PT951837E - Péptidos bioactivos, seus usos e processo para a sua produção - Google Patents

Description

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Descrição "Péptidos bioactivos, seus usos e processo para a sua produção"

Campo da Invenção

Esta invenção diz respeito a composições à base de novos péptidos bioactivos que estimulam o crescimento de animais, a um processo para a sua preparação e à utilização de tais composições para estimular o crescimento de animais de sangue quente e peixes.

Antecedentes da Invenção É bem conhecido que a proteína de plasma porcino e bovino pode ser utilizada em formulações alimentares para animais de sangue quente para melhorar a saúde, crescimento e desempenho geral. Contudo, a necessidade para a substituição da tal proteína do plasma é de grande importância. O custo da proteína de plasma continua a aumentar à medida que a procura estrangeira e doméstica aumentam. Além disso, um fornecimento inadequado de proteína de plasma é um problema frequente. Também devido à preocupação de contaminar os animais hospedeiros através da alimentação com proteína de plasma começa a haver necessidade de um produto não plasmãtico que possa ser utilizado naquelas formulações em que a proteína do plasma, ou não se encontra disponível ou a sua utilização é impedida.

Além proteína proteicos uma disso, é bem conhecido que hidrolizados de preparados através da reacção de materiais seleccionados com pelo menos uma enzima 2 proteolítica podem também ser utilizados em formulações alimentares. Tais compostos existem geralmente em quantidades para maximizar o seu teor na formulação alimentar sem ter um efeito negativo no hospedeiro. Tais hidrolizados constituem um substituto da farinha de peixe como uma fonte proteica fornecendo assim valor nutricional, mas não disponibilizam nenhum outro benefício para o crescimento do hospedeiro.

Tarky et al. (J. of Food Science, vol. 38 (1973) p. 917-918) ensina a hidrolizar desperdícios de peixe utilizando pepsina.

Assim presentemente é experimentada uma necessidade de um substituto adequado do plasma como um ingrediente de formulações alimentares, assim como a necessidade para se conseguir uma estimulação do crescimento dos animais hospedeiros.

Sumário da Invenção A necessidade anteriormente mencionada, é satisfeita pela presente invenção através da disponibílízação de uma composição à base de um péptido bioactivo que não só fornece uma alternativa a produtos de plasma, mas que serve também para estimular o crescimento tanto de animais como de peixes.

De acordo com a presente invenção, é produzida uma composição de péptido bioactivo através da hidrólise enzimática de uma proteína utilizando enzima proteolítica derivada do bacalhau, especialmente dos estômagos do bacalhau do Atlântico. A presente invenção baseia-se na constatação de que o péptido obtido através de hidrólise enzimática de uma fonte proteica com a enzima pepsina derivada do estômago do bacalhau do Atlântico pode ser utilizado como um 3 substituto da proteína do plasma para conseguir a estimulação do crescimento de animais de sangue quente.

Num primeiro aspecto da presente invenção, é disponibilizado um processo para produzir composições à base de um péptido bioactivo que estimulam o crescimento de animais e peixes caracterizado por compreender; a) o tratamento de uma fonte proteica de peixe com um ácido b) fazer contactar a fonte de proteína tratada com ácido resultante, com a enzima de pepsina derivada de peixe; c) remover lípidos da fonte proteica acidificada tratada com pepsina; d) remoção de sólidos da fonte tratada com pepsina; e) recuperação das composições de péptido bioactivo resultantes.

Além disso, a presente invenção encontra-se também baseada na constatação de que tais produtos peptídicos podem ser utilizados em baixos níveis para estimular o crescimento de peixes.

Neste contexto, num aspecto da presente invenção é fornecido uma composição alimentar para animais que vai estimular o seu crescimento, contendo a dita composição uma composição à base de péptido bioactivo que consiste essencialmente numa mistura de péptidos possuindo um aminoãcido aromático na posição N terminal, produzida por hidrólise de uma fonte proteica de peixe a um pH de 2-6 com pepsina de peixe como enzima hidrolítica.

Num outro aspecto desta invenção é disponibilizado o uso de composições peptídicas obtidas, através do processo acima para aumentar o peso de animais de sangue quente e de peixes. 4

Outros aspectos, objectos e as várias vantagens desta invenção tornar-se-ão aparentes a partir da discussão anterior e das reivindicações em anexo. O termo composições à base de péptido bioactivo, quando aqui utilizado destina-se a definir uma composição que consiste essencialmente numa mistura de péptidos com um aminoácido aromático na posição N-terminal, produzido por hidrólise de uma fonte proteica a um pH de 2-6 com pepsinas de peixe como enzima hidrolítica. 0 produto peptidico bioactivo desta invenção é preparado através de um processo que compreende os passos de : (a) hidrolizar um material proteico seleccionado, disperso num meio aquoso, conjuntamente com pepsina de bacalhau a uma temperatura e pH acídico controlados; (b) remover lípidos e sólidos a partir da fonte proteica acidificada tratada com pepsina; e seguidamente (c ) recuperar o péptido bioactivo resultante. 0 processo utiliza material proteico de peixe. 0 processo desta invenção encontra-se particularmente adaptado a efectuar a hidrólise da proteína num meio acídico de pH controlado para produzir uma composição à base de péptido bioactivo adequada para utilização na estimulação do crescimento de animais hospedeiros. O material proteico é preparado para o tratamento por moagem, trituração, ou outros meios para disponibilizar um tamanho de partícula adequado para fazer uma mistura com ácido. A mistura aquosa é aquecida com agitação numa combinação de temperatura e tempo tal, que a velocidade de reacção de hidrólise inicial é maximizada. 5 A enzima utilizada neste processo da invenção é a enzima pepsina proteolítica derivada do estômago do bacalhau do Atlântico. Numa concretização presentemente preferida desta invenção a enzima é obtida, através de um processo que compreende a homogeneização do estômago de bacalhau na presença de ácido fõrmico em quantidade suficiente para baixar o pH para 4 e depois aquecendo durante um período de tempo em que o homogeneizado transforma-se numa dispersão líquida devido à digestão dos tecidos pelas enzimas presentes no estômago e depois recuperando-se a partir da fase aquosa seguindo-se a remoção da lama e de óleos, efectuando-se seguidamente a concentração e secagem da enzima pepsina desejada.

Durante a realização do processo o homogeneizado do estômago do bacalhau do Atlântico pode também ser utilizado como a fonte de enzima. Assim, a seguir à homogeneização do estômago do bacalhau na presença de ácido e à digestão dos seus tecidos pelas enzimas aqui presentes, a dispersão líquida resultante que é rica em enzima pode ser utilizada directamente no processo da presente invenção como fonte de enzima para a produção de péptidos bioactivos.

Na produção da composição de péptido bioactivo da invenção, uma fonte de proteína adequada é tratada a um pH na gama de cerca de 2-6, preferencialmente a um pH de 4, com a enzima pepsina derivada dos estômagos do bacalhau do Atlântico durante um tempo para efectuar a hidrólise da fonte de proteína de modo a formar uma mistura de péptidos possuindo aminoácidos aromáticos em posições N-terminais que após aquecimento e remoção posterior de óleos e lama deram origem a uma composição líquida que consiste essencialmente em péptidos bioactivos e pepsina de bacalhau desactivada. 6 O passo de hidrólise é efectuado num reactor de tanque continuamente agitado utilizando uma proporção entre enzima e substracto proteico seleccionada para obter o nível desejado de conversão num período de tempo de 24 a 100 horas.

Habitualmente a enzima é adicionada em quantidades na gama de 0,5 a 5 g por 1000 kg de proteína. O ácido utilizado no processo de hidrólise encontra-se numa quantidade para se ter normalmente 3% de volume por volume.

Após a remoção de óleos e sólidos não dissolvidos da dispersão do material proteico aquoso parcialmente hidrolizado, a fracção de hidrolizado proteico recuperada pode ser concentrada, tanto por osmose reversa, ou evaporação térmica e seca, ou por secagem por congelação, ou secagem por pulverização, e enviada para o armazém de produto para embalamento posterior e distribuição.

Enzima de pepsina adequada para a utilização numa concretização da presente invenção é obtida por hidrólise de estômagos de bacalhau do Atlântico a um pH na gama de 2-6. Após hidrólise, o hidrolizado resultante é sujeito a remoção de lípidos e sólidos seguida de ultrafiltração da mistura resultante de péptido líquido e pepsina para efectuar a recuperação da enzima pepsina a partir dela. A pepsina do bacalhau do Atlântico que é utilizada no processo desta invenção é uma enzima proteolítica preparada a partir do estômago de bacalhau do Atlântico (Gadus morhua) por autólise. A enzima possui uma actividade específica de 100-200 unidades Anson expressas em μ mol TCA -tirosina solúvel libertada da hemoglobina por hora a pH 3 e a 25°C.

Verificou-se que as composições produzidas pelo processo desta invenção possuem propriedades significativamente distintivas. Tais composições são 7 péptidos bioactivos que são capazes de estimular o crescimento quando incluídas em composições alimentares para animais hospedeiros.

Neste contexto, os péptidos bioactivos desta invenção são os mais adequados para fornecer um processo para a estimulação do crescimento de um animal, alimentando tal animal com uma quantidade do tal péptido bioactivo para efectuar uma estimulação do crescimento do animal hospedeiro. Em geral, tal estimulação do crescimento é conseguida quando o péptido bioactivo é introduzido no animal hospedeiro numa quantidade na gama de 0,1 a 5 g/kg de peso corporal por dia.

Formulações para alimentação utilizando composições do péptido activo desta invenção são adicionadas a ingredientes alimentares tradicionais para o animal hospedeiro desejado numa quantidade de péptido bioactivo que é suficiente para conseguir uma actividade de estimulação do crescimento.

Geralmente tais quantidades vão estar na gama de cerca de 0,1 a cerca de 5 por cento em peso da alimentação total, preferencialmente de cerca de 1 a 2%. A hidrólise enzimãtica da fonte proteica é normalmente efectuada a uma temperatura na gama de cerca de 10°C a cerca de 45°C e a um pH na gama de 2 a cerca de 6. Um pH é adequado é conseguido, através da utilização ou de ácido mineral, ou de um ácido orgânico, ou dos seus sais, que é adicionado antes da adição da pepsina. A quantidade de ácido utilizado é a que irá fornecer o nível de pH desejado.

Numa concretização presentemente preferida da invenção é utilizado um ácido carboxílico inferior nomeadamente ácido fórmico.

Matérias primas para a fonte proteica adequadas ao processo da presente invenção incluem: 8

Desperdícios de peixe incluindo peixe completo rejeitado, o peixe restante após terem sido feitos filetes, materiais solúveis de peixe, vísceras de peixe e quaisquer outros materiais que sejam produtos secundários da indústria do peixe e indústria transformadora.

Os exemplos seguintes irão ainda ilustrar o processo e produtos da invenção.

Exemplo I

Preparação da Enzima

Estômagos de bacalhau do Atlântico recolhidos nas fábricas de transformação são homogeneizados na presença de suficiente ácido fórmico para baixar o pH do homogeneizado para 4. O homogeneizado é então aquecido a 27 °C e mantido a esta temperatura durante 4 8 horas. Durante este período o homogeneizado torna-se uma dispersão líquida devido à digestão dos tecidos pelas enzimas presentes nos estômagos. A dispersão líquida é então armazenada num tanque em que uma lama se deposita gradualmente no fundo e um óleo flutua à superfície. A fase aquosa entre a lama e a camada de óleo é então concentrada por ultrafiltração (peso molecular de corte 10,000) e seca por pulverização a uma temperatura inferior à temperatura de inactivação para a enzima pepsina (65 ° C) . 0 pó resultante seco e amarelo contém cerca de 100-200 unidades Anson de actividade da protease medida através de ensaios padrão para a actividade de pepsina por ex. μ mol de tirosina libertada da hemoglobina por hora a pH 3 e 25 °C.

Exemplo II 9

Produção de Péptidos Bíoactívos Líquidos 1000 kg de produto secundário resultante do processamento de peixe, por ex. carne residual, espinhas, peles, vísceras, cabeças foram homogeneizados num moinho de carne industrial e foram adicionados 30 1 de ácido fórmico a 85% quando o homogeneizado foi bombeado para um tanque de armazenamento com equipamento de agitação.

Ao homogeneizado acidificado resultante foi adicionado 1 kg de enzimas do estômago do bacalhau que foi obtido de acordo com o protocolo do Exemplo I. A mistura resultante foi então mantida a 3 0 “C durante um período de cerca de 5 dias para se conseguir uma degradação enzímãtica dos produtos enzimáticos acidificados. A seguir o produto resultante da digestão foi aquecido a uma temperatura de 80 °C para inactivar a enzima adicionada e para permitir ao óleo que se encontrava presente nas matérias primas de flutuar até à superfície para ser removido. Após remoção do óleo por centrifugação numa centrífuga industrial e remoção das espinhas não dissolvidas por filtração foram obtidos 850-950 litros de uma dispersão aquosa que foi depois concentrada por evaporação até 4 0% de peso seco e um volume final de 250-350 litros. 0 produto concentrado resultante contendo 20% em volume de proteína não digerida e 70% em peso de péptido e 10% de minerais é designado por péptido em bruto líquido ou "LCP" do inglês liquid crude peptide.

Exemplo III

Produção de Péptido Bioactivo Seco 10 100 litros de péptído bruto líquido do Exemplo II foi seco por pulverização num secador de pulverização NIRO com uma temperatura do ar de saída de 80°C, para disponibilizar 40 kg de pêptido em bruto seco "DCP" do inglês dried crude peptide contendo proteína não digerida, péptidos e aminoãcídos.

Exemplo IV

Produção de Péptidos Refinados "RBP" 400 litros de LCP produzidos como descrito no Exemplo II foram sujeitos a uma filtração de partículas convencional utilizando uma unidade de filtro de saco, para fornecer 250 litros de uma solução livre de partículas maiores do que 40 μ. Depois o filtrado resultante foi sujeito a ultrafiltração numa unidade de filtração de cartucho de fibra oca (Amicon) com um peso molecular de corte de 10,000 para fornecer 200 litros de um permeado contendo péptidos com um peso molecular inferior a 10,000. O péptido bioactivo refinado "RBP" do inglês refined bioactive peptide resultante pode ser utilizado na forma líquida. Contudo, 200 litros de RBP foram secos por secagem por pulverização num secador Niro a 85 °C (ar de saída) para fornecer 80 kg de RBP na forma seca.

Exemplo V

Preparação de Composições Alimentares

Foram preparados uma série de composições alimentares teste utilizando o péptido seco refinado produzido como no Exemplo IV utilizando uma formulação dietética padrão possuindo o teor de péptido como 11 indicado na tabela seguinte. Para avaliação de desempenho uma outra série de composições de alimentação foram preparadas da mesma maneira com proteína de plasma porcino. N° da composição 1 2 3 4 5 6 7 Período de alimentação 0-13 dias Proteína de plasma % 0 4 3 2 1 0 0 Péptido refinado % 0 0 1 2 3 4 2 Período de alimentação 13-33 dias Proteína do plasma % 0 0 0 0 0 0 0 Péptido refinado % 0 0 0 0 0 2 1

Exemplo VI 0 Efeito de RBP e da Proteína de Plasma Porcino

Para determinar o efeito do péptido (RBP) e do plasma porcino no desempenho do crescimento de suínos na fase inicial foi efectuada uma série de tratamentos utilizando as formulações do Exemplo V com 7 canetas de 22 suínos individuais de fases iniciais.

Os resultados dos tratamentos alimentares são indicados na tabela seguinte: 12

Composi-ção do tratamen to 1 2 3 4 5 6 7 Peso inicial (kg) 5,91 5 , 90 5 , 91 5 , 91 5 , 91 5 , 91 5,91 Dia 13 7 , 58 8,18 8 , 53 8,29 9,17 8,94 8,23 Dia 33 16,24 16,24 17 , 04 16,85 17,94 16,49 17,8 Ganho de peso (kg) 0-13 dias 1,67 2,28 2,62 2,37 3,26 3,03 2,32 0-33 dias 10,33 10,34 11,13 10,94 12,03 10,58 11,89 Ganho de peso (%) 0-13 dias 23 38 44 40 55 51 39 0-33 dias 175 175 188 185 204 179 201 Proteína consumi -da/ ganho de peso 0,32 0,27 0,27 0,29 0,26 0,26 0,27

Os resultados acima mostram que a utilização do péptido bioactivo da presente invenção possui um efeito marcado no crescimento de suínos jovens e que este produto pode substituir as proteínas do plasma em dietas iniciais. A um nível de 2% nas dietas iniciais o péptido bioactivo (RBP) provoca a mesma estimulação do crescimento que 4% da proteína do plasma porcino durante os primeiros 13 dias após desmame.

Ao contrário da proteína do plasma, o péptido bioactivo da presente invenção resulta numa estimulação do crescimento, através do período de crescimento completo desde o desmame dos suínos e os 33 dias seguintes.

Exemplo VII

Preparação de Composições Alimentares de Peixe 13

Uma composição para utilizar como alimentação para salmão foi preparada misturando os ingredientes seguintes:

Ingrediente % de Peso Seco Farinha de peixe (seca a temperatura baixa) 44 Farinha de peixe (qualidade normal) 19 Óleo de peixe 20 Farinha de trigo 14 Amido de batata 2 Vitamina C 0,1 Pré-mistura (minerais e vitaminas) 1,0 Cor de rosa de carofila (astaxantina) 0,1 Composição química Matéria seca 96% Proteína .....................1 í in NJ o\o Lípidos 21% Minerais 10%

Para demonstrar a eficácia do péptido bioactivo na alimentação de salmão, foi preparada uma composição em que 5% da farinha de peixe foi substituída por 5% de péptido em bruto seco bioactivo (DCP).

Exemplo VIII

Efeito de DCP no Crescimento do Salmão

Salmões (Salmo salar) com um peso individual de 600 g foram separados em duas gaiolas de redes no mar com 100 14 peixes em cada gaiola. Um grupo foi alimentado com alimentação padrão de salmão do Exemplo VII e o outro grupo com a mesma alimentação contendo 5% de DCP.

Após alimentação durante 6 meses o salmão alimentado com a alimentação padrão possuía um peso médio de 2,280 kg, enquanto que o salmão alimentado com a dieta com 5% de DCP possuía um peso médio de 2630 kg. O crescimento do grupo de referência durante este período de alimentação era por outras palavras a partir de um peso individual médio de 600 g de 2,280 g, ou 1,680 gramas, em que o grupo contendo DCP cresceu de 600 gramas a 2,630 gramas, ou 2,030 gramas. A comparação do crescimento entre os dois grupos indica que a utilização do produto da presente invenção foi conseguido com um peso 12% superior em relação aqueles peixes que não receberam o péptido bioactivo (DCP).

Lisboa, 27 de Dezembro de 2007

Claims (13)

1 Reivindicações 1. Processo para a produção de composições â base de péptido bioactivo que estimulam o crescimento de animais e peixes caracterizado por compreender: a) o tratamento de uma fonte proteica de peixe com um ácido b) fazer contactar a fonte de proteína tratada com ácido resultante com a enzima de pepsina derivada de peixe; c) remover lípidos da fonte proteica acidificada tratada com pepsina; d) remoção de sólidos da fonte de tratada com pepsina; e) recuperação das composições à base de péptido bioactivo resultantes.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dito ácido ser um ácido mineral seleccionado a partir do grupo que consiste em ácido clorídrico, fosfórico, e sulfúrico, ou os seus sais.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dito ácido ser um ácido orgânico seleccionado a partir do grupo que consiste em ácido fórmico, acético, propiónico, e cítrico, ou seus sais.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a dita enzima pepsina ser derivada do estômago do bacalhau do Atlântico.

5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o dito contacto com a enzima pepsina ser efectuado em condições adequadas para efectuar a 2 formação de péptidos bioactivos possuindo aminoácidos aromáticos na posição N-terminal.

6. Processos caracterizado por o passo (a) ser efectuado a um pH na gama de 2-6, a uma temperatura na gama de 10°C a 60 °C durante um tempo suficiente para efectuar a formação do péptido,

7. Composição de péptido bioactivo com um efeito estimulante do peso obtido pelo processo definido por uma ou várias das reivindicações 1-6.

8. Composição de acordo com a reivindicação 7, mas apenas na medida em que ê obtida através do processo definido por uma ou várias das reivindicações 1-5, caracterizado por consistir essencialmente numa mistura de péptidos com um amínoácido aromático na posição N-terminal seleccionado a partir do grupo que compreende a tirosina e fenilalanina, consistindo os ditos péptidos em menos do que cerca de 100 unidades de aminoácidos e possuindo um peso molecular inferior a 10,000 e sendo produzidos por hidrólise enzimática da fonte de proteína com pepsina derivada de peixe a um pH na gama de 1-6.

9. Composição alimentar para animais que vai estimular o seu crescimento, contendo a dita composição uma composição à base de péptido bioactivo que consiste essencialmente numa mistura de péptidos com um amínoácido aromático na posição N-terminal produzidos por hidrólise enzimática de uma fonte de proteína de peixe a um pH na gama de 2-6 com pepsina derivada de peixe como enzima hidrolítica. 3

10. Composição alimentar de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por a dita composição à base de péptido bioactivo se encontrar presente numa quantidade na gama de 0,1 a 5 por cento em peso.

11. Uso de uma composição à base de péptido de acordo com a reivindicação 7, para aumentar o peso de peixe e de animais de sangue quente.

12. Uso de uma composição à base de péptido de acordo com a reivindicação 7, para a produção de uma composição alimentar ou de um suplemento alimentar.

13. Uso de uma composição à base de péptido de acordo com a reivindicação 7, numa composição alimentar em que a dita composição à base de péptido bioactivo se encontra presente numa quantidade na gama de 0,1 a 5 por cento em peso da dita alimentação. Lisboa, 27 de Dezembro de 2007