PT95297A - Processo para a preparacao de imidazo{4,5-c}piridinas substituidas com fenilalcanoilo - Google Patents

Description

V CAMPO......DO.......iLNVENIC)

Este invento encontra-se no carnpo da terapia de mamxfe— ros e relaciona-se com compostos para o tratamento de doenças ern rnamiferos como inflamação, perturbações cardiovasculares, asma © outras doenças.. De interesse particular, é a classe de Irnidazo-|„4, 5-~c JPiridinas Substtuidas com Fenilalcanoilo úteis para o tratamento de perturbaçSes cardiovasculares e de perturbações relaccionadas com o sistema irnuno-inflarnatório provocadas pelo factor de activação de plaquetas (PAF).

ANIECEDEMIES DO INVENTO 0 'factor de activação de plaquetas (PAF) tem sido associado com várias actividades e vias biológicas, tornando-o assim num mediador importante, responsável por uma variedade de processos fisiológicos que incluem, rnas não estão limitados a eles, activação e agregação de plaquetas, contracção dos músculos lisos, patogénese de deposiç:ão imun o--complexa, inflamação, e alterações respiratórias, cardiovasculares e intravasculares» Estes processos fisiológicos estão associados com urn grande número de doenças como, por exemplo, perturbações cardiovasculares, asrna, edema no pulmão, choque de endotoxina, sxndrorna da dificuldade de respiração no adulto e doenças inflamatórias.. A Patente dos Estados Unidos 4 804 658 descreve uma classe de derivados de imidazopiridina, úteis no tratamento de doenças ou perturbaç:ões provocadas pelo factor de activação de plaquetas.. 0 presente invento é distinto desta descoberta, porque no presente invento um fenilalcanoilo está ligado ao azoto (posição 5) que forma o anel de seis membros no sistema de anel de imidazopiridina, ern oposição â referida descoberta em que a

A porção benzamida cinco membros no

de sistema de anel de irçidazopiridina.

SUMARIO DO INVENTO

de U presente invento relaciona-se com uma nova compostos representadas pela fârrnula (I):

OC—(CHaW CH \ R2 e de seus isorneros; ou de um seu sal de adição de ácido farmaceuticarnent© aceitável, em que R1 e R,

são cada um independentemente seleccionado© a partir de hidrogénio; alquilo de cadeia linear ou ramificada de 1 a 15 átomos de carbono; cicloalquiio de; 3 a 8 átomos de carbono; cicloalquiio substituído que; pode estar substituído por urn ou rnais do que um alquilo de 1 a 6 átomos de carbono; fenilo; fenilo substituído que pode estar substituído por um ou rnais do que um alquilo de 1 a 6 átomos de carbono ou halogéneo; alcenilo linear ou ramificado com 3 a Hv5 átomos de carbono; γ é fenilo ou fenilo substituído por urn ou rnais do que um alquilo de 1 a 6 átomos de carbono; alcoxi em que o alquilo tern 1 a 8 átomos de carbono; e halogéneo seleccionado a partir do grupo que consiste ern bromo, fl .uoro ou cloro; rn n é um inteiro de 0 a 15:; é um inteiro de 1 a 5; ê urn grupo substituinte numa ou rnais das posições 4, 6 ou ? do anel piridina, sendo o referidos grupos xnde— pendenternente seleccionados a partir de hidrogénio:; alquxio de 1 a 6 átomos de carbono.·; halogéneo ern que o halogéneo é seleccionado a partir de bromo, fluoro, ou cloro; ou alcoxi em que o alquilo tem 1 a 6 átomos de carbono:; é hidrogénio ou alquilo de 1 a 4 átomos de carbono. 0 invento relaciona-se ainda com composições farmacêuticas que compreendem um composto de fórmula (I). Estes compostos e composiçSes têm actividades antagonistas do RAF"’ potentes e especificas e por conseguinte sáo Citeis no tratamento de várias doenças e perturbações provocadas pelo RAF, por exemplo inflamação, perturbações cardiovasculares, asma, edema no pulmão, e sindrorna da dificuldade de respiração no adulto.

Urn rnodo de realização preferido do presente invento são os compostos de f(Srmula (II): ?c\. ··

/RCH\ R2

II ou de um seu sal de adiçráo de ácidos farmaceuticament© aceitável;; ern que R.| e l:?2 são cada um independentemente seleccionado a partir de hidrogénio" alquilo de cadeia linear ou ramificada de 1 a 15 átomos de carbono;; cicloalquilo de 3 a 8 átomos de carbono; cicloalquilo substituído em que o substituinte alquilo de 1 a 8 átomos de carbono; alquenilo de cadeia linear ou ramificada tendo de 3 a 15 átomos de carbono; m é um inteiro, desde 0 a 5.. n um inteiro desde 1 a 5.. R,..j é hidrogénio ou alquilo de 1 a 6 átornos de carbono. é hidrogénio ou alquilo de 1 a 4 átomos de carbono..

Rp. é seleccionado a partir de hidrogénio; alquilo de 1 a 6 átornos de carbono; alcoxi de 1 a 8 átomos de carbono; e halogénio seleccionado a partir do grupo que consiste em bromo, fluoro ou cloro..

Corno usado aqui, o termo "alquilo de 1 a 15 átomos de carbono" refere-se a grupos hidrocarboneto de cadeia linear ou de cadeia ramificada que têm desde um a quinze átomos de carbono, ilustrativo destes grupos alquilo são rnetilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, pentilo, neopentilo, hexilo, iso-hexilo, octilo, decilo e outros semelhantes..

Como usado aqui, o termo "cioloalquilo de 3 a 8 átomos de carbono" inclui grupos cioloalquilo que têm desde três a oito carbonos. Ilustrativo destes grupos cicloalquilo são ciclopro-pilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo—hexilo, ciclo-heptilo, ciclo-octilo e outros semelhantes..

Como usado aqui, o termo halogéneo inclui fluoro, cloro e bromo,.

Como usado aqui, o termo "alcenilo tendo 2 a 15 átomos de carbono" refere-se a grupos hidrocarboneto insaturados lineares ou ramificados tendo desde 2 a 15 ãtornos de carbono.. Ilustrativo destes grupos alcenilo são 2-propenilo, hexenilo, octe-nilo, decenilo e outros semelhantes.

Como usado aqui, o termo "alcoxi", ern que o alquilo tem 1 a 6 átomos de carbono" refere-se a éteres de cadeia linear ou ramificada.. Ilustrativo destes grupos são rnetoxi, etoxi, propoxi, butoxi, isopropoxi e outros semelhantes.

Incluído no âmbito dos modos de realização do presente invento são as formas tautornéricas dos compostos descritas, as formas isoméricas que incluem os isõrneros geométricos, os enan-tá hrneros e diastereórneros, e seus sais f arrnaceutieamente aceita..... vexs. de adição de um sal preparado com um ácido, cuja sais refere-se a formula (I) 0 termo ácidos aceitáveis" composto de considerada adequada para consumo humano. f a r rn a o e u t i c a m e n t e por contacto de um união é geralmente Exemplos de sais de adição de ácidos farmacologicamente aceitáveis incluem, mas não estão limitados e eles, sais hidroeloreto, hidrobrometo, hidra-iodeto, sulfato, fosfato, acetato, propionato, lactato, rnaleato, rnalato, succinato, e t ar tara to. Todos estes sais podern ser preparados através de meios convencionais por reaeção, por exemplo, do ácido apropriado com o composto correspondente de Fórmula (I).

Os compostos de fórmula (I) podem ser preparados de acordo com os procedimentos seguintes..

Esquema A

3 (Ri=H, R2 =cycloalkyl)

KtBuO 3 (R1 = allyl, R2 =cycloalkyl) R„ sdío corno anteriorrnente definidos.. O etilenoacetal de p •bromobenzaldeído (1) do Esquema A pode ser litiado a baixa temperatura (-78°C a -40°C) com reagentes tais como t-butil-lítio.. 0 intermediário litiado pode ser condensado com N—rnetoxi—Isl-metil-arnidas de ácido acético apro— priadamente substituídas (2) a temperaturas variando desde? -78o(J até 0o C de rnodo a obterem—se cetonas tais corno 3 como produtos.. A remoção do etilenoacetal é efectuada por hidrólise ácida e a redução selectiva do aldeido-carbonilo revelado até ao álcool benzilico 5 é Isvada a cabo utilizando reagentes tais como tri—t.....butoxi—alumino-hidreto de lítio.. 0 álcool 5 é convertido no cloreto B por meio de reacção corri reagentes de halogenação tais como cloreto de tionilo,. 0 cloreto 8 é convertido no composto objectivo 8 por meio de reacção com imidazopiridina 7 num sol..... vente tai. como dimetii-acetarnida a temperaturas variando até 115° C.

Alternatívarnente, quando R.j = H e ' cicloalquilo, o composto 3 pode ser alquilado com haletos tais como iodeto de a..LL.Lo, utilizando uma base forte tal como t—BuOK em dirnetilfor— rnamida a desde a temperatura ambiente até 50° C„ Esta reacção dá origem a 3 (R= alilo, = cicloalquilo)» 0 composto 3 é em seguida convertido em 8 corno anteriormente descrito.

Um segundo procedimento para a síntese de cetonas com esta estrutura é utilizar, como material de partida, o benzal-deido correspondente que tern consigo um carboxilo no anel aromático. Este é convertido na N, D - d i. rn e t i 1 h ::L d r o x i 1. a rn i d a, utilizando processos químicos semelhantes oas anteriormente descritos., Esta amida é convertida na cetona por meio de reacção com um reagente organornetálico adequado que tem consigo o substituinfce alquilo desejado.. Utilizando processos químicos semelhantes aos ante..... riormente descritos, o aldeído "mascarado" é convertido no

derivado clorometilo e este é partida, de rnodo a obter-se o ..." í í 0 acop]..ado corn a irnidazopir: c o rn p o s t o o b j e c t á. v o..

Ldina de

Esquema B

13 - <

As arnidas di-substituidas 2 (e.. g.. , R.^ e R.^ = cioloal- quilo) do Esquema A, podern ser sintetizadas a partir dos intermediários correspondentes rnono-subsiituidos corno exemplificado no Esquema B. Deste modo, o ciclopentanoacetato de rnetilo 1 é convertido no hidroxiéster 2 por meio de condensação do seu enolato com ciclo—hexanona a baixa temperatura (—70°C). 0 éster 2 ê desidratado até se obter 3 por meio de reacçao com anidrido do ácido trifluorornetano-sulfônico ern piridina contendo 4-dimetil-amino-piridina, com aquecimento até 50°C. A olefina 3 é reduzida até 4 por meio de hidrogenação utilizando níquel Raney W-2 como catalisador.. 0 composto 4 © convertido no ácido 5 por rneio de tratamento com iodeto de litio em excesso ern DMF ao refluxo.. 0 acido 5 é convertido naamida 6 por rneio de reacçêto primeiro com cloreto de tionilo, ern seguida reacçao com o cloreto de ácido resultante corn hidrocloreto de N, O-dimetil-hídroxilamina ern diclorornetano contendo trietilarnina a temperaturas variando desde a temperatura ambiente até 50°C.

Os compostos de fórmula II em que R,_ é alcoxi podern ser preparados partindo de 2 ·- rn e t o x i.....4.....b e n z a I d e i d o, o qual pode ser

preparado de acordo corn o procedimento descrito por Arrnstrong et al„ Synthetic Communications 18 717 (1988) ou biiennon, et ai.. J.. Med. Chern. 29 194 (1988) e, ern seguida, levando a cabo os procedimentos que são descritos nos Exemplos C a LL

Este invento também se -relaciona corn urn método de tratamento para pacientes (ou animais mamíferos criados ern vacarias, ern industrias de carnes, ou indústrias de peles ou como animais de estimação) que sofrern de perturbaçSes ou de doenças que podern ser atribuídas ao PAI" corno previarnente descrito, e rnais espeeif icamente, com urn método de tratamento que envolve a adrninistraç:ão do composto (I), corno ingrediente activo» Λ

De acordo, o composto (I) pode ser utilizado entre outras funções para a redução da inflamação, para a correcçâo de alterações e perturbações respiratórias, cardiovasculares, e intravasculares, e para a regulação da activação ou da coagulação de plaquetas, para a patogénese da deposição irru.m o-complexa e contracções dos músculos lisos,,

Para o tratamento de inflamação, de perturbações cardiovascular, asma, ou de outras doenças provocadas pelo PAF, o composto (I) pode ser administrado oralmente, topicamente, parentericarnente, ou por pulverização de inalação ou rectalmente em formulações unitárias de dosagem, que contêm suportes, adju..... vantes e veículos farrnaceuticarnente aceitáveis, não tóxicos, convencionais.. Como usado aqui, o termo parentérico inclui i n j e c ç õ e s s u b c u t â n e a s, i n J e c ç ã o i n t r a ven o s a, i n t r a rn u s c u 1 a r, intraesternal ou técnicas de infusão..

Os compostos do presente invento podem ser administrados através de qualquer via adequada, preferenc:i.aI.mente na forma de uma composição farmacêutica adaptada a essa via, e na dose eficaz para o tratamento pretendido.. As doses terapêutica-mente eficazes dos compostos do presente invento requeridas para prevenir ou evitar o progresso da situação médica, são rapidamente estabelecidas por qualquer especialista nesta técnica.

De acordo com o anteriormente exposto, o invento fornece uma classe de novas composições farmacêuticas, que compreendem um ou rnais compostos do presente invento em associação com um ou rnais suportes e/ou diluentes e/ou adjuvantes farrnaceuticarnente aceitáveis, não tóxicos (colectivarnente referidos aqui como materiais de "suporte") e se desejado, outros ingredientes activos.. Os compostos e a composição podem, por exemplo, ser administrados intravascularmente, oralmente, " v.r·^ ρο Ν intraperitonealrnente, subcutanearnente, intrarnuscularmente ou topicamente..

Para administração oral, a composição farmacêutica pode estar na forma de, por exemplo, um comprimido, cápsula, suspensão ou liquido, A composição farmacêutica é preferencialmente feita na forma de uma unidade de dosagem que contem numa quantidade particular de ingrediente activo. Exemplo dessas unidades de dosagem são comprimidos ou capsulas.. Estes podem conter com vantagem urna quantidade de ingrediente activo desde cerca de 1 a 2.50 rng, preferencialmente desde cerca de 25 a 150 mg. Uma dose diária adequada para urn mamífero pode variar largamente, dependendo da condição do paciente e de outros factores. Contudo, uma dose de desde cerca de 0, 1 a 3000 rng/kg de peso corporal, parti-· cu..Lar mete desde cerca de i a 100 rng/kg de peso corporal pode ser apropriada, U ingrediente activo pode também ser administrado por injecção na forma de uma composição em que, por exemplo, solução salina, clextr ose ou agua podem ser usados corno urn suporte adequado, Urna dose diária adequada vai desde cerca de 0, 1 a 100 mg/kg de peso corporal, injectada por dia em doses múltiplas, dependendo da doença a ser tratada. Uma dose diária preferida será desde cerca de 1 a 30 rng/kg de peso corporal... 0 regime de dosagem para o tratamento de estados de doença infecciosa com os compostos e/ou composiçSes deste invento é seleccionado de acordo com uma série de factores, incluindo o tipo, idade, sexo e condição médica do paciente; a gravidade da infecção; a via de administração; e o composto particular ernpre..... gue e, por conseguinte, pode variar largarnente. ν' \ y ·<ί ξί ΐΐ λ ...ν'

Para fins terapêuticos, os compostos deste invento são vulgarmente combinados com um ou rnais adjuvantes apropriados parei a via indicada de administração. Se for per os, os compostos podem ser misturados corri lactose, sacarose, pó de amido, ésteres de celulose de ácidos alcanoicos, ésteres alqui.li.cos de celulose, talco, ácido esteárico, estearato de magnésio, óxido de magnésio, ©ais de cálcio ou de sódio dos ácidos sulfúrico e fosfórico, gelatina, acácia, alginato de sódio, polivi.nilpirroli.dona, e/ou álcool polivinxlica, e depois convertidas em comprimidos ou encapsulados para administração conveniente. Ern alternativa, os compostos podem ser dissolvidos ern água, pol.ietilena-~gI.icol, prop:LJ.,eno-~g,J,.icoJ.., etanol, òlea de milho, óleo de semente de algodão, óleo de amendoim, óleo de sésamo, álcool benzi lie:; o, cloreto de sodio, e/ou vários tampões,. Outros adjuvantes e modos de administração ©3o bem e largamente conhecidos na técnica farmacêutica. As dosagens apropriadas, em qualquer caso considerado, dependem certamente cia natureza e da gravidade cia situação a ser tratada, da via de administração, e da espécie de mamífero envolvido, que inclui o seu tamanho e quaisquer idiossincrasias individuais.

Suportes, diluentes e adjuvantes representativos incluem, por exemplo, água, lactose, gelatina, amidos, estear ato de magnésio, talco, óleos vegetais, gomas, polialquileno-glicóis, geleia de petróleo, etc. As composições farmacêuticas podem ser feitas numa forma sólida corno grânulos, pòs ou supositórios ou numa forma liquida corno soluções, suspensões ou emulsões. As composições farmacêuticas podem ser sujeitas a operações farmacêuticas convencionais corno esterilização e/ou podem conter ad j uvan tes farmacêuticos corno con ser van tes, estabilizadores, agentes de hurnidificaçlo, agente© de emulsão, tarnpões, etc.

'.....ϋ·~ !"

Islivais de dosagem da ordem desde cerca de 0, 1 rng a cerca de 1000 mg por quilograma de peso corporal por dia são úteis no tratamento das situaçcfes anteriormente indicadas (desde cerca de 50 mg a cerca de S 9 por paciente por dia).. Por exemplo, inflamação é eficazmente tratada e a actividade analgésica e antipirética manifestada, por administração desde cerca de 25 a cerca de 75 mg de composto por quilograma de peso corporal por dia (cerca de 75 rng a cerca de 3,75 g por paciente por dia). Preferencialmente, desde cerca de 5 mg a cerca de 50 mg por quilograma de peso corporal por dose diária produz resultados altamente eficazes (cerca de 250 mg a cerca de 2, 5 g por paciente por dia).. A quantidade de ingrediente activo que pode ser cornbi"·-nada corn os materiais de suporte para produzir urna forma de dosagem individual, variará dependendo do hospedeiro a ser tratado e do modo particular de administração» Por exemplo, uma formulação entendida para administração oral em humanos pode conter desde 5 rng a 95 rng de agente activo composto corn urna quantidade apropriada e conveniente do material de suporte, que pode variar desde cerca de 5 a 95 por cento da composição total. Formas unitárias de dosagem conterão geralmente entre desde cerca de 25 a cerca de 500 rng de ingrediente activo..

Deve ser entendido, contudo, que o nivel da dose especifica, para qualquer paciente particular, dependerá de uma variedade de factores que inoluern a actividade do composto especifico empregue, a idade, o peso corporal, a saúde geral, o sexo, a dieta, o tempo de administração, a via de administração, a velocidade de excreção, a combinação de droga© e a gravidade da doença particular causadora da terapia»

Os Exemplos seguintes são destli^<iôâN .,a' urna melhor ilustração do presente invento e não se destinam a limitar o invento em espirito ou âmbito. Mos Exemplos, todas as parte© sao partes em peso a menos que seja expressamente estabelecido de outro mo do..

PREPARAÇÃO DOS MATERIAIS DE PAHjígÀ, ·· EXEMPLO A

Preparação do C1.oreto de CicIopentanaceti 1 o

COCI 0 acido ciclopentano.....acético (1.7 g, 0,132 rnol) foi agitado dentro de 50 rnl de cloreto de tionilo e submetido a refluxo durante duas horas, A mistura foi arrefecida e o solvente em excesso foi removido através de destilação â pressão atrnosfé..... rica.. 0 resíduo foi destilado (p„ e.. = 38-39° C a 0,1 rnrn 1-lg), de rnodo a obeterern-se 15 g do composto em epígrafe» (81,% de rendimento de destilado).. ,

EXEMPLO B

Preparação da Μ - M e t o xi ···· N ·- rn e t i 1 ·- C i c 1 o pentana c e t a rn i d a

? rH C—N""CH3 och3

0 hidrocloreto de M, O-dimetil-hidKoxilamina (13 g„ 0,12 rnol) foi agitada em 20 rni de dicloroetano e arrefecido até 0o0 sob érgon,. Foi adicionada trietilarnina (25 g, 0,,2.5 rnol),, gota a gota, durante 15 minutos e a mistura agitada arrefecei,.! durante 30 minutos., 0 cloreto de ácido do Exemplo A (15 g, 0,1 rnol) foi dissolvido em diclorornetano (50 ml) e adiconado a 0oC, durante 1/2 hora à mistura.. A mistura foi em seguida agitada durante um período adicinal de tempo de uma hora a 0o G„ A mistura foi deixada a aquecer até a temperatura ambiente durante 2 horas e o solvente foi removido in vácuo,. 0 resíduo foi tratado corn 100 ml de acetato de etílo/éter (25::75) e o hidrocloreto de trietilarnina filtrado.. 0 filtrado foi separado do solvente por evaporação deste © o resíduo destilado a 0, 1 mm Hg, p„ e„ = 62.....63° C, de rnodo a obterern-se 1.2 g (70% de rendimento) do composto em epígrafe.. EXEMPLO 0

Preparação do 2-(4-Bromofenil)-Dioxolano

0 4.....brornobenza 1 deido (56 g, 0,3 rnol.) foi dissolvido em 5Ό0 ml de benzeno contenda 80bml (excesso) de etileno.....glicol.

Esta mistura foi agitada rapidamente por meio de motor. Foi adicionado o ácido p-tolueno solfônico (5 g) e a mistura foi

, . Λ \ ν f V '

submetida a refluxo corn urn separador der água, de um dia para o outro (24 Horas·).. A mistura arrefecida foi vertida em 1 litro de K2C0, e extraida corn acetato de etilo» A fase orgânica foi lavada com HgO e em seguida corn salmoura.. 0 extacto foi seco sobre sulfato de sódio e filtrado,, Depois da remoção do solvente, o resíduo foi crornatografado sobre gel de sílica utilizando acetato de etilo a 10%/hexano de modo a obter-se 50 g (70% de; rendimento) do composto ern epígrafe (p„ f. = 56—5?°C).

EXEMPLO D

Preparação da 2-Ciclopentil-1-[4-(Dioxolan il)Fenil]Etan ona ΓΛ 0 2-(4-bromofenil)dioxolano do Exemplo C (7 g, 0, 03 rnol) foi dissolvido ern 75 ml de TEIF e arrefecido até -75° C sob ãrgon.. Foi adicionado terc-butil-lítia (29 rnl de solução 1,7 M ern hexano), lentamente, a -76°C mantendo a temperatura de tal maneira que nunca subisse acima de -40® C- Depois de a adição

ficar completa, a solução foi arrefecida até -79°C foram nados 4, 2 g (0, 024 moí) do produto do Exemplo B, ern I HF adicio- Depois 22 22 de 0oC, vertida dentro de a, a solução foi deixada a aquecer até KHS04 0, 5N e extraída com acetato de etilo., Depois de lavagern corn salmoura, o extracto foi seco sobre NapSO^. Depois do solvente ter' sido removido, o resíduo foi cromatografado sobre sílica com acetato de etilo a 10%/hexano de modo a obter—se 2, 8 g do composto em epígrafe.

IXEMPLG E P r e p a r a ç ã o d o 4-(2-Ciclopentil-l-Oxoetil)Bezenocarboxaldeído

CHO

0 produto do Exemplo D (2, 8 g, 0, 1.1 rnol) fd dissolvido em 50 ml de THE e foram adicionados 5 ml de HC1 IN,, a mistura foi submetida a refluxo durante 3 horas e arrefecida,. 0 solvente foá removido num evaporador rotativo.. 0 resíduo foi dissolvido em acetato de etilo e lavado com IMaHSQ^ a 7%„ Depois de secagem da solução sobre Na^SO^, a camada orgânica foi concentraria no evaporador rotativo e o resíduo foi cromatografado sobre o-íii,..... corn acetato de etilo a 5%/hexano de rnodo a obter-se 2, 2 g c|n composto em epígrafe (95% de rendimento), sob a forma de um õleo 23 -

EXEMPLO F Preparaçio da 2 C i c 1 o p e n t i 1.....1.....L 4 '·· (H i d r o x i rn e 111) F e n i. 1J E t a η o n a

OH /

0 produto do Exemplo E (2, 2 g., 0, 01. rnol) foi dissolvido em THF (50 rnl) e arrefecido sob ãrgon atê 0oC„ Foi adicionado tri-t-butoxialumino-hidreto de litío (2,7 g), ern porções, durante 1/2 hora a 0oC e agitada durante 2 horas a 0oC.. A mistura foi deixada a agitar durante um periodo de tempo total de 4 horas até que a cromatografia de camada fina indicou que a reacçao .estava completa.. A mistura foi vertida dentro de KHSCJ^ 0, 5N e extraida com acetato de etilo. Depois de secagem ©obre Isia^SO^, o solvente foi removido, de modo a obter.....se 2, 8 g do composto em epigrafe (97% de rendimento) sob a forma de um óleo.. 24

EXEMPLO G

Preparação da 1- [ 4- (Cloromet.il) Fen il ] --2--01.(:::101::)601 ile t an on a

Cl

=0 0 produto do Exemplo F (450 mg, 0, 002 rnol) foi dissolvido em 5 ml. de benzeno foram adicionados 250 mg de cloreto de ti.oni.lo., A mistura foi < submetida a refluxo durante uma hora.

Depois de arrefecimento, a solução foi vertida dentro de Kr-,0,., 2 d diluido e extraída com acetato de etilo. A camada orgânica foi seca sobre Na^SO foi evaporado o solvente e foi crornatografada sobre gel de silica utilizando acetato de etilo a 5%/hexano de modo a obter-se 275· rng do composto em epígrafe, sob a forma de um óleo (56% de rendimento)..' 25

EXEMPLO Η

Preparação do

Cloreto de Ciclo-hexanocetilo

O

Cl

Seguindo o procedimento do Exemplo A„ 37 g (0, 262 rnol) de ácido ciclo-hexanci-acético foram convertidos no composto em epígrafe.. EXEMPLO I Preparação da N ·· rn e t o x i - N - rn e t i. 1 - C i c 1. o - h e x a η o e e t a rn i d a

Seguindo o procedimento do Exemplo B, 18 g (0,1 rnol) do produto do Exemplo l-l foram convertidos no composto em epígrafe.. A purificação do composto em epígrafe por meio de crornatografia de gel de sílica utilizando acetato de etilo a 20%/hexano como eluente deu origem a 9 g (50% de rendimento) do composto em epígrafe.. 26 26

EXEMPLO J

Preparação da 2 ··· C i. c 1 o—h e x i. 1.....1 --1„ 4 -- (2 -- II) i ο x α 1. a n i 1) F e n ::L 1. JE t a η α n a

Seguindo o procedimento do Exemplo D, 11, g (0,048 mal) de etilenaacetal do p.....bromobenzaldeido e 8’, 9 g do produto do

Exemplo I foram combinados de modo a obterem.....se depois de croma..... tografia de gel de sílica utilizando acetato de etilo a 15%/he..... xano, 11 g (84% de rendimento) do composto em epígrafe.. 27 27

EXEMPLO K Preparação do 4--(2- C i. c 1 o.....h e x i. 1 -· 1. - 0 x o e t i 1) b e n z. e η o c a r b o x a I dei. d o

Seguindo o procedimento do Exemplo E, 3 g (0,01 rnol) do produto do Exemplo J foram hidralisados em 50 ml de THF contendo 7 ml de HCL 1M de rnodo a obterem.....se 2, 4 g do composto em epígrafe (35% d e r e n d 1. rn e n t o) „ ,

EXEMPLO L Preparação da 2-Ci.clo-pentil·····!····· [ 4-· ( Hidroxirnetil) Fen J E t anona

s_y

Seguindo o procedimento do Exernplo F, o produto do Exemplo K, 2,5 g (0,01.1 rnol) foi reduzido em 35 ml de THF contendo 3, 5 g de tri-terc-butóxi-alurnino-hidreto de li tio de rnodo a obterem-se 2,25 g do composto em epígrafe (90% de rendimento).. Ν' EXEMPLO Μ

Preparação da 1 -1.. 4-- (Clarometil) Fenil J -2-Ciclo-~hexiletanona

0 produto do Exemplo L (2., 25 g, 0., 0097 rnol) foi adi— c::i..onado a 1.0 ml de cloreto de tionilo e submetido a refluxo durante urna hora» 0 cloreto de tionilo foi removido por meio de um evaporador rotativo e o resíduo foi dissolvido em acetato de etilo e lavada com MaHCO^.. A camada orgânica foi seca sobre MgSO^.. Depois de remoção do solvente o resíduo foi cr orna tografado sobre gel de silica utilizando acetato de etilo a 5%/hexano de modo a obterem-se 1,8 g do composto em epígrafe (74% de rendimento)..

Preparação da 2.....Ciclo”hexil”l.....[4.....(2-Dioxolanil)Fenilj.....4-Penten.....1.....Ona ΓΛ

0 produto do Exemplo -J (1,0 g„ 0,006 rnol) foi dissolvido em 30 rnl de DMF seco à temperatura ambiente sob uma atrnos fera de azoto e foi adicionado t foutôxido de potássio (1,4 g)..

Depois de agitação durante 5 minutos, foi adicionado 1 g de iodeto de alilo e a recção foi aquecida até +50°C durante 1 hora., Foi adicionada outra porção equivalente de iodeto de alilo e a agitação foi continuada durante 2 horas a -1-50° C„ Depois de arrefecimento à temperatura ambiente a mistura foi vertida em 50 ml de KHSO^ 0, 5N e extraída com acetato de etilo. Depois de secagem da camada orgânica sobre Na^SO o solvente foi removido e o resíduo foi cromatagrafado sobre gel de sílica utilizando acetato de etilo a 10%/hexano de modo a obter-se 1 g do composto em epígrafe- (54% de' rendimento)..

*' ^ i.' ' EXEMPLO Ο

Preparação do 4~( n±cla~hexiI~l"-0xa-4-”PenteniIL )Ber»zenocarboxalc!eido

CHO

Seguindo o procedimento do Exemplo E, 480 mg (0, 0014 mal) do produto do Exemplo M e 3 ml de HC1 IN derarn origem a 282 mg do composto em epigrafe (75% de rendimento)..

EXEMPLO L

Preparação da 2-C±clo”hexil"l·- L 4-- (Hidroxirnetil) Fenil J 4-Pen ten~l.....Ona

Seguindo o procedimento do Exemplo F» a reacção de 280 mg (0,001 mol) do produto do Exemplo 0 com 315 mg de tri- "terc-butoxi-alurnino.....hidreto de litio deu origem a 250 mg do composto em epígrafe (92% de rendimento),,

EXEMPLO Q

Preparação da 1 [ 4 (Citar ame til.) Fen il ..I -2-Cicla“hexil 4 Pen ten 1 On a

O

Seguindo o procedimento do Exemplo M, 21.0 mg (0, 0007'? rnol) do produto do Exemplo P foram submetidos a refluxo em 3 ml de dloreto de tionilo.. 0 produto bruto foi oromatografado sobre gel. de sílica utilizando acetato de etilo a 5%/hexano de modo a obterem.....se 85 mg do composto em epígrafe (40% de rendi..... mento)..

Preparação do a.....C i c 1 o i") e n t i 1.—1 -1~| ± d r o x i. c i. c 1 o.....h e xan o a c e t a t o d e M e t i 1 o

l-oi dissolvida di-isopropilamina (12,7 g, 0,125 mol) em 150 ml de IHh seco e arrefecida até -70°C sob Foi adicionado n-BuLi (80 ml de solução 1,6M em hexano, 0,125 mol) e a solução foi agitada durante 5 minutos a --70°C„ Foi adicionado ciclopen- tanoacetato de rnetilo (17 g, 0,125 mol) em 50 ml de THF, a .....70°C, durante 15 minutos e a reacção foi agitada a -70°C, durante mais 1.5 minutos., l-oi em seguida adicionada urna solução de ciclo--hexa--nona (11,3 g, 0,1.15 mol) em THF (50 ml), a ™70°C, durante 1/2 hora e foi agitada no frio durante 1 hora,, A recção foi aquecida até â temperatura ambiente durante 1 hora e foi temperada com 5 ml de HC1 1.11, 0 solvente foi removido num evaporador rotativo e adicionou-se acetato de etilo., A solução foi em seguida lavada com NaHQQ,„j e as camadas foram separadas,. A camada orgânica foi seca sobre Ma^SO^.. 0 agente de secagem foi filtrado e o filtrado .-foi submetido a extracçao do solvente de modo a obter-se um residuo, o qual foi cromatografado sobre gel de sílica uti..l,i^anc|0 acetato de etilo a 7%/hexano de modo a obterem—se 2 A, 8 g do composto em epígrafe (92% de rendimento),.

EXEMPLO S

Preparação do a Ci.c 1 opent::i.. 1 - 1 -Ciclo hexeno 1. Acetato de Met± 1 o

0 produto do Exemplo R (16,25 g, 0,068 rnol) foi dissolvido em piridina (100 ml) contendo 3 g de 4.....dimetilaminopiri—

dina a 25°C„ Foi adicionado anidrido trifluorornetano-sulfõnico (20, 0 g, 0, 068 rnol), gota a gota, sob durante 10 minutos.. A temperatura foi aumentada até +50°C durante 15 minutos,. Depois de arrefecirnento da rnietura até a temperatura ambiente e agitação durante 15 minutos, a mistura reaccional foi vertida dentro de 600 rnl de H01 2M e extraída com acetato de etilo/éter 1:: 1.. A fase orgânica foi lavada com salmoura e seca sobre Na^SO^,, a filtração do agente de secagem e remoção do solvente deu origem a 16 g do composto em epígrafe (99% de rendimento)., ' - ί ·; >: \ · EXEMPLO 1" ”'v" '

Preparaç:ão do as ·-·· C ::Le 1 o p e n t i. I- 0 i. c I. o ·· h e x a n oace t a t o d e M e t :i, o

0 produto do Exemplo S (15 g, 0,067 rnol) foi hidro genado ern metanol (150 ml) utilizando Ni. Raney W--2 (3 g) como catalisador a 5 psi (0,35 kgf/crn"') e +25° C durante 20 horas até que 97% da absorção teórica de hidrogénio seja levada a cabo.. A mistura reaccional foi filtrada e o filtrado concentrado.. A destilação do residuo deu origem a 14, 5 g (96% de rendimento) do composto em epígrafe (p„ e„ 85--88° C a 0,1 mm Hg).. C14H24°2=

Calculado:: Encontrado:: C,C, 74, 95; 75, 08 10, 7811, 20 uK.

EXEMPLO U

PreparaçSo do A c i d o a.....C i c 1 o p e n t i 1 ~1 ···· C i c l o.....h e x e η o ····· A c é t i c o

co2h 0 produto do Exemplo T (5 g, 0,,022 rnol) foi dissolvido em 40 ml de DMF e foram adicionados 5 equivalentes de LiL. A mistura reaecional foi em seguida submetida a refluxo durante 24 horas sob · A reacção foi arrefecida, diluida com 25 ml de KHSQ,, 0, 5N e extraída com acetato de etilo.. Depois de secagem da. camada orgânica sobre Ma^SO^, o solvente foi removido.. A croma-tografia sobre gel de sílica utilizando acetato de etilo/hexa-· no/H0Ac (5::95::1) deu origem a 4 g do composto em epígrafe (87% de rendimento).. L:13H22U2 ”

Calculado:: Encontrado:: C,C„ 74, 23; 73, 78 10, 54 10, 89

EXEMPLO V

Preparação da a.....Ciclopentil.....N-Metoxi-N-Metil-Ciclo-hexanoacetamida

0 produto do Exernplo U (3, 25' g, 0,015 rnol) foi disso!..... vida em 25 rnl de cloreto de tianilo e em seguida submetido a refluxo durante 3 hora©,. 0 solvente em excesso pai removido por meio de destilação e o resíduo rsultanta foi usado no passo seguinte.. 0 hidrocloreto de D, ls|.....dirnetil.....hidroxilamina (4,5 g) foi dissolvido em 75 ml de dicloroetano contendo 7, 8 g de trietilL-·.. amiria sob uma atmosfera de azoto.. Esta solução foi agitada durante·) 1/2 hora e em seguida o cloreto de ácido bruto anterior····· mente preparado foi adicionada à temperatura ambiente.. Depois de aquecimento até 50*8, a reacção foi agitada durante 30 minutos., q solvente foi removido depois de arrefecimento e o residuo foi dissolvido em acetato de etilo e lavado com Kí-180. 0, 5N„ A camada 4 orgânica foi seca sobre Na^SO^., 0 agente de secagem foi filtrado e o filtrado foi concentrado nurn evaporador rotativo- 0 resíduo 1 o..L cruindtoyrdf diJu sobre gel. de silica utilizando acetato de etilo a 10%/hexanu de modo a obterem-se 3,3 g do composto em epígrafe (84% de rendimento)., , \ . -.SSON. C1BH27°2N: Calculado:: C, 71, 10; II, 10, 74 M, 5, 52 Encontrado:: c. 71, 11; H, 10, 39 IM, 5, 53 EXEMPLO W Preparação da 2.....Ciclo.....hexil-2.....Giclopentil~l~[4.....(2-Dioxolanil)Fenil]Etanona ΓΛ

0 produto do Exemplo C (3 g, 0, 013 rnol) foi tratado com terc~butil.....litio (19 ml de 1,BM/hexano) de acordo com o procedi..... mento descrito no Exemplo D.. Em seguida foram adicionados 3, 2 g (0,013 mol) do produto do Exemplo D, â mistura reaccional.. A mistura foi em seguida processada de acordo com o procedimento descrito no Exemplo D. A crornatografia do produto bruto sobregel de silica utilizando acetato de estilo a 5%/hexano deu origem a 730 mg de uma mistura 1:: 1 do composto em epigrafe e da arnida de partida-

EXEMPLO X

Preparação do 4.....(2.....Ciclo.....hexil.....2.....Ciclopen til.....1.....Oxoetil)benzenocarboxaldeido

CHO

0 material bruto do Exemplo W (730 mg) foi tratado com 5 rnl de HC1 1M ern 25 ml de THF e submetido a refluxo durante? 1 hora.. 0 solvente foi removido e o residuo extraído com acetato de etilo e a camada orgânica foi lavada com salmoura.. Depois de secagem e filtração, o solvente foi. removido e o residuo foi cr orn ato grafado duas vezes sobre gel de sílica utilizando acetato de etilo 10% e em seguida a 5%/hexano de modo a obterem-se 175 rng do composto em epígrafe.

EXEMPLO Y

Preparação da 2.....C ± c 1 o "· h e x ::L I. - 2.....C i c I o p e n t i 1......2- L 4 - (h i d r o xi. rn e t i 1) F e n i 1J E t a η o n a

Seguindo o procedimento do Exemplo F, 175 mg (0,00058 rnol) do produto do Exemplo X foram convertidos no composto em epígrafe utilizando tri-terc-butoxi.....alurnino-hidreto de litio (175 ml) em THF. 0 produto foi cromatografado sobre gel de silica utilizando acetato de etilo a 25%/hexano de modo a obterem.....se 140 mg do composto em epigrafe (79% de rendimento)..

EXEMPLO Z

Preparaçao da ·- [ 4 - C1 o r o rn e t ::L 1) F e n i. 1J.....2 ·- C i. c I o—h e x á. 1 ··- 2 - C i. o 1 o p e n 'fc i. 1 ·~· ΙΞ fc a η o n a

(Ο ι ut 1/..1 obt:i

Seguindo o procedimento do Exernplo lvl, 140 rng 1-0 rnrnol) do produto do Exernplo Y foram convertidos no cloreto ..izando SOClg- Depois de cromatografia do produto bruto,, foram dos 90 mg do composto em epígrafe (Bl% de rendimento).. 43

PRODUTOS FINAIS EXEMPLO 1

Preparação da 2.....Ciclopentil-l- L 4-- ( 5H-Imidazo |„ 4, 5-c J - P i r i d i n - 5.....i 1.....Ivl e t i 1) F e n i 1J E t a η o n a 0

0 produto do Exemplo G (270 mg., 0,0011 rnol) foi disso I. vi. d o em 5 ml de dirnetilacetamida contendo 135 mg (0,0011 rnol) de lH-irn::i..dazo|,.4, 5.....cjpiridina e agitado sob azoto a 80°C durante 24 horas e a 115°C durante um período de tempo adicional de 8 horas.. A reacção mostrou ficar completa por "!"LC„ Depois de arrefecimento, o solvente foi removido por destilação em vácuo.. A crornatografia do produto bruto (duas vezes) sobre gel de sílica utilizando CFI^OH/CHgClp/NH^0H (5/95/1) como eluente deu origem a 200 mg (57%) do composto em drato, p„ f„ = 153-158” C„ epígrafe, sob a forma de mono.....hi..... C20H21ISi3U" H2U:

Calculado:: Encontrado:: C„ C„ 71,19; 71, 08; 8, 87 8, 91 N,N, 12, 45 12, 45 44

EXEMPLO 2

Preparação da 2.....Ciclopentil-···!.....L 4.....( 5li--Imidazo L 4., 5-c J -··

Piridin-5~ilHvletil) Fenil J Etanona 0

+0.5 H20

Seguindo o procedimento do Exemplo 1, 1, 8 g (0,0072 mol) da produto do Exemplo M foram adicionados a 855 mg (0,0075 mol) de ll-i-irnidazoL4, 5-cJpiridina em 20 ml de dimetil...... acetarnida e aquecidos a 80° C de um dia para o outro.. Depois de crornatografia com CH^Cl,,,/CH,.^0H/NH^ 0H (95::4, 4:1, 5), foram obtidos 650 mg do composto em epxgrafe, sob a forma de um herni-·hidrato,. C21H23N13(1'1/2H20;: P.. M. 342, 40

Calculado:: C, 73,65; H, 7,06; Encontrado: C, 73,16; H, 7,02; IM, 12, 26 N, 11, 80

EXEMPLO 3

Preparaçao da S-Ciclo-hexil-l.....|„ 4-· ( 5H-·I rnidazo |.. 4, 5--c J..... F3 i r i d i n - 5 ···· i I. Ivl e t i I) F e n ::i_ IJ 4 ·· F3 e ir b e n 1. 0 n a o

Seguindo o procedimento do Exemplo 1, 85 mg (0,00029 mol) do produto do Exemplo Q foram feitos reagir com 35 mg de 1H.....irnidazo[4, 5.....c]piridina„ 0 produto bruto foi crornato..... grafada sobre gel de sílica utilizando MeOH/CHgClg/NH^OH (5/94/1) como eluente, de modo a obterem.....se 65 mg do composto em epígrafe (60% de rendirnento).. C24H27N3°" H2°" P. M. 391, 48

Calculado:: Encontrado C, C, 73, 62;; 73, 45 H, 7, 46IM, 10, 73 H, 7, 62; IM. 10, 66

i".N EXEMPLO 4

Preparação da 2 ·· C i cl o h e x i 1 2 C i o 1 o p e n t i. 1 1 - L 4--(5 H I rn ::i.. d a z o |„ 4, 5 c J -

Piridin.....5.....il.....Ivle til) Fen il J E t an on a

Seguindo o procedimento do Exemplo 1, 90 mg (0,,29 rnrnol) do produto do Exemplo Z foram feitos reagir com 34 mg de imida..... zopiridina,, 0 produto bruto foi cromatografado sobre gel de s Ί 1 i ca u t i 1 i z a n d o M e 0 H / C H 1Μ Η ^ 0 H (5 / 9 4 /1) c o rn o e 1 u e n t e, d e modo a obterem~-se 60 mg (49¾) do composto em epígrafe, sob a for rn a de rn o no --· h i d rato,. i:'26H31N3ÍJ" H2U:: P„ M„ 419, 53

Calculado:: C, 74, 43 5 H, 7, 93; 10, 0 Encontrado:: c. 74, 31; H, 7, 81; M„ 9, £

·, λ';·-;:' EXEMPLO 5

Preparação da 2 C i c 1 o h e x i. 1 1 ···· | ’ 4 (5 H I rn i d a ~z o [ 4, 5 - c ]

Piridin.....5-~il-Me til) Met oxiFen il ,J Et an on a 0

Seguindo o procedimento descrito no Exemplo., a 1.....[(4..... ~clorometoxi~3-metoxi)fenilJ-2-ciclo-hexiletanona é convertida no composto ern epígrafe., EXEMPLO 6

Agregação e secreção de_,jxlagmtas......in.du2Íjias„,,B^QJpAF - „3

Plaquetas de coelho marcadas com PHjserotonina» lavadas foram preparadas corno previarnente descrito em COX, f.i. P. ., J.. I.....I.NDEN e S„ I. SAIDVIP eleva os níveis AMP cíclicos (cAMP) de plaquetas e inibe in vitro a activação de plaquetas induiaidas pelo facbor de activação de plaquetas (PAF),. Psptideos..........b:: 2b.....2.8., 1984, e mantidas numa atmosfera de b% de UUa 87°U ate serem usadas no . 8 . bioensaio., Partes aliquotas das plaquetas (2vbx..L0 /rnl) foram incubadas ou com um antagonista de PAF ou com ° veiculo apropriado, durante 60 s, antes da adição de PAF (0,2 nM a 0,2 j.iM)„ A agregaç:âo foi continuarnente rnonotorizada num registador em mapa e registada como o máximo de vestígios a 60 s depois da adiyao de 48 -

PAF.. A secreção de [3H]serotonina foi medida numa arnostra da suspensão de plaquetas, removidas a 80 seg depois da' adição de FW"„ A percentagem de inibição da agregação e da secreção foi calculada por comparação das plaquetas tratadas com o antagonista com as plaquetas controlo, tratadas com o veiculo apropriado-Cada combinação de antagonista e PAF foi repetida usando preparações de plaquetas diferentes- Os valores de CI^0 foram determinados por inspecção das curvas dose-resposta.

Exemplo 7

Inibiçlíe......da.._Ligaçãp......ffcPAF......gm.....Reeeptores de Membrana Ho t a s_H u m anas

Preparação...........do......._ Recef^t <;í r:: Dez unidades de plaquetas embaladas humana© no prazo, cada uma contendo 45-85 ml de plasrna rico em plaquetas, foram compradas nurn banco de sangue comercial. Utensílios de plástico disponíveis foram usados durante toda a preparação do receptor. As unidades foram juntas e urna parte aliquota de 1 ml foi removida para a determinação da concentração de plaquetas, usando urn Coulter Counter.. 0 restante plasrna rico em plaquetas foi disperso ern tubo cónicos de 50 rnl e centrifu-gado à temperatura ambiente, durante 15 minutas a 3000 RPM (2300 x g)- 0 plasma foi decantado e as plaqueta© foram ressus-pensas em 35 rnl de tampão (Trizma 7,0 10 rnM; EDTA 2 rnM (sal dipotássico), e KC1 150 rnM) e transferidas para tubos novos, que foram centrifugados novamente, como anteriormente. As plaquetas foram lavadas 3 vezes, evitando contaminação de eritrócitos no fundo das peletes. As peletes forarn consolidadas em cada passo, e pela última lavagem corn tampão EDTA/KC1, a maioria dos eritrõ-rvi tns estavam no tubo 1- As peletes forarn ressuspensas ern tampão que continha Trizrna 7, 0 10 rnM com CaCl^ 10 m|v|- A seguir à cen trifugação, o tampão foi decantado e as peletes foram

ressuspiensas ern tampão de CaCl^,, evitando a contaminação de eritrõitos através da recuperação de menos do que 100% dos péletes das plaquetas» As plaquetas ressuspensas foram distribuídas em partes aliquotas de 8.....10 ml em tubos Corex e despe..... daçadas por três ciclos de congelação (neve carbõnica/rnetanol) e aquecidas (24°C)„ Os tubos foram centrifugados a 40 000 x g, durante 20 minutos a 4°C» 0s sobrenadantes foram decantados e cada pelete foi ressuspensa em 5-7 ml de Trizrna 7, 0 10 rnl'1. Todos as peletes ressuspensas foram Juntas e partes aliquotas de 1200 j.il foram distribuídas em tubos micrõfugos de 1, 5 ml e congeladas a --70o0.. 0 teor em proteinas foi determinado por ensaia da proteina de fluorescarnina.. tttodflSLJto......Eafiaift;____Caracterização do.........Receptor - Cada preparação do receptor foi avaliada para a determinação do nurnero de populações de receptor., do numero de equivalente© de recepto- res de PAF/rng de proteina e da constante de dissociação (l< ) para d a ligação de RAF-., Isto necessita de. 2-3 experiências em que a coneentração de proteina foi mantida constante e a concentração do ligando SH-PAF- variou desde aproximadarnente 0, 10.....2, 5 nl¥l e os dado© foram analizados pela metodologia de Scatchard» 0 volume de incubação total foi de 250 j.il para estes procedimentos e as incubações foram conduzida© a 24°G, durante 30 minutos» Para outras experiências, os volumes totais de incubação são de 500 μ!» Concentrações de ligando e de proteina foram ajustadas de modo a originar equivalentes de receptor de 0, 075 nlvl, na presença 3 de "H.....PAI- 0, 75 nlvl„ Cada preparação de receptor foi depois usada

na determinação da relação de substituição dose.....resposta de PAF não marcado e de antagonista de PAF", triazolarno» Desde que o valor de Kq e os valores de 0Iqq piara o PAI- e piara o triazolarno forem consistentes com dados idênticos recolhidos piara prepiara····· çcíes de receptores antigas, usadas no ensaio, a nova pirepiaração de receptor foi usada piara a avaliação de compostos» Métodos de Ensaio: Ensaio de_____Rotina...„dé"-CQWiPC»sto.s - Os compostos foram pesados corn precisão e solubilizados em quantidades de DMSO de modo que urna parte aliquota de 5 j.il na encubado deverá ter a concentração de composta desejado,. Os compostos testados para o primeiro tempo neste ensaio, foram avaliados a uma concentração de 50 j.iM no rneio de incubação,, Todos os com..... postos foram no geral solubilizados em DMSO, durante cerca de duas horas antes do ensaio., 0 triazolarno foi sempre incluído em cada ensaio de registo como composto de controlo de inibição.. Uma concentração padrão de 50 j.ilvl inibiu a ligação l-I-PAF em aproxi-madamente 50%. A solução de controlo de ligação não específica foi feita através de secagern até se atingir cerca de 26, 2 jjlL de PAI- não marcado, sob uma corrente de argon. 0 PAF foi ressolubi— lizado em 1000 jjlL de DMSO., Quando distribuído numa parte aliquota de 5 jil, a concentração, final de PAF 1. jíM no incubado excedeu ern 3 1000 vezes a concentração de '"H-PAF.

Todos os tampões que continham proteínas foram feitos â temperatura ambiente, no dia do ensaio.. U tampão do ensaio foi preparado através de adição de 125 mg de albumina humana a 25 rni de tampão de estoque (Trizma 7,0 10 rnM com UaU.i.^ 20 rnlvl).. 0 tampão de lavagem foi feito por adição de 20 gramas de albumina de soro de bovino em 1000 ml de tampão de estoque., te roa de 80 rni de tampão de lavagem foi decantado para um pequeno prato de pirex e usado para embeber 65 filtras de vidro de 2, 6 cm Whatman 61--/6.. 0 restante tampão de lavagem foi vertido numa pipeta e colocado num banho de gelo em conjunto corn os filtros.. 0 ligando para o ensaio foi preparado por adição de

Q cerca de 10 j,il de PAF" de estoque ( IJuPont IsiEIM, ΜΕΓ—668) a 3 1.4 ml de de tampão de ensaio.. Visto que a quantidade de H—PAF no incubado final era para ser 0, 75 nlvl, a quantidade actuai de Η.....RAF de estaque a ser usado teve que ser determinada para cada lote de material, corn base nas suas actividades específicas.

Os receptores de membrana para o ensaia foram preparados por descongelação do número apropriado de tubos, â temperatura ambiente e adição das membranas a Trizma 7, 0 10 mlvl que continha CaClp 10 rnlvl.. Um volume total de 14 ml foi atingido. A quantidade actual de membranas necessária foi determinada pela necessidade de ter equivalentes de receptor de PAF 0, 075 nlvl por tubo de ensaio. Todos os materiais foram deixados em movimento através de agitação, num prato de agitação.

Primeiro, 5 jj.1 de composto ou de DMSO foi adicionado a cada tubo de polipropileno de 12 x 75 mm, seguida por adição de 3 95 jjlL de tampão de ensaio. À seguir, 200 jjl de ' H-PAF foi adi- 3 oionado a cada tubo e 3 partes aliquotas de ' H-PAF foram retiradas a diferentes tempos, ficando o restante dispensada colocado ern frascos de cintilação. A reacção foi iniciada por adição de 200 jil de membranas. Todos os tubos foram muito brevemente agitados ern vórtice e colocados num banho de água a 24°C, durante cerca de 30 minutos. Durante este tempo, os filtros Whatman GF/C foram colocados em suportes para filtros de pregas de vácuo de b Millipore. As incubações foram terminadas por, em primeiro lugar, adição de 4 ml de tampão de lavagem gelado a cada tubo de incubação e depois decantação destes sobre os filtros sob vácuo. Os tubos e os filtros foram lavados rnais duas vezes. Cada filtro foi colocado em frascos de cintilação de 20 ml aos quais 20 ml de Aquasol. (DuPont NEN, NDF952) foi adicionado.

Em resumo, cada tubo de ineubaççáo continha um volume total de 500 j.il de incubado. Isto consistia em 5 j.tl de droga com DMSO ou unicamente DMSO, 95 j.il de tampão de ensaio, 200 j.il de '"Vl-PAF (concentração final de 0,75 nM) e 200 rnicrolitros de 52

•"©ceptores <::le membrana (concentração final de 0,075 nIV1).. Foram Preparados 60 tubos por ensaio e cada dose foi realizada em triplicado.. 0© controles em 'bodos os ensaios consistiram em 2 ‘-ontrolOs "0" de diluente (DMSG) (2 determinações em triplicado colocadas a diferentes posições nos 60 tubos de ensaio), 1 controlo de ligação não especifico, e 1 controla de draga de 'triazolarno.. As restantes 16 doses foram usadas para testar 16 compostos diferentes a uma dose de registo de 50 jíM, ou para a determinação de dose-resposta, para um composto.. Ern geral, curvas close-resposta foram realizadas para 4 doses de composto, com a intensao de inibição da ligação ‘3H~PAF de 15-85%, onde pelo menos existe 1 dose no lado do ponto dos 50%, .Gáloulxr^ .....de.______Rotina: Calculou-se a média das determinações de DPM ern triplicado (corrigidas para a base) numa única dose de composto, enquanto que a média foi calculada para todas as 6 determinações de ligação total (dose "O", só com DMS0).. A quantidade para a ligação não específica (PAF 1 ji|v|) foi subtraída de todas as médias de doses, dando uma quantidade de ligação especifica ern todos os casos,. A percentagem de substitui-çau de H—PAI- ou de inibição de ligação foi calculada a partir da fórmula SIBo-Stíc/SItío x 100, em que STBo = ligação especifica dos controles de dose 01 e SBc = ligação específica na presença de composto. Se um composto teste na dose de registo inicial de 50 j.ilvl Inibiu a ligação de 45% ou rnais, o composto foi considerada activo e foi. bestado na maneira dose—resposta para a determiação de urn valor de 0s compostos que inibiram a ligação de PAF em menos de 45% a urna concentração de 50 jilvl foram considerados inactivos e rnais nenhum teste foi feito,,

Ds valores de (JIqq foram determinados ern compostos activos ern testes subsequentes,. Três ou rnais doses de composto devem inibir a ligação \l~PAF entre 15-85%.. Usando urn programa de £· t

* %\

computador, os dados em % de substituição foram transformados (logit) e pelo menos a regressão linear quadradaffoi realizada nos dados, inserindo a condição de 1.5-85¾ para a determinação dos valores de Cl a partir dos pontos dados, derivadas do rnesrno ensaio. 50

Secreção de Agregação de Receptor Plaquetas Plaquetas Plaquetas em Coelhos em Coelhos Humanas C o rn ρ o s t o GI..... (n lvl) bu CI50 (nM) CI50 (nM) 2.....ciclopentil·"·!-" 379 .....|„ 4.....( 5 H -- i rn i d a z o L 4, 5 -- c J..... 2587 8., 41 P i r i cl i n - 5 - i 1 -· rn e t i 1) --·· feniljetanona 2~ciclo.....hexil~l” 131 948 4, 44 ····· [ 4.....(SH.....irniclazo [ 4, 5~c ]..... piridin.....5--:1.1.....rnetil) - feniljetanona 2-ciclo.....hexil----1---- 105 833 2, 22 -1„ 4.....(5H----imidazo [ 4, 5.....c ] - piriclin.....5---il-rnetil) - f e n i 1J.....4 ····· p e n t e n.....1 - o n a 2"---ciclo.....hexil—2-ciclo— 89 278 1, 46 pen til—1- L 4-- (Bl-l-imidazo- L 45 - c J.....p ir i d i n -· 5 -11 - rn e - t i1)feni1J etanona

Claims (2)

1. Reivindicações Processo para a preparação de urn composta da fórmula (I)::

   O /1 II / C—(CH2)m— CH R2 e de seus isórneros; ou de um seu sal de adição de ácido farmaceutiearnente aceitável., em que:: R„l e são cada um independentemente ©eleccionados -a partir de hidrogénio" alquilo de cadeia linear ou ramificada de 1 a 15 átomos de carbono; cicloalquilo de 3 a 8 átomos de carbono:; cicloalquilo substituído que pode estar substituído por um ou rnais do que um alquilo de 1 a 8 átomos de carbono; fenilo; fenilo substituído que pode estar substituído por urn ou roais do que urn alquilo de 1 a 6 á t o rn o s d e c a r b ο η o o u h a 1 o g é n e o; a 1 c e η í 1 o li n e a r o u ramificado com 3 a 15 átomo© de carbono; Y é fenilo ou fenilo substituído por um ou rnais do que um alquilo de 1 a 8 átomos de carbono; alcoxi ern que o alquilo tem -1 a 8 átomos de carbono; e halogéneo seleccionado a partir do grupo que consiste em bromo, fluoro ou cloro; rn n é um inteiro de 0 a 5:; é urn inteiro de 1 a 6; é urn grupo substituinte numa ou rnais das posiçSes 4, 8 ou 7 do anel, piridina, sendo o referidos grupos inde..... pendentemente selecoxonados a partir de hidrogénio; alquilo de 1 a 8 átomos de carbono; halogéneo em que o halogêneo ê seleacionado a partir de bromo, flúoro, ou cloro; ou alcoxi ern que o alquilo tem 1 a 6 ãtornos de carbono; é hidrogénio ou alquilo de 1 a 4 átomos de carbono; caracterizado por; a) se fazer reagir um composto de formula:: Cl

   com um c:omposbo de fórmula:

   Ο ΟΝ 2§. — Processo de acordo com a Reivindicação 1, carac- terizado por se preparar a 2~ciclopentil-l-[4-(5H-imidazo [4, 5-c3-p i r i d i n.....5 - i 1 - rn e t i 1) f e n il ] e t a η o n a - 3§. — Processo de acordo com a Reivindicação 1, carac— terizado por se preparar a 2—ciclo—h®xil—2~ciclopentii—1--1.4--(tíH..... .....imidazo [ 4, 5-c ] piridin-5-il-metil) f enil J etan ona. 4§. — Processo de acordo corn a Reivindicação 1, carac— terizado por se preparar a 2™c:Lclo~h©xil~l“L4“( b’H-:imidazo|..4., b-c J..... pirídin-S-il-metil )fenil J -4-penten-l"Ona.. 5Ê.. — Processo de acordo corn a Reivindicação 1, carac— terizado por se preparar a 2-ciclo-hexii-l-|..4.....(5H-irnidazoL4, b-c ,.|..... pir idin-5-il-rnetil) f enil ] et anona. 8ã. — Processo para a preparação de urna composição farmacêutica útil no tratamento de doenças ou de distúrbios provocadas pela factar de activação de plaquetas, caraeterizado por se incluir na referida composição pelo pelo menos um composto de acordo cuin a Reivindicaçrão 1, ern conjunto corn um ou rnais suportes farmaceuticarnente aceitáveis não toxi oos 7§. - Processo de acordo com a Reivindicação 6, carac-terizado por o referido composto Ser selecc±onado a partir do grupo constituído por;: 2-cxclQpentil-l-[4-(5H-±midazo[4, 6-o Widin-6-il-wfcil)fenil]- etanona; 2-cxclo-hexil-2-ciclopentil-l-1.. 4- ( 5l+...:;i.midazo [4, 5...-0 ] piridin-5-i.l--rnetil) f enil J etanona; 2.....ciolo-hexil-1-1.. 4-- (5H.....imidazo ].. 4. 5-c J piridin~-5~il.....rnetil) fen il J -4- —penten.....1-ona; ou 2-ciclo-hexil-l.....[ 4- (SH-irnidazo |„ 4, 5-c J pir idin-5.....il-rnetil) f enil J - etanona.. 8Ê„ - Método para o tratamento de doenças ou de distúrbio© provocados pelo factor de activação de plaquetas, caracteri-zado por compreender a administração de urna dose terapeuticamente eficaz de pelo menos um composto, de acordo com a Reivindicação 1, a um mamífero com necessidade deste tratamento, sendo a gama de dosagem de desde cerca de 0, 1 ate 3000 rng por quilograma de peso corporal, por dia, em particular de desde cerca de 1 até 100 mg por quilograma de peso corporal por dia,, 9§„ ..... Método de acordo com a Reivindicação 6, caracte- rizado por o referido composto ser seleccionado a partir do grupo constituído por:: 2-ciclopentil-1- L 4— (SH-irnidazo L4, 5-c„| piridin-5-il-metil)fenil J -etanona 2--xd.oIo-hexi.l-2 ciclopentil 1- L4 (SH-irnidazo|.. 4, 5 c ] piridin 5 il- .....rnetil) f en il j e t an on a 2-ciclo-hexil-l-1.. 4.....(SH-irnidazo [4, 5-c J pir idin-5-il.....rnetil) f enil j -4- .....penten-1.....ona; ou 59 - ♦ τ

   VJ-
2. 2-ciclo-hexil.....1.....L 4--(5Η.....imidazoL 4, 5.....c.J piridin.....5--::11......inetil)f en: etancina. Lisboa, 1.2 de Setembro de 1990

   J. PEREIRA DA CRUZ Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 10-A 3» 1200 LISBOA