PT954565E

PT954565E - Diferenciação adiopogénica de células estaminais mesenquimatosas humanas

Info

Publication number: PT954565E
Application number: PT97934171T
Authority: PT
Inventors: Mark F Pittenger
Original assignee: Osiris Therapeutics Inc
Priority date: 1996-07-30
Filing date: 1997-07-21
Publication date: 2007-01-31
Also published as: CA2262014C; JP2001523084A; US6709864B1; DE69736814T2; US6322784B1; EP0954565A1; CA2262014A1; ATE342349T1; DK0954565T3; AU3729097A; US5827740A; ES2274547T3; EP1659172A1; EP0954565A4; DE69736814D1; WO1998004682A1; EP0954565B1

Description

DESCRIÇÃO

"DIFERENCIAÇÃO ADIPOGÉNICA DE CÉLULAS ESTAMINAIS MESENQUIMATOSAS HUMANAS"

Este pedido é uma continuação em parte do documento U.S. n° de série 08/700753, apresentado em 30 de Julho de 1996 (pendente).

Esta invenção refere-se a adipócitos e mais particularmente à produção de adipócitos a partir de células estaminais mesenquimatosas humanas. O tecido adiposo proporciona um armazenamento de reserva de energia para o corpo na forma de triglicéridos, podendo este tecido libertar ácidos gordos livres quando a incorporação calórica cai abaixo das necessidades metabólicas. Em resposta a uma incorporação dietética aumentada, normalmente o corpo aumentará automaticamente o gasto de energia através da actividade para manter um balanço energético. A energia também pode ser libertada como calor. O tecido adiposo está profundamente envolvido na manutenção da temperatura corporal através do tecido adiposo castanho e armazenamento de energia através de tecido adiposo branco. Existem vias de regulação de energia normais que equilibram a incorporação dietética com a actividade metabólica largamente mediada através do hipotálamo. É agora também evidente que o adipócito desempenha um papel activo neste processo e que produz, provavelmente, moléculas que servem para responder e efectuar a regulação do metabolismo dos triglicéridos. 1

Os dois tipos de tecido adiposo, castanho e branco, realizam papéis muito diferentes no corpo. 0 adiposo branco é concebido para armazenar incorporação calórica em excesso enquanto que o tecido adiposo castanho utiliza um sistema único para separar o excesso de calorias e utilizá-lo para gerar calor corporal. 0 calor é gerado nas mitocôndrias do tecido adiposo castanho em que a oxidação do substracto é utilizada para criar um gradiente de ião de hidrogénio que é, depois, colapsado, num modo regulado gerando calor em vez de ATP. Foi demonstrado que animais transgénicos que carecem de tecido adiposo castanho mantêm o metabolismo eficiente, são obesos e continuam a sobreaquecer (Lowell et ai, 1993). Outros estudos em roedores também demonstraram uma ligação entre a obesidade, sobreaquecimento continuado e uma sensibilidade ao frio, sugerindo uma ligação ao sistema nervoso simpático (Friedman e Leibel, 1992) . 0 desequilíbrio no metabolismo energético no corpo conduz a vários estados de doença, mais notoriamente obesidade e diabetes induzida pela obesidade, podendo estes serem descritos como disfunções dos tecidos de armazenamento de energia. Foi identificada em 1950 uma mutação em murganhos que leva à obesidade (Ingalls et ai., 1950) e foi, recentemente, identificado o gene, através de clonagem posicionai. O produto do gene ob é uma proteina de pm 16000 denominada leptina ou proteina OB. A leptina é produzida apenas por adipócitos e é uma hormona que regula o hipotálamo. Foi identificada uma mutação no murganho que resulta na terminação prematura da translação de ARNm de modo a que nenhuma proteina leptina funcional seja formada (Zhang et ai. 1994). O papel da leptina na regulação do metabolismo dos lipidos é uma área de pesquisa intensa. 2

Pesquisas publicadas recentemente incluem estudos dos elementos promotores a montante, verificados estarem adjacentes ao gene ob, que foi demonstrado ligarem C/EBP (ou CCAAT/ proteina melhorada de ligação) (Yeh et al, 1995 e Hwang et al, 1996) . 0 possuir-se um modelo de sistema experimental para a adipogénese in vitro de células humanas proporcionaria descobertas nesta área.

Recentemente foi referido que a leptina pode servir como uma hormona que regula a fertilidade e pode ser a ligação entre o peso corporal apropriado e a fisiologia reprodutiva (Chehab et al. 1996) . Ambas as mulheres com falta de peso e com excesso de peso possuem dificuldade em engravidar estando tal, provavelmente, associado com o desequilíbrio hormonal no corpo destes indivíduos. A ligação entre o peso corporal, fertilidade e a leptina produzida pelos adipócitos foi conjecturada e agora testada em murganhos. Quando os murganhos obesos, que normalmente não produzem descendência sem transplantar os ovários para fêmeas receptoras, foram injectados com leptina, o seu peso corporal decresceu dramaticamente e estes foram capazes de dar à luz as suas próprias ninhadas (Chehab et al, 1996) .

Foi verificada uma variedade de tipos de células produzindo vesículas contendo lipidos, sob condições de cultura especificas. Por exemplo, as células 3T3-L1 de murganho, derivadas a partir de NIH 3T3, uma linha de células de murganho imortalizada, podem ser crescidas e cultivadas como uma célula fibroblástica. Contudo, após exposição a dexametasona e metil-isobutilxantina, as células sofrem diferenciação que resulta na produção de vacúolos contendo lipidos intracelulares (Spiegel-man e Green, 1981) . As células estromáticas da medula de rato foram verificadas sofrerem diferenciação osteogénica e 3 adipogénica quando cultivadas com soro fetal de vitela e dexametasona, mas o tipo de células predominante varia dependendo das condições (Beresford et al., 1992). De um modo especifico, quando o análogo do esteróide, dexametasona, esteve presente ao longo do tempo da cultura, a osteogénese foi favorecida; mas quando a dexametasona esteve presente apenas durante a cultura secundária, a via adipogénica predominou, como evidenciado pelos marcadores específicos da linhagem e observação citológica. As células CH3 10T1/2, derivadas de murganho, são uma linha multipotencial que, quando tratada com 5-azacitidina, sofre diferenciação terminal nos adipócitos, miócitos e condrócitos. A 5-azacitidina causa inibição da metilação do ADN e causa, assim, a activação de uns poucos genes responsáveis pela associação a estas linhagens (Konieczny e Emerson, 1984).

De acordo com a presente invenção, é proporcionada uma composição conforme a reivindicação 1 e método conforme a reivindicação 4 induzindo células estaminais mesenquimatosas humanas a diferenciarem-se, de um modo preferido, na linhagem adipogénica, i. e., a diferenciarem-se em adipócitos. 0 requerente verificou que as células estaminais mesenquimatosas e, em particular, as células estaminais mesenquimatosas humanas (hMSC) podem ser direccionadas para se diferenciarem em adipócitos, tratando as células estaminais mesenquimatosas humanas com (i) um glucocorticóide e (ii) um composto que eleva os níveis de AMPc intracelulares por regulação superior da produção de AMPc ou por inibição da degradação de AMPc; em particular um composto que inibe composto(s) que degrada(m) o AMPc. 4

De acordo com a invenção, as células estaminais mesenquimatosas humanas são tratadas com uma dexametasona e metil-isobutiloxantina que inibe a actividade de um composto que degrada AMPc; em particular, um inibidor da fosfodiesterase. As células são, subsequentemente, cultivadas em meio contendo insulina e soro bovino fetal.

As células estaminais mesenquimatosas humanas, bem como o seu isolamento e expansão, foram descritas na Patente U.S. N°. 5486359. Como conhecido na técnica, as células estaminais mesenquimatosas humanas são capazes de produzir dois ou mais tipos diferentes (linhagens) de células mesenquimatosas ou tecidos e, em particular, conjuntivos. A presente invenção proporciona um método para gerar adipócitos a partir de células estaminais mesenquimatosas humanas (hMSCs) primárias, de um modo previsível e reprodutível. A invenção é única, uma vez que envolve células humanas em culturas primárias e após passagem em vez de linhas celulares transformadas ou imortalizadas que são predeterminadas para entrar na via adipogénica. As hMSCs são capazes de entrar em múltiplas linhagens incluindo as linhagens osteociticas, condrocíticas, miocíticas, tendonociticas e estromogénicas, proporcionando, a presente invenção, um método e composição para induzir as hMSCs a diferenciarem-se em adipócitos. Num aspecto preferido, de acordo com a presente invenção, as hMSCs são induzidas a diferenciarem-se essencialmente e apenas em adipócitos, i. e., não existe produção essencial ou associação a células de outras linhagens mesenquimatosas. 0 método pode também ser utilizado para gerar adipócitos a partir de MSCs a partir de outras espécies, tais como coelho, cão, rato e murganho. 5 A invenção também proporciona métodos para purificar os adipócitos para se obter uma população altamente purificada. 0 método da invenção para a diferenciação in vitro de células estaminais mesenquimatosas humanas derivadas, de um modo preferido, a partir de medula espinal, em células adipoblásticas ou adipociticas é útil para os investigadores que desejam estudar este programa de desenvolvimento em células humanas in vitro. Um melhor entendimento de doenças do metabolismo energético incluindo obesidade e diabetes relacionada com a obesidade resultará, também, a partir de estudos de diferenciação de células estaminais mesenquimatosas a adipócitos. Enquanto uma base celular e bioquímica para a obesidade à muito que foi conjecturada, os avanços têm sido lentos devido à falta de sistemas modelo com ferramentas bioquímicas e moleculares para estudar. Os enormes progressos recentes na base molecular da adipogénese abriram novos caminhos através do entendimento desta via de diferenciação de células mesenquimatosas, porém, tem estado em falta um sistema modelo de humano tal como aquele aqui descrito. 0 método também possui utilidade no isolamento e preparação de adipócitos para implantação num doente, para o propósito do aumento de tecido a seguir a trauma ou cirurgia cosmética.

Breve Descrição das Figuras

As Figuras 1A-1B demonstram que quando as MSCs humanas são tratadas de acordo com a invenção, estas sofrem diferenciação para a linhagem adipogénica. A Figura IA demonstra hMSCs (4X) cultivadas em meio normal de hMSC para o mesmo período de tempo da Figura 1B. Não existem provas 6 de vacúolos contendo lípidos, mantendo as células o aspecto de fibroblastos a elevada densidade. Na Figura 1B são as hMSCs que foram permitidas tornarem-se confluentes e, depois, mantidas em meio normal durante 10 dias após adicionar o meio de Indução Adipogénica (contendo metil-isobutilxantina e dexametasona) durante 48 h, e, depois, mudadas para o meio de manutenção de adipócitos, contendo insulina durante 2 semanas adicionais. Os vacúolos com lipidos são pela primeira vez evidentes a cerca de 5-7 dias mas aumentam em tamanho e abundância ao longo do tempo. A Figura 2A demonstra um controlo semelhante da cultura tal como a Figura IA a uma ampliação superior (20X) . A Figura 2B demonstra uma cultura de hMSCs confluentes que foram sujeitas a meio de Indução Adipogénica durante 48 horas e, depois, mantidas em meio de Manutenção Adipogénica durante 14 dias. Os vários vacúolos contendo lipidos dos adipócitos são evidentes numa larga proporção das células. A Figura 3 apresenta os resultados de cultura de hMSCs sob uma variedade de condições, apenas uma das quais demonstra um elevado grau de diferenciação adipogénica. Todas as fotos são a uma ampliação de 10X. A Figura 3A apresenta uma cultura de hMSCs mantida em meio de cultura normal de hMSC isolado. As células crescem com uma morfologia fibroblástica. A Figura 3B apresenta uma cultura similar que foi tratada com meio de Indução Adipogénica durante 48 horas e, depois, com meio de Manutenção Adipogénica durante uns 14 dias adicionais, com mudanças de meio a cada 3 dias. As células adipogénicas, talvez tantas quanto 30-35% das células, são evidentes uma vez que estas contêm os vacúolos com lipidos retrácteis grandes. A Figura 3C apresenta uma 7 cultura de hMSCs que foi mantida no meio de Manutenção Adipogénica durante 14 dias mas nunca foi sujeito a tratamento com dexametasona/metil-isobutilxantina. As células mantêm um aspecto morfológico plano, sem vacúolos evidentes. A Figura 3D apresenta uma cultura de hMSCs que foi tratada com meio normal de hMSC contendo 1 μΜ de dexametasona durante 48 horas e, depois, cultivada durante 14 dias em meio de Manutenção Adipogénica. As células estão desorganizadas mas apresentam muito poucos, se alguns, vacúolos com lípidos. A Figura 3E apresenta uma cultura de hMSCs que foi tratada com meio de hMSC normal contendo metil-isobutilxantina a 0,5 m. durante 48 horas e, depois, foi mantida em meio de Manutenção Adipogénica durante 14 dias. As células retêm um fénotipo fibroblástico plano. A Figura 3F apresenta uma cultura de hMSCs que foi tratada com um meio que induz as células a diferenciarem-se ao longo de uma via osteogénica. Este meio contém dexametasona a 0,1 μΜ, fosfato de β-glicerol a 10 nM e ácido ascórbico 2-fosfato a 50 μΜ. A presença de material osteóide retráctil é evidente mas não grandes vacúolos com lipidos. A Figura 4A apresenta uma cultura de hMSCs sujeita a meio de Indução Adipogénica durante 48 horas e, depois, cultivada durante 14 dias no meio de Manutenção Adipogénica. Os grandes vacúolos com lipidos são evidentes nesta imagem de campo claro. Os lipidos podem, também, ser revelados através da utilização de um corante solúvel em lípidos fluorescente, tal como Vermelho de Nilo, e visualizando através de iluminação epifluorescente, como apresentado na Figura 4B. Assim, as células adipogénicas podem, também, ser identificadas utilizando corantes vitais e colorações histológicas que marcam os vacúolos com lípidos. A Figura 5A apresenta hMSCs em cultura que não foram tratadas com meio de Indução Adipogénica mas que foram cultivadas, fixas e coradas ao mesmo tempo que as culturas adipogénicas apresentadas em 5B e 5C. A Figura 5B apresenta hMSCs que foram tratadas uma vez durante 48 horas, com meio de Indução Adipogénica, depois, cultivadas durante três semanas adicionais em meio de Manutenção Adipogénica e, depois, fixas em formalina tamponada neutra e coradas com Óleo Vermelho 0, um corante solúvel em lipido que se acumula nas goticulas de gordura. A Figura 5C apresenta um disco de hMSCs que foi tratado de novo, com meio de Indução Adipogénica durante um segundo e terceiro periodos de 48 horas, para induzir mais hMSCs a tornarem-se adipogénicas. Tanto como 30-40% das células foram convertidas em adipócitos através dos três tratamentos de indução, quando observadas duas semanas após o terceiro tratamento. Os painéis 5A-5C foram todos corados com Óleo Vermelho O.

Na Figura 5D o factor de transcrição CAAT/proteína melhorada de ligação (ou C/ΕΒΡα) é expresso a níveis elevados nas hMSCs adipogénicas, como demonstrado por esta transferência de western utilizando um anticorpo específico para a isoforma a' de C/EBP de 34 kd. 9

Na Figura 5E a proteína aP2 de ligação ao ácido gordo apresenta elevados níveis de expressão nas hMSCs adipogénicas, como apresentado por esta transferência de western utilizando um anticorpo específico para a forma específica de adipócito de 14 kd de P2. A Figura 6A apresenta as MSCs adipogénicas isoladas que se ligaram à superfície mais elevada. A população é composta de mais de 99% de células adipogénicas, como evidenciado pelas gotículas de lípidos em cada célula. A Figura 6B apresenta as hMSCs não adipogénicas que se instalaram na superfície inferior do frasco. Estiveram presentes na superfície inferior muito poucas células contendo gotículas de lípidos. Estas células não adipogénicas poderiam ser tratadas com tripsina/EDTA e repicadas para outro disco e serem demonstradas reter potencial adipogénico (dados não apresentados), indicando que estas permanecem como células estaminais mesenquimatosas, capazes da progressão da linhagem. A Figura 7 apresenta um exemplo de hMSCs crescidas em matriz estabilizada de gel de colagénio e, depois, induzidas para se diferenciarem em adipócitos. As células foram coradas com corante fluorescente Vermelho de Nilo que se acumula nos vacúolos com lípidos que são visualizados por iluminação ultravioleta. Apenas os depósitos de lípidos nas células são visíveis e muitos dos adipócitos estão fora do plano de focagem na matriz tridimensional. 10

Descrição Detalhada das Formas de Realização Preferidas

Como referido anteriormente, um aspecto da invenção proporciona uma composição conforme a reivindicação 1 que compreende uma população homogénea, isolada, de células estaminais mesenquimatosas humanas que possui o potencial de se diferenciar em células de mais do que um tipo de tecido mesenquimatoso, e uma substância que induz células de uma população de células estaminais mesenquimatosas a diferenciarem-se na linhagem adipogénica.

De acordo com a invenção, as células estaminais mesenquimatosas são induzidas para se diferenciarem na linhagem adipogénica pela utilização de dexametasona e metil-isobutilxantina, um composto que inibe a degradação de AMPc; em particular um inibidor da fosfodiesterase.

Os exemplos preferidos da substância que elevou os niveis de AMPc intracelulares ou são análogos de AMPc incluem dibutiril-AMPc, 8-CPT-AMPc (8-(4)-clorofeniltio)-adenosina 3', 5'monofosfato cíclico; 8-bromo-AMPc; dioctanoil-AMPc, Forscolina, etc. A substância que inibe a degradação de AMPc através da inibição da actividade de fosfodiesterase é a metil-isobutilxantina. 0 composto que aumenta os níveis de AMPc e a dexametasona são utilizados em quantidade que são eficazes para induzir hMSCs a diferenciarem-se em adipócitos. 0 composto regulador de AMPc e a dexametasona podem ser adicionados às hMSCs separadamente ou em mistura uma com a outra. 11

Em geral, a dexametasona é utilizada numa concentração de cerca de 0,1 a 10 micromolar, de um modo preferido, de cerca de 0,5 a 2 micromolar. A isobutilxantina de metilo, que inibe a degradação de AMPc, é geralmente empregue numa concentração desde cerca de 0,1 a 10 milimolar e, de um modo preferido, desde cerca de 0,2 a 2 milimolar.

Ao utilizar um composto que regula superiormente a produção de AMPc, tal composto é empregue geralmente numa concentração desde cerca de 0,1 a 100 micromolar, de um modo preferido, desde cerca de 0,5 a 10 micromolar. É para ser entendido que as quantidades anteriores são representativas e o âmbito da invenção não está deste modo limitado.

Apesar de um dos compostos que é empregue para induzir hMSCs a diferenciarem-se em adipócitos ser um dos que regula o AMPc (tanto um que é conhecido por regular superiormente a produção de AMPc ou um que evita a degradação de AMPc), o âmbito da invenção não está limitado a qualquer mecanismo particular de acção. Assim, por exemplo, apesar de um dos compostos que pode ser utilizado na presente invenção ser um inibidor da fosfodiesterase que é conhecido inibir a degradação de AMPc através da inibição da degradação do AMPc pela fosfodiesterase, a invenção não está limitada a um mecanismo de acção que está dependente após a prevenção da degradação de AMPc. Assim, por exemplo, o inibidor da fosfodiesterase pode ser eficaz para 12 induzir a diferenciação das hMSCs a adipócitos através de um mecanismo de acção que não a inibição da degradação de AMPc.

Podem ser utilizados para induzir as hMSCs a diferenciarem-se em adipócitos compostos em adição à (i) dexametasona e (ii) metil-isobutilxantina, um regulador do AMPc. Assim, de acordo com a invenção a insulina é também utilizada em conjunto com a metil-isobutilxantina e a dexametasona.

Numa forma de realização preferida, é proporcionado uma composição para induzir hMSCs a diferenciarem-se em adipócitos que é compreendida de (i) dexametasona, (ii) um composto que regula o AMPc e a metil-isobutilxantina, um composto que inibe a degradação de AMPc tal como, um inibidor da fosfodiesterase, (iii) insulina ou um factor do tipo da insulina e (iv) qlucose. A adição de compostos como aqui anteriormente descritos para induzir a diferenciação de hMSCs a adipócitos de acordo com a invenção não necessita que todas as hMSCs tratadas sejam induzidas para se diferenciarem em adipócitos. Assim, de acordo com um aspecto da presente invenção é produzida uma composição compreendida de células estaminais mesenquimatosas humanas e adipócitos em que quando baseada nos dois componentes os adipócitos estão presentes numa quantidade de pelo menos 5% em peso e, de um modo preferido, pelo menos 15% em peso. A quantidade de adipócitos pode ser até 50% em peso ou superior, baseada nos dois componentes.

De acordo com uma forma de realização preferida, a composição que é gerada é essencialmente livre de células associadas da linhagem mesenquimatosa que não adipócitos. Numa forma de realização particular, existem menos do que um porcento 13 de células associadas da linhagem mesenquimatosa que não adipócitos, e de um modo mais preferido, menos do que 0,1% e, de um modo muito preferido, nenhumas células associadas à linhagem mesenquimatosa que não adipócitos.

Apesar do tratamento com hMSCs de acordo com a invenção produzir uma mistura de adipócitos e hMSCs não diferenciadas, os adipócitos produzidos podem ser recuperados a partir da mistura para produzir uma população de adipócitos isolada. Os processos representativos para recuperação de adipócitos são descritos nos exemplos que formam uma parte desta aplicação.

De acordo com um aspecto da presente invenção, as hMSCs podem ser tratadas para induzir diferenciação em adipócitos de um modo tal que tal diferenciação é efectuada in vitro ou in vi vo.

Assim, por exemplo, as hMSCs podem ser misturadas com compostos, como aqui descrito anteriormente, que induzem diferenciação nas hMSCs sendo a mistura resultante utilizada in vivo para induzir diferenciação para adipócitos in vivo. Assim, por exemplo, a mistura sem cultura in vitro durante um período de tempo para induzir diferenciação in vitro pode ser empregue numa matriz apropriada (por exemplo do tipo aqui descrito) para induzir diferenciação das hMSCs a adipócitos in vivo.

Assim, de acordo com um aspecto da presente invenção é proporcionada uma composição compreendida de células estaminais mesenquimatosas humanas, dexametasona, metil-isobutilxantina e insulina. Uma composição pode ser utilizada para produzir adipócitos in vitro ou pode ser utilizada para induzir diferenciação de hMSCs in vivo. 14 A capacidade para gerar largas percentagens de células adipogénicas a partir de uma população de hMSCs permitirá números de células superiores para implante ou pesquisa. Poucas hMSCs serão necessárias como material de partida. Repetindo o passo de indução adipogénica mais vezes, poderá ser possível induzir a maioria das hMSCs numa população de adipócitos. No caso em que existe uma mistura de células, as hMSCs adipogénicas podem facilmente ser isoladas pela sua densidade flutuante. 0 isolamento de uma população enriquecida de adipócitos a partir de hMSCs cultivadas também poderá permitir uma caracterização detalhada do fénotipo do adipócito.

Os adipócitos podem ser utilizados com uma variedade de materiais para formar uma composição para propósitos tais como cirurgia reconstrutiva. As células podem ser combinadas com uma biomatriz para formar um material bidimensional ou tridimensional, como necessário. Os cirurgiões utilizam rotineiramente material gordo e tecidos gordos de sítios remotos para construir uma área em que foi removido tecido. Isto envolve frequentemente um processo separado com os seus riscos inerentes. Como uma alternativa, as hMSCs podem ser isoladas a partir do doente e crescidas em cultura. As hMSCs poderiam então ser misturadas com um material biocompatível tal como colagénio, esponja de colagénio, alginato, material à base de ácido poliláctico, etc. para formar um compósito. 0 compósito poderia então ser tratado para induzir diferenciação adipogénica das MSCs in vitro durante 1-3 semanas, depois implantado quando necessário. Por exemplo, as MSCs adipogénicas poderiam ser misturadas com um colagénio solubilizado ou outro biomaterial que é depois permitido gelificar para formar um compósito tridimensional que poderia ser utilizado para aumento do peito a 15 seguir a mastectomia. Tal compósito poderia ser formado ou esculpido para o tamanho ou forma apropriada. Outra composição inclui a cultura de hMSCs na matriz de pele acelular que está correntemente no mercado tal como o produto da LifeCell Corporation. Neste formato as células seriam cultivadas para colonizarem a matriz e, depois, sofrerem diferenciação como descrito. A matriz com as células adipogénicas poderia então ser cortada pelo cirurgião para se adaptar ao sitio de reconstrução. Como uma alternativa as hMSCs podiam ser induzidas para se tornarem adipócitos previamente à sua introdução nos materiais biocompativeis. Como outra alternativa, as hMSCs em combinação com compostos que promovem a diferenciação em adipócitos podem ser utilizados como uma biomatriz como descrito sem proceder à cultura, durante um periodo de tempo para induzir diferenciação na qual a diferenciação é induzida na totalidade ou em parte in vi vo.

Similarmente à sua utilização em cirurgia reconstrutiva, as hMSCs adipogénicas serão utilizadas essencialmente do mesmo modo em cirurgia cosmética electiva; para construir tecido subjacente debaixo da pele com um compósito de células autólogas e matéria biocompativel. A invenção será futuramente descrita no que diz respeito aos seguintes exemplos; contudo, o âmbito da invenção não é para ser deste modo limitado. A não ser que descrito em contrário, as percentagens e partes são em peso. 16

Marcadores Bioquímicos de Adipócitos

Foi descrito na literatura uma quantidade de moléculas que são marcadores específicos de adipócitos que serão úteis para caracterizar os adipócitos derivados a partir de hMSCs. Estes incluem enzimas envolvidas na interconversão de ácidos gordos a triglicéridos tais como esteraoil-CoA-desaturase (SCDI) ou o transportador da glucose reactivo à insulina (GLUT4). 0 produto do gene ob, a leptina, é um polipéptido de 16000 de peso molecular que é apenas expresso em células pré-adiposas ou tecido adiposo. A expressão da proteína ligada ao intensificador CCAAT, C/EBP, foi verificada preceder à expressão de vários marcadores de diferenciação adipogénica e é julgado desempenhar um papel chave no desenvolvimento de adipócitos. Outro marcador é o 422 adiposo P2 (422/aP2), uma proteína cuja expressão é aumentada durante a diferenciação em adipócitos (Cheneval, et al, 1991). Esta via de diferenciação é julgada também envolver proliferação de peroxissoma activada pelo receptor γ2 (PPAR J2) , que é envolvido na iniciação da transcrição de genes de adipócito (Tontonoz, et al, 1994). Estudos utilizando estes marcadores e os métodos descritos permitirão uma análise mais detalhada da progressão da linhagem da célula estaminal mesequimatosa para diferenciação de adipócito.

Corantes solúveis em lípidos como marcadores de diferenciação de adipócitos

Os corantes solúveis em lípidos estão disponíveis para corar vacúolos com lípidos em adipócitos. Estes incluem Vermelho de Nilo, Azul de Nilo, Negro de Sudão, e Óleo Vermelho O, entre 17 outros. Cada destes corantes hidrofóbicos possui uma propensão para acumular nos vacúolos contendo lípidos dos adipócitos em desenvolvimento e pode identificar prontamente as células adipogénicas em populações de MSCS diferenciadas. Pelo menos um destes corantes pode ser utilizado para isolar adipócitos a partir de células não diferenciadas utilizando um separador de células activado por fluorescência (FACS). Um exemplo da utilização de Vermelho de Nilo para identificar hMSCs adipogénicas é apresentado na Figura 4.

Exemplo 1

Criação de Adipócitos a partir de MSCs humanas

As MSCs humanas são isoladas a partir da medula óssea vermelha de dadores voluntários como descrito no documento U.S. 5486359.

As células são crescidas até as colónias estarem bem definidas e nesse ponto as células são sujeitas a uma sub-cultura (1 a 3) ou estas podem ser ensaiadas in vitro quanto à adipogénese. Para o ensaio de adipogénese, as hMSCs são sub-cultivadas em discos de cultura de tecidos de 35 mm a 10000 células por disco e alimentadas com 2 mililitros de Meio de hMSC normal (Meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM), Soro Bovino Fetal seleccionado a 10% (FBS), e mistura antibiótico/antimicótico (IX) (Life Technologies, Inc.)) e as células são mantidas a 37 °C, CO2 a 5% e humidade a 90%. As células são re-alimentadas com o meio fresco a cada terceiro dia e são permitidas multiplicar-se e tornarem-se confluentes. As células são mantidas após alcançarem confluência re-alimentando 18 cada terceiro dia e este periodo de tempo de pós-confluência de cultivação aumenta a resposta adipogénica no passo seguinte (pelo menos de 14 dias). A diferenciação em adipócitos é iniciada mudando o meio para 2 mL de Meio de Indução Adipogénica (DMEM com soro fetal bovino a 10% contendo insulina a 10 yg/mL (recombinante humana, Boehringer Mannheim Corp.), de metil-isobutilxantina a 0,5 mM (MIX) (Sigma Chemical Co.), 1 μΜ dexametasona (Dex)(Sigma Chemical Co.))· Este meio é deixado nas células durante 48 horas com as células mantidas a 37 °C, CO2 a 5% e humidade a 90% e é então substituído com Meio de Manutenção Adipogénica (DMEM contento FBS a 10% e insulina a 10 yg/mL) . O meio é mudado a cada 3-4 dias. As hMSCs começam a exibir pequenos vacúolos com lípidos em 3-7 dias e estes alargam e tornam-se mais numerosos ao longo do tempo, até pelo menos 30 dias. Existem diversas variações que foram experimentadas com sucesso.

Quando as MSCs humanas são tratadas como descrito anteriormente, estas sofrem diferenciação para a linhagem adipogénica, como apresentado na Figura 1. A Figura IA mostra hMSCs (4X) cultivadas em meio hMSC normal para o mesmo período de tempo como a Figura 1B. Não existe evidência de vacúolos contendo lípidos e as células mantêm o aspecto de fibroblastos a elevada densidade. Na Figura 1B são as hMSCs que foram permitidas tornarem-se confluentes e, depois, mantidas durante 10 dias antes de adicionar o Meio de Indução Adipogénica durante 48 horas, e, depois, mudado para o Meio de Manutenção

Adipogénica durante umas 2 semanas adicionais. Os vacúolos com lípidos aparecem em primeiro lugar a cerca de 3-7 dias mas aumentam em tamanho e abundância ao longo do tempo. A Figura 2A apresenta uma cultura de controlo similar como a Figura IA a uma ampliação superior (20X). A Figura 2B apresenta uma cultura de 19 hMSCs confluentes que foi sujeita a Meio de Indução Adipogénica durante 48 horas e, depois, mantida em Meio de Manutenção Adipogénica durante 14 dias. Os vários vacúolos contendo lipidos dos adipócitos são evidentes numa vasta proporção de células.

A Figura 3 apresenta os resultados da cultura de hMSCs sob uma variedade de condições, apenas uma das quais apresenta um elevado grau de diferenciação adipogénica. Todas as fotos estão a uma ampliação de 10X. A Figura 3A apresenta uma cultura de hMSCs mantida em meio de cultura hMSC normal sem aditivos. As células crescem com uma morfologia fibroblástica. A Figura 3B apresenta uma cultura similar que foi tratada com Meio de Indução Adipogénica durante 48 horas e, depois, com Meio de Manutenção Adipogénica durante uns 14 dias adicionais com mudanças de meio cada 3 dias. As células adipogénicas, possivelmente tantas como 30 -35% das células, são evidentes uma vez que estas contêm os vacúolos com lipidos retractivos. A Figura 3C apresenta uma cultura de hMSCs que foi mantida no Meio de Manutenção Adipogénica durante 14 dias mas nunca foi sujeito ao tratamento com a dexametasona/metil-isobutilxantina. As células mantêm um aspecto morfológico plano sem vacúolos evidentes. A Figura 3D apresenta uma cultura de MSCs que foi tratada com meio de hMSC normal contendo de dexametasona a 1 μΜ durante 48 horas e, depois, cultivada durante 14 dias no Meio de Manutenção Adipogénica. As células estão desorganizadas mas apresentam muito poucos, se alguns, vacúolos com lipidos. A Figura 3E apresenta uma cultura de hMSCs que foi tratada com hMSC normal contendo 0,5 mL de metil-isobutilxantina durante o período de indução e, depois, foi mantida durante 14 dias no Meio de Manutenção Adipogénica. As células retêm um fénotipo fibroblástico plano. A Figura 3F apresenta uma cultura de hMSCs que foi tratada com um meio que induz as células ao longo de uma 20 via osteogénica. Este meio contém dexametasona a 0,1 μΜ, fosfato de β-glicerol a 10 mM e ácido ascórbico 2-fosfato a 50 μΜ. A presença de material osteóide retractivo é evidente mas não vacúolos com lipidos grandes.

As células adipogénicas podem também ser identificadas utilizando corantes vitais e colorações histológicas que marcam os vacúolos com lipidos. A Figura 4A apresenta uma cultura de hMSCs sujeita ao tratamento adipogénico e cultivada durante 14 dias em Meio de Manutenção Adipogénica. Os grandes vacúolos com lipidos são evidentes nesta imagem de campo branco. Mas os lipidos podem ser, também, revelados utilizando um corante solúvel de lipido fluorescente, tal como Vermelho de Nilo (Greenspan, et al. 1985) e visualizados por iluminação por epifluorescência, como apresentado na Figura 4B.

Os resultados aqui apresentados foram reproduzidos várias vezes com hMSCs derivadas a partir de diferentes dadores e é aqui descrita informação adicional no método. Foram obtidos resultados semelhantes com hMSCs a partir de todos os indivíduos testados (4 ou mais dadores) . A percentagem de células que se tornam adipócitos contendo lipidos varia dependendo das especificações da cultura. Especificamente, aquelas células que se permitiu tornarem-se completamente confluentes e mantidas, deste modo, durante até 2 semanas anteriormente à indução de adipócitos, apresentaram uma percentagem muito mais elevada de adipócitos ao longo do tempo, do que as culturas que foram induzidas anteriormente à confluência ou na confluência. Tantas como 30-35% das hMSCs possuem aspecto adipogénico, 2 semanas após indução, quando tratadas como aqui descrito, como apresentado na Figura 1B. As hMSCs podem ser cultivadas em vários tamanhos de cultura com igual sucesso, deste modo a 21 obtenção de grandes quantidades de células não deve apresentar quaisquer problemas.

Exemplo 2

Melhoramento da Diferenciação Adipoqénica

Estas experiências foram realizadas para determinar se uma população de células estaminais mesenquimatosas humanas crescendo em cultura pode ser tratada para induzir diferenciação adipogénica (que induz uma percentagem de 5-10% das células para se tornarem adipócitos) e, depois, tratadas de novo posteriormente para induzir mais das hMSCs a diferenciarem-se. As experiências foram também realizadas para examinar quer se é possivel purificar uma população de células adipogénicas induzidas a partir da cultura misturada de hMSCs e MSCs adipogénicas que resultam a partir do tratamento com agentes adipogénicos. Ambos os conjuntos de experiências foram bem sucedidos como a seguir descrito e nas figuras anexas.

As hMSCs foram induzidas para o fénotipo adipogénico através da cultura em Meio de Indução Adipogénica durante 48 horas como descrito. O meio foi então mudado para o Meio de Manutenção Adipogénica e as células foram cultivadas a 37 °C numa atmosfera de CO2 a 5% durante 3 a 6 dias até existirem goticulas de lipidos perceptiveis dentro das células. Aproximadamente 5-10% das células tornam-se adipogénicas como verificado na Figura 5. A Figura 5A apresenta uma cultura de hMSCs que não foi tratada quer com meio adipogénico mas que foi cultivada, fixa e corada ao mesmo tempo que as culturas adipogénicas apresentadas em 5B e 5C. A Figura 5B foi tratada 22 uma vez com Meio de Indução Adipogénica, depois, cultivada em Meio de Manutenção Adipogénica durante três semanas adicionais e, depois, fixa em formalina tamponada neutral e corada com Óleo Vermelho 0, um corante solúvel em lipido que se acumula nas goticulas de gordura. Um disco de hMSCs foi também tratado de novo com Meio de Indução Adipogénica fresco durante um segundo e terceiro periodo de 48 horas para induzir mais hMSCs para se tornarem adipogénicas como apresentado na Figura 5C. Tanto como 30-40% das células foram convertidas para adipócitos pelos três tratamentos de indução quando observadas duas semanas após o terceiro tratamento. Os painéis 5A-5C foram todos corados com Óleo Vermelho O.

Expressão de proteínas adipogénicas na diferenciação de hMSCs

As hMSCs expressam proteínas específicas de adipócitos a seguir á diferenciação. Nas Figuras 5D e 5E, 10 g do lisado de proteína total foi sujeito a resolução por SDS-PAGE, transferido para nitrocelulose e marcadas com anticorpos para C/ΕΡΒα ou aP2. Na Figura 5D, o factor de transcrição CAAT/intensificador da proteína de ligação (ou C/ΕΡΒα) é expresso a elevados níveis nas hMSCs adipogénicas como apresentado por esta transferência de western utilizando um anticorpo específico para a isoforma cc de 34 kd de C/EBP. Na Figura 5E, a proteína de ligação ao ácido gordo, aP2, apresenta elevados níveis de expressão nas hMSCs adipogénicas como demonstrado por esta transferência de western utilizando um anticorpo específico para o forma especifica de adipócito de 14 kd de P2. 23

Expressão de genes adipogénicos na diferenciação de hMSCs A expressão dos factores de transcrição que são conhecidos estarem envolvidos na diferenciação adipogénica também indica que as hMSCs se tornaram adipócitos. Uma classe de compostos conhecidos como proliferadores de peroxissomas, que inclui alguns agentes hipolipidémicos utilizados clinicamente, pode activar receptores nucleares associados com diferenciação adipogénica. 0 receptor γ2 (ou PPARy2) activado pelo proliferador do peroxissoma, em particular, foi demonstrado estar associado com adipogénese. A análise de transferência de ARN (transferência de Northern) foi utilizada para identificar a expressão elevada de PPARy2 ARN em hMSCs sofrendo diferenciação adipogénica. Foi isolado o ARN total a partir das hMSCs de controlo e hMSCs adipogénicas, sujeito a resolução através de electroforese em gel desnaturante e transferido para nitrocelulose e marcadas para expressão de PPARy2 em culturas de hMSCs (pista 1, 10 yg) ou hMSCs adipogénicas (pista 2, 10 yg; pista 3, 20 yg) . Como apresentado na Figura 5F, é detectado o ARN de PPARy2 a 1,7 kb como indicado pela seta e a sua expressão é elevada a cerca de 5 vezes em ARN a partir de hMSCs adipogénicas. A expressão elevada de ARN para a lipase de lipoproteinas, um enzima responsável pela hidrólise do núcleo dos triglicéridos para monoacilglicerol e ácidos gordos livres, indica diferenciação adipogénica de hMSCs, como apresentado na Figura 5G. Tal como em 5F, 10 yg de ARN total a partir de hMSCs de controlo (pista 1) ou hMSCs adipogénicas (pista 2) ou 20 yg de ARN a partir hMSCs foi sujeito a resolução em electroforese em 24 gel desnaturante, transferido para nitrocelulose e marcado para a expressão de ARN de LPL. O ARNm para LPL é encontrado como duas bandas de 3,3 e 3,7 kb pistas 2 e 3 (as bandas em 3 estão ligeiramente modificadas devido à elevada quantidade).

Exemplo 3

Isolamento de Adipócitos a partir de hMSCs A criação de adipócitos a partir de células estaminais mesenquimatosas humanas através das condições anteriormente descritas produz grandes quantidades de adipócitos, talvez tanto quanto 30%-40% das células presentes. Para utilizações requerendo uma população pura, os adipócitos podem ser isolados a partir de hMSCs não adipogénicas por vários métodos como a seguir listado. 0 método um para isolamento de hMSCs adipogénicas utiliza centrifugação por gradiente de densidade e tira vantagem da superior flutuação das células adipogénicas contendo lipidos. Neste método, as culturas contendo hMSCs e adipócitos derivados de hMSCs são tratadas com tripsina a 0,05% /EDTA a 0,53 mM para remover as células a partir do disco de cultura sendo as células lavadas por adição de 10 mL de meio de hMSCs normal e centrifugadas durante 10 minutos a 1000 rpm numa centrífuga GS-6R (Beckman Instruments, Inc.) a 20 °C. O sedimento de células contém adipócitos e hMSCs é ressuspenso em 2 mL de Meio de Manutenção Adipogénica e disposto em camadas cuidadosamente no topo de 8 mL de Percoll de uma densidade de 1,045 g/mL. Os tubos são centrifugados a 2200 rpm (1100 xg) numa centrífuga Beckman GS-6R durante 20 minutos a 3 °C. Os adipócitos são 25 recuperados nos 2 mL mais elevados e na interface com a densidade Percoll de 1,045. (As MSCs não adipogénicas entram na densidade Percoll de 1,045 e podem ser recuperadas no fundo do tubo.) Os adipócitos recuperados foram lavados pela adição de 10 mL de Meio de Manutenção Adipogénica e centrifugados a 1000 rpm durante 10 min a 20 °C na centrífuga GS-6R. Os adipócitos são novamente semeadas a uma densidade de 150000 células por 35 mm de disco em Meio de Manutenção Adipogénica e devolvidas à incubadora. O método dois para isolar hMSCs adipogénicas utiliza selecção de células activada por fluorescência (FACS). As hMSCs diferenciam-se em adipócitos numa cultura podem ser isolados utilizando um corante fluorescente solúvel em lípidos, tal como Vermelho de Nilo (10-100 pg/mL) para corar adipócitos contendo vacúolos com lípidos. A cultura é então tratada com tripsina/EDTA como anteriormente para libertar as células a partir do recipiente de cultura e sujeitando a população misturada a separação celular activada por fluorescência (FACS). Os parâmetros na máquina são ajustados para seleccionar e recuperar células adipogénicas na população e estas pode ser utilizadas directamente ou novamente semeadas e cultivadas na incubadora.

Como descrito anteriormente, o Método três de isolamento das células adipogénicas numa população misturada é tratar com tripsina/EDTA e lavar as células como anteriormente. As células são então colocadas num frasco de cultura de tecidos e o frasco preenchido com meio. O frasco é fechado bem apertado e invertido de modo a que a superfície tratada para a adesão de células esteja mais elevada. Os adipócitos flutuantes, contendo gotículas de lípidos sobem ao topo e ligam-se à superfície do 26 frasco. No dia seguinte o meio é removido e o frasco lavado com meio fresco sendo o frasco colocado direito. O frasco, agora apenas com meio suficiente para cobrir a camada de células, é devolvido à incubadora para manutenção posterior.

As hMSCs adipogénicas acumulam goticulas de lipidos que faz decrescer a densidade de flutuação das células. As hMSCs adipogénicas foram então isoladas como se segue. 0 disco de células contendo adipócitos e hMSCs não adipogénicas de uma cultura que foi tratada durante apenas 48 h de periodo de indução e, depois, crescida durante três semanas, foi tratada com tripsina a 0,05% e EDTA a 5 mM durante 3-5 minutos para libertar as células do disco. As células foram então enxaguadas do disco com 10 mL de meio fresco e colocadas num frasco de 25 cm2 sendo o frasco enchido até ao cimo com meio fresco. O frasco foi invertido de modo a que a superfície de cultura habitual estivesse na parte superior sendo o frasco colocado numa incubadora a 37 °C de um dia para o outro. As células adipogénicas que flutuam mais sobem até ao topo e ligam-se à superfície, enquanto as hMSCs não adipogénicas depositam-se na superfície inferior e ligam-se. As seguintes fotos diárias foram tiradas às células em cada superfície como apresentado na Figura 6. A Figura 6A apresenta as hMSCs adipogénicas que se ligam à superfície superior. A população é composta de mais que 99% de células adipogénicas como evidenciado pelas goticulas de lipidos em cada célula. A Figura 6B apresenta as hMSCs não adipogénicas que se depositaram na superfície inferior do frasco. Muito poucas células contendo goticulas de lipidos estavam presentes na superfície inferior. Estas células não adipogénicas poderiam ser tratadas com tripsina/EDTA e novamente semeadas para um outro disco e serem demonstradas reterem potencial adipogénico (dados não apresentados), indicando que estas permanecem como 27 células estaminais mesenquimatosas, capazes da progressão da linhagem.

Exemplo 4 MSCs Adipogénicas em Cirurgia Reconstrutiva

Os adipócitos podem ser utilizados com uma variedade de materiais para formar uma composição para propósitos específicos, tal como cirurgia reconstrutiva. As MSCs podem ser combinadas com uma biomatriz para formar material bidimensional ou tridimensional, como necessário. Os cirurgiões utilizam rotineiramente materiais gordos e tecidos gordos de sitios remotos para construir uma área em que o tecido foi removido. Isto envolve frequentemente um procedimento separado com os seus riscos inerentes. Como uma alternativa, as hMSCs são isoladas a partir do doente e crescidas em cultura. As hMSCs são então misturadas com material biocompatível tal como colagénio, esponja de colagénio, alginato, material à base de ácido poliláctico, etc. para formar um compósito. 0 compósito é então tratado para induzir diferenciação adipogénica das MSCs in vitro durante 1-3 semanas, sendo implantado depois quando necessário. Por exemplo, as MSCs adipogénicas estão misturadas com colagénio solubilizado ou outro biomaterial que é então permitido gelificar para formar um compósito tridimensional que é útil para o aumento do peito a seguir a mastectomia. Tal compósito é formado ou esculpido para o tamanho e forma apropriados. A Figura 7 apresenta um exemplo de hMSCs crescidas numa matriz de gel de colagénio estabilizado e, depois, induzidas para se diferenciarem em adipócitos. As células foram coradas com corante fluorescente Vermelho de Nilo que se acumula nos 28 vacúolos com lípidos que são visualizados por iluminação ultravioleta. Apenas os depósitos de lípidos nas células estão vísiveis e muitos dos adipócitos estão fora do plano de focagem na matriz tridimensional.

Outra composição inclui a cultura de hMSCs em matrizes de pele acelulares que estão correntemente no mercado. Neste formato as células são cultivadas para colonizar a matriz e, depois, sujeitas a diferenciação como descrito. A matriz com as células adipogénicas é então cortada pelo cirurgião para se adaptar ao sítio da reconstrução. Como uma alternativa as hMSCs podem ser induzidas para se tornarem adipócitos após a sua introdução em materiais biocompatíveis. De um modo similar à sua utilização em cirurgia reconstrutiva, essencialmente do mesmo modo as hMSCs adipogénicas possuem utilidade na cirurgia cosmética electiva; para construir o tecido subjacente abaixo da pele com um compósito de células autólogas e material biocompatível.

Exemplo 5

Utilização De hMSCs Adipogénicas Como Uma Fonte De Leptina Como Um Implante Para Infertilidade 0 papel da leptina na obesidade também coloca questões acerca do seu papel nas mulheres que possuem baixo conteúdo de gordura corporal e um ciclo menstrual irregular, e que frequentemente não conseguem engravidar. Pesquisas recentes sugerem que a leptina poderia servir como um regulador metabólico para sinalizar quando o corpo possui reservas de gordura suficientes para suportar a concepção e desenvolvimento 29 do feto (Chebab et al. 1996) até ao ponto que as MSCs são uma boa fonte de leptina, podendo estas ser utilizadas como um implante para a libertação de leptina no corpo dessas mulheres. Tal implante pode tomar a forma de hMSCs adipogénicas encapsuladas ou uma matriz contendo hMSCs adipogénicas que pode ser implantada onde os produtos de secreção terão acesso ao sistema circulatório.

Literatura Citada

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Lisboa, 10 de Janeiro de 2007 34

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Composição que compreende células estaminais mesenquimatosas que foram isoladas a partir de um humano e que possuem potencial para se diferenciarem em células de mais de um tipo de tecido conjuntivo e uma substância numa quantidade eficaz para induzir as referidas células estaminais a diferenciarem-se dentro da linhagem adipogénica, em que a substância que induz as células a partir da população de células estaminais mesenquimatosas para se diferenciarem dentro da linhagem adipogénica compreende dexametasona, metil-isobutilxantina e insulina.
2. Composição de acordo com a reivindicação 1 para produção de adipócitos, compreendendo ainda células estaminais mesenquimatosas humanas isoladas numa matriz biocompativel que suporta a diferenciação e maturação de células estaminais mesenquimatosas humanas em adipócitos.
3. Composição da reivindicação 2, em que a matriz é compreendida de colagénio.
4. Processo para indução de células estaminais mesenquimatosas humanas para se diferenciarem em adipócitos, compreendendo: colocar em contacto células estaminais mesenquimatosas humanas com uma substância compreendendo dexametasona, metil-isobutilxantina e insulina. 1
5. Processo da reivindicação 4 que compreende ainda o isolamento de adipócitos a partir das hMSCs restantes. dexametasona e a com a outra.
6. Processo da reivindicação 4 em que a metil-isobutilxantina estão misturadas uma Lisboa, 10 de Janeiro de 2007 2