PT93313B

PT93313B - Processo para a preparacao do acido z(2r, 5r)-3-(2-hidroxietilideno)-7-oxo-4- -oxa-1-azabiciclo{3,2,0}heptano-2-carboxilico a partir de caldos de fermentacao de streptomyces sp.

Info

Publication number: PT93313B
Application number: PT93313A
Authority: PT
Inventors: Maria Concepcion Graci Alvarez; Maria Pilar J De Urrie Senante; Pablo Floriano Martin
Original assignee: Smithkline Beecham Plc
Priority date: 1989-03-01
Filing date: 1990-03-01
Publication date: 1998-06-30
Also published as: EP0387178A1; GR3022981T3; PT93313A; DK0387178T4; ES2010143A6; DK0387178T3; EP0387178B1; EP0387178B2; EP0387178B9; ATE147103T1; DE69029527D1; DE69029527T3; DE69029527T2

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇAO DO ÃCIDO Z(2R,5R)-3-Ç2-HIDRQXIETILIPENO)-7-0X0-4-0XA-1-AZABrGlCL0Ç3,2,QJhEPTAN0-2-CARBQXILICO A

PARTIR DE CALDOS DE FERMENTAÇÃO DE STREPTOMYCES SP,

Campo técnico da invenção

O ãcido clavulânico de formula CgHgNOg cujo nome sistemãtico está indicado no titulo, possui propriedades; antibióticas de amplo espectro e o seu especial interesse baseia-se. na activj_ dade inibidora da ^-bactamase e no acentuado efeito sinérgico que produz quando se administra associado a outros antibióticos ^-bactâmicos do tipo das penicilinas e das cef al osporinas ·.

Apresenta-se sob a forma de sais e esteres aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, que aumentam a sua estabilida de e permitem a sua administração como tal.

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Entre os sais que se podem administrar, destacam-í-se os sais dos metais alcalinos e dos metais alcalinos-terrosos, de preferência os sais de sodio e os sais de potássio, Os ésteres apropriados do ãcido clavulânico, são os derivados de álcoois e tiois, principalmente os que podem formar o antibiótico de origi_ nal por meio de hidrólise moderada i n vivo,

Esta invenção constitui uma novidade no que diz respeito ao procedimento da obtenção deste ãcido, jã que apresenta um pro

cesso completo de preparação do acido clavulânico, a partir de caldos de fermentação de Streptomyces sp, 0 referido processo tem caracterTsticas próprias, tanto consideradas no seu conjunto como nas fases separadas que compreende, e apresenta numerosas vantagens em relação a outros métodos de obtenção descritos nas pate£ tes que se referem na secção seguinte,

Estado da técnica anterior a Invenção

A presente invenção refere-se a um novo processo para a preparação do acido clavulânico e dos seus sais e esteres aceita, veis sob o ponto de vista farmacêutico que apresenta notáveis va£ tagens em relação aos métodos descritos nas patentes de invenção espanholas nos 436.766, 494,431 e relativamente aos procedimentos melhorados referidos na patente de invenção espanhola ηθ 550.133.

Com efeito, a primeira destas descreve um processo, extremamente extenso e oneroso, em que são necessárias purificações trabalhosas baseadas em métodos cromatograficos de diversos tipos que pressupõem; um filtrado inicial do caldo de cultura, difícil e dando origem a grandes perdas; adsorção do anião clavulanato sobre uma resina de permuta aniõnica; eluição com o electrÓlito; dessalinização da solução resultante; aplicação da solução dess£ linizada a uma outra resina de permuta aniõnica; eluição cromato, gráfica com o electrÓlito; dessalinização final e, por último, eliminação da ãgua ou do dissolvente utilizado na fase de dessalinização, Este processo, além de muito trabalhoso, tem o inconveniente de em todas as fases, com excepção da última que permi-3

te a utilização de dissolventes orgânicos, se realizarem em soljj ção aquosa em que o acido clavulanico e ainda os seus sais apresentam uma grande instabilidade, .0 rendimento global em clavulanato de sódio impuro representa aproximadamente 20% da quantidade inicial presente no filtrado de cultura,

Na patente de invenção espanhola nQ 494,431 suprime-se parte das purificações realizadas com resinas, utilizando-se uma fase intermédia de purificação pela formação de um sal de terc-butilamina, com um rendimento de 75% nesta fase, Contudo, não se eliminam as fases prévias de filtração do caldo de cultura nem o isolamento do aniao clavulanato sobre a resina de permuta aniÓnica e, consequentemente, não se evita a eluição com electrõ lito nem a sua posterior dessa!inização,

A crista1ização do sal de terc-butjlamina realiza-se em solução acetonica-aquosa e a sua transformação em sal de sodio ou de potássio obtem-se por passagem de uma solução aquosa da mesma através de uma resina de permuta catiónica e por tratamento com o hexanoato de etilo correspondente em solução aquosa de isopropanol, 0 rendimento global e da ordem dos 40%,

Finalmente, a patente de invenção espanhola nQ 550,133 introduz aperfeiçoamentos na anterior que consistem fundamental mente, na transformação do sal de terc-buti 1 amina em sais alcalinos, mediante tratamentos daquele com o tiocianeto do metal que corresponde ao sal do acido clavulanico que se deseja obter, A formação do sal de terc-buti1amina intermédio realiza-se por retroextracção da solução orgânica do acido clavulanico com uma so

luçãô aquosa da terc-buti1amina a um pH de 5,5, com o perigo coji sequente de decomposição do acido clavulãnico dada a grande instabilidade deste em solução aquosa (aumentada neste caso pela acidez do meio). A utilização de tiocianetos alcalinos na transformação do sal de terc-butí1amina intermédia, embora realizada em dissolventes orgânicos, exige uma eliminação posterior exaustiva dos mesmos.

Descrição da Invenção >

A presente invenção apresenta um novo processo para a preparação do ãcido clavulãnico e dos seus sais e esteres aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, a partir de caldos de fermentação de Streptomyces sp, que compreende:

A) Uma etapa de Floculação previa do caldo de cultura utilizando como agentes de floculação electrolítos inorgânicos, de preferência políelectrõlítos,

Este método apresenta as vantagens seguintes:

A Floculação obtém-se de forma espectacular em uma so fase com o auxilio de políelectrõlítos orgânicos, geralmente de polímeros sintéticos, mais especificamente os polímeros sintéticos neutros e os de carácter aniÓnico com cargas residuais negativas,

- Com esta floculação separa-se não somente o micelio mas ainda se consegue eliminar, incluídas nos floculos, as proteínas e as partículas em suspensão present

tes inicialmente no caldo de fermentação, Os rendimeji tos totais de todo este processo sao cerca de 85 a 90%.

Os flõculos que se formam no caldo‘de cultura são suficientemente grandes e compactos para permitir a sua fácil sedimentação e separação, o que se obtém mais vantajosamente utilizando-se peneiros rotativos, Evein tualmente, pode-se submeter o caldo, em seguida, a um processo de concentração aplicando-se um método de osmose inversa,

- Obtem-se assim um caldo de cultura completamente tran£ parente sem necessidade de utilizar métodos convencio, nais tais como a adsorção sobre carvão activado, a uti_ lização de coadjuvantes de filtração e de centrifugação. Ao contrario deste método de floculação, em todos os outros e necessário posteriormente submeter o caldo de cultura clarificado a diferentes processos de desproteinização e de permuta ionica de que resultam grandes perdas totais,

- Assim, no caso da patente de invenção espanhola n9 537.158, a utilização de agentes coadjuvantes de filtração, antes da adsorção sobre as resinas, não elimi. na a necessidade de centrifugação nem de desproteinização seguida de nova centrifugação, A desproteinização realiza-se a pH 4, o que implicará, necessari amen. te, uma degradação considerável do acido clavulanico

que, como se assinalou anteriormente, é muito instável em solução aquosa, aumentando a instabilidade a pH ãcido, Com efeito, as perdas globais admitidas para este processo de clarificação são de 75 a 80%, '

- Em resumo, com o presente método de Floculação consegue-se eliminar a utilização de qualquer tipo de re sinas de permuta iÕnica, assim como subsequentes deslocamentos electrolTticos e dessalinizações , o que, alem de evitar grandes perdas, permite diminuir consi_ deravelmente o custo do processo e suprimir notavelmente os tempos necessários para a purificação do ãci_ do clavulãnico,

B] Uma etapa de Purificação do acido clavulãnico contido no caldo de cultura de Streptomyces sp,, floculado e decantado de acordo coma descrição da alínea A, que se caracteriza pe la formação, como produtos intermédios estáveis, de uma gran, de variedade de sais derivados de aminas primárias, secundárias e tereiarias,

Este processo apresenta as seguintes vantagens:

- Permite proceder ã extraeção directa do ãcido clavulã nico, a partir do caldo de cultura floculado, com di£ solventes orgânicos diferentes por métodos convencionais sem necessidade de se submeter este a qualquer tipo de separação cromatografica.

Ί- A formação e cristalização dos sais de amina, como compostos intermédios, realiza-se a partir de dissolventes orgânicos separados ou a uma mistura destes, sem que em qualquer caso intervenha a mínima quantid^ de de ãgua, evitando-se assim a degradação do ácido clavulãnico, cuja estabilidade em presença da ãgua e muito menor.

- Os compostos intermédios formados são sais do ãcido clavulãnico com uma grande variedade de aminas e apr£ sentam um elevado grau de pureza (^85%) conseguindo-se a sua obtenção com rendimentos compreendidos entre 8Q e 9Q%,

C) Uma etapa de Transf ormaçao¹¹ dos sais intermédios formados a partir do ãcido clavulãnico com as diferentes aminas de acordo com o método descrito em B, por intercâmbio com diferentes sais alcalinos e sais alcalino-terrosos, de uma serie de ácidos orgânicos, incluindo ácidos aromáticos cujos pKa são inferiores aos pKa do ãcido clavulãnico,

Este método apresenta as seguintes vantagens:

- Suprime a utilização de resinas de' permuta ionica ne£ ta fase, evitando o contacto do sal com a ãgua e as subsequentes perdas.

- Realiza-se exclusivamente em meios orgânicos sem a presença sequer de traços de ãgua com o que se elimi-8-

na a maior parte dos processos de degradação.

- Permite a obteração de sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico com rendimento da ordem dos 90% e com um grau de pureza ^95%,

- A partir dos sais do acido clavulanico podem obter-se ésteres aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico por esterificação directa destes mediante processos convencionais, processo completo de obtenção do ãcido clavulanico a pre. senta rendimentos globais da ordem de 7Q% a partir dos caldos de fermentação de Streptomyces clavulígerus, Em seguida, pormenoriza-se a forma de realização das fases (A) a (C) mencionadas ante, ri ormente,

A) Fase de Coagulação-Floculação: Esta fase permite separar, retidas nos floculos, as proteínas e partículas em suspensão presentes inicialmente no caldo recolhido juntamente com o micê1 io.

tamanho dos floculos ê suficientemente grande para se formarem de modo tão compacto que a sedimentação e a separação são fãceis podendo realizar-se de forma mais vantajosa utilizando-se peneiros rotativos,

Mediante esta fase de F1oculação consegue-se um cal do de cultura completamente transparente sem necessidade

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da aplicação de métodos convencionais, tais como a adsorção sobre carvão activado, a utilização de agentes coadjuvantes de filtração e de centrifugação, que auxiliam os subsequentes processos de desproteinização de permuta iõnica causando grandes- perdas globais,

A Floculação realiza-se mediante as seguintes subfases:

AI) Adição ao caldo de cultura de um electrõlito inorg£ nico, como cloretos de metais alcalinos ou de metais alcalino-terrosos, de preferência cloreto de amonio, com a finalidade de favorecer a acção do coagulante. Geralmente utiliza-se na proporção de 0,5 a 4g/l de caldo de cultura, podendo no entanto, variar estas proporções de acordo com a consistência do caldo re colhido e com a natureza do electrõlito,

A2) Incorporação, sob agitação e mantendo o pH entre 6 e 8, de preferência pH 7, de um agente floculante inorgânico, geralmente sais de metais hidrólisãveis tais como o sulfato de alumTnio, o sulfato fêrrico e, de preferência, cloretos de alumTnio pre-hidroli_ f

sados,

Quan.do se utilizam policloretos de alumTnio, o conteúdo em Alr,0g destes deve estar compreendido entre 10 e 2Q%. A quantidade necessária varia entre 10 e 20 ml/litro de caldo de fermentação,

A3J Adição, uma vez iniciada a floculação, de um poli— electrõlito orgânico, ou mistura de vários, geralmente de polímeros orgânicos., mais especificamente polímeros do tipo das poliaminas e, de preferência, poliacrilamidas sintéticas de carácter iÕnico apropriado. 0 pH necessário para que o efeito floculante destes compostos seja máximo está compreendido entre 6 e 8, sendo determinante tanto a agitação co mo a duração da mesma na formação da dimensão dos flõculos, As concentrações das soluções aquosas que se utilizam com os diferentes tipos de poliacrilam£ das são muito diversas sendo as mais utilizadas as concentrações compreendidas entre Q,01 e 0,2%, de preferência entre O.,Q5 e Q,l%, com uma concentração total de 15Q a 4QQ mg/litro de caldo de fermentação,

A4) Separação dos flõculos do caldo de fermentação previa, sedimentação rapida, mediante a utilização de peneiros rotativos ou por simples filtração e, dado que se dispõe de líquido de cultura completamente transparente, pode proceder-se, se apropriado, a uma concentração prêviadesse líquido por osmose in. versa,

Os rendimentos comparativos em conteúdo de acido clavulânico no caldo de cultura floculado referentemente ao caldo recolhido são da ordem de 85 a 90%,

A fase de Purificação do ácido clavulânico contido no caldo de cultura floculado e decantado de acordo com o processo descrito na fase A, consiste na formação de uma grande varie

-ηdade de sais derivados de aminas primárias, aminas secundãri_ as e aminas terciárias dando lugar a produtos intermédios de grande estabilidade, o que possibilita a purificação directa do caldo floculado sem a necessidade de o submeter a .qualquer tipo de separação cromatografica,

Esta fase é constituída pelas seguintes subfases:

Bl) Extracção directa com diferentes dissolventes orgânicos do caldo de cultura floculado, a frio, median te a adição de um ácido, a um pH ligeiramente inferior ao pKa do ácido clavulânico, uma vez postas e mantidas em contacto as duas fases com agitação vigorosa. Como dissolventes orgânicos apropriados con_ sideram-se todos os dissolventes convencionais imi£ cíveis com a água, mais vantajosamente os que apresentam uma polaridade média, como são os acetatos de metilo, etilo, propilo, isopropilo, n-butilo, e de isobutilo, a meti 1isopropi1cetona, a metilbutilcetona, a meti 1isobutilcetona e o n-butanol,

B2) Secagem da fase orgânica que contem o acido clavulã nico sobre um agente excicante inerte tal como o sulfato de sÕdio,’o sulfato de magnésio, etc.

B3) Formação de um sal intermédio por adição de uma am£ na escolhida entre uma larga série de aminas primárias, secundárias e terciárias, de formula geral

na qual R-j representa um atomo de hidrogénio, um grupo metilo, etilo, isopropilo, Isobutilo, ou um grupo de formula geral ^_n^2n+l ’ ^^na 9^ua^ ^{n re}P^reseI!. ta de preferência um numero inteiro de 1 a 7), R^ e Rg representam, cada um, independentemente, um grupo benzilo eventuaImente substituído ou um radical cicloalquilo ou podem encontrar-se ligados entre si de modo a que o atomo de azoto faça parte de um heteroei'cl o,

A adição da amina realiza-se a frio dissolvida num dissolvente orgânico que eventual mente pode ser o dissolvente utilizado na extracção do principio acti

B4) Agitação, mantendo-se a mistura fria formando-se de£ te modo um precipitado do correspondente sal de ami_ na que apos filtração e secagem apresenta uma eleva, da pureza 85%) quando determinada por HPLC e uma grande estabilidade, de modo que pode utilizar-se como intermédio no processo de purificação e como ponto de partida para a obtenção de sais e esteres aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, Como exemplo juntam-se os espectros de I.V e RMhpH dos sais de sec-buti1ami na e benzi!-terc-butilamina re-

feridos nos exemplos 7 e 8 (Fig, 1,2, 3e4), respecti vamente, rendimento da obtenção do sal intermédio da amina, a partir do caldo de cultura floculado, estã compr£ endido entre 80 e 9Q%, conseguindo-se, portanto, me lhorar consideravelmente o rendimento global na purificação relativamente ao que se obtem pelos métodos descritos nas patentes de invenção citadas ant£ ri ormente,

C) Fase de formação de sais aceitáveis sob o ponto de vista farmaceutico a partir dos compostos intermédios obtidos, de acor do com a descrição da alínea B, por interacção do acido clavulânico contido no caldo de cultura floculado com diversas aminas, por permuta destes com diversos sais de metais alcalinos ou de metais al cal i.no-terrosos de uma série de ácidos orgânicos, de formula geral R-COOH, incluindo os ácidos aromáticos, cujos pKa sejam inferiores ao pKa do acido clavulân i c o.

Como ácidos orgânicos iniciais apropriados consideram-se o acido acético, o acido trimetilacético, o acido propionico, o acido i.sopropionico, o acido butírico, o acido isobutírico, o acido fenilacético e, em geral, todos os derivados n-alquí licos e alquílicos de cadeia ramificada, assim como os ácidos aromáticos em que R representa um grupo, fenilo eventualmente substituído, como no caso dos ácidos benzoico, a 1 quiJ, benzõico etc,,, Esta fase compreende as seguintes subfases:

Cl) Forma-se de início o sal de metal alcalino ou de me tal alcalino-terroso, de preferência o sal de sodio ou o sal de potássio do acido inicial escolhido, me diante tratamento de uma solução do acido num dissolvente orgânico, escolhido entre os dissolventes referidos na alínea B, com o hidróxido correspondei! te, de preferencia o hidróxido de potássio ou o hi_ dróxido de sodio, juntando-se ã solução uma quanti. dade estequiometrica, Agita-se a mistura ate ã homogeneidade, eliminasse a agua libertada por exsicação com agente desidratante inerte, de preferência sulfato de sódio ou sulfato de magnésio, e após filtração completa-se o volume para se obter uma so. lução padrão do sal do ácido orgânico,

C2) Dissolve-se uma certa quantidade do composto inter^ médio da amina no mesmo ou noutro dissolvente orgâ. nico, escolhido previamente de. acordo com as diferentes solubilidades dos sais iniciais e dos sais que se pretendem obter,

C3) ApÓs arrefecimento das soluçoes, preparadas de acor^ do com a descrição de C-j e C^, adiciona-se um dado volume da solução que contêm o sal do ãcido escolhi do ã solução que contem o sal do ácido clavulanico com a amina, de forma a que as proporções de uma e outra sejam estequiométricas,

C4) Ao proceder-se a mistura a frio começa a aparecer

-15um precipitado que corresponde ao sal de sódio ou ao sal de potássio do ãcido clavulãnico, cuja cris. talização e total após 1 hora de agitação,

C5) Por filtração do sal obtido deste modo obtêm-se o sal de sódio ou o sal de potássio do ãcido clavula nico com um rendimento de cerca de 90% nesta trans formação e com uma pureza superior a 97%, Junta-se o espectro de infravermelho e o de RMN 0 (Fig. 5 e 6), do sal de potássio obtido seguindo-se o mêt£ do descrito anteriormente,

A partir do sal de sódio ou do sal de. potássio pode-se obter os esteres aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, por esterificação directa daqueles, seguindo-se processos convencionais, mediante a reacção do sal do acido clavulãnico com um agente de esterificação, de preferência halogenetos, ésteres sulfónicos, álcoois etc,,,, que se realiza no seio de um dissolvente orgânico,

Descrição das Figuras

Figura 1: Espectro de RMN 0 do clavulanato de sec— butjlamina obtido de acordo com o descrito no Exemplo 7,

Figura 2: Espectro de infravermelho do produto obtido de acordo com o descrito no Exemplo 7,

Figura 3: Espectro de RMN ^H do clavulanato de benzil-terc-butilamina obtido de acordo com o descrito no Exemplo 8,

Figura 4: Espectro de IV do composto obtido de acordo com o de£ crito no Exemplo 8,

Figura 5: Espectro RMN do clavulanato de potássio obtido de acordo com o descrito do Exemplo 27,

Figura 6: Espectro de IV do produto obtido de acordo com o descrito no Exemplo 27,

Formas de realização da presente invenção

Descrevem-se em seguida exemplos ilustrativos da forma de realizar na prãtica a presente invenção, os quais se devem considerar não como limitativos do seu âmbito que esta apenas H mitado pelas reivindicações juntas,

Os espectros RMN ^ΊΗ realizaram-se num espectrometro VARIAN VXR de 3QQ MHz, em soluções aproximadamente a 2% de D₂0, Os desvios químicos são dados em ppm e as constantes de acoplamento (Jj em Hz.

Os espectros Γ7 realizaram-se num aparelho PERKIN ELMER

881 com os compostos dissolvidos em nujol,

Exemplo 1

A 250 ml de um caldo de fermentação de Streptomyces cl avulígerus contendo 1650 jjg/ml de princípio activo, adicionou-se uma solução aquosa de poli-hidroxicloreto de alumínio (Prodeflor AR-180), numa proporção de 1/70, com prévia adição de cloreto de amónio numa relação de 1:1000 (p/v) iniciando-se a floculação que aumentou ã medida que se neutralizou a solução aquosa com hidróxido de sódio. Mantendo-se sob agitação adicionou-se, como po.

Iielectrõlito orgânico, Praestol 2540 a 0,Q5% numa concentração de 250 mg/litro e agua na relação de 1:5 (v/v), verificando-se em seguida o aparecimento de grandes floculos- que se separaram do líquido sobrenadante (com uma concentração em princípio activo de 1405 mg/litro de caldo inicial), a partir do qual se pode extrair directamente o ácido Z-(2R,5RJ-3-(2-hidroxietiliden)-7-oxo-4-oxa-l-azabiciclo^3,2, Qjheptano-2-carboxí1ico,

Exemplo 2 >

Procedeu-se ã floculação de 500 ml do caldo de cultura de Streptomyces cl avulígerus com uma concentração de 10.25 mg/H tro de ácido clavulanico, com policloreto de alumínio Prodeflor AR-100 na concentração de 3Q ml/litro, Como electrolito inorgânico adicionou-se cloreto de amónio, neste caso numa relação de 3:20.00. (p/v). Formaram-se flõculos que aumentaram consideravelmente ao juntar, apÕs prévia neutralização, Praestol 2395 em solução aquosa a 0,1% e numa relação de 1:5 (v/v). ApÓs a adição de 50. ml/litro de ãgua, agitou-se energicamente durante 2 minuV

tos provocando-se a desagregação dos floculos facilitando a sua separação. 0 rendimento em princípio activo do líquido amarelo e completamente transparente representou 88% da quantidade inicial.

Exemplo 3

Floculou-se 1 litro de caldo de cultura de $, clavuligerus. (173Ojjg/ml de acido clavulãnico), com cloreto de amõnio e Prodeflor AR-18Q na relação 1:100 (v/v), Neutralizou-se com hidróxido de sodio e adicionou-se como agente coadjuvante da flocu lação 170 mg de Praestol 25QQ em solução aquosa a Q,Q5%, Diluiu-se com ãgua e procedeu-se ã separação dos floculos, 0 líquido transparente obtido submeteu-se a extracção directa do ãcido cia vulânico. A concentração comparativa em princípio activo do caldo floculado relativamente ã fermentação era de 1428 mg/1,

Exemplo 4

Submeteu-se a floculação 25Q ml do caldo de fermentação de Streptomyces clavuligerus com um teor em princípio activo de 2090 jjg/ml , com cloreto de amõnio a (Ί mg/1) e Prodeflor AR—180 a 04 ml/1), neutralizando-se com hidróxido de sodio, Com a adição de 70 ml de Praestol 2395 a 0,1% e 50 ml de ãgua os floculos aumentaram de tamanho, A separação dos floculos permitiu a ohten, ção de um líquido completamente transparente, 0 rendimento em princípio activo relativamente ao caldo recolhido foi de 85,4%,

Exemplo 5

Submeteram-se ã floculação dois litros, do caldo de fermentação contendo 950 J^g/ml de acido Z (2R,5Rl-3-(2-hidroxietil£ den]-7-oxo-4-oxa-l-azabicicl o£3,2,Ojheptano-carboxílico , com 3,2 g de cloreto de amÕnio e 24 ml de Prodeflor AR-180, Adicionou-se hidróxido de sódio ate neutralização e em seguida 400 ml de uma solução a 0,1% de poliacri1amida sintética, Magnaflor 156, Desagregaram-se os flõculos formados por agitação vigorosa facilitan do-se a separação dos mesmos de uma forma favorável, utilizando peneiros rotativos, 0 líquido transparente, contendo 2 mmoles/H tro de princípio activo, concentrou-se em seguida por um processo de osmose inversa, para posteriormente. se submeter ã extracção com um dissolvente orgânico,

Exemplo 6

Submeteram-se â floculação 2 litros de um caldo de cultura de S, clavuligerus, contendo 1859 mg/1 de acido clavulânico, com 2 g de cloreto de amónio e 28 ml de Prodeflor AR-180 como agente de coagulação, Incorporaram-se na suspensão previamente neutralizada, 560. mg de um agente coadjuvante de floculação, Praestol 2395 em uma solução aquosa a 0,1%, diluindo-se em segui, da com agua e mantendo-se sob agitação durante uns minutos para facilitar a desagregação e. separação dos flõculos, Rendimento obtido 9Q%,

-20Exemplo 7

Arrefeceu-se até uma temperatura inferior a 5°C, depois do que se pôs em contacto, sob agitação vigorosa, com 1 litro de acetato de etilo, 510 ml do floculado descrito no Exemplo 4 contendo de principio activo referido ao caldo de fermen

tação. Mantendo-se a agitação e a temperatura adici.'onou-se acido clorídrico até ã obtenção do pH aproximadamente de 2, Separaram-se as fases e voltou-se a extrair a fase aquosa com 1 litro de acetato de etilo, As fases orgânicas reunidas secaram-se com sul fato de sódio e reduziram-se a um volume de 14 ml, Adicionaram-se a frio 2,37 mmoles de sec-butilamina em 14 ml de acetato de etilo e apôs uma hora separaram-se 500 mg de clavulanato de^sec-butilamina c.om 85,2% de pureza,

Espectro RMN Figura 1;

5,77 (lHgOtJ d 2,81

4,82 - 4,30. (2H^ , _{+ 2J}) m

4,12 C2H₂.) d CJ = 7,6).

3,60 ClH₆<Xà dd CJ_gem = Π; JotOi = 2,8). 3,21 CIHJ q CJ = 6,7)

3,06 ClH_6p) d _CJ_gem = Π)

1,57 C2H_&) m

1,21 C.3H_b, ) d CJ = 7,61 0,93 C.3H_c) t CJ ^s 6,2)

Espectro IV: Figura 2:

3260	cm	tens,	0-H
2600-2800	n	tens,	^NH3
1790	u	tens,	C=0 p-lactâmico
1696-1684	II	tens,	C=C hexocTclico
1627	II	tens,	coo'
1574-1548	II	comb,	tens, C-N + fie
		N-H em	, NH +

Exemplo 8

A pH acido extraiu-se o caldo de fermentação floculado obtido anteriormente de acordo com o Exemplo 2, com 2 litros de acetato de etilo mantendo-se a mistura a baixa temperatura e sob agitação vigorosa. Após secagem e redução do volume para 14 ml adicionou-se a frio à fase orgânica 0,45 ml de benzi 1 -terc-butilamina em 14 ml de acetato de etilo, Obteve-se assim o clavulana to de benzi 1 - terc-buti 1 amina com um rendimento de 85% e uma pure. za de 88,8%,

Espectro RMN ^H: Figura 3:

7,42 (5H_C). S

5,63 (.1K₅*X) dd [J Q5«.-6<<).^{= 2} ’^{8 5 J} C5<<-6jJ.5_^=Q ’⁷4,81 - 4,90 (2H, _{+ 2)}).m

4,14 (2H_b) S

4,11 C2H₂,) d (J = 7,4).

3,47 OHgOC) dd CJ_gem=17; J^=2,8).

3,04 C1H_6p) dd CJ_gem=17;

1,39 (9HJ S

22/ ii

Espectro IV: Figura 4:

3334	cm	tens.	0-H
2400-2800	11	tens.	^NH3
1786	II	tens,	C=0	j5’l actâmi co
1687	II	tens,	c=c	hexocícli co
1591	II	tens,	c=c	arom, + tens
1580	II	comb,	tens,	C-N + flex.
		N-H em	NHÍ

Exemplo 9

Extrairam-se a frio 510 ml do líquido resultante da fio culação do Exemplo 1 [687,5 mg/1), com 1 litro de acetato de eti_ lo, mantendo-se a mistura em contacto sob agitação enérgica e adicionando-se 0,38 ml de acido clorídrico concentrado, Tornou-se a extrair a fase aquosa com 1 litro de acetato de etilo e re duziu-se o volume da solução orgânica para 1Q ml, Adicionaram-se em seguida 0,20 ml de Ν,Ν-dimetiletilamina em 10 ml de acetona, Após 1 hora de agitação, a frio, cristalizou-se 1,43 mrnole de clavulanato de N,N-dimeti1eti1amina com uma pureza de 87,5%,

Exemplo 10

A 600 ml do líquido procedente da concentração por osmo se inversa do caldo de cultura floculado de acordo com o método descrito no Exemplo 5, contendo 2520,5 mg/1 de ãcido clavulanico, extraiu-se da forma habitual a frio com acetato de etilo e a pH

acido e, apos secagem da fase orgânica, reduziu-se o volume para 47 mi e adicionou-se também a frio 0,92 ml de 1 ,2-dimeti1propi1 a mina em 47 ml de acetato de etilo, Apôs agitação durante 1 hora, cristalizou-se o sal do acido clavulânico correspondente que apre sentava uma pureza de 84%, obtendo-se um rendimento de 87%,

Exemplo 11

4,12 litros do caldo floculado de acordo com o processo descrito do Exemplo 6 contendo 1628 jug/ml de ácido clavulânico referidos ao caldo de fermentação, concentraram-se para 500 ml por um processo de osmose inversa, Extraiu-se com acetato de etj. lo da forma habitual e, uma vez seca a fase orgânica, concantrojj -se para 94 ml e tratou-se a frio com 1,42 g de. 1 ,1 -dimetil propi amina, cristalizando deste modo 14 mmoles do clavulanato corre£ pondente com um grau de pureza de 85,5%.

Exemplo 12

J caldo de cultura floculado de acordo com o método descrito Exemplo 3, submeteu-se a um processo de osmose inversa reduzindo -se o seu volume para 540 ml com um teor de princípio activo no concentrado de 2485 mg/1, Procedeu-se ã extracção cuidadosa em frio com acetato de etilo mantendo-se as duas fases a contacto, a uma temperatura de 2°C e adicionando-se 0.,75 ml de ãcido clorí drico concentrado, ApÕs secagem da fase de acetato de etilo, reduziu-se o volume para 40 ml e adicionou-se a frio 0,80 ml de ciclohexi1amina em 40 ml de acetato de etilo, ApÕs 1 hora sob agitação, cristalizaram 1,55 g do sal do ãcido clavulânico com

um grau de pureza de 84,6%,

Exemplo 13

500 ml do liquido procedente do caldo de. cultura floculado de acordo com o método descrito no Exemplo 2 extraiu-se da forma habitual com acetato de etilo e após secagem da fase orgânica, reduziu-se para 14 ml. Adicionaram-se a frio Q,27 g de neo pentilamina dissolvidos previamente em 14 ml de acetato de etilo e apos 1 hora filtraram-se 535 mg de clavulanato de neopenti 1 ami_ na com uma pureza de 9Q%,

Exemplo 14

510 ml de caldo floculado de acordo com o método descri_ to no Exemplo 4, extraiu-se com acetato de etilo da forma Eiabitu, al. Uma vez reduzido o volume da fase orgânica para 14 ml, tratou-se a frio com 2,38 mmoles de piperidina em 14 ml de acetato de etilo. ApÓs 1 hora, filtrou-se o sal do ácido clavulànico for mado que apos secagem pesava 0.,57 g com uma pureza de 82%.

Exemplo 15

1020 ml do caldo de cultura floculado de acordo com o método descrito no Exemplo 2, extraiu-se a frio e a pH ácido com £-hutanol. Reduziu-se o volume para 14 ml e adicionaranwse a frio 39.0 mg de benzi 1-terc-butilamina em 14 ml de acetato de etilo, Obtiveram-se deste modo 570 mg de clavulanato de benzi 1-terc-butilamina com uma pureza de 83%,

-25-,

Exemplo 16

8,24 litros de caldo de cultura floculado de acordo com o método descrito no Exemplo 6 concentraram-se para 62Q ml por osmose inversa. Extraiu-se, após arrefecimento prévio, com meti^ isobuti1cetona a pH ãcido. Reduziu-se o volume da fase orgânica para 182 ml e adicionaram-se a frio 3,3 ml de sec-butilami na em 182 ml de acetato de etilo. Obteve-se, deste modo, o clavulanato de sec-buti1ami na com um rendimento de 85,5% e um grau de pureza de 90%.

Exemplo 17

515 ml de caldo floculado de acordo com o método descH to no Exemplo 1, extrairam-se a frio, com 2 litros de metilisobutilcetona acidificando-se com 0,45 ml de ãcido clorídrico conceji trado. Secou-se a fase orgânica e concentrou-se até 11 ml, Adicionaram-se sob agitação e a frio 0,20 ml de N ,Ν-dimetiletil ami*—· na em 11 ml de acetato de etilo, Obtiveram-se Q,42 g do clavulanato correspondente, com um grau de pureza de 92%,

Exemplo 18

De acordo com o procedimento citado, flocularam-se 500 ml do caldo de cultura obtido de acordo com o descrito no Exemplo 4, obtendo-se 101Q ml de um líquido transparente com uma concentração de 895 mg/litro em princípio activo, Extraiu-se a frio com meti 1isobutilcetona após acidificação do meio. Secou-se a fase

-26orgãnica, reduziu-se o volume para 27 ml, arrefeceu-se e juntaram-se 4,8 mmoles de benzil -terc-buti'1 amina em 27 ml de acetato de etilo cristalizando o sal do ãcido clavulãnico com benzil-terc-buti1amina com um rendimento de 92% e um grau de pureza de 9 5%.

Exemplo 19

F1ocularam-se 2 litros de caldo de fermentação de S, ciavuligerus de acordo com o método descrito no Exemplo 2, concentra ram-se por osmose inversa até se obterem 55Q ml de uma solução aquosa de ãcido clavulãnico com uma concentração de 30.5Q mg/1, Extraiu-se a solução com meti 1isobutilcetona e secou-se com sulfato de sodio reduzindo-se para um volume de 5Q ml, Tratou-se com 0,65 g de terc-buti1ami na em 5Q ml de acetato de etilo, obtendo-se 7,58 mmoles de clavulanato de amina com um grau de pureza de 90%.

Exemplo 20

Extrairam-se com metil isobutilcetona a pH. ãcido 2010 ml de caldo floculado de acordo com o processo descrito no Exemplo 3 que apos secagem se reduziu para um volume de 43 ml, Adicionaram-se a frio 7,5 mmoles de 1,1-dimetilpropilamina e apos 1 hora de agitação obtiveram-se 1,8 g do sal correspondente do acido cia. vulãnico sob a forma cristalina com um grau de pureza de 88%.

Exemplo 21

Submeteram-se a extracção com metilisobuti1cetona nas condições habituais 500 ml de caldo de fermentação floculado e concentrado por osmose de acordo com o método descrito no Exemplo 5. Secaram-se e concentraram-se para 46 ml e adieionaram-se a frio 0,90 ml de cicl ohexi 1 ami na em 46 ml de acetato de etilo, 0 b ti_ veram-se 6,31 mmoles de clavulanato de ciclohexi1amina com um grau de pureza de 80%.

>

Exemplo 22

A partir de 515 ml de caldo floculado de acordo com o método descrito no Exemplo 4, realizou-se uma extracção com meti 1 isobuti 1 cetona a pH 2,1, Reduziu-se o volume da fase orgânica apos secagem para 14 ml e trataram-se a frio com 0,35 ml de 2-ami_ no-3,3-dimetilbutano em 14 ml de acetato de etilo, Obtiveram-se 0,55 g do sal de amina do acido clavulanico que apresentava um φ grau de pureza de 90%,

Exemplo 23

Dissolveram-se 543 mg de clavulanato de benzi; 1 -terc-butilamina obtido de acordo com o método descrito no Exemplo 8 em 75 ml de isobutanol e, apõs arrefecimento da solução, adicionaram-se, sob agitação e mantendo a temperatura abaixo de 5°C, 3 ml de uma solução 0,5 M de acetato de potássio em isobutanol e em seguida agitou-se durante 1 hora cristalizando o clavulanato

-28- / de potássio com um rendimento de 91% e um grau de pureza de 97%,

Exemplo 24

Preparou-se uma solução de benzoato de potássio em buta^ nol 0,2 M e adicionaram-se 35 ml desta solução a uma solução de 2 g de clavulanato de 1,2-dimeti1propi1amina obtida de acordo com o método descrito no Exemplo 10, em 20 ml de metanol, com arrefe cimento sob agitação, Deste modo, cristalizaram-se 1,5 g do sal de potássio do ácido clavulânico com um grau de pureza de 95%,

Exemplo 25

Dissolveram-se em 3Q. ml de isopropanol 40.8 mg de clavulanato de sec-but11amina obtido de acordo com o método descrito no Exemplo 7. Arrefeceu-se até uma temperatura inferior a 5°C e adicionaram-se, sob agitação, 3 ml de uma solução de eti 1-h.exanoato de potássio 0,5 M em isopropanol, ApÕs 1 hora de agitação a frio, cristalizaram 350 mg de clavulanato de potássio que apresentava um grau de pureza de 96%.

Exemplo 26

Preparou-se uma solução de clavulanato de N,N-dimetiletilamina, obtido de acordo com o método descrito no Exemplo 9, em isopropanol 0,05 Μ, A 30 ml desta solução adicionaram-se, a frio, 15 ml de uma solução de trimeti1 acetato de potássio 0,1 M em isopropanol. Agitou-se a mistura e apos 1 hora separaram-se 375 mg do sal de potássio do acido clavulânico com um grau de pi£ reza de 96%.

Exemplo 27

Dissolveram-se 4 mmoles de clavulanato de benzi 1-terc-butilamina obtido de acordo com o método descrito no Exemplo 18 em 100 ml de álcool isoamTlico, Arrefeceu-se a solução e adicionaram-se-lhe 8 ml de uma solução de acetato de potássio 0,05 M em álcool isoamTlico. Apos 1 hora sob agitação, a frio, obtiveram-se 900 mg de sal de potássio do ácido clavulãnico com um grau de pureza de 97%.

Espectro RMN ^H: Figura 5:

_L

5,69 (IHjJ d (J_5w__So<.= 2>4)4,88 - 4,96 _{+ 2}j)m

4,15 C2H₂,1 d (J = 7,6)

3,52 dd (J_gM=17; J^.^2,8)

3.09 ClHgp) d CJ_gem = Hi

Espectro IV: Figura 6:

3326	cm	tens.	0-H
1782	11	tens.	C=0	jB lactâmico
1703	II	tens,	c=c	hexocTcli co
1604	ti	tens.	coo

Exemplo 28

Dissolveram-se 6,8 g de clavulanato de sec-butT1amina obtido de acordo com o método descrito no Exemplo 16, em 600 ml de isopropanol. Arrefeceu-^s-e a solução e adicionaram-se 50 ml de uma solução de acetato de potássio 0,5 M em isopropanol. Após 1 hora sob agitação a frio, obteve-se clavulanato de potássio com

uma pureza de 97% e um rendimento de 94%,

Exemplo 29

Dissolveram-se 7,5 mmoles de clavulanato de terc-buti1 amina obtido de acordo com o método descrito no Exemplo 19 em 350 ml de isobutanol e trataram-se a frio com 15 ml de uma solução de fenilacetato de potássio 0,5 M em álcool isobutilico. Apõs 1 hora sob agitação, cristalizou o clavulanato de potássio com um rendimento de 95% e um grau de pureza de 96%,

Exemplo 30

Submeteram-se a tratamento 14 ml de uma solução 0,5 M do sal do acido clavulãnico com 1,1-dimetilpropi1amina, obtido de acordo com o método descrito no Exemplo 2Q, com 14 ml de uma solução de acetato de potássio 0,5 M em etanol, sob agitação e a frio. Obtiveram-se, deste modo, 1,5 g de clavulanato de potássio que apresentou um grau de pureza de 97%.

Claims

REIVINDICAgÕES >

1,- Processo para a preparação do ácido Z(2R,5R)-3-(2-hidroxietilideno)-7-oxo-4-oxa-l-azabiciclo © 3,2,0 7 heptano-2-carboxIlico e dos seus sais e ésteres aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, a partir de caldos de fermentação de

Streptomyces sp., caracterizado pelo facto de compreender as fases seguintes:

A) Floculação prévia do caldo de cultura utilizando como agentes de floculação electrólitos inorgânicos e realizando as fases intermédias seguintes:

Al) adição ao caldo de cultura do electrõlito inorgânico, com a finalidade de favorecer a acção do agente coagulante, na proporção de 0,5 a 4 g/1;

Α2) incorporação de um agente floculante inorgânico mantendo o pK entre 6 e 8;

A3) adição, uma vez iniciada a floculação, de um polielectrólito orgânico em concentrações compreendidas entre 0,01 e 0,2%;

A4) separação dos flõculos do caldo de fermentação englobando não só o micélio mas também as proteínas e partículas em suspensão; e concentração, eventual, do caldo de cultura transparente por osmose inversa;

B) Purificação do ácido clavulânico contido no caldo de cultura, floculado e decantado de acordo com a fase A, realizando as fases intermédias seguintes:

Bl) extracção directa com dissolventes orgânicos, a pH ãcido, do caldo de fermentação floculado e tratamento da fase orgânica com um agente inerte exsicante?

B2) formação, como compostos intermédios durante a purificação, de sais do ãcido clavulânico com aminas de fórmula geral na qual

R,, e R_ representam, cada um, independentemente, ou considerados conjuntamente, um átomo de hidrogénio, um grupo benzilo eventualmente substituído ou cicloalquilo ou um grupo de fórmula geral ^cn^H2n⁺¹ na qual n representa um número inteiro de 1 a 7 ou R^, ^{e R}3 encontram-se unidos entre si de modo que o átomo de azoto faz parte de um heterociclo;

C) Formação de sais de ãcido clavulânico aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, a partir dos compostos intermédios preparados na fase B), realizando as fases intermédias seguintes:

Cl) solubilização num dissolvente orgânico do correspondente sal de amina intermédio;

C2) preparação de soluções normais do sal de potássio de ácidos orgânicos, com pKa inferiores ao pKa do ãcido clavulãnico, eventualmente no mesmo dissolvente;

C3) tratamento a frio' das soluções preparadas de acordo com as fases intermédias Cl) e C2) em quantidade estequiomêtrica.
2. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar como electrólitos inorgânicos na fase

A) cloretos de metais alcalinos ou alcalino-terrosos ou cloreto de amónio.
3. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar como agente floculante inorgânico na fase intermédia A2) um sal metálico hidrolisãvel.
4.-34-

4, - Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de se utilizar como agente floculante inorgânico um policloreto de alumínio cujo teor em Óxido de alumínio estã compreendido entre 10 e 20%.
5. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar como polielectrõlito orgânico na fase intermédia A3) uma poliacrilamida sintética.
6.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar na fase intermédia B2) uma amina de fórmula geral na qual R^, R₂ e R^ representam, cada um, isoladamente, ou considerados conjuntamente um átomo de hidrogénio ou um grupo metilo, etilo, isopropilo ou t-butilo.
7.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar na fase intermédia B2) uma amina de fórmula geral na qual R^, R^ e R^ representam, cada um, isoladamente ou considerados conjuntamente um átomo de hidrogénio ou um grupo metilo, etilo, isopropilo, t-butilo ou benzilo eventualmente substituído.
8.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se realizar na fase intermédia B2) a formação e cristalização dos sais de amina, a frio, a partir de dissolventes orgânicos puros ou das suas misturas, num meio totalmente anidro,

Lisboa, 1 de Março de 1990