HU205368B

HU205368B - Process for producing peptides with antiaggregational effect and pharmaceutical compositions comprising same as active ingredient

Info

Publication number: HU205368B
Application number: HU892203A
Authority: HU
Inventors: Faida El-Fehail Ali; James Martin Samanen; Ronald John Shebuski
Original assignee: Smithkline Beckman Corp
Priority date: 1988-05-09
Filing date: 1989-05-08
Publication date: 1992-04-28
Also published as: EP0341915B1; PT90512A; PT90512B; AU3458889A; KR900018136A; DE68928321D1; EP0341915A3; EP0341915A2; NO891870D0; JPH0262892A; ZW6189A1; ATE158305T1; NO891870L; JP2755351B2; DK222989D0; FI892208A0; US5849690A; DE68928321T2; FI892208A; DK222989A

Description

A találmány tárgya eljárás vérlemez-aggregációt gátló hatású peptidek előállítására, valamint eljárás ezeket a peptideket hatóanyagként tartalmazó gyógyszerkészítmények előállítására. A találmány szerinti eljárással előállított peptidek alkalmazhatók fibrinolitikus ágensekkel együtt.

A koaguláciős folyamat vérrőgkeletkezéssel indul meg. A vérrög egy fibrin polimer hálóba zárt vérlemezek aggregációja. A koaguláciős folyamat rendszerint szövetek sérülésével kezdődik el, és hatására a véredényben lelassul vagy megáll a véráram. Etológiái faktorok is kiválthatnak vérrögképződést, így például olyan faktorok, amelyek nem közvetlen állnak kapcsolatban szövetsérüléssel, így például szepticemia, véredények gyulladása (phlebitis), arterioszklerotikus lerakódások. Néhány esetben a nem megfelelő vérrögképződés, és ennek következtében a véráramlás csökkenése patológiai következményekkel járhat, így például tüdóembólia, szélhődés és szívbetegségek léphetnek fel.

A koaguláció többfaktoros folyamat, amelynek utolsó előtti lépésében proteolitikus enzim, a trombin keletkezik, amely a fibrinogént két specifikus Arg-Gly maradékká hidrolizálja, és így két kisebb fibrino-peptidet, és egy fibrinmonomert alkot. Két komplementáris kötési oldal keletkezik a fibrino-peptidek eltávolításával, és így minden egyes fibrinmonomer két másik monomerhez kapcsolódhat, és így polimer hálózatot alkothat A trombin ugyancsak aktiválja a vérlemezeket is, és ezek a fibrinogénhez és fibrénmonomerekhez kapcsolódhatnak. Ezek a vérlemezkék tovább fokozzák a koaguláciős folyamatot azáltal, hogy egyéb koagulációs aktivátorokat tesznek szabaddá. Mivel a fibrin-poIimerizácró tovább folytatódik, a vérből az aggregátum kicsapódik, és így úgynevezett lágy véralvadék keletkezik. A fibrin stabilizáló faktor (FSF), amely ugyancsak trombin által aktivált enzim, a kovalens keresztkötések kialakulását katalizálja, hogy így létrejöjjön a végleges kemény véralvadék.

A trombus (vérrög) kialakulásában fontos szerep jut a vérlemezeknek. Ebben elsődlegesen közvetítő szerep jut a GPnb-IHa vérlemez-receptor komplexeknek. A von Willebrand-faktor, egy plazmaprotein, és a fibrinogén képes arra, hogy a GBUb-HIa receptorokat a szomszédos vérlemezekkel összekösse és keresztbekapcsolja, és ily módon a vérlemezeket aggregálja. A fibronectin, a vitronectin és a thrombospondin olyan fehérjék, amelyek bizonyítottan képesek a GPIIb-IIIa kötésre. A fibronectin plazmában található, és az intracelluláris mátrixban szerkezeti fehérjeként működik. A szerkezeti fehérjék és a GPIIb-IHa közötti kötés elősegíti, hogy a vérlemezkék a sérült érfalhoz tapadjanak.

A fibronectin és a vitronectin olyan szerkezeti fehérjék csoportjába tartoznak, -amelyek elősegítik a sejtek összekapcsolódását. Az aminosav-szekvencia felderítéséből megállapítható, hogy a sejt összekapcsolódásnál uralkodó szerepe van néhány ilyen proteinnek, főleg a fibronectinnek, és kiderült, hogy az Arg-Gly-Asp (egybettfs aminosav kódja RGD) szekvencia a jellemző szerkezetnek egy része, amely közrehat a kötés kialakításában [lásd Ruoslahti és munkatársai, Science, 238, 491-7 (1987)]. Humán plazma-fibronectinből készített, sejtösszekapcsolódást kiváltó polipeptideket tárgyal a kővetkező irodalom: [Pierschbacher és munkatársai, 4 589 881 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (1986) és Roushlahti és munkatársa, WO 84/00540 (1984)]. Ugyanezeket a szekvenciákat tartalmazó kisebb peptidekből kimutatták, hogy normál patkányok vesesejtjeiben (NRK) elősegítik a sejt tapadását, ha ezen peptidek egy szilárd támasztófelülethez vannak erősítve, és ha oldott formában vannak alkalmazva, akkor gátolják ezeknek a sejteknek a fibronectinhez történő tapadását [lásd Rouslahti és munkatársai, 4 578 079 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (1986) és Rouslahti és munkatársai, 4 614 517 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (1986)].

A vérlemez-aktiválásra azért van szükség, hogy elősegítsék a GPnb-IHa-nak a fibrinogénhez, a fibronectinhez és a von Willebrand-faktorhoz való kötését. Bár a pontos mechanizmus nem ismert, úgy tűnik, hogy az ADP vagy a trombin vérlemez stimuláló hatása a receptorkomplexben változást okoz, és így megkönnyíti a kötés kialakítását. Különböző módszerekkel kimutatták ennek a receptornak a vérlemez-aggregációval összefüggő jelentőségét. így Coller és munkatársa [Blood, 66, 1456-9 (1985)] kimutatták, hogy kutyáknál ADP-vel kiváltott vérlemez-aggregáció gátolható antitesteknek ehhez a komplexhez történő kapcsolásával. Nievelstein és munkatársai [Thromb. and Hemostasis, 58, 2133 (1987)] megállapították, hogy az RGDS-peptidek gátolják a vérlemezkék trombin indukálta aggregációját és adhézióját a fibronectinhez és hatásukat feltehetőleg a GPUb-HIa komplexen keresztül fejtik ki. Zimmerman és munkatársai [4 683 291 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat (1987)] olyan peptideket ismertettek, amelyek Arg-ot és Lys-t, valamint RGD-szekvenciát tartalmaznak, és amelyek gátolják a fibrinogénnek a vérlemezekhez történő kapcsolását, és gátolják a vérlemezek aggregációját.

A legújabb antitrombőzis gyógymód szerint olyan szereket alkalmaznak, amelyek módosítják a vérlemez/endoteliális sejt arachidonát-prosztaglandin rendszert, így a prosztaciklin analógokat, a ciklooxigenáz inhibitorokat, a tromboxán szintézis inhibitorokat, és a tromboxán receptor antagonistákat; és antikoagulánsokat, így a heparint. Ezek a készítmények gátolják a vérlemez-aggregáció két felismerhető fázisából vagy az egyiket vagy mindkettőt. Az első fázisban történik a vérlemezek kezdeti aktiválása, és ebben a fázisban történik a kémiai ingeranyagokra, így az ADP-re, kollagénre, az epinefrinre, a trombinra a válaszreakció. Ezt követi a második fázis, amelyet maguk a vérlemezek indítanak el, és jellemző erre a fázisra, hogy itt zajlik a tromboxán A₂ (TxA₂) szintézis és a vérlemeztároló szemcsékből pótlólagos ADP-felszabadítás. Ezek a közbenső anyagok további vérlemezeket aktiválnak.

A prosztaciklin, melyet prosztaglandin I₂ (PGL)-nek is hívnak, a véredényfal belső felületén lévő endoteliá2

HU 205 368 Β lis sejtek által természetesen termelt anyag. A PGI₂fokozza a vérlemez cAMP-t, amelynek következtében csökken a GPIIb-IHa receptor szabályozása, ily módon gátlódik a fibrinogén közvetítette vérlemez-aggregáció, és az ép véredényekben a vérlemez-aktiválás. A PGI₂ és a stabil PGI₂ analógok gátolják a vérlemezaggregáció mindkét fázisát, azonban ilyen analógok alkalmazása során nemkívánatos változások lépnek fel a vérnyomásban. (See Aiken és munkatársai, Prostaglandins, 19,629-43 (1980).

A ciklooxigenáz a prosztaglandinok, így a PGI₂ és a PGH₂ szintézisében játszik szerepet. A PGH₂ átalakul TxA₂-vé, az átalakításban tromboxán szintetáz játszik szerepet. ATxA₂ nagy hatású vérlemez-aggregáció aktivátor. A ciklooxigenáz inhibitorok és a tromboxán szintetáz inhibitorok blokkolják a TxA₂ termelést, mialatt a TxA₂ antagonisták blokkolják a TxA₂ hatását azáltal, hogy a TxA₂ receptort lekötik. Mindezek a gyógymódok a vérlemez-aktiválásnak csak a második szakaszában jelentkeznek. A ciklooxigenáz inhibitorok további hátránya, hogy a PGI₂ szintézist gátolják, amely kissé gátolja a PGI₂ termelés pozitív antiaggregáló hatását. A ciklooxigenáz inhibitorok alkalmazása ulcerogenesis-szel jár.

A heparin mukopóliszacharid, amely a koagulációs folyamatban megköti a protrombint, valamint néhány egyéb faktort. Hatását úgy fejti ki, hogy meggátolja a fibrinogén és a GPHb-HIa receptor trombin általi aktivizálódását. A heparin a vérlemez-aggregáció első fázisát gátolja és csak kis mértékű hatása van a vérlemezek egyéb úton történő aktiválására, amelyet egyéb anyagok, így kollagén, ADP vagy epinefrin váltanak ki.

Ily módon a ciklooxigenáz inhibitorok, a prosztaglandin analógok és a heparin mind gátolják a vérlemezek aggregációját. A gátlás közvetetten, a vérlemez/fibrinogén aktivizálás első vagy második fázisában jön létre. Ezért szükség van olyan szelektív gyógyászati termékekre, amelyek közvetlenül blokkolják a vérlemez-aggregációt, és ez történhet a vérlemez aktiválásának akár az első, akár a második fázisában.

Újabban elzárt artériák és mélyvénás trombózisok kezelésére olyan fibrinolitikus szereket ajánlanak, amelyek a vérrögöket vagy embóliát lizálják, és így helyreállítják, vagy elősegítik a véráramlást. Fibrinolitikus szerek a proteolitikus enzimek, amelyek a fibrint specifikus helyen hidrolizálják, és így megbontják a fibrinhálót. A fibrinnek kisebb peptidekre történő felbontása révén a véirög vagy az embolus oldhatóságát elősegítjük. A szövet plazminogén aktivátor (tPA), az urokináz (UK) és a pro-urokináz (pUK), amelyek humán eredetűek, és a streptokináz (SK), amely baktériumokból nyerhető ki, a találmány szerinti problémával összefüggésben fontos fibrinolitikus szerek. Ezek in vivő hatása során a vérben a plazminogén proteolitikusan aktiválódik, így plazmin keletkezik, amely az aktuális fibrinolitikus ágens. Ezek közül a tPA és az SK a fibrinolitikus gyógyászatban kereskedelmileg használt anyag. Ezeknél a gyógymódoknál visszatérő probléma, hogy a véredények másodlagos vérrögök képződése folytán ismét elzáródnak.

A fibrinolitikus terápia a legáltalánosabban használt gyógymód a trombózisos véredényekben a véráram visszaállítására. Ezt használják a vénrög feloldására, amely gyakran közvetlen oka az elzáródásnak. A fibrinolitikus gyógymód nem változtatja meg a vérrög keletkezését kiváltó faktorokat. így gyakran antikoagulánsokat, így heparint alkalmaznak, hogy az ismételt elzáródást megakadályozzák. Azok a betegek, akiknek az artériájában sok szűkület található, nagymértékben veszélyeztetettek, és így nagy a valószínűsége, hogy a visszaoldás után ismét trombózis lép fel akkor is, hogyha nagy dózisú heparint használtak [Gold és munkatársai, Circ., 73,347-52 (1986)]. Ezenkívül, az SK és tPA alkalmazása fokozott vérlemez-aggregálhatósággal jár [Ohlstein és munkatársai, Thrómb. Rés., 4, 575-85 (1987)]. Nagy dózisú tPA alkalmazásánál szisztemikus vérzés léphet fel, és így nem ajánlatos ismételt elzáródásnál történő felhasználásra. Ezért szükség van olyan módszerre, amellyel fibrinolitikus gyógymód után megelőzhetjük az ismételt trombózis kialakulását.

Újabban a TxA₂ antagonisták alkalmazása a visszaoldás utáni ismételt elzáródás megakadályozására hatásosnak tűnik, valamint alkalmazható a fibrinolízisnél megkívánt tPA dózis csökkentésére. [Lásd a 917 122 számú függő amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, Yasuda és munkatársai (Clin. Rés., 34,2 (1986)] kimutatták kutyákkal végzett kísérletben, hogy tPA-val végzett trombolízis után a sok fibrint tartalmazó vérlemez trombus által előidézett visszazáródás gátolható, ha murin monoklonális antitest kapcsolódik GPUb-HIa-hoz.

A vérlemez-aggregáció és vérrögkeletkezés gátolható, ha olyan pepiidet vagy polipeptideket alkalmazunk, amelyek a vérlemez GPHb-HIa receptorához kapcsolódnak. Ily módon gátolják az aktivált vérlemezeknek a Wlllebrand-faktorhoz, fibronectinhez és a fibrinogén/fibrinhez történő kapcsolódását. Az antiaggregáció- hatás ilyen módja egyedülálló,'mivel ez nem csupán az aggregációs folyamat egyetlenegy kiváltójának gátlásán alapszik, hanem a végső fázisba is beavatkozik, amely az összes ismert stimuláló anyagra közös. Mivel az egyéb antitrombózis/antikoaguláns módszerek nem analóg anyagokat alkalmaznak, így ezeket a peptideket vagy polipeptideket „antifibrotikum”-nak nevezzük, hogy ezeket mechanikailag és szerkezetileg megkülönböztessük a technika állásából ismertektől.

A találmány tárgya eljárás olyan (I) és (II) általános képletű peptidek vagy ezek gyógyászatilag elfogadható sóinak előállítására, amelyek képletében A jelentése Gly; Alá,

B jelentése Arg, HArg vagy ezeknek α-R’- helyettesített származéka;

C jelentése D vagy L alakú, Tyr, Phe, Ser, Val vagy

Nal; HPhe, Phg, Thr, Alá, Nva, Leu, Ile, Nle,

Y jelentése NRiR₂;

Rí és R₂ jelentése H, C_w alkilcsoport vagy (CH₂)_pPh;

X jelentése R4RJN;

Rt jelentése H vagy C« alkilcsoport;

Rs jelentése H, HCO, Ci_6 alkil-CO; C1-6 alkilcsoport;

HU 205 368 Β

R’jelentése Cm alkilcsoport;

m és n értéke 0 vagy 1; és p értéke 1,2 vagy 3.

A’jelentése Gly, vagy ennek α-R’- helyettesített származéka vagy His,

B’jelentése D vagy L alakú Arg, vagy ezeknek a-R’helyettesített származéka, HArg, (Et₂)Arg, vagy Lys,

C’jelentése Tyr, Trp, Ser, Thr vagy utóbbi kettő aR’-helyettesített származéka;

Y jelentése NRiR₂, vagy ha B jelentése Arg a-R’helyettesített származéka, akkor jelentése OH;

Rí és R₂ jelentése hidrogénatom vagy C;_6 alkilcsoport; X jelentése R4R5N vagy H;

R4jelentése H vagy Ci_e alkilcsoport,

Rj jelentése H, alkil-CO vagy Ph(CH₂)_qCO;

R’jelentése Cu alkilcsoport vagy PhCH₂;

Zi jelentése Cys, Pen vagy APmp; Mpr;

Z₂ jelentése Cys, Pén vagy APmp D- vagy L-izomerje; q, més n egymástól függetlenül 0 vagy 1.

A találmány tárgya továbbá eljárás vérlemez-aggregációt és vérrőgképzést gáltő hatású gyógyszerkészítmények előállítására, amelyek antifibrotikus pepiidet tartalmaznak gyógyászatilag elfogadható vivőanyagokkal összekeverve.

A találmány szerint előállított vegyületek alkalmazhatók emlősöknél vérlemez vagy Yérrögképzés gátlására, ennek során egy (I) vagy (Π) általános képletű antifibrotikus pepiidet hatásos mennyiségben adagolunk.

A találmány szerinti eljárással előállított peptidek, valamint egyéb olyan vegyületek, amelyek hasonló mechanizmussal működnek, hatásosan alkalmazhatók trombolitikius gyógymódnál ismételt trombózis kialakulásának megelőzéséhez. Ennek során az emlősök artériájában vagy vénájában trombolízist követően kialakuló ismételt elzáródás megakadályozására, fibrinolitikus szert és egy antifibrolitikus peptidet hatásos mennyiségben alkalmazunk. Ismert fibrinolitikumokkal, így sztreptokinázzal (SK), urokinázzal (UK), prourokínázzal (pUK) és szövet plazminogén aktivátorral (tPA), valamint ezek variánsaival és mutánsaival kombinálva az előzőekben leüt peptidek hatásosan alkalmazhatók ismételt trombózis kialakulásának gátlására. Továbbá, egyéb peptidek és polipeptidek, amelyek az RGD-szekvenciájú részletet tartalmazzák, a találmány szerinti megoldásban hatásosan alkalmazhatók, így például különösen a von Willebrand-faktor, humán plazma fibrinogén és humán plazma fibronektív bizonyos fragmenseí vagy származékai.

A találmány szerinti eljárás magában foglalja olyan gyógyszerkészítmény előállítási eljárását, amely trombolízisre és ismételt visszaoldásra alkalmazható, és amely emlősök artériájában vagy vénájában gátolja az ismételt elzáródás kialakulását. A készítmény gyógyszergyártásban szokásos vivőanyagokkal együtt fibrinolitikumot és egy antifibrotikum peptidettartalmaz.

Egy trombolitikus gyógymódban alkalmazható kit tartalmaz egy tartóba helyezett fibronilitikumot, és egy másik tartóba helyezett antifibrotikum peptidet.

Az 1. ábrán bemutatjuk az embereken végzett kísérletet, amely szerint az Ac-RGDS-NH₂ peptid in vitro módon hatástalan a tPA kiváltotta vérrög lízisére. A grafikon a 4. órában mért százalékos vérröglízist mutatja a szövet plazminogén aktivátor (tPA) koncentráció növekményének függvényében. A négyzetekkel jeleztük a tPA(MT2N3)-indukálta lízist a kontrollszakaszban (ECjo-3I,5±9,9 gg/ml), és körökkel jeleztük a tPA és 1 mmól/1 Ac-RGDS-NH₂ jelenlétében tapasztalt lízist (ECjo=31,9±8,6 gg/ml).

A 2. ábrán bemutatjuk a vérlemez-aggregáciő in vivő gátlását 1 ml/perc áramlási sebességgel adagolt 400 mmól/1 Ac-RGDS-NH₂ infúziónál. A vérlemezaggregáciőt/vérrögképzést a véráram csökkenése jelzi. A nyilak jelzik az infúzió kezdetét és végét. SL jelzi a vérrög mechanikus előrehaladását Az (a) jelzi a koronaérben a vérnyomást Pa az idő függvényében, amely szerint az Ac-RGDS-NH₂ infúziónak nincs hatása a vérnyomásra. A (b) jelzi a koronaérben a véráram (ml/perc) változását az idő függvényében, amely szerint a peptid infúziója után vérrögképzés gátlódik. A (c) jelzi a fő koronaérben a váráramot (ml/perc) az idő függvényében, amely szerint a peptid infúzió után a vérrögképzés gátlódik.

A 3. ábrán egy koronaér-trombózis modellen végzett vizsgálat eredményét mutatjuk be, amelyben meghatároztuk a dózisnak a vérlemez-aggregációra kifejtett in vivő gátló hatását. A grafikonon az idő függvényében bemutatjuk a fő koronaérben mért véráramot A nyíl jelzi az Ac-RGDS-NH₂ infúzió kezdetét és végét A vérrőgképzést jelzi, hogy a véráram csökken. SL jelzi a vérrög mechanikus előrehaladását, X jelzi a vérrög spontán kirázódását. Az (a) jelzi a vérrögképzés teljes gátlását (0,052 ml/perc infiíziós sebesség 400 mmól/I Ac-RGDS-NH₂). A (b) jelzi a vérrög spontán kirázódásánál tapasztalt mérsékelt gátlást (0,026 ml/perc infúziós sebesség 400 mmól/1 peptid). A (c) jelzi a részleges gátlást, amikor is a vérrög mechanikus eltávolítását igénylő teljes blokkoláshoz szükséges idő elhúzódik (0,013 ml/perc infúziós sebesség, 400 mmól/1 peptid).

Megállapítottuk, hogy bizonyos peptidek gátolják a vérlemezek aggregáciőját. Ezek a peptidek a vérlemezek receptoraival kölcsönhatásba lépnek. A vérlemez ilyen receptora a GPUb-IHa komplex, amely képes arra, hogy nagyszámú endogén szerkezetű proteint, így fibronectint és vitronectint megkössön. így a véredény sérülésénél, szétzúzásánál a lényegében extracelluláris mátrixú szerkezeti fehérjék és a vérlemezek a véredényfalhoz kötődnek, feltehetőleg a GPHb-IIIa receptoron keresztül. Ezenkívül a fibrinogén/fibrin és a von Willebrand-faktor a vérlemez GPUb-IHa receptor komplexszel kölcsönhatásba lép. Hy módon elősegítik a vérlemez aggregációja a GPUb-IHa receptor több vegyértékű kötésével. A vérlemezreceptor és fibrinogén, von Willebrand-faktor és fibronectin közötti adhéziós kölcsönhatások interferenciáját ki lehet váltani, ha ezeknek a proteineknek a kapcsolódási helyét imitáljuk, leutánozzuk. A fibronectin egy aktív fragmensének analízise során kiderült, hogy a fibronectin kapcsolódási helyénél Arg-Gly-Asp (RGD) aminosav-szekvencia

HU 205 368 Β található. Megállapítottuk továbbá, hogy az ezt a szekvenciát tartalmazó peptidek képesek a sejteknek a fibronectinhez történő kapcsolását gátolni, és gátolják a von Willebrand-faktor és fibrinogénnek a vérlemezekhez történő kötését is. így bizonyos proteinek, természetben előforduló polipeptidffagmensek, és ezeknek a fragmenseknek származékai képesek a vérlemezek aggregációját gátolni. Egy monoklonális antitest F(ab’)₂ fragmensei [Coller és munkatársai, Blood, 66, 1456-9 (1985)] és a humán plazma fibronectin peptid fragmensei [Rouslahti és munkatársai, PCT WO 84/00540 (1984) és Pierschbacher és munkatársai, 4 589 881 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom (1986)] képesek a GPIIb-IHa receptorhoz való kötődésre.

A találmány tárgya olyan peptidek előállítása, amelyek a Gly-Asp szekvenciát tartalmazzák, és amelyek képesek a GPIIb-IIIa receptorhoz való kötődésre, és ily módon gátolják a vérlemez-aggregációt. A találmány feladata, hogy az RGD-szekvencia konformációját módosítsuk azáltal, hogy a szomszédos aminosavakat megfelelőképpen megválasztjuk, vagy ezen a szekvencián belül az arginint származékká alakítsuk vagy helyettesítsük azért, hogy a peptideknek a vérlemezekhez történő kapcsolódását megkönnyítsük. A találmány másik feladata a peptid aminotermináljának védelme. Ez történhet acetilezéssel vagy alkilezéssel. További feladat, hogy a karboxilvégcsoportot módosítsuk, vagy amiddá, vagy szubsztituált amlddá vagy észterré. Ezek a módosulatok fokozzák a pepiidnek proteolitikus enzimekkel szembeni stabilitását, és különböznek azoktól a vegyületektől, amelyeket korábban sejtadhézió elősegítésére alkalmaztak [Rouslahti és munkatársai, 4 578 079 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom (1986), és Rouslahti és munkatársai, 4 614 517 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom (1986)] és különböznek azoktól, amelyeket már alkalmaztak vérlemezek aggregációjának gátlására [Zimmerman és munkatársai, 4 683 291 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom (1987)].

A találmány szerinti eljárással előállított peptidek közül némelyik tartalmaz intramolekuláris diszulfidkötést, amely fokozza a peptidek metabolikus stabilitását és biológiai aktivitását. A találmány szerinti eljárással előállíthatjuk az © és (II) általános képletú tri-, tetra-, penta-, hexa- és heptapeptideket. Az © általános képletben

A jelentése Alá, Gly,

B jelentése Arg, HArg, vagy ezeknek α-R’- helyettesített származékai;

C jelentése D vagy L formájú aminosav, így Tyr, Phe,

HPhe, Phg, Ser, Thr, Val, Nva, Leu, Ile, Nle vagy

Nal;

Y jelentése NR1R2 vagy OR3;

Rí és R₂ függetlenül jelenti a hidrogénatomot, Cm Alkot vagy (CH2)pPh-t;

X jelentése R4R5N;

R₄ jelentése H vagy Cm Alk;

Rs jelentése H, Alk, HCO, AlkCO, PhCH₂;

R’jelentése Cm Alk;

m és n értéke 0 vagy 1; és p értéke 1,2 vagy 3, valamint előállítottuk ezeknek győgyászatilag elfogadható sóit.

Előnyösen A jelentése Gly vagy Arg, ha m értéke 1, n értéke 0.

B előnyösen HArg-ot vagy Arg vagy HArg -R’helyettesített származékát jelenti.

B előnyösebben MeArg-ot jelent.

C előnyösen Ser-t, Thr-t, Tyr-t, Phe-t, Val-t vagy Nal-t jelent.

Ha n értéke 1, m előnyösen 0.

A találmány szerinti eljárással előállított (Π) általános képletű penta-, hexa- vagy heptapeptidek képletében

A’jelentése Gly vagy ennek α-R’-helyettesített származéka vagy His,

B’jelentése D- vagy L-aminosav, így Arg, HArg vagy ezeknek α-R’-helyettesített származéka, (Et₂)Arg, vagy Lys, vagy a-benzil-Arg,

C’jelentése Tyr, Trp, Ser, Thr, vagy utóbbi kettő aR’-helyettesített származéka,

Y jelentése NR1R2 vagy OH;

Rí és R₂ függetlenül jelentik a hidrogénatomot, vagy jelenti még a Cm Alk-ot,

X jelentése R+RjN vagy H,

R4 jelentése hidrogénatom vagy Cm Alk,

R5 jelentése hidrogénatom, Cm Alk, HCO, Cm AlkCO, vagy Ph(CH₂)_qCO,

R’ jelentése Cm Alk,

Zi jelentése Cys, Pen Mpr vagy APmp D- vagy L-izomerje,

Z2 jelentése Cys, Pen vagy APmp D- vagy L-izomerje, q, m és n értéke 0 vagy 1.

A találmány tárgyához tartozik ezeknek a vegyületeknek győgyászatilag elfogadható sóinak az előállítása is.

A’ előnyös jelentése Gly, ha m értéke 1, n előnyösen 0-t jelent.

B’ előnyös jelentése HArg vagy Arg vagy HArg -R’-helyettesített származéka. B előnyösen MeArg-ot jelent.

C’ előnyös jelentése Ser, Thr, Tyr. Ha n értéke 1, m előnyösen 0-1 jelent.

Z₂ előnyös jelentése APmp, Cys vagy Pen L-izomerje.

Előnyösen mind m, mind n értéke 0.

A találmány szerinti leírásban megadott képletekben X a peptid aminovégét jelzi, ily módon eltér jelentése a szokásostól. Ha X jelentése hidrogénatom, Zi jelentése dezaminosav. így például ha Zi jelentése Cys és X jelentése hidrogénatom, akkor a maradék egy dezamino-cisztein, amely 3-merkapto-propionsav (Mpa).

A találmány szerinti eljárással a következő specifikus peptideket állíthatjuk elő;

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH2;

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-Arg-Gly-Asp-(D,L)-APmp-NH₂;

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂;

I

HU 205 368 Β

Ciklo(S,S)Mpr-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH2;

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Ser-Pen-NH_Z;

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-(a-Me)Ser-Cys-NH2;

Ciklo(S,S)Mpr-MeArg-GIy-Asp-Ser-Cys-NH₂;

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Cys-NH₂;

Ciklo(S,S)Mpr-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-Arg-Gly-Asp-Pen-NH2·,

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-Arg-Gly-Asp-D-Pen-NH₂;

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-Lys-Gly-Asp-Pen-NH2;

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-HArg-Gly-Asp-Pen-NH2;

N-a-AoCiklo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-Arg-Gly-Asp-Pen-NHEt;

N-a-Ac-CikIo(S,S)Cys-D-Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Tyr-CysNH₂;

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Pen-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Pen-Arg-Gly-Asp-Cys-NH₂;

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-D-Arg-Gly-Asp-Ser-CysNH₂;

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-Sar-Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N-a-Ac-CikIo(S,S)Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-NH₂;

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-(Et₂)Arg-Gly-Asp-PenNH₂;

N-ct-Ac-Ciklo(S,S)Cys-D-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N-a-Ac-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂;

N-a-Ac-Arg-Gly-Asp-Ser-NH₂·,

N-a-Ac-Arg-Gly-Asp-Tyr-NH₂;

N-a-Ac-Arg-Gly-Asp-NH₂;

N-a-Ac-Arg-Gly-Asp-D-Ser-NH₂;

N-a-Ac-Arg-Gly-Asp-Val-NH₂;

N-a-Ac-Arg-Gly-Asp-Nal-NHz;

N-a-Ac-Arg-Arg-Gly-Asp-Phe-NH₂;

N-a-Ac-Arg-Gly-Asp-NH-CH₂-CH₂-Ph;

N-a-Ac-MeArg-Gly-Asp-Phe-NH₂;

N-a-Ac-HArg-Gly-Asp-Ser-NH₂;

N-a-Ac-Arg-Gly-Asp-Ser-NHEt;

N-a-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂;

N-a-Fonnil-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂; vagy

Gly-MeArg-GIy-Asp-Ser-NH₂.

A peptidek leírására a technika állásából ismert nómenklatúrát alkalmazzuk.

Aminosav	Hárombetűs szimbólum	Egybetűs szimbólum
Alanin	Alá	A
Arginin	Arg	R
Aszparagin	Asn	N
Aszpartxnsav	Asp	D
Asn és/vagy Asp	Asx	B
Cisztein	Cys	C
Glutamin	Gin	Q
Glutaminsav	Glu	E
Gin és/vagy Glu	Glx	z
Glicin	Gly	G

Aminosav Hárombetűs Egybetűs szimbólum szimbólum

Hisztidin	His	H
Izoleucin	Πβ	I
Leucin	Leu	L
Lizin	Lys	K
Metionin	Met	M
Fenil-alanin	Phe	F
Prolin	Pro	P
Szerin	Ser	S
Threonin	Thr	T
Triptofán	Trp	W
Tirozin	Tyr	Y
Valin	Val	V

A hagyományos ábrázolásnak megfelelőien az aminovég a molekula bal oldalán, a karboxivég a molekula jobb oldalán található. Ha másként nem jelöljük, az összes királis aminosav (AA) L-abszolút konfigurációjú. Pen jelentése L-penicillamin vagy β,β-dimetil-cisztein, APmp jelentése 2- amino-3;3-ciklopenta-metilén3-mefkapto-propionsav, Mpr jelentése 3-merkaptopropionsav, HArg jelentése homoarginin, MeArg jelentése metil-arginin, (Mez)Arg jelentése Ν’,Ν’’-dimetilarginin, (Et₂)Arg jelentése N’,N”-dietil-arginin, Nva jelentése norvalin, Nle jelentése norleucin, a-MeAsp jelentése N-a-metil-aszpartánsav, Nal jelentése béta2-naftil-alanin, Phg jelentése fenil-glicin, Trp jelentése triptofán, Boc jelentése t-butil-oxi-karbonil, Fmoc jelentése fluorenil-metoxi-karbonil, Ph jelentése fenilcsoport, Cbz jelentése karbobenzil-oxi-csoport, BrZ jelentése o-bróm-benzil-oxi-karbonil-csoport, Clz jelentése o-klőr-benzil-oxi-karbonil-csoport, Bzl jelentése benzilcsoport, 4-MBzl jelentése 4-metiI-benziI-csoport, Ac jelentése acetilcsoport, Alk jelentése 1-6 jelentése alkilcsoport, Ph jelentése fenilcsoport, Chx jelentése ciklohexilcsoport, DCC jelentése diciklohexilkarbodiimid, DMAP jelentése dimetil-amino-piridin, HOBT jelentése 1-hidroxí-benzotriazol, THF jelentése tetrahidrofurán, DMF jelentése dimetil-formamid, HF jelentése hidrogén-fluorid és TFA jelentése trifluorecetsav. 1-4 szénatomos alkil jelentése metil-, etil-, propil-, izopropil-, butil- és izobutilcsoport.

A találmány szerinti megoldásban az aminosavak α-R’ szubsztituált származékai, amelyeket jelezhetünk úgy is, mint (a-R’)AA, olyan aminosavakat jelentenek, amelyek az α-aminocsoporton R’-vel monoszubsztituáltak - R’ jelentése Ci_g Alk-csoport. R’ előnyösen metilcsoportot jelent. Ν-α-metil-arginin és az N-ametil-glicin, amelyeket jelölhetünk (<x-Me)Arg-nak és (a-Me)Gly-nek, a leírásban a hagyományos jelzésnek megfelelőén jelezzük MeArg-gal és Sar-ral (szarkozin). Az összes többi Ν-α-helyettesített aminosavaknál az a- jelzést alkalmazzuk. Azokat az aminosavakat, amelyek merkaptánnal, guanidinoval vagy hidroxilcsoporttal vannak helyettesítve, így például a Tyr, Ser, Thr, Cys vagy Pen, ezzel a jelöléssel vannak megkülönböztetve. így: (a-Me)Ser - Ν-α-metil-szerin, (Me)Ser 6

HU 205 368 Β

O-metil-szerin, (α-Me, Et)Ser - Ν-α-metil, O-etil-szerin és (α-Me, Et₂)Arg - N-a-metil-N‘.N”-dietil-arginin.

A peptideket előnyösen a Merrifield szilárd fázisú technikával állítjuk elő [J. Am. Chem. Soc., 85, 2149 (1964)], bár alkalmazhatjuk a technika állásából ismert oldatban történő előállítását is. Alkalmazhatjuk a szilárd fázisú és az oldatban végzett szintézis kombinációját, amelyben a szilárd fázisú módszerrel di-, tri-, tetra- vagy pentapeptid-fragmenseket állíthatunk elő, míg az oldatban zajló szintézissel egyéb módosított összekapcsolt fragmenseket állíthatunk elő. All és munkatársai által a J. Med. Chem., 29, 984 (1986)-ban és a J. Med. Chem., 30, 2291 (1987)-ben megadott peptidszintézis-módszereket alkalmazhatunk a találmány szerinti eljárással előállított peptidek előállításához, és ezeket neveztük meg referenciaként.

Minden aminosavat és pepiidet a technika állásából ismert módon megfelelően védünk. így például Boc, Cbz vagy Fmoc csoportot alkalmazhatunk az aminocsoport, különösen az α-aminocsoport védelmére. A Boc csoportot alkalmazzuk általában az a-aminocsoport védelmére. A benzilcsoportot vagy a megfelelően helyettesített benzilcsoportot cisztein merkaptocsoportjának védelmére, vagy egyéb tiolt tartalmazó aminosavak védelmére, vagy szerűiben a hidroxilcsoport vagy treoninban a hidroxilcsoport védelmére.

A tozilcsoportot alkalmazhatjuk His-ben az imidazolcsoport védelmére, és a tozil- vagy nitrocsoportot felhasználhatjuk az Arg-ban lévő guanidino-nitrogén védelmére. A Tyr, Ser vagy a Thr hidroxilcsoportjának vagy a lizin α-aminocsoportjának védelmére megfelelően helyettesített karbobenzil-oxi- vagy benzilcsoportot használhatunk. A lizin α-aminocsoportjának védelmére felhasználhatjuk még a ftálimidocsoportot is. Előnyösen a karbobenzil-oxi- vagy benzilvédőcsoportokat orto- és/vagy para-helyzetben szubsztituálhatjuk klóratommal, brómatommal, nitrocsoporttal vagy metilcsoporttal, és ezeket a védőcsoportok reakcióképességének változására alkalmazzuk. Cisztein és egyéb kéntartalmú csoportot tartalmazó aminosavakat diszulfid formában védhetjük tioalkil- vagy tioarilcsoportokkal. A Boc csoport kivételével a legalkalmasabb védőcsoportok azok, amelyeket enyhe savas kezeléssel nem távolíthatunk el. Ezeket a védőcsoportokat olyan módszerekkel távolíthatjuk el, mint például a katalitikus hidrogénezés, folyékony ammóniában nátriumot tartalmazó oldat vagy hidrogén-fluoridos kezelés, és ezeket a módszereket a technika állásából ismert módon hajtjuk végre.

Hogyha szilárd fázisú módszert alkalmazunk, a pepiidet a karboxivégtől kezdve fokozatosan részenként építjük fel, és a peptid aminovége felé haladva kialakul a molekula. A szilárdfázis-szintézist úgy kezdjük, hogy egy megfelelő gyantához, így például benzhidril-amingyantához (BHA) metil-benzhidril-amin-gyantához (MBHA) vagy klór-metil-gyantához (CMR) (általánosan ismertetve a 4 244 946. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban) kötjük kovalens kötéssel a védett aminosav C végét. A BHA- vagy az

MBHA-gyantát akkor alkalmazzuk, hogyha az előállítandó peptid karboxivége karboxamid. A CMR-gyantát alkalmazzuk, hogyha az előállítandó peptid karboxivége karboxilcsoport, bár ezt a típusú gyantát alkalmazhatjuk karboxamid vagy észter előállításához is.

Ha a védett aminosavat (AA) már az alkalmazni kívánt gyantához kötöttük, az aminocsoportot enyhén savas körülmények között hidrolizáljuk, és a kétszeresen védett aminosav szabad karboxilcsoportját ehhez az aminocsoporthoz kapcsoljuk. Ezt a folyamatot szakaszosan végezzük, anélkül, hogy a közbenső termékeket izolálnánk, és a folyamat a kívánt peptid kialakulásáig tart. Ezután a kész peptidet deblokkoljuk és/vagy a hordozó gyantáról lehasítjuk.

A CMR-gyantán lévő peptidet vizes alkoholban lévő alkálival hasítjuk le a gyantáról, és így a karboxiterminális aminosavként karboxisavat kapunk. Ha a CMRen lévő peptidet alkoholos oldatban lévő ammóniával vagy alkil-aminnal kezeljük, akkor a karboxivégen karboxamidot vagy alkil-karboxamidot kapunk.

Ha észtert akarunk előállítani a CMR-gyantát megfelelő alkohollal, így metanollal, etanollal, propanollal, butanollal Yagy benzil-alkohollal kezeljük trietil-amin jelenlétében, amelynek során a peptid a gyantáról lehasad, és közvetlenül megkapjuk az észtert.

A találmány szerinti eljárással kapott peptidek észtereit hagyományos módon is előállíthatjuk karboxilsavprekurzorból. Jellegzetes módon a karboxilsavat savkatalizátor jelenlétében alkohollal kezeljük. Alternatívként a karboxilsavat aktivált acil közbenső termékké is alakíthatjuk, így savhalogeniddé, és kezelhetjük alkohollal, előnyösen bázis jelenlétében.

A peptidet C-terminálisan észtercsoport kialakítására az aszpartánsav oldalsó karboxilcsoportjának észterezése nélkül kevésbé jól kidolgozott módszerek ismertek a peptidszintézisre vonatkozó technika állásából, így például a szintézist egy C-terminálisú aminosavészterrel, vagy egy dipeptiddel kezdjük, és ezt oldatban való szintézissel egy megfelelő oldalláncon védett aszpartánsav-maradékhoz kapcsoljuk. Ezután az oldalsó láncként jelen lévő karboxilcsoportról lehasítjuk a védőcsoportot, és klór-metil-gyantához (CMR) kapcsoljuk. Az aminocsoportot felszabadítjuk, és szilárd fázisú peptidszintézist végzünk. A pepiidnek a gyantáról történő lehasításához hidrogén-fluoridot alkalmazunk, így a kívánt karboxilsav-oldalláncot kapjuk, mialatt a pepiid karboxivége észterként megmarad. Hasonló módon, ha szintézist egy megfelelően védett aminosav alkilamid-szekvenciájával vagy pepiiddel kezdjük, akkor a peptid megfelelő C-terminális alkilamidját kapjuk.

Ha ilyen folyamattal állítunk elő észtereket és helyettesített amidokat, akkor az aszpartánsav 4-karboxilcsoportjának védelmére megfelelő csoport a benzilészterek és halogénatomok, vagy alkil-helyettesített benzil-észterek. Az aminocsoportot Boc csoporttal védjük, a benzil-észter-védőcsoportot hidrogénezéssel szelektíven eltávolíthatjuk, és a CMR-hordozógyantához köthetjük.

Az aminosavat (vagy dipeptidet), amelyet a gyantához kapcsolás előtt aszpartánsavhoz kell kötni, benzil7

HU 205 368 Β vagy helyettesített benzilvédőcsoportot tartalmaz (így például a hidroxil-, tio- vagy aminocsoportnál), akkor az aszpartánsav oldalsó karboxilláncának védelmére megfelelő csoport a terc-butil-észter vagy egyéb labilis savcsoport. Ilyen esetekben az aszpartánsav aminocsoportját bázis labilis csoportjával, így például fluorenilmetoxi-karbonil-csoporttal (Fmoc) védjük. Miután az aszpartánsavat egy aminosavhoz (vagy dipeptidhez) oldatban végzett szintézissel kapcsoljuk, a terc-butilészter szelektív eltávolítását enyhén savas hidrolízissel végezzük, és az oldalsó karboxilláncot a gyantához hagyományos módszerrel kapcsoljuk. Ezután a fluorenil-metoxx-karbonil-csoportot a következő szilárd fázisú peptidszintézishez enyhén bázisos körülmények között eltávolítjuk.

A pepiidnek a hordozó gyantáról történő lehasítására előnyös módszerként alkalmazzuk a vízmentes hidrogén-fluoridos kezelést megfelelő kationfogő jelenlétében. Kationfogóként alkalmazhatunk ánizsaldehidet vagy dimetoxi-benzolt. Ezzel a módszerrel egyidejűleg eltávolíthatjuk az összes védőcsoportot, kivéve a ként védő tioalkilcsoportot, és ily módon a pepiidet a gyantáról lehasíthatjuk. Az ily módon CMR-ről hidrolizált peptidek karboxilsavak, míg a BHA-gyantáről lehasított peptidek karboxamidok.

A peptidek terminális aminocsoportjának módosítására a technika állásából általánosan ismert alkilezést vagy acetilezést alkalmazzuk. Ezeket a módosításokat azelőtt végezzük, mielőtt az aminosavat a peptidbe beépítenénk, vagy végezhetjük a peptid szintézise után, és ilyenkor a terminális aminocsoportot szabaddá tesszük, de mindenesetre akkor végezzük, még mielőtt a védőcsoportokat eltávolítanánk.

Az acetilezés a szabad aminocsoporton történik a megfelelő alkilsav acil-halogenidjével vagy anhidridjével tercier amin jelenlétében. Amonoalkilezést előnyösen az aminocsoportnak'megfelelő alifás aldehiddel vagy ketonnal történő reduktív alkilezésével végezzük enyhén redukáló szer, így lítium vagy nátrium cianobór-hidrid jelenlétében. A dialkilezést az aminocsoport és feleslegben alkalmazott alkil-halogenid reakciójával bázis jelenlétében folytatjuk.

A peptidek oldatban történő szintézisét az amidkötés kialakítására ismert hagyományos módszerekkel végezzük. Szabad karboxilcsoportot tartalmazó védett Boc-aminosavat kapcsolunk szabad aminocsoportot tartalmazó védett aminosavhoz, amihez megfelelő karbodiimid-kapcsolő reagenst használunk, így például Ν,Ν’-diciklohexil-karbodiimidet (DCC), előnyösen katalizátor jelenlétében. Katalizátorként alkalmazhatunk 1-hxdroxi- benzotriazolt (HOBT) és dimetil-amino-piridint (DMAP). Más módszerek is alkalmasak, így például védett Boc-aminosav szabad karboxilcsoportját aktivált észterré, anhidriddé vagy savhalogeniddé alakítjuk, majd ezt követően egy védett aminosav szabad aminjával, előnyösen bázis jelenlétében reagáltatjuk. így például egy védett Boc-aminosavat vagy pepiidet kezelünk vízmentes oldószerrel, így metilén-kloriddal vagy tetrahidrofuránnal bázis jelenlétében, például Nmetil-morfolin, DMAP vagy trialkil-amin jelenlétében izobutil-kloroformáttal, és így „aktivált anhidrid”-et kapunk, amelyet ezt követően kétszeresen védett aminosav vagy peptid szabad aminjával reagáltatjuk. Az ily módon kapott pepiidről szelektíven lehasíthatjuk a védőcsoportot, amelyhez ismert módszert alkalmazunk. Miután az amino- vagy karboxivégről lehasítottuk a védőcsoportot, a pepiidet másik peptidhez vagy aminosavakhoz kapcsoljuk.

A találmány szerinti eljárással kapott aminosavak etil.’-helyettesített származékait, amelyek Arg, HArg, (Me₂)Arg, (Et₂)Arg, Alá, Gly, His, Abu, Tyr, (Alk)Tyr, Phe, (4’W)Phe, HPhe, Phg, Trp, His, Ser, (Alk)Ser, Thr, (AIk)Thr, Cys, (AIk)Cys, Pen, (Alk)Pen, Alá, Val, Nva, Met, Leu, Πβ, Nle és Nal származékait jelentik, a technika állásából ismert módszerrel állítjuk elő. R’ jelentheti az alkilcsoportot.

Ezeket a származékokat a következő módszerekkel állíthatjuk elő: 4 687 758 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; Cheung és munkatársai, Can. I Chem., 55,906 (1977); Freidinger és munkatársai, J. Org. Chem., 48, 77, (1982); és Shuman és munkatársai, Peptides: Proceedings of the 7th American peptide Symposium, Rich, D., Gross, E., Eds, Pierce Chemical Co., Rockford, Hl., 617 (1981). így például DMF/THF-ben Cbz- vagy Boc-aminosav oldatot kondenzálunk megfelelő alldl-halogeniddel, így például metil- vagy etil-jodiddal, bázis jelenlétében, például nátrium-hidrid vagy kálium-hidrid jelenlétében. Adott esetben koronaétert, így például 18-korona-6-ot kálium-hidriddel alkalmaztunk a reakció elősegítéséhez. Általában ebben az eljárásben, és az ezt követő eljárásokban, ha az aminosav olyan funkciós csoportokat tartalmaz, mint hidroxilcsoport, merkaptocsoport, aminocsoport, guanidinocsoport, indolilcsoport vagy imidazolilcsoport, akkor ezeket a csoportokat a már megadott módon védjük. így a Boc-Tyr(Bzl)-t nátrium-hidriddel és metil-jodiddal THF/DMF-ben 0 °C hőmérsékleten keverjük, majd szobahőmérsékleten 24 óráig keveqük, és így megkapjuk a Boc-(a-Me)Tyr(Bzl)-t.

Alternatívként az aminosav szabad aminocsoportját megfelelő aldehiddel, így például acetaldehiddel vagy benzaldehiddel kezeljük redukálószer, így például nátrium-ciano-bór-hidrid jelenlétében, és elvégezzük a monoalkilezést. Ez az eljárás különösen alkalmas -benzil-aminosavak előállítására. Az α-benzilezett aminosavakat α-metil- aminosavak előállításához közbenső termékként felhasználhatjuk. így például a-metil-arginint három lépésben állítjuk elő:

1. Az Arg(Tos)-t reagáltatjuk benzaldehiddel, és cianobór-hidriddel metanolos oldatban, és megkapjuk az (a-Bzl)Arg(Tos)-t.

2. A benzilezett terméket formaldehid/hangyasav oldatban redukáljuk, és megkapjuk az (a-BzI,Me)Arg(Tos)-t;

3. A benzilcsoportot katalitikus hidrogénezéssel felszabadítjuk (jeges ecetsav/sósav oldatban szénre felvitt 5%-os palládiummal) és így előállítjuk a MeArg(Tos)-t.

Aminosavak α-R’-helyettesített származékait úgy is előállíthatjuk, hogy Fmoc- vagy Cbz-aminosavból ka8

HU 205 368 Β pott oxazolidinokat redukáljuk. így például Fmocvagy Cbz-aminosavat megfelelő aldehiddel, például acetaldehiddel vagy benzaldehiddel melegítjük toluolszulfonsav jelenlétében toluolos oldatban és így előállítjuk a 2-helyettesített 5-oxo-oxazolidint. Ha ezt az oxadolidinont trietil-szilánnal és kloroformos oldatban TFA-val redukáljuk, akkor közvetlenül megkapjuk a Cbz- vagy Fmoc-helyettesített aminosavat. A szakember számára előnyös lehet, hogyha foramaldehidet használunk,, akkor az oxazolidinon a 2-helyzetben helyettesítetlen, és így α-metil-aminosavat állítunk elő.

A találmány szerinti eljárással előállított vegyületek közül előnyösek a (II) általános képlettel jellemzett vegyületek. Ezek a peptídek két aminosavat tartalmaznak, amelyekben tiolcsoportok találhatók. Ezek a tiolcsoportok diszulfidkötéssel kapcsolódnak, és így gyűrűs szerkezetet alkotnak. Ilyen szerkezetet kapunk a (III) általános képletű megfelelő lineáris peptidekből a képletben A’, B’, Asp, C’, Z_b Z2, m, n, p, q, X, Y, R’, Rí, R.2, R4 és Rj jelentése a már megadott, és amelyben bármelyik kémiailag reaktív központ adott esetben az előzőek szerint leírt módon védett.

A diszulfidkötés kialakítását egy vagy két módszerrel végezhetjük. Ha lineáris peptid ként tartalmazó aminosavjai közvetlenül védettek, és ez oly módon történt, hogy monomerkaptán kialakítása lehetséges, akkor a ciklizálást elvégezhetjük a második kéntartalmú aminosav védett csoportjának bázis katalizálta nukleofil helyettesítésével. Védőcsoportok helyettesítésére alkalmas csoportok például a tioalkil- vagy tioarilcsoport. Erre példaként a következő eljárást adjuk meg: az egyik kéntartalmú aminosavat tioetilcsoporttal védjük, és a második kéntartalmú aminosavat helyettesített benzilcsoporttal védjük. Hyen peptidekről a védőcsoportokat hidrogén-fluoriddal távolítjuk el, az egyik aminosavról a benzilcsoport, a másikról etil-diszulfid hasad le. Ha ezt a merkapto/diszulfid elegyet híg oldatban 7-8 pH-η keverjük, a tíoetilcsoport áthelyeződik, és a lineáris peptid ciklizálódik.

Ha a megfelelő (IH) általános képletű lineáris pepiidről a védőcsoportokat teljesen lehasíthattuk, és dimerkaptánt előállítottunk, akkor bármelyik oxidálószert alkalmazhatjuk (technika állásából ismert oxidálószerek) a dimerkaptánt diszulfiddá történő alakításához. Ilyen oxidálószeres példa az alkálifém-ferricianid, különösen a kálium- vagy nátirum-ferricianid, oxigéngáz, dijód-metán, vagy jód. A reakciót megfelelő közömbös oldószerben, így például vizes metanolban vagy vízben végezzük 0-40 °C hőmérsékleten nagy hígításnál. A reakcióelegy pH-ja 7-8. A ciklizálást a peptiddel úgy is elvégezhetjük, hogy még a peptid a hordozógyantához van kötve, mialatt egyéb funkciós csoportjai védettek, azonban előnyösen elvégezhetjük az eljárást a nem védett szabad peptiden is.

A peptídek savaddíciós sóit ismert módon megfelelő oldószerben, savfeleslegben, így például sósav, hidrogén-bromid, kénsav, foszforsav, ecetsav, maleinsav, szukcinsav vagy metánszulfonsav jelenlétében végezzük. Előnyösek az acetátsók. Bizonyos peptídek belső sót vagy ikeriont alkotnak. Kationsót kapunk, hogyha a peptidet feleslegben lévő alkalikus szerrel, például megfelelő kation hidroxidjával, karbonátjával vagy alkoxidjával kezeljük. Kationként alkalmazhatunk nátriumot, káliumot, kalciumot és ammóniumot, amelyekkel gyógyászatílag elfogadható sót kapunk.

A találmány szerinti eljárással antifibrotikus készítményt kapunk, amely hatóanyagként (I) vagy (Π) általános képletű peptidet tartalmaz gyógyászatílag elfogadható hordozóanyagokkal összekeverve. Ez a gyógyszerkészítmény hatóanyagként a találmány szerinti eljárással kapott peptideket vagy egyéb peptideket vagy fíbronectín, fibrinogén vagy von Willebrand-faktor polipeptid- származékait tartalmazhatják, amelyet előállíthatunk oldatként vagy liofilizált por formában parenterális alkalmazásra. A porokat ismét feloldhatjuk megfelelő hígítószerrel vagy egyéb gyógyászatílag elfogadható vivőanyaggal. Ezek a folyékony készítmények általában pufferek, izotónikus vizes oldatok. Megfelelő hígítószeme példa a normál izotónikus sóoldat, vízben készített 5%-os extróz vagy pufferolt nátrium- vagy ammónium-acetát-oldat. Ezek a készítmények különösen alkalmasak parenterális adagoláshoz, de felhasználhatók orális alkalmazásra, . Alkalmazhatjuk meghatározott dózisban inhalálásra, vagy belélegzéshez porlasztásra. Előnyös lehet egyéb adalékok alkalmazása, így polivinil-pirrolidon, zselatin, hidroxilcellulóz, polietilénglikol, mannitol, nátrium-klorid vagy nátrium-citrát.

Ezeket a peptideket kapszulázhatjuk is, tablettává is formálhatjuk, előállíthatunk emulziót vagy szirupot, amelyeket orális alkalmazásra használunk. Gyógyászatiig elfogadható szilárd vagy folyékony hordozóanyagokat felhasználhatunk, amelyek javíthatják vagy stabilizálhatják a készítményt, vagy megkönnyíthetik a készítmény előállítását. Szilárd vivőanyagként alkalmazhatunk keményítőt, Iaktózt, kalcium-szulfát-dihidrátot, magnézium-sztearátot vagy sztearinsavat, talkumot, pektínt, agaragart vagy zselatint. Folyékony vivőanyagként felhasználhatunk szirupot, földimogyoró-olajat, olívaolajat, sóoldatot és vizet. A vivőanyag tartalmazhat hossszan tartó felszabadítást biztosító anyagokat, így például glicerilmonosztearátot vagy gliceril-disztearátot, ezeket tartalmazhatja önmagukban vagy viasszal együtt. A szilárd vivőanyag mennyisége változhat, azonban előnyösen 1 egységdózishoz 20 mg - 1 g-ot alkalmazunk. A gyógyszerkészítmény előállítása a gyógyszergyártásban szokásos technológiával történik őrléssel, keveréssel, granulálással, préseléssel (tablettáknál) vagy őrléssel, keveréssel és kemény zselatinkapszulába töltéssel. Ha folyékony vivőanyagot alkalmazunk, akkor a készítményből szirupot, elixírt, emulziót vagy vizes vagy nemvizes szuszpenziót készítünk. Ezeket a folyékony készítményeket adagolhatjuk közvetlenül p.o. módon vagy lágy zselatinkapszulába tölthetjük.

Bukkális alkalmazásnál a találmány szerinti eljárással kapott peptideket keverhetjük egyéb adalékkal, például kakaóvajjal, glicerinnel, zselatinnal vagy polietilénglikollal és kúppá olvaszthatjuk.

Emlősöknél, különösen embereknél vérlemez-aggregáció és vérrögképződés megakadályozására, az antifib9

HU 205 368 Β rotikus peptid hatásos mennyiségét gyógyászatilag elfogadható vivőanyaggal adagoljuk. A készítményt a következő gyógykezelésekhez alkalmazhatjuk: miokardíális infarktus, mélyvénatrombózis, tüdőembólia, szélhűdésnél és egyéb infarktus jellegű megbetegedéseknél. Ugyancsak alkalmas a készítmény a következő krónikus vagy akut hiper aggiegáciő képzésénél: fokozott intravaszkuláris koaguláció (DIC), szeptikémia, sebészeti vagy fertőzés miatt fellépő sokk, műtét utáni és szülés utáni trauma, inkompatibilis vértranszfűzió, kardiopulmonáris bypass sebészet, trombózis trombocita permis purpura (ΠΡ), kígyózó véna és immunbetegségek. Az antifibrotikus pepiidet vagy orálisan, vagy parenterálisan adagolják a betegnek. Adagolásnál a plazmában lévő hatóanyag-koncentrációjának elégnek kell lenni a vérlemez-aggregáció gátlására. A gyógyászati készítmény a pepiidet 1 kg testsúlyra számítva 0,2-50 mg mennyiségben adagolják oly módon, amely a beteg állapotának a legalkalmasabb. Akut gyógykezelésnél a parenterális adagolás az előnyös. Krónikus hiperaggregációnál a leghatásosabb, ha a peptideket vizes 5%-os dextrózzal, vagy normál sóoldattal intravénás infúzióban adagolják, habár elegendő lehet intramuszkuláris injekció is. Krónikus, de nem kritikus vérlemez-aggregációnál megfelelő a kapszulavagy tabletta orális alkalmazása, vagy intramuszkuláris injekció. Apeptidet naponta 1-4-szer adagolják 0,450 mg/kg dózisban, a napi dózis 1 kg testsúlyára számítva 0,4-200 mg.

A fibrinolitikus terápiát követően kialakuló visszazáródás megakadályozására, az emlősnek antifibrotikus peptid és fibrinolitikus szer hatásos mennyiségét adagoljuk. Azt tapasztaltuk, hogy fibrinolitikus kezelésben az antifibrotikus peptid adagolásával vagy megelőzhetjük az ismételt elzáródást, vagy késleltethetjük az elzáródáshoz szükséges időt. Ha fibrinolitikus terápiát követóén véredény ismételt elzáródásának gátlására alkalmazzuk a készítményeket, akkor nemcsak a találmány szerinti eljárással előállított peptideket alkalmazhatjuk, hanem egy olyan peptideket, polipeptideket és peptidek és polipeptidek fragmenseit vagy származékait, amelyek az RGD-aminosav-szekvenciát tartalmazzák, és amelyek képesek a GPUb-IHa receptorhoz kötődni. Ilyen antifibrotikus peptidekre példák a fibronectin, fibrinogén és von Willebrands-íragmensek és származékok. Ezeket a peptrdeket/polipeptideket a technika állásából ismert módon előállíthatjuk rekombináns DNS-mődszerrel, vagy szilárd fázisú peptidszintézissel vagy hagyományos oldatban zajló szintézissel vagy oldatban zajló egyéb szintézissel. Fibronectin fragmensek előállítására módszert közölnek a következő irodalmak: Ruoslahti és munkatársai, WO 84/00540; Pierschbacher és munkatársai, 4 589 881 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat; és Rouslahti és munkatársai, 4 661111 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat. Az ily módon előállított peptideket tovább származékká alakíthatjuk amidálással, észterezéssel, alkilezéssel, acetilezéssel vagy egyéb természetes vagy szintetikus aminosavhoz történő kapcsolással. Az ily módon előállított peptidek vagy polipeptidek az előzőekben leírt módon parenterális vagy orális alkalmazásra megfelelő készítménnyé alakíthatók.

A találmány értelmében a fibrinolitikus szer olyan anyagot jelent, amely vagy természetes, vagy szintetikus tennék, és amely közvetlenül vagy közvetetten a fibrinalvadék lízisét okozza. A plazminogén aktivátorok a fibrinolitikus szerek ismert csoportja. Használható plazminogén aktivátorokra a következő példákat nevezzük meg: urokináz (UK), prourokináz (pUK), sztreptokináz (SK), szövet plazminogén aktivátor (tPA) és ezek mutánsai vagy variánsai, amelyek megtartják a plazminogén aktivátor hatását és ezekben a variánsokban egy vagy több aminosavat lehet beépíteni, eltávolítani vagy helyettesíteni, vagy amelyekbe egy vagy több funkciós domint lehet beépíteni, eltávolítani, vagy megváltoztatni, így például egy plazminogén aktivátor, a tPA aktív oldalát reagáltathatjuk egy másik plazminogén aktivátor fibrinkötő dombijával, vagy egyéb fibrinkötő molekulával, például egy antifibrin IgG Fab fiagmensével. Példaként megadunk egy másik változatot a tPA molekulát, amelyben egy vagy több glikozilált helyet megváltoztattunk. A plazminogén aktivátorok közül előnyösek azok a tPA variánsok, amelyekben a primer aminosav-szekvenciát növekedési faktor dominnal változtattuk, azért, hogy a plazminogén aktivátor fél értékidejét növeljük. A tPA növekedési faktor variánst tárgyalják például a következő irodalmak: Robinson és munkatársai, a 29 75 89 számú európai közzétételi iratban, Browne és munkatársai a 24 03 34 számú európai közzétételi iratban és az Egyesült Királyságban a British Biotechnology Ltd. által 1988. június 24-én benyújtott SKB 14 422 számú szabadalmi bejelentésben (Smith Kline Beckman Corporation DocketNumber). A fibrinolitikus szereket izolálhatjuk természetes forrásból is, azonban általában géntechnológiával hagyományos módszerrel állítják elő.

Hasznos tPA, SK, UK és pUK változatokat tárgyal például a következő irodalmi hely: 890 432 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés, 30 32 606 számú német szövetségi köztársaságbeli szabadalmi bejelentés, 83 10 3629.8 számú európai szabadalmi bejelentés és 4 568 543 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi irat. Jellegzetes fibrinolitikus szert lehet előállítani vízben, pufferban, izotónikus oldatban, így például nátrium- vagy ammóniumacetátban, vagy 3,5-5,5 pH-já adipát pufferban. Pótlólagosan a következő adalékokat alkalmazhatjuk: polivinil-pirrolidon, zselatin, hidroxi-cellulőz, polietilén, glikol, mannitol és nátrium-klorid. Ezeket a készítményeket liofilizálhatjuk is.

A gyógyászati készítményeket előállíthatjuk az antifibrotikummal és fibrinolítikummal ugyanabban a tartőedényben, azonban előnyős, ha ezeket az anyagokat külön tartókba helyezzük. Ha mindkét szert oldatként állítjuk elő, akkor ezeket felhasználhatjuk infúziós/injekciós rendszerként szimultán alkalmazáshoz, vagy tandémrendszerben.

A készítményeket alkalmazhatjuk miokardíális infarktus, mélyvénás trombózis, tüdőembólia, szélhűdés és egyéb infarktus jellegű megbetegedés gyógyítására.

HU 205 368 Β

Az antifibrotíkumot alkalmazhatjuk a tPA vagy egyéb fibrinolitikus szer adagolása előtt, azzal egyidőben vagy ennek parenterális adagolása után. Ajánlatos a kezelést az antifibrotikus szemel a visszaoldás után egy bizonyos ideig tovább folytatni, hogy így maximálisan megakadályozzuk a visszaoldásos utólagos kezelést. A tPA, SK, UK vagy pUK hatásos dózisa 1 kg testsúlyra vonatkoztatva 0,5-5 mg. Az antifibrotikus peptid hatásos dózisa 1 kg testtömegre 0,1-25 mg.

Az inhibitort és a fibrinolitikus szert előnyösen egyidőben vagy eltérő időben alkalmazzuk, ezárt célszerű kittet előállítani, amely egy külön tárolóban, például dobozban, kartonban vagy egyéb tárolóban olyan üvegeket, fiolákat tartalmaz, amelyek mindegyike parenterális alkalmazásra megfelelő hatásos mennyiségű inhibitort, és parenterális alkalmazásra megfelelő hatásos mennyiségű tPA-t vagy egyéb fibrinolitikus szert tartalmaz. Az ilyen kit például mindkét szert külön tárolóban, vagy ugyanabban a tárolóban, adott esetben liofilizált formában, valamint tartalmaz visszaoldásra megfelelő oldószert. így például ugyanabban a tárolóban két külön kamrába helyezhetünk visszaoldásra megfelelő oldószert, és liofilizált anyagot, amelyeket alkalmazás előtt összekeverünk. Ilyen elrendezésnél a fibrinolitikus és az antifibrotikus pepiidet külön csomagolhatjuk, így két tárolóba, vagy liofilizálhatjuk, és por formában egy tárolóba helyezhetjük.

Ha mindkét szert oldatként állítjuk elő, akkor ezeket infűziós/injekciós rendszerekbe szimultán alkalmazásra vagy tandemelrendezésben kiszerelhetjük, ily módon a vérlemez-aggregációt gátló szert előállíthatjuk i.v. injektálható formában, vagy készíthetünk belőle infúziós csomagot is, amikor ezt egy csővel egy másik infúziós csomagban lévő fibrinolitikus szerhez kapcsoljuk. Ha ilyen rendszert alkalmazunk, akkor a beteg először az antifibrotikus inhibitortól kap infúziót vagy injekciót, és ezt követően a fibrinolitikus szerből infúziót.

A peptidek gyógyászati hatását a következő vizsgálatokkal állapítottuk meg:

Humán vérben előre kialakított alvadékot fibrinolitikus gyógymóddal lizálunk

Humán vérben kialakított vérrög lízisekor megvizsgáltuk az antifibrotikus pepiidnek a tPA-ra kifejtett fibrinolízisét in vivő kísérletekben. Állott, citráttal kezelt, Amerikai Vörös Kereszttől kapott humán plazmát 20 percig centrifugáltunk 1300 g-n, hogy a maradék vérsejtet eltávolítsuk. 6 mm szövettenyészet-lemezhez adtunk plazmát, 125 jód-fibrinogént, kalcium-kloridot és trombint, majd az elegyet 15-18 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáltuk. Következő napon a mintákat jól kiöblítettük, hogy szabaddá tegyük az alvadékot. Az alvadékokat kétszer triszpufferolt sóoldattal mostuk. A sóoldat heparint és albumint tartalmazott. Az alvadékokat ezután az alvadók készítéséhez használt plazma 1-1 miéhez adtuk. Ezután minden egyes kémcsőbe tPA-t adunk 7-250 ng/ml koncentrációban (végkoncentrációk). A kémcsöveket gyenge rázás közben 4 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. 4 óra elteltével 25 μΐ alikvotot távolítunk el, és mérjük az alvadókból felszabaduló ¹²⁵jód mennyiségét. Minden egyes mintából három párhuzamos mérést végzünk.

Ennek a vizsgálatnak az eredményét grafikusan az 1. ábrán ábrázoltuk. Az ábrából kitűnik, hogy az AcRGDS-NH₂-nek a tPA-val kiváltott alvadéklízisben nincs szerepe.

Vérlemez-aggregáció gátlásának in vivő bemutatása

Aiken és munkatársai Prostaglandins, 19, 629-43 (1980) szakirodalmi helyen leírt módszer szerint elkábított kutyáknak peptidekből infúziót adunk, és vizsgáljuk a szisztemíkus és hemodínamikus hatást, amelyből megállapítjuk a vérrögképződés in vivő gátlását. A módszer szerint egy kicsi Lexan® hengert helyezünk mechanikusan sérült bal oldali koronaérbe, és így egy 80-90%-os részleges elzárást idézünk elő. Ilyen körülmények között a vérlemezek a szubendoteliás kollagénhez tapadnak, és az elzárt helyen aggregálnak. Az aggregáció megállapítható a véráram 2-3 perc alatti fokozatos csökkenéséből, amíg a trombuszt (vérrögöt) az elzárt véredény központjából mechanikusan eltoljuk, és a koronaérben a véráram helyreáll. Ezt a folyamatot a kísérlet során minden 2-3 percben megismételjük.

Ebben a vizsgálatban az Ac-RGDS-NH₂ alkalmazásával kapott eredményeket a 2 (a-c) ábrán szemléltetjük. Ily módon az a) jelzi a mért artériás vérnyomást (Pa), b) jelzi a mért koronaér- véráramot (ml/perc) és c) jelzi a fő koronaérben tapasztalt véráramot. Akontrollszakaszban a véráramlás nő [b) és c) ábrák]. A növekedés egészen addig tart, amíg az alvadók szabadon rázódik (SL). A nyíl jelzi az A-RGDS-NH₂ (400 mm, 0,1 ml/mm) koronaér-infuzió kezdetét. Az infúzió során (2, nyíl) a vérrögkeletkezés teljesen gátlódik. Az infúzió végén a vérrögképződés elindulásával lecsökken a véráram.

Ily módon az antifibrotikus peptid infúziós áramlási sebességének változtatásával az antiaggregáló aktivitás dózisfüggőségét megállapítottuk, a fő koronaér-véráram (ml/mm) mérésével. Ezt a 3 (a-c) ábrán szemléltettük, amelynek Ac-RGDS-NH₂ hatását ábrázoltuk. Az a) jelzi, hogy a vérrögképzés teljesen gátlódik (400 mmól/l Ac-RGDS-NH₂, 0,052 ml/perc). A b) jelzi, hogy a vérrög spontán elrázódásával mérsékelt a gátlás (400 mmól/l, 0,026 ml/perc). A c) jelzi a részleges gátlást, a teljes blokkoláshoz szükséges idő meghoszszabbodik (400 mmól/l, 0,013 ml/perc). Ismét nyíllal jelöltük az infúzió kezdetét és végét.

Vérlemez-aggregáció gátlás

Felnőtt mongrel kutyáktól vért gyűjtöttünk, majd (a koaguláció megelőzése érdekében citráttal kezelt). Vérlemezben gazdag plazmát állítottunk elő (PRP) 150 g-n szobahőmérsékleten 10 percig végzett centrifugálással. A vérlemezeket mostuk, mialatt a PRP-t 800 g-n 10 percig centrifugáltuk. Az így kapott sejtlemezeket kétszer Tyrode pufferral (pH=63) (kalciummentes) mostuk, és Tyrode puffénál (pH-7,4) (1,8 mmól/liter kalcium 340⁵sejt/ml-hez) reszuszpendáltuk. Ezután mindegyik vérlemez-aggregációs mérésnél az agonista előtt 3 perccel pepiidet adagolunk. Az agonista végső koncentráció 0,1 egység/ml trombin és 2 pmól/liter ADP (Sigma). Chro11

HU 205 368 Β no-Log Lumi-aggregométerrel ellenőriztük az aggregációt. Az agonista adagolása után. 5 perccel mért fényáteresztésból számítottuk a %-os aggregációt a következő képlet alapján: %-os aggregáciő=[(90-CR):(90-10)]^,100.

Az egyenletben CR jelentése a diagramról leolvasott ér- 5 ték, 90 az alapvonal, 10 a vakpróbában mértPRP. A következő tengelyeket tartalmazó diagramról olvastuk le: %-os aggregáciőgátlás, peptidkoncentráció.

A peptideket 200 pmól/liter koncentrációban alkalmaztuk, és hogy a megfelelő dózisválaszgörbét felvehessük, kétszeresre hígítottuk.

A pepiidnek a plazma proteázzal szembeni stabilitását fokoztuk azáltal, hogy az agonista adagolása előtt a peptideket PRP-ben 3 óráig (előnyösebb, minta 3 perc) inkubáltuk.

A következő táblázatban a találmány szerinti eljárással előállított peptidek vérlemez-aggregációval szembeni aktivitását adtuk meg.

Antiaggxegáló hatás

Példa száma	Szerkezet	3 óra múlva a %-os hatás	Antiaggregáló hatás
IC50, pmól PRP/ADP	IC50, gmól WP/trombin
1.	ciklo-Ac-Cys-MeArg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂	100	1,1	NT
2.	ciklo-Ac-Cys-Arg-Gly-Asp-D,L-APmp-NH₂	100	1,53	NT
3.	ciklo-Ac-Cys-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH2	100	32,7	54,3
4.	ciklo-Mpr-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂	NT	10,9	NT
5.	ciklo-Ac-Cys-MeArg-Gly-Asp-Ser-Pen-NH₂	NT	1,3	NT
6.	ciklo-Ac-Cys-MeArg-Gly-Asp-(a-Me)Ser-Pen-NH₂		76,96	NT
7.	ciklo-Mpr-MeArg-Gly-Asp-Ser-Cys-lSfflfe	NT	1,2	NT
8.	cikIo-Ac-Cys-MeArg-Gly-Asp-Cys-NH2	NT	0,91	NT
10.	ciklo-Ac-Cys-Arg-Gly-Asp-Pen-NH2	NT	4,12	NT
11.	ciklo-Ac-Cys-Arg-Gly-Asp-D-Pen-NH₂	NT	20,3	NT
12.	ciklo-Ac-Cys-Lys-Gly-Asp-Pen-NH2	NT	55,3	NT
13.	ciklo-Ac-Cys-HArg-Gly-Asp-Pen-NH₂	NT	3,85	NT
14.	ciklo-Ac-Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂	NT	0,26	NT
15.	Ac-Arg-Gly-Asp-Ser-NHEt	NT	200	NT
16.	ciklo-Ac-Cys-Arg-Gly-Asp-Pen-NHEt	NT	9,5	NT
17.	ciklo-Ac-Cys-D-Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂	NT	4,10	NT
18.	cikIo-Ac-Cys-MeArg-Gly-Asp-Tyr-Cys-NH₂	NT	1,49	NT
24.	ciklo-Ac-Cys-(Et₂)Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂	NT	81,7	NT
26.	Ac-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂	100	7,4	28,2
27.	Ac-Arg-GIy-Asp-Ser-NH2	0	91,3	67,2
28.	Ac-Arg-GIy-Asp-Tyr-NH₂	98	101,5	137
29.	Ac-Arg-Gly-Asp-NH₂	54,2	137,8	356
30.	Ac-Arg-GIy-Asp-D-Ser-NH₂	33,3	138,8	200
31.	Ac-Arg-Gly-Asp-Val-NH₂	91,7	55,5	NT
32.	Ac-Arg-Gly-Asp-Nal-NH₂	100	40,5	NT
33.	Ac-Arg-Arg-Gly-Asp-Phe-NH₂	5,9	112,7	NT
34.	Ac-Arg-Gly-Asp-NHCH₂CH₂Ph	100	75,9	NT
35.	Ac-MeArg-Gly-Asp-Phe-NH₂	100	10,8	NT
36.	Ac-Harg-Gly-Asp-Ser-NH₂	33,3	68,2	NT
37.	MeArg-GIy-Asp-Ser-NH₂	NT	66,3	NT
38.	HCO-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂	NT	6,9	NT
39.	Gly-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂	NT	12,0	NT
49a.	ciklo-AcNH-Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-OH		0,08
49b.	ciklo-H₂N-Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-OH		0,12
55a.	ciklo-AcNH-Pen-Gly-Arg-Gly-Asp-Cys-NH₂		31
55b.	ciklo-AcNH-Cys-His-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂		5,01
55c.	ciklo-AcNH-Cys-BzlArg-Gly-Asp-Pen-NH₂		7,74
55d.	ciklo-AcNH-Cys-Arg-Gly-Asp-Trp-Cys-NH₂		5,85
56a.	ciklo-PhCO-Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH2		0,2
56b.	ciklo-PhCH₂CO-Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂		0,28
56c.	ciklo-BuCO-Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NHz		0,25

PRP-lemezekben gazdag plazma WP-mosott lemezek

HU 205 368 Β

A következő példákkal korlátozás nélkül szemléltetjük a találmányt.

A következő példákban a hőmérséklet ’C-ban van megadva. Az aminosavelemzést Dionex autoion 100 készülékkel végeztük. Apeptidanalízist aminosavanalízissel végeztük. Tömegspektrum-vizsgálatot VG Zab tömegspektrométerrel (gyors atombombázó) végeztük. Vékonyréteg-kromatográfiához EM szilikagél vékonyréteglapokat alkalmaztunk (0,25 mm). Az ODS-jelzés az oktadecil-szilil szilikagél-kromatográfiás hordozót jelenti. Az eluensek összetételében a rövidítések jelentése a következő:

B.: butanol,

A: ecetsav,

W: víz,

E: etil-acetát,

IP: izopropanol,

P: piridin,

CA: klór-ecetsav.

A HPLC-vizsgálatot Beckman 344 gradiens-kromatográfiás rendszerrel végeztük CRIB-integrátorral vagy izokratikus vagy folyamatos gradiensmódszerrel. Ahol jeleztük, ott a peptid tisztaságát a HPLC-kromatogram integrálása alapján állítottuk meg. MeArg-ot Ali és munkatársai szerint megadott módszerrel végeztük, a vonatkozó amerikai egyesült államokbeli szabadalom száma 4 687 758 (1987).

l.példa

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂

A védett peptidgyanta közbenső terméket, N-a-AcCys-(SEt)-MeArg(Tos)-Gly-Asp(OCHx)-Ser(Bzl)Cys(4-MBzl)-MBHA-t 4-benzhidril-amin-gyantán szilárd fázisú módszerrel szintetizáltuk, amelyhez Beckman 990 MP szintetizátort (1,0 mmól fokozat) alkalmaztunk. Minden aminosavon az aminocsoportot terc-butil-oxi-karbonillal védtük, és szekvenciálisán N,N-diciklohexil-karbodiimid/1 -hidroxi-benzotriazol (DCC/HOBt) összekapcsoltuk. Az összekapcsolás Ali és munkatársai szerinti módon a J. Med. Chem., 29, 948 (1986) és J. Med. Chem., 30, 2291 (1987) megadottak szerint történt. Mikor az utolsó aminosavat is kapcsoltuk, a peptidet ecetsavanhidriddel (10 ekvivalens) és diizopropil-etil- aminnal (10 ekvivalens) dimetil-formamidban acetilezünk. A peptidet a gyantáról lehasítjuk, az oldalsó láncáról a védőcsoportokat eltávolítottuk, vízmentes hidrogén-fluoriddal (30 ml) ánizsaldehid (3,0 ml) jelenlétében 0 °C hőmérsékleten 60 perc alatt. A hidrogén-fluoridot vákuumban elpárologtattuk, a maradékot vízmentes éterrel mostuk, és a nyersterméket 50%-os ecetsavoldattal extraháltuk, és ioncserélt vízzel 2 literre hígítottuk. A vizes oldat pHját tömény ammónium-hidroxid- oldattal 7,5-re beállítjuk, Ilyen enyhén lúgos körülmények között a cisztein 4 MBzl csoportjának eltávolításával keletkezett szabad tiol következtében a második cisztein merkapto-etilvédőcsoportja nukleofilon áthelyeződik, és így a peptid intramolekulárisan ciklizálódik. Az oldaton keresztül inért gázt, így nitrogént vagy argont buborékoltatunk, hogy a termelődő etil-merkaptánt kihajtsuk. A ciklizáció 24-48 órán belül lezajlik. Ezután a reakcióoldatot egy oktadecil-szilán (ODS) fordított fázisú kromatográfiás kolonnán átengedjük (a kolonnát előzetesen vízzel ekvilibráljuk). A peptidet 15%-os acetonitril/víz0,1% TFA-oldattal eluáijuk, és így 678,6 mg (98% nyerstermék) kapunk. A peptidet közepes nyomású ODS fordított fázisú kolonnán kromatografáljuk, így tisztítjuk. Eluensként 5% acetonitril/víz - 0,1% TFAoldatot alkalmazunk. A cím szerinti peptidet két frakcióban kapjuk meg.

Kitermelés: 222,3 mg

Tisztaság: 98%

Fizikai adatok:

Összegképlet: C24H40N10O10S2

Molekulatömeg: 692,231

FAB: (M+H)⁺ 693,5, (M-H)' 692,0

AAA: Asp (1,07); Ser (1,00); Gly (1,00); Cys (2,37)

Peptidtartalom: 67,7

Kromatográfiás adatok:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), Rf-0,42, (B:A:W:P, 15:3:8:10) Rf=0,36.

2. HPLC: Altex Ultrasphere® ODS, 4,5 mm«25 cm, detektálás: 220 nmól.

Izokratikus elúció: 2% acetonitril/H2O-0,l% TFA, k’-0,2.

Gradienselúció: H2O - 0,1% TFA-val equilibrált kolonnával végezzük, 5% acetonitril/^O - 0,1% TFA 5 perc, 50% 20 perc k’=l,5.

2. példa

N-(í-Ac-Ciklo(S,S)Cys-Árg-Gly-Ásp-(DL)-APmp-NH₂

Előállítjuk a védett peptidgyanta közbenső terméket, N-a-Ac-Cys(SEt)-Arg(Tos)-Gly-Asp(OCHx)APmp(4-MBzl)-MBHA-t, hasítjuk, cíklizáljuk, és izoláljuk. Az eljárás az 1. példa szerinti módon történik 0,5 mmól lépésben. A peptidet közepes nyomású ODS fordított fázisú kolonnán kromatográfiásan tisztítjuk. Eluensként 15% acetonitril/víz-0,1% TFA-t alkalmazunk. A cím szerinti terméket három frakcióban eluáljuk. így 150,9 mg (45,8%) terméket kapunk.

Tisztasága: 96%.

Fizikai adatok:

Összegképlet: C25H4iN90sS2

Molekulatömege: 659,4

FAB: (M+H)⁺ 660

AAA: Asp (1,00), Gly (1,00), Arg (0,91)

Peptidtartalom: 60,6%

Kromatográfiás adatok:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1),Rf=0,67, (B:A:W:P, 15:3:8:10),Rf=0,5.

2. HPLC: Altex Ultrasphere® ODS, 4,5 mm«25 cm, detektálás: 220 nmól.

Izokratikus: 10% acetonitril/H₂O-0,l% TFA, k’=3,24.

Gradiens: A: acetonitril, B: H₂0-O,l% TFA, 12-50% A, időtartam: 20 perc, k’=l,97.

3. példa

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂Védett peptidgyanta közbenső terméket, N-aAc-Cys(SEt)-Aig(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-Cys(4MBzl)-MBHA-t szintetizálunk, hasítunk és ciklizáljuk. Az eljárást az 1. példa szerinti módon történik 1,0 mmól lépésben. Liofilizálással 530 mg (78%) terméket kapunk, amelyet közepes nyomású ODS fordított fázisú kolonnán kromatográfiásan tisztítunk. Eluens: 1% acetonitril/víz0,1 % TFA. A cím szerinti termék 90% tisztaságú. Kitermelés: 61 mg.

Fizikai adatok:

Összegképlet C23H38NÍ0O10S2 Molekulatömege: 678,75

FAB:(M+H)*679

AAA: Asp (1,00); Ser (0,98); Gly (0,97); Arg (0,90); Cys (1,75)

Peptidtartalom: 86,3%

Kromatográfiás adatok:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), Rf=0,32, (B:W:IP:CA, 6,5:2:1,5:1,3), Rf-0,06.

2. HPLC: Vydac 218 TP ODS kolonna,

4,6 mm*25 cm, detektálás: 220 nmől.

Gradiens: A: acetonitril, B: Η₂Ο-0,1% TFA, 0-50%, időtartam: 35 perc, k’=6,4.

4. példa

Ciklo(S,S')Mpr-Árg-Gly-Ásp-Ser-Cys-NH2 Védett peptidgyanta közbenső terméket, Mpr(4MBzl)-Arg(Tos)-Giy-Asp(OCHx)-Ser(Bzl)-Cys(SEt)MBHA-t előállítunk, hasítjuk, ciklizáljuk és izoláljuk. Az eljárás az 1. példa szerinti módon történik 1,0 mmól lépésben. A peptidet közepes nyomású ODS fordított fázisú kolonnán kromatográfiásan tisztítjuk. Eluens: 3,5% acetonitril/víz-0,1% TFA. A cím szerinti tennék 96% tisztaságú.

Kitermelés: 489 mg (79%).

Fizikai adatok:

Összegképlet: C21H35N9O9S2

Molekulatömeg: 621,208

FAB: (M+H)⁺ 622,1; (M-H)‘ 620,7

AAA: Asp (1,00), Ser (0,97), Gly (1,00), Cys (0,57)

Arg (10,3)

Peptidtartalom: 73,88%

Kromatográfiás adatok:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1),Rf=0,42, (B:A:W:P, 15:3:8:10), Rf=0,41.

2. HPLC: Altex Ultrasphere® ODS, 4,5 mm«25 cm, detektálás: 220 nm.

Izokratikus: 4% acetonitril/H2O-0,l% TFA, k’=3,6. Gradiens: A: acetonitril, B: H₂O-0,l% TFA, 3-50%

A, időtartam: 20 perc, k’=3,3.

5. példa

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Ser-Pen-NHz előállítása

Védett peptidgyanta közbenső terméket, N-a-AcCys(SEt)-MeÁrg(Tos)-Gly-Asp(OCHx)-Ser(Bzl)-Pen (r-MBzl)-MBHA-t állítunk elő, hasítjuk, ciklizáljuk és izoláljuk. Az eljárás az 1. példa szerinti módon történik 1,0 mmól léptékben. így 542 mg (75%) terméket kapunk, amelyet közepes nyomású ODS fordított fázisú kolonnán kromatográfiásan tisztítunk. Eluens: 6% acetonitril/víz-0,1% TFA. A cím szerinti termék 94% tisztaságú.

Kitermelés: 47,5 mg.

Fizikai adatok;

Összegképlett C26H44N10O10S2

Molekulatömeg: 720,27

FAB: (M+H)⁺ 721,3

AAA: Asp (1,00), Ser (0,96), Gly (1,00), MeArg (0,89)

Peptidtartalom: 78,12%

Kromatográfiás adatok:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), Rf-0,42, (B:A:W:P, 15:5:10:10), Rf=0,41.

2. HPLC: Altex Ultrasphere® ODS, 4,5 mm*25 cm, detektálás: 220 nm.

Izokratikus: 6% acetonitril/H₂O-0,l% TFA, k’-5,66.

Gradiens: A: acetonitril, B: H₂O-0,l% TFA, 0-50% A, időtartam: 20 perc, k’-3,19.

6. példa

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-(a-Me)Ser-Cys-NH₂

Védett peptidgyanta közbenső terméket, N-a-Ac-Cys(SEt)-MeAig(Tos)-Gly-Asp(OCHx)(a-Me)Ser(Bzl)-Cys(4-MBzI)-MBHA-t előállítunk, hasítjuk, ciklizáljuk és izoláljuk. Az eljárást az 1. példa szerintimódon végezzük. 0,5 mmól léptékben. Apeptideket fordított fázisú ODS kolonnán eluáljuk. Eluens: 10% acetonitril/H₂O-0,l% TFA. Az így kapott tennék 47 mg. A terméket preparatív HPLC-vel tisztítjuk izokratikus körülmények között: 5,5% acetonitril/víz-0,1% TFA. Kolonna: Altex Ultrasphere® ODS, 5 μ, 10 mm»25 cm.

Detektálás 220 nm-en történik. A cím szerinti termék 96% tisztaságú.

Kitermelés: 10,6 mg.

Fizikai adatok:

Összegképlet: C^H^NmOkA

Molekulatömeg: 706,237

FAB: (M+H)⁺ 707,5-nél; M-H* 709,5-nél

AAA: Asp (1,06), Gly (1,00)

Peptidtartalom: 55,85%

Kromatográfiás adatok:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1),Rp-0,4I, (B:A:W:P, 15:5:10:10), Rf=0,49.

2. HPLC: Altex Ultrasphere® ODS, 4,5 mm«25 cm, detektálás: 220 nm.

HU 205 368 Β

Izokratikus: 4,5% acetonitril/H₂O-0,l% TFA, k’=8,95.

Gradiens: A: aeetonitril, Β: H2O-0,l% TFA, 0-50% A, időtartam: 20 perc, k’=5,97.

7. példa

Ciklo(S,S)Mpr-MeArg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH.2 Védett peptidgyanta közbenső tennéket, Mpr(4MBzl)-MeArg(Tos)-Gly-Asp(OCHx)-Ser(OBzl)Cys(SEt)-MBHA-t előállítunk, hasítunk, ciklizálunk és izolálunk az 1. példa szerinti módon 1,0 mmól léptékben. Apeptidet kromatográfiásantisztítjuk, eluensként 5% acetonitril/H₂O-0,l% TFA-t alkalmazunk, így

256,5 mg (40%) cím szerinti terméket kapunk. A terméket Sephadex® G-15 gélszűréssel tisztítjuk, amikor is eluensként 0,2 mól/liter ecetsavat alkalmaztunk. A kapott tennéket preparatív HPLC-vel tovább tisztítjuk gradiens körülmények között: A: aeetonitril, Β: H2O0,1% TFA, 5-30%, időtartam: 10 perc. Kolonna: Altex Ultrasphere® ODS, 5 μ, 10 mm«25 cm.

Detektálás: 220 nm.

Cím szerinti tennék 98%-nál tisztább.

Fizikai adatok:

Összegképlet: C22H37N9O9S2 Molekulatömeg: 635,22 FAB: (M+H)* 636,2

AAA: Asp (1,00), Ser (0,84), Gly (1,04), Cys (1,48)

Kromatográfiás adatok:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), Rf=0,39, (B:A:W:P, 15:5:10:10), Rf=0,49.

2. HPLC: Altex Ultrasphere® ODS, 4,5 mm*25 cm, detektálás: 220 nm.

Izokratikus: 5% acetonitril/H2O-0,l% TFA, k’=5,93. Gradiens: A: aeetonitril, Β: H2O-0,l% TFA, 0-50%

A, időtartam: 20 perc, k’=7,86.

8. példa

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Cys-NH2 Védett peptidgyanta közbenső tennéket, N-a-AcCys(4-MBzl)-MeArg(Tos)-Gly-Asp(OCHx)-Cys(SEt)MBHA-t előállítunk, hasítunk, ciklizálunk és izolálunk az 1. példa szerinti módon 1,0 mmól léptékben. A terméket ODS fordított fázisú kolonnán eluáljuk, 5% acetonitril/H₂O-0,l% TFA eluenssel. 780 mg cím szerinti tennéket kapunk, amelyet Sephadex® G-15 gélszűréssel tisztítunk. Ehhez eluensként 0,2 mól/l ecetsavat alkalmazunk. A tennéket preparatív HPLC-vel izokratikus körülmények között tovább tisztítjuk. Eluens: 5% acetonitril/H2O-0,l% TFA, kolonna: Altex Ultrasphere® ODS, 5 μ, 10 mm*25 cm.

Detektálás: 220 nm.

A cím szerinti termék 98%-nál tisztább.

Fizikai adatok:

Összegképlet: C12H35N9O8S2 Molekulatömeg: 605,21 FAB: (M+H)* 606,2; (M-H)' 604 AAA: Asp (1,00), Gly (1,13), Cys (2,04)

Peptidtartalom: 77,33%

Kromatográfiás adatok:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), Rf=0,43, (B: A: W:P, 15:5:10:10), Rf=0,56.

2. HPLC: Altex Ultrasphere® ODS, 4,5 mm«25 cm, detektálás: 220 nm.

Izokratikus: 5% acetonitril/H2O-0,l% TFA, k’=4,76. Gradiens: A: aeetonitril, Β: H2O-0,l% TFA, 0-50%

A, időtartam: 20 perc, k’=7,18.

9. példa

Ciklo(S,S)Mpr-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH-í Védett peptidgyanta közbenső terméket, Mpr(4MBzl)-MeArg(Tos)-Gly-Asp(OCHx)-Pen(4-MBzl)ΜΒΉΑ-t előállítunk, hasítunk és izolálunk az 1. példa szerinti módon 1,0nmól léptékben. Apeptidet0,01 mól/l K₃Fe(CN)6-oldattal ciklizáljuk, A pepiidet ODS fordított fázisú kolonnán kromatografáljuk. Eluens: 10% acetonitril/H₂O-0,l% TFA, így 365 mg (63%) cím szerinti terméket kapunk. A terméket tovább tisztítjuk Sephadex® G-15 gélszűréssel, amihez 0,2 mól/l ecetsavat alkalmazunk. A cím szerinti tennék 96%-nál tisztább.

Fizikai adatok:

Összegképlet: C21H36N8O7S2

Molekulatömeg: 576,22

FAB: (M+H)* 577,2; (M-H)' 575,3

AAA: Asp (1,00), Gly (1,15), Mpr+Pen (1,55) '

Peptidtartalom: 65,77%

Kromatográfiás adatok:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), Rj=0,58, (B:A:W:P, 15:5:10:10), Rp-ö,5.

2. HPLC: Altex Ultrasphere® ODS, 4,5 mm»25 cm, detektálás: 220 nm.

Izokratikus: 10% acetonitril/H₂O-0,l% TFA, k’=6,ll.

Gradiens: A: aeetonitril, B: H₂O-0,l% TFA, 0-50% A, időtartam: 20 perc, k’=10,93.

10. példa

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-Arg-Gly-Asp-Pen-NH2 Védett peptidgyanta közbenső terméket, N-a-AcCys(SEt)-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Pen(4-MBzl)MBHA-t előállítunk, hasítunk, ciklizálunk, és az 1, példa szerinti módon 1,0 mmól léptékben végezzük az eljárást. így 400 mg (65%) terméket kapunk. A terméket Sephadex® G-25 kolonnán kromatografáljuk, tisztítjuk, eluens: B:A:W-4:1:5. A cím szerinti tennék 97%-nál tisztább.

Fizikai adatok:

Összegképlet: C22H37N9O8S2

Molekulatömeg: 619,711

FAB: (M+H)* 620,2-nél, (M-H)' 618,7-nél

AAA: Asp (1,00), Gly (1,01), Cys (1,00) Arg (0,67)

Peptidtartalom: 95,6%

HU 205 368 Β

Kromatográfiás adatok:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), Rf=0,37, (B:W:I:C, 65:20:15:3), Rf=0,097.

2. HPLC: Vydac 218 TP ODS kolonna,

4,6 mm«25 cm, detektálás: 220 nm-en.

Izokratikus: 6% acetonitriI/H2O-0,l% TFA, k’=2,2. Gradiens: A: acetonitril, B: H₂O-0,l% TFA, 0-50%

A, időtartam: 15 perc, k’=3,7.

11. példa

N-o.-Ac-Ciklo(S,S)Cys-Arg-Gly-Asp-D-PerL-NHz Védett peptidgyanta közbenső tennéket, N-a-AcCys(SEt)-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-D-Pen(4-MBzl)MBHA-t állítunk elő, hasítunk, ciklizálunk és izolálunk. Az eljárást az 1. példa szerinti módon, 1,5 mmól léptékben végezzük. Az így kapott peptidek közepes nyomású ODS fordított fázisú kolonnán kromatográfiásan tisztítjuk.

Eluens: 15%metanoI/H₂O-0,l%TFA.

A cím szerinti termék 96%-nál tisztább.

Kitermelés: 50 mg (5,4%).

Fizikai adatok:

Összegképlet C22H37N9O8S2 Molekulatömeg: 619,711 FAB: (M+H)⁺620,2-nél, (M-H)- 618,8-náI AAA: Asp (1,00), Gly (1,03), Arg (0,88) Peptidtartalom: 54%

Kromatográfiás adatok:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), Rf=0,42, (B:W:I:C, 65:20:15:3), Rr-0,11.

2. HPLC: Vydac 219 TP ODS kolonna,

4,6 mm«25 cm, detektálás: 220 nm-en.

Izokratikus: 5% acetonitriI/H₂O-0,l% TFA, k’=2,7. Gradiens: A: acetonitril/H₂O-0,l% TFA, 0-50% A, időtartam: 15 perc, k’=3,3.

12. példa

N-CL-Ac-Ciklo(S,S)Cys-Lys-Gly-Asp-Pen-Nllz Védett peptidgyanta közbenső terméket, N-a-AcCys(SEt)-Lys(Clz)-Gly-Asp(OBzl)-Pen(4-MBzl)MBHZ-t előállítunk, hasítunk, ciklizálunk és izolálunk. Az eljárást az 1. példa szerinti módon 2 mmól léptékben végezzük. A nyersterméket Abmerlite® XAD-2 kolonnán átengedjük, eluáljuk. Eluensként 50% acetonitriI/H₂O-0,l% TFA-t alkalmazunk. A terméket közepes nyomású ODS fordított fázisú kolonnán kromatográfiásan tisztítjuk. 5% acetonitril/H2O-0,l% TFA eluenssel. A cím szerinti termék 97%-nál tisztább.

Kitermelés: 180 mg (15%).

Fizikai adatok:

Összegképlet: C22H37N7O8S2

Molekulatömeg: 591,698

FAB: (M+H)⁺592,3-nél, (M-H)’ 591-nél

AAA: Asp (1,00), Gly (1,13), Lys (1,09) Cys (2,25)

Kromatográfiás adatok:

1. TLC: (B:W:W:E, 1:1:1:1), Rf=0,38,

2. HPLC: Vydac 218 TP ODS oszlop,

4.6 mm’25 cm, detektálás: 220 nm-nél.

Izokratikus: 3% acetonitril/H₂O-0,l% TFA, k’=3,5.

Gradiens: A: acetonitril, Β: H2O-0,l% TFA, 0-50% A, időtartam: 15 perc, k’=2,9.

13. példa

N-<x-Ac-Ciklo(S,S)Cys-HArg-Gly-Asp-Pen-NHz előállítása

2,5 mól/liter NaOH-oldatban feloldunk 290 mg,

1.7 mmól O-metil-izokarbamid-hidrogén-szuIfátot, és az oldat pH-ját 11-re beállítjuk. Az oldathoz adunk N-a-Ac-Cys-Lys-Gly-Asp-Pen-NH2-peptidet.

A reakcióelegyet egy éjszakán keresztül szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd Amberlite® XAD-2 kolonnán eluáljuk 50% acetonitril/H2O-0,l% TFA-val. A terméket közepes nyomású ODS fordított fázisú kolonnán kromatografáljuk. Eluens: 10% acetonitril/HíO0,1% TFA. így 95% tisztaságú cím szerinti pepiidet kapunk.

Kitermelés: 40 mg (37%).

Fizikai adatok:

Összegképlet C23H39N9O8S2

Molekulatömeg: 633,74

FAB: (M+H)⁺ 634,2-nél, (M-H) 632,3-nál

AAA: Asp (1,00), Gly (1,16), Cys (2,45)

Peptidtartalom: 68,9%

Kromatográfiás adatok:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1),Rp-0,44, (B:W:I:C, 65:20:15:3), Rf-0,19.

2. HPLC: Vydac 218 TP ODS kolonna,

4,5 mm’25 cm, detektálás: 220 nm-en.

Izokratikus: 4% acetonitril/H2O-0,l% TFAk’=2,0.

Gradiens: A: acetonitril, B: H2O-0,l% TFA, 0-50% A, időtartam: 15 perc, k’=3,2.

14. példa

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NHí

Védett peptidgyanta közbenső terméket, N-a-AcCys(SEt)-MeArg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Pen(4-MBzl)MBHA-t előállítunk, hasítunk, ciklizálunk és izolálunk. Az eljárást az 1. példa szerinti módon 1,0 mmól léptékben végezzük. A kapott terméket közepes nyomású ODS fordított fázisú kolonnán kromatográfiásan tisztítjuk. Eluens: 5% acetonitril/H₂O-0,l% TFA. A cím szerinti tennék 95% tisztaságú.

Kitermelés: 209 mg (35%).

Fizikai adatok:

Összegképlet: C23H39N9O8S2

Molekulatömeg: 633,738

FAB: (M+H)⁺634,7-nél,

AAA: Asp (1,00), Gly (0,98), Cys (1,06)

Peptidtartalom: 66%

HU' 205 368 Β

Kromatográfiás adatok:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1),Rf=0,62, (B:A:W:P, 15:5:10:10), Rf=0,39.

2. HPLC: Altex Ultrasphere® ODS, 4,5 mm«25 cm, detektálás: 220 nm-en.

Izokratikus: 5% acetonitril/H2O-0,l% TFAk’=2,39.

Gradiens: A: acetonitril, Β: H2O-0,l% TFA, 5-50% A, időtartam: 20 perc, k’=4,16.

75. példa

N-a-Ac-Arg-Gly-Ásp-Ser-NHEt előállítása

a) Boc-Ser(Bzl)-NHEt előállítása ml tetrahidrofuránban feloldunk 2,3 ml (20,9 mmól) N-metil-morfolint és 6,0 mg (20,3 mmól) Boc-Ser(Bzl)-t, és az oldathoz adunk -15 °C hőmérsékleten 2,7 ml (20,8 mmól) izobutil-kloroformátot. Az oldatot néhány percig keverjük, és a reakcióelegyen gáz halmazállapotú etil-amint buborékoltatunk keresztül. A reakcióelegyet -15 °C hőmérsékleten 30 percig keverjük. A reakcióelegyet leszűrjük, és a szűrletet szárazra pároljuk. A kapott maradékot etilacetátban (100 ml) feloldjuk, ezt követően 1 mól/liter sósavoldattal (2*50 ml) mossuk, majd az elegyet mossuk 50 ml vízzel, 2*50 ml 10%-os nátrium-karbonátoldattal és 50 ml sóoldattal. A szerves fázist vízmentes nátrium- szulfáton víztelenítjük, szűrjük és betöményítjük, így fehér por formában kapjuk meg a cím szerinti terméket, amely 6,0 mg. A szerkezetet NMRrel megállapítottuk.

b) Boc-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-NHEt előállítása

A 15. a) példában előállított pepiidről a BOC védőcsoportot vízmentes TEA (10 ml/mg) oldattal szobahőmérsékleten 40 perc alatt lehasítjuk. A TFA-t eltávolítjuk, és a megmaradt TFA-t meghatározzuk. A 12. a) példa szerinti eljárással a cím szerinti dipeptideket BOC-Asp(OBzl)-ból (5,82 mg, 18 mmól), BocSer(Bzl)-NHEt (10,4 g, 18 mmól)-ból, N-metil-morfolinból (8 ml, 73 mmól) és izobutil-kloroformátból (2,4 ml, 18 mmól) előállítjuk. így 8,81 g üveges anyagot kapunk.

A szerkezet meghatározása NMR-rel történik.

c) Boc-Asp-Ser(Bzl)-NHEt előállítása

100 ml etil-acetátban és 25 ml metanolban feloldunk 4,0 g 15. b) példában előállított terméket. Az így kapott oldathoz adunk 5% Pd/BaSO4-ot (2,0 g), és az elegyet Parr keverőberendezésben 30 percig 45 Psi hidrogénnyomáson hidrogénezzük. A reakcióelegyet leszűrjük, és a szűrletet betöményítjük, így 3,18 g fehér üveges anyagot kapunk. A szerkezetet NMR-rel meghatározzuk.

d) Boc-Asp( O-benzil-resin)-Ser(Bzl)-NHEt előállítása

A 15. c) példa szerint előállított pepiidet (1,31 g, 3 mmól) hidroxi-metil-gyantához (1% keresztkötésű, 1 g, 1 mmól) kötjük, ehhez 4-pirrolidino-piridint (0,15 g, 1 mmól) és DCC-t (620 mg, 3 mmól) alkalmazunk metilén-kloridban.

e) Ac-Arg-Gly-Asp-Ser-NHEt előállítása

Egy peptidgyanta közbenső terméket, Ac-Arg-GlyAsp(OBzl-gyanta)-Ser(Bzl)-NHEt-t előállítunk a 15. d) példában kapott pepiidből, amikor is Boc-Gly-t és Boc-Arg(Tos)-t szekvenciálisán kapcsolunk, és a gyantáról lehasítunk, és az 1. példa szerinti módon a védőcsoportokat eltávolítjuk. A pepiidet fordított fázisú ODS szilikagélkolonnán kromatográfiásan tisztítjuk. Eluens: 5% acetonitril/H2O-0,l% TFA.

A cím szerinti vegyület tisztább, mint 95%. Kitermelés: 173 mg.

Fizikai adatok:

Összegképlet: C09H34N8O8

Molekulatömeg: 502,53

FAB: (M+H)⁺503,0-nál,

AAA: Asp (1,08), Gly (1,00), Ser (1,02), Arg (1,07)

Peptidtartalom: 76,36%

Kromatográfiás adatok:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1),Rf=0,38, (B:W:IP:CA, 6,4:2:1,5:3), Rf=0,08.

2. HPLC: Vydac 218 TP ODS, 4,6 mm«25 cm, detektálás: 220 nm-nél.

Izokratikus: 5% acetonitril/H2O-0,l% TFAk’=0,4.

Gradiens: A: acetonitril, Β: Η2θΌ,1% TFA, 0-10% A, időtartam: 10 perc, k’=3,5.

16. példa

N-a.-Ac-Ciklo( S,S)Cys-Arg-Gly-Asp-Pen-NHEt előállítása

a) Boc-Pen(4-MBzl)-NHEt előállítása

A cím szerinti védett aminosavat állítjuk elő a 15. a) példa szerinti módon Boc-Pen(4-MBzl)-ből.

b) Fmoc-Asp(O-tBut)-Pen(4-MBzl)-NHEt előállítása

A cím szerinti vegyületet a 15. b) példa szerinti módon állítjuk elő.

c) Fmoc-Asp( O-benzil-gyanta)-Pen(4-MBzl)-NHEt előállítása a 16. b) példa szerint előállított peptid Boc védőcsoportját lehasítjuk, amikor is a terméket vízmentes TFAval szobahőmérsékleten 40 percig keverjük. A TFA-t eltávolítjuk, és tömegméréssel a maradék TFA-t meghatározzuk. Az így kapott maradékot EtoAc/Hexánból átkristályosítjuk. így 1,88 g (2,5 mmól) TFA-sőt kapunk. A terméket ezután hiroxil-metil-gyantához kötjük (1% keresztkötés, 1,82 g, 1,0 mmól), a kötéshez 4-pirrolidino-piridnt (katalitikus mennyiségű) és DCCt (2,5 mmól) alkalmazunk metilén-kloridban.

d) N-a.-Ac-Ciklo( S,S)Cys-Arg-Gly-Asp-Pen-NHEt előállítása

Védett peptidgyanta közbenső terméket, N-á-AcCys(SEt)-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl-gyanta)-PenNHEt-t a 16. c) példa szerint kapott pepiidből előállítunk, amikor is a Boc-Gly-t, Boc-Arg(Tos)-t, BocCys(SEt)-t szekvenciálisán kapcsolunk, és az Fmoc

HU 205 368 Β

Yédőcsoport lehasítása után 20% piperidinnel DMFben a terméket acilezzük. Ezután a terméket hasítjuk, ciklizáljuk az 1. példa szerinti módon. A terméket közepes nyomású ÖDS fordított fázisú kolonnán kromatográfiásan tisztítjuk. Eluens: 15% acetonitriEHíO0,1% TFA. A cím szerinti terméket 97% tisztaságban állítjuk elő.

Kitermelés: 307 mg (48%).

Fizikai adatok:

Összegképlet: C24H41N9O8S2

Molekulatömeg: 647,77

FAB: (M+H)⁺648,3-nél, (M-H)' 646,7-nél

AAA: Asp (1,00), Gly (1,04), Arg (1,03)

Peptidtartalom: 69,5%

Kromatográfiás adatok:

1. TLC: (B:A:W:E, l:l:l:l),Rf=0,53, (B:W:I:C, 65:20:16:3), Rf=0,l6.

2. HPLC: Vydac 218 TP ODS kolonna,

4,5 mm*25 cm, detektálás: 220 nm-nél.

Izokratikus: 9% acetonitril/H₂O-0,l% TFAk’=l,6.

Gradiens: A: acetonitril, Β: H₂O-0,l% TFA, 0-50% A, időtartam: 15 perc, k’=3,9.

17. példa

N-o.-Ac-Ciklo(S,S)Cys-D-Arg-Gly-Asp-Pen-NHz előállítása

A védett peptidgyanta közbenső terméket [N-a-AcCys(SEt)-D-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Pen(4-MBzl)MBHA-t] előállítjuk, hasítjuk, ciklizáljuk és izoláljuk az 1. példa szerinti módon 1,00 mmól léptékben. A terméket közepes nyomású ODS fordított fázisú kolonnán kromatográfiásan tisztítjuk és 6% acetonitril/HzO0,1% TEA-val eluáljuk. így 95% tisztaságú cím szerinti terméket kapunk.

Kitermelés: 300 mg (50%).

Fizikai adatok:

Összegképlet: C29H37N9O8S2

Molekulatömeg: 619,73

FAB: (M+H)⁺620,4-nél, (M-H)' 619-nél

AAA: Asp (1,00), Gly (1,03), Cys (2,42) Arg (1,01)

Peptidtartalom: 71,1%

Kromatográfiás adatok:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), RpO,31, (B:A:W:P, 15:5:10:10), Rj-0,54.

2. HPLC: Altex Ultrasphere® ODS, 4,5 mm«25 cm, detektálás: 220 nm-nél.

Izokratikus: 6% acetonitril/H₂O-0,l% TFAk’=5,2.

Gradiens: A: acetonitril, B: H2O-0,l% TFA, 5-50% A, időtartam: 20 perc, k’=3,9.

18. példa

N-<x-Ac-Ciklo(S,S)Cys-ldeArg-Gly-Asp-Tyr-Cys-NHi

A védett peptidgyanta közbenső terméket, N-a-AcCys(SEt)-MeArg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Tyr(BrZ)Cys(4-MBzl)-MBHA-t előállítjuk, hasítjuk, ciklizáljuk és izoláljuk az 1. példa szerinti módon 1,0 mmól léptékben. A terméket közepes nyomású ODS fordított fázisú kolonnán kromatográfiásan tisztítjuk. Az eluens 11% acetonitril/H2O-0,1% TFA. így 350 mg (45%) cím szerinti terméket kapunk. A terméket Sephadex® G-15 gélszűréssel tovább tisztítjuk, amihez 0,2 mól/liter ecetsavat alkalmazunk eluensként.

A cím szerinti tennék 95% tisztaságú.

Fizikai adatok:

Összegképlet: C30H44N10O10S2

Molekulatömeg: 768,27

FAB: (M+H)⁺769,3-néI, (M-H)'767,8-nél

AAA: Asp (1,00), Gly (1,00), Cys (1,91) Tyr (1,02)

Peptidtartalom: 82,75%

Kromatográfiás adatok:

1. TLC: (B:A:W:E, l:l:l:l),R^0,65, (B:A:W:P, 15:5:10:10), Rf=O,78.

2. HPLC: Altex Ultrasphere® ODS, 4,5 mm«25 cm, detektálás: 220 nm-nél.

Izokratikus: 9% acetonitril/H2O-0,l% TFAk’=6,4.

Gradiens: A: acetonitril, B: H2O-0,l% TFA, 5-50% A, időtartam: 20 perc, k’=5,5.

19. példa

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Pen-MeArg-Gly-Asp-Pen-NHz előállítása

A védett peptidgyanta közbenső terméket N-a-AcPen(4-MBzl)-MeArg(Tos)-Gly-Asp(OCHx)-Pen(4MBzl)-MBHA-t, előállítjuk, hasítjuk és izoláljuk.

Az eljárást az 1. példa szerinti módon, 1,0 mmól léptékben végezzük.

A peptidet 0,01% K3Fe(CN)s-oldattal ciklizáljuk. A peptidet az ODS fordított fázisú kolonnáról 10% acetonitrilben H2O-0,l% TFA eluenssel eluáljuk. így 395 mg (60%) cím szerinti terméket kapunk.

A terméket tovább tisztítjuk Sephadex® G-15 gélszűréssel, amihez 0,2 mól/liter ecetsavat alkalmazunk eluensként.

A cím szerinti tennék 95% tisztaságú.

Fizikai adatok:

Összegképlet: C^ELuNgOsSz

Molekulatömeg: 661,27

FAB: (M+H)⁺662,3-nél, (M-H)'660,l-nél

AAA: Asp (1,00), Gly (1,03)

Peptidtartalom: 43,7%

Kromatográfiás adatok:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), Rf-0,6, (B:A:W:P, 15:5:10:10), Rj-0,56.

2. HPLC Altex Ultrasphere® ODS, 4,5 mm*25 cm, detektálás: 220 nm-nél.

Izokratikus: 10% acetonitril/H₂O-0,l% TFAk’-4,4.

Gradiens: A: acetonitril/H₂O-0,l% TFA 1-50% A, időtartam 20 perc, k’-6,8.

HU 205 368 Β

20. példa

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Pen-Arg-Gly-Asp-Cys-NH₂ előállítása

A védett peptid közbenső terméket, N-a-Ac-Pen(4MBzl)-Arg(Tos)-Gly-Asp(OCHx)-Cys(SEt)-MBHA-t előállítunk, hasítunk, ciklizálunk és izolálunk. Az eljárást az 1. példa szerinti módon, 1,0 mmól léptékben végezzük. A peptidet ODS fordított fázisú kolonnán eluáljuk, eluensként 5% acetonitril/víz-0,1% TFA-t alkalmazunk.

így 400 mg (65%) cím szerinti terméket kapunk.

A terméket tovább tisztítjuk Sephadex® G-15 gélszűréssel, amihez 0,2 mól/liter ecetsavat alkalmazunk.

Ily módon 95% tisztaságú cím szerinti terméket kapunk.

Fizikai adatok:

Összegképlet: C22H37N9O8S2

Molekulatömeg: 619,22

FAB: (M+H)⁺ 620,2-nél, (M-H)' 618,9-nél

AAA: Asp (1,00), Gly (1,07), Arg (0,85)

Peptidtartalom: 62,4%

Kromatográfiás adatok

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), Rf-0,61, (B:A:W:P, 15:5:10:10), Rf=0,69.

2. HPLC: Altex Ultrasphere® ODS, 4,5 mm»25 cm, detektálás: 220 nm-nél.

Izokratikus: 3% acetonitril/H2O-0,l%TFAk’«8,4.

Gradiens: A: acetonitril, Β: Η₂Ο-0,1% TFA, 1-50% A, időtartam: 20 perc, k’=5,8.

21. példa

N-a.-Ac-Ciklo(S,S)Cys-D-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂ előállítása

A védett peptidgyanta közbenső terméket, N-a-AcCys(SEt)-D-Arg(Tos)-Gly-Asp(OCHx)-Ser(Bzl)Cys(4-MBzl)-MBHA-t előállítjuk, hasítjuk, ciklizáljuk és izoláljuk, az eljárást az 1. példa szerinti módon, 1,0 mmól léptékben végezzük.

A peptidet kolonnáról 5% acetonitril/víz-0,1% TFAval eluáljuk.

Ily módon 370 mg (55%) cím szerinti terméket kapunk.

A terméket tovább tisztítjuk Sephadex® G-15 gélszúréssel, amihez 0,2 mól/liter ecetsavat alkalmazunk eluensként.

A cím szerinti termék 95% tisztaságú.

Fizikai adatok:

Összegképlet: C23H38N10O10S2

Molekulatömeg: 678,22

FAB: (M+H)⁺ 679,2-nél, (M-H)’ 677,2-nél

AAA: Asp (1,00), Gly (1,13), Ser (0,86), Cys (2,02), Arg (1,21)

Peptidtartalom: 45,5%

Kromatográfiás adatok:

l.TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1),Rf-0,47, (B:A:W:P, 15:5:10:10), Rr-0,62.

2. HPLC: Altex Ultrasphere® ODS, 4,5 mm«25 cm, detektálás: 220 nm-nél.

Izokratikus: 3% acetonitril/H2O-0,l% TFAk’=3,6.

Gradiens: A: acetonitril, Β: H2O-0,l% TFA, 1-50% A, időtartam: 20 perc, k’=5,3.

22. példa

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-Sar-Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂ előállítása

A védett peptidgyanta közbenső terméket, N-aAc-Cys(SEt)-Sar-Arg(Tos)-Gly-Asp(OCHx)-Pen(4MBzl)-MBHA-t előállítjuk, hasítjuk, ciklizáljuk és izoláljuk. Az eljárást az 1. példa szerinti módon, 1,0 mmól léptékkel végezzük. A peptidet a kolonnáról 7% acetonitril/víz-0,1% TFA eluenssel eluáljuk.

így 600 mg (87%) cím szerinti terméket kapunk. A terméket tovább tisztítjuk Sephadex® G-15 gélszűréssel, amihez 0,2 mól/liter ecetsavat alkalmazunk eluensként.

A cím szerinti termék 95% tisztaságú.

Fizikai adatok:

Összegképlet: C25H42N10O9S2

Molekulatömeg: 690,26

FAB: (M+H)* 691,2-nél, (M-H)' 689-nél

AAA: Asp (1,00), Gly (1,14), Arg (1,04)

Peptidtartalom: 78,8%

Kromatográfiás adatok:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), Rf-1,54, (B:A:W:P, 15:5:10:10), Rf-0,67.

2. HPLC: Altex Ultrasphere® ODS, 4,5 mm«25 cm, detektálás: 220 nm-nél.

Izokratikus: 7% acetonitril/H2O-0,l% TFAk’-4,2.

Gradiens: A: acetonitril, Β: H2O-0,l% TFA, 1—50% A, időtartam: 20 perc, k’=6,5.

23. példa

N-d-Ac-Ciklű(S,S)Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-NH2 előállítása

Védett peptidgyanta közbenső terméket, N-a-AcCys(SEt)-Arg(Tos)-Gly-Asp(OCHx)-Cys(4-MBzl)MBHA-t előállítunk, hasítunk, ciklizálunk és izolálunk. Az eljárást az 1. példa szerinti módon 1,0 mmól léptékben végezzük.

A peptidet az ODS fordított fázisú kolonnáról 3% acetonitril/víz-0,1% TFA-val eluáljuk. így 280 mg (47%) cím szerinti terméket kapunk.

A terméket Sephadex® G-15 gélszűréssel tisztítjuk. Eluensként 0,2 mól/liter ecetsavat alkalmazunk.

A cím szerinti termék 95% tisztaságú.

Kromatográfiás adatok:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1),Rf-0,49, (B:A:W:P, 15:5:10:10), Rj-0,45.

2. HPLC: Altex Ultrasphere® ODS, 4,5 mm«25 cm, detektálás: 220 nm-nél.

Izokratikus: 3% acetonitril/H2O-0,l% TFA, k’-2,7

Gradiens: A: acetonitril, B: H₂O-0,l% TFA 1-50% A, időtartam: 20 perc, k’-5,0.

HU 205 368 Β

24. példa

N-a.-Ác-Ciklo(S,S')Cys-(Etí)Árg-Gly-Asp-Pen-NH-í előállítása

Védett peptidgyanta közbenső terméket, N’-a-AcCys(Et)-(Et₂)Arg-Gly-Asp(OCHx)-Pen-MBHA-t előállítunk, hasítunk, ciklizálunk és izolálunk, az eljárást az 1. példa szerinti módon 1,0 mmól léptékben végezzük. A pepiidet a kolonnáról 9% acetonitril/víz-0,1% TFA-val eluáljuk.

így 590 mg (87%) cím szerinti terméket kapunk.

A terméket Sephadex® G-15 gélszűréssel tisztítjuk, amelyhez eluensként 0,2 mól/liter ecetsavat alkalmazunk.

A cím szerinti termék 95% tisztaságú.

Fizikai adatok:

Összegképlet C26H4JN9O8S2

Molekulatömeg: 675,82

FAB: (M+H)⁺676,4-nél,

AAA: Asp (1,00), Gly (1,12),

Peptidtartalom: 51,77%

Kromatográfiás adatok:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R£=0,45, (B:A:W:P, 15:5:10:10), Rj-0,64.

2. HPLC: Altex Ultrasphere® ODS, 4,6 mm*25 cm, detektálás: 220 nm-nél.

Izokratikus: 9% acetonitril/H₂O-0,l% TFAk’=3,2.

Gradiens: A: acetonitril, B: H₂O-0,l% TFA, 5-50% A, időtartam: 20 perc, k’=4,2.

25. példa

N-O.-Ac-Ciklo(S,S)Cys-D-MeArg-Gly-Asp-Pert-NH₂ előállítása

Védett peptidgyanta közbenső terméket, N-a-AcCys(SEt)-D-MeArg(Tos)-Gly-Asp(OCHx)-PenMBHA-t előállítunk, hasítunk, ciklizálunk és izolálunk. Az eljárást az 1. példa szerinti módon 1,0 mmól léptékben végezzük.

Boc-D-MeArg(Tos)-t állítunk elő hasonló módon, mint amit a 4 6887 758 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban L- izomerre megadnak. A pepiidet a kolonnáról eluáljuk, eluensként 7% acetonitril/víz-0,1% TFA-t alkalmazunk. így 450 mg (71%) cím szerinti terméket alkalmazunk.

A terméket Sephadex® G-15 gélszűréssel tovább tisztítjuk, amelyhez eluensként 0,2 mól/liter ecetsavat alkalmazunk.

így megadjuk a cím szerinti terméket.

26. példa

N-a-Ác-N-a-MeÁrg-Gly-Asp-Ser-NHi előállítása

A védett peptidgyanta közbenső terméket, N-a-AcMeArg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(BzI)-BHA-t előállítjuk, az előállítást az 1. példa szerinti módon, szilárd fázisú módszerrel 0,5 mmól léptékben végezzük.

Hídrogén-fluoridos hasítás után és vízmentes éterrel történő mosatás után a pepiidet jeges ecetsavval extraháíjuk és Eofilizáljuk. Ily módon 75,8 mg (31%) terméket kapunk.

A terméket Sephadex® G-15 gélszűréssel tisztítjuk, amihez eluensként 0,2 mól/liter ecetsavat alkalmazunk.

A cím szerinti termék 96%-nál tisztább. A terméket három frakcióban eluáljuk és így 60,6 mg anyagot kapunk.

Fizikai adatok:

Összegképlet: Ci8H₃₂N₈0s

Molekulatömeg: 488,501

FAB: (M+HÁ 489,5

AAA: Asp (1,00), Ser (0,48), Gly (1,09)

Kromatográfiás adatok:

TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R£=0,25, (B:A:W:P, 15:5:10:10), Rf=0,31.

27. példa

N-a-Ac-Arg-Gly-Asp-Ser-NHz előállítása

A védett peptidgyanta közbenső terméket, a N-aAc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-BHA-t előállítjuk, hasítjuk és izoláljuk.

Az eljárást a 26. példa szerinti módon végezzük 0,5 mmól léptékben. Apeptidet CCD-vel tisztítjuk, amihez eluensként a következő elegyet alkalmazzuk: B:A:W“4:1:5. A végterméket négy frakcióban kapjuk meg, így 80,8 mg anyagot állítunk elő.

Fizikai adatok:

Összegképlet: CnHoNsOs

Molekulatömeg: 474,474

FAB: (M+H)⁺475

AAA: Asp (0,99), Ser (0,24), Gly (1,03), Arg (1,00)

Kromatográfiás adatok:

TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), Rf=0,2, (B:A:W:P, 15:5:10:10), Rf=0,49.

28. példa

N-a-Ac-Arg-Gly-Asp-Tyr-NHz előállítása

A védett peptidgyanta közbenső terméket, a N-a-AcArg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Tyr(Bzl)-BHA-t előállítjuk, hasítjuk és izoláljuk. Az eljárást a 27. példa szerinti módon 0,5 mmól léptékben végezzük. A terméket Sephadex® G-15 gélszűréssel tisztítjuk, amihez 0,2 mól/liter ecetsavat alkalmazunk.

142,1 mg cím szerinti terméket kapunk.

Fizikai adatok

Összegképlet: C23H24N8O8

Molekulatömeg; 550,57

FAB: (M+H/551

AAA: Asp (1,00), Gly (1,02), Tyr(1,00), Arg (0,90)

Kromatográfiás adatok:

TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), Rp-0,41, (B:A:W:P, 15:5:10:10), Rf=0,4.

29. példa

N-a-Ac-Arg-Gly-Asp-NFF_ előállítása

Védett peptidgyanta közbenső terméket, N-a-Ac20

HU 205 368 Β

Arg(NO₂)-Gly-Asp(OBzl)-BHA-t előállítunk, hasítjuk és izoláljuk.

Az eljárást a 27, példa szerinti módon 0,5 mmól léptékben végezzük. A terméket CCD-vel tisztítjuk, amihez eluensként B:A:W=4:l:5-öt alkalamzunk. A terméket négy frakcióban kapjuk meg.

Kitermelés: 98,6 mg.

A peptidet tovább tisztítjuk Sephadex® G-15 gélszűréssel, amihez eluensként 0,2 mól/liter ecetsavat alkalmazunk. Ily módon 65,7 mg néhány frakcióban felfogott cím szerinti peptidet kapunk.

. Fizikai adatok:

Összegképlet: C14H23N7O6

Molekulatömeg: 387,389

FAB: (M+H)⁺ 388

AAA: Asp (1,00), Gly (1,13), Arg (0,93)

Kromatográfiás adatok:

1LC:(B:A:W:E, l:l:l:l),Rf»0,2, (B:A:W:P, 15:5:10:10), Rf=0,44.

30. példa

N-a-Ac-Arg-Gty-Asp-D-Ser-NHi előállítása

A védett peptidgyanta közbenső terméket, N-a-AcArg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-D-Ser(Bzl)-BHA-t előállítjuk, hasítjuk és izoláljuk. Az eljárást a 27. példa szerinti módon, 1,0 mmól léptékben végezzük.

A terméket közepes nyomású ODS fordított fázisú kolonnán tisztítjuk, majd 0,5% acetonitril/H₂O-0,l% TFA-val eluáljuk.

A cím szerinti tennék tisztasága 95%. Kitermelés: 337 mg.

Fizikai adatok:

Összegképlet: CnHjoNsOg

Molekulatömeg: 474,464

FAB: (M+H)⁺ 475,3; (M-H)' 473,5

AAA: Asp (1,00), Ser (0,99), Gly (0,96), Arg (1,01)

Peptidtartalom: 44,8%

Kromatográfiás adatok:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1),Rf=0,3,

2. HPLC: Vydac 218 TP ODS kolonna,

4,6 mm*25 cm, detektálás: 220 nm-nél.

Gradiens: A: acetonitril, B: H₂O-0,l% TFA, 0-50% A, időtartam: 3Ó perc, k’=3,4.

31. példa

N-rx-Ac-Arg-Gly-Asp-Val-NHi előállítása

A védett peptidgyanta közbenső terméket, a N-aAc-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Val-MBHA-t előállítjuk, hasítjuk és izoláljuk.

Az eljárást^-a 27. példa szerinti módon végezzük 1,0 mmól léptékben.

A terméket közepes nyomású ODS fordított fázisú kolonnán tisztítjuk, amelyhez eluensként 15% metanol/víz-0,1% TFA-t alkalmazunk.

A cím szerinti tennék 95%-nál tisztább Kitermelés: 125 mg.

Fizikai adatok:

Összegképlet: C19H34N8O7

Molekulatömeg: 486,528

FAB: (M+H)⁺ 487,3; (M-H)· 485,9

AAA: Asp (1,00), Gly (0,99), Val (1,06), Arg (0,96)

Peptidtartalom: 79,6%

Kromatográfiás adatok:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1),Rf=0,43;

(B:W:IP:CA, 6,5:2:1,5:0,3), Rf=0,ll.

2. HPLC: Vydac 218 TP ODS kolonna,

4,6 mm«25 cm, detektálás: 220 nm-nél.

Izokratikus: 5% acetonitril/H₂O-0,l% TFA, k’=l,3.

Gradiens: A: acetonitril, B: H₂O-0,l% TFA, 6-50%, időtartam: 05 perc, k’=0,84.

32. példa

N-ct-Ac-Arg-Gly-Asp-Nal-NHi előállítása

A védett peptidgyanta közbenső terméket a N-a-AcArg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Nal-MBHA-t előállítjuk, hasítjuk és izoláljuk.

Az eljárást a 27. példa szerinti módon végezzük 1,0 mmól léptékben.

A terméket közepes nyomású ODS fordított fázisú kolonnán tisztítjuk és eluensként 40% metanol/víz0,1% TFA-t alkalmazunk.

A cím szerinti terméket 98%-nál tisztább. Kitermelés: 57 mg.

Fizikai adatok:

Összegképlet: C27H36N8O7

Molekulatömeg: 584,632

FAB: (M+H)⁺ 585,3; (M-H)’ 583,9

AAA: Asp (1,00), Gly (0,99), Arg és Nal együtt eluálódik

Peptidtartalom: 81,3%

Kromatográfiás adatok:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1),Rf=0,60, (B:W:IP:CA, 6,5:2:1,5:0,3), Rf=0,23.

2. HPLC: Vydac 218 TP ODS kolonna,

4,6 mm«25 cm, ' detektálás: 220 nm-en.

Izokratikus: 18% acetonitril/H₂O-0,l% TFAk’-l,2.

Gradiens: A: acetonitril, B: H₂O-0,l% TFA, 15-50% A, időtartam: 15 perc, k’=2,l.

33. példa

N-a-Ac-Arg-Gly-Asp-Phe-NHí előállítása

A védett peptidgyanta közbenső terméket, N-a-AcArg(Tos)-Arg(Tos)-Gly-Asp(OCHx)-Phe-BHA-t előállítjuk, hasítjuk és izoláljuk.

Az eljárást a 27. példa szerinti módon végezzük, 1,0 mmól léptékben. A terméket közepes nyomású ODS fordított fázisú kolonnán kromatográfiásan tisztítjuk. Eluensként 8% acetonitril/H₂O-0,l% TFA-t alkalmazunk.

HU 205 368 Β

A cím szerinti tennék 98% tisztaságú. Kitermelés: 303,4 mg.

Fizikai adatok:

Összegképlet CmH^NüOs

Molekulatömeg: 690,356

FAB: (Μ+Η)⁺691; (M-H)’ 690

AAA; Asp (1,00), Gly (1,00), Phe (0,91), Arg (1,89)

Peptidtartalom: 56,3%

Kromatográfiás adatok:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), Re=0,4, (B:A:W:P, 15:3:8:10), Rf=0,4„

2. HPLC: Ultrasphere® ODS, 4,6 mm*25 cm, detektálás; 220 nm-nél.

Izokratikus; 10% acetonitril/H₂O-0,l% TFA k’=2,78.

Gradiens: A: acetonitril, B: H₂O-0,l% TEA, 10-50% A, időtartam: 20 perc, k’=2,8.

34. példa

N-a-Ac-Arg-Gly-Asp-NH-CHz-CHz-Ph, előállítása

a) Boc-Asp(OBzl)-Ntí-(CH₂)zPh előállítása ml vízmentes tetrahidrofuránban feloldunk Nmetil-morfolint (15,5 mmól), és Boc-Asp(OBzl)-t (5,0 g, 15,5 mmól), és az oldatot állandóan keverjük, majd ehhez adunk -15 °C hőmérsékleten argongáz-atmoszférában 15,5 mmól izobutil-kloroformátot. 5 perc múlva a reakcióelegyhez adunk 15 ml vízmentes tetrahidrofuránban oldott 2,0 ml (15,5 mmól) fenetil-amint. Areakcióelegyet 15 percig -15 °C hőmérsékleten tartjuk, majd hagyjuk, hogy az elegy hőmérséklete szobahőmérsékletre emelkedjen. Ezután további 2 órán keresztül keveqük az elegyet és leszűrjük, a szűrietet vákuumban szárazra pároljuk. A kapott maradékot 100 ml etil-acetátban feloldjuk, és ezután 1 mól/liter sósavoldattal (2*50 ml) és vízzel (50 ml), majd 10% nátriumkarbonát-oldattal (2*50 ml), végül sóoldattal (50 ml) mossuk. A szerves fázist nátrium-szulfát felett víztelenítjük, szűrjük, és betöményítjük. így 5,59 mg (85%) amorf fehér szilárd anyagot kapunk.

b) Boc-Gly-Asp(OBzl)-NH-(CHf^P'n előállítása

A 12/a) példában kapott pepiidről (4,18 g, 12,8 mmól) a Boc védőcsoportot vízmentes TFA-val (10 ml/g) szobahőmérsékleten 30 perc alatt lehasítjuk. A TFA-t vákuumban eltávolítjuk, és a maradék TFA-t tömegméréssel meghatározzuk. A szabad aminhoz Boc-Gly-t (2,24 mg,

12.8 mmól) kapcsolunk, ezt a 12. a) példában megadott módszerrel végezzük. A terméket szilikagélkolonnán kromatográfiásan tisztítjuk, eluensként etil-acetát és hexán 3:1 arányú elegyét alkalmazzuk. így 3,35 g (54%) világossárga üveges anyagot kapunk.

c) Boc-Arg(Tos)-Gly-Asp( OBzl)-NH-( CHf^Ph előállítása

A 12. b) példa szerint kapott peptidről (2,61 g,

6.8 mmól) aBoc védócsoportot eltávolítjuk, és az így kapott dipeptidet a 12. b) példa szerinti módon BocArg(Tos)-szal (3,4g, 6,8 mól) kapcsoljuk. Aterméketszilikagélkolonnán kromatográfiásan tisztítjuk, és eluensként etil-acetát és izopropanol 1:1 arányú elegyét alkalmazzuk. 3,41 g (63%) fehér üveges anyagot kapunk.

d) Ac-Arg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)NH-(CH₂)₂Ph előállítása

A 12. c) példa szerint kapott peptidről a védőcsőportót a 12. b) példa szerinti módon lehasítjuk. A szabad bázist (2,92 g, 4,2 mmól) és az ecetsavanhidridet (2,0 ml, 21,2 mmól) 30 ml dimetil-forrnamidban feloldjuk, és 0,73 ml (4,2 mmól) diizopropil-etil-aminnal kezeljük. A reakcióelegyet 30 percig keverjük, és vákuumban szárazra pároljuk. A maradékot szilikagélkolonnán kromatográfiásan tisztítjuk. Eluens: etil-acetát: izopropanol 1:1 arányú elegye.

Kitermelés: 2,94 g (95%) fehér üveges anyag.

e) Ác-Arg-Gly-Ásp-NH-fCHf’jPh előállítása

2,5 g, a 12. d) példa szerint előállított védett peptidet és 2,5 ml ánizs-aldehidet vízmentes hidrogén-fluoriddal (25 ml) kezelünk 0 °C hőmérsékleten, 30 percig. A hidrogén-fluoridot elpárologtatjuk, és a peptid-ánizs-alkoholos elegyet 1 mól/liter ecetsavval kezeljük (3·50 ml), és a vizes elegyet vízmentes éterrel (3*100 ml) mossuk. A vizes extraktumot liofilizáljuk, így 1,52 g terméket kapunk. A terméket ODS kolonnán tisztítjuk, eluens: 40% metanol/H₂-0,l% TFA. A cím szerinti peptid 97% tisztaságú.

Kitermelés: 326 mg.

Fizikai adatok:

Összegképlet: C22H33N7O6

Molekulatömeg: 491,547

FAB: (M+H)* 492,1; (M-H)'490,6

AAA: Asp (0,51), Gly (0,99), Arg (1,00)

Peptidtartalom: 81,2%

Kromatográfiás adatok:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), Rf=0,58, (B:W:1P:CA, 6,5:2:1,5:0,3), Rf=0,17.

2. HPLC; Vydac 218 TP ODS kolonna,

4,6 mm«25 cm, detektálás: 220 nm-nél.

Izokratikus: 12% acetonitril/H₂O-0,l%TFAk’=2,3.

Gradiens: A: acetonitril, Β:Ή2θ-0,1% TFA, 10-50% A, időtartam: 25 perc, k’=2,2.

5.példa

N-ct-Ac-MeArg-Gly-Asp-Phe-NHx előállítása

A védett peptidgyanta közbenső terméket, N-a-AcMeArg(Tos)-Gly-Asp-Phe-BHA-t előállítjuk, hasítjuk, izoláljuk, és a 26. példa szerinti módon tisztítjuk, így a cím szerinti peptidet előállítjuk.

Fizikai adatok:

Összegképlet: C24H36N8O7

Molekulatömeg: 548,270

FAB: (M+H)⁺ 549,2, (M-H)' 547,8

AAA: Asp (1,00), Gly (1,00), Phe (1,05), MeArg (1,18)

HU 205 368 Β

Kromatográfiás adatok:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), Rf=0,52, (B:A:W:P, 15:3:8:10), R^O,46.

2. HPLC: Ultrasphere® ODS, 4,6 mm*25 cm, detektálás: 220 nm-nél.

Izokratikus: 10% acetonitril/H2O-0,l% TFA k’=3,43.

Gradiens: A: acetonitril, Β: H2O-0,l% TFA, 10-50% A, időtartam: 20 perc, k’=3,6.

36. példa

N-a-Ac-HArg-Gly-Asp-Ser-Nfh előállítása

A védett peptidgyanta közbenső terméket, a N-aAc-Lys(Clz)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-BHA-t előállítjuk, hasítjuk és izoláljuk.

Az eljárást a 26. példa szerinti módon végezzük. így N-a-Ac-Lys-Gly-Asp-Ser-NH2-t kapunk.

100 mg, 0,197 mmól peptidet feloldunk 2 ml karbonátpufferban (pH=10,5), és az oldathoz adunk 0,1 mól/liter NaOH-oldatban (1 ml, 4 mól/liter NaOH-oldattal pH=ll-re beállított oldat) oldott O-metil-izourea-hidrogén-szulfátot (0,34 g, 1,97 mmól).

A reakcióelegyet egy éjszakán keresztül szobahőmérsékleten állni hagyjuk, majd a reakcióelegyet kétszer kromatografáljuk (Sephadex® G-10, vízben duzzasztott, eluálás: 0,1 mól/liter vizes ecetsavval történik), és a tisztított peptidet liofilizáljuk.

Ily módon 48 mg cím szerinti peptideket kapunk.

Fizikai adatok:

Összegképlet: Cis^NgOg

Molekulatömeg: 488,50

FAB: (M+H)⁺ 489,2, (M-H)' 487,7

AAA: Asp (1,00), Ser (0,97), Gly (0,99), Cys (0,21), HArg (0,88)

Kromatográfiás adatok:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), Rf=0,33, (B:W:IP:CA, 6,5:2:1,5:3), Rf=0,04.

2. HPLC: Altex Ultrasphere® ODS, 4,5 mm«25 cm, detektálás: 220 nm-en.

Izokratikus: 3% acetonitril/H2O-0,l% TFAk’=0,8.

Gradiens: A: acetonitril, B: ^0-0,1% TFA, 0-50% A, időtartam: 15 perc, k’=2,l.

37. példa

N-a-MeArg-GLy-Asp-Ser-NHi előállítása

A védett peptidgyanta közbenső terméket, a MeArg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-BHA-t előállítjuk és hasítjuk.

Az eljárást a 26. példa szerinti módon végezzük, azzal a különbséggel, hogy az acetilezési lépést kihagyjuk.

A szabad peptidet a 26. példa szerinti módon tisztítjuk.

A cím szerinti vegyületet előállítjuk.

Fizikai adatok:

Összegképlet: C16H30N8O7

Molekulatömeg: 446,22

FAB: (M+H)⁺ 447,2, (M-H)' 445,6

AAA: Asp (1,00), Ser (0,95), Gly (1,00), MeArg (1,00)

Peptidtartalom: 76,74%

Kromatográfiás adatok:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), Rí=0,26, (B:A:W:P, 15:5:10:10), Rf=0,31.

2. HPLC: Ultrasphere® ODS, 4,6 mm*25 cm, detektálás: 220 nm-nél.

Izokratikus: H2O-0,1% TFA k’=0,66.

Gradiens: A: acetonitril, B: H2O-0,l% TFA, 0-50% A, időtartam: 20 perc, k’=0,64.

38. példa

N-a-Formil-MeArg-Gly-Asp-Ser-NHi előállítása

A védett peptid közbenső terméket, a MeArg(Tos)Gly-Asp(OBzl)-Ser(Bzl)-BHA-t tisztítjuk.

Az eljárást szokásos módon végezzük 0,5 mmól léptékben.

A terminális aminocsoportot hidrogén-fluoriddal szabaddá tesszük (védőcsoportot eltávolítjuk), a gyantához kötött peptidet a következő eleggyel kezeljük: hangyasav (98%, 7 ml)+ecetsavanhidrid (1 ml).

Ezután a peptidet a gyantáról lehasítjuk, így megkapjuk a cím szerinti peptidet.

Fizikai adatok:

Összegképlet: CnHaoNgOg

Molekulatömeg: 474,219

AAA: Asp (1,00), Ser (0,97), Gly (0,98),

Peptidtartalom: 78,15%

Kromatográfiás adatok:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1),Rj-0,37, (B:A:W:P, 15:5:10:10), Rf=0,34.

2. HPLC: Ultrasphere® ODS, 4,6 mm«25 cm, detektálás: 220 nm-en.

Izokratikus: 1% acetonitril/H₂O-0,l% TFA k’=2,02, 2,69 (cisz/transz N-formil-izomerek).

Gradiens: A: acetonitril, Β: H2O-0,l% TFA, 0-50% A, időtartam: 20 perc, k’=2,17.

39. példa

Gly-MeArg-Gly-Asp-Ser-NHi előállítása

A védett peptidgyanta közbenső terméket a BocGly-MeArg(Tos)-Asp(OCHx)-Ser(Bzl)-BHA-t előállítjuk, hasítjuk.

Az eljárást a 26. példa szerinti módon végezzük.

A szabad peptidet közepes nyomású ODS fordított fázisú kolonnán kromatográfiásan tisztítjuk. Eluensként 1% acetonitril/HíO- 0,1% TFA-t alkalmazunk.

A terméket négy frakcióban kapjuk meg. A cím szerinti peptid tisztább, mint 95%.

Kitermelés: 406 mg (80%).

Fizikai adatok:

Összegképlet: C18H33N9O8

Molekulatömeg: 503,245

FAB: (M+H)⁺ 504, (M-H)' 502

HU 205 368 Β

AAA: Asp (1,00), Ser (0,94), Gly (1,96), N-MeArg (0,98)

Peptidtartalom: 69,97%

Kromatográfiás adatok:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), Rf=0,29,

2. HPLC: Altex Ultrasphere® ODS, 4,5 mm*25 cm, detektálás: 220 nm-nél.

Izokratikus: 1% acetonitri]/H20-0,l%TFAk’=l,07.

Gradiens: A: acetonitril, Β: H2O-0,l% TFA, 0-50% A, időtartam: 20 perc, k’=2,35.

40. példa

Ála-MeArg-Gly-Ásp-Ser-NPE. előállítása

A védett peptidgyanta közbenső terméket, az AlaMeArg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Ser(BzI)-BHA-t előállítjuk. Az előállítása a 26. példa szerinti módon történik, azzal az eltéréssel, hogy az acetilezést kihagyjuk.

A lineáris peptidet a gyantáról hidrogén-fluoriddal szokásos módon lehasítjuk, így megkapjuk a cím szerinti peptidet.

41. példa

N-a-Ac-Ala-Arg-Gly-Asp-OCHi előállítása

Boc-Asp-OMe-t kapcsolunk céziumsós módszerrel klőr-metil-gyantához, így előállítjuk a Boc-Asp(Obenzil-gyanta)-OMe-t, amelyben az aszpartámsav a gyantához van kötve a karboxilcsoport oldalláncon keresztül. A következő aminosavak mindegyikéből 3 ekvivalensnyit feloldunk dimetil-formamidban: Boc-Gly, Boc-Arg(Tos) és Boc-Ala; majd ezeket szekvenciálisán kapcsoljuk ekvimoláris mennyiségű diciklohexil-karbodiimid és 1-hidroxi-benztriazol felhasználásával. A kötés mértékét egy alikvot mennyiségből történő ninhidrines analízissel kvalitatívan meghatározzuk, és ha szükséges a kötéskapcsolást megismételjük.

A Boc csoportot eltávolítjuk trifluor-ecetsav/metilén-klorid 1:1 arányú elegyével, majd metilén-kloriddal mossuk, és 5%-os diizopropil-etil-amin/metilénklorid felhasználással szabad amint kapunk.

Az utolsó kapcsolás után, és a Boc csoport eltávolítása után a peptid/gyantát dimetil-formamiddal és metilén-kloriddal mossuk, majd szárítjuk. A peptidet ecetsavanhidrid (10 ekvivalens) és diizopropil-etil-amin (10 ekvivalens) elegyével acetilezzük. A pepiidről a védócsoportokat eltávolítjuk, és a gyantáról ánizs-alkohol jelenlétében hidrogén-fluoriddal 0 °C hőmérsékleten 1 óra alatt lehasítjuk.

A hidrogén-fluoridot 0 °C hőmérsékleten elpárologtatjuk, a maradékot dietil-éterrel (négyszer) mossuk, és fordított fázisú HPLC-vel tisztítjuk, így a cím szerinti peptidet kapjuk.

42. példa

N-o.-Ác-Ciklo(S,S)Cys-Abu-Arg-Gly-Asp-Pen-NH2 előállítása

A védett peptidgyanta közbenső terméket, a N-aAc-Cys(SEt)-Abu-Ajg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Pen(4MBzl)-MBHA-t előállítjuk, lehasítjuk, ciklizáljuk és izoláljuk.

Az eljárást a 3. példa szerinti módon végezzük. A peptidet közepes nyomású ODS fordított fázisú kolonnán kromatográfiásan tisztítjuk, és előállítjuk a cím szerinti vegyületet.

43. példa

N-et-Ac-Ciklo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Cys-OCH3

a) HiN-Asp(O-benzil-gyanta)-Cys(4-MeBzl)-OCH3 előállítása

Dimetil-formamidban H2N’-Cys(4-MBzl)-OMe-t kapcsolunk 3 ekvivalensnyi Fmoc-Asp(4-tBuO)-val. A kapcsoláshoz 3 ekvivalensnyi 1-HOBT-t és 3 ekvivalensnyi diciklohexil-karbodiimidet használunk.

óra múlva dimetil-formamidot vákuumban elpárologtatjuk, és a maradékot etil-acetáttal összekeverjük és szűrjük. A szűrletet 5%-os vizes nátrium-bikarhonátoldattal és vízzel mossuk. A szerves fázist magnéziumszulfáton víztelenítjük, szűrjük és az oldószert vákuumban eltávolítjuk.

A védett dipeptidet szilikagél-kromatográfiásan tovább tisztítjuk.

Fmoc-Asp(4-tBuO)-Cys(4-MBzl)-OMe-t kezelünk 50%-os TFA/metilén-kloriddal 0 °C hőmérsékleten 1 órán keresztül, majd az oldószert vákuumban elpárologtatjuk. A maradékot metilén-kloridban feloldjuk, vízzel háromszor mossuk és a szerves fázist rövid ideig magnézium-szulfát felett víztelenítjük. Az elegyet szűrjük és az oldószert elpárologtatjuk. így Fmoc-AspCys(4-MBzl)-OMe-t kapunk.

A dipeptid szabad karboxilcsoportját klór-metilgyantához kötjük céziumsós módszerrel, a módszert a Gisin és munkatársai Helv. Chim. Acta, 56, 1476 (1973) irodalmi helyen ismertetik.

A gyantán kötött dipeptidet dimetil-formamidban készített 20%-os piperídinnel kezeljük (3*10 perc). A gyantát háromszor mossuk dimetil-formamiddal, és így megkapjuk a cím szerinti gyantához kötött dipeptidet.

b) N-a,-Acetil-Ciklo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Cys-OCff előállítása

A 43. a) példa szerint kapott gyantához kötött dipeptidet szekvenciálisán Boc-Gly, Boc-MeArg(Tos) és Boc-Cys(SEt)-hez kapcsoljuk, acetilezzük, a gyantáról lehasítjuk, az 1. példa szerinti módon ciklizáljuk. A cím szerinti peptidet fordított fázisú HPLC-vel végzett tisztítással állítjuk elő.

44. példa

N-a.-Acetil-Ciklo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Cys-NHEt előállítása

a) HiN-Cys(4-MBzl)-NHE-t előállítása

Boc-Cys(4-MBzl)-OCH3-ot feloldunk metanolban, az oldatot 0 °C hőmérsékletre hűtjük, és 1 térfogat etil-amint (0 °C-ra hűtött) adunk hozzá.

A reakcióelegyet erősen lezárjuk és szobahőmérsékleten 8 napon keresztül keverjük. A reakcióelelgyet ismét 10 °C-ra hűtjük, levegőztetjük, és az oldószert vákuumban elpárologtatjuk. A maradékot metilén-kloridban feloldjuk, 1 térfogatnyi TFA-val kezeljük, és 1 órán át szobahőmérsékleten keverjük.

HU 205 368 Β

A cím szerinti etil-amidot gélkromatográfiás tisztítással állítjuk elő.

H₂N-Asp(O-benzil-gyanta)-Cys(4-MBzl)-NHEt előállítása

b) A 44. a) példa szerint előállított etil-amidot a 21.

a) példa szerinti módon H₂N-(4-MBzl)Cys-OMe-vel helyettesítjük, Fmoc-Asp(4-tBuO)-hoz kapcsoljuk, majd klór-metil-gyantához kötjük, és a szabad amint előállítjuk, így megkapjuk a cím szerinti vegyületet.

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Cys-NHEt előállítása

c) A 44. b) példa szerint előállított gyantához kötött dipeptidet szekvenciálisán a következő fragmensekhez kötjük: Boc-Gly, Boc- MeArg(Tos) és Boc-Cys(SEt). A terméket acetilezzük, a gyantáról lehasítjuk és ciklizáljuk. Az eljárást az 1. példa szerinti módon végezzük.

A cím szerinti pentapeptidet fordított fázisú HPLCvel végzett tisztítás után előállítjuk.

45. példa

A 15. c) példa szerinti módszerrel Boc-Pen(4MBzl)-t kapcsolunk hidroxi-metil-gyantához (1% keresztkötés, 1 g, 1 mmól) és ehhez 4-pirrolidino-piridin (0,15 g, 1 mmól) és DCC-t (620 mg, 3 mmól) metilénkloridban alkalmazunk. Az 1. példa szerinti eljárással Boc-Asp(OBzl)-t, Boc-Gly-t, Boc-MeArg(Tos)-t és Boc-Cys(SEt)-t kapcsolunk, acetilezzük, és hidrogénfluoriddal kezeljük, majd ciklizálással a következő vegyületeket kapjuk:

a) N-a.-Ac-Ciklo(S,S)Cys-MeArg-Asp-Pen-OH

Fizikai jellemzők:

Összegképlet: C₂3H38NsO9S₂

Molekulatömeg: 634,72

FAB (M+H)⁺ 635,3

Aminosav-analízis: Asp (1,00), Gly (1,02), Cys+Pen (1,92)

Peptidtartalom: 85,26%

Kromatográfiás jellemzők:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), R_{=0,54, (B:A:W:P, 15:5:10:10), Rf=0,53.

2. HPLC: Beckman Ultrasphere ODS-oszlop 5 μ,

4,5 mni’25 cm, detektálás 220 nm-nél.

Gradiens: 10-50% acetonitril 0,1% vizes tetrahidrofuránban, 20 perc alatt, k’=4,27.

Hasonló eljárást alkalmazva, de elhagyva az 1. példa szerinti acetilezési lépést, kapjuk a szabad aminovegyületet,

b) Ciklo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-OH

Fizikai jellemzők:

Összegképlet: C₂iH38N₈O8S₂

Molekulatömeg: 592,69

FAB (M+H)⁺ 593,1

Aminosav-analízis: Asp (1,00), Gly (1,05)

Peptidtartalom: 86,85%

Kromatográfiás jellemzők:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1),Rf-0,39, (B:A:W:P, 15:5:10:10), Rf=0,43.

2. HPLC: Beckman Ultrasphere ODS-oszlop 5 μ,

4,5 ιηιη·25 cm, detektálás 220 nm-nél.

Gradiens: 10-50% acetonitril, 0,1% vizes tetrahidrofuránban, 20 perc alatt, k’=3,52.

46. példa

Parenterális egységdózis-készítmény mg, az 1. vagy 2. példa szerint előállított pepüdet alkalmazzuk steril száraz por formájú készítmény előállításához: 20 mg pepiidet feloldunk 15 ml desztillált vízben. Az oldatot szűrjük, steril körülmények között, és 25 ml-es többdózisos ampullákba töltjük, majd liofilizáljuk. A port ismét oldattá alakíthatjuk, ha 20 ml 5%-os intravénás vagy intramuszkuláris injektálásra alkalmas vízben oldott dextrózt (D5W) adunk hozzá. A dózist az injektálási térfogat határozza meg. További hígítás is lehetséges, ha az egységdózis előre kiszámított térfogatát egy újabb térfogatinjektálásra alkalmas D5W-hez adjuk, vagy ha előre kiszámított dózist adunk egy másik, gyógyszerelosztásra alkalmas mechanizmusba, így például üvegbe vagy csöpögtető infúziós zacskóba, vagy egyéb injekcióinfúziós rendszerbe.

47. példa

Orális egységdózis-készítmény

Orális alkalmazásra megfelelő kapszulát készítünk, ha 50 mg pepiidet 75 ml laktózzal és 5 mg magnéziumsztearáttal összekeverünk és megőrlünk. Az így kapott port szitáljuk és kemény zselatinkapszulába töltjük.

48. példa

Orális egységdózis-készítmény

Orális alkalmazásra megfelelő tablettát állítunk elő, ha 20 mg szukrózt, 150 mg kalcium-szulfát-dihidrátot és pepiidet 10% zselatinoldattal összekeverünk és granulálunk. A nedves granulátumot szitáljuk, szárítjuk, 10 mg keményítővel, 5 mg talkummal és 3 mg sztearinsavval összekeverjük, majd tablettává préseljük.

49. példa

Az 1. példában leírtakkal analóg módon dolgozunk a megfelelő aminosavak felhasználásával és állítjuk elő a következő peptideket:

a)N-a.-Ac-Ciklo(S,S)Pen-Gly-Arg-Gly-Asp-Cysnh₂

Fizikai adatok:

Összegképlet: C24H40N10O9S2

Molekulatömeg: 676,76

FAB: (M+H)⁺ 677,1

Aminosav-analízis: Asp (1,00), Gly (1,56), Cys+Pen (1,47), Arg (1,01)

Peptidtartalom: 77,5%

Kromatográfiás jellemzők:

l.TLC: (B:A:W:E, l:l:l:l),Rr-0,45,

HU 205 368 Β (B:W:IP:CA, 6,5:2:1,5:0,3), Μ,15.

2. HPLC: Vydac 218 TP ODS-oszlop 5 μ,

4,6 mm«25 cm, detektálás: 220 nm-nél.

Gradiens: 0-50% acetonitril 0,1% vizes TFA-ban 15 perc alatt, k’=2,8.

Izokratikus: 7% acetonitril 0,1% vizes TFA-ban, k’=2,7.

b) N-&-Ac-Ciklo(S,S)Cys-His-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂

Fizikai adatok:

Összegképlet: C29H46N12O9S2 Molekulatömeg: 770,88 FAB: (M+H)⁺ 771,2

Aminosav-analízis: Asp (1,00), Gly+Arg (1,83), His (0,70)

Peptidtartalom: 83%

Kromatográfiás jellemzők:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), Rf=0,34, (B:W:IP:CA, 6,5:2:1,5:0,3), Rf=0,12.

2. HPLC: Vydac 218 TP ODS-oszlop 5 μ,

4,6mm*25 cm, detektálás: 220 nm-nél.

Gradiens: 0-50% acetonitril 0,1% vizes TFA-ban, 15 perc alatt, k’=4,0.

Izokratikus: 10% acetonitril 0,1% vizes TFA-ban, k’=2,3.

c) N-&-Ac-Ciklo(S,S)Cys-(a-Bzl)Arg-Gly~ Asp-Pen-NH₂

Fizikai adatok:

Összegképlet: C29H43N9O8S2 Molekulatömeg: 709,84 FAB: (M+HT 710,5

Aminosav-analízis: Asp (1,00), Gly (1,07) Peptidtartalom: 74%

Kromatográfiás jellemzők:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), Rf=0,74, (B:A:W:P, 15:5:10:10),Rf=0,73.

2. HPLC: Beckman Ultrasphere ODS-oszlop 5 μ,

4,5 mm«25 cm, detektálás 220 nm-nél.

Gradiens: 1-50% acetonitril 0,1% vizes TFA-ban 20 perc alatt, k’-3.

Izokratikus: 15% acetonitril 0,1% vizes TFA-ban, k’-8,4.

d) N-&-Ac-Ciklo(S,S)Cys-Arg-Gly-Asp-Trp-Cys-^2.

Fizikai adatok:

Összegképlet: C33H47NUO9S2 Molekulatömeg: 805,92 FAB: (M+H)⁺ 806,2

Aminosav-analízis: Asp (0,74), Gly (1,3), Arg (1,00), Trp (0,74)

Peptidtartalom: 60%

Kromatográfiás jellemzők:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), Rf-0,71, (B:W:EP:CA, 6,5:2:1,5:0,3), Rf=0.

2. HPLC: Vydac 218 TP ODS-oszlop 5 μ,

4,6 mm«25 cm, detektálás 220 nm-nél.

Gradiens: 0-50% acetonitril 0,1% vizes TFA-ban 15 perc alatt, k’=4,9.

Izokratikus: 15% acetonitril 0,1% vizes TFA-ban, k’=2,5.

50. példa

A 14. példában leírtak szerint dolgozunk, azzal az eltéréssel, hogy ecetsavanhidrid helyett benzoil-kloridot használunk és állítjuk elő a következő^- vegyületeket:

a) N-a-Benzoil-Ciklo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂

Fizikai adatok:

Összegképlet: C28H44N9O8S2

Molekulatömeg: 695,81

FAB: (M+H)* 696,3

Aminosav-analízis: Asp (1,00), Gly (0,97), Cys+Pen (1,38)

Peptidtartalom: 89,39%

Kromatográfiás jellemzők:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), Rf-0,67, (B:A:W:P, 15:5:10:10), Rf-0,61.

2. HPLC: Beckman Ultrasphere ODS-oszlop 5 μ,

4,5 mm*25 cm, detektálás 220 nm-nél.

Gradiens: 10-50% acetonitril 0,1% vizes TFA-ban 20 perc alatt, k’-7,3.

Az intermedier peptidet fenil-ecetsavval vagy pentánsavval acilezzük és ecetsavanhidrid/diizopropil-etilamin helyett DCC/HOBT elegyet használunk és állítjuk elő a következő peptideket:

b) N-a-Feni.l-acetil-Ciklo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH^

Fizikai adatok:

Összegképlet: C29H43N9O8S2

Molekulatömeg: 709,84

FAB: (M+Hf 710,2

Aminosav-analízis: Asp (1,00), Gly (1,01), Cys+Pen (2,01)

Peptidtartalom: 64,92%

Kromatográfiás jellemzők:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1), Rf-0,7, (B:A:W:P, 15:5:10:10), Rf=0,66.

2. HPLC: Beckman Ultrasphere ODS-oszlop 5 μ,

4,5 mm«25 cm, detektálás 220 nm-nél.

Gradiens: 10-50% acetonitril 0,1% vizes TFA-ban 20 perc alatt, k’-5.

HU 205 368 Β

c)N-&-Butanoil-Ciklo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂

Fizikai adatok:

Összegképlet: C26H₄₃N₉O₈S2 Molekulatömeg: 661,79 FAB: (M+H)⁺662,3

Aminosav-analízis: Asp (1,00), Gly (0,97), Cys+Pen (1.99)

Peptidtartalom: 82,97%

Kromatográfiás jellemzők:

1. TLC: (B:A:W:E, 1:1:1:1),Rf=0,63, (B:A:W:P, 15:5:10:10), Rf=0,60.

2. HPLC: Beckman Ultrasphere ODS-oszlop 5 μ,

4,5 mm*25 cm, detektálás 220 nm-nél.

Gradiens: 10-50% acetonitril 0,1% vizes TFA-ban 20 perc alatt, k’=3.

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Eljárás az (I) vagy (Π) általános képletú peptidek és ezek gyógyászatilag elfogadható sóinak előállítására - a képletben

A jelentése Gly, Alá;

B jelentése Arg, HArg vagy ezeknek α-R’- helyettesített származéka;

C jelentése D vagy L alakú, Tyr, Phe, Ser, Val vagy

Nal; HPhe, Phg, Thr, Alá, Nva, Leu, Ile, Nle,

Y jelentése NR1R2;

Rí és R2 jelentése H, Ci_g alkilcsoport vagy (CH2)_pPh;

X jelentése R4R5N;

R₄ jelentése H vagy alkilcsoport,

Rs jelentése H, HCO, C1-6 alkil-CO; C1-6 alkilcsoport; R’jelentése C1-4 alkilcsoport; m és n értéke 0 vagy 1; és p értéke 1,2 vagy 3,

A’jelentése Gly, vagy ennek α-R’-helyettesített származéka; vagy His

B’jelentése D vagy L alakú Arg, vagy ezeknek a-R’helyettesített származéka, HArg, (Et2)Arg vagy Lys, vagy a-benzil-Arg,

C’jelentése Tyr, Trp, Ser, Thr vagy utóbbi kettő aR’-helyettesített származéka;

Y jelentése NR1R2, vagy ha B jelentése Arg a-R’-helyettesített származéka, akkor jelentése OH;

Rí és R2 jelentése hidrogénatom vagy C1-6 alkilcsoport; X jelentése R4R5N vagy H;

R₄ jelentése H vagy C1-6 alkilcsoport,

R5 jelentése H, Ci_e alkil-CO vagy Ph(CH₂)qCO;

R’ jelentése Ci-4 alkilcsoport;

Zi jelentése Cys, Pen vagy APmp D- vagy L-izomerje; q, m és n egymástól függetlenül 0 vagy 1 azzal jellemezve, hogy

a) a védett aminosavakat kapcsoljuk, így megfelelően védett (la) általános képletú peptidet kapunk - a képletben X, Y, B, C, m és n jelentése a tárgyi körben megadott, és (Y”) jelentése klór-metil-, benzhidril-amin- vagy metil-benzhidril-amin-gyanta, vagy jelentése Y, melynek jelentése a tárgyi körben megadott; majd a védőcsoportot eltávolítjuk, és ha szükséges, a peptidet a gyantáról lehasítjuk, és kívánt esetben gyógyászatilag elfogadható sót állítunk elő,

b) egy adott esetben védett (Ha) általános képletú peptidet - a képletben

X, Zi, A’, B’, C’, Z2, m és n jelentése a tárgyi körben megadott, és

T¹ és T² jelentése hidrogénatom vagy kilépőcsoport, (Y”) jelentése klór-metil-, benzhidril-amm- vagy metil- benzhidril-amin-gyanta, vagy jelentése Y, melynek jelentése a tárgyi körben megadott - bázissal ciklizálunk, majd a védőcsoportokat eltávolítjuk, és ha szükséges, a peptidet a gyantáról lehasítjuk, és kívánt esetben gyógyászatilag elfogadható sót állítunk elő, vagy

c) egy adott esetben védett (Ilb) általános képletú peptidet - a képletben

X, Zi, A’, B’, C’, Z2, m és n jelentése a tárgyi körben megadott;

(Y”) jelentése klór-metil-, benzhidril-amin- vagy metil- benzhidril-amin-gyanta, vagy jelentése Y, melynek jelentése a tárgyi körben megadott, oxidációval ciklizálunk; majd a védőcsoportokat eltávolítjuk, és ha szükséges, a peptidet a gyantáról lehasítjuk, és kívánt esetben gyógyászatilag elfogadható sót állítunk elő.

(Elsőbbsége: 1989.04.10.)
2. Az 1. igénypont szerinti a) eljárás az (I) általános képletú peptidek és ezek gyógyászatilag elfogadható sóinak előállítására - a képletben

A jelentése Alá,

B jelentése Arg, HArg vagy ezeknek a-helyettesített származéka;

C jelentése D vagy L alakú, Tyr, Phe, Ser, Val vagy

Nal; HPhe, Phg, Thr, Alá, Nva, Leu, Ile, Nle,

Y jelentése NR1R2;

Rí és R2 jelentése H, C1-6 alkilcsoport vagy (CH₂)_pPh;

X jelentése R+RjN;

R₄ jelentése H vagy C1-6 alkilcsoport;

R₅ jelentése H, HCO, C^ alkil-CO; Ci_e alkilcsoport; R’jelentése Ci_4 alkilcsoport; m és n értéke 0 vagy 1; és p értéke 1, 2 vagy 3azzal jellemezve, hogy a védett aminosavakat kapcsoljuk, így megfelelően védett (la) általános képletú peptidet kapunk - a képletben X, A, B, C, m és n jelentése a tárgyi körben megadott, és (Y”) jelentése klór-metil-, benzhidrilamin- vagy metil-benzhidril-amin-gyanta, vagy jelentése Y, melynek jelentése a tárgyi körben megadott; majd a védőcsoportot eltávolítjuk, és ha szükséges, a pepiidet a gyantáról lehasítjuk, és kívánt esetben gyógyászatilag elfogadható sót állítunk elő.

(Elsőbbsége: 1988.05.09.)
3. Az 1. igénypont szerinti b) vagy c) eljárás a (Π) általános képletű peptidek és ezek gyógyászatilag elfogadható sóinak előállítására - a képletben

A’ jelentése egyszeres kötés;

HU 205 368 Β

B’jelentése D vagy L alakú Arg, vagy ezeknek ct-R’helyettesített származéka; HArg vagy (E® Arg,

C’jelentése Tyr, Trp, Ser, Thr,

Y jelentése NRiR₂;

Rí és R₂ jelentése H, vagy Ci_j alkilcsoport;

X jelentése R4R5N vagy H;

R₄ jelentése H vagy C1-6 alkilcsoport,

Rj jelentése H, HCO, Ci-j alkil-CO; C_t_s alkilcsoport; R’jelentése C_M alkilcsoport;

Zi jelentése Cys, Pen vagy APmp; Mpr;

Z₂ jelentése Cys, Pen vagy APmp D- vagy L-izomerje; q, m és n egymástól függetlenül 0 vagy 1; és azzal jellemezve, hogy

a) egy adott esetben védett (Ha) általános képletű pepiidet - a képletben

X, Zi, A’, B ’, C’, Z₂, m és n jelentése a tárgyi körben megadott, és

T¹ és T² jelentése hidrogénatom vagy kilépűcsoport, (Y”) jelentése klór-metil-, benzhidril-amin- vagy metil-benzhidril-amin-gyanta, vagy jelentése Y, melynek jelentése a tárgyi körben megadott - bázissal ciklizálunk, majd a védőcsoportokat eltávolítjuk, és ha szükséges, a pepiidet a gyantáról lehasítjuk, és kívánt esetben gyógyászatilag elfogadható sót állítunk elő, vagy

b) egy adott esetben védett (Eb) általános képletű pepiidet - a képletben

X, Zi, A’, B ’, C\ Z₂, m és n jelentése a tárgyi körben megadott;

(Y”) jelentése klőr-metil-, benzhidril-amin- vagy metil- benzhidril-amin-gyanta, vagy jelentése Y, melynek jelentése a tárgyi körben megadott; oxidációval ciklizálunk, majd a védőcsoportokat eltávolítjuk, és ha szükséges, a pepiidet a gyantáról lehasítjuk, és kívánt esetben gyógyászatilag elfogadható sót állítunk elő.

(Elsőbbsége: 1988.05.09.)
4. Az 1. igénypont szerinti a) , b) vagy c) eljárás, azzal jellemezve, hogy (Y”) helyén benzhidril-amin vagy metil-benzhidril-amin gyantacsoportot tartalmazó vegyületet alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1988.05.09.)
5. Az 1. igénypont szerinti a), b) vagy c) eljárás, azzal jellemezve, hogy a védöcsoportot hidrogén-fluoriddal távolítjuk el. (Elsőbbsége: 1988.05.09.)
6. Az 1. igénypont szerinti b) vagy c) eljárás, azzal jellemezve, hogy oxidatív cíklizálást végzünk, amelyben oxidálószerként alkálifém-ferricianidot, oxigént, jódot vagy dijőd-metánt alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1988. 05.09.)
7. Az I. igénypont szerinti b) vagy c) eljárás, azzal jellemezve, hogy báziskatalizátor jelenlétében ciklizálást végzünk, amelyben T¹ vagy T² valamelyike hidrogénatom, és a másik alkil- vagy aril-tio-csoport. (Elsőbbsége: 1988.05.09.)
8. Az 1. igénypont szerinti a) eljárás C helyén Ser, Thr, Tyr, Phe vagy Val csoportot tartalmazó (I) általános képletű vegyületek előállítására, azzal jellemezve, hogy megfelelőén helyettesített kiindulási vegyűleteket alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1988.05.09.)
9. Az 1. igénypont szerinti b) vagy c) eljárás C’ helyén Ser, Thr vagy Tyr csoportot tartalmazó (Π) általános képletű vegyületek előállítására, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási vegyűleteket alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1988.05.09.)
10. Az 1-9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás A vagy A’ helyén Gly csoportot tartalmazó (I) vagy (Π) általános képletű vegyületek előállítására, azzfll jellemezve, hogy megfelelőén helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1989.05.08.)
11. Az 1-10. igénypontok bármelyike szerinti eljárás olyan (I) vagy (H) általános képletű vegyületek előállítására, amelyeknek képletében B’ vagy B jelentése HArg vagy Arg, amikor is m vagy n értéke 0, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási vegyűleteket alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1989.05.09.)
12. Az 1. igénypont szerinti b) vagy c) eljárás olyan (I) vagy (Π) általános képletű vegyületek előállítására, amelyeknek képletében m és n értéke 0, azzal jellemezve, hogy megfelelően helyettesített kiindulási vegyületeket alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1988.05.09.)
13. Az 1. igénypont szerinti a) eljárás

N-a-Ac-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂;

N-a-Ac-Arg-Gly-Asp-Ser-NH₂;

N-a-Ac-Arg-Gly-Asp-Tyr-NH₂;

N-a-Ac-Arg-Gly-Asp-NH₂;

N-a-Ac-Arg-Gly-Asp-D-Ser-NH₂;

N-a-Ac-Arg-Gly-Ásp-VaI-NH₂;

N-a-Ac-Arg-Gly-Asp-Nal-NH₂;.

N-a-Ac-Arg-Arg-Gly-Asp-Phe-NKz;

N-a-Ac-Arg-Gly-Asp-NH-CH₂-CH₂-C6Hj;

N-a-Ac-MeArg-Gly-Asp-Phe-NH₂;

N-a-Ac-HArg-Gly-Asp-Ser-NH₂;

N-cc-Ac-Arg-Gly-Asp-Ser-NHEt;

N-a-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂;

N-a-Formil-MeAig-Gly-Asp-Ser-NH₂ vagy ezek gyógyászatilag elfogadható sóinak előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1988.05.09.)
14. Az 1. igénypont szerinti a) eljárás

Gly-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂ vagy gyógyászatilag elfogadható sóinak előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1989.04.10.)
15. Az 1. igénypont szerinti b) vagy c) eljárás

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Ser-CysNH₂;

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-Arg-Gly-Asp-(D,L)APmpNH₂;

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-Arg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂;

N-cc-Ac-Ciklo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Ser-PenNH₂;

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-(Me)SerCys-NH₂;

Ciklo(S,S)Mpr-MeArg-Gly-Asp-Ser-Cys-NH₂;

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Cys-NH₂;

Ciklo(S,S)Mpr-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-Arg-Gly-Asp-D-Pen-NH₂;

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-Lys-GIy-Asp-Pen-NH₂;

HU 205 368 Β

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-HArg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-Arg-Gly-Asp-Pen-NHEt;

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-D-Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Tyr-CysNH₂;

N-ot-Ac-Ciklo(S,S)Pen-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂;

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Pen-Arg-Gly-Asp-Cys-NH₂;

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-D-Arg-Gly-Asp-Ser-CysNH₂;

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-NH₂;

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-Arg(Et₂)-Gly-Asp-PenNH₂; vagy

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-D-MeArg-Gly-Asp-PenNH₂;

és ezek gyógyászatilag elfogadható sóinak előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1988.05.09.)
16. Az 1. igénypont szerinti a) eljárás

N-a-Ac-MeArg-Gly-Asp-Ser-NH₂ előállítására, azzal jellemezve, hogy a megfelelő kiindulási anyagokat alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1988.05.09.)
17. Az 1. igénypont szerinti b) vagy c) eljárás

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂ előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) egy adott esetben védett (IV) általános képletű pepiidet - a képletben

T¹ és T² jelentése hidrogénatom vagy kilépőcsoport, bázissal ciklizálunk, vagy

b) SH SH

Ac-Cys-MeArg-Gly-Asp-Pén-NH₂-t oxidatívan ciklizálunk.

(Elsőbbsége: 1988.05.09.)
18. Az 1. igénypont szerinti b) vagy c) eljárás

N-a-Ac-Ciklo(S,S)Cys-Sar-Arg-Gly-Asp-Pen-NH₂ előállítására, azzal jellemezve, hogy

a) egy (V) általános képletű, adott esetben védett pepiidet - a képletben

T¹ és T² jelentése hidrogénatom vagy kilépőcsoport, bázissal ciklizálunk, vagy

b) SH SH

Ac-Cys-Sar-MeArg-Gly-Asp-Pen-NH₂-t oxidatívan ciklizálunk.

(Elsőbbsége: 1989.05.08.)
19. Eljárás vérlemez-aggregációt gátló hatású gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 1. igénypont szerint előállított (I) általános képletű pepiidet - a képletben

X, A, B, C, Y és m, n jelentése az 1. igénypontban megadott - vagy egy (II) általános képletű peptidet - a képletben

X, Z], A’, B’, C’, Z2, Y, m és n jelentése a 3. igénypontban megadottvagy ezek gyógyászatilag elfogadható sóit a gyógyszergyártásban szokásos segédanyagokkal gyógyszerkészítménnyé formázzuk. (Elsőbbsége: 1989. 04. 10.)
20. Eljárás vérlemez-aggregációt gátló hatású gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 2. igénypont szerint előállított (I) általános képletű peptidet - a képletben

X, A, B, C, Y és m, n jelentése az 1. igénypontban megadott - vagy egy 3. igénypont szerint előállított (Π) általános képletű peptidet - a képletben

X, Zi, A’, B’, C’, Z2, Y, m és n jelentése a 3. igénypontban megadott vagy ezek gyógyászatilag elfogadható sóit a gyógyszergyártásban szokásos segédanyagokkal gyógyszerkészítménnyé formázzuk. (Elsőbbsége: 1988.05.09.)
21. Eljárás vérlemez-aggregációt gátló hatású gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 1. igénypont szerint előállított (I) általános képletű peptidet - a képletben X, A, B, C, Y, m és n jelentése az

1. igénypontban megadott - vagy (H) általános képletű peptidet - a képletben X, Z_b A’, B’, C’, Z2, Y, m és n jelentése a 3. igénypontban megadott - vagy ezek gyógyászatilag elfogadható sóját és egy fibrinolitikus szert a gyógyszergyártásban szokásos segédanyagokkal gyógyszerkészítménnyé formázzuk. (Elsőbbsége: 1989. 04.10.)
22. Eljárás vérlemez-aggregációt gátló hatású gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 1. igénypont szerint előállított (I) általános képletű peptidet - a képletben X, A, B, C, Y, m és n jelentése a

2. igénypontban megadott - a 3. igénypont szerint előállított (II) általános képletű peptidet - vagy a képletben X, Zi, A’, B’, C’, Z2, Y, m és n jelentése az 4. igénypontban megadott - vagy ezek gyógyászatilag elfogadható sóját és egy fibrinolitikus szert a gyógyszergyártásban szokásos segédanyagokkal gyógyszerkészítménnyé formázzuk. (Elsőbbsége: 1988.05.09.)
23. A 22. igénypont szerinti eljárás vérlemez-aggregációt gátló hatású gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy fibrinolitikus szerként Streptokinázt, Urokinázt, Pro-urokinázt vagy tPa-t vagy ezek mutánsát vagy származékait alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1989.04.10)
24. A 23. igénypont szerinti eljárás vérlemez-aggregációt gátló hatású gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy fibrinolitikus szerként Streptokinázt, Urokinázt, Pro-urokinázt vagy tPa-t vagy ezek mutánsát vagy származékait alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1988.05.09)
25. Eljárás vérlemez-aggregációt gáltó hatású gyógyszerkészítmények előállítására, azzal jellemezve, hogy egy 1. igénypont szerint előállított (I) általános képletű peptidet - a képletben

X, A, B, C, Y és m, n jelentése az 1. igénypontban megadott - vagy egy (II) általános képletű peptidet - a képletben

X, Zj, A’, B’, C’, Z2, Y, m és n jelentése az 1. igénypontban megadottvagy ezek gyógyászatilag elfogadható sóit a gyógyszeigyártásban szokásos segédanyagokkal gyógyszerkészítménnyé formázzuk. (Elsőbbsége: 1989.05.08.)