PT90512B

PT90512B - Processo para a preparacao de peptidos anti-agregantes e de composicoes farmaceuticas que os contem

Info

Publication number: PT90512B
Application number: PT90512A
Authority: PT
Inventors: Fadia El-Fehail Ali; James Martin Samanen; Ronald John Shebuski
Original assignee: Smithkline Beecham Corp
Priority date: 1988-05-09
Filing date: 1989-05-09
Publication date: 1994-10-31
Also published as: NO891870L; JP2755351B2; US5849690A; JPH0262892A; DE68928321T2; EP0341915B1; AU3458889A; EP0341915A2; HUT49891A; ZW6189A1; ATE158305T1; DK222989D0; EP0341915A3; PT90512A; FI892208A; DK222989A; DE68928321D1; KR900018136A; FI892208A0; NO891870D0

Description

“Processo de preparação de péptidos anti-agregantes e de composiçães farmacêuticas que os contêm para que

SMITHKLINE BECKMAN CORPORATION, pretende obter privilégio de invenção em Portugal.

RESUMO presente invento refere-se a um processo de preparação de compostos que são eficazes para inibir a agregação de plaquetas, de fórmula (i)

X-(A) -B-Gly-Asp-(C) -Y (i) m n o qual compreende:

a) a ligação de aminoácidos protegidos de modo a formar um composto adequadamente protegido de fórmula

X-(A)_m-B-Gly-Asp-(C)_n-/”Y_7

b) a desprotecção e, se necessário a clivagem do péptido da resina e

c) a formação opcional de um seu sal farmaceuticamente aceitável. 0 invento refere-se ainda à preparação de composiçães farmacêuticas para exercerem esta actividade.

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,<í // <··' '

-2MEMORIA DESCRITIVA

Campo do Invento

Este invento descreve a preparação de novos péptidos que inibem a agregação de plaquetas, de composiçães farmacêuticas que contêm esses péptidos e métodos para usar os péptidos. Descreve-se, em particular, um método para usar os péptidos deste invento, em combinação com agentes fibrinoliticos.

Antecedentes do Invento

Um trombo é o resultado do processo que inicia a cascata da coagulação. Compãe-se de um agregado de plaquetas malhadas nu ma rede polimórica de fibrina. Este processo começa normalmente em consequência de um dano nos tecidos e tem como efeito retardar ou impedir o fluxo sanguíneo num vaso. Podem também iniciar a formação do trombo factores etiológicos que não estejam directamente relacionados com o dano nos tecidos, como placa ateroesclerótica, inflamação dos vasos sanguíneos (flebite) e septicémia. Nalguns casos, a formação inadequada de um trombo e o subsequente decréscimo do fluxo sanguíneo, podem ter consequências patológicas como hemorragia cerebral, embolia pulmonar e doenças cardíacas .

A cascata da coagulação é um processo muitifactorial e produz, na sua penúltima etapa, a enzima proteolítica, a trombina, que hidrolisa o fibrinogônio em dois resíduos específicos Arg-Gli, para formar dois fibrino-pôptidos mais pequenos e o monóraero fibrina. Por remoção dos fibrino-pôptidos ficam expostos dois locais de ligação complementares e cada raonómexo de fibrina pode ligar-se a dois outros monómeros para formar uma rede polimórica.

As plaquetas também são activadas pela trombina e podem ligar-se ao fibrinogônio e aos monómeros de fibrina. Estas plaquetas amplificam mais o processo libertando outros activadores da coagulação. A medida que esta polimerização da fibrina progride, o agregado precipita do sangue formando o chamado coágulo mole. 0 factor estabilizador da fibrina (FSF), que é uma enzima, também activada pela trombina, catalisa a formação de ligaçBes cruzadas covalentes produzindo o coágulo duro final.

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As plaquetas desempenham um papel importante na formação de trombos. Isto ô principal mente mediado através dum complexo receptor de plaquetas chamado GPIIb-IIIa. 0 factor de Von Willebrand, uma proteína do plasma e o fibrinogónio são capazes de ligar e de recticular os receptores GPIIb-IIIa em plaquetas adjacentes e portanto produzem agregação de plaquetas. A fibronectina, a vitronectina e a trombospondina são proteínas que também se verificou ligarem-se a GPIIb-IIIa. A fibronectina foi encontrada no plasma e, como proteína estrutural, na matriz intracelular. A ligação entre proteínas estruturais e o GPIIb-IIIa podem fazer com que as plaquetas adiram às paredes danificadas do vaso.

A fibronectina e a vitronectina são membros de uma classe de proteínas estruturais que desempenham uma larga gama de ligação nas células. 0 conhecimento da sequência de aminoácidos do domínio de ligação da célula de algumas destas proteínas, em particular da fibronectina, estabeleceu a sequência Arg-Gli-Asp (no código de uma só letra para cada aminoácido RGD) como parte da es. trutura essencial que intervém nas ligaçães. Ver Ruoslahti et al., Science, 238, 491-7 (1987). F oram revelados (Pierschbacher et al., patente americana 4 589 881 (1986) e Rouslahti et al., W0 84/00540 (1984)) polipéptidos que têm propriedades de ligação de células e foram preparados a partir da fibronectina do plasma humano. Mostrou-se que péptidos mais pequenos, que também contêm esta sequêri cia, possuem propriedades de adesão de células às células de rim da ratazana normal (NRK) quando presas a um suporte sólido e inibem a adesão destas células à fibronectina quando usadas em forma solubilizada. Ver Rouslahti et al., patente americana 4 578 079 (1986) e Rouslahti et al., patente americana 4 614 517 (1986).

A activação de plaquetas é necessária para ligar o GPIIb-Illa ao fibrinogánio, fibronectina e ao factor de Von Willebrand. Ainda que não se conheça o mecanismo exacto, o estímulo das plaque^ tas pelo ADP ou pela trombina parece promover uma mudança no complexo receptor e facilitar as ligaçães . A importância deste receptor na agregação de plaquetas foi demonstrada por métodos que mascaram o receptor. Assim, Coller et al. (Blood, 66, 1456-9 (1985)) mostraram que os anticorpos para este complexo inibem a

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agregação de plaquetas em cães, induzida pelo ADP. Nievelstein et al. (Thromb. and Hemostasis, 58, 2133 (1987)) mostraram que os péptidos -RGDS- inibem a agregação induzida pela trombina e a adp são de plaquetas à fibronectina e podem interagir por intermédio do complexo GPIIb-IIIa. Zimmerman et al. , patente americana 4 683 291 (1987) descobriram péptidos contendo Arg e Lis e uma se. quéncia -RGD-, que inibem a ligação do fibrinogônio às plaquetas e inibem a agregação de plaquetas.

A terapia anti-trombótica corrente utiliza agentes que mp dificam o sistema plaqueta/araquidonato-prostaglandina de células endoteliais, como os análogos da prostaciclina, inibidores da ciclo-oxigenase, inibidores da sintese do tromboxano e antagonistas de receptores de tromboxano; e anti-coagulantes como a heparina. Estes agentes inibem uma ou as duas fases discernlveis da agregação de plaquetas. A primeira fase, que é uma resposta aos estimu los químicos, como o ADP (difosfato de adenosina) , colagéneo, ep_i nefrina ou trombina, provoca a activaçâo inicial das plaquetas. A esta segue-se uma segunda fase que ó iniciada pelas próprias plaquetas e que se caracteriza pela síntese do tromboxano A^ (TxA^) e a libertação de ADP adicional dos grânulos de armazenagem de pl_a quetas. Estes mediadores activam depois outras plaquetas.

A prostaciclina, também chamada prostaglandina I? (PGI^) é produzida naturalmente pelas células endoteliais que revestem as paredes dos vasos sanguíneos. A PGl^ aumenta o cAMP das plaquetas o que resulta numa baixa da regulação do receptor GPIIb-Illa, inibindo portanto a agregação de plaquetas mediada pelo fibrinogénio e a activaçâo de plaquetas em vasos sanguíneos intaq tos. Os análogos da PG^ e da PG]^ estável inibem tanto a fase primária como a secundária da agregação de plaquetas. Contudo o uso destes análogos tem sido associado a variaçães indesejáveis da pressão sanguínea. Ver Aiken et al., Prostaqlandins, 19, 629-43 (1980).

A ciclo-oxigenase é a enzima responsável pela sintese das prostaglandinas como a PG^ e PGh^. A PGH^ é depois transformada em TxA^ pela tromboxano sintetase. 0 TxA2 ô um activador podero69 213

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so de agregação de plaquetas. Os inibidores da ciclo—oxigenase e os inibidores da tromboxano sintetase actuam de modo a bloquear a produção de ΤχΑ^, enquanto que os antagonistas do TxA₂ bloqueiam os efeitos do ΤχΑ₂ por ligação ao receptor ΤχΑ₂» Todas estas terapias actuam somente sobre a fase secundária da actiuação de pia, quetas. Os inibidores da ciclo-oxigenase têm um inconveniente adicional devido à sua inibição da síntese da PGI₂ o que de certo modo evita os efeitos anti-angregantes positivos da produção de PGI₂. 0 uso de inibidores da ciclo-oxigenase tem sido associado à ulcerogenese.

A heparina ô um mucopolissacárido que liga a protrombina bem como certos outros factores no desencadear da coagulação. Exerce o seu efeito evitando a activação do fibrinogénio pela trom bina e evitando a activação do receptor da GPIIb-IIIa pela trombi^ na. Inibe apenas a fase primeira da agregação de plaquetas e tem pequeno efeito sobre a activação de plaquetas por outros meios, p. ex. pelo colagénio, ADP e epinefrina.

Portanto os inibidores da ciclo-oxigenase, análogos da prostaglandina e a heparina inibem todos a agregação de plaquetas indirectamente através da inibição da fase primária ou secundária da activação plaquetas/fibrinogóneo. Há portanto necessidade de produtos terapêuticos selectivos que bloqueiem directamente a agregação de plaquetas, quer derive da fase primária quer da secundária da activação de plaquetas.

Progressos recentes para tratamento de artérias obstruídas e da trombose de veias profundas utilizam agentes fibrinolíti cos para lisar os trombos ou embolias a fim de restabelecer ou me lhorar o fluxo sanguíneo. Os agentes fibrinollticos são enzimas proteolíticas que hidrolisam a fibrina em locais específicos, fragmentando a sede de fibrina. A fragmentação da fibrina em péptidos mais pequenos tem o efeito de solubilizar os trombos ou êmbolos. 0 activador do plasminogéneo tecidual (tPA), a uroquinase (UK) e a pro-Uroquinase (pUK) que são de origem humana e a estreptoquinase (SK) que é de origem bacteriana, são considerados agentes fibrinollticos dentro do contexto desta descrição. A sua acção in vivo é activar proteoliticamente o plasminogénio no san69 213

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-6gue formando plasmina que ó o agente real fibrinolítico. Destes, o tPA e a SK são usados comercial mente na terapia fibrinolltica. Contudo um problema periódico com esta terapia é a reoclusão do uaso sanguíneo deuida à formação de um segundo trombo.

A terapia fibrinolltica é usada muito frequentemente para ✓

restabelecer o fluxo sanguíneo de um vaso trombosado. E útil para dissolver o trombo que é frequentemente a causa imediata do bloqueio. Contudo, a terapia fibrino lltica não inverte os facto res responsáveis pelo início do trombo. Por esta razão usam-se frequentemente anticoagulantes como a heparina para evitar a re-oclusão. De facto pacientes com elevada grau de estenose numa artéria encontram-se em risco extremamente elevado de re-trombose após reperfusão, mesmo na presença de doses elevadas de heparina. Ver, Gold et al., Circ., 13, 347-52 (1986). Além disso, o uso de SK e da tPA tem sido associado à hiper-agregabilidade de plaquetas. l/er Ohlstein et al. , Thromb. Res. , 4, 575-85 (1987). Pode associar-se □ tratamento com doses mais elevadas de tPA, com a hja morragia sistémica e este tratamento não é recomendado para evitar a re-oclusSo. Há portanto necessidade de um método para evitar a re-trombose após terapia fibrinolltica.

^ecentemente os antagonistas do ΤχΑ^ mostraram-se de algum modo promissores para inibir a re-oclusão após reperfusão e para baixar a dose de tPA necessária para a fibrinolise. Ver pedido de patente copendente americana da Série N9. 917 122. Yasuda et al. (Clin. Res., 34, 2 (1986)) demonstraram que a reoclusão por trombos de plaquetas ricas em fibrina, após trombólise em tPA, pode ser inibida por um anticorpo monoclonal murino contra GPIIb-Illa, em cáes.

Sumário do Invento z

E objectivo deste invento apresentar um processo para ini bir a agregação de plaquetas e a formação de trombos, que utiliza um péptido ou polipéptido que se liga ao receptor de GPIIb-IIIa. Deste modo, inibe-se a capacidade das plaquetas activadas se liga rem ao factor de l/on Willebrand, à fibronectina ou a fibrinogônio/ /fibrina. Assim, a actividade anti-agregante é única pois que

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-7ía» <r não só confia meramente na inibição de um estímulo do processo ajg ti-agrenate, como interfere com a etapa final comum a todos os e.s timulos conhecidos. Uma vez que os outros processos anti-trombóticos/anti-coagulantes operam por meios não análogos, estes pépt_i dos ou polipéptidos serão denominados anti-fibróticos para os distinguir, tanto sob o ponto de vista mecânico como estrutural, dos métodos anteriormente existentes.

Num dos aspectos deste invento prepara-se um composto de fórmula (i) ou (li):

X-(A)_m-B-Gly-A_Sp-(C)_n-Y (i) onde

A é Arg, HArg, (Me₂)Arg, (Et₂)Arg, Ala, Gly, His, Abu ou um seu derivado substituído σί-R ' » ou Pro;

B é Arg, HArg, (Me₂)Arg, (Et2)Arg ou seu derivado substituído σζ-R ’ ;

C é um aminoácido D- ou L- escolhido entre Tyr, (Alk)Tyr, Phe, (4'W)Phe, HPhe, Phg, Trp, His, Ser, (Alk)Ser, Thr, (Alk)Thr, Cys, (Alk)Cys, Pen, (Alk)Pen, Ala, Vai, Nva, Met, Leu, Ile, Nle ou Nal;

W é halogéneo ou Alk;

Y é NR^R₂ ou RjJ

Rj^ e R₂ são, independentemente um do outro, H, Alk ou (CH₂)_pPh;

R-j é Alk, (CH₂)_pPh ou, quando B for HArg, (Me₂)Arg, (Et₂)Arg ou um derivado, substituindo <X.-R¹ , de Arg, HArg, (Me₂)Arg ou (Et₂)Arg, H;

X é R^Rj-N;

R^ é H ou Alk;

R₅ é H, Alk, HCO, AlkCD, PhCH₂ ou Ph(CH₂) CO;

R» é Alk ou PhCH₂; q, m e n são 0 ou 1; e p é 0, 1, 2 ou 3

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ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; ou

I I ^(II) ^X-^l-^(A,)m“^B,-^Gly-^Asp-^(C,)n^Z2^Y onde

A' ô um aminoácido D- ou L- escolhido entre Arg, HArg, (Me₂)Arg, (Et₂)Arg, Ala, Gly, His, Abu, Lis ou seu derivado substituído <-R ' ou Pro?

B ' ó um aminoácido D- ou L- escolhido entre Arg, HArg, (Me₂)Arg, (Et₂)Arg, Lys ou um seu derivado substituído at-R ' ;

C’ é um aminoácido D- ou L- escolhido entre Tyr, (Alk)Tyr, Phe, (4'W)Phe, HPhe, Phg, Trp, Hys, Ser, (Alk)Ser, Thr, (Alk)Thr, (Alk)Cys, (Alk)Pen, Ala, Uai, Nva, Met, Leu, Ile, Nle ou Nal ou um seu derivado, substituído <-R’;

W ó halogéneo ou Alk;

Y é NR.^ ou 0R₃;

R^ e R₂ são, independentemente um do outro, H, Alk ou (CH₂)_pPhe;

R.j é Alk, (CH₂)_pPh ou, quando B for HArg, (Me₂)Arg, (Et₂)Arg ou um derivado, substituído p<-R ’ , de Arg, HArg, (Me₂)Arg ou (Et₂)Arg, H;

X ô R₄R₅N ou H;

R^ é H ou Alk;

R₅ é H, Alk, HCO, AlkCD, PhCK₂ ou Ph(CH₂) CD;

R' é Alk ou PhCH₂;

é um isómero D- ou L- de Cis, Pen ou de APmp;

Z^ é um isómero D- ou L- de Cis, Pen ou de APmp;

q, m e n são, independentemente uns dos outros, 0 ou 1; e p é D, 1, 2 ou 3;

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

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-9^ste invento apresenta ainda um processo de uma composição farmacêutica para inibir a agregação e a formação de coágulos, que compreende um péptido co e um veiculo farmaceuticamente aceitável.

preparação de de plaquetas anti-fibrótiEste invento apresenta um método para tratar a trombose ou embolismo ou para inibir a agregação de plaquetas ou a formação de coágulos num mamífero disso necessitado, que compreende a administração interna de uma quantidade efectiva de um péptido a_n ti-fibrótico de fórmula (i) ou (ll).

Os compostos preparados por este invento bem como outros que possam operar pelo mesmo mecanismo, são também particularmente úteis para evitar a re-trombose durante a terapia trombolitica. Num outro aspecto, portanto, ô objectivo deste invento apresentar um método para inibir a reoclusão de uma artéria ou veia de um ma mífero após trombólise, que compreende administrar internamente uma quantidade efectiva de um agente fibrinolitico e de um péptido anti-fibrótico. Combinados com fibrinolíticos conhecidos como a estreptoquinase (SK), uroquinase (UK), pro-uroquinase (pUK) e activador do plasminogônio tecidual (tPA) e suas variantes ou mutantes, os péptidos acima descritos são úteis para inibir a retrom bose. Além disso, outros péptidos e polipéptidos que contenham a sequência de aminoácidos -RGO- são úteis neste invento, especialmente certos fragmentos ou derivados do factor de von Willebrand, do fibrinogénio do plasma humano e da fibronectina do plasma humç no.

Este invento pode também ter como concretização uma comp_o sição farmacêutica para actuar na trombólise e reperfusão e inibir a reoclusão numa artéria ou veia de um mamífero, que compreeri de um fibrinolítico e um péptido anti-fibrótico num veiculo farma cêutico.

Finalmente este invento é um conjunto de instrumentos para ser usado num método para realizar a terapia trombolitica, que compreende por um lado um fibrinolí tico e por outro um péptido a_n ti-fibrótico.

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-10Breve Descrição das Figuras

A Fig. 1 mostra que o péptido Ac-RGDS-NH^ não tem efeito sobre a lise in vitro do coágulo, no homem, promovida pelo tPA. 0 gráfico mostra a % de lise do coágulo às 4 horas em função de cori centraçães crescentes do activador do plasminogôneo tecidual (tPA). Os quadrados representam a lise induzida pelo tPA (MT2N3) no período de controlo (£0^^=31,5+.9,9 g/ml) e os círculos representam a lise na presença de tPA e Ac-RGDS-NH^ (l mM) (ECgg=31,9_+8,6 g/ /ml).

A figura 2 demonstra a inibição in vivo da agregação de plaquetas por infusão de Ac-RGDS-Nl·^ 400 mM à taxa de 0,1 ml/min.

A agregação de plaquetas/formação de trombos está indicada por uma redução do fluxo sanguíneo. As setas indicam o início e o fim da infusão. SL (shake loose) indica o deslocamento mecânico do trombo. 0 traçado do topo (a) indica a pressão sanguínea da arté ria coronária (mmHg) em função do tempo e revela não haver efeito da infusão de Ac-RGDS-Nl·^ sobre a pressão sanguínea. 0 traçado do meio (b) mostra a variação do fluxo sanguíneo (ml/min) coronário fásico em função do tempo e revela a inibição da formação dos trombos após infusão do péptido. 0 traçado inferior (c) mostra o fluxo (ml/min) sanguíneo coronário médio em função do tempo e revela a inibição da formação de trombos após infusão do péptido.

A figura 3 mostra que a inibição in vivo da agregação de plaquetas no modelo da trombose coronária dBpende da dose. 0 grá fico mostra o fluxo sanguíneo coronário médio em função do tempo.

As setas indicam o início e o fim da infusão de Ac-RGDS-Nl·^. A formação de trombos está indicada por um decréscimo do fluxo sanguíneo. SL (shake loose) indica o deslocamento mecânico de um trombo, X indica que o trombo se desprende espontaneamente. 0 traçado do topo indica uma completa inibição da formação do trombo (400 mM a 0,052 ml/min de caudal de infusão). 0 traçado do meio indica uma inibição moderada com desprendimento espontâneo dos trombos (400 mM a 0,026 ml/min de infusão). 0 traçado inferi or mostra uma inibição parcial com prolongamento do tempo de bloqueio total, necessitando de deslocamento mecânico do trombo (400 mM e 0,013 ml/min).

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Descrição Pormenorizada do Invento

Verificou-se que certos péptidos inibem a agregação de plja quetas. Crê-se que estes péptidos interagem sobre os receptores das plaquetas (o que se tipifica pelo complexo GPIIb-IIIa) capazes de se ligarem a uma larga gama de proteínas estruturais endógenas, como a fibronectina e a vitronectina. Assim, os danos, a disrupção ou a irregularidade do interior de um vaso sanguíneo ex. põe as proteínas estruturais subjacentes da matriz extracelular e pode demonstrar-se as plaquetas ligam-se à parede do vaso presumi velmente através do receptor de GPIIb-IIIa. Além disso o fibrinjo géneo/fibrina e o factor de von Willebrand interagem com o compls xo receptor de GPIIb-IIIa nas plaquetas. Isto promove a agregação de plaquetas através das ligações muitivalentes do receptor GPIIb-Illa. Pode haver interferências nestas interacções adesivas entre receptores das plaquetas e o fibrinogéneo, factor de von Willebrand e fibronectina, por imitação dos locais de ligação destas proteínas. A análise de um fragmento activo de fibronectina mostrou que o local de ligação da fibronectina contém a sequência de aminoácidos Arg-Gly-Asp (RGD). Demonstrou-se também que os pépt_i dos que contêm esta sequência são capazes de inibir a ligação de células à fibronectina e de inibir a ligação do factor de von Wi_l lebrand e de fibrinogônio às plaquetas. Assim, certas proteínas, fragmentos de polipéptidos que ocorrem naturalmente e derivados destes fragmentos são capazes de inibir a agregação de plaquetas.

Ds fragmentos FÍab'^ de um corpo monoclonal (Coller et al., BIood, 66, 1456-9 (1985)) e fragmentos de péptidos de fibronectina do plasma humano (Rouslahti et al. , PCT W0 84/00540 (1984) e Pierscjj bacher et al., patente americana 4 589 881 (1986)) são capazes de se ligar ao receptor GPIIb-IIIa,

Este invento prepara péptidos que compreendem a sequência Gly-Asp e que se podem ligar ao receptor GPIIb-IIIa das plaquetas e portanto inibir a agregação de plaquetas. Llm dos aspectos deste invento é modificar a conformação da sequência RGD por escolha adequada de aminoácidos a juntar e por derivação ou substituição da Arg nesta sequência a fim de facilitar a ligação dos péptidos às plaquetas. Um outro aspecto deste invento é a protecção do

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terminal amino do péptido por acetilação ou alquilação e a modifi cação do terminal carboxilo como amida, amida substituída ou éster. Estas modificaçSes melhoram a estabilidade do péptido em re lação aos enzimas proteolíticos e distingue-se dos compostos que têm sido anteriormente usados para promover a adesSo de células (Rouslahti et al. , patente americana 4 578 079 (1986) e Rouslahti et al., patente americana 4 614 517 (1986)) e para inibir a agregação de plaquetas (Zimmerman et al. , pat. am. ηθ. 4 683 291 (1987)). Alguns dos pôptidos preparados pelo invento contêm uma ligação intramolecular de bissulfureto que melhora tanto a sua es; tabilidade metabólica como a actividade biológica.

Os compostos preparados pelo invento são tri-, tetra-, pe_n ta-, hexa- e heptapéptidos de fórmulas (i) e (li):

X-(A)_m-B-Gly-Asp-(C)_n-Y (I) onde:

A é Arg, HArg, (f^ÍArg, (Et2)Arg, Ala, Gly, His, Abu ou um seu derivado substituído ot-R ' , ou Pro;

B é Arg, HArg, (l^^jArg, (Et2)Arg ou um seu derivado subjs tituído ot-R ’ ;

C é um aminoácido D- ou L- escolhido entre Tyr, (Alk)Tyr, Phe, (4'W)Phe, HPhe, Phg, Trp, His, Sbt, (Alk)Ser, Thr, (Alk)Thr, Cys, (Alk)Cys, Pen, (Alk)Pen, Ala, Vai, Nva, Met, Leu, He, Nle ou Nal;

W é halogéneo ou Alk;

Y é NR₁R₂ ou 0R₃;

R^ e R₂ são, independentemente um do outro, H, Alk ou (ch₂)_pPh;

Rj é Alk, (CH₂)pPh ou, quando B for HArg, (Me₂)Arg, (Et₂)Arg ou um derivado substituí do o<-R ’ de Arg, HArg, (Me₂)Arg ou (Et₂)Arg, H;

X é R₄R₅N;

R^ é H ou Alk;

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-13R₅ é H, Alk, HCO, AlkCO, PhCH₂ ou Ph(CH₂)_qC0;

R’ é Alk ou PhCH₂? q, m e n são 0 ou 1; e p é 0, 1, 2 ou 3;

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

A é adequadamente Gly ou Arg e, quando m for 1, n é adequadamente 0.

B é adequadamente HArg ou um derivado substituí do o/-R ' de Arg ou HArg, B ô de preferência MeArg.

C é adequadamente Ser, (Me)Ser, Thr, Tyr, Phe, Vai ou Nal. Quando n for 1, m é adequadamente 0.

Os compostos preparados por este invento são também penta-, hexa- ou heptapéptidos de fórmula (li):

(II) ^x-^zl-(A')m-B^,-G¹y-^Asp-(C')_n ^Z2-Y onde:

A · é um aminoácido 0- ou L- escolhido entre Arg, HArg, (Me₂)^Arg, (Et₂)Arg, Ala, Gly, His, Abu, Lys ou um seu derivado substituído o<-R' ou Pro;

B’ é um aminoácido D- ou L- escolhido entre Arg, HArg, (Me₂)Arg, (Et₂)Arg, Lys ou um seu derivado substituído<<-R· ;

C’ ô um aminoácido D- ou L- escolhido entre Tyr, (Alk)Tyr, Phe, (4’W)Phe, HPhe, Phg, Trp, His, Ser, (Alk)Ser, Thr, (Alk)Thr, (Alk)Cys, (Alk)Pen, Ala, Vai, Nva, Met, Leu, Ile, Nle ou Nal ou um seu derivado substituídoc<-R';

W é halogéneo ou Alk;

Y ô NR₁R₂ ou OR^;

Rj e R₂ são, indspendentemente um do outro, H, Alk ou (CH ) Ph;

P

R^ ô Alk, (CH₂)pPh ou, quando B for HArg, (Me₂)Arg, (Et₂)69 213

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-14Arg ou um derivado substituído -R' de Arg, HArg, (Me₂)Arg ou (Et₂)Arg, H;

X á R₄R₅N ou H;

R^ é H ou Alk;

R₅ 6 H, Alk, HCO, AlkCO, PhCH₂ ou Ph(CH₂)_qC0;

R» 6 Alk ou PhCH₂;

Z± é um isóraero D- ou L- de Cys, Pen ou APmp;

Z₂ é um isómero D- ou L- de Cys, Pen ou APmp;

q, m e n sSo, independentemente uns dos outros, 0 ou 1; e p é □, 1, 2 ou 3;

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

A’ é adequadamente Gly ou Arg e, quando m for 1, n é de preferência 0.

B’ é adequadamente HArg ou um derivado substituído -R' de Arg ou HArg. B é de preferência MeArg.

C' ó adequadamente Ser, (Me)Ser, Thr, Tyr, Phe ou Nal. Quando n for 1, m é adequadamente 0.

Z₂ é de preferência um isómero L- de APmp, Cys ou Pen.

De preferência m e n são ambos 0.

significado de X nas fórmulas aqui referidas pretende dg notar o terminal amino do péptido e portanto afasta-se do convencional. Note-se que quando X for K, Z^ é um des-amino ácido. Por exemplo, quando Z^ for Cys e X for Η, o resíduo corresponde à des. -amino cisteína, que é o ácido 3-mercaptopropanóico (Mpa).

São compostos específicos preparados por este invento:

N^-Ac-CicloCS,S) Cys-MeArg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂;

N^-Ac-CicloíS,S) Cys-Arg-Gly-Asp-(D,L) APmp-NH₂;

N⁰^-Ac-Ciclo(S ,S ) Cys-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂ ;

Ciclo(S,S)Mpr-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂;

N^-Ac-CicloíS,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Ser-Pen-NH₂;

N^-Ac-Ciclo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-(Me)Ser-Cys-NH₂;

213

SKB CASE 1442 0 t f ' ~

Ciclo(S,S)Mpr-MeArg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂;

N^-Ac-CicloíS,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Cys-NH₂ 5

Ciclo(S ,S) Mpr-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂ >

N^-Ac-CicloíS, S)Cys-Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂ 5

N^-Ac-CicloCS,S)Cys-Arg-Gly-Asp-D-Pen-NH₂>

N^-Ac-CicloíS,S)Cys-Lys-Gly-Asp-Pen-NH₂ í

N^-Ac-CicloíS,S)Cys-HArg-Gly-Asp-Pen-NH₂ >

N^-Ac-CicloíS,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂ >

N^-Ac-CicloíS,S)Cys-Arg-Gly-Asp-Pen-NHEt;

N^-Ac-CicloíS,S)Cys-D-Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂ j

N⁰*-Ac-Ciclo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Tyr-Cys-NH₂ j

N^-Ac-CicloCS,S)Pen-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂ »

N^-Ac-CicloíS, S)Pen-Arg-Gly-Asp-Cys-NH₂ >

N‘²'-Ac-Ciclo(S,S)Cys-D-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂ >

N -Ac-Ciclo(S,S)Cys-Sar-Arg-Gly-Asp-Pen-NH ;

»

N -Ac-Ciclo(S,S)Cys—Arg—G1y—Asp—Cys—NH₂;

N^-Ac-CicloíSjSjCys-ArgÍEt^-Gly-Asp-Pen-Nl·^;

N^-Ac-Ciclo(S,S)Cys-D-MeArg-Gly-Asp-Pen-Nl·^ í

N^-Ac-MeArg-Cly-Asp-Ser-Nh^ >

N^-Ac-Arg-Gly-Asp-Ser-Nh^ >

N^-Ac-Arg-Gly-Asp-Tyr-NH₂ >

N^-Ac-Arg-Gly-Asp-Nl·^ 5

N^-Ac-Arg-Gly-Asp-D-Sar-Nl·^;

N^-Ac-Arg-Gly-Asp-Val-Nl·^ >

N^-Ac-Arg-dy-Asp-Nal-NF^ 5

N^-Ac-Arg-Arg-Gly-Asp-Phe-Nl·^ j

N^oí-Ac-Arg-Gly-Asp-NH-CH₂-CH₂-C₆H₅ ;

N^-Ac-MeArg-Gly-Asp-Phe-NH^ »

N^ei'-Ac-HArg-Gly-Asp-Ser-NH₂ ;

N^-Ac-Arg-Gly-Asp-Ser-NHEt;

N^e2'-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂ ;

N^-F ormil-MeA rg-Gly-Asp-Ser-NH₂; ou

Gly-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂.

Utiliza-se aqui a nomenclatura comum para descrever os péptidos.

213

SKB CASE 14420

Aminoácido	-16-	A
Símbolo 3 letras	Símbolo	Símbolo 3 letras	Símbolo 1 letra
1 letra	Aminoácido
Alanina	Ala	A	Isoleucina	Ile	I
Arginina	Arg	R	Leucina	Leu	L
Asparagina	Asn	N	Lisina	L ys	K
Acido Aspártico	Asp	D	Metionina	Met	M
Asn e/ou Asp	Asx	B	Fenilalanina	Phe	F
Cisteina	Cys	C	Prolina	Pro	P
Glutamina	Gin	Q	Serina	Ser	S
Acido Glutãmico	Glu	E	T reonina	Thr	T
Gin e/ou Glu	Glx	Z	T riptofano	T rp	W
Glicina	Gly	G	T irosina	T yr	Y
Histidina	His	H	Ualina	Uai	u
De acordo	com a representação convencional	o terminal am_i

no está à esquerda e o terminal carboxilo está à direita. A não ser que se especifique de outro modo, todos os aminoácidos (AA) quirais são assumidos como tendo a configuração absoluta L-. Pen refere-se à L-penicilamina ou /i,/2-dimetilcisteina, APmp refere-se ao ácido 2-amino-3,3-ciclopentametileno-3-mercaptopropiónico, Mpa refere-se ao ácido 3-mercaptopropiónico, Pmp refere-se ao ácido

3,3-ciclopentametileno-3-mercaptopropiónico. Mdp refere-se ao ácido 3-mercapto-3-metilbutanoico, HArg refere-se à homoarginina, (Me₂)Arg refere-se à N',N-dimetilarginina, (Et₂)Arg refere-se à N¹,N-dietilarginina, Nua refere-se à norvalina, Nle refere-se à norleucina, oí-MeAsp refere-se ao ácido N^-metilaspártico, Nal refere-se à β-2-naftilalanina, Phg refere-se à fenilglicina, HPhe re fere-se à homofenilalanina, Trp refere-se ao triptofano, Abu refe re-se ao ácido 2-aminobutírico, (Alk)Tyr refere-se à 0-(alquil em C^ ^)-tirosina, (Alk)Ser refere-se à 0-(alquil em Cj, ^-serina, (Alk)Thr refere-se à 0-(alquil em C^ ^)-treonina, (Alk)Cys refere -se à S-(alquil em ^-cisteina, (Alk)Pen refere-se à S-(alquil em C^ 4)-penicilamina, (Y'W)Phe refere-se à fenilalanina substitu_í da na posição 4 do anel fenílico por W, Boc refere-se ao radical t-butiloxicarbonilo, Fmoc refere-se ao radical fluorenilmetoxica_r bonilo, Ph refere-se ao radical fenil, Cbz refere-se ao radical carbobenzilóxilo, BrZ refere-se ao radical o-bromobenziloxicarbo69 213

SKB CASE 14420

-17nilo, Clz refere-se ao radical o-clorobenziloxicarbonilo, Bzl refere-se ao radical benzilo, 4-MBzl refere-se ao radical 4-metilbenzilo, Ac refere-se a acetilo, Alk refere-se ao radical alquilo em C Chx refere-se a ciclo-hexilo, DCC refere-se à diciclo-he xilcarbodiimida, DMAP refere-se a dimetilaminopiridina, HOBT refe re-se ao 1-hidroxibenzotriazolo, THF refere-se ao tetra-hidrofura no, DMF refere-se à dimetilformamida, HF refere-se ao ácido fluorí drico e TFA refere-se ao ácido trifluoroacético. Alquilo em significa metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo ou isobutilo.

Derivados substituídos oé-R ' dos aminoácidos deste invento, que se designam por (°i-R*)AA, referem-se a aminoácidos que estão mono-substituídos no grupo oí-amino por R', onde R' ô Alk ou benzi lo. R’ é de preferência metilo. A N°^-metilarginina e a N^-metil. glicina que sejam, respectivamente, (pt-Me)Arg e (oó-Me)Gly, são também designadas como MeArg e Sar (sarcosina) de acordo com a no tação convencional do passado. Todos os outros aminoácidos N-o<-substituídos levam a designação o<- na sua representação. Assim, os aminoácidos que podem ser alquilados nos grupos mercaptano, gua nidino ou hidroxilo, como Tyr, Ser, Thr, Cys ou Pen, distinguem-se pela ausência desta designação. Assim, (o<-Me )Ser é a N^-metilserina, (Me)Ser é a O-metilserina, (oZ-Me, Et)Ser é a N°á- me til, 0-etilserina e a (oZ-Me, Et2)Arg é a N^-metil-N 'N-dietilarginina.

De preferência os pêptidos preparam-se pela técnica da fa se sólida de Merrifield (3. Am. Chem. Soc., 85, 2149 (1964)) ainda que os processos em solução conhecidos na arte possam ser utiliza^ dos com sucesso. Pode usar-se uma combinação da fase sólida e da síntese em solução, p. ex. na síntese convergente em que os fragmeri tos de di-, tri-, tetra- ou pentapéptidos podem ser preparados por síntese em fase sólida e, tanto ligados como depois modificados, por síntese em solução. Empregaram-se os processos de síntese de pêptidos estabelecidos, na generalidade, por Ali et al., in 3. Med. Chem., 29, 984 (1986) e 3. Med. Chem., 30, 2291, (1987) para preparar a maior parte dos pêptidos deste invento, processos esses aqui incorporados para referência.

Cada aminoácido ou péptido é adequadamente protegido como é sabido na arte dos pêptidos. Por exemplo, os grupos 80c, Gbz

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SKB CASE 14420

ou Fmoc podem ser usados para proteger um grupo amino, especialmente um grupo οά-amino. 0 grupo Boc é geralmente preferido para proteger o grupo οά-amino. Usa-se um grupo benzilo ou um grupo benzilo adequadamente substituido, para proteger o grupo mercapto da cistelna ou outro tiol contendo aminoácidos; ou o hidróxilo da serina ou da treonina. 0 grupo tosilo pode ser usado para pro teger o grupo imidazolilo da Hys, e os grupos tosilo ou nitro para proteger o azoto guanidino da Arg. Um grupo benzilo ou carnobenzilóxilo adequadamente substituídos podem ser usados para o grupo hidroxilo da Tyr, Ser ou Thr ou o grupo £-amino da lisina.

D grupo ftalamido pode também ser usado para proteger o grupo £-amino da lisina. Uma substituição adequada dos grupos protectores carbobenzilóxilo ou benzilo é em orto- e/ou para- com cloro, bromo, nitro ou metilo e usa-se para modificar a reactividade do grupo protector. A cistelna e outros aminoácidos contendo enxofre podem também ser protegidos pela formação de um bissulfureto com um grupo tioalquilo ou tioarilo. Excepto para o grupo Boc, os grupos protectores são, muito convenientemente, aqueles que não são removidos por tratamento ácido brando. Estes grupos protectores são removidos por métodos como a hidrogenação catalítica, sódio em amónia ou tratamento com HF, tal como são conhecidos na arte.

Se se usarem processos de fase sólida, o péptido é construído em sequência, começando pelo terminal carboxilo e trabalhando em direcção ao terminal amino do péptido. A síntese em fa se sólida inicia-se pela ligação covalente do terminal C de um ami noácido protegido a uma resina adequada, p. ex. a resina benz-hidrilamina (BHA), a resina mstilbenz-hidrilamina (MBHA) ou uma resina clorometilada (CMR), como está estabelecido na generalidade, na patente americana NS. 4 244 946. A resina de suporte BHA, ou a MBHA, é usada se o terminal carboxilo do péptido for uma carboxamida. Usa-se em geral um suporte CMR se o terminal carboxilo do péptido for um grupo carboxilo, ainda que possa também ser us£ do para produzir uma carboxamida ou um éster.

Logo que o primeiro aminoácido (AA) protegido se ligou à resina pretendida, o grupo amino ô hidrolisado por tratamento áci.

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SKB CASE 14420

do brando, e o carboxilo livre do segundo AA protegido é ligado a este grupo amino. Este processo é realizado em sequência sem íscj lamento dos produtos intermediários, até que se tenha formado o péptido desejado. 0 páptido completo pode então ser desbloqueado e/ou separado da resina de suporte por qualquer ordem.

péptido fixo em CMR, com um alcali em péptido da resina e torna o aminoácinum ácido carboxílico. 0 tratamento com amónia ou aminas alquílicas num uma carboxamida, ou uma alquilcarboxa□ tratamento de um álcool aquoso faz separar o do de terminal carboxílico de um péptido fixo em CMR, solvente alcoólico fornece mida, no terminal carboxilo

Se se desejar obter um éster, a resina CMR pode ser trata, da com um álcool apropriado, p. ex. álcool metílico, etílico, pro. pilico, butilico ou benzílico, na presença de trietilamina para separar o péptido da resina e produzir directamente o éster.

Os ésteres dos pôptidos deste invento podem também ser preparados por métodos convencionais a partir do precursor do áci. do carboxílico. Normalmente, o ácido carboxílico ó tratado com um álcool na presença de um catalisador ácido. Em alternativa, o ácido carboxílico pode ser convertido num produto acilico interme. diário activado, como p. ex. um halogeneto ácido e tratado com um álcool, de preferência na presença de uma base.

Os processos para produzir ésteres no terminal C dos pépt_i dos sem esterificaçSo do grupo carboxilo da cadeia lateral do áci do aspártico, s3o ligeiramente mais elaborados mas sSo já bem conhecidos dos peritos na arte da síntese de péptidos. Por exemplo, a síntese começa com um éster do aminoácido de terminal C ou de um dipéptido e liga-se, na síntese de fase em solução, a um resíduo de ácido aspártico de cadeia lateral adequadamente protegida.

grupo carboxilo da cadeia lateral é então desprotegido selectivamente e ligado a uma clorometil-resina (CMR). Liberta-se o gru po amino e utiliza-se a síntese de péptidos em fase sólida. A s.e guir separa-se da resina usando HF, obtendo-se o desejado ácido carboxílico na cadeia lateral, enquanto que o terminal carboxilo do péptido permanece como um éster. De modo semelhante, se se co

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SKB CASE 14420

-2 0meçar a sequência de síntese com a alquilamida de um dipóptido ou aminoácido adequadamente protegidos, obtém-se a correspondente al. quilamida do péptido no terminal C.

Para produzir ésteres e amidas substituídas neste processo, são adequados como grupos protectores do grupo carboxilo 4 do ácido aspártico, os ésteres benzilicos e os ésteres benzílicos substituídos com halogéneo ou alquilo. Quando o grupo amino esti. ver protegido pelo grupo Boc, o grupo protector do éster benzílico pode ser removido selectivamente por hidrogenação e ligado ao suporte de CMR.

Se houver grupos protectores de benzi lo ou de benzilo subs tituído (como para o hidróxilo, tiol ou amino) no aminoácido (ou dipéptido) que deve ser ligado ao ácido aspártico antes da ligação à resina, é adequado usar um t-butilôster ou outro grupo lábil ácido, para proteger o carboxilo da cadeia lateral do ácido aspár^ tico. Neste caso o grupo amino do ácido aspártico ó protegido por um grupo básico lábil, como o de parte do fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc). Após ligação da fase em solução, do ácido aspárti. co ao aminoácido (ou dipéptido), consegue-se a desprotecção sele£ tiva do t-butilóster por hidrólise ácida branda e liga-se o carbo xilo da cadeia lateral à resina por métodos convencionais. Remove-se então o grupo fluorenilmetoxicarbonilo por uma base fraca para depois se proceder à sintese do péptido em fase sólida.

método preferido para separar um péptido da resina de suporte é tratar o péptido fixado na resina com HF anidro na preSBnça de um varredor adequado de catiães, como o anisol ou o di metoxibenzeno. Este método remove simultaneamente todos os grupos protectores excepto um grupo tioalquilo protegendo enxofre e sepa ra o péptido da resina. Os péptidos hidrolisados deste modo da CMR são ácidos carboxílicos e os separados de resina BHA são obti. dos como carboxamidas.

A modificação do grupo terminal amino do péptido é acompa. nhada por alquilação ou acetilação, como é sabido na arte. Estas modificaçães podem realizar-se sobre o aminoácido antes da incorporação no péptido ou depois do péptido ter sido sintetizado, e o

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SKB CASE 14420 c·

-21grupo terminal amino ter sido libertado, mas antes de se removerem os grupos proteotores.

Normalmente, a acetilação realiza-se sobre o grupo amino livre usando o halogeneto de acilo ou o anidrido do correspondente alquil-ácido, na presença de uma amina terciária. A mono-alqui^ lação realiza-se de modo muito conveniente por alquilação com redução do grupo amino com uma cetona ou aldeído alifático adequados na presença de um agente de redução branda, como o cianoboro-hidreto de lítio ou de sódio. A di-alquilaçâo pode ser realizada tratando o grupo amino com um excesso de halogeneto de alquilo na presença de uma base.

A síntese em solução de péptidos ó conseguida usando môto^ dos convencionais para formar ligações amida. Normalmente um Boç. -aminoácido protegido que tenha um grupo carboxilo livre liga-se a um aminoácido protegido que tenha um grupo amino livre usando como agente de ligação uma carbodiimida adequada p. ex. a N,N’-d_i ciclo-hexilcarbodiimida (DCC), opcionalmente na presença de catalisadores como o l-hidroxibenzotriazolo (HOBT) e a dimetilaminopiridina (DMAP). São também adequados outros métodos como a formação de anidridos, halogenetos de ácidos ou ésteres activados do carboxilo livre de um Boc-aminoácido protegido e a subsequente reacção com a amina livre de um aminoácido protegido, opcionalmeji te na presença de uma base. Por exemplo um Boc-aminoácido ou péptido protegido ó tratado num solvente anidro, como o cloreto de metileno ou o tetra-hidrofurano (THF), na presença de uma base, como a N-metilmorfolina, DMAP ou uma trialquilamina, com isobutilcloroformiato para formar o anidrido activado, que reage a seguir com a amina livre de um segundo aminoácido ou péptido protegido. 0 péptido formado por estes métodos pode ser desprotegido selectivamente usando técnicas convencionais, no terminal amino ou carboxilo, e ligado a outros péptidos ou aminoácidos usando técnicas semelhantes.

Os derivados substituídos oé-R ' dos aminoácidos deste invento, que incluem derivados de Arg, HArg, (Me₂)Arg, (Ft₂)Arg,

Ala, Gly, His, Abu, Tyr, (Alk)Tyr, Phe, (4*W)Phe, HPhe, Phg, Trp, His, Ser, (Alk)Ser, Thr, (Alk)Thr, Cys, (Alk)Cys, Pen, (Alk)Pen,

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SKB CASE 14420

-22Ala, Uai, Nva, Met, Leu, Ile, Nle e Nal, são preparados pelos métodos comuns da química. 0 substituinte R' pode ser Alk, como atrás se definiu ou benzilo.

Os métodos representativos para preparar estes derivados são descritos na pat. amer. NS. 4 687 758 ; Cheung et al. , Can. 0. Chem., 55, 906 (1977); Freidinger et al., 3. Orq. Chem., 48, 77 (1982); e Shuman et al., Peptides: Proceedinqs of the 7th American Peptide Symposium, Rich, D., Gross, E., Eds, Pierce Chemical Co., Rockford, 111., 617 (l98l), aqui incorporados para referência. Normalmente, a solução do Cbz- ou Boc-aminoácido em DMF/THF é condensada com um halogeneto de alquilo apropriado como o iodeto de metilo ou etilo, na presença de uma base, como o hidreto de sódio ou hidreto de potássio. Opcionalraente pode juntar-se um éter de coroa, como o 16-coroa-6 com hidreto de potássio, para féi cilitar a reacção. Em geral, neste processo e naqueles que se s_e guem, se o aminoácido tem um grupo funcional, como o grupo hidroxilo, mercaptan, amino, guanidino, indolilo ou imidazolilo, estes grupos são protegido como atrás se descreveu. Assim, o Boc-Tyr(Bzl) é tratado com hidreto de sódio e iodeto de metilo em solução de THF/DMF a OBC e agitado à temperatura ambiente durante 24 horas obtendo-se o Boc-(o<-Me)Tyr(Bzl).

Em alternativa, a amina livre do aminoácido reage com um aldeído apropriado, como o acetaldeído ou o benzaldeldo, na prese_n ça de um agente redutor como o cianoboro-hidreto de sódio para rea lizar a mono-alquilação. Este processo ô especial mente útil para preparar oí-benzil-aminoácidos. Os ot-benzil-aminoácidos podem tani bém ser usados como produtos intermediários para preparar ot-meti.1 aminoácidos. Por exemplo, a oé-metilarginina ó preparada em três etapas: 1.) fazendo reagir Arg(Tos) com benzaldeldo e cianoboro

-hidreto de sódio numa solução de metanol, obtendo-se (ot-Bzl)Arg(Tos); 2.) reduzindo o produto benzilado com solução de formaldeído/ácido fôrmico, obtendo-se (oG-Bzl, o4-Me) A rg(Tos ) ; e 3.) l.i bertando o grupo benzilo por hidrogenação catalítica (5% de Pd/C em ácido acético glacial/HCl), obtendo-se MeArg(Tos).

Os derivados substituídos ck-R · dos aminoácidos podem também ser preparados por redução de oxazolidinonas preparadas a par^

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SKB CASE 14420

Zí'

-23tir dos Fmoc- ou Cbz-aminoácidos. Normalmente aquece-se um Fmocou Cbz-aminoácido com um aldeído apropriado, como o acetaldeído ou o benzaldeldo, na presença de ácido tolueno-sulfónico, em relação de tolueno, obtendo-se a 5-oxo-oxazolidina substituída em 2. Por redução desta oxazolidinona com trietilsilano e TFA em solução de clorofórmio, obtém-se directamente o aminoácido Cbz ou Fmoc-ol subs tituido. Os peritos na arte notarão que quando se usa formaldeído, a oxazolidininona não está substituída na posição 2 e que se produzem ot-metil-aminoácidos.

Um grupo preferido de compostos deste invento é o descrito pela fórmula (ll). Estes compostos possuem dois aminoácidos que têm grupos tiol que estão juntos numa ligação di-sulfureto, formando uma estrutura cíclica.

Esta estrutura é produzida a partir do correspondente péptido linear (III)

S-T¹ S-T²

I I ^(III) _X-_Zl-(A.)_m-B'-Gl_y-^Asp-(C.)n^Z2-^Y onde A', B’, Asp, C', Z^, Z₂, m, n, p, q, W, X, Y, R', R , R₂, R^,

R^ e R^ são como atrás atrás definidos, com quaisquer centros qu_i micamente reactivos opcionalmente protegidos como anteriormente 1 2 se descreveu. T e T são grupos deslocáveis como os grupos tioalquilo, tioarilo, benzilo substituído ou hidrogénio. São exemplos de grupos deslocáveis adequados o hidrogénio, tioetilo, benzilo e o grupo 4-metilbenzilo.

A formação da ligação di-sulfureto pode ser conseguida por um dos dois métodos gerais. Se os aminoácidos contendo enxofre, do péptido linear, forem protegidos de modo diferente, de mo do a permitir a formação de um raono-mercaptan, a ciclizaçâo pode realizar-se por deslocamento nucleofIlico, catalisado por uma base, do grupo protector do segundo aminoácido contendo enxofre.

São grupos especial mente úteis como grupos protectores deslocáveis, os grupos tioalquilo ou tioarilo. E exemplo deste método a protecção de um aminoácido contendo um enxofre por um grupo tioetilo

213

SKB CASE 14420 r',·

-24e a protecção do segundo por um grupo benzilo substituído. A de.s protecção de um péptido destes pelo HF remove o grupo benzilo de um aminoácido, deixando o segundo protegido como di-sulfureto de etilo. Por agitação deste mercapto/di-sulfureto em solução dilui, da a um pH de cerca de 7 a 8, obtém-se o deslocamento do grupo tioetilo e a ciclização do péptido linear.

Se o correspondente péptido linear de fórmula (III) estiver completamente desprotegido e tiver sido produzido como dimercaptan, qualquer agente oxidante, conhecido na arte como capaz de converter um dimercaptan num di-sulfureto, pode ser usado. SSo exemplos destes agentes um ferricianeto de metal alcalino especialmente potássio ou ferricianeto de sódio, gás oxigénio, diiodome tano ou iodo. A reacção realiza-se num solvente inerte adequado como o metanol aquoso ou a água, a temperaturas entre cerca de 0 a cerca de 4DBC, sob diluição elevada. 0 pH ô usualmente mantido desde cerca de 7 até cerca de B. A ciclização pode realizar-se sobre o péptido enquanto este está ligado à resina de suporte ou enquanto outros grupos funcionais estejam ainda protegidos, mas realiza-se de preferência sobre o péptido livre desprotegido.

Os sais ácidos de adição dos péptidos são preparados de modo clássico num solvente adequado, a partir do composto aparentado e com um excesso de ácido como o clorídrico, bromídrico, sul. fúrico, fosfórico, acético, maleico, succínico ou metano-sul fónico. A forma de sal acetato é especial mente útil. Certos compostos formam sais interiores ou ziuitteriães que podem ser aceitáveis. Os sais catiónicos são preparados tratando o composto aparentado com um excesso de um reagente alcalino como um hidróxido, carbona to ou alcóxido, contendo o catião apropriado. Os catiões como Na⁺, K⁺, Ca⁺⁺ e NH^⁺ são exemplos de catiões presentes em sais farmaceuticamente aceitáveis.

Este invento prepara uma composição anti-fibrótica que compreende um péptido de acordo com a fórmula (i) ou (II) e um veículo farmaceuticamente aceitável. As composições farmacêuticas dos péptidos preparados como atrás se descreveram e de outros péptidos ou polipéptidos derivados da fibronectina, fibrinogéneo ou factor de von Willebrand, podem ser formulados como soluções

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SKB CASE 14420

ou pós liofilizados para administração parentérica. Os pós podem ser reconstituídos, antes de usar, por adição de um diluente adequada ou de outro veículo farmaceuticamente aceitável. A formulja ção liquida é em geral uma solução aquosa, tamponada, isotánica. São exemplos de diluentes adequados a solução salina isotánica normal, a solução clássica de 5/fa de dextrose em água ou a solução de acetato de sódio ou de amónio tamponada. Estas formulações são particularmente adequadas à administração parsntérica mas podem também ser usadas na administração oral ou contidas num inalador de doses medidas ou num nebulizador para insuflação. Pode ser de. sejável juntar excipientes como polivinilpirrolidona, gelatina, hidroxicelulose, acácia, polietileno-glicol, manitol, cloreto de sódio ou citrato de sódio.

Em alternativa, estes péptidos podem ser encapsulados, com primidos ou preparados numa emulsão ou xarope para administração oral. Podem juntar-se veículos sólidos ou líquidos, farmacêutica mente aceitáveis, para melhorar ou estabilizar a composição ou pa. ra facilitar a preparação da composição. Os veículos sólidos incluem o amido, lactose, sulfato de cálcio di-hidratado, terra alba, estearato de magnésio ou ácido esteárico, talco, pectina, acá^ cia, agár ou gelatina. Os veículos líquidos incluem xarope, óleo de amendoim, azeite de oliveira, solução salina normal e água. 0 veículo pode também incluir um produto para retardar a acção, como o monoestearato de glicerilo ou diestearato de glicerilo, soz_i nho ou com uma cera. A quantidade de veiculo sólido varia mas, de preferência, estará entre cerca de 20 mg até cerca de 1 g por unidade de dosagem. As composições farmacêuticas são preparadas de acordo com as técnicas convencionais de farmácia, envolvendo a moagem, mistura, granulação e compressão, quando necessário, para formar pastilhas; ou moagem, mistura e enchimento para o caso das cápsulas de gelatina dura. Quando se usa um veículo líquido, a preparação estará sob a forma de xarope, emixir, emulsão ou uma suspensão aquosa ou não-aquosa. Esta formulação líquida pode ser administrada directamente p. o. ou pode encher cápsulas de qe latina mole.

Para administração rectal, os péptidos deste invento po69 213

SKB CASE 14420 dem também ser combinados com excipientes como a manteiga de cacau, glicerina, gelatina ou polietileno-glicois e moldada em supositório.

Este invento também apresenta um processo para inibir a agregação de plaquetas e a formação de coágulos num mamífero, especialmente no homem, disso carenciado, processo que compreende a administração interna de uma quantidade efectiva do péptido anti-fibrótico e um veículo farmaceuticamente aceitável. As indicações desta terapia incluem o enfarte miocárdico, trombose de veias profundas, embolia pulmonar, dissecação de aneurismas, embolia c_e rebral e outros distúrbios relacionados com o enfarte. Devem tam bém responder a este tratamento os estados crónicos ou agudos de hiper-agregabilidade tais como coagulação intravascular dissemina da (DIC), septicémia, choque infectioso ou cirúrgico, trauma pos_t -operatório e post-parto, cirúrgia de by-pass cardiopulmonar, transfusão de sangue incompatível, deslocamento da placenta, púrpura trombocitopópica trombótica (TTP), veneno de cobra e doenças da imunidade. D péptido anti-fibrótico ó administrado quer oral quer parentericamente ao paciente, de modo tal que a concentração da droga no plasma seja suficiente para inibir a agregação de pia quetas. A composição farmacêutica contendo o péptido é administrada numa dose entre cerca de 0,2 e cerca de 50 mg/kg de modo consistente com o estado do paciente. Para uma terapia aguda pre fere-se a administração parentôrica. Para os estados persistentes de hiperagregabilidade ô mais eficaz uma infusão intravenosa do péptido em dextrose a 5% em água ou em soro salino normal, ai_n da que a injecção bolus intramuscular possa ser suficiente.

Para os estados de agregabilidade crónica, mas não crítica, de plaquetas, é adequada a administração oral de uma cápsula ou pastilha ou uma injecção bolus intramuscular. 0 péptido é adrni nistrado de 1 a 4 vezes por dia, a um nível de cerca de 0,4 a cer ca de 50 mg/kg para se obter uma dose total diária de cerca de 0,4 a cerca de 200 mg/kg/dia.

ste invento apresenta ainda um método para inibir a reoclusão de uma artéria ou veia após terapia fibrinolítica, método que compreende a administração interna de uma quantidade efectiva

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-27de um péptido antifibrótico e de um agente fibrinolítico, a um ma mífero necessitado deste tratamento. Uerificou-se que a administração de um péptido antifibrótico em terapia fibrinolltica ou evita completamente a reoclusão ou prolonga o tempo até reoclusão. Este invento, quando usado para inibir a reoclusão de um vaso após terapia fibrinolltica, pretende englobar não só os péptidos acima indicados como outros péptido, polipéptidos e fragmentos, ou derivados de péptidos e polipéptidos que possuam a sequência de ami. noácidos -RGD- e que sejam capazes de se ligar ao receptor GPIIb-Illa. Podem ser exemplos destes compostos anti-fibróticos os d.e rivados e fragmentos de fibronectina, fibrinogéneo e factor de von Willebrand. Estes péptidos/polipéptidos podem ser preparados como é sabido na arte por métodos de DNA recombinante ou por síntese de péptidos no estado sólido ou por síntese em solução convencional ou por síntese em solução. Os métodos para preparação de fragmentos de fibronectina foram descritos por Ruoslahti et al., W0 84/ /00540; Pierschbacher et al. , patente americana 4 589 881 e Rous^ lahti et al., patente americana 4 661 111, aqui incorporados para referência. Os péptidos produzidos deste modo podem dar produtos derivados por amidação, esterificaçâo, alquilação, acetilação ou por ligação a outros aminoácidos naturais ou não naturais. Os pé. ptidos/polipéptidos produzidos deste modo podem ser formulados co mo acima se indicou, para administração parentérica ou oral.

Os termos agente fibrinolítico, usados no contexto deste invento, pretendem significar qualquer composto, quer natural quer sintético que, directa ou indirectamente, provoque a lise de um coágulo de fibrina. Os activadores de plasminogéneo são um grupo bem conhecido de agentes fibrinolíticos. São activadores de plasminogéneo úteis, por exemplo, a uroquinase (UK), pro-uroquinase (pUK), estreptoquinase (SK), activador do plasminogéneo tecidual (tPA) e seus mutantes ou variantes, que retêm a activida^ de do activador de plasminogéneo, p. ex. variantes onde se tenham adicionado, eliminado ou substituído um ou mais aminoácidos ou ori de um ou mais domínios funcionais tenham sido acrescentados, eliminados ou alterados, p. ex. combinando o local activo de um acti vador de plasminogéneo como o tPA, com o domínio de ligação à fibrina de outro activador de plasminogéneo, p. ex., uma ou mais re

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-28giões Kringle da uroquinase, ou com uma outra molécula de ligação à fibrina como um fragmento Fab de um IgG anti-fibrina. Outras variantes que servem de exemplo incluem moléculas tPA onde um ou mais locais de glicosilação tenham sido alterados. Entre os acti vadores de plasrainogôneo preferidos Bstão as variantes de tPA onde a primeira sequência de aminoácidos tenha sido alterada no domínio do factor de crescimento de modo a aumentar a semi-vida do soro do activador de plasminogéneo. As variantes do factor de crescimento tPA estão descritas por, p. ex., Robinson et al., EP-A-297589 e Broiune et al. , EP-A-240334 e no pedido de patente do Reino Unido, da British Biotechnology Ltd. de 24 de Bunho de 1988 com Docket Number SKB 14422 da SmithKline Beckman Corporation, to dos aqui incorporados para referência. Os agentes fibrinollticos podem ser isolados de fontes naturais mas vulgarmente são produzi dos por métodos tradicionais de engenharia genérica.

Formulações úteis de tPA, SK, UK e pUK estão descritas, por exemplo, no pedido co-pendente US, Série N9. 890 432, no pedi do de patente alemã N9. 3 032 606, no pedido de patente europeia 4 568 543, todas aqui citadas para referência. Normalmente os agentes fibrinollticos podem ser formulados em solução aquosa, tamponada, isotónica, como p. ex. acetato ou adipato de amónio ou de sódio, tamponado a pH 3,5-5,5. Podem também juntar-se excipientes adicionais como a polivinilpirrolidona, gelatina, hidroxice lulose, acácia, polietileno-glicol, manitol e cloreto de sódio. Estas composições podem ser liofilizadas.

As composições farmacêuticas podem ser formuladas com o anti-fibrôtico e o fibrinolltico ambos no mesmo recipiente mas preferem-se formulações em recipientes diferentes. Quando ambos os agentes estiverem sob a forma de solução poderão estar contidos num sistema de infusão/injecção para administração simultânea ou um a seguir ao outro.

As indicações desta terapia incluem o enfarte do miocárdio, trombose de veias profundas, embolia pulmonar, embolia cerebral e outros distúrbios ligados ao enfarte. 0 anti-fibrótico é administrado logo antes, ao mesmo tempo ou logo após a administr£ ção parentérica de tPA ou outro agente fibrinolltico. Pode ser

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-29desejável continuar o tratamento com o anti-fibrótico durante um período de tempo bem depois da reperfusão ter sido realizado para inibir no máximo a reoclusão post-terapia. As doses efectivas de tPA , SK, UK ou pUK podem ser de 0,5 a 5 mg/kg e a dose efectiva do péptido anti-fibrótico pode ser de cerca de 0,1 a 25 mg/kg.

Para uma administração conveniente do inibidor e do agente fibrinolítico, simultaneamente ou em alturas diferentes, prepara—sb um kit compreendendo, num único recipiente, p. ex. caixa ou cartão ou outro, frascos, sacos, pequenos frascos ou outros recip_i entes contendo cada um uma quantidade efectiva de inibidor para administração parentérica, como acima se descreveu, e uma quantidade efectiva de tPA ou de outro agente fibrinolítico para administração parentérica como acima se descreveu. Este kit pode conter, p. ex., ambos os agentes farmacêuticos em recipientes separados ou no mesmo recipiente, opcionalmente como pastilhas liofilizadas e recipientes de soluçães para as reconstituir. Uma va riante é incluir a solução de reconstituição b a pastilha liofil_i zada em duas câmaras do mesmo recipiente, que se possam misturar antes de usar. Com este arranjo, o fibrinolítico e o péptido anti-fibrótico podem ser embalados separadamente, como no caso dos dois recipientes, ou liofilizados juntos sob a forma de pó e fornecidos num só recipiente.

Quando ambos os agentes se apresentam em solução, podem estar contidos num sistema de infusão/injecção para administração simultânea ou um a seguir ao outro. Por exemplo, o inibidor da agregação de plaquetas pode estar sob forma injectável, o.v., ou num vaso de infusão ligado em série por tubos ao agente fibrinoM tico num outro saco de infusão. Usando este sistema, um paciente pode receber uma injecção inicial tipo bolus ou infusão do inibidor anti-fibrótico seguido de uma infusão do agente fibrinolítico.

A actividade farmacológica dos péptidos foi avaliada pelos seguintes ensaios.

Interacção com lise de terapia fibrinolítica de um coágulo pre-formado no homem ensaio da lise do coágulo no homem é usado para avaliar

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SKB CASE 14420

o efeito in vitro do péptido anti-fibrótico sobre a fibrinolise induzida pelo tPA. Plasma humano, fora da validade, citratado, da Cruz Vermelha Americana ó centrifugado durante 20 minutos a

1300 x g para remover restos de células do sangue. Ounta-se uma 125 soluç3o consistindo em plasma, I-fibrinogónio, cloreto de cál_ cio e trombina, a placas de cultura de tecidos, de depósitos de 6 mm, e incuba-se durante 15 a 18 h a 37SC. Na manhã seguinte cada depósito é lavado para libertar o coágulo. Os coágulos são lavados por 2 vezes com soro tamponado com Tris contendo heparina e albumina. Cada coágulo é então adicionado a 1,0 ml do mesmo plajs ma usado para preparar o coágulo. 0unta-se tPA aos tubos numa ga ma de concentrações de 7 a 250 ng/ml (concentração final). 0s tu bos são incubados a 37SC sob rotação suave durante 4 horas. No fim das 4 h, retira-se uma aliquota de 25 ixl e conta-se para me125 dir ο I libertado do coágulo. Todas as amostras correm em tri. plicado.

0s resultados deste ensaio estão representados graficameri te na Figura 1. Isto demonstra que o péptido AC-RGDS-NH₂ não interage com a lise do coágulo induzido pelo tPA.

Demonstração da Inibição In Vivo da Agregação de Plaquetas

A inibição in vivo da formação de trombos demonstra-se re gistando os efeitos sistémicos e hemodinâmicos da infusão de pépti dos em cães anestesiados, de acordo com os métodos descritos por Aiken et al., Prostaqlandins, 19, 629-43 (l9B0). Sucintamente, um pequeno cilindro Lexa n® ó colocado à volta de uma artéria coronária da dobrada para a esquerda mecanicamente danificada, para produzir uma obstrução parcial, fixa, de B0 a 90%. Nestas condições, as plaquetas aderem ao colagéneo subendotélico exposto e agregam-se no local da obstrução. A gregaçSo ó avaliada como redução gradual do fluxo sanguíneo ao longo de 2-3 min. até que o trombo seja desalojado mecanicamente do lúmen do vaso obstruído e que o caudal de sangue da coronária seja restabelecido. Repete-se este processo em cada 2-3 min ao longo do periodo de controlo do ensaio.

0s resultados duma destas experiências em que se usou Ac-RGDS-NH₂, estão indicados na figura 2 (a-c). Assim, o gráfico

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SKB CASE 14420

-31do topo (a) mede a pressão sanguínea arterial (mmHg), o do meio (b) mede o fluxo sanguíneo fásico da coronária (ml/min) e o de baixo (c) mede o fluxo sanguíneo médio da coronária. Durante o p.e riodo de controlo, o fluxo descreve (gráficos (b) e (c)) até que o coágulo seja deslocado (shaken loose - SL). A seta indica o início da infusão coronária de Ac-RGDS-Nf^ (400 mm a 0,1 ml/mm).

Esta infusão tem como resultado uma inibição completa da formação do trombo até que termine a infusão (segunda seta). 0 fim da infusão resulta num decréscimo do fluxo à medida que ocorre a forma ção de trombas.

A dependência da dose da actividade anti-agregativa demonstra-se observando o efeito sobre o fluxo sanguíneo médio na coronária (ml/mm) quando a taxa de infusão do péptido anti-fibrótico varia. Isto está demonstrado na figura 3 (a-c) para o Ac-RGDS-NH^. 0 gráfico do topo (a) mostra inibição completa da formação de trombos (400 mM a 0,052 ml/min). 0 gráfico do meio (b) mostra inibição moderada com desprendimento espontâneo do trombo X (400 mM a 0,026 ml/min). 0 gráfico de baixo (c) mostra uma inibição parcial com prolongamento de tempo para se completar o bloqueameji to (400 mM, 0,013 ml/min) o que exige que o trombo se tenha desl_o cado (SL). De novo o início e o fim da infusão estão marcados por setas.

Inibição da Agregação de Plaquetas

Recolheu-se sangue (citratado para evitar a coagulação) de cães vadios, adultos, nativos. Preparou-se o plasma rico em plaquetas, PRP, por centrifugação a 150 x g durante 10 min à tempera tura ambiente. Prepararam-se plaquetas lavadas centrifugando o PRP a 800 χ g durante 10 min. 0 peletizado de células assim obt_i do foi lavado duas vezes com tampão de Tyrode (pH 6,5) sem Ca e re-suspendeu-se em tampão de Tyrode (pH 7,4) contendo 1,8 mM Ca ⁺a 3 χ 10⁵ células/ml. Em todos os ensaios de agregação de plaque tas juntaram-se os péptidos 3 min antes do agonista. As concentrações finais do agonista foram de 0,1 unidade/ml de trombina e 2yxM de ADP (Sigma). A agregação foi controlada num Chrono-Log Lli mi-Aggregometer*'. Usou-se a reansmitância da luz 5 min após a adji ção do agonista, para calcular a percentagem de agregação de acor

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SKB CASE 14420

-32do com a fórmula % de agregação = (90-CR) : (90-10)_7 x 100 onde CR é a leitura do mapa, 90 é a linha de base e 10 é a leitura do branco de PRP. Determinaram-se as IC^g pondo em gráfico a Λ% de inibição da agregação_7 versus oncentração do péptido_/. 0s péptidos foram avaliados a 200 e diluídos em sequência por um factor de 2, para estabelecer uma curva adequada de resposta às doses.

Para determinar a estabilidade dos péptidos às proteases do plasma, os péptidos foram incubados durante 3 h (melhor do que 3 min) no PRP antes da adição do agonista.

seguinte quadro ilustra a actividade dos péptidos prepa. rados por este invento, sobre a agregação de plaquetas.

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SKB CASE 14420

Os exemplos que se seguem não pretendem limitar o âmbito deste invento mas sim ilustrar o processo de preparaçSo e o uso dos compostos referidos.

EXEMPLOS

Nos exemplos que se seguem todas as temperaturas estão em graus centígrados. A análise de aminoácidos foi realizada numa Dionex auto-ião 100. A análise do teor de péptidos baseou-se na análise de aminoácidos. Os espectros de massa foram obtidos com um espectrómetro de massa VG Zab usando bombardeamento atómico rá pido. Para a cromatográfia em camada fina usaram-se placas de ca mada fina (0,25 mm) de sílica gem EM. ODS refere-se a um suporte cromatográfico de gel de octadecilsililsilica. As abreviaturas usadas para representar a composição eluente são B: butanol,

A: ácido acético, W: água, E: acetato de etilo, IP: isopropanol, P: piridina e CA: ácido cloroacético. A HPLC foi realizada num sistema Beckman 344 de cromatográfia em gradiente, com um integrador de registos CRIB quer no modo isocrático ou de gradie_n te continuo. A pureza do péptido, quando indicada, baseia-se na integração do cromatograma de HPLC. Preparou-se a MeArg pelo método descrito por Ali et al. na patente americana 4 687 75Θ (1987)

Exemplo 1

Preparação de N^-Ac-Ciclo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂ (péptido protegido)-(resina intermediária) N^-Ac-Cys(ΞΕt)- MeArg(Tos)-Gly-Asp(QChx)-Ser(Bzl)-Cys(4-MBzl)-MBHA foi sin tetizado pelo método da fase sólida sobre resina 4-raetilbenz-hidrilamina, usando um sintetizador automático Beckman 990 MP em escala 1,0 mmol. Todos os aminoácidos foram protegidos em t-but_i loxicarbonil no grupo amino e foram ligados em sequência usando N,N-diciclo-hexilcarbodiimida/l-hidroxibenzotriazolo (DCC/HOBt) do modo estabelecido por Ali et al. em 0. Med. Chem., 29, 984 (1986) e 3. Med. Chem., 30, 2291 (l9B7). Depois de ligar o último aminoácido, o péptido foi acetilado usando uma mistura de anidrido acético (10 eq.) e diisopropiletilamina (10 eq.) em dimetil. formamida. 0 péptido foi separado da resina com desprotecção dos grupos protectores da cadeia lateral usando HF anidro (30 ml) na

213

SKB CASE 14420 tf

-36presença de anisol (3,0 ml) a OSC durante 60 minutos. Depois da evaporação do HF no vácuo, lavou-se o resíduo com éter anidro e extraiu-se o péptido em bruto com ácido acético a 50% e diluiu-se com 2 1 de água desionizada. 0 pH da solução aquosa foi a j us tado até 7,5 com hidróxido de amónio conc. Nestas condições ligeiramente alcalinas o tiol livre criado pela remoção do grupo 4 MBzl da cisteína provoca um deslocamento nucleofílico do grupo protector mercaptoetil da segunda cisteína provocando a ciclização intramolecular do péptido. Faz-se borbulhar um gás inerte, c mo o azoto ou o argon, através da solução para remover o etilmercaptan produzido. 0 processo de ciclizaçâo realiza-se entre as 24 e 4B h. Faz-se então passar a solução reagente por uma coluna cromatográfica, de fase inversa, de octadecilsilano (0D5), previa mente equilibrada com água. Eluiu-se o péptido com solução de 15% acetonitrilo/H20 - 0,1% TFA, obtendo-se 678,6 mg (98% de rendimento bruto). Purificou-se o péptido por cromatografia usando uma coluna de fase inversa, pressão média, de ODS, que foi eluida com 5% acetonitrilo/H2θ-0,1% TFA. 0 péptido do titulo foi eluldo em duas fracções, obtendo-se 222,3 mg com pureza >98%.

Características físicas:

P.M.: 692,231

Bomb. At. Ráp.: (M+H)⁺ 693,5, (M-H)~ 692,0

AAA: Asp (l,07); Ser (l,00); Gly (1,00); Cys (2,37)

Teor de péptidos: 67,7%

Dados da Cromatografia:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_f=0,42 (B:A:W:P, 15:3:8:10), R_f=0,36

2. HPLC: Altex Ultrasphere® ODS, 4,5 mm x 25 cm, detecção a 220 nM.

Eluição isocrática: 2% acetonitrilo/^ 0 - 0,1% TFA, k' =0,2

Passo da eluição em gradiente: aplicada à coluna equilibrada com Η₂0 - 0,1% TFA, 5% acetonitrilo/H₂0-0, TFA 5 min, 50% 20 min. k'=l,5.

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SKB CASE 14420 v

-37Substituindo, na sequência acima, Boc-Ser(Bzl) por Boc-Thr(Bzl) obtém-se N*^t-Ac-Ciclo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Thr-Cys-NH₂.

Substituindo, na sequência acima, Boc-Ser(Bzl) por Boc-D-(Me)Cys obtém-se N^-Ac-Ciclo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-D-(Me)Cys-Cys-NH₂.

Substituindo, na sequência acima, Boc-Ser(Bzl) por Boc-Ual obtém-se N^-Ac-Ciclo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Val-Cys-NH₂.

Substituindo, na sequência acima, Boc-Ser(Bzl) por Boc-Nva obtém-se N^-Ac-Ciclo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Nva-Cys-NH₂.

Substituindo, na sequência acima, Boc-Ser(Bzl) por Boc-Phg obtém-se N ^-Ac-CicloíS,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Phg-Cys-NH₂.

Substituindo, na sequência acima, Boc-Ser(Bzl) por Boc-HPhe obtém-se N^-Ac-Ciclo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-HPhe-Cys-NH₂.

Exemplo 2

Preparação de N°^-Ac-Ciclo(S ,S ) Cys-Arg-Gly-Asp-(D , L )-APmp-NH₂ péptido protegido-resina intermediária N^-Ac-CysíSEt)-Arg(Tos)-Gly-Asp(OChx)-APmp(4-MBzl)-ΜΘΗΑ foi preparado, separado, ciclizado e isolado do mesmo modo do Exemplo 1 em escala 0,5 mmol. 0 péptido foi purificado por cromatografia flash usando uma coluna de fase inversa, pressão média, ODS, eluída com 15% de acetonitrilo/H₂0-0,l% TFA. 0 composto do titulo foi eluído em 3 fracções obtendo-se 150,9 mg (45,8%) com pureza >96%.

Características Físicas

F.M.: ^C25^H41^N9°b^S2 ’ ^Ρ·^Μ·^{: 659}»⁴

Bomb. At. Rap. (FAB): (M+H)⁺ 660

AAA: Asp (l,00), Gly (l,00), Arg (0,9l)

Teor de péptidos: 60,6%

Dados da Cromatografia

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_f = 0,67; (B:A:W:!, 15:3:8:10),

R_f = 0,5.

2. HPLC: Altex UItrasphere® ODS, 4,5 mm x 25 cm, detecção a 220 nM.

213

SKB CASE 14420

Isocrática: 10% acetonitrilo/H₂0 - 0,1% TFA, k'=3,24

Gradiente: A: acetonitrilo, B: H₂0-0,l^í> TFA, 12-50% A durante 20 min, k’=l,97.

Substituindo, na sequência acima, Boc-Arg(Tos) por Boc-MeArg(Tos) obtém-se N^-Ac-Ciclo(S,S)Cys-MeArg-Cly-Asp-(D,L)-APmp -nh₂.

Exemplo 3

Preparação de N°^-Ac-Ciclo(S ,S )Cys-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂ péptido protegido-resina intermediária N°^-Ac-Cys(Set)-Arg(Tos)-Gly-Asp(0Bzl)-Ser(Bzl)-Cys(4-MBzl)-MBHA foi sintetizado separado e ciclizado do mesmo modo do Exemplo 1 em escala 1,0 mmol. Foi liofilizado obtendo-se 530 mg (7B%). Foi purificado por cromatografia flash usando uma coluna de fase inversa, ODS, de média pressão, eluída com 1% acetonitrilo/H₂0-0,1% TFA. Obtiveram-se 61 mg do péptido do título com pureza de 90%.

Caracteristicas Físicas:

P.M.: 678,75

FAB: (M+H)⁺ 679

AAA: Asp (l,00)j Ser (θ,9θ); Gly (0,97); Arg (0,90); Cys (1,75)

Teor de Péptidos: 86,3%

Dados da Cromatoqrafia:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_f=0,32 (B:W:IP:CA, 6,5:2:1,5:0,3), R_f=0,06

2. HPLC: coluna l/ydac 218 TP ODS, 4,6 mm x 25 cm, detecção a 220 nM

Gradiente: A: acetonitrilo, B: H₂0-0,l% TFA, 0-50% du.

rante 35 min, k'=6,4.

Substituindo, na sequência acima, Ser(Bzl) por Boc-Tyr(Brz) obtém-se N^-Ac-Ciclo(Ξ,S)Cys-Arg-Gly-Asp-Tyr-Cys-NH₂.

Substituindo, na sequência acima, Boc-Ser(Bzl) por Boc-Phe obtém-se N°^-Ac-Ciclo(S,S)Cys-Arg-Gly-Asp-Phe-Cys-NH₂.

213

SKB CASE 14420 <6

-39Substituindo,na sequência acima, Boc-Ser(Bzl) por Boc-Met obtém-se N°6-Ac-Ciclo(S ,S ) Cys-A rg-Gly-Asp-Met-Cys-NH^.

Substituindo, na sequência acima, Boc-Ser(Bzl) por Boc-Nle obtém-se N^-Ac-CicloíS,S)Cys-Arg-Cly-Asp-Nle-Cys-NH₂.

Substituindo, na sequência acima, Boc-Ser(Bzl) por Boc-Nal obtém-se N^-Ac-CicloíS,S)Cys-Arg-Cly-Asp-Nal-Cys-Nh^ .

Substituindo, na sequência acima, Boc-Ser(Bzl) por Boc-Ile obtém-se N^-Ac-CicloCS,S)Cys-Arg-Gly-Asp-Ile-Cys-NH^.

Exemplo 4

Preparação de Ciclo(S,S)Mpr-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH2 péptido protegido-resina intermediária Mpr(4-MBzl)-Arg(Tos)-Gly-Asp(OChx)-Ser(Bzl)-Cys(SEt)-MBHA foi preparado, separado, ciclizado e isolado do mesmo modo do Exemplo 1 em escala 1,0 mmol. 0 péptido foi purificado por cromatografia flash de fase inversa, média pressão, ODS, elulda com 3,5% acetonitrilo/h^O-Ojl/ TFA. Obtiveram-se 4B9 mg (79%) do composto do titulo, com 96% de pureza.

Caracteristicas Físicas:

F.M.: ^C2l^H35^N9°9^S2

P.M.: 621,208

FAB: (M+H)⁺ 622,1; (Μ-H)” 620,7

AAA: Asp (l,00), Ser (0,97), Gly (l,00), Cys (0,57), Arg (l,03) Teor de péptidos: 73,88%

Dados da Cromatografla:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_f=0,42 (B:A:W:P, 15:3:8:10), R_f=0,41

2. HPLC: Altex Ultrasphere® ODS, 4,5 mm x 25 cm, detecção a 220 nm.

Isocrática: 4% acetonitrilo/F^O-O,^, TFA, k' = 3,6

Gradiente: A: acetonitrilo, B: 1^0-0,1% TFA, 3-50% A durante 20 min, k'=3,3

213

SKB CASE 1442 0 .

-40Exemplo 5

Preparação de N^-Ac-Ciclo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Ser-Pen-Nl·^ péptido protegido-resina intermediária N°^-Ac-Cys(SEt)-MeArg(Tos)-Gly-Asp(0Chx)-Ser(Bzl)-Pen(4-MBzl)-MBHA foi preparado, separado, ciclizado e isolado do mesmo modo do Exemplo 1, em escala 1,0 mmol, obtendo-se 542 mg (75%). Foi purificado por erg matografia flash usando uma coluna de fase inversa, pressão média, ODS, eluida com 6% acetonitrilo/f^0-0,1% TFA, obtendo-se 47,5 mg do composto do titulo com pureza de 94%.

Garacteristicas Físicas:

F.M.

P.M.

FAB:

AAA:

Teor ^C26^H44^N1O°1O^S2

720,27 (M+H)⁺ 721,3

Asp (1,00), Ser (0,96), de pêptidos: 7B,12%

Gly (1,00),

MeArg (0,B9)

Dados da Cromatografia:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_f=0,42 (B:A:W:P, 15:5:10:10), R =D,41

2. HPLC: Altex Ultrasphere^^ ODS, 4,5 mm x 25 cm, detecção 220 nm

Isocrática: 6% acetonitrilo/l^O-0,1% TFA, k'=5,66

Gradiente: A: acetonitrilo, B: H₂Q-0,l% TFA, 0-50% A durante 20 min, k'=3,19

E x e mp 1 o 6

Preparação de N -Ac-Ciclo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-MeSer-Cys-Nl·^ péptido protegido-resina intermediária N°^-Ac-Cys(SEt)-MeA rg(Tos )-Gly-Asp ( OChx )-(“C-Me)Ser( Bzl )-Cys (4-MBzl)-MBHA foi prg parado, separado, ciclizado e isolado do mesmo modo do Exemplo 1 em escala 0,5 mmol. 0 péptido foi eluído em coluna ODS de fase inversa usando 10% acetonitrilo/l·^0-0,1% TFA obtendo-se 47 mg.

Foi depois purificado por HPLC preparativa usando condições isocráticas, 5,5% acetonitrilo/H_0-0,1% TFA spbre coluna Altex Ultrasphere^ ODS, 5/*, 10 mm x 25 cm, com detecção a 220 nm, obtendo-se 10,6 mg com pureza >96%.

213

SKB CASE 14420

-41Caracteristicas Físicas:

F.M.

P.M.

FAB:

AAA:

Teor ^C26^H42^N1O°1O^S2

706,237 (M+H)⁺ a 707,5; (M-H)

Asp (1,06), Gly (l,00) de péptidos: 55,85% a 709,5

Dados da Cromatografia:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_f=0,41 (B:A:W:P, 15:5:10:10), R_f=0,49

2. HPLC: Altex UltraspherX^ ODS, 4,5 mm x 25 cm, detecção a 22 0 nm

Isocrática: 4,5% acetonitrilo/H₂0-0,1% TFA, k’=_,95

Gradiente: A: acetonitrilo, Θ: H₂0-0,l% TFA, 0-50% A durante 20 min, k'=5,97

Exemplo 7

Preparação de Ciclo(S,S)Mpr-MeArg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂ péptido protegido-resina intermediária Mpr(4-MBzl)-MeArg (Tos)-Gly-Asp(OChx)-Ser(0-Bzl)-Cys(SEt)-MBHA foi preparado, separado, ciclizado e isolado do mesmo modo do Exemplo 1 em escala 1,0 mmol. 0 péptido foi eluído da coluna usando 5% acetonitrilo/ /H₂0-0,l% TFA, obtendo-se 256,5 mg (40%) do composto do titulo.

Foi purificado por filtração gel por Sephadex® G-15 usando ácido acético 0,2M como eluente. Foi depois purificado por HPLC preparativo usando condiçães de gradiente, A: acetonitrilo, B: H₂0-0,l% TFA, 5-30% durante 10 min, em coluna Altex UItrasphere^S) ODS, 5/a., 10 mm x 25 cm, com detecção a 220 nm, obtendo-se o composto do ti tulo com pureza >98%.

Caracteristicas Físicas:

P.M.: 635,22

FAB: (M+H)⁺ a 636,2

AAA: Asp (l,00), Ser (0,B4), Gly (l,04), Cys (l,48)

213

SKB CASE 14420

-42Dados da Cromatografia;

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1) R_f=0,39 (B:A:W:P, 15:5:10:10) R_f=0,49

2. HPLC: Altex Ultrasphere® ODS, 4,5 mm x 25 cm, detecção a 220 nm

Isocrática: 5% acetonitrilo/^0-0,1% TFA, k’=5,93

Gradiente: A:acetonitrilo, B: Η₂0-0,1% TFA, 0-50% A durante 20 min, k’=7,B6

Exemplo 8

Preparação de N°^-Ac-Ciclo(S ,S ) Cys-MeArg-Gly-Asp-Cys-NH2 :

péptido protegido-resina intermediária lX-Ac-Cys(4-MBzl)-MeArg(Tos)-Gly-Asp(OChx)-Cys(SEt)-MBHA foi preparado, sepa rado, ciclizado e isolado do mesmo modo do Exemplo 1 em escala 1,0 mmol. Foi eluído em coluna ODS de fase inversa, usando 5% acetonitrilo/H20-0,1% TFA, obtendo-se 7B0 mg do péptido do título. Foi purificado por filtração gel em Sephadex® G-15 usando ácido acético 0,2M como eluente. Foi depois purificado por HPLC preparativa em condiçães isocráticas, 5% acetonitrilo/H^0-0,1% TFA, em coluna Altex Ultrasphere® ODS, 5^, 10 mm x 25 cm com detecção a 220 nm, obtendo-se o composto do título com pureza >98%. Características Físicas:

F.M.: ^Ci2^H35^N9°B^S2

P.M.: 605,21

FAB: (M+H)⁺ a 606,2; (M-H)~ a 604

AAA: Asp (l,00), Gly (l,13), Cys (2,04)

Teor de péptidos: 77,33%

Dados da Cromatografia:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_f=0,43 (B:A:W:P, 15:5:10:10), R_f=0,56

2. HPLC: Altex Ultrasphere® ODS, 4,5 mm x 25 cm, detecção a 220 nm

Isocrática: 5% acetonitrilo/H20-0,l% TFA, k'=4,76

Gradiente: A: acetonitrilo, B: H20-0,l% TFA, 0-50% A durante 20 min, k'=7,18

213

SKB CASE 14420

-4 3Exemplo 9

Preparação de Ciclo(S,S)Mpr-MeArg-Gly-Asp-Pen-NHg:

péptido protegido-resina intermediária Mpr(4-MBzl)-MeArg(Tos)-Gly-Asp(0Chx)-Pen(4-MBzl)-MBHA foi preparado, separado e isolado do mesmo modo do Exemplo 1, em escala 1,0 nmol. 0 péptido foi ciclizado usando KgFe(CN)g em solução 0,01M. 0 péptido foi cromatografado em coluna ODS de fase inversa usando 10$ acetonitrj. lo/HgO-0,1% TFA, obtendo-se 365 mg (63$) do composto do titulo.

Foi depois purificado por filtração-gel em Sephadex® G-15, usando ácido acético 0,2M como eluente, obtendo-se o composto do titulo com pureza >96$.

Caracterlsticas Físicas:

F.M.: C₂₁H₃₆N_b0₇S₂

P.M.: 576,22

FAB: (M+H)⁺ a 577,2; (M-H)“ a 575,3

AAA: Asp (l,00), Gly (l,15), Mpr+Pen (l,55)

Teor de péptido: 65,77$

Dados da cromatoqrafia:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_f=0,58 (B:A;W:P, 15:5:10:10), R_f=0,5

2. HPLC: Altex Ultrasphere® ODS, 4,5 mm x 25 cm detecção a 22 0 nm

Isocrática: 10$ acetonitrilo/H₂0-0,l$ TFA, k’=6,ll

Gradiente: A: acetonitrilo, B: H₂0-0,l$ TFA, 0-5$ A durante 20 min, k'=10,93

Exemplo 10

Preparação de N^Ac-Cicl o (Ξ ,S ) Cys-Ar g-Gly-Asp-Pen-NHg :

péptido protegido-resina intermediária N^-Ac-Cys (SEt)-Arg(Tos)-Gly-Asp(0Bzl)-Pen(4-Bzl)-MBHA foi preparado, separado, ciclizado e isolado do mesmo modo do Exemplo 1, em escala 1,0 mmol, obtendo-se 400 mg (65$). Foi purificado por cromatografia de partilha em Sephade?/® G-25, usando (B:A:K, 4:1:5) obtendo-se o composto do título com pureza >97$.

213

SKB CASE 14420

-44Características Físicas:

F.M.: ^C22^H37^N9°8^S2

P.M.: 619,711

FAB: (M+H)⁺ a 620,2, (Μ-H) a 618,7

AAA: Asp (l,D0), Gly (l,0l), Cys (l,00), Arg (0,67)

Teor de pêptidos: 95,6%

Dados da Cromatografia:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_f=0,37 (B:W:I:C, 65:20:15:3), R_f=0,097

2. HPLC: Coluna Vydac 218 TP, ODS, 4,6 mm x 25 cm detecção a 220 nm

Isocrática: 6% acetonitrilo/H₂0-0,1% TFA, k'=2,2

Gradiente: A: acetonitrilo, B: H₂0-0,1% TFA, 0-50% A durante 15 min, k'=3,7

Exemplo 11

Preparação de N^-Ac-Cicl o (S,S)Cys-Arg-Cly-Asp-D-Pen-NH₂:

péptido protegido-resina intermediária N°á-Ac-Cys(SEt)-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-D-Pen(4-MBzl)-MBHA foi preparado, separado, ciclizado e isolado do mesmo modo do Exemplo 1, em escala 1,5 mmol. 0 péptido foi purificado por cromatografia fias usando uma coluna ODS de fase inversa, de média pressão, eluída com 15% metanol/H₂0-0,1% TFA. Obtiveram-se 50 mg (5,4%) do composto do título com pureza >96%.

Características Físicas:

F.M.: ^C22^H37^N9°B⁵2

P.M.: 619,711

FAB: (M+H)⁺ a 620,2, (M-H)“ a 618,8

AAA: Asp (l,00), Gly (l,03), Arg (0,88)

Teor de pêptidos: 54%

Dados da Cromatografia:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_f=0,42 (B:W:I:C, 65:20:15:3), R_f=0,ll

213

SKB CASE 14420

-452. HPLC: coluna Vydac 218 TP, ODS, 4,6 mm x 25 cm, detecção a 22 0 nm

Isocrática: 5% acetonitrilo/l^O-0,1% TFA, k'=2,7

Gradiente: A: acetonitrilo/l·^0-0,1% TFA, 0-50% A durante 15 min, k’=3,3

Exemplo 12

Preparação de N^-Ac-Ciclo(S,S)Cys-Lys-Gly-Asp-Pen-NH₂:

péptido protegido-resina intermediária hf^-Ac-CysCSEt)-Lys(Clz)-Gly-Asp(0Bzl)-Pen(4-MBzl)-MBHZ Foi preparado, separado, ciclizado e isolado do mesmo modo do Exemplo 1, em escala 2,0 mmol. 0 péptido em bruto foi passado por uma coluna Amberlite® XAD-2 e eluldo com 50% acetonitrilo/H₂0-0,l% TFA. Foi purificado por cromatografia flash usando uma coluna ODS de fase inversa, de média pressão, eluida com (% acetonitrilo/H₂0-0,1% TFA. Obtiveram-se 1B0 mg (15%) do composto do título com pureza >97%.

Características Físicas:

F.M.: ^C22^H37^N7°8^S2

P.M.: 591,698

FAB: (M+H)⁺ a 592,3, (M-H)~ a 591

AAA: Asp (l,00), Gly (l,13), Lys (l,09), Cys (2,25)

Dados da Cromatografia:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_f=0,38

2. HPLC; coluna Vydac 218 TP, ODS, 4,6 mm x 25 crr^ detecçSo a 22 0 nm

Isocrática: 3% acetonitrilo/H₂0-D,l% TFA, k’=3,5

Gradiente: A: acetonitrilo, B: H₂0-0,l% TFA, 0-50% A durante 15 min, k’=2,9

Exemplo 13

Preparação de N°LAc-Cíc1o(S,S)Cys-HArg-Gly-Asp-Pen-NH₂:

A uma solução de sulfato ácido de 0-metiliso-ureia (290 mg; 1,7 mmol) em solução 2,5M de NaOH, pH ajustado a 11, juntojj -se o péptido N^ot-Ac-Cys-Lys-Gly-Asp-Pen-NH₂ (100 mg; 0,17 mmol). Depois de repousar durante a noite à temperatura ambiente, a mis69 213

SKB CASE 14420

-46tura reagente foi passada por uma coluna de Amberlite XAD-2 e eluída com 50$ acetonitrilo/l·^0-0,1$ TFA. Foi purificada por cro matografia flash usando uma coluna ODS de fase inversa, de média pressão, eluída com 10$ acetonitrilo/t^O-O,1$ TFA obtendo-se 40 mg (37$) do péptido do título com pureza de 95$.

Características Físicas;

F.M.: C₂₃H₃₉N₉O₀S₂

P.M.; 633,74

FAB: (M+H)⁺a 634,2, (M-H)“ a 632,3

AAA: Asp (l,00), Cly (l,16), Cys (2,45)

Teor de péptidos: 68,9$

Dados da Cromatoqrafia:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_f=0,44 (B:W:I:C, 65:20:15:3), R_f=0,19

2. HPLC: coluna Vydac 218 TP, ODS, 4,5 mm x 25 cm, detecção a 220 nm

Isocrática: 4$ acetonitrilo/H₂0-0,l$ TFA, k’=2,0

Gradiente: A: acetonitrilo, B: H₂0-0,l$ TFA, 0-50$ A durante 15 min, k’=3.2

Exemplo 14

Preparação de N°^Ac-Ciclo(S,S)Cys-MeArg-Cly-Asp-Pen-NH₂:

péptido protegido-resina intermediária N$-Ac-Cys(SEt)-MeArg(Tos)-Gly-Asp(0Bzl)-Pen(4-MBzl)-MBHA foi preparado, separado, ciclizado e isolado do mesmo modo do Exemplo 1, em escala 1,0 mmol. Foi purificado por cromatografia flash usando uma coluna ODS de fase inversa, de média pressão, eluída com 5$ acetonitrilo/H 0-0,1% TFA, obtendo-se 209 mg (35$) do composto do titulo com pureza de 95$.

Características Físicas:

F.M.: ^23^39^9^8^2

P.M.: 633,738

FAB: (M+H)⁺ a 634,7

AAA: Asp (l,00), Gly (0,98), Cys (l,0ó)

Teor de péptidos: 66$

213

SKB CASE 14420

-X..3 **

-47Dados da Cromatografia:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_f=D,62 (B:A:W:P, 15:5:10:10), R_f=0,39

2. HPLC: Altax Ultrasphera ®ODS, 4,5 mm x 25 cm, detecção a 220 nm

Isocrática: 5% acetonitrilo/l·^0-0,1% TFA, k’=2,39

Gradiente: A: acetonitrilo, B: H₂0-0,l% TFA, 5-50% A durante 20 min, k’=4,16

Exemplo 15

Preparação de N^-Aç-Arq-Gly-Asp-Ser-NHEt

a) Preparação de Boc-Ser(Bzl)-NHEt

A uma solução de Boc-Ser(Bzl), (6,0 g; 20,3 mmol) e N-me tilmorfolina, 2,3 ml (20,9 mmol) em 50 ml de THF, juntou-se isobu tilcloroformiato (2,7 ml; 20,B mmol) a -15SC. A solução foi agi tada durante alguns minutos e fez-se borbulhar etilamina gasosa através da mistura. Agitou-se a mistura a -152C durante 30 min. Foi então filtrada e concentrou-se o filtrada à secura. 0 resíduo resultante foi dissolvido em acetato de etilo (100 ml) e lavado sucessivamente com HC1 1M (2x50 ml), água (50 ml), Na₂C0^ a 10% (2x50 ml) e salmoura (50 ml). A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada obtendo-se 6,0 g de um pó branco. A estrutura foi conformada por RMN.

b) Preparação de Boc-Asp(OBzl)-5er(Bzl)-NHE t grupo protector Boc do composto do Exemplo 15 (a) foi desprotegido por TFA anidro (10 ml/g) à temperatura ambiente durante 40 min. Removeu-se o TFA e o TFA residual foi determinado por pesagem. Usando o processo do Exemplo 12 (a), o dipéptido do título fci preparado a partir de Boc-Asp(OBzl) (5,B2 g; 18 mmol), Boc-Ser(Bzl)NHEt (10,4 g; 18 mmol), N-metilmorfolina (B ml, 73 mmol) e isobutilcloroformiato (2,4 ml; 18 mmol), obtendo-se 8,81 g de material vítreo. A estrutura foi confirmada por RMN.

c) Preparação de Boc-Asp-Ser(Bzl)-NHEt

A uma solução de 4,0 g de 15 (b) em acetato de etilo (100 ml) e metanol (25 ml), juntou-se 5% Pd/BaSO^ (2,0 g) e a mistura

213

SKB CASE 14420

foi hidrogenolisada num agitador Parr durante 30 min, sob 45 psi de hidrogénio. A mistura foi filtrada e o filtrado foi concentra do até 3,18 g de um material vítreo branco. A estrutura foi confirmada por RMN.

d) Preparação de Boc-Asp(O-benzil-resina)-Ser(Bzl)-NHEt composto do Exemplo 15 (c) (l,31 g; 3 mmol) foi ligado a uma hidroximetil-resina (l% de ligações cruzadas, 1 g, 1 mmol), usando 4-pirrolidinopiridina (0,15 g; 1 mmol) e DCC (620 mg; 3 mM) em cloreto de metileno.

e) Preparação de Aç-flrq-Gly-Asp-Ser-NHEt pôptido-(resina intermediária) Ac-Arg-Gli-Asp( OBzl-resi. na)-Ser(Bzl)-NHEt foi preparado a partir do composto do Exemplo 15 (d) por ligações sequênciais de Boc-Gly e Boc-Arg(Tos) e foi separado da resina e desprotegido como se descreveu no Exemplo 1. 0 péptido foi purificado por cromatografia flash usando uma coluna ODS de sílica, de fase inversa, eluída com 5% acetonitrilo/ /H₂0-0,l% TFA, obtendo -se 173 mg com pureza >95%.

Caracteristicas Físicas:

F.M.: ^Ci9^H34^Ng°0

P.P.: 502,53

FAB: (M+H)⁺ 503,0

AAA: Asp (1,08), Gly (l,00), Ser (l,02), Arg (l,07)

Teor de péptidos: 76,36%

Dados da Cromatografia:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_f=0,3B (B:W:IP:CA, 6,5:2:1,5:0,3), R_f=0,08

2. HBLC: l/ydac 218 TP, ODS, 4,6 mm x 25 cm, detecção a 220 nm

Isocrática: 5% acetonitrilo/H₂0-0,l% TFA, k'=0,4

Gradiente: A: acetonitrilo, B: 1-^0-0,1% TFA, 0-10% A durante 10 min, k‘=3,5.

Usando o mesmo processo, a substituição da etilamina pela di-n-butilamina permite obter N*^t-Ac-Arg-Gly-Asp-N(C^Hg)₂.

213

SKB CASE 14420

-49Exemplo 16

Preparação de N°^-Ac-Ciclo(5 ,S ) Cys-Arq-Cly-Asp-Pen-NHE t:

a) Preparação de Boc-Pen(4-MBzl)-NHEt:

aminoácido protegido do título foi preparado do mesmo modo do Exemplo 15 (a) usando 8oc-Pen(4-MBzl).

b) Preparação de Fmoc-Asp(0-tBut)-Pen(4-MBzl)-NHEt:

composto do título foi preparado de acordo com o proces. so do Exemplo 15 (b).

c) Preparação de Fmoc-Asp(0-benzil-resina)-Pen(4-MBzl)-NHEt:

grupo protector Boc do composto do Exemplo 16 (b) foi desprotegido por agitação com TFA anidro à temperatura ambiente durante 4B min. Removeu-se o TFA e o TFA residual foi determinado por pesagem. 0 resíduo resultante foi cristalizado em EtOAc/ /Hexano, obtendo-se 1,88 g (2,5 mmol) do sal de TFA. Foi então ligado à hidroximetil-resina.(l% de ligações cruzadas; 1,82 g; 1,0 mmol) usando 4-pirrolidinopiridina (quantidade catalítica) e DCC (2,5 mmol) em cloreto de metileno.

d) Preparação de N^-Ac-Ciclo(5,5)Cys-Arq-Cly-Asp-Pen-NHEt:

péptido protegido-resina intermediária N°^-Ac-Cys (SE t)-Arg(Tos)-Gly-Asp(O-Bzl-resina)-Pen-NHEt foi preparado a partir do composto do Exemplo 16 (c) por ligações em sequência de Boc-Gly, Boc-Arg(Tos), Boc-Cys(SEt) e acetilação após desprotecção do grupo Fmoc por 20% de piperidina em DMF. Foi então separado, ciclisado e isolado de modo semelhante ao do Exemplo 1. 0 pépti.

do foi purificado por cromatografia flash usando uma coluna ODS de fase inversa, de média pressão, eluída com 15% acetonitrilo/ /H^ 0-0,1% TFA, obtendo-se 307 mg (46%) com pureza de 97%. Características Físicas:

P.M.: 647,77

FAB: (M+H)⁺ a 648,3, (M-H)~ a 646,7

AAA: asp (l,00), Gly (l,04), Arg (l,03)

Teor de péptidos: 69,5%

213

SKB CASE 14420 z' >’ , è

-50Dados da Cromatografia:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_f=0,53 (B:W:L:C, 65:20:15:3), R =0,16

2. HPLC: coluna Vydac 218 TP ODS, 4,5 mm x 25 cm, detecção a 220 nm

Isocrática: 9% acetonitrilo/H₂0-0,l% TFA, k'=l,6

Gradiente: A: acetonitrilo, B: Η^Ο-Ο,Ι^ TFA, 0-50% A durante 15 min, k’=3,9

Exemplo 17

Preparação de N^-Ac-Ciclo(S,S)Cys-D-Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂:

péptido protegido-resina intermediária N°^{* i 2}-Ac-Cys(SEt)-D-Arg(Tos)-Gly-Asp(0Bzl)-Pen(4-MBzl)-MBHA foi preparado, separado, ciclizado e isolado do mesmo modo do Exemplo 1, em escala 1,00 mmol. Foi purificado por cromatografia flash usando uma coluna ODS de fase inversa, de pressão média, eluida com 6% acetonitrilo/ /H₂0-0,l% TFA, obtendo -se 300 mg (50%) do composto do título com pureza de 95%.

Características Físicas:

F.M.: C₂₂H₃₇N_g0gS₂

P.M.: 619,73

FAB: (M+H)⁺ a 620,4, (M-H)~ a 619

AAA: Asp (l,00), Gly (l,03), Cys (2,42), Arg (l,0l)

Teor de péptidos: 71,1%

Dados da Cromatografia:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_f=0,31 (B:A:W:P, 15:5:10:10), R_f=0,54

2. HPLC: Altex Ultrasphere® ODS 4,5 mm x 25cm, detecção a 22 0 nm

Isocrática: 6% acetonitrilo/H₂0-0,l% TFA, k'=5,2

Gradiente: A: acetonitrilo, B: 8^0-0,1% TFA, 5-50% A durante 20 min, k’=3,9

213

SKB CASE 14420

-51Exemplo 18

Preparação de N°ⁱ-Ac-Ciclo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp~Tyr-Cys-NH₂:

péptido protegido-resina intermediária N 'Í-Ac-Cys (SE t) -MeArg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Tyr(Brz)-Cys(4-MBzl)-MBHA foi preparado, separado, ciclizado e isolado do mesmo modo do Exemplo 1, em esca la 1,0 mmol. Foi purificado por cromatográfia flash usando uma coluna ODS, de fase inversa, média pressão, eluída com 11% acetonitrilo/H₂0-0,1% TFA, obtendo-se 350 mg (45%) do composto do títju lo. Foi depois purificado por filtração gel por Sephadex® G-15, usando ácido acético 0,2M como eluente, obtendo-se o composto do título com 95% de pureza.

Características Físicas:

F.M.

P.M.

FAB:

AAA:

Teor ^C30^H44^N10°10^S2

768,27 (M+H)⁺ a 769,3, (M-H)~ Asp (1,00), Gly (l,00) de péptidos: 82,75% a 767,B

Cys (1,91), Tyr (l,02)

Dados da Cromatográfia:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_f=0,65 (B:A:W:P, 15:5:10:10), R_f=0,7B

2. HPLC: Altex Ultrasphere^^ ODS, 4,5 mm x 25 cm, detecçSo a 22 0 nm

Isocrática: 9% acetonitrilo/H₂0-0,l% TFA, k’=6,4

Gradiente: A: acetonitrilο, B: H₂0-0,l% TFA, 5-50% A durante 20 min, k*=5,5

Exemplo 19

Preparação de N °^-Ac-Ciclo(S ,5 )Pen-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂ :

péptido protegido-resina intermediária N°^-Ac-Pen(4-MBzl) -MeArg(Tos)-Gly-Asp(OChx)-Pen(4-MBzl)-MBHA foi preparado, separado e isolado do mesmo modo do Exemplo 1, em escala 1,0 mmol. 0 pépti do foi ciclizado usando uma solução a 0,01% de K^FeíCN)^. 0 pépti do foi eluído em coluna ODS de fase inversa, usando 10% acetonitr_i 1o/H₂0-0,1% TFA, obtendo-se 395 mg (60%) do composto do título.

213

SKB CASE 14420

-52Foi depois purificado por filtração gel por Sephadex¹^ G-15, usan do ácido acético 0,2M como eluente, obtendo-se o pôptido do título com pureza de 95%.

Características Físicas:

F.M.: ^C25^H43^N9°B^S2

P.M.: 661,27

FAB: (M+H)⁺ a 662,3, (M-H)^- a 660,1

AAA: Asp (l,00), Gly (l,03)

Teor de péptidos: 43,7%

Dados da Cromatografia:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_f=0,6 (B:A:W:P, 15:5:10:10), R =0,56 (r)

2. HPLC: Altex UltrasphereODS, 4,5 mm x 25 cm, detecção a 22 0 nm

Isocrática: 10% acetonitrilo/H₂0-0,l% TFA, k‘=4,4

Gradiente: A: acetonitrilo, B: H₂0-0,l% TFA, 1-50% A durante 20 min, k'=6,B

Exemplo 20

Preparação de N°^-Ac-Cicl o(S ,S ) Pen-A rg-Gly-Asp-Cys-NH₂ :

péptido protegido-resina intermediária N°ó-Ac-Pen(4-MBzl) -Arg(Tos)-Gly-Asp(OChx)Cys(SEt)-MBHA foi preparado, separado, ciclizado e isolado do mesmo modo do Exemplo 1, em escala 1,0 mmol.

péptido foi eluído em coluna ODS de fase inversa usando 5% acetonitrilo/H₂0-0,1% TFA, obtendo-se 400 mg (65%) do composto do tí tulo. Foi depois purificado por filtração gel por Sephadex® G-15 usando solução 0,2M de ácido acético, obtendo-se o péptido do títu lo com pureza de 95%.

Características Físicas:

F.M. : ^C22^H37^N9^D8^S2

P.M.: 619,22

FAB: (M+H)⁺ a 620,2, (M-H)~ a 618,9

AAA; Asp (l,00), Gly (1,07), Arg (0,85)

Teor de péptidos: 62,4%

213

SKB CASE 14420

-5 3- <·'

Dados da Cromatografia:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_f=0,61 (B:A:W:P, 15:5:10:10), R_f=0,69

2. HPLC: Altex Ultrasphere® ODS, 4,5 mm x 25 cm, detecção a 220 nm

Isocrática: 3% acetonitrilo/H20-0,1% TFA, k’=8,4

Gradiente: A: acetonitrilo, B: H20-0,l% TFA, 1-50% A durante 20 min, k’=5,8

Exemplo 21

Preparação de N°^-Ac-Cicl o(S ,S ) Cis-D-Arg-Cly-Asp-Ser-Cys-NH2 :

péptido protegido-resina intermédia N°^-A c-Cys (SE t )-D-Arg(Tos)-Gly-Asp(OChx)-Ser(Bzl)-Cys(4-MBzl)-MBHA foi preparado, separado, ciclizado e isolado do mesmo modo do Exemplo 1, em esca la 1,0 mmol. 0 péptido foi eluído da coluna usando 5% acetonitr_i lo/H20-0,l% TFA, obtendo -se 370 mg (55%) do composto do título. Foi depois purificado por filtração gel por Sephadex ® G-15 usan do ácido acético 0,2M como eluente, obtendo-se o péptido do título com pureza de 95%.

Caracteristicas Físicas:

F.M.

P.M.

FAB: AAA : Teor ^C23^H38^N1O°1O^S2

678,22 (M+H)⁺ a 679,2, (M-H)“ a 677,2 Asp (1,00), Gly (l,13), Ser (0,86), de péptidos: 45,5%

Cys (2,02), Arg (l,2l)

Dados da Cromatografia:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_f=0,47 (B:A:W:P, 15:5:10:10), R_f=0,62

2. HPLC: Altex Ultrasphere® ODS, 4,5 mm x 25 cm, detecção a 22 0 nm

Isocrática: 3% acetonitrilo/^0-0,1% TFA, k' = 3,6

Gradiente: A: acetonitrilo, B: H20-Q,l% TFA, 1-50% A durante 20 min, k'=5,3

213

SKB CASE 14420

Exemplo 22

Preparação de N^-Ac-CicloCS,SJCys-Sar-Arg-Gly-Asp-Pen-Nl·^ :

péptido protegido-resina intermediária N°^-Ac-Cys(SEt)-Sar-Arg(Tos)-Gly-Asp(OChx)-Pen(4-MBzl)-MBHA foi preparado, separado, ciclizado e isolado do mesmo modo do Exemplo 1, em escala 1,0 mmol. 0 péptido foi eluldo de uma coluna usando 7% acetonitrilo/H20-0,1% TFA, obtendo-se 600 mg (87%) do composto do titulo. Foi depois purificado por filtração gel por Sephadex® G-15 usando ácido acético 0,2M como eluente, obtendo-se o composto do título com pureza de 95%.

Características Físicas:

P.M.: 690,26

FAB: (M+H)⁺ a 691,2, (M-H)~ a 689

AAA: Asp (l,00), Gly (l,14), Arg (l,04)

Teor de péptidos: 78,B%

Dados da Cromatografia:

1. TLC: (B:A:W:E, l:l:l:l), R_f=0,53 (B:A:W:P, 15:5:10:10), R =0,67

2. HPLC: Altex Ultrasphere ODS, 4,5 mm x 25 cm, detecção a 22 0 nm

Isocrática: 7% acetonitrilo/^0-0,1% TFA, k'=4,2

Gradiente: A: acetonitrilo, B: H20-0,l% TFA, 1-50% A durante 20 min, k'=6,5

Exemplo 23

Preparação de X-Ac-Ciclo(S,S)Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-h^ :

péptido protegido-resina intermediária N^-Ac-Cys(SEt)-Arg(Tos)-G1y-Asp(OChx)-Cys(4-MBzl)-MBHA foi preparado, separado, ciclizado e isolado do mesmo modo do Exemplo 1, em escala 1,0 mmol 0 péptido foi eluído de uma coluna ODS, de fase inversa, usando 3% acetonitril0/H20-0,1% TFA, obtendo-se 280 mg (47%) do composto do titulo. Foi purificado por filtração gel por Sephadex (ÉD G-15 usando ácido acético 0,2M como eluente, obtendo-se o péptido do título de pureza de 95%.

213

SKB CASE 14420

-55Dados da Cromatografia:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_f=0,49 (B:A:W:P, 15:5:10:10), R_f=0,45

2. HPLC: Altex Ultrasphere ® ODS, 4,5 mm x 25 cm, detecção a 220 nm

Isocrática: 3% acetonitrilo/H₂0-0,l% TFA, k’=2,7

Gradiente: A: acetonitrilo, B: H₂0-0,l% TFA, 1-50% A durante 20 min, k'=5,0

Exemplo 24

Preparação de Ν°^-Αc-Ciclo(S ,S) Cys-(E t₂)Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂ :

péptido protegido-resina intermediária N^-Ac-Cys(Et)-(Et₂)Arg-Gly-Asp(0Chx)-Pen-MBHA foi preparado, separado, ciclizja do e isolado do mesmo modo do Exemplo 1, em escala 1,0 mmol. 0 péptido foi eluldo da coluna usando 9% acetonitrilo/H₂0-0,1% TFA, obtendo-se 590 mg (87%) do péptido do título. Foi purificado por filtração gel por Sephadex ® G-15 usando ácido acético 0,2M como eluente, obtendo-se o péptido do título com pureza de 95%. Características Físicas:

F.M.: C₂₆H₄₅N₉0₈S₂

P.M.: 675,82

FAB: (M+H)⁺ a 676,4

AAA: Asp (l,00), Gly (l,12)

Teor de pôptidos: 51,77%

Dados da Cromatografia:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_f=0,45 (B:A:W:P, 15:5:10:10), R_f=0,64

2. HPLC: Altex Ultrasphere ® ODS, 4,6 mm x 25 cm, detecção a 22 0 nm

Isocrática: 9% acetonitrilo/H₂0-0,1% TFA, k’=3,2

Gradiente: A: acetonitrilo, B: H₂0-0,l% TFA, 5-50% A durante 20 min, k’=4,2.

213

SKB CASE 14420

«.•«i

-56Exemplo 25

Preparação de N^-Ac-CicloíS,S)Cys-D-MeArg-Gly-Asp-Pen-Nl·^ ί péptido protegido-resina intermediária N°^-Ac-Cys(SEt)-D-MeArg(Tos)-Gly-Asp(OChx)-Pen-MBHA foi preparado, separado, ciclizado e isolado do mesmo modo do Exemplo 1, em escala 1,0 mmol. Boc-D-MeArg(Tos) foi preparado do mesmo modo que o isómero L como foi descrito na patente americana 4 6S7 75Θ. 0 péptido foi eluído da coluna usando 7$ acetonitrilo/H^0-0,1$ ΤΓΑ, obtendo-se 450 mg (71 $) do péptido do título. Foi depois purificado por fiX tração-gel por Sephadex® G-15 usando ácido acético 0,2M como eluente, obtendo-se o péptido do título.

Exemplo 26

Preparação de N^oi-Ac-N'^>i-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂ péptido protegido-resina intermediária N^-Ac-MeArgÍTos) -Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-BHA foi preparado pelo método da fase sólida, em escala 0,5 mmol, como se descreveu no Exemplo 1. Depois da separação com HF e da lavagem com éter anidro, o péptido foi extraído com ácido acético glacial e liofilizado, obtendo-se 75,8 mg (31 $). Foi purificado por filtração-gel com Sephadex CD G-15 usando ácido acético 0,2M como eluente. 0 composto do título foi eluído em 3 fracções, obtendo-se 60,6 mg com pureza >96$. Características Físicas:

P.M.: 488,501

FAB: (M+H)⁺ a 489,5

AAA: Asp (l,00), Ser (0,48), Gly (l,09)

Dados da Cromatoqrafia:

TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_f=0,25 (B:A:W:P, 15:5:10:10), R_f=0,31

Exemplo 27

Preparação de N^-Ac-Arg-Gly-Asp-Ser-NH₂ péptido protegido-resina intermediária N -Ac-Arg(Tos)69 213

SKB CASE 14420

-G1y-Asp(OBzl)-BHA foi preparado, separado e isolado do mesmo modo do Exemplo 26, em escala 0,5 mmol. 0 péptido foi purificado por Distribuição em Contra-Corrente (CCD) usando B:A:W, 4:1:5.

240 transferências deram 80,8 mg em quatro fracções.

Caracteristicas Físicas:

F.M. : ^Ci7^H3O^Ng°0

P.M.: 474,474

FAB: (M+H)⁺ a 475

AAA: Asp (0,99), Ser (0,24), Cly (l,03), Arg (l,00)

Dados da Cromatoqrafia:

TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R =0,2 (B:A:W:P, 15:5:10:10), R„=0,49

Exemplo 28

Preparação de N^-Ac-Arg-Gly-Asp-Tyr-Nl·^ péptido protegido-resina intermediária f/^-Ac-ArgíTos )-Gly-Asp(OBzl)-Tyr(BrZ)-BHA foi preparado, separado e isolado do mesmo modo do Exemplo 27, em escala 0,5 mmol. 0 péptido foi puri ficado por filtração-gel com Sephadex ® G-15 usando ácido acético 0,2M como eluente. 0btiverara-se 142,1 mg do péptido do título. Caracteristicas Físicas:

P.M.: 550,57

FAB: (M+H)⁺ a 551

AAA: Asp (l,00), Gly (l,02), Tyr (l,00), Arg (0,90)

Dados da Cromatoqrafia:

TLC (B:A:W:E, 1:1:1:1), R =0,41 (B:A:W:P, 15:5:10:10), R =0,4

Exemplo 29

Preparação de N^-Ac-Arg-Gly-Asp-NH₂ péptido protegido-resina intermediária N^o<-Ac-Arg(N0₂ )-Gly -Asp(OBzl)-BHA foi preparado, separado e isolado do mesmo modo do Exemplo 27, em escala 0,5 mmol. Foi purificado por CCD usando

213

SKB CASE 14420

d.

-5B<r

B:A:W, 4:1:5, obtendo-se 98,6 mg em quatro fracções. 0 péptido foi depois purificado por filtração-gel com Sephadex® G-15 usan do ácido acético 0,2M como eluente, obtendo-se 65,7 mg em várias fracções.

Características Fisicas:

P.M.: 387,3B9

FAB: (M+H)⁺ a 388

AAA: Asp (l,00), Gly (l,13), Arg (0,93)

Dados da Cromatografia:

TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_f=0,2 (B:A:W:P, 15:5:10:10), R_f=0,44

Exemplo 30

Preparação de N^-Ac-Arg-Gly-Asp-D-Ser-Nh^ péptido protegido-resina intermediária N^-Ac-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-D-Ser(Bzl)-BHA foi preparado, separado e isolado do mesmo modo do Exemplo 27, em escala 1,0 mmol. Foi purificado por cromatografia flash usando uma coluna ODS de fase inversa, de pressão média, eluída com 0,5% acetonitrilo/l·^0-0,1% TFA. Obti veram-se 337 mg do péptido do título com pureza de 95%. Características Físicas:

F.M.: ^ci7^H30^N8°8

P.M. : 474,474

FAB: (M+H)⁺ 475,3; (Μ-H)^- 473,5

AAA: Asp (l,00), Ser (0,99), Gly (0,96), Arg (l,0l)

Teor de pêptidos: 44,8%

Dados da Cromatografia:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_f=0,3

2. HPLC: coluna Vydac 218 TP ODS, 4,6 mm x 25 cm, detecção a 22 0 nm

Gradiente: A: acetonitrilo, B: H₂0-0,l% TFA, 0-50% A durante 30 min, k’ = 3,4

tf 213

SKB CASE 14420 f

-59Exemplo 31

Preparação de N^-Ac-Arg-Cly-Asp-Val-Nl·^ péptido protegido-resina intermediária N°9.Ac-A rg (T os ) -Gly-Asp(OBzl)-Val-MBHA foi preparado, separado e isolado de modo semelhante ao do Exemplo 27, em escala 1,0 mmol. Foi purificado por cromatografia flash usando uma coluna ODS de fase inversa, de pressão média, elulda com 15% metanol/H^0-0,1% TFA. Obtiverani -se 125 mg do péptido do título com pureza >95%.

Características Físicas:

P.M.: 486,52B

FAB: (M+H)⁺ 487,3; (Μ-H) 4B5,9

AAA: Asp (l,00), Cly (0,99), Vai (l,06), Arg (0,96)

Teor de péptidos: 79,6%

Dados da Cromatografia:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_f=0,43 (B:W:IP:CA, 6,5:2:1,5:0,3), R_f=0,ll

2. HPLC: coluna Vydac 218 TP ODS, 4,6 mm x 25 cm, detecção a 220 nm

Isocrática: 5% acetonitrilo/H^0-0,1% TFA, k'=l,3

Gradiente: A: acetonitrilo, B: 1^0-0,1% TFA, 6-50% A durante 15 min, k'=0,84

Exemplo 32

Preparação de N^-Ac-Arg-Gly-Asp-Nal-Nl·^ péptido protegido-resina intermediária N -Ac-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Nal-MBHA foi preparado, separado e isolado do mesmo modo do Exemplo 27, em escala 1,0 mmol. Foi purificado por cromatografia usando uma coluna ODS de fase inversa, de pressão média, eluída com 40% metanol/l^0-0,1% TFA. Obtiveram-se 57 mg do péptido do título com pureza >98%.

213

SKB CASE 14420

Características Físicas:

F.M.: ^C27^H36^NB°7

P.M. : 584,632

FAB: (M+H) ⁺ 585,3; (Μ-H) 583,9

AAA: Asp (l,00), Gly (0,99), Arg e Nal presentes mas co-eludem

Teor de péptidos: 81,3$

Dados da Cromatografia:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_f=0,60 (B:W:IP:CA, 6,5:2:1,5:0,3), R_f=0,23

2. HPLC: coluna l/ydac 218 TP ODS, 4,6 mm x 25 cm, detecção a 22 0 nm

Isocrática: 18$ acetonitrilo/H₂0-0,1 TFA, k'=l,2

Gradiente: A: acetonitrilo, B: H₂0-0,l$ TFA, 15-50$ A durante 15 min, k’=2,l

Substituindo Boc-Nal por Boc-(Me)Thr neste processo obtém -se N°^L-Ac-Arg-Gly-Asp-(Me)Thr-NH₂.

Substituindo Boc-Nal por Boc-Nva neste processo, obtém-se N^-Ac-A rg-Gly-Asp-Nva-NH₂.

Substituindo Boc-Nal por Boc-Nle neste processo, obtém-se N^-Ac-Arg-Gl y-Asp-Nle-NH₂.

Exemplo 33

Preparação de N^ol'-Ac-Arg-Arg-Gly-Asp-Phe-NH₂ péptido protegido-resina intermediária N°^Ac-Arg(Tos)-Arg(Tos)-Gly-Asp(OChx)9Phe-BHA foi preparado, separado e isolado do mesmo modo do Exemplo 27, em escala 1,0 mmol. Purificou-se por cromatografia flash usando uma coluna ODS, de fase inversa, de pressão média, eluída com 8$ acetonitrilo/H₂0-0,1$ TFA. 0btiv.e ram-se 303,4 mg do péptido do título com pureza de 98$.

Características Físicas:

P.M.: 690,356

FAB: (M+H)⁺ 691; (M-H)~ 690

AAA: Asp (l,00), Gly (l,00), Phe (0,9l), Arg (l,B9)

213

SKB CASE 14420

Teor de péptidos: 56,3%

Dados da Cromatografia:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_f=0,4 (B:A:W:P, 15:3:8:10), R_f=0,4

2. HPLC: Ultrasphere® ODS, 4,6 mm x 25 cm, detecção a 220 nm

Isocrática: 10% acetonitrilo/H₂0-0,1% TFA, k'=2,7B

Gradiente: A: acetonitrilo, B: H₂0-0,l% TFA, 10-50% A durante 20 min, k’=2,B

Substituindo Boc-Arg(Tos) por Boc-HArg(Tos) no quinto resíduo adicionado e Boc-Phe por Boc-(4'-Mo)Phe no quinto resíduo nas sequências de síntese acima mencionadas, obtém-se N^-Ac-HArg-A rg-Gly-Asp-(4’-Me)Phe-NH₂.

Substituindo por Boc-(Et₂)Arg no quinto resíduo adicionado à resina e substituindo Boc-Phe por Boc-His(Tos) no primeiro resíduo na sequência de síntese acima, obtém-se N°ⁱ-Ac-(Et2)^ftrg-Arg-Gly-Asp-His-NH₂.

Substituindo Boc-Arg(Tos) por Boc-Ala no quinto resíduo adicionado e Boc-Phe por Boc-Ile no primeiro resíduo na sequência de síntese acima, obtém-se N -Ac-Ala-Arg-Gly-Asp-Ile-NH₂.

Exemplo 34

Preparação de N^-Ac-Arg-Gly-Asp-NH-CH^CH^CgH,.

a) Preparação de Boc-Asp(OBzl)-NH-(CH₂)₂CgH^

A uma solução agitada de Boc-Asp(OBzl), 5,0 g (15,5 mmol) e N-metilmorfolina (15,5 mmol) em 50 ml de THF seco em atmosfera de Ar, juntou-se isobutilcloroformiato (15,5 mmol) a -152C. Após alguns minutos, juntou-se fenetilamina 2,0 ml (15,5 mmol) em 15 ml de THF seco. Manteve-se a mistura a -152C durante 15 min e deixou-se aquecer até temperatura ambiente. Depois de agitar por mais 2 horas, filtrou-se a mistura reaccional e concentrou-se o filtrado no vácuo, à secura. 0 resíduo resultante foi dissolvido em acetato de etilo (100 ml) e lavado sucessivamente com HC1 1 M (2x50 ml), água (50 ml), carbonato de sódio a 10% (2x50 ml) e sal. moura (50 ml). Secou-se a matéria orgânica sobre sulfato de sódio,

213

SKB CASE 14420

filtrou-se e concentrou-se, obtendo-se 5,59 g (85/) de uma substância sólida, amorfa, branca.

b) Preparação de Boc-Gly-Asp(OBzl)-NH-(CH^)2^^ grupo protector Boc- do composto do Exemplo 12 (a) (4,18 g; 12,8 mmol) foi removido por tratamento com TFA anidro (10 ml/g) à temperatura ambiente durante 30 minutos. Removeu-se o TFA no vácuo e o TFA residual foi determinado por pesagem. Ligou-se Boc-Gly (2,24 g; 12,8 mmol) à amina livre usando o método de 12 (a). Purificou-se por cromatografia usando uma coluna de sílica, elulda com uma mistura 3:1 de acetato de etilo/hexano, obtendo-se 3,35 g (54%) duma substância vítrea amarelo-clara.

c) Preparação de Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp(0Bzl)-NH-(CH2)2C₆H,0 grupo protector Boc do composto do Exemplo 12 (b) (2,61 gj 6,B mmol) foi removido e o dipéptido resultante foi ligado a Boc-Arg(Tos) (3,4 g; 6,8 mmol) pelo método do Exemplo 12 (b). Pu. rificou-se por cromatografia flash usando uma coluna de sílica, elulda com uma mistura 1:1 de acetato de etilo/isopropanol, obte_n do-se 3,41 g (63%) de uma substância vítrea branca.

d) Preparação de Ac-A rg(Tos )-G1 y-Asp ( OBzl) NH-( )2^ composto do Exemplo 12 (c) foi desprotegido como se des. creveu no Exemplo 12 (b). A base livre (2,92 g; 4,2 mmol) e ani drido acético (2,0 ml; 21,2 mmol) foram dissolvidos em 30 ml de DMF e tratados com diisopropiletilamina (0,73 ml; 4,2 mmol). Agi tou-se a mistura reaccional durante 30 minutos e concentrou-se à secura no vácuo. Purificou-se este resíduo por cromatografia flash usando uma coluna de sílica eluída com uma mistura 1:1 de acetato de etilo/isopropanol, obtendo-se 2,94 g (95%) de uma subs. tância vítrea branca.

e) Preparação de Ac-Arg-Gly-Asp-NH-(CH ) C H_c péptido protegido do Exemplo 12 (d) (2,5 g) e anisol (2,5 ml) foram tratados com HF anidro (25 ml) a 02C durante 30 min. Após evaporação do HF, a mistura péptido/anisol foi tratada com ácido acético 1 M (3x50 ml) e a parte aquosa foi lavada com

213

SKB CASE 14420

-63«jr éter anidro (3x100 ml). 0 extracto aquoso foi liofilizado obtendo-se 1,52 g. Purificou-se por cromatografia flash usando uma coluna ODS eluida com 40% metanol/h^0-0,1% TFA. Obtiveram-se 326 mg do péptido do título com pureza de 97%.

Características Físicas:

F.M.: ^C22^H33^N7°6

P.M.: 491,57

FAB: (M+H)⁺ 492,1; (M-H)“ 490,6

AAA: Asp (0,5l), Gly (0,99), Arg (l,00)

Teor de péptidos: Bl, 2%

Dados da Cromatografia:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_f=0,58 (B:W:IP:CA, 6,5:2:1,5:0,3), R_f=0,17

2. HPLC: coluna Vydac 218 TP ODS, 4,6 mm x 25 cm, detecção a 22 D nm

Isocrática: 12% acetonitrilo/H₂0-0,l% TFA, k'=2,3

Gradiente: A: acetonitrilo, B: H₂0-0,l% TFA, 10-50% A durante 15 min, k'=2,2

Usando o mesmo processo mas substituindo a fenetilamina por anilina obtém-se (Z-Ac-Arg-Gly-Asp-NHC H .

o P

Exemplo 35

Preparação de N^oL-flc-MeArg-Gly-Asp-Phe-NH₂ péptido protegido-resina intermédia tZ-Ac-MeArg(Tos)-Gly-Asp-Phe-BHA foi preparado, separado da resina, isolado e purificado do mesmo modo do Exemplo 26 obtendo-se o péptido do titu lo.

Características Físicas:

F._M.: ε_2ΛΛ0₇

P.M.: 548,270

FAB: (M+H)⁺ 549,2, (M-H)“ 547,B

AAA: Asp (1,00), Gly (l,00), Phe (l,05), MeArg (l,18)

213

SKB CASE 14420

-64/ '

Dados da Cromatoqrafia:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_f=0,52 (B:A:W:P, 15:3:8:10), R_f=0,46

2. HPLC: Ultrasphere® ODS, 4,6 mm x 25 cm, detecção a 220 nm

Isocrática: 10% acetonitrilo/H₂0-0,1% TFA, k'=3,43

Gradiente: A: acetonitrilo, B: H₂0-0,l% TFA, 10-50% A durante 20 min, k’=3,6

Exemplo 36

Preparação de N°^-Ac-HArg-Gly-Asp-Ser-NH₂ péptido protegido-resina intermediária N^-Ac-LysíClz)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-BHA foi preparado, separado da resina e isolado do mesmo modo do Exemplo 26, obtendo-se N^-Ac-Lys-Gly-Asp-Ser-NH₂. A uma solução do péptido (100 mg; 0,197 mmol) dissolvido em 2 ml de tampão de carbonato (pH=10,5), juntou-se uma solu ção de sulfato ácido de 0-metilisoureia (0,34 g; 1,97 mmol) dissol. uido em NaOH 0,1 M (l ml, ajustado até pH 11 com NaOH 4 M). Depois de repousar durante a noite à temperatura ambiente, a mistura reagente foi cromatografada por duas vezes (Sephadex® G-10, intumescida em H₂0, elulda com ácido acético aquoso 0,1 M) e o péptido purificado foi liofilizado, obtendo-se 48 mg do péptido do titulo.

Caracteristicas Físicas:

F.M. : ^Ci8^H32^N8°8

P.M.: 488,50

FAB: (M+H)⁺ 489,2, (Μ-H)^- 487,7

AAA: Asp (l,00), Ser (0,97), Gly (0,99), Cys (0,2l), HArg (0,88)

Dados da Cromatoqrafia:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_f=0,33 (B:W:IP:CA, 6,5:2:1,5:0,3), R_f=0,04

2. HPLC: Altex Ultrasphere ® ODS, 4,5 mm x 25 cm, detecção a 22 0 nm

Isocrática: 3% acetonitrilo/H₂0-0,1% TFA, k'=0,8

Gradiente: A: acetonitrilo, B: H₂0-0,l% TFA, 0-50% A durante 15 min, k'=2,l

213

SKB CASE 14420

Exemplo 37

Preparação de N°^-MeA rg-Gly-Asp-Ξ er-NH₂ péptido protegido-resina intermediária MeArg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-BHA foi preparado e separado da resina do mes mo modo do Exemplo 26, omitindo o passo da acetilação. 0 péptido liure foi purificado do mesmo modo do Exemplo 26, obtendo-se o péptido do titulo.

Características Físicas:

F.M.: C₁₆H_3ON₀O₇

P.M.: 446,22

FAB: (M+H)⁺ 447,2, (M-H) 445,6

AAA: Asp (l,00), Ser (0,95), Gly (l,00), MeArg (l,00)

Teor de péptidos: 76,74%

Dados da Cromatografia:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_f=0,26 (BjA:W:P, 15:5:10:10), R_f=0,31

2. HPLC: UItrasphereODS, 4,6 mm x 25 cm, detecção a 220 nm

Isocrática: H₂0-0,l% TFA, k’=0,66

Gradiente: A: acetonitrilo, B: H₂0-0,l% TFA, 0-50% A durante 20 min, k'=0,64

Exemplo 38

Preparação de l\f^5<'-Formil-MeArg-Gly-Asp-5er-NH₂ péptido protegido intermediário MeArg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Nzl)-BHA foi preparado do modo usual, em escala 0,5 mmol. D_e pois de desproteger o grupo terminal amino com HF, o péptido fix_a do na resina foi tratado com uma mistura de anidrido acético (l ml) em ácido fórmico (98%, 7 ml). A subsequente separação da resina produziu o péptido do título.

Características Físicas:

F.M.: ^ci7^H30^N8°B

P.M.: 474,219

AAA: Asp (1,00), Ser (0,97), Gly (θ,9θ)

213

SKB CASE 14420 ff -66Teor de péptidos: 78,15%

Dados da Cromatoqrafia:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1) R_f=0,37 (B:A:W:P, 15:5:10:10) R_f0,34

2. HPLC: Ultrasphere® ODS, 4,6 mm x 25 cm, detecçSo a 220 nm

Isocrática: 1% acetonitrilo/H^0-0,1% TFA k’=2,02 - 2,69 (isómero cis/trans de N-formilo) Gradiente: A: acetonitrilo, B: H₂0-0,l% TFA, 0-50% A durante 20 min, k'=2,17

Exemplo 39

PreparaçSo de Gly-MeArg-Cly-Asp-Ser-NH₂ péptido protegido-resina intermediária Boc-Gly-MeArg(Tos) -Asp(OChx)-Ser(Bzl)-BHA foi preparado e separado da resina como no Exemplo 26. 0 péptido livre foi purificado por cromatografia flash usando uma coluna ODS, de fase inversa, de pressSo média, elulda com 1% acetonitrilo/H₂0-0,1% TFA. Obtiveram-se 406 mg (BO/c) em quatro fracções, com pureza >95%.

Características Físicas:

F.M.: ^ciq^H33^N9°q

P.M.: 503,245

FAB: (M+H)⁺ 504, (M-H)~ 502

AAA: Asp (l,00), Ser (0,94), Gly (l,96), N-MeArg (0,98)

Teor de péptidos: 69,97%

Dados da Cromatoqrafia:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R =0,29 (r)

2. HPLC: Altex Ultrasphere ODS, 4,5 mm x 25 cm, detecçSo a 220 nm

Isocrática: 1% acetonitrilo/H₂0-0,1% TFA, k'=l,07

Gradiente: A: acetonitrilo, B: H₂Q-Q,1% TFA, 0-50% A durante 20 min, k'=2,35

Exemplo 40

PreparaçSo de Ala-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂

213

SKB CASE 14420 Z* / ··__—··

C·’

-67 ' péptido protegido-resina intermediária Ala-MeArg(Tos)-G1y-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-BHA foi preparado como no Exemplo 26, omi tindo o passo da acetilação. 0 péptido linear foi separado da rg sina com HF, do modo usual, obtendo-se o composto do titulo.

Exemplo 41

Preparação de N -Ac-Ala-Arg-Gly-Asp-OCH^

Liga-se Boc-Asp-OMe a uma clorometil-resina, usando o método do sal de césio, para obter Boc-Asp(0-benzil-resina)-0Me onde o ácido aspártico está ligado à resina pelo grupo carboxilo da cadeia lateral. Dissolvem-se em dimetilformamida 3 equivalentes de cada aminoácido protegido (Boc-Gly, Boc-Arg(Tos) e Boc-Ala) e ligam-se em sequência usando quantidades equimolares de diciclo-hexilcarbodiimida e 1-hidroxibenzotriazolo. Determina-se a extensão da ligação por análise qualitativa de ninidrina de uma al_í quota e repetem-se as ligações quando necessário. Os grupos Boc são retirados por tratamento com uma mistura 1:1 de ácido triflug roacético/cloreto de metileno e, após lavagem com cloreto de meti, leno, obtém-se a amina livre usando 5% diisopropiletilamina/clorg to de metileno. Depois da ligação final e remoção do grupo Boc, o péptido/resina é lavado com dimetilformamida e cloreto de metileno e seco. Acetila-se o péptido usando uma mistura de anidrido acético (10 eq) e diisopropiletilamina (lD eq). Desprotege-se o péptido e separa-se da resina por tratamento com HF na presença de anisol a Da durante 1 h. 0 HF é removido por evaporação a DS, o resíduo é lavado com éter dietílico (4x, deitar fora) e purificado por HPLC de fase inversa, para se obter o composto do título

Exemplo 42

Preparação de de N -Ac-Ciclo(S,S)Cys-Abu-Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂ péptido protegido-resina intermediária N -Ac-Cys(SEt)-Abu-Arg(Tos)-G1y-Asp(OBzl)-Pen(4-MBzl)-MBHA é preparado, separado, ciclizado e isolado como no Exemplo 3. Purifica-se o péptido por cromatografia flash usando uma coluna ODS de fase inversa e média pressão, obtendo-se o composto do título.

213

SKB CASE 14420

Substituindo Boc-Abu por Boc-(Et₂)Arg como quinto resíduo na sequência de síntese acima, obtém-se N -Ac-Ciclo(S,S)Cys-(E t^)A rg-A rg-Gly-Asp-Pen-NHz.

Substituindo Boc-Abu por Boc-(oZ-Me)Ala como quinto resíduo na sequência de síntese acima, obtém-se N^-Ac-CiclofSjSjCys-(ti-Me)Ala-Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂.

Exemplo 43

Preparação de N^-Ac-CicloíS,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Cys-OCH^

a) Preparação de H₂N-Asp(O-benzil-resina)-Cys(4-MeBzl)-0CH^

Liga-se H₂N-Cys(4-MBzl)-OMe a 3 equivalentes de Fmoc-Asp(4-tBuO) em DMF usando 3 equivalentes de 1-HOBT e 3 equivalentes de diciclo-hexilcarbodiimida. Após 3 h, evaporou-se a DMF no vácuo, triturou-se o resíduo em acetato de etilo e filtrou-se. Lavou-se o filtrado com bicarbonato de sódio aquoso a 5% e com água Secou-se a camada orgânica sobre sulfato de magnésio, filtrou-se e removeu-se o solvente no vácuo. 0 dipéptido protegido foi depois purificado por cromatografia em sílica gel.

Tratou-se Fmoc-Asp(4-tBuO)-Cys(4-MBzl)-OMe com 50% TFA/ /cloreto de metileno a 00 durante lhe evaporou-se o solvente no vácuo. Re-dissolveu-se o resíduo em cloreto de metileno, lavou-se três vezes com água e secou-se rapidamente a camada orgânica sobre Mg50 . Por filtração e evaporação do solvente obteve-se Fmoc-Asp-Cys(4-HBzl)-OMe.

ácido carboxílico livre do dipéptido foi ligado à cloro metil-resina usando o método do sal de césio, como foi estabeleci do por Gisin et al. , Helv. Chim. Acta, 56, 1476 (1973). 0 dipépt.

do fixado na resina foi tratado com piperidina a 20% em DMF (3x10 min). Levou-se a resina três vezes com DMF, obtendo-se o dipépti do fixado em resina, do título.

b) Preparação de N^-Acetil-Ciclo(Ξ,S)Cys-MeArg-Cly-Asp-Cys-OCH^ dipéptido fixado em resina obtido no Exemplo 43 (a) foi ligado em sequência a Boc-Gly, Boc-MeArg(Tos) e Boc-Cys(SEt), ace tilado, separado da resina e ciclizado usando o processo do Exem69 213

SKB CASE 14420

Z

pio 1. o péptido do título foi purificado usando HPLC de fase i_n versa.

Utilizando um processo idêntico, excepto por começar com H₂N-Cys(4-Mzl )-OEt e substituindo por (<X.-Me)HArg(Tos) na sequência de síntese acima, obtém-se N°ⁱ'-Acetil-Ciclo(S,S)Cys-(oL-Me)HArg-Gly-Asp-Cys-OEt.

Exemplo 44

Preparação de N°*~-Acetil-Ciclo(S ,S ) Cys-MeA rg-Gly-Asp-Cys-NHE t

a) Preparação de H^N-Cys(4-MBzl)-NHEt

Dissolve-se Bos-Cys(4-MBzl)-OCH^ em metanol, arrefece-se até 03 e junta-se 1 volume de etilamina (pre-arrefecida a Os). A mistura reaccional é encerrada de modo estanque e agitada à temp.e ratura ambiente durante 8 dias. A mistura reagente é re-arrefec_i da até 103C, ventilada e o solvente é removido no vácuo. Dissolve-se o resíduo em cloreto de metileno, trata-se com um volume de TFA e agita-se durante 1 h, à temperatura ambiente. A etilamida do título foi purifica por cromatografia em sílica-gel.

Preparação de H₂N-Asp(D-benzil-resina)-Cys(4-MBzl)-NHEt

b) A etilamida do exemplo 44 (a) foi substituída com H₂N-(4-MBzl)Cys-0Me no processo de 21 (a), ligada a Fmoc-Asp(4-tBuO), ligada a uma clorometil-resina e a amina livre é libertada obtendo-se o composto do titulo.

Preparação de N^-Aç-Ciclo(5,S)Cys-MeArq-Gly-Asp-Cys-NHEt

c) 0 dipéptido fixado em resina do Exemplo 44 (b) é ligado em sequência a Boc-Gly, Boc-MeArg(Tos) e Boc-Cys(SEt), acetilado, separado da resina e ciclizado usando o processo do Exemplo 1. 0 pentapéptido do titulo foi purificado por HPLC de fase inversa.

Utilizando o mesmo processo, excepto em substituir a etil amina pela isopropilamina e em começar o processo com Boc-Pen(4-MBzl )-OCHg , obtém-se N^-A c-Ciclo(Ξ , S ) Cys-MeA rg-Gl y-Asp-Pen-nhc₃h_?.

213

SKB CASE 14420

-70- Z'R

Exemplo 45

Substituindo os aminoácidos protegidos apropriados nas s_e quÊncias de síntese acima referidas dos Exemplos 4 ou 11, obtêm-se os seguintes páptidos lineares:

a) iZ-Ac-Pro-Arg-Gly-Asp-Nl·^ ;

b) N^-Ac-MeArg-Gly-Asp-Nle-Nh^ 5

c) N^-Ac-MeArg-Gly-Asp-Met-Nl·^ J

d) N^-Ac-HArg-Gly-Asp-Leu-Nl^ 5

e) N^-Ac-MeArg-Gly-Asp-Trp-NH^í

f) N^-Ac-MeArg-Arg-Gly-Asp-Thr-NHj 5

g) N^oi-Ac-Ala-MeArg-Gly-Asp-(Me)Ser-NH₂;

h) N^-Ac-Arg-(Et₂)Arg-Gly-Asp-Ala-NH₂ ;

i) N°^t-Ac-Abu-MeArg-Gly-Asp-D-Phe-NH₂;

j) N^aL-Ac-MeArg-Gly-Asp-D-(Et)Tyr-NH₂;

k) l\l^oL-Ac-Arg-Gly-Asp-HPhe-NH₂ ; e

l) N^-Ac-MeA rg-Gly-Asp-(Me)Cys-NH₂.

Exemplo 46

Substituindo os aminoácidos protegidos apropriados nas s_e quÊncias de síntese acima referidas, de acordo com o Exemplo 1 ou Exemplo 20, obtêm-se os seguintes péptidos cíclicos:

a) N°ⁱ-Ac-Ciclo(S,S ) -Cys - Me A rg-Gl y-Asp-Cys-NH₂ ;

b) N^-Ac-CicloíSjS)-Cys-HArg-Gly-Asp-Cys-NH₂ ;

c) N“^í-Ac-Ciclo(S,S)-D,L-APmp-Arg-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

d) N^-Ac-CicloíS,5)-Cys-MeArg-Arg-Gly-Asp-Cys-NH₂;

e) N^-Ac-CicloíSjS)-Pen-Pro-A rg-Gly-Asp-Cys-NH₂ ;

f) Ciclo(S,5)-Mpa-Arg-(Et₂)Arg-Gly-Asp-(4'-Cl)Phe-D,L-A Pmp-NH₂;

g) N^t<-Ac-Ciclo(S,S)-Pen-Ala-MeArg-Gly-Asp-Trp-Cys-NH₂ ;

h) N°^L-Ac-Ciclo(S,S)-Cys-HArg-Arg-Gly-Asp-Ala-Cys-NH₂;

i) N^-Ac-Ciclo(S,S)-Cys-MeArg-Gly-Asp-(Me)Thr-Cys-NH₂;

j) N^-Ac-CicloC Ξ,S)-Cys-HArg-Gly-Asp-(Et)Tyr-D,L-APmp-NH₂;

k) N^-Ac-CicloíS,S)-D,L-APmp-Arg-Gly-Asp-Leu-Cys-NH₂J

l) N^-Ac-CicloíS,S)-Cys-Arg-Gly-Asp-His-Pen-NH₂; e

m) Ciclo(S,S)-Mpa-Arg-Gly-Asp-(Me)Ser-Cys-NH₂.

213

SKB CASE 14420 /

Exemplo 47

Preparação de Ciclo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂

Usando o método do Exemplo 14, mas omitindo o passo da acetilaçâo, preparou-se o composto do titulo.

Exemplo 4B

Preparação de N -PhCO-Ciclo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂ composto do Exemplo 47 (0,5 mmol) foi agitado em cloreto de metileno e tratado com trietilamina (l mmol) a 09. Ounta-se cloreto de benzoilo (0,6 mmol) e aqueceu-se a mistura reagente até temperatura ambiente. Após 3 h a mistura reagente foi diluída com água gelada e cloreto de metileno. Separou-se a camada orgânica, lavou-se com água e bicarbonato de sódio a 5% e secou— se sobre MgSO^. Evaporou-se o solvente e cromatografou-se o resíduo em coluna ODS de fase inversa, de pressão média, obtendo-se o composto do título.

Usando o mesmo processo, excepto na substituição do clorjs to de fenilacetilo, obtém-se N -PhCH₂C0-Ciclo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂.

Exemplo 49

Preparação do Ciclo(S,5)Cys-MeArq-Gly-Asp-Pen-OH

Usando o processo de 15 (c), ligou-se Boc-Pen(4-MBzl) a uma hidroximetil-resina (l% de ligações cruzadas, 1 g, 1 mmol) re correndo à 4-pirrolidinopiridina (0,15 g; 1 mmol) e DCC (620 mg, 3 mmol) em cloreto de metileno. Usando o processo do Exemplo 1, ligaram-se Boc-Asp(OBzl), Bos-Gly, Boc-MeArg(Tos) e Boc-Cys(SEt), acetilam-se, tratam-se com HF e ciclizam-se para se obter o composto do título.

Exemplo 50

Usando os métodos de síntese descritos acima em detalhe, obtiveram-se os seguintes compostos:

a) N^-Ac-CicloíS ,S)-Cys-(oL-Et)HArg-Gly-Asp-Cys-NH₂ ;

b) l\l -Ac-Cicl o(S ,S )-Cys-(o4-Bzl) Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂ ;

c) IM -Ac-Ciclo(S,S)-D,L-APmp-MeArg-Gly-Asp-Trp-Cys-NH₂;

213

SKB CASE 14420

-72d) N°^-A c— Ciclo(S,S)-Pen-D-HArg-Gly-Asp-D-Tyr-Cys-NH2Í

e) N^-Ac-CicloíS ,S ) -Pen-D- (<*-E t) A rg-Gl y-Asp-(E t) S er-Cys-Nh^ 5 f ) N^-Ac-CicloCSjS)-Cys-D-MeArg-Gly-Asp-D-Phe-Cys-Nl·^ 5

g) N^-Ac-CicloCS ,S)-Cys-D-(oi-Et)Arg-Arg-Gly-Asp-D-Cys-NH₂ ;

h) Ciclo(S,S)-Mpr-D-(oí-Me)His-Arg-Gly-Asp-Cys-NH2 5

i) Ciclo(S,S)-Pmp-D-Ala-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH2»

j) N°^í'-Ac-Ciclo(S,S)-Pen-(^o4-MB,Et2)Arg-MeArg-Gly-Asp-Cys-NH2;

k) N^oi-HC0-Ciclo(S,S)-Cys-(o4-Me)Ala-Arg-Gly-Asp(Me)Pen-Cys-NH2 5

l) N°ⁱ-Ac-Ciclo(S,S)-Cys-(Me2 )A rg-MeA rg-Gly-Asp-Cys-Nl·^ ;

m) N⁰‘--Ac-Ciclo(S,S)-Cys-(oi-Et)Gly-HArg-Gly-Asp-D-Cys-NH₂ 5

n) N^-Ac-CicloCs ,S )-D-Cys-His-(ot-Me)HArg-Gly-Asp-Cys-NH2 > e

o) N^-Ac-Ciclo(Ξ ,S )-D-Pen-(oó-Me)Abu-Arg-Gly-Asp-D-Pen-NH2 .

Exemplo 51

a) N^-Ac-His-MeArg-Gly-Asp-D-Ala-Nl·^ 5

b) N^-Ac-Í Me₂)Arg-Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Nh^ J

c) N^-Ac-(°4-Me, Me₂ ) A rg-Gl y-Asp-Nal-Nh^ »

d) N^oi-Ac-(°i-Me)HArg-Gly-Asp-(Et)Pen-NH2 j

e) N^-Ac-(“!—Bzl) A rg-G1 y-Asp-D-Thr-NH2 5 e

f) N^ot-PhCO-MeArg-Gly-Asp-D-Leu-NH₂ .

Exemplo 52

Composição da Unidade de Dosagem Parentérica

Uma preparação que contém 50 mg do péptido do Exemplo 1 ou 2 sob a forma de pó seco estéril, foi obtida do modo seguinte: dissolveram-se 20 mg de péptido em 15 ml de égua destilada. Filtrou-se a solução em condiçães estéreis para uma ampola de 25 ml, multi-dose e liofilizou-se. 0 pó é reconstituído por adição de 20 ml de 5% de dextrose em água (D5W) para injecção endovenosa ou intramuscular. A dosagem é portanto determinada pelo volume da injecção. Podem ser feitas subsequentes diluiçães por adição de um volume medido desta unidade de dosagem a um outro volume de D5W para injecção ou pode juntar-se uma dose medida a um outro me canismo que forneça a droga, p. ex. uma garrafa ou saco para infu são em gotas, I.V., ou outro sistema de infusão-injecção.

213

SKB CASE 14420 z

-73Exemplo 53

Composição da Unidade de Dosagem Oral

Preparou-se uma cápsula para administração oral por mistij ra e moagem de 50 mg do péptido com 75 mg de lactose e 5 mg de e_s tearato de magnésio. 0 pó resultante foi peneirado e foi encher uma cápsula de gelatina dura.

Exemplo 54

Composição da Unidade de Dosagem Oral

Preparou-se uma pastilha para administração oral, por mi_s tura e granulação de 20 mg de sucrose, 150 mg de sulfato de cálcio di-hidratado e o péptido com uma solução a 10% de gelatina.

0s grânulos húmidos foram peneirados, secos, misturados com 10 mg de amido, 5 mg de talco e 3 mg de ácido esteárico; comprimiu-se depois para se obter a pastilha.

A descrição acima exposta revela completamente como real_i zar e usar este invento. Este invento, contudo, não está limitado aos arranjos precisos aqui descritos e abrange todas as modifi cações dentro do âmbito das reivindicações seguintes.

213

SKB CASE 14420

Claims

1 - Processo de preparação de um composto de fórmula (i): X_(A)_m-B-Gly-Asp-(C)_n-Y (i) onde

A é Arg, HArg, (Me₂)Arg, (Et₂)Arg, Ala, Gly, His, Abu ou um seu derivado substituido emot-R' ou Pro;

B é Arg, HArg, (Me₂)Arg, (Et₂)Arg ou um seu derivado subs. tituído em ol-R ' ;

C é um aminoácido D ou L escolhido entre Tyr, (Alk)Tyr, Phe, (4'W)Phe, HPhe, Phg, Trp, His, Ser, (Alk)Ser, Thr, (Alk)Thr, Cys, (Alk)Cys, Pen, (Alk)Pen, Ala, Vai, Nva, Met, Leu, Ile, Nle ou Nal;

W é halogéneo ou Alk;

Y é NR_xR₂ ou 0R₃;

Rj. e R₂ são cada um, independentemente um do outro, H, Alk ou (CH„) Ph;

2 p

R₃ é Alk, (CH₂)_pPb ou, quandD B for HArg, (Me₂)Arg, (Et₂)Arg, ou um derivado de Arg substituído em^-R', HArg, (Me₂)Arg ou (Et₂)Arg, H;

X é R^R^N;

R^ é H ou Alk;

R₅ é H, Alk, HCO, AlkCQ, PhCH₂ ou Ph(CH₂)_qC0;

R ’ é Alk ou PhCH₂ j q, m e n são 0 ou 1; e p é 0, 1, 2 ou 3;

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável ; processo caracterizado por compreender:

a) a ligação de aminoácidos protegidos de modo a formar um composto adequadamente protegido de fórmula:

69 213

SKB CASE 14420

-75X-(A)^-B-01y-Asp-(C)_n-/~Y_7 onde

X, A, B, C, m e n são definidos como acima; e Γ^γ_7 é uma clorometil-, benzo-hidrilamina ou metilbenzo-hidriamina-resina, ou Y é como acima definido para a fórmula (i);

b) a desprotecção e, se necessário, a clivagem do péptido da resina; e

c) a formação opcional de um seu sal farmaceuticamente aceitável.

2 - Processo de preparação de um composto de fórmula (li): S-Ξ

X-^zl-(A’)m-B^,-G¹y-^Asp-(C')n-^Z2-^Y (H) onde

A’ ó um aminoácido D ou L escolhido entre Arg, HArg, (Me₂)Arg, (Et₂)Arg, Ala, Gly, His, Abu, Lys ou um seu derivado substituído em o<-R ' , ou Pro;

B' é um aminoácido D ou L escolhido entre Arg, HArg, (Me₂)Arg, (Et₂)Arg, Lys ou um seu derivado substituído emoó-R';

C' é um aminoácido D ou L escolhido entre Tyr, (Alk)Tyr, Phe, (4'W)Phe, HPhe, Phg, Trp, His, Ser, (Alk)Ser, Thr, (Alk)Thr, (Alk)Cys, (Alk)Pen, Ala, Uai, Nva, Met, Leu, Ile, Nle ou Nal ou um seu derivado substituído emA-R¹;

W é haiogéneo ou Alk;

Y é NR_xR₂ ou 0R₃;

R^ e R₂ são, independentemente um do outro, H, Alk ou (CH₂)_pPh;

R^ é Alk, (CH₂)_pPh ou, quando B for HArg, (Me₂)Arg, (Et₂)Arg ou um derivado de Arg substituído emoí-R', HArg, (Me₂)Arg ou (Et₂)Arg, H;

X é R₄R₅N ou H;

69 213

SKB CASE 14420

-76R. é H ou Alk ,

R₅ é H, Alk, HCO, AlkCO, PhCH₂ ou Ph(CH₂)_qC0;

R' é Alk ou PhCH₂;

Z^ é um isómero D ou L de Cys, Pen ou APmp;

Z₂ é um isómero D ou L de Cys, Pen ou APmp;

q, m e n são, independentemente uns dos outros, 0 qu 1; e p é 0, 1, 2 ou 3 ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, caracterizado por:

a) i. ciclizar com uma base um composto opcionalmente protegido de fórmula:

1 ?

ST ST ^x-^Zl-(A')m-B'-G¹y-^Asp-(C')n-Z2-2C^YJ^r onde,

X, Z , A', B·, C', Z₂, m e n são definidos como acima para a fórmula (li); e

1 2

T e T são H ou um grupo deslocável;

rv-_7 uma clorometil-, benzo-hidrilamina- qu metilbenzo-hidrilamina-resina ou Y é definido como acima para a fórmula (II), ii. remover quaisquer grupos protectores e, se neces sário, clivar o péptido da resina, e iii. formar, opcionalmente, um seu sal farmaceuticamente aceitável; ou

b) i. ciclizar, por oxidação, um composto opcionalmente protegido de fórmula

SH

X-Z. -(A ' ) -B '-G1 y-Asp-( C ¹ ) -Z„-/~Y_7 1 m n 2

69 213

SKB CASE 14420

-77onde,

X, Z^, A', B', C’, , Y, m e n são definidos como acima para a fórmula (li);

r^J ê uma clorometil-, benzo-hidrilamina- ou metilbenzo-hidrilamina-resina, ou Y é definido como acima para a fórmula (II);

ii. remover quaisquer grupos protectores e, se necessário, clivar o péptido da resina; e iii. formar, opcionalmente, um seu sal farmaceuticamente aceitável.

3 - Processo de acordo com as reivindicaçães 1 ou 2, caracterizado por Y_7 ser uma benzo-hidrilamina- ou metilbenzo-hidrilamina-resina.

4 - Processo de acordo com as reivindicaçães 1 ou 2, carac terizado por os grupos protectores serem removidos pelo HF.

5 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracteriza^ do por compreender a ciclização oxidante e por o oxidante ser um ferricianeto de metal alcalino, oxigénio, iodo ou diiodometano.

6 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizja do por compreender uma ciclização catalisada por base onde um επί 2 12 tre T ou T e H e o outro de T ou T é um grupo alquilo ou aril. -tio.

7 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza do por C ser Ser, (Me)Ser, Thr, Tyr, Phe, Nal ou l/al.

8 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracteriza do por C’ ser Ser, (Me)Ser, Thr, Tyr, Phe ou Nal.

9 - Processo de acordo com qualquer das reivindicaçães 1 a B, caracterizado por A ou A' ser Gly ou Arg.

10 - Processo de acordo com qualquer das reivindicaçães 1 a 9, caracterizado por B' ou B ser HArg ou um derivado de Arg ou de HArg, substituído emoL-R', onde quer m quer n é 0.

11 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracteri69 213

SKB CASE 14420

-78zado por (τι s n serem 0.

12 - Processo de acordo com qualquer das reivindicaçães 1 a 11, caracterizado por B ou B' ser MeArg.

13 - Processo de acordo com a reivindicaç3o 1, caracterizado por o composto preparado ser:

N^-Ac-MeArg-Gly-Asp-Ξer-NH₂;

N°^<-Ac-Arg-Cly-Asp-Ser-NH₂ ;

N^-Ac-Arg-Gly-Asp-Tyr-NH₂ >

N^-Ac-Arg-Gly-Asp-NH₂;

N^-Ac-Arg-Gly-Asp-D-Ser-NH₂ 5

N^-A c-A rg-Gl y-A s p-l/al-NH₂ ;

N^-Ac-Arg-Gly-Asp-Nal-NH₂;

N°ⁱ-Ac-Arg-Arg-Gly-Asp-Phe-NH₂ ;

N^ot-Ac-A_rg-Gly-Asp-NH-CH₂-CH₂-C₆H₅ ;

N^-Ac-MeArg-Gly-Asp-Phe-Nl·^ ;

l\l°^-Ac-HArg-Gly-Asp-Ser-NH₂ ;

N^-Ac-Arg-Gly-Asp-Ser-NHEt;

N°ⁱ-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂ ;

N°^t-Formil-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂ ; ou

Gly-MeArg-Gly-Asp-5er-NH₂;

ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.

14 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por o composto preparado ser:

N'^>i-Ac-Ciclo(S,S)Cys-I^víeArg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂;

N^-A c-Ciclo(S,S)Cys-Arg-Gly-Asp-(D,L)APmp-NH₂;

N^-Ac-CicloCS,S)Cys-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂;

Ciclo(S,S)Mpr-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂;

N°^Z-Ac-Ciclo(S,S)Cys-NeArg-Gly-Asp-Ser-Pen-NH₂;

N^-A c-Ciclo( S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-(l^vle)SBr-Cys-NH₂;

Ciclo(S,S)Mpr-MeArg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂;

N°GAc-Cíc1o(S,S)Cys-MeA rg-Cly-Asp-Cys-NH₂;

Ciclo(S,S)Mp r-MeA rg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N^-Ac-Ciclo(5,S)Cys-A rg-Cly-Asp-Pen-NH₂;

Ac-Ciclo(S,S)Cys-Arg-Gly-Asp-D-Pen-NH₂ ;

69 213

SKB CASE 14420

-79['Á-fic-Cic 1 o(S ,S)Cys-Lys-Gly-Asp-Pen-NH₂ ;

(Z-A c-Ciclo(S,S)Cys-HArg-Gly-Asp-Pen-NH₂5 iZ-Ac-CicloCS,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂ 5

N“%Ac-Ciclo(S,S)Cys-Arg-Gly-Asp-Pen-NHEt;

N‘^í-Ac-Ciclo(S,S)Cys-D-Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N°^Z'-Ac-Ciclo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Tyr-Cys-NH₂;

Z-Ac-CicloíS,S)Pen-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

fZ-Ac-CicloC Ξ,S)Pen-Arg-Gly-Asp-Cys-NH₂;

N°^t-Ac-Ciclo(S,S)Cys-D-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂;

fZ-Ac-Ciclo(S,S)Cys-Sar-Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N°^t-Ac-Ciclo(S,S)Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-NH₂;

iZ-Ac-Ciclo(S,S)Cys-Arg(Et₂)-Cly-Asp-Pen-NH₂; ou (Z-Ac-Ciclo (S , S ) Cys-D-MeA rg-Gly-A sp-P en-NH₂ ;

ou de um seu sal farmaceuticamente aceitável.

15 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza. do por o produto preparado ser

N°^í-Ac-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂.

16 - Processo de acordo com a reivindicação 2, para prepja rar iZ-Ac-CicloíS,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂, caracterizado por compreender:

a) ciclizar com uma base, um composto opcional mente protegido de fórmula

ST

Ac-Cys-MeArg-Cly-Asp-Pen-NH₂ onde T^ e T₂ são H ou um grupo deslocável ; ou

b) ciclizar, de modo oxidante, um composto de fórmula

ΞΗ

69 213

SKB CASE 14420

-80a) ciclizar com uma base um composto opcionalmente prote gido de fórmula

ST

Ac-Cys-S ar-A rg-Gly-A sp-Pen-NH₂ onde

T^ e T₂ são H ou um grupo deslocável ; ou b) ciclizar, de modo oxidante, um composto de fórmula

SH SH

I I

Ac-Cys-Sar-MeArg-Gly-Asp-Pen-Nl·^.

1B - Processo de preparaçSo de uma composição farmacêutica, caracterizado por se associar um composta de fórmula I, como se definiu na reivindicação 1, ou de fórmula II, como se definiu na reivindicação 2, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, com um veículo farmaceuticamente aceitável.

19 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por se associar um composto de fórmula I, como se definiu na reivindicação 1 ou de fórmula II, como se definiu na reivindicação 2, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, com um agente fibrinolítico e um veículo farmaceuticamente aceitável.

20 - Processo de preparação de uma composição farmacêutica, caracterizado por o agente fibrinolítico ser a estreptoquinase, uroquinase, pro-uroquinase ou tPA, ou um seu derivado ou mutante.

21 - Processo de preparação de um composto de fórmula

ST¹ ST² ^X-²1-^(A'^}m”^B'-Giy-Asp-(C·)_n-Z₂-/“^Y_7 onde

X, Z, A', B· , C', Z₂ , m e n são definidos como na reivin69 213

SKB CASE 14420

-81dicação 3; e

1 2

T e T são H ou um grupo deslocável, é uma clorometil-, benzo-hidrilamina- ou metilbenzo-hidrilamina-resina, ou Y é definido como na reivindicação 2, caracterizado por compreender o acoplamento de aminoácidos adequ.a damente protegidas.