PT925310E - Utilizacao de polissacarideos sulfatados no tratamento de feridas cronicas - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"UTILIZAÇÃO DE POLISSACARÍDEOS SULFATADOS NO TRATAMENTO DE FERIDAS CRÓNICAS" A presente invenção refere-se à utilização de polissacarídeos sulfatados obtidos por sulfatação de derivados da celulose ou de polissacarídeos polianiónicos e às utilizações destes em composições farmacêuticas e para tratamento de feridas.

Os derivados dos sacarídeos e dos polissacarídeos sulfatados, nos quais um ou mais grupos hidroxilo em resíduos de sacarídeos individuais são substituídos por grupos sulfato, são conhecidos. Estes sacarídeos sulfatados podem ocorrer naturalmente, como no caso dos glucosaminoglicanos sulfatados como o sulfato de heparano e o sulfato de condroitina. Têm sido preparados outros sacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos sulfatados por sulfatação dos sacarídeos, oligossacarídeos ou polissacarídeos que ocorrem naturalmente.

Um derivado de um sacarídeo sulfatado sintético conhecido é o octassulfato de sacarose, obtido por sulfatação da sacarose. 0 sal de alumínio de octassulfato de sacarose insolúvel (conhecido como sucralfato) tem sido proposto para várias utilizações medicinais, incluindo a melhoria da cura de feridas na EP-A-0 230 023. A US-A-2 697 093 descreve a sulfatação da celulose, inulina, amido ou dextrina com reagentes de trióxido de enxofre--amina terciária. Os materiais sulfatados resultantes estão estabelecidos como sendo úteis como espessantes para pasta, 1 adesivos, e aditivos para lamas utilizadas nos poços de perfuração de petróleo.

Determinados polissacarideos sulfatados, e em particular os glucosaminoglicanos sulfatados, são utilizados em medicina como anti-coagulantes. Para além disso, a heparina, um copolimero altamente poli-disperso de glucosamina ligada 1-4 e de resíduos de ácido urónico, têm um papel importante no controlo da coagulação do sangue. A heparina liga-se à anti-trombina de serina inibidora da protease produzindo um complexo que acelera a proteólise da enzima responsável pela coagulação. As propriedades anti-coagulantes da heparina e dos seus análogos são conhecidos há algum tempo e têm sido utilmente aplicadas no campo da biomedicina. A preparação da heparina e dos glucosaminoglicanos sulfatados a partir de fontes naturais é cara, e desta forma é desejável um alternativa.

Foi agora verificado que a sulfatação dos derivados da celulose como a celulose regenerada oxidada (ORC) ou os polissacarideos polianiónicos como o alginato de sódio resulta em materiais polissacarideos sulfatados que têm vantagens inesperadas como materiais que curam feridas, e para além disso exibem propriedades anti-coagulantes. 0 termo "derivado de celulose" engloba qualquer éster, éter, produto de hidrólise ou produto da oxidação da celulose, aceitável biologicamente. Os derivados da celulose preferidos incluem a carboximetil celulose, a hidroxietil celulose, o acetato de celulose e, especialmente, os derivados da celulose oxidados como a celulose regenerada oxidada (ORC), ou os éteres ou ésteres de celulose oxidados descritos e reivindicados no pedido de patente US provisório USSN 60/020 758 dos mesmos 2 \ \

f autores do presente pedido e com data de 28 de Junho de 1996 e com o título de "Bioresorbable Medicai Devices from Oxidized Cellulose Derivatives". Os materiais preferidos são obtidos por oxidação da hidroxietil celulose, carboximetil celulose ou acetato de celulose com tetróxido de diazoto. 0 material mais preferido é a celulose regenerada oxidada (ORC). 0 termo "polissacarldeo polianiónico" engloba qualquer polissacarídeo biologicamente aceitável em que vários dos resíduos de sacarídeo em cada molécula de polissacarídeo compreendem um grupo aniónico como o carboxilato, ou ácido complementar ou sal de um grupo aniónico destes. Deverá ser considerado que alguns dos derivados da celulose definidos acima serão também polissacarídeos polianiónicos. Os polissacarideos polianiónicos preferidos incluem os alginatos, as pectinas, o ácido hialurónico, o amido oxidado e os derivados de celulose oxidados como descrito acima. Mais preferivelmente, o polissacarídeo polianiónico é um alginato. Os polissacarídeos polianiónicos sulfatados que ocorrem naturalmente como o sulfato de condroitina não estão incluídos no âmbito da presente invenção, que se refere apenas aos derivados polissacarídeos sintéticos (i.e. sulfatados quimicamente). A celulose regenerada oxidada (ORC) é um derivado de celulose bem conhecido que é preparado a partir de celulose como descrito na US-A-3 122 479. A oxidação dos grupos hidroxilo primários da celulose a grupos carboxilato resulta num derivado de celulose polianiónico, nomeadamente a ORC. A ORC é conhecida e utilizada no campo biomédico como um agente hemostático, como descrito na US-A-2 517 772. Está comercialmente disponível na forma de um material sob a marca registada Surgicel (Johnson & Johnson Medicai, Inc.) e como uma composição hemostática para o 3 \

tratamento de feridas sob a marca registada Interceed (Johnson & Johnson Medicai, Inc.)· Verificou-se que a ORC é quer hemostá-tica quer completamente bioabsorvivel, e desta forma apresenta vantagens importantes como material de compressa para feridas. 0 termo "alginato" utilizado aqui engloba o ácido alginico, os sais solúveis deste como o alginato de sódio, e os sais insolúveis deste como o alginato de cálcio. De preferência, o alginato é alginato de cálcio, que está disponível para utilização em compressas para feridas sob as Marcas Registadas Instat (Johnson & Johnson Medicai, Inc.) e Kaltostat (E.R. Squibb & Sons, Inc.). De preferência, o alginato tem um peso molecular no intervalo de 50 000 a 400 000 e uma proporção de ácido manurónico/ácido gulurónico de aproximadamente 0,45.

Os polissacarídeos sulfatados utilizados na presente invenção diferem dos materiais base não sulfatados por pelo menos alguns dos grupos hidroxilo nos resíduos de sacarídeos dos polissacarídeos terem sido convertidos em grupos sulfato. De preferência, uma média de pelo menos 0,1 grupos hidroxilo em cada resíduo de sacarídeo foram convertidos em grupos sulfato. Mais preferivelmente, pelo menos 1 grupo hidroxilo, em média, em cada resíduo de sacarídeo foi convertido em grupos sulfato, e mais preferivelmente entre 3 e 4 grupos hidroxilo em cada resíduo de sacarídeo foram assim convertidos.

Os polissacarídeos sulfatados podem existir na forma de ácido livre, mas serão mais normalmente utilizados na forma de um sal ou de um hidrato. 0 sal pode ser um sal com um catião de metal alcalino como o sódio ou o potássio, ou pode ser um sal formado com iões polivalentes como o cálcio ou o alumínio (por analogia com o sucralfato), ou pode ser um sal formado com 4 ί L-Ci t catiões complexos como o amónio ou o alquilamónio. Certamente, o polissacarideo sulfatado ou os seus sais solúveis pode ser armazenado ou utilizado na forma de uma solução aquosa tamponada. Em qualquer dos casos, o termo "polissacarideo sulfatado" na presente especificação engloba todos estes sais e hidratos.

Os polissacarideos sulfatados podem ser preparados com praticamente qualquer peso molecular entre 500 e 5 000 000, dependendo do peso molecular do material de partida. Os polissacarideos sulfatados de baixo peso molecular têm geralmente sais de metal alcalino que são solúveis em água, e em conformidade estes materiais que têm pesos moleculares no intervalo de 1 000 - 50 000 são preferidos em algumas aplicações. Estes materiais têm de preferência uma solubilidade de pelo menos 10 g/1, mais preferivelmente pelo menos 25 g/1 em água a pH 7.

Quando se deseja um material sulfatado insolúvel, o polissacarideo base de preferência tem um peso molecular médio no intervalo de 50 000 - 250 000, mais preferivelmente de 50 000 - 150 000. Estes polissacarideos sulfatados e/ou os seus sais são normalmente praticamente insolúveis em água. Por exemplo, a ORC sulfatada insolúvel pode ser preparada a partir de ORC fibrosa disponível comercialmente na forma de um material tecido, não tecido ou tricotado, fornecendo desta forma uma ORC sulfatada na forma de um material. A presente invenção apresenta uma composição farmacêutica compreendendo um derivado de celulose sulfatado e/ou um polissacarideo aniónico sulfatado. O termo "composição farmacêutica" inclui as composições para tratamento de feridas e 5

u compressas para feridas e implantes, assim como composições medicinais tópicas, orais ou parenterais.

Verificou-se, surpreendentemente, que os polissacarídeos sulfatados têm uma capacidade excepcional para se ligarem a matrizes de metaloproteinases (MMP's). Estas matrizes de metaloproteinases estão implicadas em várias situações clinicas, incluindo as feridas crónicas como as úlceras do decúbito. Isto porque o balanço entre a deposição da matriz e a renovação do tecido, que por seu lado pode depender do balanço entre as enzimas proteoliticas e os seus inibidores, é fundamental para curar a ferida e para outras situações clinicas. Os fluidos de feridas crónicas têm mostrado conter elevados niveis de MMP2 (Gelatinase A) e MMP9 (Gelatinase B).

Em conformidade, a presente invenção também apresenta a utilização de um polissacarideo sulfatado para a preparação de uma composição para o tratamento de situações clinicas mediadas por uma matriz de metaloproteinase. De preferência, a situação clinica é uma ferida, especialmente uma ferida crónica ou uma úlcera.

Este aspecto da invenção também engloba a utilização de uma composição farmacêutica contendo o polissacarideo sulfatado para o tratamento de uma ferida crónica como uma úlcera venosa ou uma úlcera do decúbito num mamífero por administração tópica ou sistémica desta, de preferência em conjunto com excipientes farmacêuticos convencionais. De preferência, o oligossacarídeo sulfatado é aplicado como numa composição de compressas para feridas. De preferência, o polissacarideo sulfatado é aplicado sob a forma de pomada contendo 0,1%-10% p/p do polissacarideo 6 ΐ sulfatado em conjunto com excipientes convencionais como a água e um agente gelificante.

As composições farmacêuticas em conformidade com a presente invenção podem para além disso compreender excipientes farmacêuticos convencionais e/ou outros agentes activos. Podem também ser adaptadas para administração tópica, oral ou parenteral.

Os polissacarideos aniónicos sulfatados podem ser preparados por sulfatação de um derivado de celulose ou de um polissacarideo polianiónico com complexos de trióxido de enxofre-amina terciária ou complexos de trióxido de enxofre-pi-ridina num solvente polar inerte adequado, como a N-metil pirrolidona. 0 grau de sulfatação pode ser controlado por ajuste da proporção molar entre o polissacarideo e o trióxido de enxofre, porque a reacção é essencialmente quantitativa. A extensão da sulfatação pode ser monitorizada por rmn e análise elementar, e em particular por espectroscopia de infra-vermelho.

Se se desejar um derivado de polissacarideo sulfatado de baixo peso molecular, solúvel, então a sulfatação é de preferência realizada num polissacarideo de baixo peso molecular, solúvel. Por exemplo, a sulfatação pode ser realizada em oligossacarideos ORC obtidos como descrito no pedido de patente da Grã-Bretanha co-pendente dos mesmos autores do presente n° 9 613 683.3 dos autores da presente intitulado "Oxidised Oligosaccharides". Com brevidade, os oligossacarideos ORC são preparados por tratamento da ORC comercialmente disponível com solução de hidróxido de sódio 6M a 37°C durante 45 minutos, seguido de filtração. 0 filtrado contendo os oligossacarideos ORC em solução é sujeito à neutralização e 7

diálise para remover fragmentos e impurezas tendo um peso molecular inferior a 1 000, e é em seguida liofilizado.

As formas de realização especificas da invenção serão agora também descritas, através de exemplo, com referência aos desenhos de acompanhamento, nos quais: A Figura 1 mostra a quantidade medida de MMP de ligação para um derivado de ORC sulfatado em conformidade com a presente invenção, comparada com a própria ORC e também comparada com um controlo de colagénio; e A Figura 2 mostra a quantidade medida de MMP2 e MMP9 de ligação para esponjas de alginato sulfatado/colagénio comparada coma a esponja de colagénio puro e as esponjas de alginato não sulfatado/colagénio.

Exemplo 1

Activou-se ORC (Interceed , 10 g) moída por colocação sob a forma de lama em 100 ml de água desionizada com agitação durante 40 minutos a 40°C. Filtrou-se a lama utilizando um dispositivo de Buchner, e o bolo resultante foi re-suspenso em 100 ml de ácido acético glacial e agitou-se durante mais 30 minutos a 4°C para remover o excesso de água. Filtrou-se novamente a lama e lavou-se extensivamente com N-metil pirrolidona (NMP) até todo o ácido acético estar removido.

Dissolveu-se piridina trióxido de enxofre (40 g) em 40 ml de N-metil pirrolidona, arrefeceu-se até 4°C, e adicionou-se lentamente à ORC activada. Agitou-se a lama a 4°C durante 2 horas, e ajustou-se o pH para 5,6 por adição cuidadosa de NaOH 8 2M frio. A lama neutralizada foi despejada em três volumes de metanol e recolheu-se o precipitado. Lavou-se o material sulfatado com várias porções de metanol para remover a N-metil pirrolidona antes de ser lavada com água destilada para remover sulfato de sódio não ligado. Congelou-se o material e liofilizou-se. A análise FT-IV do material revelou que todos os grupos hidroxilo primários e um ou mais dos grupos hidroxilo secundários eram sulfatados. 0 produto é o sal de sódio insolúvel da ORC sulfatada.

Exemplo 2

Repetiu-se o procedimento de Exemplo 1 com uma amostra de 10 g de material de ORC Interceed®, resultando num produto de material de ORC sulfatado.

Exemplo 3

Preparou-se como se segue um material compósito consistindo num complexo entre a ORC sulfatada em conformidade com a presente invenção e colagénio.

As fibras de ORC sulfatada (0,875 g) preparadas como no Exemplo 1 foram suspensas em 10 ml de ácido acético 0,06 M destilado e agitou-se até ficarem completamente dispersas. Pôs--se sob a forma de lama colagénio de bovino, que foi completamente tratado com água de cal, liofilizado e moído até fibras de 1 mm (1, 625 g) , em 250 ml de ácido acético 0,05 M e homogeneizou-se durante 15 segundos num "Waring Blendor". Adicionou-se a suspensão de ORC sulfatada à lama de colagénio, e 9 Γ

t homogeneizou-se a mistura durante mais 15 segundos. Recticulou--se a lama por adição de 0,0325 ml de HMDI, seguido de homogeneização durante 2 x 15 segundos. Desgaseificou-se a lama sob vácuo, depejou-se para placas de Petri de 9 cm por 9 cm, congelou-se e liofilizou-se. As esponjas resultantes foram esterilizadas com irradiação gama.

Exemplo 4

Preparou-se um alginato de cálcio sulfatado a partir de ácido Alginico fornecido pela Sigma Chemical Company (A7003). Sulfatou-se uma amostra deste material (10 g) como descrito no Exemplo 1.

Exemplo 5

Preparou-se um material compósito consistindo num complexo entre o alginato sulfatado obtido no Exemplo 4 e o colagénio pelo procedimento descrito no Exemplo 3, utilizando fibras de alginato sulfatado moido em vez de fibras de ORC sulfatada.

Procedimento 1: Efeito da Sulfatação na Ligação da Matriz de Metaloproteinase pela ORC O efeito da sulfatação da ORC na ligação na matriz de metaloproteinase (MMP) foi obtido como se segue.

Preparou-se a ORC sulfatada pelo procedimento descrito no Exemplo 2. Preparou-se uma esponja de colagénio livre de ORC para efeitos de comparação. Também se preparou uma amostra de material de ORC Surgicel® para comparação. 10

u

Brevemente colocaram-se 50 mg de cada material num copo de plástico de 15 ml contendo 2,5 ml de um fluido de ferida aguda diluído a 1:50 num tampão de proteolise (tris 50 mM/HCl pH 7,8, CaCl2 50 mM, NaCl 0,5 M) e incubou-se a 37°C num banho-de-maria com agitação durante 3 horas.. 0 fluído de ferida aguda contém várias proteinases, incluindo matrizes de metaloproteinases e muitas destas enzimas ligar-se-ão preferencialmente a vários materiais de compressas. O excesso de fluído absorvido por cada material foi mecanicamente expresso utilizando uma espátula de metal e deitado fora. As compressas restantes foram colocadas em seringas de 2 ml pré-embaladas (cada seringa continha um volume de 0,5 ml de contas de vidro de 2,5 mm). Forçou-se 4 ml de tampão de proteolise através da seringa em alíquotas de 1 ml que foram deitadas fora. Nesta fase de lavagem todas as proteinases não ligadas e as proteinases que foram apenas fracamente ligadas ao material das feridas foi removido das compressas deixando as formas mais fortemente ligadas. A compressa lavada com tampão foi em seguida removida para outro copo de plástico de 15 ml. Adicionou-se 1 ml de tampão amostra não desnaturado (6,3 ml de tris 0,05M/HC1 pH 6,8, 2,5 ml de glicerol, 0,5 g de SDS, 16,2 ml de água e azul de bromofenol) a cada amostra que se colocou num agitador orbital na posição seis durante 2 horas, o tampão amostra separou as proteinases fortemente ligadas dos materiais que estão agora presentes na própria amostra tampão. Após este tempo retiraram-se 20 microlitros de tampão amostra de cada contentor e sujeitou-se a electroforese em substracto de gelatina SDS-gel de poliacrilamida (zimografia) como descrito por Heussen C. e Dowdle E.B. em Anal. Biochem. 102:196-202 (1980).

As áreas das zonas individuais de clarificação nos géis, que são devidas à actividade da proteinase, foram exactamente 11 f—' í L· medidas pelo sistema "Optilab". Isto obteve-se por repetição de cada experiência de ligação (n=3) e análise dos resultados estatisticamente pelo teste T de Students, em que P < 0,05. A análise foi contra o controlo de colagénio puro.

Os resultados mostrados na Figura 1 demonstram um aumento sinérgico surpreendente na ligação MMP para a ORC sulfatada. Na Figura 1, a Pro2 e a Pro9 são formas de pró-enzima de MMP2 e de MMP9. Quer a MMP2 quer a MMP9 podem existir como formas activas de uma pró-enzima. 0 peso molecular da proMMP9 ou da pro9 é 92kDa. A activação da MMP é um processo em dois passos, ocorre uma alteração conformacional na proenzima, seguida de remoção do pró-peptideo por uma série de alterações autocataliticas. O peso molecular das formas activas resultantes é 86 kDa para a ActMMP9 e 66 kDa para a ActMMP2, algumas vezes denominadas ACT9 e ACT2 em abreviatura.

Procedimento 2: Efeito da Sulfatação do Alqinato na Ligação da Matriz de Metaloproteinase por Complexos de Colagénio--Alqinato:

Repetiu-se o procedimento 1 nas amostras seguintes: uma esponja de colagénio puro (experiência comparativa), esponjas de colagénio/alginato de cálcio contendo 5% e 20% p/p de alginato (experiências comparativas identificadas como 5% ALG e 20% ALG) , e esponjas de colagénio/alginato de cálcio sulfatado contendo 5%, 10% e 20% p/p de alginato de cálcio sulfatado, preparado como descrito no exemplo 5 e identificado como 5% SALG, 10% SALG e 20% SALG.

Os resultados são mostrados na Figura 2. Pode ver-se que as esponjas de colagénio/alginato sulfatado exibem uma ligação mais 12 forte quer à MMP2 (Gelatinase A) quer à MMP9 (Gelatinase B) do que as esponjas de comparação.

As formas de realização especificas da presente invenção descritas acima têm somente o objectivo de ilustração. Serão manifestas ao leitor especialista muitas outras formas de realização que caem dentro do âmbito das reivindicações acompanhantes.

Lisboa, 30 de Agosto de 2000

O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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Claims (11)

1. u

   REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um polissacarídeo quimicamente sulfatado seleccionado no grupo consistindo em derivados de celulose sulfatados e polissacarideos polianiónicos quimicamente sulfatados para a preparação de uma composição para o tratamento de uma ferida crónica.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o polissacarídeo sulfatado é seleccionado no grupo consistindo em hidroxietil celulose sulfatada, carboximetil celulose sulfatada e celulose regenerada oxidada sulfatada.
3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 2, em que o polissacarídeo sulfatado é celulose regenerada oxidada sulfatada.
4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o polissacarídeo sulfatado é seleccionado no grupo consistindo em alginatos sulfatados, pectinas sulfatadas e ácido hialurónico sulfatado.
5. 5. Utilização de acordo com a reivindicação 4, em que o polissacarídeo sulfatado é um alginato sulfatado.
6. 6. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o polissacarídeo sulfatado compreende em média pelo menos 0,1 grupos sulfato para cada resíduo de sacarídeo do polissacarídeo.
7. 7. Utilização de acordo com a· reivindicação 6, em que o polissacarídeo sulfatado compreende uma média pelo menos 1 1 grupo sulfato por cada resíduo de sacarídeo do polissacarídeo.
8. 8. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o polissacarídeo sulfatado tem um peso molecular médio no intervalo de 25 000 a 250 000.
9. 9. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o polissacarídeo sulfatado está na forma de material tecido, não-tecido ou tricotado.
10. 10. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o polissacarídeo sulfatado está na forma de um complexo sólido com colagénio.
11. 11. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o polissacarídeo sulfatado é solúvel em água numa extensão de pelo menos 10 g/1 a 25°C. Lisboa, 30 de Agosto de 2000 O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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