PT89145B

PT89145B - Processo para a preparacao de derivados da manumicina e de composicoes farmaceuticas que os contem

Info

Publication number: PT89145B
Application number: PT89145A
Authority: PT
Inventors: Hans Harald Sedlacek; Axel Zeeck; Gerhard Dickneite; Hans Zahner; Ralf Thiericke
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1987-12-04
Filing date: 1988-12-02
Publication date: 1993-05-31
Also published as: FI885596A0; DK673988A; DE3741056A1; PT89145A; EP0318849A3; DK673988D0; AU617391B2; JPH02251A; KR890009962A; EP0318849A2; US5079263A; FI885596A; AU2653788A

Description

A presente invenção refere-se a deriva» com a fórmula geral I

Q

RR

R

(I)

á presente invenção refere-se a um processo para preparação de compostos da fórmula geral I, caracterizado por se deixar fermentar a estirpe Streptomyces parvulus Tu 64 (DSM 40?22) na presença de ácidos benzóicos substituídos com a fórmula geral II

na qual

R¹ = H ou OH;

R^ = H ou OH;

R³ = H, OH, OCH CH ou NHgj

R^ = H, OU, OCH ou NH₂, em meios de cultura adequados.

Os compostos da fórmula geral I sao derivados da manumicina (fórmula III), que foi descrita por P. Buzzetti et al. (phar. Acta Helv., 1963, 38, 871) e cuja '5 _ estrutura e configuração absoluta foi determinada por A. Zeeck et al. (J. antibiotics, 1987, 40, 1530 e 1549).

CH,

III

A fim de contornar a biosinte.se normal da unidade tíentral de partida m-C^N para manumicina juntaram=ee ao meio de cultura quantidades não fisiológicas de outras molé· cuias precurssoras durante a fase estacionaria do crescimen to do Streptomyces parvulus (DSM 40722). 0 meio de cultura aci ma referida contem, para alem de uma fonte de carbono e de azo·· to, os sais inorgânicos usuais. Através da extracção da micela com um solvente orgânico, insolúvel ou apenas pouco solúvel em agua, obtêm-se extractos corados, a partir dos quais se obtêm através de cromatografia os compostos da fórmula geral I, após separação dos componentes lipófilos e purificação do composto bruto por meio de cromatografia. Através de hidrólise de compostos da fórmula geral I na qual Rr =

ο eom solução metanólica de KOH a 20%, obtêm-se compostos da fórmula geral I com = NH^. Os compostos (l) e (2) da Tabela 1 podem também ser obtidos através de redução da manumicina (fóa? mula III) por meio de processos conhecidos, tais como o descritó por A. Zeeek et al. (J.Antibiotics, I987, 40, 154l). Descobri mos que os compostos da fórmula geral I, em especial os compostos (l), (2), (3) e (5) da Tabela 1 inibem a elastase leucocitaria .

Tabela 1. Compostos da fórmula geral I com os seguintes radicais

	R¹	E⁸	R³	4 R
Composto (l)	OH	H	OH	H N	CH^ CH^ H CH^	-ch₃
					0
Composto (2)	H	H	OH	H N.	ch₃ ch₃ h ch₃ I 1 ** 1 1 *	X
(composto (3) (= 64~mABA)	H	H	H	“x	CH CH Η CH	X
					⁰
Composto (4)	H	H	H	^NH2
Composto (5( (= 64-pABA)	H	H	KH₂	H
- 4 -

das proteases neutras, participa no organismo humano e animal na catabólise das mais diferentes proteínas solúveis e tecidu^ lares.

No entanto, uma vez que uma actividade proteolítica descontrolada conduziria à destruição de importantes proteínas reguladoras (tais como as do sistema de coagulação e dos complementos), em condiçoes fisiológicas o organismo mantém um equilíbrio entre a enzima e os seus inibidores naturais (como por exemplo o inibidor da 2-protease, a 2-macro globulina). Porém, em diferentes estados patológicos pode verificar-se uma secreção aumentada de elastase nos leucócitos (em especial nos granulocitos poliraorfo-nucleares) ou uma libertação diminuída dos inibidores, e portante dar-se a destrui ção de importantes proteínas estruturai.s e de regulação.

Os quadros clínicos com esta eti&logia são múltiplos e podem atingir diferentes orgãos e tecidos: estão aqui compreendidos os diferentes estados de qhoque (por exemplo, o choque séptico), as perturbações do sistema de coagulação, as doenças pulmonares, tais como o acute respiratory distress syndrome (AS.DS)^m e o efisema pulmonar, complicações pós-traumaticas e pós-operatórias, diferentes formas inflamato rias tanto no seu estado agudo como crónico, tais como a artri te reumatóide e outras colagenoses.

Para além disso, a elastase secretada pelas células tumorais desempenha um papel importante na forma ção de metastases e no crescimento invasivo dos tumores, pois destrói a membrana basal que envolve o tumor primário facilitando assim a saída de células tumorais através dessa matriz.

Desta forma, a aplicação de inibidores da elastase tem interesse terapêutico em todos os quadros clínicos descritos.

A presente invenção é descrita em mais pormenor nos exemplos que se seguem:

Exemplo 1: Processo para preparaçao de 64-mABA (Composto (3) da Tabela l)

a) Processo para preparaçao de uma suspensão de esporos da estirpe produtora. Inocular 100 ml de solução de cultura (4 g de estracto de levedura, 10 g de extracto de malte, g de glucose, 1 1 de água corrente, pH antes da esterilização 7,3) num balão de Erlenmeyer de: 500 ml com entrada lateral, com a estirpe DSM 40722, e incubar durante 72 horas a 28°C e 250 rpm num agitador rotativo. Em seguida distribuir uniformemente 20 ml do líquido de cultura num balão de Roux de 500 ml com meio de cultura com a composição acima indicada, ao qual se adicionaram 20 g de agar-agar por litro para solidificar, e decantar. Incubar as culturas durante 10 a 14 dias a 28°C. Os esporos de cada balão de Roux formados durante este tempo são recolhidos com 500 ml de água desionizada contendo uma gota de um agen te tensio-activo não iónico usual, sendo imediatamente utilizados ou preservados a -22°C.

b) Processo para preparação de uma cultura ou pré-cultura da estirpe produtora em balão de Erlenmeyer.

Inocular num balão de Erlenmeyer de 5θθ ml com entrada lateral contendo 100 ml de uma solução de cultura com a composição de 2% da farinha de soja isenta de gorduras, 2% de manitol e água ad 100 (pH 7,5 antes de ser autoclavada), com uma cultura cultivada em tubinho inclinado ou com 0,2 ml de uma suspensão de esporos, e incubar sobre agitador automático, a 250 rpm e 28°C. Para inocular 10, 20, 25 θ 100 1 de fermentadores é suficiente uma cultura submersa de há 48 horas (5%) na mesma solução de cultura.

- 6 c) Fermentação.

Um fermentador de 15 1 de capacidade é manobrado como se segue. Introduzem-se 4 1 de ar por minu to no líquido de cultura, a 28° C de temperatura de incubação e 250 rpm (meio de cultura: farinha de soja isenta de gorduras 2%, manitol 2%, pH da solução antes da esteriliza, ção com NaOH acertado a 7,5)· Através da adição repetida de poucas gotas de solução etanólica de poliol e possível suprimir a formação de espuma. Passadas 30-45 horas, de preferência 36 horas, juntar 55 mMo& de ácido 3-amino-benzoico (dissolvido num pouco de água, pH = 7) por cada litrc de meio de cultura. Passadas mais 38 horas acertar o pH da cultura a 4,5 com HCL 2 M, agitar durante 10 minutos con Hyflo-celite (5θ g por litro) e filtrar. Extrair o resíduo de filtração por três vezes com acetona (25O ml por litro de solução de cixTtura), e o filtrado da cultura por três vezes com acetato de etilo. Evaporar os extractos. Reunir os resíduos hidro^oleosos e extrair por quatro vezes com cloroformio (3θ ml por litro de solução de cultura). Depois de evaporar o solvente das fases orgânicas reunidas obtem-se um composto bruto oleoso, que solidiff.ca ao ser tratado cometer de petroleo arrefecido em gelo.

pá amorfo castanho escuro á cromatografado por duas vezes sobre colunas de Sephadex LH-20 (lOO x 2,5 cm, solvente de aplicação e eluente: CHCl^)0 Segue-se uma cromatografia sobre coluna de silicagel RP-8 (acetonitrilo: água 3:1 v/v) a fim de se obter apás uma fermatação óptima 123 mg/l de caldo de cultura o 64-mABA puro, amarelo e amorfo (composto 3)· θ seu ponto de fusão e de 196-197°C.

Outras propriedades são as seguintes:

de -213° (0=0.15 em CHCl^)

IR (KBr): 3420, 3260, 2940, 2910, 1605, 1575 (sh), 1530 e 996 cm

Espectro de UV: À_max (metanol) = 351 (40 800), 263 (25 100) ¹³C, ^XHSMN (200 MHz, CDCl^): /θ -197.4 (s, 0-1«), 174.3 (C~3),

168.7 (s,C-l»), 165.9 (s, C-13), 144.0 (d, C-ll), 142.1 (d, C-5»), 141.6 (d, C-9), 138.9 (d, C-3»), 13«.8 (s, C-2), 137.4 (s, C-4), 136.9 (d, C-7), 130.2 (d, C-10), 130.1 (s, C-2*),

129.4 (s, C-4»), 129.3 (d, C-6), 128.5 (d, C-8), 123.O (d, C-5 I,

120.4 (d, C-12), 120.1 (d, C-l), 118.0 (d, C-3). 115-3 (s, C-2), 37.1 (t, C-7»), 32.8 (d, C-6»), 32,2 (t, c-5), 29.8 (t, C-8»), 25.7 (t, C-4), 22.8 (t,C-9»), 20,8 (q, C-13»),

16.6 (q, C-12»), 14,4 (q, C-10»), 14,1 (q, C-ll»);, {COCl_y'_t

0.86 (t, H 6.4 Hz, 10»-Η₃), O.93 (d. J 6.4 Hz. 13Ή ), 1,14-1.42 (m, largo, 7»-^, 8»-H₂, 9*-^), 1.84 (d, J 1.6 Hz, 12»-H^), 2.12 (d, J 1.6 Hz, 11»-H₃), 2.34-2.50 (m, largo, 6»-H), 2.58^.2.60 (s, largo, 4-H₂, 5-H ), 5*36 (d, J 10 Hz, 5*-H),

6.09 (d, j 15 Hz, 12-H), 6.42 (dd, J 13.5 θ 12 Hz, 10-H), 6.62-6.88 (m, 7-H), 9“H, incluindo 6.82,3»-η), dd, J 15,3 θ 11 Hz,

8-H), 7.15 (d, largo, J 7,5 Hz, 5-H), 7.22-7.46 (m, 1-H, 11-H) 11-H), 7.64 (s, largo, NH), 7.86 (s, 3-H), 7.88 (s, Largo, NH), I3.8O (s, largo, OH);

Espectroscopia de massa: m/z 502 (21%, M⁺, obtido: 502.2832 para ^C31^H38^H2°4^

417 (24%), 324 (11%). 193 (38%). 123 (ll%), 109 (64%);

Análise elemental: C, 74.04; H, 7-81; N, 5,49; ^C31^H38^N2°₄exige C, 74.06; H, 7.62; N, 5,57.

Dissolver 94 mg de 64-mABA em 50 g de

Exemplo 2: Processo para preparação do composto (4) da Tabela através de hidrólise de 64-mABA *·

solução metanolica de KOH a 20% e deixar ferver sob refluxo du rante 24 horas. Acertar o pH da mistura de reacçao a pH 2 com ácido oxálico aquoso e extrair por duas vezes com 300 ml de CHCl^. Secar os extractos orgânicos reunidos com Na^SO^ e eva· porar, obtendo-se assim um pá amarelo amorfo. Após cromatogra· fia em coluna deste composto, bruto sobre silicagel (45 cm x 2.5 cm, CHCCl^ : MeOH 9:1 v/v) obtêm-se três compostos principa is:

a) 5,8 mg de composto de partida,

b) 3θ mg de óleo amarelo claro,

c) 34.2 mg de pó amarelo,

RF = 0.60 RF = 0,43 RF = O.39 (CHClyMeOH

9ilv /v)

». II I )

II B I! j

Após purificação de b) sobre uma coluna de Sephadex LH-20 (45 cm x 2.5 cm, CHCl^) obtêm-se 20.0 mg (54%) de ácido 2,4,6-trimetil-2,4-decadienico (fórmula IV),

Após cromatografia do composto c) sobre uma coluna de Sephadex LH 20 (50 cm x 2.5 cm, CHCl^) obtêm-se 3θ2 mg (55%) de composto (4) sob a forma de um pó amorfo, amarele, com as seguintes propriedades:

Ponto de fusão: 256°C

IR (KBr): 3440, 3380, 3260, 1680 (sh) 1610, 1550 e 1008 cm'¹

Espectro de UV em metanol: 1 = 342 (44 500), 259 (24 600).

^x max ¹³C, ¹H-RMN (200 MHz, DMSO-dg)2

2.09 (s, 4-H₂), 2.48 (s, 5-H₂), 3.3O (s, largo, NH, encoberto por HOD), 6.43-7.08 (m, 9 protões), 7,26 (dd, J 15·° ^e

12.5 Hz, 11-H), 9.91 (s, largo, OH); θ 166.1 (s, C-13), 148.8 (s, C-2), 142.5 (d, C-ll), 137.3 (d, 0-9), 136.9 (d, C-7),

129.9 (s, C-4), 114.8 (s, C-2), 28.8 (t, largo, C-4, C-5), os sinais 129.1 (d), 127.4 (d), 121.2 (d), 119.0 (d), 114.9 (d), 114.6 (d) e 112.5 (d) não puderam ser inequivocamente re lacionados com C-l, C-3, C-5, C-6, C-8, C-10 e C-12; os sinais para C-l e C-3'¹ não foram observados.

Espectrometria de massas m/z 310 (13$, M⁺, observado:.3IO.I317 para ^8^3^3^ ¹⁹⁸ ’ ^1θ0 (^χ5$), 170 (92$), 132 (l00$)_o

Exemplo 3: Processo para preparação de 64-pABA (composto (5) da Tabela l)

A uma cultura de Streptomyoes parvulus DSM 40722 eotn 36 horas juntar 55 mMol/litro de ácido 4-amino-benzáico (nas mesmas condições indicadas no exemplo lc). Passadas 74 horas procedeu-se à extracção do rnicelo e do filtrado de cultura conforme acima descrito. Após dupla cromatografia em coluna do composto bruto sobre silicagel (30 cm + 5 cm. CHC MeOH 9:1 v/v) obtêm-se 35.8 mg/litro de 64-pABA (composto (5)) sob a forma de pá amorfo, amarelo, com as seguintes caracterís ticas:

Ponto de fusão: 242°G

IR (KBr): 3440, 3350, 3240, 2930, 2860, 1710 sh, 1615 sh, 1585 1000 cm”¹

Espactro de UV em metanol: 392 (31 500), 261 (l4 400), 201 (15 200) ¹³C, “H-KMN (200 MHz, DMSO-dg): ^C 166.4 (s, C-13), 149,6 (s, C-l), 143,1 (d, C-ll), 142.5 (d, C-9), 137-8 (d, C-7), 128.3 (d, C-3 θ C-5), 127-3 (d, C-10), 124.1 (s, C-4), 122.9 (d, C-8), 119.4 (d, C-12), 114.9 (s, C-2), 113.8 (d, C-2 e C-6), 28.8 (t, largo, C-4 e C-5), os sinais para C-l e C-3 nao foram observados.

Ή 2.10 (s, 4-H₂), 2.47 (s, 5-H₂), 3.3O (s, largo, NH, encoberto por HOD), 5·5Ο (s, largo, NH). 6.34—6.94 (m, 7 protoes,

incluindo 6.57 (d, J 8.5 Hz. 2-H e 6-H)), 7·23 (d, J8.5 Hz,

3-H e 5-H), 7.3O (dd, J 14.5 e 12 Hz, 11-H), 9.94 (s, largo, °H);

Espectrometria de massa! m/z 31θ (8.4$ M⁺

Achado: 310.1317 para θ_ι8 ^Ηι8^Β2°3^ ¹⁹⁸ 17° (40.7$),

132 (100$).

Exemplo 4: Teste da elastase de granulocitos polimorfo-nucleares (PMN-elastase)

A elastase foi isolada de leucócitos huma nos de acordo com o método descrito por EngelBrecht et al. (Hoppe-Seyler¹s Physiol. Chem. 363. pag. 3θ5-315, 1982). Como substrato utilizou-se MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-pNÁ (Calbiochem) descrita por Nakajima et al. (J. Biol. Chem. 254, págs. 4027-4032, I979)· A libertação da p-nitro-anilina a.partir dc substrato foi medida passados 15 minutos no espectrofotometro, como aumento da absorção a 405 nm. Este valor de absorção foi definido como 1088 da actividade enzimatica da PMN-elastase.

Os inibidores da PMN-elastase foram pre-incubados durante uma hora com o enzima, em concentrações crescentes até um máximo de 100yug/ml. A reacção do enzima foi iniciado com adição do substrato. Como ΙΟ^θ definiu-se a concentração de inibidor que inibiu 5°$ da actividade do enzima. Os compostos que com a cor. centraçao máxima de 100yug/ml nao apresentavam qualquer efeito inibidor foram definidos como inactivos.

Os valores obtidos para ΙΟ^θ sao apresentados na Tabela 2. 0 composto de referencia manumicina apresenta uma actividade comparável com as dos compostos (l) a (3): enquanto que o composto (5) apresenta um efeito inibidor nitidamente mais fraco. 0 composto (4) é ineficaz neste teste.

Tabela 2ί

Composto

Efeito inibidor de manumicina e dos derivados da manumicina testados sobre a PMN-elastase

IC (yug/ml)

Manumicina	(Fórmula IIl)	4.4
Composto (l)		2.5
Composto (2)		3.1
Composto (3)	(=64-mABA)	3.6
Composto (4)
Composto (5)	(=64-pABA)	42.0

R Ε I V I K D I C A-g Õ B S

Claims

Processo para a preparação de composto com a fórmula geral 1

12 4' na qua1

H ou OH;

H ou OH;

R caracterizado por se deixar fermentar a estirpe Streptomyces parvulus Tú 64 (DSM 40?22) na presença de ácidos benzóicos substituídos com a fórmula geral II na qual

R = H ou OH; R² = H ou OH; R^ = H, OH, OCH^, CH„ ou NH 3 R^ = Ii, OH, OCHy ou NH₂, em meios de cultura adequados

- Processo para a preparaçao de compostos 12 3 de fórmula geral I, na qual R = R = R = H e

R^ =

CH, caracterizado por se adicionar ácido 3-amino-benzóico ao processo da reivindicação 1.

- 3& _

Processo para a preparaçao de um compos to da formula geral I, na qual R¹ = R? = β = H e R³ = NH^, caracterizado por se adicionar ácido 4-amino-benzóico ao processo da reivindicação 1.

- Processo para a preparação de composiçÕ farmacêuticas contendo como ingredientes activos compostos da fromula I quando preparado de acordo com as reivindicações an teriores, caracterizado por se incorporarem compostos da formula geral I na qual

R¹ = H ou OH;

R² = H ou OH;

R³ = Η, OH, OCHy CH₃ ou NH₂;

R^ = H, OH, OCHy NH₂ ou nos excipientes farmacológicos adequados.