PT96577B

PT96577B - Processo para a preparacao de celulas de plantas transgenicas que exprimem asparagina sintetase dependente de amonio procariotico

Info

Publication number: PT96577B
Application number: PT96577A
Authority: PT
Inventors: Denes Dudits; Katalin Paulovics; Katalin Kalman; Janos Gyorgyey; Ferenc Nagy; Laszlo Bako; Gabor Horvath; Peter Eckes; Gunter Donn
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1990-01-26
Filing date: 1991-01-25
Publication date: 2001-04-30
Also published as: EP0511979A1; YU13191A; HUT65648A; TR25404A; ZA91568B; EP0511979B1; CN1053641A; PT96577A; WO1991011524A1; AU7176891A; DE69103404T2; MY105446A; HU9202437D0; US5545819A; US5723762A; DE69103404D1; NZ236890A; CS9100165A2; SK279160B6; CZ283506B6

Description

HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE CÉLULAS DE PLANTAS

TRANSGÉNICAS QUE EXPRIMEM ASPARAGINA SINTETASE

DEPENDENTE DE AMÓNIO PROCARIÕTICO

A asparagina desempenha uma função importante como uma forma de transporte de azoto e em muitas plantas - incluindo os fixadores de azoto - é o principal composto envolvido na tran£ ferência de azoto das raízes para a corrente da transpiração .

Nas plantas a asparagina forma-se a partir de glutamina, aspartato e ATP catalisado pela asparagina-sintetase. ASN (E. C. 6.3.5.4) enquanto o glutamato, AMP e pirofosfato se formam como sub-produtos.

Descobriu-se agora que se pode introduzir nas células das plantas asparagina-sintetase dependente de amónio ASN-A (E.C. 6.3.1.1) originando plantas transgénicas que apresentam diversas vantagens: um maior rendimento da fixação fotossintética de CO2, uma velocidade de crescimento melhorada, um de senvolvimento acelerado da planta e uma formação de flores mais precoce, o acréscimo da massa verde e do peso seco da planta. Deste modo, pode estender-se a área de cultivo destas plantas e regiões com climas menos favoráveis e em regiões com um clima quente serã possível efectuarem-se três colheitas em vez de duas.

-2Para além disso, as plantas transgènicas toleram a aplicação de inibidores de glutamina-sintetase (GS), como, por exemplo, fosfinotricina (PPT) ou metionina-sulfoximina (MSX) apresentando mesmo uma estimulação da fosfossíntese e do cres cimento após a aplicação desses inibidores.

Contrastando com o gene (ou genes) que codificam ASN das plantas superiores (gene asn), o gene asnA da E. coli codifica um diferente tipo de ASN que utiliza amónio em vez de glutamina para a produção de asparagina {Cedar e Schwartz, J. Biol. Chem. 244 (1969) 4112-4121). 0 gene para este enzima foi isolado e caracterizado por Nakamura et al., Nucleic Acids Research, 2 (1981) 4669-4676. Descobriu-se que este enzima procariótico é activo nas plantas e abre uma nova via de assimila ção de amónio nestas plantas transgènicas. Isto origina uma al_ teração total no metabolismo do azoto das plantas com um efeito estimulador no crescimento e na produção de massa verde.

Sob condições normais os transformantes, tanto GS como ASN-A, utilizam amoníaco. A vantagem da via bacteriana será mais pronunciada durante os períodos sem luz quando a actividade GS do cloroplasto se encontra limitada pela reduzida disponi bilidade de ATP, de carga energética e de iões magnésio (0'Neal e Joy Plant Phys. 54 (1974) 773-779; Joy Can J. Bot., 66 (1988) 2103-2109) . Além disso, a expressão do gene bacteriano asn-A nas plantas permite mesmo uma assimilação de amoníaco quando o

GS da planta se encontra bloqueado por inibidores específicos semelhantes a PPT. Nas plantas não transformadas a inibição da actividade GS perturba a via principal de utilização de amoníaco e a acumulação de amónio é um dos factores principais na mortalidade das plantas tratadas Tachibana et al., J. Pes ticide Sei. 11 (1986) 33-37. Deste modo, a presença de um en zima bacteriano pode reduzir a acumulação de amoníaco nas plan tas transgénicas tratadas com PPT que não só poderão sobreviver a doses de herbicidas que seriam mortais para as plantas de tipõ selvagem, como também as plantas transgénicas tratadas deste modo poderão apresentar uma estimulação do crescimen to.

Será evidente para o especialista que estes efeitos po sitivos não se limitam ao gene asnA da E. coli , uma vez que outras bactérias contêm o mesmo gene ou um gene que possui a mesma capacidade de amidação do ácido asparagínico e dos seus sais para produzir asparagina.

Deste modo, a presente invenção refere-se ã utilização de um gene asnA procariõtico numa célula de uma planta, a uma construção de um gene que consiste num gene que codifica um asnA procariõtico, que se encontra ligado de modo operacional a uma sequência reguladora que efectua a expressão do referido gene numa célula da planta, e um vector que contém uma tal constru ção genética, a uma célula de uma planta transformada com uma tal construção genética ou um vector e que exprime uma asparagino-sintetase específica do amoníaco procariõtico numa planta, especialmente au plantas produtoras de cereais e sementes ou α propagação de material de tais plantas que contêm células transformadas,

-4tal como anteriormente se definiu.

Os aspectos preferenciais compreendem a utilização do gene asnA de E. coli, que codifica o referido enzima e de genes sintéticos que codificam o referido enzima, especialmente genes que compreendem codãos que são preferencialmente utilizados pelas plantas. A presente invenção também compreende ge nes que codificam enzimas que possuem uma composição aminoácida diferente da dos enzimas naturais mas que possui essencialmente a mesma actividade catalítica por eliminação ou adição de codãos ou por. substituições ~de codãos nos genes naturais por outros que codifiquem aminoácidos diferentes. Todas estas modificações se encontram ao alcance do especialista.

EXEMPLO 1

Expressão do gene asnA de E. coli com a pequena subunidade pro motora de RUBISCO, no tabaco

1. Produção de plantas de tabaco transgénicas

Com base na sequência nucleotídica completa do gene asnA de E. coli (Nakamura et al., Nucleic Acids Research, 18 (1981) 4673, Fig. 3 ) efectuou-se a reclonagem do fragmento PstI-Hgal do plasmídeo pMY114 em pUC9.

Depois ligou-se o gene asnA (1,1 kb) ao promotor da pe quena subunidade genética por pea-ribulose-1,5-bifosfato-carbo

-5xilase (RUBISCO, Herrera-Estrella et al., Nature, 310 (1984) 115-120) e introduziu-se a totalidade do fragmento no vector Agrobacterio pPCVOOl .(Koncz e Schell Mol. Gen. Genet., 204 , (1986) 383-396. Após transformação do disco das folhas das plantas do tabaco SRI, identificaram-se as plantas transgénicas com base na sua resistência ã canamicina. Entre diversos transformantes seleccionaram-se duas^plantas (ASP4, ASP5) que apresentavam tolerância ao tratamento com 1 kg/ha de PPT. Como resultado deste tratamento com PPT, as plantas de controlo SRI foram completamente aniquiladas e nunca se descobriram plantas que ultrapassassem o crescimento normal com capacidade para florescerem e produzirem sementes. Os transformantes AsP4 e ASP5 apresentaram apenas sintomas nas folhas inferiores e mais velhas, embora a região meristemática pudesse ultrapassar a inibição. Após continuação do desenvolvimento estas plantas floresceram e produziram sementes.

auto-desenvolvimento de plantas de tabaco transgénicas ASP4 e ASP5 originou uma população; da plantas criadas a par tir da semente segregadora com progénies sexualmente resisten tes e sensíveis. Sob as condições in vitro que se utilizaram na presença de 10 yiM de L-PPT no meio de cultura foi possível fazer uma discriminação clara entre os dois fenótipos.

Também se demonstrou a presença da sequência asnA num genoma dos transformantes por hibridação do ADN de acordo com Southern. Após digestão dos ADNs das plantas com EcoRI revelou-se um fragmento de hibridação nas plantas transformadas .

-6Na análise de hibridação de Northern detectou-se uma pequena quantidade de mARN que é homólogo do gene de asnA no ARN total isolado a partir dos transformantes ASP5 desenvolvidos in vitro.

2. Acumulação reduzida de amoníaco nas plantas transgénicas do tabaco

A inibição na actividade de GS por tratamento com PPT originou um rápido aumento da.concentração de amoníaco nas folhas das plantas de tabaco de controlo. A velocidade de acumu lação de amoníaco medida de acordo com o método de microdifusão e nesslerização subsequente (Shelp et al., Gan J, Bot. ,

63, (1985), 1135-1140):♦depende da concentração do herbicida aplicado.

Para uma dose de 0,5 kg/ha as plantas transgénicas podem ultrapassar os efeitos do tratamento com PPT (Quadro 1).

Quadro 1

Acumulação de amoníaco nas plantas de tabaco de controlo (SR1) e nas plantas transgénicas com o gene asnA após aspersão como

0,5 kg/ha de PPT horas Concentração de amoníaco (mm)

SR1 ASP4 ASP5

até 4	0,58	0,42	0,40
6	1,20	0,82	0,78
24	1,70	0,70	0,75
48	1,95	0,60	0,50

-7Também se podia observar um reduzido nível de acumulação nestas plantas por comparação com as plantas de tabaco SRI após pulverização com 1 kg/ha (Quadro 2) . 0 baixo nível de amoníaco detectado seria responsável pelos danos pouco pronun ciados das plantas transformadas.

Quadro 2

Efeitos de 1 kg/ha PPT na concentração de amoníaco nas plantas do tabaco (SRI) e nas plantas transgénicas (ASP4, ASP5 ) horas concentração de amoníaco (mM)

SRI ASP4 ASP5

até 6	0,8	0,78	0,88
8	2,2	0,87	0,95
24	4,9	2,0	1,40
48	8,6	4,1	3,6

3. Estimulação do crescimento e desenvolvimento das plantas

A comparação pormenorizada do comportamento de cresc_i mento entre as plantas de controlo e as plantas ASP revelou di ferenças consideráveis: uma maior velocidade de crescimento caracterizava as plantas transgénicas mas conseguiu-se uma es timulação mais significativa por tratamento das plantas ASP com doses baixas de PPT.

-8Pode demonstrar-se a aceleração base assim como a ac£ leração induzida por PPT no crescimento de acordo com diversos tipos de curvas de crescimento.

A Fig. 1 indica que, embora a pulverização com 0,025 kg/ha de PPT já inibisse o crescimento de plantas SR1, se de tectou uma grande quantidade de estimulação em ambos os trans formantes. A aspersão com 0,05 kg/ha de PPT possui uma influência negativa em todas as plantas. Cada um dos pontos re presenta a altura média de três plantas.

As diferenças entre as diversas linhas sob condições de controlo e de tratamento também são detectáveis se se carac terizar o crescimento das plantas de acordo com as curvas de Baule Mitscherlich (Fig. 2) sob condições de estufa. Pode se guir-se a inibição e a estimulação de crescimento pelo coeficiente angular das curvas com ângulos alfa característicos que se apresentam na Fig. 2 .

4. Aumento do peso seco nas plantas transgénicas

Para além das diferenças na altura das plantas também são detectáveis os efeitos estimuladores medindo o peso seco. Os dados apresentados no Quadro 3 demonstram a produtividade mais elevada dos transformantes asnA:

-9Quadro 3

seco final (g) de plantas de controlo (SRI)	e de transfor
	mantes	(ASP4,	ASP5)
Linhas				Tratamento

	Controlo		0,025	kg/ha	PPT
SRI	3,19	100	%	2,76	100	%
ASP 4	3,85	120	%	4,79	173	%
ASP5	3,74	117	%	5,05	183	%

EXEMPLO II

Efeito do gene asnA comandado pelo promotor CaMV35s nas plantas transgénicas

1. Selecção de plantas transgénicas

Como uma abordagem alternativa introduziram-se moléculas plasmídicas (pUC) portadoras do gene asnA de E. coli com o promotor CaMV35's nos protoplastos das folhas .de SRI por incorporação directa de ADN (R. X. Fang et al., The Plant Cell, 1^ (1989) 141-150) . Seleccionaram-se directamente os transformantes com base na sua resistência a PPT. Regeneraram-se as plantas a partir do crescimento de micro-caules na presença de 10 uM de L-PPT.

-10A hibridação de Southern confirmou α presença do gene asnA no ADN isolado a partir das plantas regeneradas resistentes a

PPT.

2. Acumulação reduzida de amoníaco e melhoramento da tolerãn cia a PPT nas plantas transgénicas

O auto-desenvolvimento de transformantes regenerados or_i ginou progénies segregadoras com diversos níveis de resistência a PPT (meio enriquecido com mais de 30 jiM de L-PPT) .

De acordo com o fenótipo resistente, as plantas transfor madas acumulavam menos amoníaco do que as plantas SRl quando pu_l verizadas com 1 kg/ha de PPT (Quadro 4).

Quadro 4

Acumulação de amoníaco após pulverização das plantas com 1 kg/ha de PPT horas Concentração de amoníaco (mM)

SRl ASP70 ASP95

6	6,85	2,92	1,95
24	9,50	5,60	5,10
48	22,3	13,60	17,40
120	58,60	28,30	35,6
144	113,00	39,40	50,00

-113. Eficácia da fotossíntese

Caracterizaram-se plantas SR1 de controlo e plantas de tabaco transgénicas, de acordo com diversos parâmetros de fotojs síntese, tais como velocidade de fixação C0₂ (Szajko et al., Acta Agr. Acad. Hung., 20 (1971), 247-260). e indução de fluo rescência (Hideg et al., Photobiochem. Photobiophys, 12 (1986) 221-230) . Sob condições de estufa trataram-se as plantas com diversas doses de PPT e também se determinou o teor de amónio. Tal como se indica no Quadro 5, as plantas transgénicas com o gene ASN-A apresentaram um aumento considerável na eficácia de fixação de CO₂ em comparação com as plantas de controlo. A apli_ cação de um tratamento com uma pequena dose de PPT poderia estimular mais a fixação de CO₂, embora a diferença entre as plantas SR1 com ou sem tratamento com PPT (50 g/ha) não seja estatisticamente significativa. O Quadro 5 também torna evidente que no caso das plantas do tabaco a concentração inibidora de PPT origina a acumulação de amónio com sério prejuízo da fotojs síntese por inibição do transporte electrónico e uma redução de 50% da fixação de CO₂· Sob as mesmas condições as plantas tranis formadas (ASP 70) podem tolerar o tratamento no que se refere ã função de fotossíntese.

-12Quadro 5

Parâmetros de fotossíntese

Trata- Concen mento tração Linhas com de amoPPT níaco (g/ha) (mM)' x

Fixação de CO₂2 (^imole CO₂/dm xh)

Indução de fluorescência (em % de SRI de controlo)

F.-F /F -F χ o m o +s.

η P 1% m

SRI	0	0,37	38,17	12,05	20	-	100	100	0,45
	50	2,00	44,23	17,73	20	-	101	102	0,44
>	750	34,35	19,54	12,42	20	+	80	194	0,59
ASP70	0	0,47	49,32	7,86	20	+	98	114	0,38
	50	2,70	58,07	6,06	20	+	99	110	0,42
	750	15,80	31,61	14,16	20		92	144	0,49

Efectuou-se a anãlise 4 dias após o tratamento com PPT.

4. Caracteristicas de crescimento das plantas transformantes asnA

A análise da velocidade de crescimento (mm/dia) mostrou de um modo reprodutível o crescimento acelerado dos transforman tes durante o desenvolvimento inicial da planta. Os dados encontram-se indicados no Quadro 6 para plantas desenvolvidas em estufa.

-13Quadro 6

Velocidade de crescimento (mm/dia) durante diversos períodos de desenvolvimento das plantas (estufa)

Altura Final

Períodos (6 dias) da Planta

uinhas —	i :	:ii	III	IV	V	VI	VIII	VIII	(cm)
(SRl	.0,29	0,45	0,27	0,52	0,75	1,31	1,93	1,37	41,08
Asp70/l	0,60	1,15	0,43	1,23	1,83	2,08	1,53	0,50	58,0 141 %
Asp70/2	0,61	0,93	0,50	0,75	1,18	1,51	1,83	0,25	48,5 118 %

SR1: média de 5 plantas

ASP70/1 e ASP70/2: plantas individuais

A análise destas plantas em campos de cultura revelou diferenças semelhantes ãs observadas em estufa (Quadro 7) . A velo cidade de crescimento de plantas ASP durante os períodos I-III foi consideravelmente maior do que no caso das plantas SR1. Nes ta experiência o efeito estimulador da PPT sobre as plantas tran£ genicas também foi confirmado especialmente no último período de crescimento. As curvas de Baule-Mitshcerlich (Fig. 3) demonstram claramente que as plantas ASP exibiam um crescimento mais rápido do que as plantas SRl de controlo desenvolvidas em campos de cultura.

-14Quadro 7

Velocidade de crescimento (mm/dia) durante diversos períodos de desenvolvimento das plantas (experiência em campo de cultura)

TrataPeríodos (7 dias)

Linhas --------------------------Altura Final da Planta (cm) mento

I II III IV

Controlo	SR1	0,36	0,85	1,31	3,24	42,5	100	%
	Asp70	0,45	1,07	1,50	3,14	47,6	112	%
	Asp95	0,48	1,14	1,92	3,24	51,5	121	%
25 g/ha	SR1	0,29	0,56	1,15	2,74	35,0	100	%
PPT	Asp70	0,44	1,02	1,69	3,84	53,8	154	%
	Asp95	0,31	0,88	1,27	3,78	48,7	139	%

Média de 5 plantas

5. Produtividade dos transformantes asnA

Tal como se indica no Quadro 8 a massa verde total, assim como o peso seco, aumentaram nas plantas ASP em comparação com as plantas SR1. Pode avaliar-se a partir destes factos que as plantas transgénicas são significativamente estimuladas por tra tamento com PPT. Ao mesmo tempo, AS PLANTAS SR1 de controlo tam bém foram inibidas pela pulverização.

-15Quadro 8

Massa Verde (g)

Ensaio em campo de cultura

Controlo	25 g/ha	PPT
Linhas	Total	%	Folhas	%	Total	%	Folhas	%
SR1	86,5	100	57,4	100	78,7	100	43,4'	100
ASP70	95,2	110	62,3	108	139,9	178	92,41	213
ASP95	103,8	120	68,4	119	105,0	133	71,56	165

Peso Seco (gr)

Ensaio em Campo de Cultura

Controlo	25 g/ha	PPT
Linhas	Total	%	Folhas	%	Total	%	Folhas	%
SR1	6,66	100	4,83	100	6,42	100	5,05	100
ASP70	8,05	121	5,82	120	10,99	171	8,56	169
ASP95	8,48	127	6,34	131	8,96	140	6,78	134

Dados Médios Totais de 5 Plantas

Claims

1.- Processo para a preparação de uma célula de uma planta transgénica, caracterizado por se introduzir na célula referida uma asparagina sintetase (ASN—A) específica de amónio procariótico.

2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se introduzir na referida célula uma estrutura de gene que contém um gene que codifica uma ASN-A procariótica, ligado operativamente a uma sequência reguladora que efectua a expressão do referido gene numa célula de planta.

3.- Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2,

-17caracterizado por a ASN-A ser uma ASN-A de E. coli

4. - Processo de acordo com uma qualquer das reivindi cações anteriores, caracterizado por o.gene que codifica ASN-A ser constituído por codãos específicos de plantas.

5. — Processo para a preparação de uma planta, sementes ou material de propagação, caracterizado por se propagar uma célula obtida pelo processo de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores.