PT87805B

PT87805B - Processo microbiano para preparacao de um novo antibiotico, fumifungina, e de composicoes farmaceuticas que o contem

Info

Publication number: PT87805B
Application number: PT87805A
Authority: PT
Inventors: Hans-Wolfram Fehlhaber; Kirity Roy; Triptikumar Mukhopadhyay; Bimal Naresh Ganguli; Richard Helmut Rupp
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1987-06-25
Filing date: 1988-06-23
Publication date: 1992-10-30
Also published as: GR3004684T3; US5001258A; DK348988A; EP0296545A1; ES2038244T3; JP2780780B2; DE3868712D1; IE881937L; DK348988D0; IE60784B1; PT87805A; JPS6434949A; EP0296545B1; ATE73128T1

Description

Memória descritiva referente à patente de invenção de HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em D-6230 Frankfurt am Main 80, República Federal Alemã, (inven tores: Dr. Triptikumar Mukhopa fhyay e Dr. Kirity Roy, residen tes na índia, Dr. Hans-Wolfram Fehlhaber e Dr. Richard Helmut Rupp residentes na Alemanha Ocidental e Dr. Bimal Naresh Ganguli residente na Alemanha Ocidental), para “PROCESSO MICROBIANO PARA PREPARAÇÃO DE UM NOVO ANTIBIÓTICO, FUMIFUNGINA,

E COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS QUE

CONTÊM“.

Memória descritiva

A presente invenção refere-se a um novo antibiótico, designado fumifungina, bem como a um processo para a sua preparação a partir da cultura de fungos N2 Y-83, 0405 e sua mutantes e variantes.

A fumifungina pode ser descrita como o ácido 2-amino-4-acetóxi-3,5,14- trihidróxi- ^-eicosénico, e possui a seguinte fórmula estrutural:

JU____,*^7^-·.-:'•‘JTtf-vy-·*··, Λ· .....

. Δί. A.V* — *-· · Μ ι «Aà jlt -· «- *-.·» «4 iJ, M ..... —--- — — ú'ii*XSiS

H,C(CH„)_c - CH(CH„), - CH = CH - CH - CH - CH - CH - COOH .

^{3 2 5} ι ^{2 6} ι ι ι ι

OH OH OAc OH NH₂

Outros antibióticos deste grupo, mas diferentes da fumifungina, e que têm sido referidos na literatura sao a termozimocidina e/ou miriocina.

A termozimocidina é descrita no Tetrahedron 28, 5493, 1972, Chemical Communications 788, 1973, Tetrahedron Letters 211. 1978 e na Patente belga N2 796 682.

A miriocina foi descrita no journal of Antibiotics, 25, 109, 1972, Journal of Organic Chemistry,

38, 1253, 1973 e na Patente americana Ne 3 928 572.

Descrições da termozimocidina e da mirio cina podem ser encontradas ainda no CRC-Handbook of Antibiotic Compounds, Vol. VI, páginas 391-481, nos capítulos Fatty Acid Derivatives e Fungai Metabolites 11 de W.B. Turner & D.C. Aldridge, Academic Press 1983, páginas 173-175. O organismo que produz a termozimocidina foi descrito como Ascomyceto Myriococcum albomyces termófilo.

No entanto, de acordo com todos os dados conhecidos, a fumifungina distingue-se notóriamente da termozymocidina e miriocina e de todos os restantes antibióti*⁴cos conhecidos.

A cultura de fungos Ne Y-83,O4O5 utilizada para a produção de fumifungina foi isolada a partir de uma amostra de solo do Himalaia na Índia e identificada pelos métodos conhecidos, segundo as suas propriedades fisiológicas, bioquímicas e morfológicas, como Aspergillus fumigatos Fresenius 1863.

Foi registada em 23.6.1987 junto da Deutschen Sammlung von Mikroorganismen (Gõttingen) sob o número DSM 4152.

Objecto da presente invenção é também um processo para preparação do novo antibiótico fumifungina.

Estes processo compreende a cultura de fungos ne Y-83,O4O5 ou dos seus mutantes ou variantes, em condições aeróbicas sobre um meio de cultura contendo fontes de carbono e de azoto, sais minerais e elementos traço, e o isolamento e purificação deste antibiótico do caldo de cultura.

Como fontes de carbono podem considerar -se a glucose, sacarose, amido ou dextrina. Dá-se preferên cia à glucose como fonte de carbono. Como fontes de azoto podem considerar-se a farinha de soja, triptona, extracto de levedura, extracto de carne de vaca, extracto de malte, água de germinar milho, peptona ou compostos inorgânicos, tais como sais de amónia. Dá-se preferência ao extracto de malte ou a uma combinação de extracto de malte com outras fontes de azoto. No que se refere aos sais minerais, pode tratar-se de cloreto de sódio, hidrofosfato ou dihidrofosfato de potássio ou carbonato de cálcio. Como elementos tra ço podem utilizar-se sais do ferro, manganês, cobre, zinco cobalto ou de outros metais pesados.

A cultura da estirpes n^ Y-83,O4O5 pode ser feita a temperaturas entre 24° e 30°C e a um pH entre 6,0 e 8,0. De preferência procede-se â cultura da cultura n? Y-83,O4O5 a 26°C (+ 1°C) e a ph’ 6,5.

A cultura é feita durante 66 a 96 horas, obtendo-se após esse período de tempo um rendimento óptimo do antibiótico desejado. A fermentação faz-se de pre ferência durante 90 horas em condições de submersão, em frascos de agitação. A evolução da fermentação e formação da fumifungina a que se refere a presente invenção pode ser controlada através da determinação da bioactividade do caldo de cultura contra Bacillus subtilis, Candida albicans e Aspergillus niger, segundo o método de determinação conhecido da difusão em placas de agar-agar.

No caldo de cultura formado, a fumifungina encontra-se presente tanto no filtrado da cultura como no bolo micelar. A fumifungina é isolada de preferência do caldo de cultura, que é separado do micélio por meio de centrifugação. Pode ser obtida através de um ou mais métodos conhecidos, como a extracção utilizando solventes não miscíveis com água, tais como n-BuOH, ou de adsorção sobre materiais absorventes tais como carvão activo, Diaion

HP-20^R ou Amberlit XAD-2^.

método preferido é a adsorção a Diaion

R '

HP-20 e posterior desorção do composto com solventes orgâ- ’ nicos adequados. Os solventes que podem ser considerados para o efeito são o metanol, acetona ou acetonitrilo, bem como combinações aquosas destes solventes. Para o processo a que se refere a presente invenção dá-se preferência à eluição progressiva com (1) MeOHíH^O (1:1) e depois com MeOH:H_?O (8:2) como solventes. 0 posterior tratamento da fumifungina obtida através da eluição de Diaion HP-20 com MeOH:H₂O (8:2) pode ser feito por exemplo através de evaporação à secura do velume total ou extracção dos eluados com n-SuOH ou readsorção dos eluados diluídos sobre resinas tais como Diaion HP-20^ ou Amberlit XAD-2^.

método preferido consiste na evaporação dos eluados no vácuo a fim de eliminar uma grande parte do solvente orgânico, diluição do concentrado assim obtido cóm água desmineralizada e readsorção da solução obtido sobre Diaion HP-20 e depois desorção com MeOHcH^O (6:4) e em seguida com MeOH a 100%. A eliminação do solvente dos eluados activos fornece a fumifungina bruta. A purificação final pode ser obtida através de cromatografia sobre substratos tais como silicagel, silicageles modificados, celulose ou LH-2O, ou através de cristalização da fumifungina bruta com solventes orgânicos ou suas misturas aquosas, ou através de uma combinação destes métodos.

No método preferencial cromatografa-se a fumifungina bruta sobre uma silicagel modificada (silicagel dimetiloctadecilsilada com 50 yu), que passa a ser designada por RP-18 introduzida numa coluna, e eluiu-se sob pressão segundo o método conhecido por cromatografia líquida de média pressão (médium pressure liquid chromatography - MPLC).

De entre os diferentes solventes para eluição do RP-18, tais como metanol, acetonitrilo ou acetona ou suas misturas aquosas, utiliza-se para a eluição progressiva de preferência primeiro MeOH:H₂O (6:4) e depois MeOHz^C ·«·-> .

(7:3). A eliminação dos solventes dos eluados activos no vá cuo e a liofilização total fornece a fumifungina sob a forma de composto sólido incolor.

Os exemplos seguintes destinam-se a melhor ilustrar a presente invenção:

EXEMPLO I:

i solamento da cultura Y-83.

0405 DO SOLO

Composição do meio de cultura para o isolamento:

Glucose

Peptona

Ag ar- ag ar

Água desmineralizada

Cloranfenicol

C icloheximida pH g

g g

litro

0,05 g

0,2 g

9,0

Na preparação do meio de cultura acima referido o cloranfenicol e a cicloheximida são adicionados no fim. 0 cloranfenicol dissolvido em 10 ml de álcool a 95% é adicionado ao meio de cultura e muito bem misturado.

Depois junta-se uma solução de clorheximida em 10 ml de acetona e mistura-se muito bem com o meio de cultura. Este é autoclavo durante 10 minutos a uma temperatura de 121°C. O pH era de 9,0 antes da autoclavagem e de 7;© depois disso.

Vazar respectivamente 150 ml do meio de cultura esterilizado e arrefecido a 45°C em placas de Petri de 150 mm. e deixar solidificar.

A cultura de fungos n® Y-83,0405 foi isolado pro processos conhecidos a partir da amostra de solo do Himalaia, de acordo com o método de diluição do solo e sementeira sobre o meio de cultura acima referido.

EXEMPLO II: MANUTENÇÃO DA ESTRIPE DA

CULTURA K2 Y-83,0405

A cultura n2 Y-83,O4O5 é mantida em meio de glucose e agar-agar de Sabourand, com a seguinte coraposi ção:

Glucose	40	g
Peptona	10	g
Na_oHP0, 2 4	1	g
Agar-agar	15	g
Agua desmineralizada	1	1 i tro
pH	6,5

Após dissolução completa dos componentes através de aquecimento distribuir o meio de cultura por tubos de ensaio e depois esterilizar durante 20 minutos a 121°C. Deixar arrefecer os tubos de ensaio e solidificar o meio de cultura. O agar-agar inclinado com esporos da cultura ne Y-83.O4O5 e incubado a 26°C (+ 1°C), até se observar uma boa formação de esporos. As culturas com boa formação de esporos são mantidas em frigorifico.

EXEMPLO III: FERMENTAÇÃO DA CULTURA Ne Y-83,0405 EM FRASCOS DE AGITAÇÃO

Composição do meio de cultura de inocu1ação:

Amido solúvel 15 g

Farinha de soja 15 g

Glucose 5 g

CaC0₃ 2 g

NaCL 5 g

Extracto de levedura 2 g

Água de germinar milho 1 g &

...

Água desmineralizada 1 litro pH 6,5 j i

Distribuir respectivamente 100 ml do í meio de cultura de inoculação acima descrito em balões de Erlenmeyer de 500 ml com gargalo largo e esterilizar durante 20 minutos a 121°C. Em seguida, arrefecer os balões e depois inocular com alguns fios de platina bem cheios da cultura com boa formação de esporos acima referida, e agitar durante 60 horas a 240 r.p.m. e a 26°C (+ 1°C), observandose uma boa multiplicação. A cultura de inoculação assim obtida é utilizada para inoculação do meio de cultura de pro dução com a seguinte composição.

Composição do meio de cultura de produ-

Gluco	se	10 g
Extracto de malte	20 g
Peptona	10 g
Na₂HPO₄	1 g
ZnSo^	x 7H₂O	0,22 mg
CaCl₂		0,55 mg
MnCl₂	x 4H₂O	0, 5 mg
FeS0₄	x 5H₂O	0,16 mg
CoCl₂	x 6H₂O	0,16 mg
Água -	desmineralizada	1 litro
pH antes da esterilização	6,5
pH depois da esterilização	6, 3

Distribuir respectivamente 200 ml do meio de cultura de produção acima referido por balões de Erlenmeyer de 1 litro e esterilizar durante 20 minutos a

121°C. Arrefecer os balões e depois inocular com o meio de cultura de inoculação acima mencionado (1% v/v). A fermentação processa-se durante 90 minutos num agitador rotativo a 220 r.p.m. e a uma temperatura de 26°C (+ 1°C).

A produção de fumifungina é controlada através do perfil de actividade contra Bacillus subtilis, Candida albicans e Aspergillus niger. Após a colheita, o ca do de cultura é centrifugado e a fumifungina é isolada do filtrado do meio de cultura e purificada conforme descrito no exemplo IV.

EXEMPLO IV: ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO

DA FUMIFUNGINA

Para separação do micelo e do filtrado de cultura centrifugar cerca de 60 litros do caldo de fermentação .

Acertar o pH do filtrado de cultura (55 litros) a pH 5,9 e vazar através de uma coluna cheia com Diaion HP-20¹ (1,8 litros). Lavar com água desmineralizada (7 litros). Através de eluição com metanol a 50% em água (20 litros) eliminam-se as impurezas inactivas e fortemente coradas.

Eluir depois a coluna de Diaion HP-20^xcom metanol a 80% em água. As primeiras fracções são inacti vas (2 x 800 ml), mas as fracções seguintes (12 x 800 ml) apresentam actividade. Os eluados activos são concentrados para 7 litros sob pressão reduzida. Posterior eluição com metanol a 80% em água (10 x 800 ml) não fornece mais qualquer actividade. Diluir o concentrado através da adição de 15 litros de água desmineralizada. Passar de novo a solução diluída através de Diaion HP-20 (1 litro) e lavar com metanol/água da coluna, e eluir esta depois com metanol (4 litros). A evaporação do solvente sob pressão reduzida e posterior liofilização fornecem 1,5 g de fumifungina bruta.

A fumifungina bruta (600 mg) aplica-se uma cromatografia líquida de média pressão utilizando RP-16 como material de suporte de reversão de fase. A coluna é eluida com metanol a 60% em água, a uma velocidade de fluxo

de 11 ml/minutos, até ter passado 1 litro de eluado. Iludase então o elute para metanol a 70% em água. Reunir as fracções activas, evaporar sob pressão reduzida e liofilizar, obtendo-se assim 100 mg de fumifungina pura e incolor.

As propriedades físico-químicas da furni fungina são apresentadas na Tabela que se segue.

TABELA I

Propriedades físico-químicas da fumifungina

1.	Aspecto	pó incolor
2.	Solubilidade	metanol, DMSO
3.	Análise elementar	calc. C: 61,25 %	obtido:	C: 58,9 %
		H: 9,51 %		H: 9,5 %
		N: 3,20 %		N: 3,2%
4.	Fórmula molecular	^C22^H41^N°7
5.	Peso molecular	431
6.	Ponto de fusão	1O8°C
7 .	Reacções coradas	a) KMnO^ - descoloração
		b) Ninhidrina - coloração	violeta
8.	UV (MeOH)	absorção final
9.	IR (Nujol)	3300, 3000, 1725,	1640, 1570, 1400,
		1350, 1240, 1090,	975, 77C	>, 730 cm
10	. ¹H-RMN (CD₃0D)	0,9, t (J = 6 Hz)	, 3H
		1,2-1,5, m largo,	2 OH
		2,05, S, 3H
		2,1, m, 2H
		3,5, s largo, IH
		3,76, d(J = 4Hz),	IH

0\

3, 82, d( J = 6 Hz) ,

4,16, dd (J = 2 & 4 Hz) , 1H 5,33-5,4, m, 2H

5,83-5,95, m, 1H

O novo composto fumifungina possui propriedades bactericidas e fungicidas. As concentrações mínimas de inibição de fumifungina necessárias para a inibição do crescimento de diferentes estripes e fungos são apresentadas na TABELA II.

Tabela II: Valores de concentração mini ma de inibição da fumifungina (CHI)

N2 Estripes testadas

Candida albicans

Saccharomyces cerevisiae

Wild Yeast

Aspergillus niger

Penicillium digitatum

Trichophyton mentagrophytes

Botrytis cinerea

Fusarim culmorum

Alternaria solani

Cercospora beticola

Cladosporium resinae

Piricularia oryzae

Valores da CHI em g/L

62, 5

62, 5 >7, 8 >7, 8 >15,6

250

31, 2

0,9 >0,9

Claims

REIVINDICAÇÕES

- lã Processo para a preparação de um compos to com a fórmula geral I

H_C(CH„)_c - CH(CH_n)_c - CH - CH - CH - CH - CH - CH - COOH.

^{3 2 5} I ^{2 6} I I I I

OH OH OAc OH NH₂ caracterizado por se cultivar a cultura de fungos Ne Y-83, 0405 (DHS 4152) em condições aeróbicas sobre um meio de cultura contendo fontes de carbono, fontes de azoto, sais minerais e elementos traço, a uma temperatura entre 24 e 30°C e a um ph entre 6,0 e 8,0 durante 66 a 96 horas, e se isolar e purificar o composto do caldo de cultura pelos pro cessos usuais.

Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se fazer a cultura a 26°C (+ 1°C) e a pH 6,5.

3 a —

Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por se proceder à cultura durante 90 horas.

- 4- Processo de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a fermentação se realizar sob a forma de fermentação submersa.

5Processo para preparação de composições farmacêuticas, caracterizado por se incorporar um composto da fórmula geral I quando obtido de acordo com a reivindicação 1, em conjunto com os adjuvantes e/ou excipientes usu ais, numa formulação galénica adequada.

Ressalvo a entrelinha sobre

A requerente declara que o primeiro pedido desta patenta foi apresentado na República Federal Ale mã, em 25 de Junho de 1987, sob o n? P 37 20 981.7.