PT87752B

PT87752B - Processo para a preparacao de uma molecula analoga a do factor viii:c, com actividade coagulante

Info

Publication number: PT87752B
Application number: PT87752A
Authority: PT
Inventors: Gerd Zettlmeissl; Hans Kupper; Egon Amann; Bernd Huber; Klaus-Dieter Langner
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1987-06-19
Filing date: 1988-06-17
Publication date: 1992-10-30
Also published as: AU609829B2; DK332888D0; EP0295597A3; EP0295597A2; FI882890A7; JPS6425799A; PT87752A; DE3720246A1; AU1810388A; KR890000666A; FI882890L; FI882890A0; DK332888A

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

A invenção refere—se a um mutante do factor

Vlli:c (F VIII:C), caracterizado por faltarem na nova molécula _{f J o} 741 , 1689 _J ~ , os aminoácidos Ser a Arg , referindo—se a numeraçao dos aminoácidos à molécula madura de F VIII:C (após cisão do pê— ptido de sinal). Esta última molécula ê constituída por 2332 aminoácidos (Ala -Tyr ). A nova proteína, apesar das drásticas alterações em relaçao aos parâmetros estruturais (por exemplo, ausência de vários grupos SM e de várias posiçoes de glicosilaÇao) e em relaçao ao número das posiçoes de cisão da trombina, possui uma actividade de pró—coagulaçao muito semelhante à da proteína autêntica.

No processo em série de coagulação 60 sangue,

o factor F VIII:C desempenha um papel central) funcionando co mo co—factor na activaçao do factor X através do factor IX ac tivado. F VIII:C representa a proteína que está deficiente ou mesmo ausente nos seres humanos que sofrem de hemofilia A clás sica. A hemofilia A ê uma doença que se transmite através do cromossoma X e que se manifesta em indivíduos do sexo masculi no com uma frequência de cerca de 0,01 %.

Foram já isolados e caracterizados tanto o cDNA codificante para o F VIII:C humano como o gene completo do F VIII:C (Gitschier et al· , 1984, Nature 312» 326—33θ» Wood et al.> 1984} Nature 312} 330-337» Vehar et al·} 1984} Nature 312} 337-342; Toole et al., 1984, Nature 312, 342-347)-0 cDNA codifica para 2332 aminoácidos da proteína madura, o que corresponde a um peso molecular de 246 763 d. A purificação do F VIII:C a partir de concentrados comerciais de F VIIi:C conduziu a uma série de polipêfjtidos associados com actividade biológica, com pesos moleculares de 8θ 000 a 200 000 d, repre sentando as dadeias de proteína com 90 000 d e com 80 000 d um passo intermediário importante na activaçao (Anderson et al. , 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 2979—2983)· Na molê cuia intacta estas duas cadeias polipeptídicas encontram-se 2 + ligadas por meio de uma ponte de Ca e representam nesta for ma uma forma parcialmente activa do F VIII:C, processada atra vés da trombina.

A cadeia com posição N-terminal de 90 000 d obtêm-se a partir de moléculas precursoras do factor F VIIl:c, ~ ~ 74o 1 74o por cisão com trombina na posição Arg (Ala -Arg ),enquan to que a proteína de 8θ 000 d resulta da cisão com trombina na posição Arg (Glu -Tyr J. Para se atingir a actividade total do F VIII:C cindem—se, por meio da trombina, o fragmento N-terminal de 90 000 d na posição Arg^ (fragmentos obtidos: 50 000 d e 40 000 d) e o fragmento C—terminal de 80 000 d na posição Arg^^ (f_rag_mentos obtidos: 73 000 d e 7 000 d) (Eaton et al., 1986, Biochemistry 25) 505—512, Eaton et al. , 1986, Biochemistry 25> 8343—8347» Anderson et al. , vi *νθΤΛ

de acima)

Com base num cDNA de F VIII:C modificado pude ram exprimir-se moléculas de proteína biologicamente activas, em células animais, moléculas essas em que-se removeu a zona entre os ammoacidos Ser e Leu ou entre os aminoacidos

ΤΙΐΓ^θθ e Asn^A&39 (j>_ooi_{e e}t _ai. , 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 5939-5924). Estas moléculas possuem contudo todas as quatro posiçoes de cisão da trombina consideradas essenciais

.. ~ ~ . 372 . 740 . 1648 . 1689, para a activaçao (posiçoes Arg , Arg , Arg , Arg ). Nestas experiências exprimiram-se as proteínas encurtadas (por remoção das zonas de aminoácidos referidas) como uma cadeia contínua.

Burke et al.(1986, J. Biol. Chem. 26l, 12574—

740

1649

2332

-1257θ) exprimiram as regiões Ala -Arg* e Glu*“*'-Tvr‘ como cadeias separadas, em conjunto, numa célula hospedeira e puderam identificar no meio moléculas F VIII:C também biològi camente activas, que continham as duas cadeias numa forma associada. As duas cadeias de proteína correspondem às espécies F VIII:C obtidas a partir de plasma por cisão com trombina nas posiçoes Arg^Q ou Arg^A^⁴^, com um peso molecular de 9θ 000 ou de 80 000, respectivamente. Como no F VIII:C obtido a partir de plasma, encontram—se nestas espécies os posiçoes de cor . ~ * 372 . 1689 , .

te da trombina nas posiçoes Arg e Arg , necessárias a activaçao posterior.

Em todos os mutantes da molécula F VIII:C até agora descritos existem assim as duas posiçoes de cisão da trombina, inicialmente mencionadas, na sua forma natural.

Por eliminaÇao dos aminoácidos Ser^^ a Arg^^ no mutante, o que constitui um objectivo desta invenção, mantêm-se apenas a posição de cisão em Arg^J de entre as quatro posiçoes de cisão da trombina consideradas como essenciais pa ·» / *** ra a activaçao do F VIII:C natural (nas posiçoes Arg

372 krg

740

Arg

1648

1689 e Arg ⁷). A posição de cisão em Arg

1648 ta completamente, das posiçoes de cisão em Arg?^° e Arg^A^^^

restam apenas os aminoácidos limítrofes. Devido à eliminaÇao referida, os aminoácidos Arg?^ e encontram-se ligados por meio de uma ligaÇao peptídica· Esta ligaÇao representa uma nova posição de cisão da trombina nesta nova molécula, derivada por mutaçao do F VIII:C e expressa como cadeia contl nua.

novo gene F VIII.‘C codiíicante para esta no \a proteína pôde introduzir-se em células animais e aí proceder-se à sua expressão. Na camada sobrenadante da cultura das células·animais modificadas deste modo pode identificar—se uma molécula com a actividade de prô-coagulaçao específica do F VIII: C. Por meio de tratamento com trombina pode aumentar-se a actividade desta proteína de uma ordem de grandeza.

A activaçao do mutante de acordo com a invenção pela trombina conduz, devido à remoção de posiçoes de ci— j

I ~ ~ ~ sao de activaçao potenciais, a padrões de cisão definidos, mais simples do que os da proteína nativa e de mutantes de eliminaÇao descritos por outros grupos. Desta maneira obtêm-se uma possibilidade directa de utilização experimental da corre laçao entre a cisão da trombina e a actividade biológica.0 me canismo de activaçao simplificado pode ser vantajoso na aplicaÇao da molécula na terapia de substituição. Surpreendente— ] i

mente, a nova molécula possui uma vida média biológica na activaçao pela trombina, pelo menos tao grande como a da proteí | na nativa, embora faltem duas posiçoes de cisão da trombina | em relaÇao à proteína original. A activaçao da nova molécula ê pelo menos duas vezes mais rápida.

No novo mutante, devido a eliminaÇao das regiões polipeptídicas Ser^^^-Arg^^^^, removem—se 20 das 25 posiçoes de glicosilaçao de asparagina potenciais (Vehar et al., vide acima). Este facto e a falta de uma parte considerável j da proteína simplifica a preparaçao, por meio de técnicas de ι engenharia genética, uma vez que os organismos hospedeiros pa-ί ra tal utilizados necessitam de levar a cabo um menor número ;

de sinteses de proteínas e de glicosilaçoes. Sabe-se que as proteínas heterélogas na síntese em leveduras e em células ani mais nao sao glicosiladas exactamente como a proteína natural mente ocorrente (Broker et al. (1987), Biochim. Biophys. Acta 9O8, 203—213i Conradt et al., 1986, Carbohydrate Res. 149 , 443-450). Esta falsa glicosilaçao pode levar a uma vida média fisiológica reduzida e a reacçoes imunológicas indeseja— das. A remoção da maior parte das posiçoes de N-glicosilaçao potenciais diminui assim a possibilidade da falsa glicosila çao em organismos hospedeiros, de um modo drástico.

Exemplo s

1. Clonagem de F VIIIíC

Para a clonagem de sequências de DNA específi cas do F VIIIíC preparou—se cDNA a partir de tecidos de fígado humano, de acordo com métodos conhecidos (Maniatis, T., Fritsch. E. F. e Satnbrook, J. 1982, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory). Com este cDNA estabeleceram-se bancos genéticos nos vectores AgtlO e Xgtll (Young, R. A. e Davis, R. W. (1983), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80, 1194-1198). Além disso, prepararam-se vários bancos de genes genémicos humanos nos fagovectores X Charon 4a (Lawn, R., et al· (1978) Cell 15, 1157-1174). Pesquizaram-se estes bancos de genes em relaÇao às sequências de DNA específicas do F VIIIíC. O fundamento pa ra o isolamento de todos os clonos específicos do F VIIIíC fo ram 17 oligonucleótidos sintéticos. Estes oligonucleótidos ba seiam-se na sequência publicada por Wood et al. (Wood et al. (1984), Nature 312, 33θ-337) e e correspondem à curta sequência parcial da cadeia codificante ou da cadeianao codificante (Tab. 1). Os oligonucleótidos referidos serviram ou como sonda, apôs marcaÇao terminal radioactiva, para o Screening dos bancos de genes acima referidos, ou para o priming espe cífico de novas sínteses de cDNA com mRNA de fígado humano.

Por meio de hibridaÇao especifica, isolaram—se quatro clonos diferentes a partir dos bancos de cDNA e um clono a partir dos bancos de genes genômicos, que em conjunto cobrem a sequência total do F VIIIíC (Fig. l; o DNA—intrao no clono de DNA genô— mico K20 encontra-se representado por uma linha interrompidaj a numeraÇao das bases na Fig. 1 refere-se ao DNA-exao). A par tir destes clonos, por isolamento dos fragmentos de restrição apresentados na figura 2 e por ligaçao destes fragmentos nos vectores pUCl8 ou pUC19 (Norrander et al. (1983) Gene 26, 101-I06; Yanish-Perron et al. (1985) Gene 33, 103-119), através de vários passos intermediários, obteve-se um plasmldeo que contém a sequência de codificação completa do F VIII:C. Este Plasmldeo, pGX3254 (Fig. 2) tem o comprimento de 10623 pares de bases e contêm a região de codificação do F VIIIíC de 7θ56 pares de bases (correspondente a 2351 aminoácidos do F VIIIíC), bem como 71 pares de bases da região nao translaccionada 5' θ 821 pares de bases da região naõ translaccionada 3’· A sequên cia de codificaÇao total dp F VIIIíC no pGX3254 determinou—se de acordo com o método didesoxi (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 74, 5463-5467) e ê idêntica à sequência do F VIIIíC publicada por Wood et al. No texto que se segue todas as coordenadas sequenciais mencionadas referem-se à sequência do F VIIIíC publicada por Wood et al. As sequências de vector dp pGX3254 sao constituídas por partes de pUCl8 e por ** Λ partes de pUC19· Por construção conjunta da sequencia de codi ficaÇao do F VIIIíC, por meio de posiçoes de restrição adequa das em vectores plasmideos, inseriu-se um agente de lincagem Xhol sintético (GCTCGAGC), nas posiçoes Hpal existentes natu— ralmente, na região nao codificante 3’ (posição 7433) da sequência do F VIIIíC (pGX3243). Além disso, por subclonagem de um fragmento PvuII, que contêm a sequência do F VIIIíC de 71 a 103θ do λ9δ (Fig. l), na posição Smal do vector pGX3237 (re giao de polilincagemí Ciai—Sphl-Xhol—Xbal—EcoRI—Smal-BamHI-SalI-Pstl-HindlII), obteve-se o plasmldeo pGX3238, que contêm uma única posição Xhol na posição 104 (5’ do codao de ini ciaçao do F VIIIíC—ATG). Por meio do acoplamento das regiões 5»_F VIIIíC do pGX3238j dos subfragmentos apresentados na Fig. 2 e efes regiões 3'—FVIII:C do pGX3243, obteve—se o pGX3254,que contêm então a sequência total do F VIIIíC, flanqueada por po- 6 siçoes Xhol. Na figura 2 da por uma linha preta a um contorno fino.

cheio e a região nao codificante por

2· Preparaçao dos mutantes de eliminaÇao pGX3788 e pGX3789

Prepararam-se dois mutantes de eliminaÇao em relaÇao à sequência de cDNA do F VIII:C naturalmente ocorrente no pGX3254. Utilizou-se a técnica da mutagene pontual diri gida (site—directed mutagenesis) de acordo com Zoller e | i

Smith (Zoller, M. J. e Smith, M. (1983) emí Methods Enzymol. 100:468-500). 0 plasmídeo pGX3788 contêm uma sequência para ο ί F VIII:C, na qual se eliminou a informação codificante para j os aminoácidos 74l a 1689 (= F VIII:C ^74l—I689). 0 plasmídeo ! pGX3789 contêm uma sequência, na qual se elimina a informação ’

I para os aminoácidos 8l6 a 1598 (= F VIII:C Δ816—1598). De modo anêlogo a da construção anteriormente descrita para o pGX— 3254, prepararam-se o pGX3788 e o pGX3789 igualmente flanquea dos por posiçoes Xhol na mesma posição.

a) Estratégia para a mutagénese

Pensou-se que as sequências repetitivas na se quência de c—DNA do F VIII:C poderiam ser a causa da ocorrência de possíveis eliminações espontâneas durante a mutagêne— se. Por esta razao, efectuou—se a mutagénese em subclonos da sequência de pGX3254 que nao possuem essas sequências repetitivas. Escolheram-se os subclonos de modo a que, apés efectua da a mutagénese através da escolha de posiçoes de restrição adequadas, se pudesse construir um plasmídeo que codificasse para uma molécula de F VIII:C com a eliminaÇao desejada.

b) Preparaçao de subclonos para a mutagénese

Subclonaram-se dois fragmentos de F VIII:C pa ra a mutagénese·’ um fragmento BamHI com 2874 bp (pares de bases) (posição 1869—4743) Fig. 3a) θ um fragmento Sphl com

e-j»

265O bp (posição 3931—6581» Fig 3a)· θ vector para a subclona gem foi o pGX2Ó27 (Fig. 4). Este contém um agente de polilin— cagem com posiçoes de corte para os enzimas de restriçaoJClal-Sphl—PvuII—Xbal—EcoRI-Smal—BamHI—SaII—PstI—Hindlll, bem como, para além de uma origem de replicaÇao específica de plasmídeos

I o do bacteriófago M13· Este último permite o empacotamento de cadeias simples do DNA plasmídeo por meio de uma superinfec— | çao com bacteriófagos Μ±3· 0 vector pGX2683 contêm a região i de polilincagem com orientação contrária a do pGX2Ó27· Os DNA's de cadeia simples assim obtidos serviram em seguida como tem- I ί

platos para a mutagênese induzida por oligonucleétidos. 0 sufe | clono pGX46O2 (Fig. 5) possui o fragmento BamHI acima referi- i do na posição BamHI do pGX2Ó27· 0 subclono pGX4604 (Fig. 7) I possui o fragmento Sphl acima referido na posição Sphl do I pGX2Ó27 e o subclono pGX46O5 (Fig. 9) possui o mesmo fragmen- ί

I to Sphl na orientação contrária no pGX2Ó27· i

c) Mutagênese ί

i

Isolou—se a cadeia nao codificante do plasmí— deo pGX46O2 (Fig. 5) e, através do oligonucleótido sintético í

5’-AAA TAT GAG ACG CGT fCT GAT GAT—3’, introduziu—se uma nova posição MluI (posição 2500) na posição de codao 8l4/8l5 (ACT TTT—ACG CGT) na sequência do F VIII:C. O plasmídeo resultan 1 te ê o pGX3787 (Fig. 6). 1 ! I í

Isolou-se a cadeia nao codificante do plasmí- j deo pGX4604 (Fig. 7), do modo acima descrito e, através dooli . gonucleótido sintético 5’-AAT CAG AGC CCC CGA AGC TTT CAA AAG- j -3’ s introduziu-se uma nova posição Hindlll (posição 5124) nas posições de codõo I689/I69I (CGC AGC TTT -> CGA AGC TTT) na se quência do F VIII:C. O plasmídeo resultante ê o pGX37Ô2 (Fig.

8).

í

Isolou-se também a cadeia codificante do pias I mídeo pGX46O5 (Fig. 9) e util izou-se como templato de DNA em i conjunto com o oligonucleótido sintético 5'—CAG GGA CAA ACG j

CGT ATC CTT TTT CTT—3' > para introduzir uma nova posição MluI

I (posição 4846) na posição de codão 1579/1598 (ACC ATT — ACG CGT) na sequência do F VIII:C. 0 plasmídeo resultante ê o pGX37Ô3 (Fig. 10).

d) Construção conjunta dos plasmídeos pGX3788 e Ρ&Χ37θ9

Prepararam-se em seguida os plasmídeos pGX3788 (= F VIII:C/V41-1689) e _PGX3789(= F VIII:C$8l6-1598) por j introdução das regiões 5’ © 3’ 80 F VIII:C em falta· A cons— j truçao conjunta efectuou-se em vários passos. í [

e) pGX3788

Ligou—se o fragmento isolado HindIII (posição 5124)-SphI (posição 6581) do pGX37Ô2 (Fig. 8, parte tracejada) com o fragmento isolado BamHI (posição 1869)—HindIII (posição 2277) do pGX46O2 (Fí;í. 5) © com o fragmento grande do PGX2683 tratado com fosfatase alcalina. Procedeu-se à transformaçao da mistura em E. coli, estirpe JM101, e analisou-se o DNA pias mídeo das colónias resistentes à ampicilina por endonuclease de restrição. Isolou-se o DNA plasmídeo de um clono correcto, pGX3791, e confirmou—se a eliminação por meio de sequenciaçao (Fig. 11B).

Construiu-se o pGX3788 por ligaçao dos frai gmentos apresentados na Fig. 13. 0 pGX3794 contêm o extremo 5' ’ da sequência do F VIII:C como fragmento Xhol (posição 104)— -BamHI (posição 1869)(Fig. 12B ) e o pGX3793 contêm o extremo : 3’ da sequência do F VIII:C como fragmento Sphl (posição 6581)-Xhol (posição 7437)(Fig· 12A). Os fragmentos ligaram-se um com o outro, de modo a manter a ordem de leitura de transia— cÇao do F VIII: C e a fundir os codoes 740 (Arg) e ΐ69θ (Ser) ' por meio de uma posição HindIII (Fig. 14). Deste modo, a molê j cuia especificada pelo pGX3788 possui uma eliminaÇao que abran ge os aminoácidos 74l a 1689 do factor VIII:C.

i

f) PGX3789

Construiu-se em primeiro lugar o plasmídeo pGX379O Fig. 11A) por meio da ligaÇao dos fragmentos seguintes: fragmento MluI (posição 4846)-SphI (posição 6581) do PGX3783» fragmento BamHI (posição 1869)—MluI (posição 25θθ) do pGX3787 e fragmento grande BamHI—Sphl do pGX2683» tratado com fosfatase alcalina· Isolou—se o DNA plasmldeo do clono correc to, segundo análise por restrição, pGX379O, e confirmou-se a eliminaÇao por meio de sequenciaÇao (Fig. 11A). Construiu—se em seguida o pGX3789 por ligaÇao dos fragmentos apresentados na Fig. 15· Ligaram-se os fragmentos um com o outro, de modo a manter a ordem de leitura de translacçao do F VIII:C e a fundir os codoes 815 (Thr) e 1599 (Leu) por meio de uma posição MluI, introduzindo-se um aminoácido adicional (arginina) entre as posiçoes 815 (Thr) e 1599 (Leu) (Fig. 16). Deste modo, a molécula especificada pelo pGX37Ô9 possui uma eliminação que abrange os aminoácidos 8l6 a 1598 do F VIII:C. A Fig.

apresenta a carta de restrições do pGX3254 em comparaçao com os mutantes de eliminaÇao pGX3788 e pGX3789·

3· Construção de plasmídeos de expressão do F VIII:C

Isolou—se o fragmento Xhol com 75^0 pares de bases, a partir do plasmldeo pGX3254, que contêm a sequência total de codificação do F VIII:C, encheu—se por meio do fragmento de Klenow da DNA-polimerase e ligou-se na posição cheia Xbal do vector pZET4 ou na posição cheia Xbal do vector pSVA— STOP 1. 0 vector pZET4 utiliza o promotor SV40 para a expressão de genes heterélogos e possui sinais de junção de mRNA (registo DE 36 21 371 Al). 0 vector pSVASTOP 1 utiliza também o promotor SV40, mas nao possui sinais de junção de mRNA (registo DE 36 24 453 Al). Os plasmídeos resultantes, que contêm o fragmento F VIII:C na orientação correcta em relaÇao ao pro motor SV40 do pZET4 ou do pSVASTOP 1, são o pZF VIII:C ou o pSVF VIII:C.

Isolou—se o fragmento Xhol com 469¾ pares de bases do pGX3788, que contêm a região de codificaÇao do mutan te de eliminação F VIII:0^7^1-1689> procedeu—se ao seu enchimento, e ligou-se na posição cheia Xbal do vector pZET4 ou na posição cheia Xbal do vector pSVASTOP 1. Os plasmídeos resultantes, que contêm o fragmento F VIII:C na orientaÇao correc— ta em relaçao ao promotor SV4O no pZET ou no pSVASTOPI, sao o ! pZF VIII:0^741-1689 ou o pSVF VIII:Câ74l-l689. ^J t

Isolou—se o fragmento Xhol com 5195 pares de bases, a partir de pGX3789» que contêm a região de codificação do mutente de eliminaÇao F VIII: C/l8l6—1598, procedeu-se ao seu enchimento e ligou-se na posição cheia Xbal do vector pZET4 ou na posição cheia Xbal do vector pSVASTOPI. Os plasmí deos resultantes, que contêm o fragmento F VIII:C na orientação correcta em relaçao ao promotor SV4O no pZET4 ou no pSVA— ST0P1, são o pZEF VIII: C/8l6-1598 ou o pSVF VIII: C/l8l6-1598.

4. Expressão do factor VIII:C em células animais

Co—transfeccionaram—se as construções de fa— ctor VIII:C, descritas na secção 3» com dois plasmídeos DHFR diferentes (pSVOAdhfr, registo DE 36 24 453 Al, ou pSV2dhfr,

Lee et al. , Nature 2 9¾ (198D, 228-232) em células DHFR” CHO (Urlaub e Chasin (1980), Proc. Nat. Acad. Sei. USA 77» 4216— -4220), ou com o vector pRMHl40 (Hudziak et al. , Cell 31 (l98l), ! 137-146) em células BHK. Seleccionaram-se em seguida as células transfeccionadas do fenétipo DHFR⁺ NE0⁺. As camadas sobre nadantes dos clonos celulares obtidos por selecção submeteram -se a testes com vista à produção de F VIII:C.

A identificação processou—se de acordo com três métodos diferentes:

i) Identificação imunológica pelo método ELISA.

Neste caso utilizou-se a combinaÇao de anti-soro policlonal contra F VIIIíC (por exemplo K. F VIII:C Cag: 9460— —010886; Behringwrke) e dos anticorpos monoclonais ESH2,

_ ί j ESH8 (Bioscott)j conjugados com peroxidase. 0 limite inferior de detecçao situou—se entre 1 e 3 ng de F VIII:C/ /ml.

ii) Teste de actividade biológica com o COA—TEST F VIII:C (Kabi Vitrum). 0 limite inferior de detecçao foi de 1—3 ng de F VIIl:C/ml.

iii) Teste de congelação segundo Lee et al., Throm. Res. 3θ (1983) 511-519. (

a) Expressão em células CHOί

Co—transfeccionaram—se cada um dos plasmídeos | de F VlIIiC, pSV F VIII:C, pSV F VIII:c/tel6-1598, pSV F VIII: ' :c/74l-l689» pz F VIIIíC, pZ F VIII:C/8l6-1598 OU pZ F VIIIíC- ( 2l74l-l689, com um dos vectores DHFR, pSVOAdhfr ou pSV2dhfr, de acordo com o método da co—precipitaÇao com fosfato de cálcio (Graham e van der Eb , Virology 52 (1973)» 456—467) em células CHO.

Para tal misturaram-se, em cada caso, 20 pg dos plasmídeos de expressão de F VIII:C com 5 pg dos vectores DHFR (pSV2dhfr ou pSVOAdhfr), procedeu-se à co-precipitaÇao e submeteram-se em seguida à transfecçao (0,5—ΙχΙΟθ células num j

Q _χ ί volume de cultura de 25'cm ). Após 3 dias procedeu-se a tri- i psinaçao das células, transferiram-se para caixas de Petri de 60 mm e adicionou-se-lhes um meio de selecçao (sem glicina, hipoxantina e timidina). Nestas condiçoes sobrevivem apenas : as células que foram transfeccionadas de forma estSvel com o gene DHFR.

Após 1 a 3 semanas isolaram-se clonos celulares individuais e procedeu-se à sua multiplicaÇao num meio sem glicina, hipoxantina e timidina. Testaram—se as camadas sobre nadantes com um total de 73 clonos celulares, de entre os j quais se puderam identificar 12 clonos sobrenadantes F VIII:C, I que imunologicamente como antigenes, quer ainda por meio da sua actividade biológica. A Tab. 2 representa um quadro geral dos clonos celulares F VIII:C expressos em relaÇao às constru—

cçoes transfeccionadas em células CHO.

**» #* Como exptessao basica antes da amplificaçao com Methotrexatj identificaram-se 2-3 ng/ml de antigenes F VIII:C, por meio de identificação com o método ELISA. A actividade biológica dos clonos F VIII:C expressos situou—se en tre 8 e l4 MU/ml/ΙΟθ células.

b) Expressão de F VIII:C em células BHK

Co—transfeccionaram—se 20 pg de cada um dos plasmldeos de expressão de F VIII:C, pSV F VIII:C, pSV F VIII: Ç^8i6-1598, pSV F VIII:C67(H-1689, pZ F VIII:C, pZ F VIII: CÀ816-1598 ou pZ F VIII: 04741-1689, com 10 ^ig do plasmídeo pRMHl40 codificante para a resistência a G4l8, de acordo com o método da co—precipitaÇao com fosfato de cêlcio, descrito em a), em células BHK. Após 3 dias procedeu-se à tripsinaÇao das células, transferiram-se para três caixas de-Petri de 6θ mm, e adicionou-se-lhes um meio de selecçao contendo 400 ^ig/ml de G4l8. Após 12 a 14 dias isolaram—se os clonos celulares re«is tentes ao G4l8 e procedeu—se à sua multiplicação. Testou—se um total de 45 clonos celulares das camadas sobrenadantes, com vista à sua actividade antigênica e biológica, de acordo com os métodos descritos em a), tendo reagido 19 clonos sobrenadantes de forma positiva em relaçao ao F VIII:C. A Tab. 3 apre senta um quadro geral da distribuição dos clonos celulares F VIII:C expressos, em relaçao as construções transfeccionadas em células BHK.

A actividade biológica média dos clonos celulares F VIII:C expressos situou—se em cerca de 12MU/ml/10^ cê lulas. Segundo o método ELISA puderam identificar-se 2—4 ng/ml de antigenes F VIII:C.

Testou—se, com trombina, a camada te de cultura de um novo clono celular, que tinha feccionado com a construção pZ F VIII: Cz^74l—1689, sobrenadan— sido transcom vista à

capacidade de activaçao do mutante de eliminaÇao expresso (Too le et al.j Nature 312 (Ι9θ4)» 3^2-347)· Para tal» adicionou-se à camada sobrenadante de cultura lU/ml de trombina e incubou-se à temperatura ambiente. Recolheram-se amostras alíquotas a tempos variados (t ) θ determinou—se a actividade biológica ^A ~ I por meio do teste de coagulaÇao. A fig· 17 apresenta o resul- ! tado desta experiência. AÍ» assinalam-se os tempos de coagula çao (t ) com (—x-) e os MU/ml correspondentes com (-·—)» me— dindo-se a influência da ρς-trombina (1 U/ml) sobre a activida de da molécula de F VIIIί0^741-1689· Desta experiência resulta que a molécula de F VIII: C/Í7(H-l689 ê activado por um factor de cerca de 10 devido à influência da trombina.

Mostrou—se ainda» em comparaçao com o mutante F VIII: CZÍ816-1598 e com o F VIII:C natural» que o mutante j

F VIII:0^816—1589 apresenta um tempo de inactivaÇao realmente maior.

Tabela 1:

.)

Oligonucleótidos específicos do F VIII:C

Oligonucleótido NQ

Posição

3í

Cadeia codificante!

1572

1609

1610

1613

1611

1573

1612

1614

Cadeia nao codificante:

1492

1493

1494

1495 1531

1496

1497

1498

1499

- 20 301 - 317 962 - 978

1761 - 1777 3429 - 3445 4l4l - 4i6o 4992 - 5008 6i4i - 6157

7198 - 7179 6465 - 6446 5685 - 5666 5092 - 5073 2400 - 2351 2339 - 2320 1179 - 1160

570 - 551 120 - 101

Posição em bp (pares de bases) referente à sequência de Wood et _al., (1984) Nature 312, 330-337

Tabela 2: Clonos expressos em CHO do factor VIII:C

A) Cotransfeccionados com com pSV2dhfr·’

Plasmídeo

Quantidade DHFR⁺—clono

Positivo em relaçao à expressão do F VIII:C (ELISA; Teste COA) pSV F VIII:C 6 pSV F viu: CÓ816-1589 8 pSV F VIII :Od74l-1689 0 pZ F VIII:C 2 0 pz F VIII:CA816-1598 13 5 pZ F VIII:C4741-1689 4 0

B) Cotransfeccionados	com pSVOAdhfr:
pSV F VIII:C	l4	2
pSV f viu: (^816-1598	6	0
pSV F VIII:C4741-1689	6	I
pZ F VIII:C	4	1
pZ F VIII:G4816-I598	7	2
pZ F VIII:0^7^1-1689	3	0
	73	12

Tabela 3^; Clonos expressos em BHK do factor VIII:C cotransfeccionados com pRMHlÇO

Plasmídeo Quantidade Positivo em relaÇao à

Neo⁺—Clono expressão do F VIII :C (ELISA; Teste COA)

pSV	F	VIII:C	7	1
pZ	F	VIII: ΟΔ741-1689	22	9
pZ	F	VIII: OÚ816-1598	9	3
pSV	F	VIII :02)816-1598	7	6

19

Claims

- ia _

Processo para a preparaçao de derivados de Fa ctor VIII:C, em que se removeu parte da informação genética» por remoção (deletion) da sequência genética que codifica certos aminoácidos» de acordo com o método da mutagénese pontual dirigida (site directed mutogenesis), caracterizado por se manter a posição de corte (cisão) da trombina natural exis

372 740 ~~ tente em Arg , se introduzir uma nova em Arg . e se remove ' ₊ · ₊ a 1648 . lbtíy rem as previamente existentes em Arg e Arg .

- 2ô Processo para a preparaçao de derivados do Fa17 ctor VIII:C, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se removerem (apagarem) os aminoácidos 74l a 1689 da molé cuia autêntica.

_ «V

Processo para a preparaçao de derivados de Fa ctor VIII:c, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se exprimir o DNA codificante para os derivados de Factor VIII:C em bactérias, leveduras, células humanas ou animais.

- 4a «*» M

Processo para a preparaçao de uma composição farmacêutica» caracterizado por se incorporar como ingrediente activo um derivado de Factor VIII:C, quando preparado da acordo com as reivindicações I, 2 ou 3, com veículos farmacêu

A ** ticos ou substancias tampao adequados.

* requerente declara que o primeiro pedido

- »·