴클레오티드는 그의 5' 말단에서 아데노신 5' 트리포스페이트 및 폴리뉴클레오티드 키나제로 미리 포스포릴화되었다. 혼합물은 1X 어니일링 완충액 (1X 어니일링 완충액은 75mM KCl 및 5mM트리스-Cl, pH 8.0이다) 내 총 부피 10ml에 함유된다. 혼합물은 65℃ 에서 7분간 가열한 후에 실온에서 10분간 배양시킨다. 이 공정은 올리고뉴클레오티드가 단일 가닥 기질 DNA에 어니일링되도록 한다. 어니일링된 분자는 22ml H2O, 1ml 20mM ATP, 각각이 T4 DNA 리가제 및 DNA 폴리머라제 I 큰 단편인 2 유니트 (유니트의 정의는 New England Biolabs catalogue , 1986참조), 2ml 20 X dNTP (각각 2mM 농도의 4개의 데옥시리보뉴클레오티드 5' 트리포스페이트의 혼합물) 및 완충액 내 4ml 10X 양(fill)(완충액 내 1X 양은 27.5 mM Tris-Cl pH 7.5, 15 mM MgCl2, 2mM DTT임)을 첨가함으로써, 공유결합적으로 폐쇄된 이중 가닥으로 연장 및 전환된다. 실온에서 한시간 동안 배향 후 반응물의 반을 HB101 적당한 세포 내로 표준 형질 전환 방법에 의해 도입시킨다. 37℃에서 하룻밤 동안 배양시킨 후, 콜로니를 니트로셀룰로오즈 여과기 상으로 옮기고 표준 방법으로 교잡화시킨다. 올리고뉴클레오티드 S102C는 그이 5' 말단을 q-32P-ATP 및 폴리뉴클레오티드 키나제로 방사성 동위원소에 의한 표지를 함으로써 원하는 돌연변이를 감지하는데 사용된다. 37℃에서 5X SSC 내에서 3시간 동안 예비교잡화시킨 후에 1X Denhardt 및 150mg/ml의 효모 tRNA, 방사성 동위원소로 표시된 올리고뉴클레오티드를 첨가하고 37℃에서 하룻밤 동안 여과기 상에서 DNA 와 교잡화되도록 방치한다. 여과기를 37℃에서 5X SSC 에서 30분간 세척한 후에, 58.0℃에서 TAC내에서 30분간 세척한다. 후자의 세척시, 플라스미드 DNA 가 원하는 돌연변이를 함유하는 콜로니만이 방사성 동위원소로 표시된 올리고뉴클레오티드탐침과 계속 교잡화될 것이다. 이들 콜로니는 세척한 여과기를 X-선 필름에 노출시킨 후에 감지된다. 플라스미드 DNA는 원래의 페트리 접시로부터의 몇몇 이들 콜로니로부터 제조되며, 전술한 바대로 HB101 적당한 세포내로 도입되고, 상기와 같이 방사성 동위원소로 표시된 올리고뉴클레오트드 탐침으로 재스크리닝된다. 플라스미드 DNA는 DNA 가 탐침과 교잡화되는 콜로니로부터 제조되어 원하는 DNA 서열에 대해 분석된다. pGEM-3z(f+)-pST-SXE-S102C 로 지정된 S102C 돌연변이를 함유하는 하나의 클론으로부터의 플라스미드 DNA는 형질전환에 의해 JM101 적당한 세포로 도입되며, 단일가닥 DNA는 형질전환체로부터 유도된 정제된 파아지로부터 제조된다.
112 위치에서 티로신-암호화 DNA를 시스테인-암호화 DNA로 치환하기 위해 Y112C로 지정된 하기 올리고뉴클레오티드가 합성된다 :
5' GAC CGC GTC TFT GAG AAG CTF 3'
이러한 올리고뉴클레오티드는 112위치에서 티로신 코돈을 암호화하는 DNA가 시스테인을 암호화하는 DNA로 교체되었다는 점에서 rpST 유전자내의 유사 DNA와 다르다.
pGEM3z(f+)pST-SXE-S102C 로부터의 주형 단일 가닥 DNA 및 Y112C 올리고뉴클레오티드를 전술한 바와 같이 어니일링시키고, 연장시키고 결합시킨다. 이 혼합물을 HB101 적당한 세포내로 도입시키고 형질 전환체를 S102C에 대하여 정확시 기술된 바대로 돌연변이가 존재하는지에 대해 분석한다. Y112C 올리고뉴클레티드는 방사성 동위원소로 표시된 감지 탐침으로서 사용된다. 교잡화 및 세척 조건은 S102에 기술된 바와 같다. Y112C 돌연변이를 함유하는 수개의 클론이 DNA 서열 분석으로부터 식별된다. S102C 및 Y112C 돌연변이를 함유하는 플라스미드 DNA는 pGEM-3z(f+)pST-SXE-S102C, Y112C로 지정된다.
[실시예 13]
적절한 세균 발현 플라스미드로의 재구성
변형된(돌연변이된) 클론은 세균 발현 플라스미드 pRO211 (EP 173280에 기술되어 있음)로 재구성된다. M13 클론은 ECoRI 및 HindIII 으로 절단되고 pST 유전자 단편은 분리된다. pRO211 을 송아지 장의 알칼리성 포스파타제 및 분리된 큰 단편으로 처리된 동일한 효소로 클로닝시킨다. 두 조각을 T4 DNA 라가제로 함께 결합시키고 적절한 세균 균주, 예를들면 N99cl+로 형질 전환시킨다. 이 균주에는 야생형 g 억제인자가 존재한다. 이는 pRO211 내의 P2프로모터로부터의 발현을 억제한다. 적절한 구성물이 분리되면, 이를 온도 민감성 g 억제인자를 함유하는 세균 균주, 예컨대 4200으로 형질전환시킨다. 이들 균주내에서 rpST 의 발현은 온도에 의존한다. 42℃ 에서 억제인자는 불활성이고 발현이 일어난다. 이 단계에서, rpST 는 여기에 참고로 통합된 EP 173280 호에 기술된 방법에 의해 제조될 수 있다. pST 유전자 생성물의 발현을 위해 사용되는 E. coli 균주는 E. coli 4200에 제한되는 것은 아니다. 임의의 적절한 E. coli 균주가 이용될 수 있다.
실시예 1, 2 및 3의 절차를 따르지만 183 및 191 위치에서 시스테인을 알라닌, 세린, 글로타민산, 아르기닌, 트립토판 또는 아스파라긴에 대한 적절한 코돈으로 치환함으로써, 상기 위치에서 시스테인에 대한 TGT 를 세린에 대한 TCT, AGC 또는 AGT 로, 글루타민산에 대한 GAG 또는 GAA 로, 아르기닌에 대한 CGN, AGA 또는 AGG 로, 아스파라긴에 대한 AAT 또는 AAC 로, 알라닌에 대한 GCG 로, 또는 트립토팜에 대한 TGG 로 전환시킨다.
[실시예 14]
[(MeO-PEG-OCOCH2)Cys102,112,Glu183,191]rpST 의 제조
150mL 의 0.5 N NaH2O3(pH=8.4)내 200mg Cys102,112Glu183,191rpST 용액에 28mg의 디티오트레이탈을 첨가하고 용액을 한시간 동안 휘저어 섞는다.
용액에 500mg의 MeO-PEG-O2CCH2I (-550)을 첨가하고 반응 혼합물을 8시간 동안 실온에서 휘저어 섞는다. 반응 혼합물을 아미콘 YM-10 막을 통해 한외여과시켜서 135mg 의 생성물을 수득한다.
[실시예 15]
[(MeO-PEG-NHCOCH)Cys127]인터루킨-2의 제조
25mg의 인터루킨-2 가 25mL의 0.5 N NaH2O3(pH=8.4)에 용해된 용액에 20mg 의 MeO-PEG-NHCOCH2l (-2000)을 첨가하고 반응 혼합물을 48시간 동안 유리 티올이 감지되지 않을 때까지 휘저어 섞는다. 반응 혼합물을 아미콘 YM-10 말을 통해 한외여과시켜 16mg 의 생성물을 수득한다.
[실시예 16]
[(MeO-PEG-OCOCH2)Cys183,191]r-pST 의 제조
250mL의 0.5 N NaHCO3(pH=8.4)내 400mg rpST 용액에 28mg의 디티오트레이톨을 첨가하고 용액을 1시간 동안 휘저어 섞는다. 이 용액에 1.0g의 MeO-PEG-O2CCH2I (=2000) 1.0g을 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 6시간 동안 휘저어 섞는다. 반응 혼합물을 아미콘 YM-10 막을 통해 한외여과시키고 최종적으로 동결건조시켜 420mg 의 생성물을 수득한다.
[실시예 17]
유도체화된 재조합 동물 소마토트로핀을 수용하는 동물의 성장 향상을 측정하기 위한 하수체가 절단된 쥐(Hypox rat) 시험 방법
동물의 성장속도를 변경하는데 있어서 본 발명의 다양한 유도체화된 제조합 동물 소마토트로핀의 효과는 표준 하수체 절단된(hypox) 쥐 분석을 이용하여 결정된다. 하수체 절단된 쥐는 자체의 성장 호르몬을 생산하지 못하여 주입된 소의 성장 호르몬에 민감하다. 측정된 반응은 예컨대 10일 정도의 시간 동안의 성장이다.
하수체가 절단된 알비노 쥐(타코닉 농장, Sprague-Dawley-derived)각각에 실시예에 따라 재조된 조정물의 충분한 양을 주사하여 나열된 배합물 0.2ml 내의 800 마이크로그램 (80 마이크로그램/일)의 rpST의 10-일 투여량을 제공한다. 대안적으로, 하수체가 절단된 알비노 쥐 각각에 rpST 유도체 80 마이크로그램을 매일 주사한다.
[시험 절차]
시험하기 전에 동물의 중량을 측정하고 체중을 기준으로 하여 시험에 사용하기 위한 동물을 선택한다. 체중이 그룹의 평균 체중으로부터의 표준편차인 동물들만이 선택된다. 이러한 결과 그룹을 컴퓨터 산출 임의 추출절차에 의해 8마리의 쥐/그룹으로 구성된 처리 그룹으로 임의로 분류한다. 이 시험 동물들을 깨끗한 우리로 이동시키고 하나의 우리에 4마의의 쥐를 수용한다. 시험 동물 연구 첫날 시험동물들의 체중을 재고 과다한 체중 증가 또는 손실(±5 그램)을 갖는 동물은 교체했다. 그리고 나서 동물을 시험 그룹으로 배정하고 처리했다.
10일 시험 주기의 마지막에 각각의 동물에 대한 총중량 증가를 기록하고 각 처리에 대한 쥐의 평균 체중 증가를 측정한다. 하기 표1에 요약되어져 있는 이들 시험 결과는 이들 유도체의 생물학적 활성을 보여준다.
상기 데이타로부터, 평가된 각각의 유도체화된 재조합 돼지 소마토트로핀이 생물학적으로 활성이며 동물의 우수한 성장을 제공한다는 것이 확인된다.
[실시예 18]
개질 또는 유도체화된 재조합 동물 소마토트로핀의 안정성
pH 7.4의 인산염 완충 식염수 (NaH2PO4H2O 3.45gm, Na2HPO43.55gm, NaCl 9.50gm 를 증류수에 용해시켜 1000ml가 되도록 함)내에서 제조합 동물 소마토트로핀 유도체 (100mg/ml 이하)의 농축 용액을 제조한다. 이것을 밀리포어(millipore) 무균 Millex-0.22um 여과기 장치를 통하여 여과시키고 0.1ml 분량을 튜브내에 넣는다. 이것을 45℃ 오븐에 놓고 요구되는 간격으로 제거한다. 그 다음 내용물을 인산염 완충 식염수로 희석시킨다. 상등액을 HPLC 에 의해 단량체 및 이량체 함량에 대해 분석한다. 결과를 초기 농축물과 비교하고 안정성을 평가한다.
대안적으로, pH 7.4 에서 빈약한 용해도를 보여주는 소마토트로핀 유도체를 보다 덜 바람직한 pH (4-10) 에서 용해시키거나 현탁액으로서 평가한다 (표2 참조).
[실시예 19]
[(MeO-PEG-OCCH)Cys ]rpST 를 이용한 주입물의 제조 및 생체내 용해에 의한 상기 주입물의 평가
한 세트의 주입물들을 96mg 의 -270 매쉬 카스트로왁스 및 64mg 의 분말 [(MeO-PEG-OCCH)Cys ]rpST 및 rpST 로부터 제조한다. PEG의 평균 분자량은 2000이다. 혼합물을 교반하여 넓은 표면의 페트리 접시위로 붓고 실온에서 CHCl를 증발시키고 진공 건조로 건조시킨다. 건조된 잔사를 수집하여 약 1000 psig 에서 카버 프레스(Carver Press)를 사용하여 1/8 직경의 원통형 주입물로 성형한다. 이렇게 형성된 주입물의 중량은 각각 60 내지 70mg이다. 이렇게 제조된 주입물을 생체내 용해 평가에 적용시킨다. 각각의 주입물을 10ml 의 인산염 완충 용액(0.05% Na 아지드로 pH 7.4)을 함유하는 분리된 플라스틱 시험관에 넣고, 이 시험관들을 장치 내 물의 온도가 39℃ 에서 유지되면서 시험관이 흔들어지는 요동 물 선반에 놓는다. 시험관을 하룻동안 요동시킨 다음 용액을 각 시험관으로부터 제거하여 HPLC 에 의하여 rpST에 분석한 다음 용액에 버린다. 새로운 인산염 완충 용액을 각 시험관에 첨가하고 시험관을 그 후에 3일간 더 요동시킨다. 각각의 시험관으로부터의 용액을 HPLC 에 의해 rpST 에 대해 다시 분석하고 용액은 다시 버린다. 새로운 인산염 완충액을 다시 각 시험관에 첨가하고 시험관을 다시 3일간 요동시킨 다음 다시 rpST 에 대해 분석한다.
인산염 완충 용액은 NaHPO·HO 3.45g, NaHPO4 3.55g, NaCl 9.5g을 1000ml 가 될 때까지 증류수에 용해시킨 것이다 (표 3 참조).

Claims (6)

  1. 소마토트로핀의 하나 이상의 시스테인 잔기가 (CH2CO2R1),(CH2CONHR1), [CH(COR2)(CH2)x(COR3)], [CH2CONHCH(COR2)(CH2)X-(COR3)] 또는 [CH2CO NH-(CH2)XCOR4] (여기에서 R1은 CH2CH2(OCH2CH2)y-OMe 이고; R2및 R3는 H 또는 R4이고; R4는 NHCH2CH2(OCH2CH2)yOMe 또는 OCH2CH2(OCH2-CH2)yOMe 이고; x 는 1 내지 3의 정수이고 y 는 10 내지 300의 정수이며; 단 R2및 R3는 동시에 H일 수 없고, 상기 소마토트로핀의 유도체화된 시스테인 잔기가 유도체화되기 전게 디설파이드 결합을 형성한다면, 두개의 시스테인 모두는 동일한 설프히드릴 유도체를 함유할 것임) 로 구성되는 치환체로 유도체화되는, 유도체화된 소마토트로핀.
  2. 제1항에 있어서, 상기 소마토트로핀은 그의 본래 형태에 하나 이상의 시스테인 잔기를 함유하는 유도체화된 소마토트로핀.
  3. 제1항에 있어서, 상기 소마토트로핀은 소마토트로핀 본래의 형태에 첨가 또는 치환된 시스테인 잔기를 갖는 유도체화된 소마토트로핀.
  4. 제1항에 있어서, 상기 소마토트로핀이 Cys102,112Glu183,191pST 또는 Glu183,191p ST 인 유도체화된 소마토트로핀.
  5. 제약학적으로 유효량의 제1항에 따란 개질 또는 유도체화된 소마토트로핀 또는 제약학적으로 허용가능한 그의 염; 및 제약학적으로 허용가능한 고체 또는 액체 담체로 구성되는, 동물의 장기간에 걸친 성장 속도를 증가시키는데 효과적인 제약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 조성물은 동물에 비경구적으로 투여되는 조성물.
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Families Citing this family (25)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof
GB9100381D0 (en) * 1991-01-09 1991-02-20 Erba Carlo Spa Human bfgf derivatives,their analogs and process for their production
AU2147192A (en) * 1991-06-28 1993-01-25 Genentech Inc. Method of stimulating immune response using growth hormone
US5336488A (en) * 1991-08-07 1994-08-09 American Cyanamid Company Method of treating or preventing mastitis in animals with involuting mammary glands by administering recombinant cytokines
JP2704214B2 (ja) * 1991-12-10 1998-01-26 タノックス バイオシステムズ インコーポレイテッド 非対合システイン残基を有するサイトカイン及びその結合体
EP0679095A1 (en) * 1992-11-25 1995-11-02 Amgen Boulder Inc. Modified insulin-like growth factors
EP0622394A1 (en) * 1993-04-30 1994-11-02 S.A. Laboratoires S.M.B. Reversible modification of sulfur-containing molecules with polyalkylene glycol derivatives and their use
EP1881005B1 (en) 1997-07-14 2013-04-03 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of G-CSF and related proteins
US6753165B1 (en) 1999-01-14 2004-06-22 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
US20080076706A1 (en) 1997-07-14 2008-03-27 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of Growth Hormone and Related Proteins, and Methods of Use Thereof
US7153943B2 (en) 1997-07-14 2006-12-26 Bolder Biotechnology, Inc. Derivatives of growth hormone and related proteins, and methods of use thereof
US7495087B2 (en) 1997-07-14 2009-02-24 Bolder Biotechnology, Inc. Cysteine muteins in the C-D loop of human interleukin-11
US7270809B2 (en) 1997-07-14 2007-09-18 Bolder Biotechnology, Inc. Cysteine variants of alpha interferon-2
AU2008202371B2 (en) * 1999-01-14 2012-08-02 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
US8288126B2 (en) 1999-01-14 2012-10-16 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
EP1284987B1 (en) 2000-05-16 2007-07-18 Bolder Biotechnology, Inc. Methods for refolding proteins containing free cysteine residues
EP1352062A2 (en) * 2001-01-11 2003-10-15 Maxygen Aps Improved growth hormone molecules
MXPA04004809A (es) * 2001-11-20 2004-08-11 Pharmacia Corp Conjugados de hormona de crecimiento humana modificada quimicamente.
WO2004060299A2 (en) 2002-12-26 2004-07-22 Mountain View Pharmaceuticals, Inc. Polymer conjugates of interferon-beta with enhanced biological potency
US7524813B2 (en) 2003-10-10 2009-04-28 Novo Nordisk Health Care Ag Selectively conjugated peptides and methods of making the same
EP1677819A1 (en) * 2003-10-10 2006-07-12 Novo Nordisk A/S Long-acting molecules in sustained release formulations
WO2007041614A2 (en) 2005-10-03 2007-04-12 Bolder Biotechnology, Inc. Long acting vegf inhibitors and methods of use
WO2008076933A2 (en) 2006-12-14 2008-06-26 Bolder Biotechnology, Inc. Long acting proteins and peptides and methods of making and using the same
CN106139158A (zh) 2010-01-22 2016-11-23 诺沃—诺迪斯克保健股份有限公司 体内功效延长的生长激素
US11045523B2 (en) 2013-04-05 2021-06-29 Novo Nordisk Healthcare Ag Formulation of growth hormone albumin-binder conjugate

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2514950B2 (ja) * 1986-03-10 1996-07-10 エフ・ホフマン―ラ ロシユ アーゲー 化学修飾蛋白質，その製造法および中間体
US4847325A (en) * 1988-01-20 1989-07-11 Cetus Corporation Conjugation of polymer to colony stimulating factor-1
EP0355460B1 (en) * 1988-08-24 2000-12-27 American Cyanamid Company Stabilization of somatotropins by modification of cysteine residues utilizing site directed mutagenesis or chemical derivatization
US5166322A (en) * 1989-04-21 1992-11-24 Genetics Institute Cysteine added variants of interleukin-3 and chemical modifications thereof

Also Published As

Publication number Publication date
GR3026436T3 (en) 1998-06-30
KR910020032A (ko) 1991-12-19
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PT97539A (pt) 1992-02-28
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NO911752L (no) 1991-11-05
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ATE163431T1 (de) 1998-03-15
AU639324B2 (en) 1993-07-22
NZ237959A (en) 1994-05-26
NO911752D0 (no) 1991-05-03
DK0458064T3 (da) 1998-04-27
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AU7607591A (en) 1991-11-07
JPH069696A (ja) 1994-01-18
FI912144A0 (fi) 1991-05-03
IL97932A (en) 1998-02-22
EP0458064B1 (en) 1998-02-25
EP0458064A2 (en) 1991-11-27
IE911511A1 (en) 1991-11-06
DE69128944D1 (de) 1998-04-02
DE69128944T2 (de) 1998-06-25
ES2113354T3 (es) 1998-05-01
CA2041742A1 (en) 1991-11-05
IL97932A0 (en) 1992-06-21

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