KR0130969B1 - 동물의 재조합 소마토트로핀과 그의 응집을 막는 방법 및 그를 포함하는 제약학적 조성물 - Google Patents
동물의 재조합 소마토트로핀과 그의 응집을 막는 방법 및 그를 포함하는 제약학적 조성물Info
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제1도는 M13mp11내로 돼지의 소마토트로핀 유전자를 클로닝시키는 것이다.
제2도는 AA1올리고뉴클레오티드 및 M3mp11p ST - 단일 가닥 DNA를 사용한 돌연변이 도표의 개략도이다.
제3도는 생거(Sanger)디데옥시 사슬종결법을 사용하여 M13mp11pST34 - 단일가닥 DNA와 M13mp11pST34 - 단일 가닥 DNA의 DNA서열을 분석해 놓은 것이다.
제4도는 올리고뉴클레오티드 GLU3 및 CLU4 및 M13mp11pST - 단일 가닥 DNA를 사용한 돌연변이 도표의 개략도이다.
제5도는 변이된 pST유전자를 함유하는 세균성 발현 벡터 구조의 개략도이다.
본 발명은 동물의 재조합 소마토트로핀의 (4)개의 시스테인 아미노산중 최소한 1개가 대치되고, 변형되고, 제거되거나 유도된 상기한 바의 변경되거나 유도된 동물의 신규한 재조합 소마토트로핀에 관한 것이다. 비록 소마토트로핀이 계속해서 재조합 되어왔다고는 하지만, 동물에게 유효하게 투여하기 위해 배합되는데 있어서는, 종종 어려움이 따르고 있었다. 이렇게 발현된 소마토트로핀과는 달리, 시스테인 유도화나 다른 아미노산의 대체로서, 소마토트로핀내에 존재하는 네 개의 시스테인 잔기를 변경시키거나 제거시키는 것은, 동물에게 투여하는데 허용가능한 방식으로 배합하는데 있어서 보다 나은 안전성을 가진, 생물학적으로 활성인 화합물을 유도시킨다..
따라서, 본 발명의 목적은, 소마토트로핀의 시스테인 잔기중 최소한 한 개를 다른 아미노산으로 대치시키고, 변형시켜, 제거하거나 화학적으로 유도시킨, 동물의 신규한 소마토트로핀을 제공하는 것이다. 본 발명의 또다른 목적은 동물의 소마토트로핀의 시스테인 잔기중 두 개, 세 개 또는 네 개 모두를 대치시키고/거나 유도시켜, 그들의 신규한 화합물을 제공하는 것이다. 두 개의 시스테인은 작은 루우프(loop)에 있고(나머지) 두 개는 큰 루우프내에 존재한다.
또한 본 발명은 생물학적으로 유효한, 상기 대치되고, 대체(변형)되고, 제거되고/거나 유도된 동물의 소마토트로핀의 조성물과 그것을 한츤 더 안정하게 투여하는 것을 목적으로 한다. 또 본 발명의 목적은, 동물의 성장속도를 5일 이상 연장시키도록 하기 위해, 성장촉진시키는 양의, 변형되거나 유도된 동물의 재조합 소마토트로핀이나 제약학적으로 또한 약리학적으로 허용가능한 그의 염과 함께 제약학적으로 또한 약리학적으로 허용가능한 고체나 액체 담체로 구성되는, 비경구적 투여에 적합한 생물학적으로 활성을 갖는 동물의 재조합 소마토트로핀의 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 이러한 것을 포함한 목적은 하기 상세한 설명으로 더욱 더 분명해질 것이다.
본 발명은 동물의 소마토트로핀의 시스테인 아미노산 잔기중 한 개 내지 네 개를 별개로, 아르기닌, 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 아스파타긴, 글루타민, 히스티딘, 알라닌, 글리신, 이소튜신, 류신, 발린, 페닐알라닌, 트립토판, 티토신, 메티오닌, 세린, 트레오닌이나 프롤린의 아미노산으로부터 선택된, 한 개 내지 네 개의 아미노산 잔기로 대치시키거나; 네 개의 시스테인 모두를 시스테인 산으로 전환시키거나; 작은 루우프내의 두 시스테인이나 큰 루우프내의 두 시스테인 또는 상기한 두가지 루우프내의 네 개의 시스테인 모두를, (CH2COOH),[CH(CO2H)(CH2)XCO2H], (CH2CONR3R4),(R5), [(CH2)nSO3], (CHCH2CONR3CO), (CO2)mNR3R4, (CH2OCOCH2R5), 또는 (SR6) (여기서 R3및 R4는 각각 H,[(CH2)XCO2H], [CH(CO2H)(CH2)XCO2H], 히드록실기가 없거나 2개 이하의 히드록실기로 치환된 C1-C6알킬 또는 폴리에틸렌 글리콜이고; R5는 C1-C6알킬 또는 C1-C4알콕시메틸이고 R6는 한 개 또는 두 개의 카르복실산이나 술픈산 기들로 임의로 치환된 페닐, 폴리에틸렌 글리콜 또는 C1-C6알킬이고; n은 0내지 4의 정수이며, m은 2내지 4의 정수이고; X는 1-3의 정수임)로부터 선택된 치환체로 유도시키고; 단, 상기한 동물의 재조합 소마토트로핀의 시스테인 아미노산 잔기가 유도될 때, 상기 소마토트로핀의 큰 루우프내 두 시스테인 잔기나 작은 루우프내의 두 시스테인 잔기를 상기한 기들로 치환시키고;(C-말단에 가장 가깝고 불안정한) 작은 루우프내의 시스테인 잔기상 치환체가 (N-말단에 가장 가깝고 안정한) 큰 루우프의 시스테인 상에 있는 것과 같거나 또는 다른 치환체이며 한 개의 시스테인 아미노산 잔기가 시스테인 상으로 산화될 때, 상기 소마토트로핀내의 상기 모든 잔기들이 시스테인 산으로 산화된다는 것을 조건으로 하는, 변형(대체 또는 제거된 시스테인(류)) 또는 유도된 신규한 동물의 재조합 소마토트로핀에 관한 것이다.
본 발명은 또한 동물의 재조합 소마토트로핀의 55,166,183 또는 191 위치에 있는 한 개 이상의 시스테인 아미노산 잔기물, 아르기닌, 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민, 히스티딘, 알라닌, 글리신, 이소류신, 류신, 발린, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 메티오닌, 세린, 트레오닌 또는 프롤린으로써 대체 시키거나 상기 네 개의 시스테인 잔기 모두를 시스테인 산으로 산화시켜, 동물의 재조합 소마토트로핀의 응집을 막는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 또한 동물의 재조합 소마토트로핀의 183 및 191위치에 있거나 55 및 166위치에 있는 시스테인 아미노산 잔기 사이의 2개의 S-S결합중 최소한 하나를 감소시키고나서 55 및 166 위치에 있는 시스테인상 유도체들이 183 및 191위치에 있는 시스테인 치환체와 같거나 다른 치환체일 수 있다는 것을 조건으로 하는 55 및 166 위치/ 및 또는 183 및 191위치의 감소된 결합 또는 결합들의 시스테인 각각을 상기 유도체로 유도시킴으로써 동믈의 재조합 소마토산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민, 히스티딘, 알라닌, 글리신, 이소류신, 류신, 발린, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 또는 프롤린으로써 대체 시키거나, 상기 네 개의 시스테인 잔기 모두를 시스테인 산으로 산화시켜, 동물의 재조합 소마토트로핀의 응집을 막는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 또한 동물의 재조합 소마토트로핀의 183 및 191 위치에 있거나 55 및 166위치에 있는 시스테인 아미노산 잔기 사이의 2개의 S-S결합중 최소한 하나를 감소시키고나서 55 및 166 위치에 있는 시스테인 아미노산 잔기 사이의 2개의 S-S결합중 최소한 하나를 감소시키고나서 55 및 166 위치에 있는 시스테인상 유도체들이 같을수도 있거나 183 및 191위치에 있는 시스테인상 치환체와는 다른 치환체일 수 있다는 것을 조건으로 하는 55 및 166 위치 및/또는 183 및 191위치의 감소된 결합 또는 결합들 각각을 같은 유도체로 유도시킴으로써 동물의 재조합 소마토트로핀의 응지을 막는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 신규한, 동물의 유도된 재조합 소마토트로핀의 제조에서 사용되는 치환체에는(CH2COOH),[CH(CO2H)(CH2)xCO2H],(CH2CONR3R4),(R5),[(CH2)nSO3],(SR6)(CHCH2CONR3CO),(CH2)mNR3R4,또는(CH2OCOCH2R5), (여기서 R3및 R4는 각각 H,[(CH2)xCO2H], [CH(CO2H)(CH2)xCO2H], 0내지 2개의 히드록실기들로 치환된 C1-C6알킬 또는 폴리에틸렌 글리콜이고; R5는 C1-C6알킬이나 C1-C4알콕시메틸이고; R6은 한 개 또는 두 개의 카르복실산이나 술픈산 기들로 임의로 치환된 페닐, 폴리에틸렌 글리콜 또는 C1-C6알킬이며, n은 0내지 4의 정수이고; m은 2내지 4의 정수이며 x는 1내지 3의 정수임)이 있다.
본 발명에 따르면, 동물의 바람직한 신규 소마토트로핀은 소마토트로핀의 작은 루우프내 s-s결합이 감소되고 183 및 191 위치에 있는 시스테인이 (CH2COOH),[CH(CO2H)(CH2)xCO2H], (CH2CONR3R4),(R5) [(CH2)nSO3],
(SR6), (여기서 R3,R4,R5,R6n 및 x는 기술된 바와 같음)로부터 선택된 치환체로 유도된 돼지, 소, 양, 사람 및 조류의 재조합 소마토트로핀이다.
또한 이 시스테인은 한 개 내지 총 네 개까지 제거된다.
특별히 지적한 것을 제외하고는, 본 발명의 출원과 관련되어 기탁된 모든 플라스미드, DNA서열 및 미생물들은 미합중국 매릴랜드 주 20952로크빌시에 소재한sms 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(ATCC)과 뉴우저어지주 프린스톤시에 주재하는 아메리칸 사이나미드 컴파니 배양수집소에 기탁되어 있다.
제1도에서, M13mp11은 제한 효소 ECoRI 및 HindⅢ로써 절단시키고 송아지의 장내 알칼리성 포스파타제로 처리한 것이다. 발현 플라스미드 PEFF-902를 제한효소ECoRI 및 HindⅢ로 소화시킨다. 이 적절한 단편들을 1%아가로우스 겔 상에서 전기영동시킨후 정제시킨다. 이 정제된 단편을 리게이션시키고 E.coil JM 101 내로 형질전환시킨다. 그 결과 M13mp11pST-RF DNA의 구조를 볼 수 있다.
제3도에서, 왼쪽에서 오른쪽으로 레인순서는 야생형 돼지의 소마토트로핀(pST)의 GATC에 이은 변이체 pSTA34의 GATC이다.
제5에서, 플라스미드는 항생물질 암피실린 저항성(ampR)을 부여한다.
본 발명에서 동물의 바람직한 변형 재조합 소마토트로핀은 하기와 같이 설명되지만, 재조합-유도된 소마토트로핀은 또다른 Asp-Gln부가적 치환없이 또는 기타 치환으로써 역시 본 발명에 따라 제조된다. 아미노산 사슬길이를 제거시키고, 아미노산 길이를 첨가시키고 아미노산(시스테인 포함), 활성 부위를 갖는 단편 등을 대체시킨 동물의 또 다른 소마토트로핀은 모두 본 발명의 범주에 속한다. 여기에서 넘버링한 아미노산 잔기는 Met-Asp-Gln유사체와 관련되어 있으나, 그 넘버링은 4개의 시스테인 잔기에 의해 형성된 S-S결합을 동정하기 위해서는 당업자들에 의해 변경될 수 있다.
상기 서열에서, 상기 동물의 재조합 소마토트로핀의 R1,R1a,R2및 R2a 각각은 아르기닌, 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민, 히스티딘, 알라닌, 글리신, 이소류신, 류신, 발린, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 프롤린, 또는 시스테인에서 독립적으로 선택된 아미노산 잔기를 나타내고; 단, 상기 소마토트로핀 내 R1,R1a,R2,R2a에 의해 나타내어진 상기 아미노산 잔기중 최소한 하나는 시스테인이 아닌 아미노산잔기를 나타내는 것이다.
본 발명의 특별히 바람직한, 변형된 동물의 재조합 소마토트로핀은, 사람의재조합 소마토트로핀의 184 및 191위치나 동물의 소마토트로핀의 183 및 191위치에서 R1, 및 R1a, 치환체 하나 또는 모두가 시스테인이 아닌 아미노산을 나타내는 것이다.
부위 지향 돌연변이
본 발명의 상기 변형된 (대체된) 동물의 재조합 소마토트로핀은 부위 지향 돌연변이에 의해 일어난다. 특별히 지적된 부위에서 클로닝 된 DNA단편의 DNA서열의 변화를 위해 통상 이용되는 기술은 그 DNA의 단일 가닥형태의 생성물 요구한다. 단일 가닥 DNA는 합성 올리고뉴클레오티드가 그 안에 불일치하는 영역을 함유하는 것이 아니라면, 그 부분에 상보적인 합성 올리고 뉴클레오티드에 어니일링된다. 불일치하는 영역은 올리고 뉴클레오티드의 중심부에 보통 위치한다. 이어 어니일링된 혼합물은 이중 가닥이 되고 T4 DNA리가아제와 아데노신5' 트리포스페이트가 존재하는 가운데 데옥시 뉴클레오티드 트리포스페이트, E. coli DNA 폴리머라제 Ⅰ,(큰단편)을 첨가하여 공유결합시킨다. 이어 이 이중가닥 DNA를 DNA의 불일치 영역이 수정되고 복제되는 적절한 E.coli균주내에서 형질전환시킨다. 두가지 클론이 얻어진다. 합성의 수정을 위한 주형으로서 어떤 가닥이 선택되느냐에 따라, 클론은 야생형이나 변형(변이)된 서열을 함유한다. 변이된 서열을 함유하는 클론, 즉 올리고뉴클레오티드의 서열에 상응하는 클론을, 방사능-라밸링된 올리고뉴클레오티드에 교잡시켜 선택한다. 올리고뉴클레오티드와 야생형 서열의 불일치로 인해, 방사능-라벨링된 올리고뉴클레오티드는 변이된 서열을 함유하는 클론에 더 안정하게 결합된다. 따라서, 적당한 온도에서 항온처리하면 야생형과 변이된 클론사이에는 구분이 생긴다. 이어 동정된 클론내의 변형은 관련 영역의 DNA 서열화에 의해 확인된다.
하기 논의에서는, 돼지의 재조합 소마토트로핀은 본 발명의 변형되고 유도된, 동물의 재조합 소마토트로핀의 대표적인 예와 그의 제조에 사용되는 방법을 설명한다.
돼지의 소마토트로핀(rpST), 유전자를 단일 가닥 형성 백터 박테리오파아지 M13mp11(ATCC)내로 클로닝시키는 것을 제1도에 나온 바와같은 일반절차에 의해 이루어진다.
돼지의 소마토트로핀(rPST)유전자를 함유하는 DNA단편을 제한 효소 ECoRI 및 HindⅢ로 절단시켜 세균 발현 플라스미드 pEFF-902로부터 단리시킨다. 이어 rPST유전자 함유단편을 아가로스 겔 전기 영동으로 정제시킨다. M13mp11복제형(RF) DNA를 ECoRI 및 HindⅢ로 소화시키고, 송아지의 장내 알칼리성 포스파라제로 처리시키고, 큰 단편을 아가토우스 겔 전기영동으로 정제시킨다. 이어 이 정제된 단편을 함께 섞고 T4 DNA리가아제로 리게이션 시킨다. 이 혼합물을 E. coli JM101내에서 형질전환시키고 결과의 몇몇 플라크를 키운다. 복제형(RF) DNA는 표준 알칼리 용해 절차에 의해 생성되고 그의 구조는 적절한 제한효소로 소화시켜 결정된다. 예상했던 단편들을 함유하는 클론을 단리시키고 M13mp11pST라고 명명한다. 그 클론의 동일성을 확인하기 위해 DNA서열 분석을 사용한다.
M13mp11pST내 rpST유전자의 돌연변이는 하기와 같이 이루어지며 제2도에 나와있다. 돌연변이 프로그램의 목적은 기타 아미노산에 의해 관련 시스테인 잔기를 치환시킴으로써 작은 루우프 s-s결합, 큰 루우프 s-s결합이나 이들 모두를 형성할 수 없는 rpST분자를 생성시키는 것이다. 큰 루우프 s-s결합은 rpST유전자내 55 및 166위치의 시스테인들 사이에 위치한다. 작은 루우프 s-s결합은 183 및 191에 위치된 시스테인들 사이에 있다. 넘버링 시스템은 기술된 바와같다. 두가지 기본적인 프로토콜은 요구되는 변이체를 얻는데 사용되며 각기 예들을 하기에 기술해 놓았다.
첫 번째 방법으로, 작은 루우프 s-s결합내의 시스테인을 치환시키는 것은 긴 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 이루어진다. 이 방법으로, AA1이라 명시된 올리고 뉴클레오티드가 사용되며 그 서열은 다음과 같다:
5' GTC ATG AAG GCG CGC CGC TTC GTG GACAGC AGC GCT GCC TTC TAG 3'
이것은 183 위치의 시스테인에 대한 코돈이 TGT를 알라닌에 대해 암호화하는 GCG로 전환시키고 191에서의 시스테인은 TGT을 알라닌에 대해 역시 암호화하는 GCT로 전환시키도록 pST유전자의 서열을 변화시키는 것이다.
따라서, 작은 루우프내 시스테인 모두 알라닌으로 전환된다. 단일 가닥 M13mp 11pST DNA를 표준 프로토콜에 의해 정제된 파아지로부터 제조한다. 제2도에 도시된 것은 돌연변이 방법의 개요도이다. 단일 가닥 M13mp 11pST DNA 1000ng을, 이미 아데노신 5' 트리포스페이트와 폴리뉴클레오티드 키나아제로 5' 포스포릴화된 AA1 올리고뉴클레오티드 50ng과 혼합한다. 혼합물을 65℃에서 7분간 가열한 다음 실온에서 10분간 유지시킨다. 이 프로토콜은 올리고뉴클레오티드를 단일 가닥 DNA로 어니얼링 시킨다. 이어 어니얼링된 DNA를 ATP, dNTP'S(4가지 데옥시리보뉴클레오티드 5' 트리포스페이트의 혼합물), T4 DNA 리가아제 및 DNA폴리머라제 I 큰 단편을 첨가함으로써 이중 가닥 공유결합된 형태로 전환시킨다.
혼합물을 실온에서 1시간동안 항온처리시킨다. 이어 혼합물을 표준 염화칼슘 절차에 의해 E.coli JM101내로 형질전환시킨다. 37℃에서 밤새항온처리시킨후에는, 플라크가 JM101의론 (lswn)상에 나타난다. 그 플라크를 니트로셀룰로이스 필터상에서 리프팅시키고 표준 프로토콜로 교잡을 위해 진행시킨다. AA1D라고 명시된 두 번째 올리고뉴클레오티드는 변이체의 검색을 위해 쓰인다. AA1D는 하기 서열 5'C ATG AAG GCG CGC CGCTT 3'을 지닌다. 그것은 c-32 P-ATP 및 폴리뉴클레오티드 키나아제로써 말단에서 방사능 라벨링된다. 교잡은 5xssc(1xssc는 0.15M의 염화나트륨, 0.15M의 시트르산나트륨 PH7.0), 1x 덴하르쯔(Denhardt's)(0.02%(w/v)피콜, 0.02%(w/v)의 소의 혈청 알부민, 0.02%의 폴리비닐피를돈), 15olg/ml tRNA(교잡후)내, 37℃에서 이루어진다. 이 필터를 4℃에서 5xssc, TAC(TAC는 3M의 테트라메틸 암모늄 클로라이드 50mM(트리스)[히드로메틸]아미노메탄 PH 8.0 1mM EDTA(에틸렌디아민 헤트라셀레틴 산), 0.1%(w/v)의 도데실 황산 나트륨으로 37℃에서 마지막으로는 원하는 온도의 TAC내에서 순서대로 씻는다. 이 마지막 헴굼은 특이성을 결정한다. AA1D에 대한 온도는 52.5℃이다. x-선 필름에 노출시킨 후에는, AA1D에 완전하게 상보적인 클론들만이 관찬된다. 이 클론의 몇가지는 DNA서열화에 의해 분석된다. 이들 모두는 첫 번째 돌명변이를 포함하지만(191시스테인에서)두번째 돌연변이를 포함하는 것은 아무것도 없다).
191위치에서 시스테인을 돌연변이시키기 위해, A1인 두 번째 올리고뉴클레오티드가 사용된다. A1은 하기 서열을 갖는다;
5' GAG AGC AGC GCT GCC TTC TAG 3'
돌연변이 방법은 주형 DNA가 M13mp11pSTA3(이것은 알라닌으로 전환되는 183위치의 시스테인을 갖는 AA1 돌연변이로부터 단리된 클론임)이고 교잡은 A1으로 일어난다는 것을 제외하고는 AA1을 사용한 상기 기술한 것과 동일하다. 최종 헹굼 온도는 56℃이다. DNA서열화는 확인된 클론이 예상했던 서열을 갖는다는 것을 보여준다. 돌연변이된 클론을 M13mp11pSTA34(ATCC)라고 한다. DNA서열은 제3도에 나와있다.
두 번째 방법에서, 작은 루우프 s-s결합의 치환은 반응으로 두가지 올리고뉴클레오티드를 사용하여 얻어지며 제4도에 나와 있다. 두 올리고뉴클레오티드는 하기 서열을 갖는다:
5' GTC ATG AAG GAA CGC CGC TTC 3' GLU3
GLU
5' GAG AGC AGC GAG GCC TTC TAG 3' GLU4
GLU
주형 단일 가닥 DNA는 M13mp11pST(ATCC)이다. 같은 반응에서 두가지 올리고뉴클레오티드 및 주형 DNA를 어니일링시키고 확장시키며 전과같이 리게이팅시킨다. 혼합물을 E.coli JM101내로 형질전환시킨다. 이 방법에 있어서의 차이점은 두리프트를 각 플레이트로부터 취했다는 것이다. 각 리프트를 32p 라벨링된 GLU3이나 GLU4에 각각 교잡시킨다. 각 올리고뉴클레오티드에 대한 최종 헹굼 온도는 56℃이다. 두 올리고뉴클레오티드에 대해 포지티브한 이들 플라크만을 선택한다. DNA서열화는 Cys 183 및 Cys 191 모두가 글루탐산으로 전환된다는 것을 보여준다. 이 클론은 M13mp11pSTE34(ATCC)이다. 이 방법은 M13mp11pST와 상기한 두가지 적절한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 큰 루우프 s-s가 형성되는 것을 막는 돌연변이를 얻는데 사용된다.
Cys 55와 Cys 166을 알라닌으로 변화시키는데 적당한 두 올리고뉴클레오티드와 주형 DNA로서 M13mp11pSTA34를 사용함으로써 명백하게, 모든 시스테인 잔기를 알라닌으로 전환시키는 클론을 얻는다.
이어 변화된 클론(돌연변이체)은 제5도에 나온 바와같은 세균성 발현 플라스미드 PR0211(ATCC)이다. (유럽 특허 제173,280호에 기술되어 있음) M13클론을 EcoRI 및 HindⅢ로 절단하고 PST유전자 단편을 단리시킨다. PR0211을 같은 효소로 소화시키고 송아지 내장의 알칼리성 포스파타제로 처리하여 큰 단편을 단리시킨다. 이 두조각을 T4 DNA 리가아제와 함께 리게이팅시키고 적당한 세균 즉, 예컨대 E. coli N99cI(ATCC)내에서 형질전환시킨다. 이 균주내에, 야생형 k억제인자가 존재한다. 이는 PR0211 내에서의 PL프로모터로부터의 발현을 막는다. 일단, 적절한 구성물이 단리되면, 온도에 민감한 k억제인자를 함유한 세균주(ATCC) E. Coli 4200내로 옮긴다. 이들 군주에서, PST의 발현은 온도에 따라 좌우된다. 42℃에서, 억제인자는 불활성이며, 발현이 일어난다. 이 단계에서, PST는 발현이 일어난다는 유럽특허 제173,280호에 있는 절차에 의해 제조된다. PST의 발현은 이러한 특별한 E. Coli 균주에만 제한된 것은 아니다. 적절한 특성을 지닌 기타 균주로 대체된다. 플라스미드 발현 벡터는 ATCC에 기탁되어 있다. 세균성 균주가 각각 기탁되었다.
기타 아미노산 치환은, 적절한 코돈 및 올리고뉴클레오티드를 이용하여 상기 절차에 의해 이루어진다. 유사하게도, 이들 절차는 다양한 동물의 소마토트로핀을 변형시키는데 사용된다.
상기 절차에 의해 쉽게 제조된 동물의 변형된 재조합 소마토트로핀으로는 (Ala 55,166) rpST;(Ser 55,166) rpST;(Ala 183,191) rpST;(Glu 183,191)rpST;(Glu 183-Ala 191)rpST; (Ser 183,191)rpST; 및 (Glu 183-Ser191)rpST이 있다.
동물의 유도된 소마토트로핀
바람직하게 재조합된, 유도된 동물의 소마토트로핀을, 수성염기 예컨대 수산화나트륨이나 암모늄으로 PH 8.4로 조정시킨, 구아니딘 히드로클로라이드 중 탄산나트륨등의 수성 용액이나 동물의 소마토트로핀의 물중 용해액이나 분산액으로 제조한다. 이어 이 용액에다 디티오테리톨, 즉 (DL-트레오 -1, 4-디메르 캅토 -2, 3-부탄디올)을 서서히 첨가한다. 이 첨가는 실온의 질소분위기하에서 일반적으로 수행된다. 이어 결과용액에다 요오드 아세트아미드, 요오드아세트 산, 테트라티오산 나트륨, 메틴티오술폰산 메틸, 1,3-프로판 술폰이나 기타 유도화제를 첨가하나, 이 혼합물을 약 1내지 4시간동안 휘저어 섞은 다음, 초여과에 의해 탈염시킨다. 이 용액을 농축시키고 물, 수성 구아니딘 히드로클로라이드 등을 몇회 재희석시킨 다음 한외여과 시킨다. 이어 최종 여과로부터의 잔기를 동결건조시켜 유도된 rpST를 얻는다.
사용방법
유리하게도, 본 발명의 동물의 신규한 소마토트로핀은 동물 특히 살코기를 공급하는 동물의 성장속도를 향상시키고 그럼으로써 식품 이용 효율을 증가시키는데 유용하다. 또한 이들 화합물은 상기 동물의 육질을 향상시키고, 즉 지방분이 적은 상기동물의 지방분 비율을 증가시키는데 효율적이다. 더구나, 본 발명의 화합물은 수유동물에 있어서의 수유생산을 증가시키고, 코우트를 제공하는 양과 기타 동물들에 있어서의 모직의 질을 향상시키는테 효과적이다.
본 발명의 변형(대체)되거나 유도된 소마토트로핀은 상기 기술된 생물학적 향상을 이룩하기 위해 동물을 처리하는데 있어서 효과적인 반면, 본 발명의 변형되거나 유도된 동물의 소마토트로핀의 증가된 이용성과 효율성은, 부분적으로 상기 소마토트로핀의 변형이나 유도에 의해 제조된 소마토트로핀의 응집을 저지하는데 기여한다. 그러한 저해는 본 발명에 의해 기술된 바와 같이 변형되거나 유도되지 않은 재조합 소마토트로핀이나 원래의 소마토트로핀으로 쉽게 또는 효과적으로 이루어진 현저하게 향상된 지효성전달 시스템을 제조하게 한다.
본 발명의 변형되거나 유도된 소마토트로핀은 매우 안정하며 이량체 형성으로 인한 응집이 근본적으로 없다는 것이 밝혀졌다. 더구나 본 발명의 변형되거나 유도된 소마토트로핀은 상당히 개선된 지효성 조성물 제조에 있어서 그들 자체에 유동성을 부여한다.
동물의 원래의 소마토트로핀이 하루만에 응집되는 반면, 본 발명의 변형되거나 유도된 소마토트로핀을 함유하는 비경구적 조성물은 10일이상 동안 변형되거나 유도된 소마토트로핀을 계속 방출시킨다.
조성물
사실상, 본 발명의 조성물은 생물학적으로 활성인 비경구 조성물의 형태로 주사에 의해 일반적으로 투여된다. 본 발명의 동물의 재조합 소마토트로핀을 투여하기에 유용한 비경구 조성물로는 겔, 페이스트, 미소구(microsp heres), 마이크로캡슐, 삽입편(implants)등이 있다. 그 자체로서, 조절된 방식으로 물질을 방출하여 투여의 빈도를 감소시키는, 생물학적으로 활성인 물질의 투여형태를 제공하는데 있어서 상당한 관심을 끌고 있다.
생물학적으로 활성인 거대분자의 지효성 조성물의 개발은, 복잡한 그들의 작용양식 및 복잡한 거대분자구조로 인해 특별한 문제를 제공한다. 따라서, 생물학적으로 활성인소마토트로핀을 함유하는 유효한 지효성 조성물의 개발이 요구되고 있다.
투여의 이러한 형태로 유용한 조성물은 희석시킨 수산화암모늄내에 변형되거나 유도된 동물의 소마토트로핀을 용해시킨 다음, 알칼리 금속 벤조에이트, 라우레이트, 카르보네이트 등의 용액을 거기에 첨가함으로써 제조된다. 비이온성 계면활성제를 이후에 그 용액과 혼합하고 결과의 혼합물을 분무건조시킨다. 따라서 형성된 고형물을 용융된 지방분이나 왁스 또는 이들의 혼합물과 섞고 결과의 용융 혼합물을 용융점이상의 온도에서 용융상과 들어오는 공기를 유지하기 위한 열 자켓이 장치된 공기/액체 분무노즐을 통해 분무시킨다. 미소구를 차가운 용융적(molten droplets)으로서 형성시킨다. 이들은 약 45내지 180미크론의 원하는 크기로 일련의 시이브상에서 수집하고 이용을 위해 보존한다. 원하지 않았던 크기의 미소구는 재순환시킨다. 대안적으로, 균일한 혼합물을 원심분리 디스크상에 공급하고 그렇게 형성한 미소구를 상기와 같이 수집하거나, 용융 혼합물을 원하는 평균입자크기가 될 때까지 냉각시키고 분쇄시킨다.
이어 생물학적으로 활성인 미소구를 동물에게 주사하기 위해 제약학적으로나 약학적으로 허용가능한 액상부형제내에 분산시킨다. 미소구-액사 조성물은 대개 머리, 목 또는 귀 가까이에 있는 동물의 피부조직의 피하에 주사함으로써 일반적으로 투여된다.
또한 본 발명의 변형되거나 유도된 동물의 소마토트로핀을 통상적인 펠릿 삽입건(gun)을 사용하여 동물의 피부조직에 주사하는 생양립성 삽입편으로서 제조된다. 이들 조성물을 분말화된 변형되거나 유도된 소마토트로핀을 캐스터 왁스와 같은 왁스와, 또는 코풀리(글리콜리드/락티드),수산화마그네슘 및 산화프로필렌과 프로필렌 글리콜과의 축합으로 형성된 소수성염기로 제조된 산화에틸렌 축합물의 혼합물과 섞음으로써 제조된다. 그렇게 형성된 조성물을 펠릿화 프레스내로 도입하고 직경 약 0.3175㎝(1/8인치)의 실린더형 펠릿으로 형성한다.
그렇게 형성된 펠릿을 통상적인 펠릿 삽입건으로 투여한다.
본 발명은 하기 실시예들에 의해 더 잘 설명될 수 있다.
실시예 1
긴 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 작은 루우프 S-S결합내에서 시스테인을 치환하는 방법
AA1이라 명시된 올리고뉴클레이티드는 하기 서열을 갖는다:
5' GTC ATG AAG GCG CGC TTG GTG GAG AGC AGC GCT GCC TTC TAG 3'
이것은 183위치의 시스테인에 대한 코돈이 TGT를 알라닌에 대해 암호화하는 GCG로 전환시키고 191위치의 시스테인이 TGT를 역시 알라닌에 대해 암호화하는 GCT로 전환시키도록 rpST 의 서열을 변경시킨다. 따라서, 작은 루우프내 시스테인은 모두 알라닌으로 전환된다. 단일 가닥 M13mp 11pST DNA를 표준 프로토콜에 의해 정제된 피아지로부터 제조한다. 단일 가닥 M13mp 11pST DNA 1000ng을 1x 어니일링 완충액(1x 어니일링 완충액은 75mMKc1 5 mMtrs pH 8.0임)을 함유하는 10/1의 최종부피인 폴리뉴클레오티드 키나아제 및 아데노신 5' 트리포스페이트로 이미 5' 포스포릴화된, AA!올리고뉴클레오티드 50ng과 혼합한다. 이 혼합물을 65℃에서 7분동안 가열한다음 실온에서 10분동안 유지시킨다. 이 프로토콜은 올리고뉴클레오티드를 단일가닥 DNA로 어니일링 시킨다. 이어 어니일링된 DNA를 H2O201 1, 10 x 필린(fillin) 완충액(1x 필린 완충액은 27.5 mMgC12 pH 7.5,2 mM DTT임)4/1, 20mM ATP 11 I, dNTP 21 I(2mM농도에서 각각 네가지 데옥시리보뉴클레오티드 5' 트리포스페이트의 혼합물), T4 DNA리가아제 2U 및 DNA폴리머라제 I 큰 단편 2U(1986. 뉴 잉글랜드 바이 오랩 카타로그에서 정의한 것을 참고한다)를 첨가함으로써 이중 가닥 공유 결합된 형태로 전환시킨다. 이 혼합물을 실온에서 1시간동안 항온처리한다. 이어 혼합물을 표준염화칼슘 절차로 E. Coli JM101로 형질전환시킨다. 37℃에서 밤새항온처리한 후, JM101 의로운 상에서 플라크를 살펴볼 수 있다. 이 플라크를 니트로셀룰로이스 필터상에서 리프팅시키고 표준 프로토콜로 교잡시킨다.
AAID라고 명시된 두 번째 올리고뉴클레오티드를 돌연변이체 검사를 위해 사용한다. AAID는 하기 서열을 갖는다.: 5' C ATG AAG GCG CGC CGC TT3'.
그것은 d-32P-ATP 및 폴리뉴클레오티드 키니아제로 5' 말단에서 방사능-라벨링된다. 교잡은 5xSSC, 1x덴하므쯔, 15 olg/mg tRNA내 37℃에서 밤새 이루어진다. 그 필터를 4℃에서 5xSSC내 37℃에서 TAC내, 마지막으로 원하는 온도에서 TAC내에서 순서대로 씻는다. 마지막 헹굼은 특이성을 결정한다. AAID에 대한 온도는 52.5℃이다. X-선 필름에 노출시킨후, AAID에 완전하게 상보적인 클론들만이 관찰된다. 이들 클론의 몇가지는 DNA서열화에 의해 분석된다. 이들 모두는 첫째 돌연변이를 포함하지만(191 시스테인에서) 두 번째 돌연변이를 포함하는 것은 아무것도 없다. 191위치에서 시스테인을 돌연변이시키기 위해, A1인 두 번째 올리고뉴클레오티드가 사용된다. A1은 하기 서열을 갖는다: 5' GAG AGC AGC GCT GCC TTC TAG 3'
돌연변이 방법은 주형 DNA가 M13mp11pSTA 3(이것은 알라닌으로 전환되는 183위치의 시스테인을 갖는 AA1 돌연변이로부터 단리된 클론임)이고 교잡은 A1으로 일어난 다는 것을 제외하고는, AA1을 사용한 실시예1에 기술한것과 동일하다. 최종 헹굼 온도는 62℃이다.
DNA서열화는 확인된 클론이 예상했던 서열을 갖는다는 것을 보여준다. 돌연변이된 클론을 M13mp11pSTA34라고 한다.
실시예2
돼지의 재조합 소마토트로핀의 작은 루우프내 시스테인을 치환하는 방법.
작은 루우프 S-S 결합의 치환은 같은 반응으로 두가지 올리고뉴클레오티드를 사용하여 얻어진다. 두올리고뉴클레오티드는 하기 서열을 갖는다:
5' GTC ATG AAG GAA CGC CGC TTC 3' GLU3
GLU
5' GAG AGC AGC GAG GCC TTC TAG 3' GLU4
GLU
주형 단일 가닥 DNA는 M13mp11pST이다.
같은 반응에서, 두가지 올리고뉴클레오티드 및 주형 DNA를 어니일링 시키고 확장시키며 전과 같이 리게이팅시킨다. 혼합물을 E.Coil JM101내에서 형질전환시킨다. 이 방법에 있어서의 차이점은 두 리프트를 각 플레이트로부터 취했다는 것이다. 각 리프트를 32p라벨링된 GLU3이나 GLU4에 각각 교잡시킨다. 각 올리고뉴클레오티드에 대한 최종 헹굼 온도는 56℃이다. 두 올리고뉴클레오티드에 대해 포지티브한 이들 플라크만을 선택한다. DNA 서열화는 Cys 183 및 Cys 191모두가 글루탐산으로 전환된다는 것을 보여준다. 이 방법은 M13mp11pST와 상기한 두가지 적절한 올리고뉴클레오티드를 사용하여 큰 루우프의 S-S가 형성되는 것을 막는 돌연변이를 얻는데 사용된다. Cys 55와 Cys 166을 알라닌으로 변화시키는데 적당한 두 올리고뉴클레오티드와 주형 DNA로서 M13mp11pSTA34를 사용함으로써 명백하게 모든 시스테인 잔기를 알라닌으로 전환시키는 클론을 얻는다.
실시예3
세균성 발현 플라스미드 내에서의 재구성
변환된 클론(돌연변이체)은 제5도에 나온 바와 같은 세균성 변환 플라스미드 pR0211이다(유럽특허 제173,280호에 기술되어 있음), M13 클론을 EcoRI 및 HindⅢ로 절단하고 pST유전자 단편을 단리시킨다. pR0211을, 같은 효소로 소화시키고 송아지 내장의 알칼리성 포스파타제로 처리하여 큰 단편을 단리시킨다. 이 두조각을 T4 DNA 리가아제와 함께 리게이팅시키고 적당한 세균주, 예컨대 N990I 내에서 형질전환시킨다. 이 균주내에 야생형 入억제인자가 존재한다. 이는 pR0211내에서 P2프로모터로부터의 발현을 막는다. 일단, 적절한 구성물이 단리되면, 온도에서 민감한 入 억제인자를 함유한 세균주 4200내로 옮긴다. 이들 균주에서, rpST의 발현은 온도에 따라 좌우된다. 42℃에서, 억제인자는 불활성이며 발현이 일어난다. 이들 단계에서 rpST는 유럽특허 제 173,280호에 있는 절차에 의해 제조된다. PST 유전자 생성물의 발현에 사용되는 E.Coil 균주는 E.Coil 4200에만 제한된 것은 아니다. 임의의 적절한 E.Coil 균주가 사용될 수 있다.
상시 실시예1,2 및 3의 절차를 따르지만, 183 및 191위치에서 시스테인에 대해 알라닌, 세린 글루탐산, 아르기닌, 트립토판이나 아스파라긴에 대한 코돈을 치환시키면 상기 위치에서 시스테인에 대한 TOT는 TCN, AGC나 AGT(세린에 대한 것임), GAG 나 GAA(글루탐산), CGN, AGA나 AGG(아르기닌), ATT나 AAC(아스파라긴), GCN(알라닌)이나 TGG(트립토판)으로 전환된다.
실시예4
(Cam-Cys 55,166,183,191)rPST의 제조
돼지의 재조합 소마토트로핀(rpST)100mg 및 7M의 구아니딘 HCI 33mL의 용액을 제조하고 pH를 NaOH로 8.4까지 조정한다. 이 용액에다 디티오트레이톨 18mg(20당량)을 첨가하고 반응 혼합물을 N2분위기하실온에서 1시간동안 휘저어 섞는다. 이어 이 용액에다 요오드 아세트아미드 84mg(100당량)을 첨가하고 반응 혼합물을 4시간동안 실온에서 휘저어 섞는다. 반응 혼합물을 37mL의 H2O로 희석시키고 구아니딘 HCI과 과량의 시약을 아미콘 모델(Amicon Model)8400스터어링 셀내 아미콘 UM2막(약 1000달톤의 분자량으로 절단함)을 통해 한외 여과시켜 제거한다. 재희석과 재여과를 여러번 반복한 후, 남아있는 수성용액을 일정 중량까지 동결건조시켜 약 100mg의 보풀이 일어나는 백색 고형물을 얻는다. 검소시키지 않는 상태하에서 SDS-PAGE걸상에 생긴 생성물의 전기영동 이동도는 rpST 와는 다르다. 이 생성물은 상기 지시한 돼지의 유도된 재조합 소마토트로핀이다.
실시예5
(Cam-Cys 55,166,183,191)rpST의 제조
탈기시킨 0.02M의 NaCl(225ml)의 용액에다 돼지의 재조합 소마토트로핀(rpST)3.375gm을 첨가하고, pH를 묽은 HCI로 8.1까지 조정하고, 이 용액의 pH를 8.1에서 유지시키면서, 물 31.5ml 내에 녹인 디티오르레이톨 0.9463gm, 15mg/ml을 rpST 용액에다 첨가한다. 혼합물을 실온에서 1시간동안 정치시키고, pH를 8.4로 올린다. 이어 물 40.5ml내의 요오드아세트아미드 5.7gm을, pH를 8.4에서 유지시키면서, rpST 용액에다 첨가한다. 미세한 침전물의 형성이 이러한 첨가동안에 일어나서 원심분리에 의해 제거된다. 투명한 상등액을 제거하고 세파덱스 G-25 컬럼을 통해 통과시켜 과량의 저분자량물질을 제거시킨다. 고분자량 rpST 유분 342.8gm을 수집하고 동결건조시켜 2.2gm의 (Cam-Cys ,183,191)rpST를 얻는다.
실시예6
(Cm-Cys 183,191)rpST의 제조
돼지의 재조합 소마토트로핀(rpST)200mg 0.5N NaHCO3100ml(수성 수산화암모늄으로 pH를 약 8.4로 조정)의 용액에다 디티오트레이톨 15mg을 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 1시간동안 휘저어섞는다. 50mg의 요오드아세트산을 첨가하고 반응 혼합물을 2시간동안 실온에서 휘저어 섞는다. 이어 반응 혼합물을, 아미콘 모델 8400의 휘저어 섞는 셀내 아미콘 UM2막을 통해 한외여과시킴으로써 탈염시킨다. 몇번에 거쳐 재희석 및 재여과시킨후 잔류 용액을 동결건조시켜 중량을 일정하게 한다. 보풀이 일어나는 백색 고형물 약 200mg을 회수한다. 얻어진 생성물은 여기에서 지적된 바와 같은 돼지의 유도된 재조합 소마토트로핀이다.
상기 절차를 따라, 소의 재조합 소마토트로핀, 양의 재조합 소마토트로핀, 말의 재조합 소마토트로핀, 사람의 재조합 소마토트로핀 또는 조류의 재조합 소마토트로핀을 돼지의 재조합 소마토트로핀 대신에 각각 치환하면 다음(1)-(5)와 같이 얻어진다:
(1) (Cm-Cys 183,191) rbST
(2) (Cm-Cys 183,191) roST
(3) (Cm-Cys 183,191) rhoST
(4) (Cm-Cys 184,191) rhST
(5) (Cm-Cys 183,191) raST
실시예7
(-O3S-Cys 55, 166, 183, 191)rpST의 제조
7N 구아니딘 HCI 50mL 및 돼지의 재조합 소마토트로핀(rpST) 200mg의 용액을 제조하고 pH를 수산화나트륨으로 약 8.4까지 조정한다. 이 용액에다 디티오트레이톨 33mg을 첨가하고 반응혼합물을 1시간동안 실온에서 휘저어 섞는다. 이 용액에다 테트라티오산나트륨 200㎎을 첨가한다. pH를 즉시 약6까지 감소시키고 이것을 NaOH로 다시 8.4까지 조정한다. 이어 혼합물을 2시간동안 휘저어 섞는다. 용액을 아미콘 UM2막을 통해 한외 여과시킨다. 반응 혼합물을 약 20mL로 농축시킨다음 약 40mL의 3N 구 아니딘 HCl로 재희석시키고 재여과시킨다. 약 20mL의 용액으로 농축시킨후, H2O로 희석하고 재농축시킨다. 이 공정을 두 번 더 반복하고 잔류물을 일정 중량까지 동결건조시킨다. 백색고형물 약 200㎎을 얻는다. 생성물은 상기의 유도된 돼지의 재조합 소마토트로핀이다.
실시예 8
(-O3S - Cys 183,191) rpST의 제조
돼지의 제조합 소마토트로핀 (rpST) 250㎎의 H2O 100mL중 용액(NaOH로 pH를 약 8.4까지 조정함)에다 디리오트레이톨 70㎎을 첨가한다. 이 용액을 실온에서 한시간동안 휘저어 섞는다. 감소된 rpST의 용액에다 테트라티오산 나트륨 400㎎을 넣고 용액을 4시간동안 실온에서 휘저어 섞는다.
반응혼합물을 아미콘 UM2막을 통해, 여과시키고, 약 20mL까지 농축시킨다. 이것을 H2O약 200mL로 희석시키고 재농축시킨다. 이 절차를 두 번 더 반복한다. 최종용액을 일정중량으로 동결건조시켜 약 240㎎의 백색분말을 얻는다. 이것이 상기한 돼지의 유도된 재조합 소마토로핀이다.
실시예 9
(MeS-Cys 183,191) rpST의 제조
돼지의 재조합 소마토트로핀 (rpST) 200㎎을 H2O 100mL내에 녹인다. 이 용액의 PH를 수성 NaOH로 약8.4까지 조정한다. 이 용액에다 디티오트레이톨(DTT) 15㎎을 첨가하고 반응을 1시간동안 실온에서 휘저어 섞는다. 감소된 후, 24μ1의 메틸메탄오술포네이트를 첨가하고 반응혼합물 4시간동안 실온에서 휘저어 섞는다. 반응동안 pH를 원하는 만큼 1%의 NaOH를 첨가하여 8.4에서 유지시킨다. 용액을 UM2막을 통해 한외여과시키고 약 206mL까지 농축시킨다. 잔류물을 H2O 200mL로 희석시키고 재농축시킨다.
이어 용액을 동결건조시켜 상기한 생성물 210mg얻었으며, 즉 이것이 상기한 돼지의 유포된 재조합 소마토트로핀이다.
상기 절차를 따라, 소의 재조합 소마토트로핀, 양의 재조합 소마토트로핀, 말의 재조합 소마토트로핀, 사람의 재조합 소마토트로핀이나 조류의 재조합 소마토트로핀을 돼지의 재조합 소마토트로핀 대신 치환하면 하기 (1)-(5)를 얻는다:
(1) (MeS - Cys 183,191) 소의 재조합 소마토트로핀
(2) (MeS - Cys 183,191) 양의 재조합 소마토트로핀
(3) (MeS - Cys 183,191) 말의 재조합 소마토트로핀
(4) (MeS - Cys 184,191) 인간의 재조합 소마토트로핀
(5) (MeS - Cys 183,191) 조류의 재조합 소마토트로핀
실시예10
(HO3SCH2CH2CH2- Cys 183,191)rpST의 제조
pH = 8.4로 조정시킨, 돼지의 재조합 소마토트로핀(rpST) 200mg의 H2O 100mL중용액에다 디티오트레이톨 15mg을 첨가하고, 실온에서 한시간동안 N2 분위기하에서 반응혼합물을 휘저어 섞는다. 이 용액에다 1,3 - 프로핀 술폰 50mg을 첨가하고 이 용액을 6시간동안 실온에서 휘저어 섞는다. pH를 1%의 NaOH를 첨가하여 8.4에서 유지시킨다. 조 생성물을 UM2막을 통해 약 20mL까지 한외 여과시켜 농축시킨다. 이것을 200mL까지 두 번 희석시키고 재농축시킨다. 최종 용액을 동결건조시켜 유도된 돼지의 재조합 소마토트로핀인, 200mg의 백색 고형물을 얻는다.
유리하게도, 상기 절차를 따라 돼지의 재조합 소마토트로핀 대신 적절한 동물의 재조합 소마토트로핀을 사용하여 하기 소마토트로핀을 제조한다:
(1) (HO3SCH2CH2CH2- Cys 183,191) 소의 재조합 소마토트로핀
(2) (HO3SCH2CH2CH2- Cys 183,191) 양의 재조합 소마토트로핀
(3) (HO3SCH2CH2CH2- Cys 183,191) 말의 재조합 소마토트로핀
(4) (HO3SCH2CH2CH2- Cys 183,191) 사람의 재조합 소마토트로핀
(5) (HO3SCH2CH2CH2- Cys 183,191) 조류의 재조합 소마토트로핀
실시예11
변형되거나 유도된 동물의 재조합
소마토트로핀의 안정성 프로우파일
동물의 재조합 소마토트로핀 유도체 (100mg/ml 이하)의 인산염 완충 염수 pH 7.4(NaH2PO4H2O3.45gm, Na2HPO43.55gm, NaCl 9.50gm를 증류수를 녹여 100ml를 만든것)의 인산염중 농축용액을 제조한다. 이것을 튜브내에 놓인 시험편 0.1ml와 밀리포어 멸균 밀렉스(millex) - 022μm 여과기를 통해 여과시킨다. 이들을 45℃오븐내에 놓고 원하는 간격으로 제거시킨다. 이어 내용물을 인산염완충 염수로 희석시킨다. 상등액을 HPLC로 단량체 및 이량체에 대해 분석한다. 질량평행을 재고, 임의 침전된 물질을 기록한다. 결과를 초기 농도와 비교하고 안전성 프로파일을 증명한다.
대안적으로 pH 7.4에서 열등한 용해도를 보여주는 소마토트로핀 유도체를 덜 바람직한 ph (4-10)에서 용해시키거나 현택액으로서 평가한다.
실시예12
동물의 재조합 소마토트로핀 유도체의 비경구적 투여를 위한 주사가능한 미소구의 제조
분무 건조에 의해 미소구내에 합입시키기 위해 적합한 크기 범위로 신규한, 동물의 재조합 소마토트로핀을 제조하는 것은 희석한 수산화암모늄 용액내에 동물의 재조합 소마토트로핀 유도체를 녹인다음 벤조산 나트륨과 같은 원하는 염 용액을 첨가함으로써 수행된다. 비이온성 계면활성제 예컨대 에틸렌 옥시드와 프로필렌 옥시드의 블록공중합체를 첨가하고 일정하게 섞어서 녹인다. 이어 그 용액을 분무건조시킨다. 부히미니(Buchimini)분무 건조기, 모델#190이 이러한 목적을 위해 사용된다.
응용 지방, 왁스나 이들의 혼합물내에 그렇게 제조된 활성성분과 첨가제의 균질 혼합물을 제조하고 결과 혼합물을 가열된 자켓이 구비된 공기/ 액체분무노즐을 통해 분무시켜 들어오는 공기와 용융상을 상기 융점이상의 온도에서 유지시킨다. 냉각응용 적과 같이 미소구가 형성되고 이를 약 45내지 180미크론의 원하는 크기로 일련의 시이브상에서 수집하여 사용을 위해 보관해 둔다. 원하는 크기가 아닌 미소구는 재순환시켜 수집한다. 대안적으로, 균질 혼합물을 원심분리 디스크상에 공급하고 그렇게 형성된 미소구를 상기와 같이 수집하거나, 용융혼합물을 냉각시키거나 원하는 평균 크기로 분쇄한다.
일반적으로 본 발명의 조성물에 사용하기에 적합한 왁스와 지방의 융점은 40℃이상이다. *이들 왁스들은 글리세라이드를 함유하지 않는다는 것을 제외하고는, 조성물내에서는 지방 및 오일과 보통 유사하고 실온에서는 고형이며 고분자량의 화합물이나 저-융점 유기 혼합물로서 규정된다.
*요약화학사전
10판 Pg. 1094
반 노스트랜드 라인홀드 퍼블리셔 몇가지는 탄화수소이고; 기타는 지방산 및 알콜의 에스테르이다. 그들은 지질로서 분류된다. 왁스들은 열가소성이지만, 그들은 고급 중합체가 아니므로, 플라스틱 군내에 속한다고 여겨진다. 일반적인 특성들은 물에 대해 반발력이 있고; 부드러운 촉감을 느끼게 하며; 무독성에다가; 향기나 색깔을 관찰할 수가 없다는 것이다. 연소성이며, 우수한 유전특성도 갖는다. 대부분 유기용매에 녹고;물에는 녹지 않는다. 주요 유형은 다음과 같다:
Ⅰ. 천연
1. 동물성(밀랍, 라놀린, 셜락왁스, 차이니즈 인섹트 왁스).
2. 식물성(카누바, 칸데릴라, 월계수, 사탕수수)
3. 광물성
(가) 화석이나 땅에서 나는 왁스(오조세라이트, 세레진, 문탄)
(나) 석유왁스(파라핀, 미정질-라인)(분탄이나 스케일 왁스)
Ⅱ. 합성
1. 에틸렌형 중합체와 폴리올 에테르-에스테르(카르보왁스소프비톨)
2. 염소와 나프탈렌(할로왁스)
3. 피셔 - 트로프쉬 합성을 통한 탄화수소형
본 발명의 지방은 스테아르나 팔미트와 같은 고급 지방산의 글리세릴 에스테르로서 규정될 수 있다. 그러한 에스테르나 그들의 혼합물은 실온에서 고형이고 결정질 구조를 보여준다. 라아드나수지(tallow)가 그 예이다. 지방과 오일사이에는 화학적 차이가 없고, 단지 지방이 실온에서 고형이고 오일은 액체라는 점이 다르다. 용어지방은 보통 트리글리세라이드로서 알려져 있는 반면지질은 모든 것을 포함한다.
바람직한 지방은 50℃이상의 융점이 가장 바람직한, 주로 스테아레이트, 팔미테이트, 라우레이트, 리놀레이트, 리놀렌에이트, 올레이트 및 그의 잔류기나 혼합물로 이루어진 모노-, 디-, 또는 트리글리세라이드가 있는 장쇄 C10-C24지방산, 알콜, 에스테르, 염, 에테르나 그들의 혼합물이다. 글리세롤 트리스테아레이트는 가장 바람직한 지방이다. 부가적으로, 지방산의 친지질 염 예컨대 스테아르산 마그네슘등이 적합하다.
본 발명의 미소구는 비경구 투여를 위한 지효성조성물을 얻기 위해 제약학적으로 및 약리학적으로 허용가능한 액체내에 분산되어 있다. 부형제로는 수성 완충 시스템이나 오일 시스템이 있다. 오일은 식물성 또는 동물성 오일이다. 바람직한 오일은 중성 트레글리세라이드 액상 지방이다. 중성 오일은 잔류 산을 함유하지 않는 것이다. 본 발명의 조성물에 사용하기에 적합한 부형제로는 투여되고 있는 활성성분의 용해도에 따라 완충 염수와 같은 수성 시스템; 유기용매 예컨대 글리콜과 알콜; 및 물과 비혼화성인 액체 예컨대 오일이 있다. 얻어진 자료는 표Ⅰ에 기록되어 있다.
실시예13
담즙산 미소구
rpST유도체와 담즙산의 완충 용액을 부히 모델 190분무 건조기내에서 분무 건조시킨다. 이 미세한 입자분말(10부)을 피복물질(1부)의 염화메틸렌 용액내에 현탁시킨다. 이 현탁액을 건조시킨다. 피복된 미소구는 주사전에 적합한 현탁 부형재내에서 현탁시킨다. 이들 조성물은 표Ⅱ에 기술되어 있다. 동물의 재조합 소마토트로핀의 183 및 191 위치(사람은 184 및 191 위치)의 작은 루우프내에 시스테인을 아라닌, 세린, 글루탐산, 아르기닌, 리신등으로 대치시킨, 돼지, 소, 양, 말, 사람 및 조류의 변형된 재조합 소마토트로핀을 포함한 기타 본 발명의 유도되거나 변형된 동물의 재조합 소마토트로핀은 하기표 Ⅱ에 따라 기술된 미소구처럼 제조된다.
실시예14
동물의 재조합 소마토트로핀 삽입편의 제조
원하는 동물의 재조합 소마토트로핀 유도체와 원하는 희석액의 균질한 혼합물 충분량을 재어 삽입편을 제조한다. 이어 이 혼합물을 0.4763㎝ 또는 0.3175㎝(3/16 또는 1/8) 직경의 실린더형 다이내에서 1000내지 5000pisg의 조각사 프레스상이나 원하는 펀치 및 다이를 사용하는 회전 정제 프레스상에서 압축시킨다. 따라서 삽입편은 생분해될 수 있거나 생분해 될 수 있는 피복물 모두로써 절차 A 및 B에 의해 피복시킨다.
절차 A
생분해될 수 없는 규소 중합체
투명 등급의 규소 엘라스토머(10부)를 주걱으로 워치글래스상에서 경화제(1부)와 혼합한다. 이것을 30분동안 테시케이터내에서 탈기시킨다. 핀셋으로 삽입편 말단을 집어 규소 중합체로 롤링시키고, 알루미늄 박상에 놓아, 40℃에서 5시간동안 경화시킨다. 말단 한쪽이나 양쪽을 면도날로 제거시켜 피복시킨 실린더의 샤프트를 남긴다.
대안적으로 삽입편을, 베이스 말단의 한쪽이나 양쪽에서 피복질을 제거하기 전에, 헥산내에 분산시키고 건조시킨 다음, 40℃내지 50℃에서 밤새 경화시킨, 다우코닝(Dow corning)에 의한 상표 실라스틱R(SILASTICR)로서 판매되는, 의학용 접착제 20% 내지 40%로 침지 피복시킨다.
절차B
생분해될 수 있는 피복질
중합체나 공중합체(1부)를 클로로포름(3내지 8부)내에서 용해시킨다 각 삽입편의 끝을 핀셋으로 집어, 중합체 용액내에 침지시킨 다음, 클로로포름을 실온에서 증발시킨다. 각 삽입편을 두 번 피복시킨다. 피복물을 실온에서 밤새건조시킨 후, 중합체 말단을 면도날로 제거하여, 피복된 긴 실린더형 샤프트를 남긴다.
대안적으로 rpST나 기타 동물의 재조합 소마토트로핀을 수성 용액내에 계면활성제, 완충염 및/ 또는 방부와 블렌딩시킨다. 이어 이 용액을 부히 모델190분무건조기내에서 분무건조시켜 작은 입자 크기의 분말을 얻는다. 이어 분말을 지방이나 왁스로 응용-블렌딩시키고 실린더형 삽입편으로 성형시킨다. 이 삽입편을 절차 A나 B를 이용하여 생분해될 수 있거나 생분해될 수 없는 중합체로 피시킨다.
실시예15
(Cam-Cys 183,191)rpST를 사용한 삽입편의 제조와 시험관내 용해에 의한 상기 삽입편의 평가
CH2C121.3ml에다, 코-폴리(글리콜리드/락티드) 공중합체 92.4ms, 평균 분자량이 12,500이고 융점이 56이며 부룩필드(Broofield)점도가 3100(cps)35인 플루토닉 127로서 BASF 와 인도트사이에 의해 판매되고 있는 프로필렌옥시와 에틸렌 옥시드의 비이온성 블록 공중합체 5.3mg, 200메쉬의 mg (OH)25.3mg 및 (Cam-Cys 183,191)rpST 분말 74.6mg을 첨가한다. 이 혼합물을 진탕시키고, 커다란 표면 페트리 접시상에 쏟고 CH2C12를 실온에서 증발시킨다음 진공건조에 의해 건조시킨다. 건조된 잔류물을 수집하고 약 1000psig에서 조각사 프레스를 사용하여 0.3175㎝(1/8) 직경의 실린더형 삽입편으로 형성시킨다. 그렇게 형성된 삽입편을 60내지 70mg까지 각각 달고 Ⅰ-1이라고 한다.
두 번째 세트형 삽입편을, 볼텍스-제니에 믹서내에서 128mg의 분말 캐스퍼왁스(-271메쉬)와 32mg의 분말 (Cam-Cys 183,191)rpST를 함께 섞음으로써 제조한다. 이렇게 제조된 혼합물을 0.3175㎝(1/8)직경의 실린더형 삽입편을 상기와 같은 방식으로 형성시킨다. 펠릿을 각각 60내지 70mg까지 재고 Ⅰ-2라고 한다.
세 번째 세트의 삽입편을 -270매쉬 케스터왁스 96mg와 분말 ㅍ(Cam-Cys 183,191)rpST 64mg을 사용하여 제조한다. 0.3175㎝(1/8)직경의 실린더형 삽입편을 60-70mg까지 재어 Ⅰ-3라고 한다.
이어 그렇게 제조된 삽입편을 시험관내에서 용해 평가한다. 각 삽입편을 별도의 플라스틱 튜브(0.05% 아지드화 나트륨이 있는 10ml의 인산염 완충 용액: pH 7.4)에 넣고 튜브를, 단위기내 물 온도가 39℃에서 유지되는 동안 튜브를 진탕시키는 진탕 수 선반내에 놓는다. 튜브를 하루동안 진탕시키고 용액을 각 튜브로부터 제거하고 HPLC에 의해 rpST를 분석하고 용액을 버린다. 새로운 인산염 완충 용액을 각 튜브에 첨가하고 튜브들을 3일동안 더 진탕시킨다. 각 튜브로부터 용액을 rpST에 대해 HPLC로 분석하고 용액을 다 버린다. 새로운 인산염 완축액을 각 튜브로 다시 첨가하고 각 튜브를 사흘동안 다시 진창시키고 rpST에 대해 다시 분석한다.
이러한 측정에서 사용된 삽입편을 얻어진 결과대로 하기에 기술해 놓았다. 인산염 완충 용액은 NaH2PO4.H2O 3.45g, Na2HPO43.55g, NaCl 9.5g을 증류수에 녹여 1000ml이 되게 한 것이다.
실시예16
마이크로캡슐화된 동물의 재조합 소마토트로핀의 제조
폴리(락티드-코-글리콜리드)0.85g을 클로로포름 29.8g내에서 녹이고 2분간 볼텍성시킨다. 이어, 25-미크론의 스테인레스 강 시이브를 통해 건조 시이빙된, 돼지의 재조합 소마토트로핀 (Cam-Cys 183,191) 0.150g을 중합체/클로로포름 용액에다 첨가하고 3분동안 볼텍싱시킨다. 이어 단백질의 결과 현택액을 50-ml 짜리 둥근 바닥용기(기계교반기가 들어있음)내에 채운다. 교반속도를, 주위온도 700rpm 으로 고정시킨다. 클로로포름 3.2g을 더 사용하여 처음의 용기를 헹군다. 이어, 총 클로로포름 양은 32.95g이다. 이어 실리콘 오일(350cs)을 첨가하고(8분간 13.1g) 폴리(락티드-코-글리콜리드)를 침전시킨다. 플라스크의 내용물을 4-리터짜리 플라스크내에서 기계적으로 진탕시키고 있는 1720g의 헵탄으로 옮긴다. 3시간후, 경화되 미소구를 일련으로 스테인레스-강 시이브를 통해 여과시키고 진공하에서 건조시킨다.
55 및 166 위치나 183 및 191위치의 시스테인 사이에 있는 s-s결합중 하나 또는 모두를 감소시키거나 유도시킨 서로 다른 아미노산 잔기나 유도된 재조합체로 동물의 재조합체의 55,166,183이나 191위치에 있는 아미노산 잔기인 하나이상의 시스테인을 대치시킨, 변형된, 동물의 재조합 소마토트로핀의 마이크로캡슐화에 유용한 기타 중합체 및 용매가, 하기에 기술되어 있다.
기록된 물질의 약어는 하기와 같다:
A = 중합된 샘플
B = 재침전된 샘플
글리 = 글리콜리드
락트 = 락티드
카프로 = 카프로락톤
TMC = 트리메틸렌 카르보네이트
PHB = 폴리히드록시부티레이트
PHV = 폴리히드록시발레레이트
PEO = 폴리에틸렌 옥시드
동물의 변형되고 유도된 재조합 소마토트로핀의 마이크로캡슐화를 위해 유용한 중합체
A) = 중합된 샘플
B) = 재침전된 샘플
실시예17
변형되거나 유도된, 동물의 재조합 소마토트로핀을 제공받은 동물의 성장증진을 측정하기 위해 뇌하수체를 제거한(시궁)쥐로 시험한 방법.
동물의 성장 속도를 변화시키기 위한 본 발명의 동물의 여러 변형(대치)되거나 유도된 재조합 소마토트로핀의 효과는 뇌하수체를 제거한(시궁) 쥐분석을 사용하여 결정한다. 뇌하수체를 제거한 시궁쥐는 그 자체의 성장 호르몬을 생산하지는 않지만 소의 주사된 성장 호르몬에 대해서는 민감하다. 측정된 반응은 10여일동안에 걸쳐 일어난다.
뇌하수체를 제거한 알비노 시궁쥐(타코닉 팜즈, 스프로그 돌리로부터 얻을 수 있음)각각에다 실시에 xx내에서 제조된 조성물 충분량을 주사하여, 기록된 배합물 0.2ml내 돼지의 성장 호르몬 800μg을 10-일적용(80μg/일)시킨다. 대안적으로, 각각의 뇌하수체를 제거한 알비노 시궁쥐에다 돼지의 성장 호르몬 유도체 80μg을 주사한다.
시험절차
시험하기 전에, 그 동물의 체중을 재고시험에 사용할 동물을 체중별로 선택한다. 체중이 그 군의 평균 체중으로부터 표준변화가 되는 그러한 동물만을 선택한다. 결과 얻어진 무리를 8마리 쥐/군으로 구성으로 처리군으로 컴퓨터로 산출된 무작위 절차에 위해 나눈다.
이어 시험 동물을 깨끗한 우리 속으로 옮기고 한 개의 우리마다 네 마리씩 집어 넣는다. 연구를 시작하는 날에, 시럼동물의 무게를 달고 체중이 지나치게 늘었거나 준(±5그람)임의의 동물을 바꾼다. 이어 동물을 시험 군에 할당하여 처리한다.
10일 동안의 시험 끝에, 각 동물의 늘어난 총 체중을 기록하고 각 처리시 마리당 평균 증가량을 결정한다. 하기 표 XX에 요약된 이러한 시험결과는, 이들 유도체의 생체활성을 증명한다.
자료에서 보면, 평가된 변형되거나 유도된 돼지의 각 재조합 소마토트로핀은 생물학적으로 활성이 있고 탁월한 동물의 성장율을 제공한다는 것을 알수 있다.
실시예18
돼지의 유도된 재조합 소마토트로핀을 제공받은 돼지의 사체(carcass) 평가
돼지들을 각 우리에 넣는다. 이 돼지들의 초기 중량을 약 60㎏이다. 돼지들을, 살아있을 때 평균 100㎏이 도면 도살한다. 시험조성물을 귀의 저부에 주사하는 것은 막 4일이 지난후에 시작한다. 돼지들에게 무제한적으로 표준 군영돼지할당량(Cy Hog ration)을 제공하고 물도 무제한적으로 제공한다.
성장결과를 주 단위로 결정한다. 하기 자료를 모은다: 일일 평균증가량, 일일 평균 먹이 설치량 및 먹이 효율.
약 40㎏이 되면, 돼지를 도살하여 사체를 평가한다. 하기 자료를, 도살시켰을 때 얻는다: 뜨거운 사체의 중량, 반건양근(semitendinosis) 중량, 기관(간, 신장, 심장)의 중량 및 (돼지 콩팥둘레의) 엽상지방중량, 24시간 냉각시킨후, 하기 측정치를 기록한다: 사체길이, 등쪽지방깊이(첫번째 갈비뼈, 마지막 갈비뼈, 마지막 요추, 10번째 갈비뼈에서의 3/4 이되는 깊이, P-2), 복부두께, 로인아이면적(loin eye areu), 컬러, 견고도, 마아볼링 및 근 스코어.
이 평가에서 네가티브 컨트롤은 매일 염수 주사를 받은 것이고, CAM-rPST는 상기 실시예7의 (Cam-Cys 183,191)rpST이며 포지티브 컨트롤은 원래의 PST를 매일 주사한 것이다.
사체평가 - (Cam-Cys 183,191)rpST
처리할때마다 여섯 마리의 돼지를 각각 우리에 가두고 44내지 94㎏의, 라이브웨이트(liveweight)가 될 때까지 각각 투여 처리한다. 성장 및 선택된 사체의 자료는 상대적인 효율을 계산하여 하기에 제공해 놓았다.
피니싱(finishing)돼지의 선택된 사체 특성과 성장 능력에 대한 카르브아미도메틸화 -rpST(CAM-rpST)의 효과(최소 자승법)
실시예19
(Cam-Cys 183,191)rpST로 수행된 질소균형실험
돼지들을 각각이 스테인레스 강 대사 크레이트에 가둔다. 돼지들을 크레이트내에 넣을 때 귀의 저부에 주사한다. 5일동안 새로운 환경에 적응하게 한다. 이 기간동안, 먹이 섭취량을 조사하고 모든 돼지들이 매일의 먹이동량을 다 써버리도록 조정한다(군영돼지 할당량, 18%의 조 단백질). 최소한 3일간 일정하게 섭취시킨 후 분뇨를 수집한다. 돼지들에게 하루에 두 번 동량을 공급하고 물을 무제한적으로 제공한다.
총 분료량을 5일간(아침마다)모은다. N소실량을 감소시키기 위해, 6N HCI 35ml를, 실험 수집단계가 시작되었을 때와 매일 수집한 후에, 플라스틱뇨 수집통에 넣는다. 가능한한 어떠한 뇨 손실이 없도록 주의한다. 수집된 뇨를 일정하게 희석시켜, 부피를 기록한 다음 샘플링하고(50ml), 라벨링하여 분석할 때까지 얼린다. 배설물을 매일 수집하여 라벨링된 플라스틱 백에 넣어 분석할 때까지 얼린다. 먹다남은 지꺼기를 모두 모아, 중량을 달고 얼린다. 소량의 먹이 샘플을 매일 취하여 얼리고 분석전에 푸울링시킨다.
먹이와 배설물 샘플을 100℃에서 밤새건조시킨다(더낮은 온도라면 더 오래건조시킨다). 건조된 먹이와 배설물샘플을 윌리 미일(Wiley mill)을 통해 분쇄하고 2일간 공기 평형시킨다. 먹이 및 배설물의 건조 물질과 N함량을 결정한다. 샘플을 자동화된 킬담 절차를 사용하여 질소에 대해 분석한다. 뇨를 마찬가지로 분석하고 일일 총 뇨 질소의 배설량을 결정한다. 뇨를 제외하고, 모든 N값을 건조 물질을 기준으로 표현한다.
돼지의 체중을 조정 첫날, 수집 첫날과 수집단계가 완성되는 도중에 기록한다. 이것은 돼지가 포지티브한 에너지 균형에 있다는 것을 확실히 해준다.
질소균형
질소 균형 연구에 있어서 CAM-rPST의 평가에서는 세가지 처리를 하는동안 총 12마리의 성장중인 돼지를 포함하였다: 1, 네가티브 컨트롤(일일 염수 주사); 2, CAM-rPST, 3mg/d; 및 3, 포지티브 컨트롤, 3mg 원래의PST. 분료를 2주 조정후, 7일간 수집한다. 결과와 상대 활성치는 다음과 같다:
실시예20
(Cam-Cys 183,191)rpST를 사용한 페이스트 제조
벤조산 나트륨을 함유한(Cam-Cys 183,191)(7% w/w)과 에틸렌 옥시드 및 프로필렌 옥시드(0.5% w/w)의 블록 공중합체의 혼합물을, 실시예 13에 기술된 분무건조 절차에 의해 제조한다.
그렇게 제조된 혼합물(7.28g)을 75℃ 내지 80℃에서, 트리스테아르산 글시세릴의, 카르필, 카르릭, 라우릭 및 카프로익 트리글리세라이드의 혼합물(Miglyol
813)3/간장콩 오일(71ml)의 혼합물 4/1 w/w 중 휘저어 섞은 용액에다 첨가한다. 75℃내지 80℃에서 균질해질때까지 혼합물을 휘저어 섞은 다음 냉각시킨다 (Cam-Cys 183,191)rpST 6.96중량%, 벤조산 나트륨 0.51중량%, 계면활성제(블록 공중합체) 0.03중량% 및 부형제 73.0중량%로 구성된 결과의 조성물을, 동물의 머리나 목 부위피하에 경피적으로 주사하여 상기 동물에게 투여한다.
실시예21
(Ala-Cys 183,191)rpST를 함유하는 점성주사가능한 겔 배합물의 제조
비이커내초 정제된 간장콩 오일 140g에다, 모노스테아르산 알루미늄 12g을 첨가한다. 혼합물을 균일해질때까지 휘저어 섞고, 간장콩내 모노스테아레이트의 투명용액이 될 때까지 30분동안 약 140 C까지 가열한다. 비이커를 히이타에서 제거하고 약 60 C까지 냉각시킨다. 이어 분무 건조된 (Ala-Cys 183,191)rpST(2.66g)을, 휘저어 섞으면서 첨가하여 균질하게 분포된 현탁액을 얻는다. 점성 혼합물을 30mL처분가능한 시린지내에 충전시킨다. 각 시린지에 채워진 부피는 20mL이고, 이는 350mg의 (Ala-Cys 183,191)rpST를 함유한다. 겔 혼합물을 시린지에 채운후, 조성물을 크림 같은, 견고하지만 압출가능한 겔로 경화시킨다. 이어 충전시린지를 사용전 냉장고에 저장한다.
실시예22
(Ala-Cys 183,191)rpST를 사용한 페이스트의 제조
참깨오일(4.18g) 및 겔루시르(Gelucire) 46/07(캐틀포스:Cattlefosse-0.74gm)를 , 휘젓개를 사용하여 유리 컨테이너 내에서 혼합한 다음 65℃까지, 휘저어 섞어 균질해지도록 가열한다. 휘젓개를 제거하여, (Ala-Cys 183,191)rpST 0.052g을 첨가하여 배합물을 생성시킨다.
실시예23
아연 결합된 (Ala-Cys 183,191)rpST와 그의 페이스트 제조
(Ala-Cys 183,191)rpST를 ml당 21.5mg 의 rPST, 40℃ 및 PH9.5에서의 0.09M의 트리스 용액내에 녹였다. 이것을 휘저어 섞으면서 1M의 ZnC12를 첨가함으로써 아연염으로 전환시킨다. 아연염이 침전한다. 이것을 40℃에서의 용액으로 유지하면서, 30분동안 10,000 x g에서 원심분리시킴으로써 회수한다. 이것을 동결건조시켜 분말을 제공한다. 비이커내 참깨 오일 140g에다가 12g의 모노스테아르산 알루미늄을 첨가한다. 내용물을(모노스테아레이트가 용해될때까지)휘저어 섞으면서 155℃에서 가열한다. 비이커를 히이터로부터 제거하고 냉각시킨다. 냉각도중에, 용액은 겔이 된다. 겔을(고전단 진탕기 및 스테인레스 강 보올이 장치된) 보올 밑내로 공급한다. 진공을 밑에 적응시키고, 아연 분말을, 조성물이 아연 분말 40%를 함유할 때까지 천천히 첨가한다. 아연 분말의 중간 직경이 10μ이하로 감소될 때까지 휘저어 섞는다. 강 보올을 겔로부터 제거하고, 시린지내에 넣는다.
상기한 DNA균주를 1988년 8월 23일 ATCC 에 기탁하였다. 그들은 mp11pSTE34(ATCC번호 40482),pRO211(ATCC 40483) 및 pig24(ATCC 40484)이다. 당업자라면 이들 DNA를 임의의 적절한 발현시스템내에 삽입시켜 본 발명의 소마토트로핀이나 그의 돌연변이체를 얻을 수 있을 것이다.
또한 본 발명의 동물의 몇가지 신규한 소마토트로핀을 발현시키는 E.Coli K12세균성 균주로 1988년 8월 23일, ATC에 기탁되었다.
그 세균성 균주에는:
E.coil : 균주 1655 (ATCC 67762)
1655/pROpSTA 34 (ATCC 67763)
1655/pROpSTE 34 (ATCC 67764)
1655/pROpST (ATCC 67765)
4200 (ATCC 67766)
4200/pROpSTA 34 (ATCC 67767)
420/pROpSTE 34 (ATCC 67768)
420/pROpST (ATCC 67769)
4255 (ATCC 67770)
4255/pROpSTA 34 (ATCC 67771)
4255/pROpSTE34 (ATCC 67772)
4255/pROpSTA (ATCC 67773)
4300 (ATCC 67774)
pROpST -SXAK182UAG(ATCC 68056, 1989년 7월 14일에 기탁됨), pROpST-SXC 183, 191 del(ATC 68057 1989년 7월 14일에 기탁됨)이 있다.
실시예24
두가지 합성 올리고뉴클레오티드를 사용한 작은 루우프 s-s결합내 시스테인 제거
C183del이라 명한 합성 올리고뉴클레오티드는 하기 서열을 갖는다.
5'CGG GTC ATG AAG AGA CGC TTC GTG GAG 3'
이 올리고뉴클레오티드는 rPST 유전자의 유사 DNA서열과 두가지 관점에서 다르다. 첫째, 183위치에서 시스테인 코돈을 암호화하는 DNA는 올리고뉴클레오티드에서 제거된다. 둘째, 184위치에서 아르기닌 코돈을 암호화하는 DNA는 올리고뉴클레오티드내 CGC에서 AGA로 변화되며, 후자는 또한 아르기닌을 암호화한다. 그러므로, 183위치에 존재하는 시스테인을 제거된다.
단일가닥 pGEM-3z(f+) pST - SX DNA는 돌연변이용 기질이다. 이 DNA는 상업적으로 구입가능한 피아지미드(phagemid), pGEM - 3z(f+) 내에 함유된 변형 rPST 유전자로 구성되어 있다. rPST 유전자 이 변형은 DNA 서열을 변화시켜 암호 영역의 225-230위치에서의 Sac Ⅰ제한 앤도뉴클레아제 절단 부위의 도입과 285-290 위치에서의 Xba Ⅰ 제한 앤도뉴클레아제의 도입을 허용한다. 이 DNA 서열에서의 변형은 rpST 단백질의 아미노산 서열을 변화시키지 않는다. ECORI/Hing Ⅲ 단편은, 피아지미드 pGEM -3z(f+)pST-SX를 유발시키는 표준절차를 사용한 이들 제한 엔도뉴클레아제로 절단된다. 단일가닥 pGEM -3z(f+)DNA를 표준프로토콜에 의한 정제파아지로부터 제조한다. 이 DNA 2000ng을 C183del 올리고뉴클레오티드 100ng과 혼합하며, 후자는 아데노신 5' 트리포스페이트와 폴리뉴클레오리드 키나아제로 미리 그의 5'에서 포스포릴화된 것이다. 혼합물을 총10μ 부피의 1 x 어니일링 완충액(1 x 어니일링 완충액은 75mM의 KCl과 5mM의 트리스-Cl이다.pH8.0)내에 포함시킨다. 이혼합물을 7분동안 65℃에서 가열하고 10분간 실온에서 항온처리한다. 이 절차는 올리고뉴클레오티드가 단일 가닥 기질 DNA에 어니일링되도록 한다. 22μ의 H2O, μ1 20mM ATP, T4 DNA 리가아제 각 2유니트 및 DNA 폴리머라제 I 큰 단편(유니트는 뉴 잉글랜드 바이오랩스 목록(1986)을 본다) 2μ1 20 x dNTP's (4개의 데옥시리보뉴클레오티드 5' 트리포스페이트 각각을 2mM 의 농도로 혼합시킨 혼합물) 및 완충액내 4μ1x 10x 필(여기서 완충액내 1 x 필은 27.5mM 트리스 -Cl pH 7.5, 15mM MgC12, 2mM DDT 임)을 첨가함으로써, 어니일링된 분자들을 공유결합된, 이중 가닥 DNA로 전환시킨다. 실온에서 1시간동안 항온처리한후, 반응물 반을, 표준 형질전환 프로토코레의해 HB101컴피턴트 세포내로 도입시킨다. 37℃에서 밤새항온 처리한후, 콜로니를 니트로셀룰로오스 필터상에 옮기고 그의 5'말단을 감마-32P-ATP와 올리고뉴클레오티드 키나아 제로 방사능라벨링시켜 원하는 돌연변이 감지에 의한 교잡을 진행시킨다. 5 x SSC, 1 x 덴하르쯔 및 150 μg/ml 효모 tRNA내, 37℃에서 3시간동 미리 교잡시킨후, 방사능라벨링된 올리고뉴클레오티드를 첨가하고 37℃에서 밤새 필터상 DNA로 교잡시킨다. 필터를 37℃, 5 x SSC내에서 30분동안 세척하고 61.5℃, TAC내에서 30분간 세척한다. 후자의 세척도중, 플라스미드 DNA가 원하는 변이체를 함유하는 이들 콜로니는 방사능 라벨링된 올리고뉴클레오티드 프로우브로 계속 교잡될 것이다. 이들 콜로니들은, X-선 필름에다 세척된 필터를 노출시킨후 감지된다. 플라스미드 DNA를 원래의 페트리 접시로부터 이미 기술한대로 HB101 컴퍼턴트 세포내로 도입시키고 방사능 라벨링된 올리고뉴클레오티드 프로우브로 재스크리닝한 이들 몇가지 콜로니를 제거시킴으로써 제조한다. 플라스미드 DNA를 그의 DNA를 프로우브로 재스크리닝한 이들 몇가지 콜로니를 제거시킴으로써 제조한다. 플라스미드 DNA를 그의 DNA를 프로우브로 교잡하고 원하는 DNA 서열에 대해 분석한 콜로니로부터 제조한다. 분석된 모든 클론은 C183del돌연변이를 함유한다. pGEM 3z(f+pST - SXC183del 이라고 명한 하나의 클론으로부터 얻은 플라스미드 DNA를 형질전환에 JM101 컴피턴트 세포내로 도입하고 단일 가닥 DNA를 단일 형질전환체로부터 유도된 정제시킨 파아지로부터 제조한다. 191위치에서 시스테인을 암호화하는 DNA를 제거하기 위해, 하기 올리고뉴클레오티드, c191del을 합성한다.
5' TTC GTG GAG AGC TCG TTC TAG TTG 3'
이 올리고뉴클레오티드는 rpST 유전자내 유사 DNA 와 두가지 관점에서 다르다. 첫째, 191위치에서 시스테인 코돈을 암호화하는 DNA는 올리고뉴클레오티드내에서 제거된다. 두 번째, 190위치에서의 세린-암호화 DNA는 올리고뉴클레오티드내에서 ABC를 TCG로 변화시키며, 또는 후자는 세린을 암호화한다.
pGEM - 3z(f+)pST - SXCl 183del로부터 얻은 주형 단일 가닥 DNA와 C191del 올리고뉴클레오티드를 어니일링시키고, 전과 같이 확장시키고, 리게이팅시킨다. 혼합물을 HA101 컴퍼턴트 세포내로 도입하고 형질전환체를 C183del에 대해 기술된 바와 같이, 돌연변이의 존재에 대해 정확하게 분석한다. C183del올리고뉴클레오티드를 방사능라벨링된 검사 프로우브로서 사용한다. 교잡 및 세적 조건은 C183del에 대해 기술된 것과 같다. C191del을 함유하는 몇가지 클론을 DNA서열분석으로부터 동정한다. C183 및 C191이 제거된 플라스미드 DNA를 pGEM-3z-(f+) - pST-SXC 183,191del이라 한다.
Claims (20)
- 동물의 재조합 소마토트로핀내에 있는 네 개의 시스테인 아미노산 잔기중 최소한 하나가 대치, 변형, 제거 또는 유도된, 동물의 재조합 소마토트로핀
- 제1항에 있어서, 작은 루우프내에 두 개, 큰 루우프내에 두 개 있는 네 개의 시스테인중 최소한 한 개가 아르기닌, 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민, 하스티딘, 알라닌, 글리신, 이소튜신, 류신, 발린, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 메티오닌, 세린, 트레오닌이나 플롤린에서 독립적으로 선택된 아미노산에 의해 대치된 동물의 재조합 소마토트로핀
- 제1항에 있어서, 작은 루우프내에 두 개 큰 루우프내에 두 개 있는 네 개의 시스테인 중 최소한 한 개의 제거된 동물의 재조합 소마토트로핀
- 제1항에 있어서, 네 개의 시스테인이 시스테인산으로 변형된 동물의 재조합 소마토트로핀
- 제1항에 있어서, 작은 루우프내 두 개의 시스테인이나 큰 루우프내 두 개의 시스테인 또는 두 루우프내 네개의 모든 시스테인이(CH2COOH),[CH(CO2H)(CH2)XCO2H],(CH2CONR3R4),(R5),[(CH2)nSO3],(CHCH2CONR3CO),(CH2)mNR3R4,(CH2OCOCH2R5), 또는 (SR6)(여기서 R3 및 R4는 각각H,[(CH2)XCO2H],[CH(CO2H)(CH2)XCO2H], 0내지 2개의 히드록실기에 의해 임의로 치환된 C1-C6알킬이나 폴리에틸렌 글리콜이고; R5는 C1-C6알킬 C1-C4 알콕시메틸이며 R6은 C1-C6알킬, 폴리에틸렌 글리콜이나 1개 또는 두개의 카르복실산이나 술폰산기들로 임의로 치환된 페닐이며; n은 0내지 4의 정수이고; m은 2내지 4의 정수이며; x는 1내지 3의 정수이다)에서 선택된 치환체로 유도되며, 단 상기 동물의 재조합 소마토트로핀의 시스테인 아미노산 잔기들이 유도되었을 때, 상기 소마토트로핀의 작은 루우프내 두 시스테인 잔기나 큰 루우프내 두 시스테인 잔기는 동일한 기로 치환되며, 작은 루우프내 시스테인 아미노산 잔기의 치환체들은 상기 소마토트로핀의 큰 루우프내 시스테인 아미노산 잔기들의 치환체와 같은 치환체거나 다른 치환체일 수 있다는 것을 특징으로 하는, 동물의 재조합 소마토트로핀
- 제1항에 있어서, 상기 동물의 소마토트로핀이 (Ala 183,191) rpST; (Ala 183,191) rbST; (Ala 183,191) roST; (Ala 183,191) raST; (ser 183,191) rpST; (ser 183,191) rbST; (ser 183,191) roST; (ser 183,191) raST; (Glu 183,191) rpST; (Glu 183,191) rbST; (Glu 183,191) roST; (Glu 183,191) raST; (Glu 183-Ala 191) rpST; (Glu 183-Ala 191) rbST; (Glu 183-Ala 191) roST; (Glu 183-Ala 191) raST; (Glu 183-ser 191) rpST; (Glu 183-ser191) rbST; (Glu 183-ser 191) roST;(Glu 183-ser 191) raST; (Arg 183,191) rpST; (Trp 183,191) rpST; (Asp 183,191) rpST and (Asn 183,191) rpST.인, 동물의 변형된 재조합 소마토트로핀
- 제5항에 있어서, 상기 동물의 재조합 소마토트로핀이 하기와 같은 동물의 재조합 소마토트로핀:
상기 서열중에서, R1 및 R1a는Cys, Cys(CH2COOH),Cys[CH(CO2H)(CH2)xCO2H],Cys(CH2CONR3R4),Cys(R5),Cys(CH2)nSO3,Cys(CHCH2CONR3CO),Cys(CO2)nNR3R4,Cys(CH2OCOCH2R5),또는Cys(SR6)이고;R2및R2a는Cys,Cys(CH2COOH),Cys[CH(CO2H)(CH2)xCO2H],Cys(CH2CONR3R4),Cys(R5);Cys(CH2)nSO3;Cys(CHCH2CONR3CO),Cys(CH2)nNR3R4,Cys(CH2OCOCH2R5), 또는 Cys(SR6)이며; (여기서 R3 및 R4는 각각은 H,[(CH2)xCO2H], [CH(CO2H)(CH2)xCO2H], 0내지 2의 히드록시기에 의해 임의 치환된 C1-C6알킬이나 폴리에틸렌 글리콜이고; R5는 C1-C6알킬이나 C1-C4알콕시메틸이고 R6는 C1-C6알킬, 폴리에틸렌 글리콜, 페닐 또는 한 개 또는 두 개의 카르복실산이나 술폰산 기로임의 치환된 페닐이고; n은 0내지 4의 정수이며; m은 2내지 4의 정수이고; x는 1내지 3의 정수이다), 단 R1 및 R1a가 Cys 일때 R2 및 R2a는 유도된 Cys를 나타내야 하고; R2 및 R2a 가 Cys일 때, R1 및 R1a는 유도된 Cys를 나타내야 하며R1 및 R1a 또는 R2 및 R2a중 어느 것이 Cys일 때, s-s결합은 상기 R1 및 R1a 또는 R2 및 R2a에 의해 나타낸 두 Cys기능기들 사이에 형성된다는 것을 특징으로 한다. - (정정) 제7항에 있어서, R2 및 R2a가 Cys일 때 R1 및 R1a가 Cys(CH2COOH), Cys(SR5)(여기서 R5는 C1-C6알킬이나 C1-C4알콕시메틸임), Cys(SR6)(여기서 R6 0내지 2개의 히드록실 기로 임의 치환된 C1-C6알킬 폴리에틸렌 글리콜, 페닐 또는 하나 또는 두 개의 카르복실산이나 술폰산 치환체로 임의 치환된 페닐임), Cys(CH2)nSo3(여기서 n은 1내지 4의 정수임), Cys(CH2CONR3R4)(여기서 R3 및 R4는 각각 H, C1-C6알킬, 폴레에틸렌 글리콜 [(CH2)xCO2H] 또는 [CH(CO2H)(CH2)xCO2H]이고, 여기서 x는 1내지 3임), 또는 Cys[CH(CO2H)(CH2)xCO2H(여기서 x는 1 또는 2임)로부터 선택되거나, R1 및 R1a가 Cys일 때, R2 및 R2a가 Cys(R5)(여기서 R5가 C1-C6알킬이나 C1-C4알콕시메틸임), Cys(SR6)(여기서 R6는 0내지 2의 히드록시기들로 임의 치환된 C1-C6알킬 프로필렌 글리콜, 또는 1개 또는 2개의 카르복실기나 술폰산 치환체로 임의 치환된 페닐임), Cys(CH2)nSo3-(여기서 n은 0내지 4의 정수임), 또는 Cys(CH2CONR3R4)(여기서 R3는 H, C1-C6알킬 또는 폴레에틸렌 글리콜이며; R4는 C1-C6알킬 또는 폴레에틸렌 글리콜임)로부터 선택되는 동물의 재조합 소마토트로핀으로, 상기 소마토트로핀이 돼지의 (CH3S-Cys 183,191)재조합 소마토트로핀, 또는 돼지의 (HO3SCH2CH2CH2-Cys 183.191)재조합 소마토트로핀으로부터 선택되는 동물의 재조합 소마토트로핀
- 제5항에 있어서, R2 및 R2a가 Cys일 때, R1 및 R1a가 Cys(CHCH2CONR3CO)(여기서 R3는 C1-C6알킬임) (CH2)nNR3R4(여기서 m은 1이고 R3은 H이며 R4는 C1-C6알킬임), 또는 (CH2OCO CH2R5)(여기서 R5는 C1-C6알킬임)로부터 선택되는 동물의 재조합 소마토트로핀
- 동물의 재조합 소마토트로핀을 중탄산나트륨이나 구아니딘 히드로클로라이드를 함유하는 수용액이나 물에 용해시키고; 상기한 용액의 pH를 8.4로 조정하고; 상기 pH조정된 용액을 디티오트레이톨로 처리한 다음; 그렇게 제조된 혼합물을 할로아세트아미드, 할로아세트산, 알칼리금속 테트라티오네이트, C1-C4 알킬 메탄티오술포네이트나 C1-C6알킬 술폰으로 처리하고; 한외여과로 결과의 혼합물을 탈염시키고 결과의 탈염된 혼합물을 재희석, 재여과 및 동결건조시킴으로써, 시스테인 잔기에서 최소한 하나나 둘의 S-S결합을 감소시키고 그 시스테인 아미노산 잔기를 유도시키는 것으로 구성된, 동물의 재조합 소마토트로핀의 응집을 막는 방법.
- 제10항에 있어서 동물의 재조합 소마토트로핀이 하기와 같은 방법:
상기 서열에서,R1 및 R1a 또는 R2 및 R2a라고 명시된 시스테인 잔기에서 설파이드 결합중 하나 또는 두 개가 감소되고 시스테인 아미노산 잔기들이 각각 Cys Cys(CH2COOH), Cys(CH2CONR3R4), Cys(R5), Cys(CH2)nSO-3,Cys(CHCH2CONR3CO),Cys(CH2)nNR3R4, Cys(SO-3), Cys(CH2OCOCH2R5), 또는 Cys(SR6) (여기서 R3 및 R4는 각각 H,[(CH2)xCO2H], [CH(CO2H)(CH2)xCO2H], 0내지 2개의 히드록실기로 임의치환된 C1-C6알킬이나 폴리에틸렌 글리콜이고; R5는 C1-C6알킬이나 C1-C4알콕시메틸이고 R6는 C1-C6알킬, 폴리에틸렌 글리콜, 하나 또는 둘의 카르복실산이나 술폰산기들로 임의치환된 페닐이며; n은 1-4의 정수이고; m은 1-6의 정수임)이고; 단, R1 및 R1a는 Cys일 때, R2 및 R2a는 유도된 Cys여야하고; R2 및 R2a가 Cys이면, R1은 유도된 Cys여야 하고; R1 al 및 R1a 또는 R2 및 R2a가 Cys이면, S-S결합은, 상기 R1 및 R1a 또는 R2 및 R2a에 의해 나타내어진 두 Cys기능기 사이에 형성된다. - 제11항에 있어서, 상기 소마토트로핀의 C-말단에 가장 가깝고 동물의 재조합 소마토트로핀의 불안정한 작은 루우프내에 있는 두 시스테인 아미노산 잔기들 사이에 형성된 S-S결합을 감소 및 유도시키는 것으로 구성된 방법
- 제11항에 있어서, 소마토트로핀의 N-말단에서 상기 동물의 재조합 소마토트로핀의 안정한 큰 루우프내에 있는 두 시스테인 아미노산 잔기사이에 형성된 S-S결합을 감소 및 유도시키는 것으로 구성된 방법.
- 제11항에 있어서, (1) 소마토트로핀의 큰 루우프내에 있어 두 시스테인 아미노산 잔기와 (2) 상기 소마토트로핀의 작고 불안정한 루우프내에 있는 두 시스테인 아미노산 잔기 사이에 형성된 두 S-S결합들을 감소시키고 유도시키는 것으로 구성되는 방법.
- 동물의 재조합 소마토트로핀의 시스테인 아미노산 잔기중 최소한 하나내지는 네 개 모두를 아르기닌, 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민, 히스티딘, 알라닌, 글리신, 이소류신, 류신, 발린, 페닐 알라닌, 트립토판, 티토신, 메티오닌, 세린, 트레오닌이나 프롤린으로부터 별개로 선택된 하나 내지는 네 개의 아미노산 잔기들로 대치시키는 것으로 구성된 상기 동물의 재조합 소마토트로핀의 응집을 막는 방법.
- 제15항에 있어서, 소마토트로핀의 C-말단 가까이 있는 183 및 191에 위치된, 상기 소마토트로핀의 불안정한 작은 루우프내 한 개 또는 두 개 시스테인을, 알라닌, 세린, 글루탐산, 아르기닌, 트립토판 또는 아스파라긴으로부터 선택된 아미노산으로 대치시키고 안정한 큰 루우프내의 55 및 166위치에 있는 시스테인들은 대치시키지 않는 방법.
- 동물의 재조합 소마토트로핀의 시스테인 아미노산 잔기중 최소한 하나내지는 네 개 모두를 제거시키는 것으로 구성된, 동물의 재조합 소마토트로핀의 응집을 막는 방법.
- 동물의 재조합 소마토트로핀의 시스테인 아미노산 잔기중 네 개를 시스테인 산으로 산하시키는 것으로 구성된, 동물의 재조합 소마토트로핀의 응집을 막는 방법.
- 183 및 191위치에 있는 시스테인 아미노산 잔기들을 아르기닌, 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 아스파라긴, 글루타민, 히스티딘, 알라닌, 글리신, 이소류신, 류신, 발린, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신, 메니오닌, 세린, 트레오닌이나 프롤린에서 각각 선택된 아미노산 잔기로 대치시킨, 성장을 촉진시키는 양의 동물의 재조합 소마토트로핀, 또는 183이나 191 또는 두위치 모두에 있는 시스테인 아미노산 잔기들을 제거시킨, 성장을 촉진시키는 양의 동물의 재조합 소마토트로핀이나 그의 제약학적으로 허용가능한 염과 그의 대해 제약학적으로 하용가능한 고체나 액체 담체로 구성되어 있고 연장된 시간동안에도 동물의 성장속도를 증가시키는데 효과적인 제약학적 조성물
- 제11항에 있어서, 상기 조성물이 상기 동물에게 비경구적으로 투여되는 조성물.
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| KR1019890012010A KR0130969B1 (ko) | 1988-08-23 | 1989-08-23 | 동물의 재조합 소마토트로핀과 그의 응집을 막는 방법 및 그를 포함하는 제약학적 조성물 |
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| KR900003368A (ko) | 1990-03-26 |
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