PT92498A - Processo para a preparacao de racoes alimentares de elevado valor para a producao animal contendo produtos enzimaticos para a lisagem de bacterias e proteases como ingredientes activos - Google Patents

Description

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Descrição referente à patente de invenção de HOECHST AKTIENGESELLBCHAET, alemã industrial e comercial, com sede D-6230 Frankfurt am Main 80, Republica Eederal Alemã, (inventores: Dr. Andreas Lotz, Dr Hans-Dister Pries, Dr. Gerhard Wõhner e Dr. Stefan Eugen Scheuermann, residentes na Alemanha Ocidental), para "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE RAÇÕES APIMENTARES DE ELEVADO VALOR PARA A PRODUÇÃO ANIMAL CONTENDO PRODUTOS ENZIMATICQS PARA A LI-SAGEM DE BACTÉRIAS E PROTEASES COMO IN-GREDIENTES ACTIVOS"

Descrição Ê já conhecida a utilização de aditivos em rações para animais com o objectivo de melhorar o valor alimentar. Tais aditivos de melhoramento são principalmente substâncias com acção anti-bacteriana, como por exemplo a Flavomi-cing^, uma mistura de vários antibióticos fosfoglicolipídicos, as moenomicinas, cuja utilização como aditivo alimentar se encontra descrita na patente alemã 12 03 107.

De acordo com a WO 8904-320 prepara-se um lisozima animal através de um microorganismo modificado por engenharia genética. Um lisozima deste tipo pode empregar-se como aditivo alimentar para ruminantes para melhorar o aumento de peso.

Na SU 1397-019 descreve-se uma mistura de lisozima e ácido cítrico ou ácido acético como estimulador - 1 -

Descobriu-se então surpreendentemente que a utilização de um produto enzimático que provoca a liso-gem de bactérias, originário de Streptomyces coelicolor DSM 3030, bem como os respectivos mutantes e variantes que também produzem esse produto enzimático, I muito útil como aditivo alimentar. Pode igualmente utilizar-se uma mistura do produto enzimático que provoca a lisagem de bactérias com protease em rações animais, com muito bons resultados no aumento de peso e no rendimento alimentar de animais. A invenção refere-se assim: 1, A utilização de um produto enzimático que promove a lisagem de bactérias, originário de Streptomyces coelicolor DSM 3030, bem como dos respectivos mutantes e varia£. tes, como aditivo em rações animais. 2. A utilização de uma mistura do produto enzimático que provoca a lisagem de bactérias com activida-de de N-acetilmuramidase e de protease, como aditivo em rações para animais. 3. A rações alimentares que contêm 0 produto caracterizado em 1. ou 2. como aditivo.

Em seguida ilustra-se detalhadamente a invenção, em especial nas suas formas de concretização preferenciais. Além disso, define-se a invenção no conteúdo das reinvindicações. 0 produto enzimático com actividade de E-acetilmuramidase, originário do DSM 3030, pode empregar-se tanto na forma pura como também transformado com outras substâncias, por exemplo com resíduos de fermentação ou proteínas. . A preparação deste produto enzimático a partir de Streptomyces - 2 - Γ\

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ooelicolor DSM 3030, bem como a sua caracterização, é conheci-da do registo de patente alemão 34- 40 735. 0 Streptomyces coelicolor DSM 3030 cultiva-se por exemplo num meio nutriente, que contém melaço de beterraba açucareira numa quantidade de 5 a 50 g, de preferência de 10 a 20 g por litro de meio de cultura. Quando se adicionam ao meio iões cálcio na forma de sais de cálcio não venenosos ligeiramente solúveis, pode aumentar-se ainda mais o rendimento. É conveniente uma concentração de cálcio de 0,05 a 1 molar. 0 produto enzimático é segregado no meio de cultura. 0 enzima com actividade de U-acetilmuramidase pode remover-se numa forma purificada, a partir deste mgio, por meio de métodos em si conhecidos, poreexemplo por precipitação ou extracção. Não e contudo imprescindível tratar a camada sobre-nadante de fermentação para obter o produto enzimático que promove a lisagem de bactérias, bastando apenas adicioná-lo direc-tamente à ração na forma de produto seco, k secagem da camada sobrenadante de fermentação efectua-se de preferência por meio de secagem em aerosol.

Um produto enzimático que provoca a lisagem de bactérias preparado desta maneira encontra-se contudo associado com proteaaes. Para se o obter o produto enzimático puro pode efectuar-se uma purificação por meio de cromatografis. de permuta iónica em permutadores catiénicos macroporosos fracamente ácidos. Um processo deste tipo encontra-se descrito no pedido de patente europeu 280 032. 0 produto enzimático assim obtido I estável e activo, com respeito à sua actividade de lisagem, numa gama de pH de menos de 3 a 9. Apés 16 horas de incubação à temperatura ambiente numa mistura de tampões a actividade máxima na gama de pH de 3 a 9 mantinha-se ainda pelo menos a 80%. - 3 - y y

t A temperatura óptima para a actividade do produto enzimático que provoca a lisagem de ‘bactérias situa·· -se na gama de 50 a 60°0. Nesta gama atinge-se pelo menos 90% da actividade máxima. A partir de temperaturas mais baixas a actividade aumenta lentamente com a temperatura atl 60°0 s à temperatura ambiente ela ê de oerca de 10%, a 30°G de cerca de 30%, a 40°0 de cerca de 60% da actividade máxima. A temperaturas mais altas a actividade decai rapidamente : a 65°0 ainda é de cerca de 30%, a 70°0 é de 10% da actividade máxima.

Pode também empregar-se um produto enzima-tico que promove a lisagem de bactérias misturado com proteases!. De acordo com a invenção, nesse caso, pode utilizar-se em princípio qualquer produto enzimático que provoca a lisagem de bactérias com actividade de N-acetilmuramidase. Um produto enzimático desse tipo é constituído principalmente por um ou mais enzimas com a actividade de N-acetilmuramidase, podendo também contudo esse enzima estar transformado com outras substâncias, por exemplo resíduos de fermentação. 0 produto enzimático pode obter-se a partir de tecidos vegetais ou animais ou ser de origem microbiana. Ê particularéiente apropriado um produto enzimático que provoca a lisagem de bactérias obtido a partir de Str4-ptomgrces coelicolor DSM 3030 bem como de um dos seus variantes ou mutantes. As proteases são priúèipalmente enzimas análogos â tripsina ou à quimotripina. A utilização de misturas enzimáti[-cas proteases tem a vantagem de se obterem com esses produtos melhores resultados no valor alimentar das rações. A relação entre o produto enzimático que provoca a lisagem de bactérias e a proteasesdeve situar-se na gama de 1:1 a 1000:1, de preferência na gama de 100:1 a 500:1, em relação à actividade enzi-mática. 0 produto enzimático que provoca a lisagem de bactérias obtido a partir da DSM 3030 bem como a mistura enzimática também referida podem adicionar-se em princípio a qualquer ração animal. São particularmente apropriadas as que _ ij. _ > ϊ

são compatíveis com as prescrições do fabricante das rações, como as rações isoladas, rações complementares e rações mine-rais. 0 produto enzimático que provoca a lisag gem de bactérias pode dosear-se na gama de 0,1 a 100 000 ppm, de preferência na gama de 1 a 1000 ppm. A actividade de lisa-gem do produto enzimático exprime-se normalmente em unidades (U). A quantificação da actividade de N-acetilmuramidase efecti -se do modo decrito na patente alemã 34- 40 735· 0 seu teor conveniente na ração animal deve ser de 0,1 a 100 U/mg de ração de preferência entre 0,5 e 50 U/mg. 0 produto enzimático isoladamente ou em mistura adiciona-se à ração como uma carga nas proporções ponderais convenientes. É importante neste caso que a distribuição do ingrediente activo na ração sega homogénea.

As rações animais que contêm o produto enzimático que provoca a lisagem de bactérias, obtido a partir da D SM 3030 ou que contêm este produto enzimático misturado com protease, podem utilizar-se para a alimentação de quaisquer animais, em especial para a alimentação de animais de criação para alimentação humana, em particular frangos, perus, porcos e vacas. A adição do produto enzimático que provoca a lisagem de bactérias ou da sua mistuna às rações animais aumenta 0 seu rendimento efectivo e provoca um maior crescimento dos animais daí resultante. A sua utilização como aditivo das rações tem, em comparação com os aditivos de acção antibiótica, a grande vantagem de não existir o perigo de criação de resistência quando se empregam durarft© períodos de tempo prolongados . - 5 -

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Os exemplos que se seguem destinam-se a melhor ilustrar a invenção.

Exemplo 1:

Oultura do S. coecicolor DSM 3030

Inoculou-se um meio de agar de fundo inclinado, que continha 2% de farinha de soja, 2% de manite e 1,3 % de ogar (pH 7,5)> com Straptomyces coelicolor DSM 3030, e cultivou-se durante 10 dias a 30°0. Misturou-se a cultura com 10 ml de uma solução estéril de 0,9% de UaCl e 0,01% de um agente tensioactivo não iónico e suspenderam-se os esporos. Utilizaram-se 0,2 ml da suspensão de esporos como inóculo de uma cultura agitada de 100 ml de meio de cultura em 300 ml de substrato de cultura.

Utilizaram-se os meios de cultura nSs 1 a 3 indicados na Tabela 1, inocularam-se e agitaram-se a 30°0 com uma frequência de 160 Upm. Apés 2, 4 e 6 dias retiraram-sê amostras, centrifugaram-se as células e determinou-se a activi-dade do produto enzimático que provoca a lisagem de bactérias na camada sobrenadante de cultura (Tabela 2). 0 rendimento mais elevado em produto enzimático que provoca a lisagem de bactérias obtève-se com a solução nutriente 3, que para alem de glucose, farinha de soja e peptona de caseína continha 2% de melaço de beterraba açucareira. - 6 - t y Tabela 1s Meios de cultura % Meio H2 12 3 Glucose 2 1 Manite 2 Farinha de soja 2 1 0,5 Peptona de caseína 0,5 Melaço 1 2 Tabela 2: Actividade do produto enzimático terias na camada sobrenadante de que provoca a lisagem de bac-cultura (U/ml) Tempo de Fermentação dias Meio N2 12 3 2 21 15 363 4 367 378 1106 6 236 558 2088 Exemplo 2: Aumento de rendimento por adição de cálcio Oultivou-se Streptomyces colicolor DSM 3030, do modo descrito no exemplo 1, num substrato nutriente que continha 1% de glucose, 2% de melaço, 0,3% de farinha de soja, 0,5% de peptona de caseína e 0,5% de 0a012 x HgO. Através da adição de CaOlg obteve-se um aumento efectivo do rendimento em produto enzimático que provoca a lisagem de bactérias na camada sobrenadante de cultura, após 2, 4 e 6 dias de 768 U/ml, 2462 U/ml e 4715 U/ml. - 7 -

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Exemplo 3 '* a) Determinação da actividade do produto enzimático que provoca a lisagem de iDactêrias: A 2,8 ml de uma suspensão de 0,2 mg de Micrococcus Luteus ATOO 4698 (Soehringer Mannheim) por ml de tampão de acetato de sódio 0,1 M (pH 5»0) adicionam-se com uma pipeta 0,2 ml de uma amostra contendo o produto enzimático que provoca a lisagem de bactérias, e determina-se a diminuição da turvaçao a 25°C por medição da extinção a 450 nm. Define-se como 1U a diminuição de extinção de 0,001 unidades da escala do fotómetro por minuto. b) Determinação da actividade da protease com azocaseína: Material deppartidas

Tampãoi tampão de fosfato de sódio 0,1 M (pH 7,0)

Solução de azocaseína: 250 mg de azocaseína + 10 ml de tampão - - agitar ate não se dissolver mais azocaseína; centrifugar a azocaseína não dissolvida utilizar a camada sobrenadan-te para o teste.

Execução do teste:

Pipetar para tubos de vidro de centrífuga de 1,5 ml Amostra Branco - 2 ml de amostra - 2 ml de amostra - 0,5 ml de tampão (adicionar) - pré-aquecer a +40°0 em banho maria durante 15 min. Λ adicionar +0,5 ml de solução de azocaseína (40 0) - misturar - incubar durante 30 min. a +40°0 em banho maria - adicionar +0,2 ml de ácido perclórico a 70% (fim da reacção) - 8 -

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- misturar - deixar em repouso durante 5 minutos à temperatura ambiente - centrifugar a caseína precipitada - determinação fotomêtrica da camada sobrenadante (E,[/|Q)

Valor - 0 : em vez da amostra utiliza-se tampão no teste. 0 valor - 0 deve ser (E^) 0,050 - 0,06). Oálculo í IIJaZOc /ml - ΔΕ 0,001 - (ΔΕ - valor - 0)xlQ0 x diluição min 30

Exemplo 4-;

Teste de 6 meses com bois de engorda

Hum teste de 6 meses com bois de engorda administrou-se a grupos de 9 animais cada doses de 100 ppm ou 200 ppm de produto enzimático por animal e dia (obtido por secagem da camada sobrenadante de cultura após separação das células de Streptomyces coelicolor DSM 3030) por Kg de suplemento alimentar, o que corresponde a uma dosagem de mistura enzi-mática mídia de 326 mg ou 4-54- mg por animal e dia. Para além do aumento do crescimento causado pelo preparado e da valorização da ração não se verificou nos animais tratados quaisquer outras alterações.

Exemplo 5?

Teste com ratos

Administrou-se a ratos na gama de peso . de 5-180 g de massa viva uma ração para ratos estandardizada - 9 -

; * (Altromin RS 3121, Altromin International, Lage Lippe, RJ?. Alemã) que correspondia às exigências de ratos em crescimento. Utilizaram-se 6 animais por tratamento e distribuiram-se pelos grupos "controle" (sem aditivo), grupo de teste I (19 U de li-sosima/mg de ração) e grupo de teste II (8 U de lisosina/mg de ração). Mantiveram-se os animais isolados em gaiolas.

Para cada animal registou-se a comida consumida diariamente e o peso em cada semana. A uma fase de alimentação de 14 dias seguiu-se um período de 7 clias de balan· ço de azoto com colheita quantitativa de excremento e urina. A partir da diferença entre a ingestão de azoto pela alimentação e a eliminação de azoto através dos excrementos e da urina, determinou-se a retenção de azoto como medida do teor proteico.

Resultado (Tabela 1): 0 aumento de peso dos grupos de teste I e II foi de 4,2 e 3?1% respectivamente, e o consumo de alimento diminuiu em média cerca de 3»3%· A retenção de azoto melhorou em média 28,5 e 25,2% respectivamente.

Exemplo 6;

Teste com leitões

Administrou-se a leitões com a gama de peso de 15-25 hg de massa viva uma mistura alimentar à base de cereais, sega e farinha de peixe, complementada segundo as exigências com vitaminas e oligoelementos (Tab. 3)· 0 grupo de controle (ns 10) e o grupo de teste (ns 7) receberam a ração sem e com aditivo de 10 U de lisosima/mg de ração, respectivamente . - 10 -

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Tabela 2

Efeito da combinação lisosima/protease em leitões

Aotividade Lisosima Protease (U/mg de ração) Aumento de peso diário g/a. Valorização da ração Controle 400,7 1,89 ± 77,3 ± 0,30 100,0 100,0 10 6,7‘ICT5 4-19,5 1,73 + 61,2 ±0,20 104,7 91,5

Tabela 5

Composição da ração em percentagem

Cevada 20,0 Trigo 10 ,0 Aveia 6,0 Milho 25,2 Linho 5,5 Farinha de luzerna 4,0 Soja 18,0 Farinha de peixe 4,0 Farela de trigo 5,0 Vitaminas e mistura de minerais 2,3 - 13 -

Claims (1)

1. REIVINDICAÇÕES - la - Processo para a preparação de uma ração alimentar de elevado valor para a produção animal, caracteriza-do por se adicionar como ingrediente activo um produto enzimá-tico que promove a lisagem de bactérias, da espécie Streptomy-ces coeiicolor DSM 3030, bem como os respectivos mutantes e variantes, às rações animais usuais. - 2a - Processo para a preparação de uma ração alimentar de elevado valor para a produção animal, caracteriza-do por se adicionar como ingrediente activo uma mistura de um produto enzimático que promove a lisagem de bactérias, de acordo com a reivindicação 1, com actividade de N-acetilmuramidase. e de uma protease, às rações animais usuais. - 5* - Processo de acordo com a reivindicação 2. caracterizado por se empregar como produto enzimático que provoca a lisagem de bactérias uma estirpe de Streptomyces coeli-color DSM 3030, as respectivas variantes ou mutantes. - m - Processo de acordo com a reivindicação 2. caracterizado por o produto enzimático que promove a lisagem de bactérias se empregar na forma de um meio nutriente seco. - 5» - Processo de acordo com uma ou mais das - 14 - t- reivindicações 1 a 4, caracterizado por o produto enzimático que promove a lisagem de Meterias contido na ração animal ter uma actividade de N-acetilmuramidase de 0,1 a 1000 U/mg de ração. - 6a - Processo de acordo com a reivindicação 5 caracterizado por a actividade ser de 0,5 a 5 U/mg. - 7a - Processo de acordo com uma ou mais das reivindicações 2 a 6, caracterizado por a proporção entre o produto enzimático que provoca a lisagem de bactérias e a pro-tease se situar na gama de 1:1 a 1000:1, calculada com base na actividade enzimática. - 8B - Processo de acordo com a reivindicação 7 caracterizado por a proporção aí referida se situar na gama de 100:1 a 500:1. A requerente reivindica a prioridade do pedido alemã apresentado em 7 de Dezembro de 1988, sob o No. P 38 41 I52.O. Lisboa, 6 de Dezembro de 1989

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