HU206447B

HU206447B - Method for increasing the mass gain in weight of animals and improving the fodder utilization by applying bacteriolysing enzimes and proteases and method for producing fodders serving for the same

Info

Publication number: HU206447B
Application number: HU896443A
Authority: HU
Inventors: Andreas Lotz; Hans-Dieter Pries; Gerhard Woehner; Stefan Eugen Scheuermann
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1988-12-07
Filing date: 1989-12-06
Publication date: 1992-11-30
Also published as: HU896443D0; DE3841152A1; DK614389A; AU623202B2; AU4589089A; DD290798A5; EP0372502A2; CA2004811A1; EP0372502A3; ZA899303B; PT92498A; HUT55613A; DK614389D0; US5147642A; JPH02207756A

Description

A találmány tárgya eljárás állatok takarmányhasznosításának és tömeggyarapodásának javítására baktériumlizáló enzimek vagy baktériumlizáló enzimek és proteázok alkalmazásával.

Az állatok takarmányozásában ismertek olyan adalékanyagok, amelyeket a takarmányhasznosítás javítása érdekében alkalmaznak. Ezek a hatásfokozók túlnyomórészt antibakteriális hatású anyagok, mint például a flavomicin - ami különböző foszfoglikolípid antibiotikumok keveréke - és a moenomicin. A moenomicin takarmány-adalékanyagként való alkalmazását a 1203 107 Isz. NSZK-beli szabadalmi leírásban ismertetik.

A 89/04320 nemzetközi közzétételi számú szabadalmi leírás szerint állati lizozimet genetikailag módosított mikroorganizmus segítségével állítanak elő. Ilyenfajta lizozimet takarmányadalék formájában kérődzők súlygyarapodásának elősegítésére lehet felhasználni.

A 1397 019 sz. szovjet szabadalmi leírásban állatok növekedésének gyorsítását előidéző lizozim és citromsav vagy ecetsav keverékét írják le.

A 3 701835 számú német szövetségi köztársaságbeli közrebocsátási iratban ismertetik a Streptomyces coelicolor lizáló enzimjeinek alkalmazását sejt és hús tartósítására, A 63 264 424 számon publikált japán szabadalmi leírásban tartós takarmány előállítására használnak adalékanyagként többek között lizozimet és proteázokat.

Meglepő módon azt tapasztaltuk, hogy Streptomyces coelicolor DSM 3030-ból, valamint ennek mutánsaiból és variánsaiból származó baktériumlizáló enzimek előnyösen alkalmazhatók takarmány-adalékanyagként, különféle állatok tömeggyarapodásának és takaimányhasznosításának fokozására. Ugyanígy nagyon jó tömeggyarapodási és takarmányhasznositási eredményre vezet, ha a fenti baktériumlizáló enzimek és proteázok keverékét adjuk a takarmányhoz.

A találmány tárgya:

1. Eljárás állatok takarmányhasznosításának javítására és tömeggyarapodásának fokozására úgy, hogy Streptomyces coelicolor DSM 3030-ból, valamint ennek mutánsaiból és variánsaiból származó Nacetilmuramidáz aktivitású baktériumlizáló enzimeket használunk állati takarmányok adalékanyagaként.

2. Eljárás állatok takarmányhasznosításának javítására és tömeggyarapodásának fokozására úgy, hogy Streptomyces coelicolor DSM 3030-ból, valamint ennek mutánsaiból és variánsaiból származó Nacetilmuramidáz aktivitással rendelkező baktériumlizáló enzimek és proteázok keverékét használjuk állati takarmányok adalékaként.

3. Eljárás az 1., illetve 2. pontban jellemzett enzimeket adalékként tartalmazó, állati tömeggyarapodást fokozó takarmányok előállítására.

A kővetkezőkben részletesen ismertetjük a találmányt, különösen annak előnyös megvalósítási módjait.

A Str. coelicolor DSM 3030-ból származó Nacetilmuramidáz aktivitással rendelkező enzimeket alkalmazhatjuk tisztán, vagy más anyagokkal, például fermentációs maradékokkal vagy proteinekkel együtt. Ezeknek az enzimeknek a kinyerését Streptomyces coelicolor DSM 3030-ból, valamint az enzimek jellemzését a 3 440 735 sz. NSZK-beli nyilvánosságrahozatali iratban részletesen leírják.

A Streptomyces coelicolor DSM 3O3O-at például a tenyésztőközeg 1 literében 5-50 g, előnyösen 10-20 g cukortépa melaszt tartalmazó táptalajon szaporítják. Amennyiben a közeghez könnyen oldódó, nem mérgező kalciumsó formájában kalciumionokat adunk, akkor a kihozatal tovább növelhető. Előnyös a 0,05-1 mól kalcium-koncentráció.

Az enzimek a tenyésztőközegbe kiválnak. Ettől a közegtől önmagában ismert módon, például kicsapás vagy extrakció útján ki lehet nyerni a tisztított, Nacetilmuramidáz aktivitású enzimet. Nem feltétlenül szükséges azonban a fermentáció felülúszójából kinyerni a baktériumlizáló enzimeket, hanem elégséges azt szárított termékként közvetlenül hozzáadni a takarmányhoz. A fermentáció felülúszóját előnyös porlasztva szárítani.

Az ily módon előállított baktériumlizáló enzimek azonban proteázokkal társulnak. Annak érdekében, hogy tiszta enzimet kapjunk, ioncserélő kromatográfiás úton tisztítást végezhetünk enyhén savas, nagyporozitású kationcserélőn. Erre megfelelő tisztítási eljárást írnak le a 280 032 sz. európai közrebocsátási iratban.

A kapott baktériumlizáló enzimek liíikus aktivitása

3-9 közötti pH-tartományban stabil és hatékony. Az enzim ebben a pH-tartományban legnagyobb aktivitásának még legalább 80%-át megtartja szobahőmérsékleten, pufferkeverékben végzett 16 órás inkubálás után.

A baktériumlizáló enzimek aktivitásának hőmérsékletoptimuma 50-60 °C között van. Az e feletti hőmérséklet-tartományban elérjük a legnagyobb aktivitás legalább 90%-át Alacsonyabb hőmérsékletekről indulva az aktivitás az emelkedő hőmérséklettel 60 °C-ig lassan növekszik: a legnagyobb aktivitásnak kb. 10%-a szobahőmérsékleten, kb. 30% 30 ^eC-on, kb. 60%-a 40 °C-on. Magasabb hőmérsékleten az aktivitás gyorsan csökken: a legnagyobb aktivitásnak még kb. 30%-a 65 °C-on, kb. 10%-a 70 °C-on megmarad.

Baktériumlizáló enzimeket proteázokkal keverve is alkalmazhatunk. Emellett a találmány szerinti eljárásban alkalmazva elvileg minden egyes baktériumlizáló enzimnek lehet N-acetilmuramidáz-aktivitása. Ilyenféle enzimek főként egy vagy több N-acetil-muramidáz aktivitással rendelkező enzimből állnak, ezek az enzimek azonban össze lehetnek keverve más anyagokkal, mint például fermentációs maradékokkal is. Az enzimeket növényi vagy állati szövetekből nyerhetjük ki, de lehetnek mikrobiológiai eredetűek is. Különösen alkalmasak a Streptomyces coelicolor DSM 3030-ból, valamint annak variánsaiból és mutánsaiból kinyert baktériumlizáló enzimek. A proteázok esetében mindenekelőtt a tripszin-, illetve a kimotripszin-féle enzimek jöhetnek szóba. Előnyös proteáztartalmú enzimkeveréket alkalmazni, mert a takarmányhasznosításban ezzel

HU 206 447 Β a termékkel jobb eredmények érhetők el. A baktériumlizáló enzimek és a proteázok közötti arány, enzimaktivitásra vonatkoztatva 1:1-1000:1, előnyösen 100:1-500:1.

A DSM 3030-ból származó baktériumlizáló enzimek, valamint a fentiekben leírt enzimkeverék elvileg valamennyi takarmányhoz hozzákeverhetek. Előnyösek például azok a takarmányok, amelyek megegyeznek a takarmány törvény előírásával, mint például az önmagukban alkalmazható takarmányok, a kiegészítő takarmányok és az ásványi anyagot tartalmazó takarmányok.

A baktériumlizáló enzimeket 0,1-100000 ppm, előnyösen 1-1000 ppm mennyiségben adagolhatjuk a takarmányhoz. A litikus aktivitást a szokásos módon egységekben (E) adjuk meg. Az N-acetilmuramidáz aktivitást a 3 440735 sz. NSZK-beli nyilvánosságrahozatali iratban leírtak szerint mérjük. Az aktivitás célszerűen 0,1-100 E/mg takarmány, előnyösen 0,550 E/mg takarmány.

Az enzimeket egyenként vagy keverékben a súlyviszonyoknak megfelelően sarzsonként keverjük a takarmányhoz. Fontos a hatóanyag egyenletes eloszlatása a takarmányban.

A DSM 3030-ból származó baktériumlizáló enzimeket, illetve baktériumlizáló enzimek és proteázok keverékét tartalmazó takarmányokat valamennyi állat takarmányozására felhasználhatjuk, de különösen előnyös mezőgazdasági haszonállatok, különösképpen broilerek, pulykák, sertések és szarvasmarhák takarmányozására.

A baktériumlizáló enzimek vagy a keverék hozzáadása a takarmányhoz jelentősen javítja annak hasznosulását és ezzel együtt fokozza az állatok növekedését. Takarmány-adalékanyagként történő felhasználásuk, az antibiotikus hatású adalékanyagokkal összehasonlítva, azzal a nagy előnnyel jár, hogy nem áll fenn a rezisztencia kialakulásának a veszélye, ha hosszabb időn át alkalmazzuk.

Az alábbiakban példák segítségével szemléltetjük a találmány szerinti eljárást.

/. példa

Streptomyces coelicolor DSM 3030 szaporítása

2% szójalisztet, 2% mannitot és 1,5% agart (pH-7,5) tartalmazó ferdefelületű agart Streptomyces coelicolor DSM 3030 törzzsel beoltunk és 10 napig 30 °C-on szaporítunk. A ferde tenyészetet 10 ml 0,9% NaCl-ot és 0,01% nemionos tenzidet tartalmazó steril oldattal összekeverjük és a spórákat leöntjük. A spóraszuszpenzió 0,2 ml-ét 300 ml űrtartalmú lombikban 100 ml tenyésztőközeget tartalmazó lombiktenyészet oltására használjuk.

Az I. táblázat 1-3. számú tenyésztőközegét egy-egy lombikba helyezzük, beoltjuk és 30 °C-on 160 fordulat/perc frekvenciával rázzuk. 2,4 és 6 nap után mintát veszünk, a sejteket lecentrifugáljuk és meghatározzuk a baktériumlizáló enzimek aktivitását a tenyészetben (II. táblázat).

Baktériumlizáló enzimre nézve a legnagyobb kihozatalt a 3. tápoldattal értük el, amely glükóz, szójaliszt és kazeinpepton mellett 2% cukorrépamelaszt is tartalmazott.

/. táblázat

Táptalajok %	Tápoldatszám
1	2	3
glükóz	2		1
mannit		2
szójaliszt	2	1	0,5
kazeinpep- ton			0,5
melasz		1	2

II. táblázat

Baktériumlizáló enzimek aktivitása a tenyészetben (E/ml)

A fermentálás időtartama (nap)	Tápoldatszám
1	2	3
2	21	15	363
4	367	378	1106
6	236	558	2088

2. példa

A kihozatal növelése kalcium adalékkal

Az 1. példában leírtak szerint Streptomyces coelicolor DSM 3030-at szaporítunk 1% glükózt, 2% melaszt, 0,5% szójalisztet, 0,5% kazeinpeptont és 0,5% CaCl₂ x 2 H₂O-ot tartalmazó táptalajon. A CaCl₂ hozzáadása következtében a tenyészetben a baktériumlizáló enzimek kihozatala jelentősen megnőtt, a 2., a 4. és a 6. nap után rendre 758 E/ml, 2462 E/ml és 4715 E/ml volt.

3. példa

a) Baktériumlizáló enzimek aktivitásának (lizozimaktivitás) meghatározása (a 3 440 735 sz. NSZK-beli közrebocsátási irat szerint):

ml 0,1 mólos nátrium-acetát pufferben (pH-5,0)

0,2 mg Mikrococcus luteus ATCC 4968-at (Boehringer Mannheim) tartalmazó szuszpenzió 2,8 ml-éhez 0,2 ml baktériumlizáló enzimet tartalmazó mintát pipettázunk és 25 °C-on extinkció méréssel 450 nm-nél meghatározzuk a zavarodás csökkenését. A fotométerskálán 0,001 egység/perc extinkció csökkenés 1 egységet (E) jelent.

b) Proteázok aktivitásának meghatározása azokazeinnel:

Kiindulási anyag:

Puffén 0,1 mól nátrium-foszfát puffer (pH-7,0)

Azokazein oldat: 250 mg azokazein + 10 ml puffer - keverés addig, amíg már több azokazein nem oldódik: a nem oldódó azokazeint lecentrifugálni és a felülúszót a méréshez felhasználni.

ί

HU 206 447 Β

Kivitelezés:

ml üveg centrifuga kémcsőbe pipettázni minta szubsztrát nélküli minta

- 0,2 ml minta -0,2 ml minta

- 0,5 ml puffért hozzáadni

- +40 °C-os vízfürdőn 5 percig előmelegíteni +0,5 ml azokazein oldatot (40 °C) hozzáadni

- keverni - 30 perc inkubálás +40 °C-os vízfürdőn

- 0,2 ml 70%-os perklórsavat hozzáadni (reakció befagyasztás)

- keverni

- 5 percig szobahőmérsékleten állni hagyni

- a lecsapódott kazeint lecentrifugálni

- a felülúszó fotometriás meghatározása (^Ε44θ)

Vakpróba: a minta helyére a puffért tesszük.

A vakpróba E440 értékének 0,050-0,060nak kell lennie

Számítás:

^1Eazokazein ml a ΔΕΟ,ΟΟΙ λ (AE-vakpróba)xlOOO = perc = 30 xhígítás

4. példa

Hat hónapos kísérlet hízóbikákkal

Hat hónapon át hízóbikákkal végzett kísérlet során kilenc-kilenc állatból álló csoportok állatonként és naponta 100 ppm, illetve 200 ppm (Streptomyces coelicolor DSM 3030 sejtjeinek elválasztása után a felülúszó megszárításával nyert) enzimet kaptak kiegészítő takarmány kilogrammonként. Ez a mennyiség állatonként és naponta átlagosan 326 mg, illetve 454 mg enzimkeveréknek felel meg. A növekedés és a takarmányhasznosítás készítményfüggő javulás mellett a kezelt állatokon semmiféle feltűnő jel nem mutatkozott.

5. példa

Patkányokkal végzett kísérlet

65-180 g élőtömeg súlyszakaszban lévő patkányok olyan szabványosított patkánytakarmányt (Altromin Nr. 3121 Altromin International, Lage Lippe, NSZK) kaptak, amely növekvő patkányok szükségletéhez volt igazítva. Egy kezeléshez 6 állatot használtunk és az állatokat kontrollcsoportra (adalék nélkül), I. vizsgálati csoportra (19 E lizozim aktivitás/mg takarmány) és Π. vizsgálati csoportra (38 E lizozim aktivitás/mg takarmány) osztottuk fel. Az állatokat anyagcsere-ketrecben tartottuk.

A takarmány-felvételt naponta, a súlyt hetente mindenkor állatonként rögzítettük. 14 napos etetési szakaszt 7 napos kvantitatív széklet és vizeletgyűjtéssel összekapcsolt nitrogénmérleg meghatározó szakasz követett

A fehérje megkötés mértékét a takarmányból felvett nitrogén és a széklettel és a vizelettel kiválasztott nitrogén különbségéből számítottuk ki.

Eredmények (1. táblázat)

A súlygyarapodás az 1. vizsgálati csoportnál 4,2%, a Π. vizsgálati csoportnál 3,1% volt, a takarmány-felhasználás átlagosan 3,3%-kal csökkent. A nitrogénretenció átlagosan 28,5, illetve 25,2%-kal javult.

6. példa

Malacokkal végzett kísérlet

15-25 kg élőtőmeg súlyszakaszban lévő malacok gabona-, szója- és halliszt alapú keveréktakarmányt kaptak, amelyet szükség szerint vitaminokkal nyom- és makroelemekkel egészítettünk ki (3. táblázat). A kontrollcsoport (n=10) adalék nélküli takarmányt kapott, a vizsgálati csoport (n-7) 10 E lizozim aktivitás/kg takarmány adalékkal kiegészített takarmányt kapott.

A takarmányfelvételt etetésenként (2/nap), a súlygyarapodást hetenként rögzítettük. A napi súlygyarapodást (g/nap) és a takarmány-felhasználást (kg takarmány/kg növekedés) a kísérleti végén számítottuk ki.

Eredmények (2. táblázat)

Az adalékanyag okozta súlygyarapodás átlagosan 4,7%-kal javult, a takarmány-felhasználás átlagosan 8,5%-kai csökkent.

1. táblázat

Lizozim/proteáz keverék hatása patkányokra

Csoport	Aktivitás	Napi súlygya- rapodás g'nap	Takar- mány-fel- használás	Nitro- ;énretenci ó g/d
lizozim	proteáz
E/mg takarmány
kont- roll			5,46	3,04	0,151
			±0,16	±0,09	±0,010,
			100,0	100,0	100,0
I	19	0,04	5,69	2,94	0,194
			±0,18	±0,12	±0,016,
			104,2	96,7	128,5,
Π	38	0,08	5,63	2,94	0,189
			±0,13	±0,09	±0,008,
			103,1	96,7	125,2,
P*		<	0,05	0,05	0,001,

¹ hibavalószínűség

2. táblázat

Lizozim/proteáz keverék hatása malacokra

Aktivitás lizozim proteáz E/mg takarmány	Napi súlygyarapodás g/nap	Takar- mányfelhasználás
kontroll	400,7	1,89
		±77,3

HU 206 447 Β

Aktivitás lizozim proteáz E/mg takarmány	Napi súlygyarapodás g/nap	Takar- mányfelhasználás
		1.00,0
10 6,7xl0“⁵	4195	1,73
		±61,2
		104,7

3. táblázat

Takarmányösszetétel%-ban

árpa	20,0
búza	10,0
zab	6,0
kukorica	25,2
lenpogácsa	55
lucemaliszt	4,0
extrahált szójadara	18,0
halliszt	4,0
búzakorpa	5,0
vitaminok és ásványianyagok	23

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás állatok tőmeggyarapodásának fokozására és takarmányhasznosításának javítására, azzal jellemezve, hogy az állatokkal adalékanyagként Streptomyces coelicolor DSM 3030-ból, valamint ennek mutánsaiból és variánsaiból származó N-acetilmuramidáz aktivitású baktériumlizáló enzime(ke)t 0,1-1000 E enzim/mg takarmány mennyiségben tartalmazó takarmányt etetünk.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy az N-acetilmuramidáz aktivitással rendelkező baktériumlizáló enzime(ke)t 0,5-5 E enzim/mg takarmány mennyiségben tartalmazó takarmányt etetünk.
3. Eljárás állatok tömeggyarapodásának fokozására és takarmány hasznosításának javítására, azzal jellemezve, hogy az állatokkal adalékanyagként Streptomyces coelicolor DSM 3030-ból, valamint ennek mutánsaiból és variánsaiból származó N-acetilmuramidáz aktivitással rendelkező baktériumlizáló enzim(ek) és proteázok keverékét 0,1-1000 E enzim/mg takarmány mennyiségben tartalmazó takarmányt etetünk.
4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az enzimeket szárított tenyészlé formában alkalmazzuk.
5. A 3. vagy 4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az N-acetilmuramidáz aktivitással rendelkező baktériumlizáló enzime(ke)t 0,55 E/mg takarmány mennyiségben tartalmazó takarmányt etetünk.
6. A 3-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy a.baktériumlizáló enzimek és proteázok enzimaktivitásra vonatkoztatott 1:1-1000:1 arányú keverékét alkalmazzuk.
7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a baktériumlizáló enzimek és proteázok enzimaktivitásra vonatkoztatott 100:1-500:1 arányú keverékét alkalmazzuk.
8. Eljárás tömeggyarapodás fokozására és takarmányhasznosítás javítására alkalmas állati takarmányok előállítására, azzal jellemezve, hogy Streptomyces coelicolor DSM 3030-ból, valamint ennek mutánsaiból és variánsaiból származó N-acetilmuramidáz aktivitással rendelkező baktériumlizáló enzime(ke)t 0,1-1000 E enzim/mg takarmány mennyiségben a takarmányokhoz keverjük.
9. Eljárás tömeggyarapodás fokozására és takarmányhasznosítás javítására alkalmas állati takarmányok előállítására, azzal jellemezve, hogy Streptomyces coelicolor DSM 3030-ból, valamint ennek mutánsaiból és variánsaiból származó baktériumlizáló enzim(ek) és proteázok keverékét 0,1-1000 E enzim/mg takarmány mennyiségben a takarmányokhoz keverjük.