CN104211755B - 一种畜禽血中生物活性肽BAPs的提取方法及生物活性肽BAPs和应用 - Google Patents

Abstract

一种畜禽血中生物活性肽BAPs的提取方法，该方法包括对新鲜畜禽血抗凝，分离出血浆和血红蛋白溶液，合并后依次加入第一种蛋白变性剂、二硫键还原剂、第二种蛋白变性剂，通过精确控制水解条件达到限量水解目标，获得无异味的BAPs。该产品剂型多样，性能稳定，经压力蒸汽灭菌，常温贮存，无菌有效期可达2年以上，贮存、运输方便。该生物活性肽应用于美容医学治疗痤疮，有效率达90%以上，还可广泛用于开发肽类试剂、肽类药物以及功能食品和食品添加剂等；本发明方法大大简化了工艺流程、降低生产成本、提高产品质量和产量，BAPs含量高达100g/L左右，回收率在70%以上，适应规模化生产，原料来源充足，易于形成产业化。

Description

一种畜禽血中生物活性肽BAPs的提取方法及生物活性肽BAPs 和应用

技术领域

本发明属于生物活性肽（bioactive peptides, BAPs）技术领域；具体涉及一种畜禽血中生物活性肽BAPs的提取方法及生物活性肽BAPs和应用。

背景技术

畜禽血来源广泛，其中蛋白质含量约19%，营养丰富，与畜禽肉相近，故有“液体肉”之美誉，具有很高的生物效价。畜禽血经抗凝可分离出约60%的血浆（含蛋白质约8%）和约40%的血细胞（主要为红细胞，含蛋白质约36%）。红细胞经溶血后释放出血红蛋白，约占全血蛋白质总量的75%。畜禽血蛋白质不但氨基酸组成平衡，必需氨基酸含量达50%以上，而且这些蛋白质一级结构的肽链中含有一些在组织水平上引起机体生物学效应的活性肽，如阿片样肽、抗氧化肽、抗菌肽、血管紧张素转换酶抑制肽等。新鲜畜禽血中的蛋白质通过限量水解处理后，可以将在母体蛋白中那些没有体现生物学活性的肽段释放出来，获得对机体具有降血压、抗氧化、抗菌消炎和增强免疫活性等生物学效应的活性肽及其它一些肽链长度不等的肽类混合物。该肽类混合物不仅能提供人体组织生长所需的营养物质，同时还具有抗感染、抗衰老、调节人体生理机能的功效。因而有可能从畜禽血中生产出满足人们特定需求的活性肽，为人类更充分地利用蛋白质资源开辟一条新的途径。

几十年来，人们对畜禽血，特别是猪血的利用，一直在进行不断地开发。开始还只是以少数制作血豆腐、猪血饼、血面条和用于肉类似物、香肠、布丁等的配方中，继后有一小部分被加工成血粉或发酵血粉，作为饲料添加剂和用于生化制药，生产血红素、蛋白胨等。由于其色泽不好，血腥味重，适口性差等原因，我国对猪血的利用率并不高，相当大一部分被废弃，既造成巨大浪费，又污染环境。

随着蛋白肽理论的发展和人们对畜禽血化学成分认识的深入，相继发现：①畜禽血蛋白质经酶促限量水解后主要以小分子肽的形式存在，比完全游离的氨基酸更易、更快被机体吸收利用，这是肽理论和实践的重大突破。这些小分子肽易溶解、低黏度、抗凝胶形成性、免消化、能完整地通过肠道直接吸收，适用于不能消化和吸收完整蛋白质的肾病、胃病和肝病等病人，可以作为他们膳食中蛋白质的主要形式；②小分子肽抗原性低，可以避免完整蛋白引起的免疫调节过敏反应，对人体无过敏性，不会增加肝脏和肾脏的负担；③血红蛋白和血浆蛋白酶解产物中含有阿片样肽、抗氧化肽、抗菌肽、血管紧张素转换酶抑制肽、免疫调节肽、促进钙吸收的酪蛋白磷酸肽、抗血栓肽等活性肽，具有对人体的心血管系统、消化系统、免疫及神经等系统产生重要的生理调节作用。

近20多年来，人们在不断地致力于探索寻找一种合适的方法，对畜禽血进行处理制备小分子活性肽。随着生物酶技术的迅速发展，利用蛋白酶水解畜禽血以提高其利用率的研究也越来越多，可供选择水解畜禽血的蛋白酶种类也多。由于蛋白酶作用存在专一性，单一的蛋白酶对一种蛋白质的水解效果往往有一定的局限性，而且在酶解过程中产生了大量疏水性氨基酸外露的小肽，使得酶解产物具有很重的苦味，严重限制了该方法的使用和推广。为了达到较高的水解效果，以降低成本，提高经济实用性，人们探讨了各种因素对复合酶水解畜禽血红蛋白的影响，对获得的某些活性肽进行分离、纯化、测定。所有这些工作基本上都集中在对血红蛋白的开发研究上，对占全血总蛋白约25%的血浆蛋白并未见有报导，基本都被废弃浪费。实际上血红蛋白与血浆蛋白合并，制备混合蛋白水解产物，这才是目前国内外畜禽血综合利用的主要方向。在欧洲、日本等发达国家，猪血的利用率已经达到50%以上，他们主要是开发肽类试剂、肽类药物以及功能食品和食品添加剂。

尽管前段人们对畜禽血常用的酶解工艺进行了一些改进，也取得了一定的效果，但真正推广的成果并不多。即便有成果转化为产品的，规模也不大。究其原因，主要存在有以下几个方面的问题。

（1）酶的产量有限，成本较高：酶的制备主要有直接提取和微生物发酵两种方法。直接提取法一般是以动植物作为原料，从中直接提取；微生物发酵法是利用微生物发酵来生产。直接提取法由于动植物生长周期长，又受地理、气候和季节等因素的影响，原料来源受到限制，酶产量有限，生产成本较高；微生物发酵法虽然酶产量较大，生产成本也较低，但由于蛋白酶作用存在专一性，单一种酶往往对一种蛋白质的水解有一定的局限性。在实际应用中，为了获得较好的水解率，往往需要采用数种酶共同作用。因此，微生物发酵生产的酶还不能完全替代直接提取法制备的某些酶。

（2）生产周期长，工艺繁琐：酶解时间一般需要8小时以上，有的甚至长达20多小时；每种酶都有各自的最适pH值，而酶解液的pH值随着酶解反应中游离氨基含量逐渐升高而改变，在生产过程中需要不断地调整酶解液的pH值。因此，很难发展成规模化生产。

（3）产物浓度低，增加了后续处理的困难和成本：在酶解反应的初始阶段，随着底物浓度的提高酶解反应速度加快，但当底物浓度超过酶解平衡点后，反而抑制了酶解反应的进行。为保证较高的底物水解率和酶解反应速度，一般选择在30～80g/L作为最适的底物浓度。因此，酶解反应液中目标产物含量低，必须进行浓缩处理。一般先采用微滤澄清，再采用超滤浓缩，这样显然大大增加了生产工艺的难度和成本。

（4）产品去味、脱色存在损耗、成本和安全等问题：畜禽血的酶解液有较重的苦腥味，适口性差，气味难闻，加上血红素的存在，颜色呈棕褐色，产品必须进行去味、脱色处理。国内外的一些资料介绍，去味脱色一般采用：①活性炭吸附技术，活性炭虽然成本不高，脱色去味效果也比较满意，但产物的损耗率高达60%；②大孔树脂、羧甲基纤维素法，此法成本较高，不适用于工业化生产；③过氧化氢氧化法，此法不可避免地会使某些目标产物肽氧化，而且残留的过氧化氢会影响到医药和食品的安全。

因此，很有必要探寻一种高效的水解提取方法，对畜禽血蛋白进行精确控制的限量水解，将在母体蛋白中那些没有体现生物学活性的肽段释放出来，提取出具有前述各种生物学功能的生物活性肽类物质，为解决畜禽血在医药、试剂和功能食品的规模化生产奠定基础。

如前所述，畜禽血不但富含蛋白质，营养价值高，而且选择性的酶解提取物——活性肽具有某些生物学功能，国内外的研究和应用主要是开发肽类试剂、肽类药物以及功能食品和食品添加剂。经检索尚未发现有在美容医学领域中应用于治疗痤疮的报导。

痤疮又称青春痘、暗疮，是好发于青春期的一种累及毛囊皮脂腺的慢性炎症性皮肤病。临床表现为粉刺、丘疹、脓疱、结节、囊肿，多见于面部、胸背部等皮脂溢出区。治疗不当容易遗留瘢痕和色素沉着等损容性的皮肤损害，严重影响患者的身心健康。痤疮的发生是多种因素综合作用的结果，主要是由于皮脂分泌过多，雄激素分泌增高或雄、雌激素水平失衡，毛囊皮脂腺导管角化过度及痤疮丙酸杆菌增殖所致，其中痤疮丙酸杆菌在痤疮的多个致病环节中起重要作用。

痤疮丙酸杆菌是一种革兰染色阳性的厌氧菌，是一种细胞内寄生菌，它可以分泌蛋白质、酶、脂多糖等成分，也可刺激机体产生抗体，所有这些都能作为致病因素。在稳定生长阶段的痤疮丙酸杆菌可以刺激单层角质形成细胞产生大量的IL-1α、TNF-α和GM-CSF，这些细胞因子可以趋化炎细胞到毛囊周围，引起炎症损伤，是炎性寻常型痤疮的发病机理之一。痤疮丙酸杆菌还可以在没有任何刺激的条件下产生大量的细胞内卟啉，主要是粪卟啉。在紫外线照射下，皮肤表面的痤疮丙酸杆菌粪卟啉可以产生活性氧，导致严重的皮肤损害。

目前，市场上对痤疮的治疗可谓种类繁多，然而美容医学研究发现，由于抗生素的不恰当使用，导致了大量的对传统抗生素耐药性痤疮丙酸杆菌的出现，很大程度上影响了治疗效果。因此，开发天然的不易耐药和安全性高的外用抗痤疮丙酸杆菌药物，成了治疗痤疮的主要手段之一。痤疮丙酸杆菌的生长繁殖必须有一个厌氧的环境，而毛囊皮脂腺导管角化过度，再加上皮脂分泌过多，使毛囊细胞粘连且不能正常移行于皮肤表面，形成适合痤疮丙酸杆菌生长繁殖的局部厌氧环境，其结果导致痤疮久治难愈，而且容易复发。因此，根治痤疮不但要杀灭痤疮丙酸杆菌，而且还要铲除其生存和继续繁殖的厌氧环境。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效的、适用于规模化生产的畜禽血(包括血浆蛋白和血红蛋白)中生物活性肽BAPs的提取方法。

本发明的目的还在于提供利用上述生物活性肽BAPs的提取方法制备获得的生物活性肽。

本发明的最后一个目的在于提供上述畜禽血中生物活性肽BAPs在医学美容中治疗痤疮的应用。

本发明的关键技术在于：

1、应用蛋白变性剂和二硫键还原剂对畜禽血蛋白进行水解的过程中，通过精确控制水解条件达到限量水解目标，即既能将那些在母体蛋白中没有体现生物学活性的肽段最大限度地释放出来，又不至于水解过度使释放出来的这些具有生物学活性的肽段再失去活性；

2、用生物化学方法取代活性炭吸附、微滤和超滤方法，将血红素与目标产物分离，大大简化生产工艺，提高产品的质量和产量，降低生产成本，以适应规模化生产。

本发明的第一个目的是通过以下技术方案来实现的：一种畜禽血中BAPs的提取方法，包括以下步骤：

（1）采取新鲜畜禽血，加入抗凝剂，混匀抗凝，离心，分离血浆和含红细胞的不溶物，分别收集；

（2）向步骤（1）所得的含红细胞的不溶物中加入纯水，搅匀后进行冷冻处理，解冻后再进行均质处理或超声波处理，彻底破碎红细胞，使血红蛋白溶出，离心，除去含红细胞膜碎片的不溶物，收集血红蛋白溶液；

（3）将步骤（1）所得血浆和步骤（2）所得血红蛋白溶液合并，加入第一种蛋白变性剂至终浓度为0.5~5.0 mol/L，70～100℃处理3～5小时，冷却至室温；

（4）向步骤（3）所得反应产物中加入二硫键还原剂至终浓度为0.2～0.5mmol/L，80～100℃处理20～40min，冷却至室温，用透析法除去反应后产物中残留的试剂；

（5）向步骤（4）所得反应产物中加入第二种蛋白变性剂至终浓度为0.3～0.8mol/L，105～125℃蒸汽压力中处理10～30min，冷却至室温；

（6）用酸试剂调节步骤（5）所得反应产物的pH为3.0～4.2，静置，收集上清液；

（7）用碱试剂调节步骤（6）所得上清液的pH为6.8～7.2，获得无异味的微黄色生物活性肽BAPs；

（8）将步骤（7）所得生物活性肽BAPs灭菌，制得畜禽血液相剂型生物活性肽BAPs；

（9）将步骤（8）所得畜禽血液相剂型BAPs进行干燥处理，制得畜禽血固相剂型生物活性肽BAPs。

在上述畜禽血中BAPs的提取方法中：

步骤（1）中所述的畜禽血优选为猪血、牛血或鹅血等；所述的抗凝剂优选为柠檬酸钠、柠檬酸钾或草酸钾等，添加量优选为0.35~1.20kg/每100L新鲜畜禽血；离心时的离心力优选为2000~2500×g，离心时间优选为5~10min。

步骤（2）中纯水的加入量优选为含红细胞的不溶物总体积的5~15%，冷冻处理的温度优选为-15℃～-25℃，冷冻处理的时间优选为6～24h；均质处理的压力优选为40～80Mpa，处理时间优选为5～10min；超声波处理的功率优选为800～1500W，处理时间优选为5～10min；离心时的离心力优选为3000～4000×g，离心时间优选为10～20min。

步骤（3）中所述的第一种蛋白变性剂优选为N₂H₄CO、C₁₂H₂₅SO₄Na或CH₆ClN₃；步骤（4）中所述的二硫键还原剂优选为C₃H₇NO₂S、C₄H₁₀O₂S₂或C₄H₄S₂O₄Na₂（二巯基丁二酸钠）。

步骤（5）中所述的第二种蛋白变性剂优选为KOH、NaOH或Ca(OH)₂，步骤（6）中所述的酸试剂优选为HCl、H₂SO₄、 HClO₄或Cl₃C₂O₂H，步骤（7）中所述的碱试剂优选为NaOH、KOH 或Ca(OH)₂。

经步骤（3）~（7）处理，畜禽血的蛋白水解率控制在20~24%。

步骤（8）中灭菌处理优选采用在120~125℃蒸汽中高压15~25min，进一步优选在121℃蒸汽中高压20min，制得畜禽血液相剂型生物活性肽BAPs。

步骤（9）中干燥处理可以采用冷冻干燥或喷雾干燥，优选喷雾干燥。

蛋白水解率通过以下公式计算：蛋白水解率（%）＝ (TAN_产物－TAN_原料)/ (TN_原料－TAN_原料)×100， BAPs提取物回收率（%）= TBAPs/TPr_原料×100，其中TAN_产物指用甲醛滴定法测定的步骤（7）中生物活性肽BAPs氨基氮总含量，TAN_原料是指用甲醛滴定法测定的步骤（3）中血浆与血红蛋白溶液合并原料中氨基氮总含量，TN_原料是指步骤（3）中血浆与血红蛋白溶液合并原料中蛋白氮总含量，TN_原料= TPr_原料×16%（蛋白质中平均氮含量为16%），TPr_原料是指用双缩脲法测定的步骤（3）中血浆与血红蛋白溶液合并原料中蛋白总含量，TBAPs是指用双缩脲法测定的步骤（7）中所得生物活性肽BAPs总含量。

蛋白水解率可作为控制和调整蛋白水解条件的指标，以求达到限量水解目标；BAPs提取物回收率可作为优化和改进生产工艺的指标，以求达到最大限度收益。

本发明的第二个目的是通过以下技术方案来实现的：利用上述畜禽血中生物活性肽BAPs的提取方法制备获得的生物活性肽BAPs。

本发明的最后一个目的是通过以下技术方案来实现的：上述生物活性肽BAPs在美容医学领域中制备具有治疗痤疮功效的药物中的用途。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：大大简化了工艺流程，降低了生产成本，提高了产品的质量和产量，其中生物活性肽BAPs含量高达100g/L左右，回收率在70%以上，能适应规模化生产，原料来源充足，易于形成产业化。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步详细说明本发明，以下原料如无特殊说明，均为市售产品。

实施例1

本实施例提供的猪血中生物活性肽BAPs的提取方法，包括以下步骤：

（1）检疫合格的新鲜猪血50L，加入柠檬酸钠180g，混合均匀抗凝，离心力2400×g离心6min，分离血浆和红细胞等不溶物，分别收集；

（2）向步骤（1）处理所得红细胞等不溶物中加入纯水2L，搅拌均匀，置-23℃冷冻20h，解冻后用超声波机，功率1200W超声处理10min，彻底破碎红细胞，使血红蛋白溶出，离心力3900×g离心12min，除去红细胞膜碎片等不溶物，收集血红蛋白溶液；

（3）将步骤（1）处理所得血浆与步骤（2）处理所得血红蛋白溶液合并，加入N₂H₄CO至终浓度3.5mol/L，95℃处理4.5小时，冷却至室温；

（4）向步骤（3）处理所得产物中加入C₃H₇NO₂S至终浓度0.24mmol/L，98℃处理38min，冷却至室温，用透析法除去反应后产物中残留的N₂H₄CO和C₃H₇NO₂S；

（5）向步骤（4）处理所得产物中加入KOH至终浓度0.72mol/L，在106℃压力蒸汽中处理25min，冷却至室温；

（6）对步骤（5）处理所得产物用C₂HCl₃O₂调pH至3.4，静置，收集上清液；

（7）对步骤（6）处理所得上清液用KOH调pH至7.1，得无异味的微黄色BAPs提取物，经测定，蛋白水解率为23.6%，BAPs提取物含量为102.7g/L，BAPs提取物回收率为72.7%；

（8）对步骤（7）处理所得BAPs提取物，在121℃蒸汽中高压20min灭菌，制得猪血液相剂型BAP；

（9）对步骤（8）处理所得猪血液相剂型BAPs喷雾干燥，制得猪血固相剂型BAPs。

蛋白水解率和BAPs提取物回收率的计算方法如下（以下实施例同）：

用双缩脲法测定步骤（3）血浆与血红蛋白溶液合并原料中蛋白总含量（TPr_原料），TPr_原料×16%（蛋白质中平均氮含量为16%）＝ TN_原料（原料中蛋白氮总含量），用甲醛滴定法测定步骤（3）血浆与血红蛋白溶液合并原料中氨基氮总含量（TAN_原料）；用双缩脲法测定步骤（7）处理所得产物中BAPs提取物总含量（TBAPs），用甲醛滴定法测定步骤（7）处理所得产物BAPs提取物中氨基氮总含量（TAN_产物）；

蛋白水解率（%）＝ (TAN_产物－TAN_原料)/ (TN_原料－TAN_原料)×100

BAPs提取物回收率（%）＝TBAPs/ TPr_原料×100；

实施例2

本实施例提供的牛血中BAPs提取物的提取方法，包括以下步骤：

（1）检疫合格的新鲜牛血10L，加入柠檬酸钾37g，混合均匀抗凝，离心力2300×g离心7min，分离血浆和红细胞等不溶物，分别收集；

（2）向步骤（1）处理所得红细胞等不溶物加入纯水400mL，搅拌均匀，置-20℃冷冻12h，解冻后用均质机在压力60Mpa下均质处理8min，彻底破碎红细胞，使血红蛋白溶出，离心力3800×g离心15min，除去红细胞膜碎片等不溶物，收集血红蛋白溶液；

（3） 将步骤（1）处理所得血浆与步骤（2）处理所得血红蛋白溶液合并，加入CH₆ClN₃至终浓度4.0mol/L，72℃处理4.0小时，冷却至室温；

（4）向步骤（3）处理所得产物中加入C₄H₁₀O₂S₂至终浓度0.37mmol/L，92℃处理27min，冷却至室温，用透析法除去反应后产物中残留的CH₆ClN₃和C₄H₁₀O₂S₂；

（5）向步骤（4）处理所得产物中加入NaOH至终浓度0.48mol/L，在124℃高压蒸汽中处理15min，冷却至室温；

（6）对步骤（5）处理所得产物用HClO₄调pH至4.0，静置，收集上清液；

（7）对步骤（6）处理所得上清液用KOH调pH至6.9，得无异味的微黄色生物活性肽BAPs，经测定，蛋白水解率为21.8%，生物活性肽BAPs含量为101.2g/L，生物活性肽BAPs回收率为70.9%；

（8）对步骤（7）处理所得生物活性肽BAPs，在121℃蒸汽中高压20min灭菌，制得牛血液相剂型生物活性肽BAPs；

（9）对步骤（8）处理所得牛血液相剂型生物活性肽BAPs喷雾干燥，制得牛血固相剂型生物活性肽BAPs。

实施例3

本实施例提供的鹅血中BAPs提取物的提取方法，包括以下步骤：

（1）检疫合格的新鲜鹅血5L，加入草酸钠50g，混合均匀抗凝，离心力2100×g离心8min，分离血浆和红细胞等不溶物，分别收集；

（2）向步骤（1）处理所得红细胞等不溶物中加入纯水200mL，搅拌均匀，置-18℃冷冻8h，解冻后用均质机在压力60Mpa下均质处理7min，彻底破碎红细胞，使血红蛋白溶出，离心力3500×g离心18min，除去红细胞膜碎片等不溶物，收集血红蛋白溶液；

（3）将步骤（1）处理所得血浆与步骤（2）处理所得血红蛋白溶液合并，加入C₁₂H₂₅SO₄Na至终浓度0.6mol/L，85℃处理3.6小时，冷却至室温；

（4）向步骤（3）处理所得产物中加入C₄H₄S₂O₄Na₂至终浓度0.45mmol/L，84℃处理30min，冷却至室温，用透析法除去反应后产物中残留的C₁₂H₂₅SO₄Na和C₄H₄S₂O₄Na₂。

（5）向步骤（4）处理所得产物中加入Ca(OH)₂至终浓度0.32mol/L，在115℃压力蒸汽中处理20min，冷却至室温；

（6）对步骤（5）处理所得产物用HCl调pH至3.8，静置，收集上清液；

（7）对步骤（6）处理所得上清液用NaOH调pH至7.0，得无异味的微黄色生物活性肽BAPs，经测定，蛋白水解率为22.5%，生物活性肽BAPs含量为99.6g/L，生物活性肽BAPs回收率为70.1%；

（8）对步骤（7）处理所得生物活性肽BAPs，在121℃蒸汽中高压20min灭菌，制得鹅血液相剂型生物活性肽BAPs；

（9）对步骤（8）处理所得鹅血液相剂型生物活性肽BAPs喷雾干燥，制得鹅血固相剂型生物活性肽BAPs。

应用实施例1 制得的猪血固相剂型BAPs对痤疮丙酸杆菌的抑菌效果观察

改良的GAM琼脂培养基，115℃蒸汽中高压15min灭菌，加入5%羊血，倾倒在平板培养皿内，以此用作冻干菌株的复苏平板。利用平板划线法将痤疮丙酸杆菌冻干菌株( ATCC11827)接种至复苏平板内，37℃厌氧培养 72h后，挑取单个生长的菌落用生理盐水稀释成0.5个麦氏单位(约为1.5×10⁸cfu/mL)浓度的菌悬液。

通过无菌操作，取实施例1制得的猪血固相剂型BAPs用灭菌蒸馏水溶解，调整含量为10mg/mL。取无菌试管8支，依次编为1～8号。在第1，3～8管中各加灭菌蒸馏水3mL，在第2、3管中各加上述BAPs溶液 3mL，第3～7管依次作倍比稀释，即第3管溶液混匀后，吸取3mL加入第4管，第4管溶液混匀后，吸取3mL加入第5管，如此一直到第7管，第7管溶液混匀后吸取3mL弃掉。将改良GAM琼脂培养基加热熔化，吸取12mL加入上述各试管，混匀后倾注于与试管编号对应的1～8号平板中。使第2～7号琼脂平板BAPs的倍比稀释度分别为1:5，1:10，1:20，1:40，1:80，1:160，BAPs浓度分别为2.00，1.00，0.50，0.25，0.13，0.06mg/mL；另取罗红霉素用灭菌蒸馏水溶解至浓度为2.5mg/mL，按上述方法制备参照组平板，得第2～7号参照琼脂平板罗红霉素浓度分别为500，250，125，62.5，31.3，15.6µg/mL。

1号平板为阴性对照（未点种痤疮丙酸杆菌），8号平板为阳性对照（不含BAPs或罗红霉素）。将制备好的菌悬液2µL点种于2～8号平板的表面，置厌氧环境中37℃培养48h后，将平板置于暗色、无反光物体表面，观察能够完全抑制痤疮丙酸杆菌生长的最低药液浓度，作为对痤疮丙酸杆菌的最低抑菌浓度(MIC) 。结果见表1和表2。

表1 BAPs对痤疮丙酸杆菌的抑菌作用

表2 罗红霉素对痤疮丙酸杆菌的抑菌作用

表1结果显示，BAPs对痤疮丙酸杆菌的MIC是0.50 mg/mL，表2结果显示，罗红霉素对痤疮丙酸杆菌的MIC是62.5µg/mL。结果表明猪血限量水解提取物BAPs对引起痤疮的主要致病菌存在明显的抑制作用。而且BAPs作为纯生物材料制剂，不同于西药抗生素，细菌对其不易产生耐药性。

应用实施例3 制得的鹅血液相剂型BAPs治疗痤疮患者46例的临床观察

寻常性座疮患者46例，年龄18～30岁，平均年龄23.6岁，其中男性患者24例，女性患者22例，病程6～25月，平均14.3月。所有患者诊断符合国际改良分级法寻常性座疮诊断标准，近1个月内未使用抗生素或抗痤疮药物。皮损分级标准：Ⅰ级，主要皮损为粉刺，有少量丘疹和脓疱，病灶数小于30个；Ⅱ级，有粉刺，并有中等数量的丘疹和脓疱，总病灶数在31～50个之间；Ⅲ级，有大量丘疹和脓疱，皮损分布广泛，偶见大的炎症皮损，总病灶数在51～100个之间，结节小于3个；Ⅳ级，结节/囊肿性或聚合性痤疮，多数有疼痛并形成囊肿，病灶数大于100个，结节/囊肿大于3个。患者分组情况见表3，两组在性别、年龄、病情及病程方面经统计学处理(P>0.05 )，无显著差异。

表3 患者分组情况

临床疗效以治疗后皮损总数减少的百分率结合临床症状的改善来进行评价[皮损减少率（%）=(治疗前皮损数-治疗后皮损数)/治疗前皮损数×100%]。基本痊愈：皮损减少率≥90%，临床症状基本消失；显效：皮损减少率＜90%≥60%，临床症状明显改善；有效：皮损减少率＜60%≥30%，临床症状减轻；无效：皮损减少率＜30%，症状没有改善。

取实施例3制得的鹅血液相剂型BAPs用灭菌蒸馏水调整含量为10mg/mL，用NaCl调整渗透压为300±10mOsm/L。

两组患者在开始治疗前分别计数各个患者的皮损数。治疗开始，于每天早晚用温水洗净患处，热毛巾擦干，保持患处清洁。治疗组给予BAPs(10mg/mL)涂抹外用，对照组给予维胺脂维E乳膏涂沫外用，两组患者均于每天早、晚涂抹1次。治疗8周后，分别计数两组各个患者的皮损数，并记录临床症状改善情况。两组患者的治疗效果见表4。

表4 BAPs治疗痤疮的临床观察

疗效	n	基本治愈	显效	有效	无效	总有效率（%）
							治疗组	23	5	9	7	2	91.3
对照组	23	3	5	7	8	65.2

表4结果显示：治疗组总有效率91.3%，对照组总有效率65.2%。经统计学处理，治疗组的疗效（总有效率）显著地高于对照组（P<0.05）。

在应用BAPs治疗痤疮的过程中，无需挤压，丘疹和脓疱中的内容物自行逐渐排出，排净后创口随之愈合。而且还发现随着治疗时间的延长，治疗部位皮脂的分泌也逐渐减少。在整个治疗观察过程中，无皮肤过敏现象发生。

实验结果表明：①BAPs对痤疮丙酸杆菌具有抑菌作用。上述BAPs经液相色谱-电喷雾-四极杆飞行时间串联质谱（LC-ESI-MS/MS）分析，结果显示这部分活性肽由30多个氨基酸残基组成，分子量为4KD左右，一般等电点大于7。分析其原因，可能是这部分活性肽主要作用于痤疮丙酸杆菌的细胞膜，破坏其完整性并产生穿孔现象，造成细胞内容物溢出而死亡；多个肽在膜上形成离子通道导致某些离子的逸出而死亡；也有可能作用于膜蛋白引起凝聚、失活和离子通道，引起膜渗透性改变而导致死亡；还有可能本身存在特异性的膜受体及其它因子的协同作用等；②由于BAPs为纯生物材料制剂，不同于西药抗生素，痤疮丙酸杆菌对其不易产生耐药性。所以BAPs对痤疮的治疗，疗效确切；③由于BAPs抑制了皮脂的分泌，保持皮脂腺导管通畅，从而使其局部不能形成适合痤疮丙酸杆菌存活和继续增殖的厌氧环境；④由于BAPs分子量远小于蛋白质，不具有抗原性，因而对人体皮肤不会因免疫调节而产生过敏反应。综上所述，畜禽血提取物BAPs对痤疮的治疗独具特色，不失其为目前美容医学中治疗痤疮较为理想的药物。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。

Claims (1)

1.生物活性肽BAPs在美容医学领域中制备具有治疗痤疮功效的药物中的用途；

所述生物活性肽BAPs经以下步骤提取：

(1)采取新鲜畜禽血，加入抗凝剂，混匀抗凝，离心，分离血浆和含红细胞的不溶物，分别收集；

(2)向步骤(1)所得的含红细胞的不溶物中加入纯水，搅匀后进行冷冻处理，解冻后再进行均质处理或超声波处理，彻底破碎红细胞，使血红蛋白溶出，离心，除去含红细胞膜碎片的不溶物，收集血红蛋白溶液；

(3)将步骤(1)所得血浆和步骤(2)所得血红蛋白溶液合并，加入第一种蛋白变性剂至终浓度为0.5～5.0mol/L，70～100℃处理3～5小时，冷却至室温；

(4)向步骤(3)所得反应产物中加入二硫键还原剂至终浓度为0.2～0.5mmol/L，80～100℃处理20～40min，冷却至室温，用透析法除去反应后产物中残留的试剂；

(5)向步骤(4)所得反应产物中加入第二种蛋白变性剂至终浓度为0.3～0.8mol/L，105～125℃蒸汽压力中处理10～30min，冷却至室温；

(6)用酸试剂调节步骤(5)所得反应产物的pH为3.0～4.2，静置，收集上清液；

(7)用碱试剂调节步骤(6)所得上清液的pH为6.8～7.2，获得无异味的微黄色生物活性肽BAPs；

(8)将步骤(7)所得生物活性肽BAPs灭菌，制得畜禽血液相剂型生物活性肽BAPs；

或将步骤(8)所得畜禽血液相剂型生物活性肽BAPs进行干燥处理，制得畜禽血固相剂型生物活性肽BAPs；

步骤(3)中所述的第一种蛋白变性剂为N₂H₄CO、C₁₂H₂₅SO₄Na或CH₆ClN₃；

步骤(5)中所述的第二种蛋白变性剂为KOH、NaOH或Ca(OH)₂。