PT87545B

PT87545B - Processo para a preparacao de composicoes lipossomicas compreendendo metabolito de acido araquidonico

Info

Publication number: PT87545B
Application number: PT87545A
Authority: PT
Inventors: Robert P Lenk; Robert L Suddith; Michelle M Tomsho; Robert J Klimchak
Original assignee: Liposome Co Inc
Priority date: 1987-05-22
Filing date: 1988-05-20
Publication date: 1992-12-31
Also published as: FI95199C; DE3851090T2; HK1007496A1; PT87545A; FI895554A0; AU617678B2; WO1988009170A1; ZA883653B; EP0292403B1; KR890701093A; FI95199B; CA1323838C; US5082664A; EP0292403A2; DE3851090D1; EP0292403A3; ES2058317T3; ATE109982T1; AU1954588A; KR970005171B1

Description

MEMÓRIA DESCRITIVA

PEDIDO AFIM DOS EUA

Este pedido é uma continuação-em-parte do pedido de paten te copendente N² 055 505, depositado a 22 de Maio de 1987.

ANTECEDENTES DO INVENTO presente invento é dirigido a formulações e métodos de preparação de lipossomas associados a metabolitos do ácido ara quidónico. Estes metabolitos do ácido araquidónico também incluem os compostos estruturalmente análogos, inibidores de enzimas sintéticos e o próprio ácido araquidónico. Uma classe destes metabolitos do ácido araquidónico é constituída pelo gru po dos agentes bioactivos conhecidos como prostaglandinas. Este invento revela particularmente lipossomas associados com prostaglandinas, usando a prostaglandina E^. 0 termo prostaglandina inclui também os compostos sintéticos estruturalmente relacionados com as prostaglandinas naturais.

As prostaglandinas são substâncias encontradas essencialmente em todos os tecidos humanos e fluidos corporais e produzem um espectro largo de efeitos abrangendo praticamente todas as funções biológicas. Estas substâncias são derivadas dos áci dos gordos essenciais com 20 átomos de carbono (sendo o precursor mais abundante o ácido araquidónico) e são sintetizados bio logicamente em estruturas tais com as da subclasse E^ das prostaglandinas com 20 carbonos (PGE-^) cuja fórmula é a seguinte:

As outras subclasses de prostaglandinas são designadas por le tras e distinguem-se por substituições no anel ciclopentano.

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-3Estas subclasses são as séries prostaglandina E e P . as quais são as mais extensivamente estudadas, sendo as subclasses A, B e C derivadas das E's. As prostaglandinas A a E são considera das prostaglandinas primárias; as estruturas das prostaglandinas CL·, e (os endoperéxidos cíclicos) e os tromboxanos k% e B₂ foram mais recentemente estabelecidas (Goodman et al., eds., The Bharmacological Basis of Therapeutics, MacMillan Publishing Co., New York, pp. 668-676). Outros agentes bioactivos que podem ser usados na invenção são as prostaciclinas e os leucotrienos.

As prostaglandinas têm diversas acçães fisiológicas tais como acção vasodilatadora, melhoramento da circulação sanguínea periférica e antilipólise. As prostaglandinas são terapêuticamente indicadas em muitas situações, que incluem mas não estando limitadas a ductus arteriosus, estimulação das contracçães uterinas conducentes à indução do parto e também do aborto, tra tamento da asma bronquica, e supressão da ulceração gástrica nos animais. São também usadas na profilaxia da arterioesclerose.

Os Iipossomas são membranas lipídicas com duas camadas, completamente fechadas, encerrando no seu interior um volume aquoso. Os Iipossomas podem ser vesículas unilamelares (possuin do uma só bicamada de membrana) ou vesículas multilamelares (estruturas do tipo cebola caracterizadas por bicamadas membranares múltiplas, cada uma separada da seguinte por uma camada aquosa). A bicamada ê composta por duas monocamadas lipídicas possuindo uma região hidrofóbica (cauda) e uma região hidrofílica (cabeça). A estrutura da bicamada membranar é tal que as caudas hidrofóbicas (não polares) das monocamadas lipídicas se orientam em direcção ao centro da bicamada enquanto que a cabeça hidrofílica se orienta em direcção à fase aquosa.

A preparação original de Iipossomas de Bangham et al. (J. Mol. Biol., 1965, 12:238-252) envolve a suspensão de fosfolípi dos num solvente orgânico 0 qual é depois evaporado até á secu ra deixando um filme de fosfolipido no vaso reaccional. Em se guida, adiciona-se uma quantidade apropriada de fase aquosa, a

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-4mistura ê deixada a “inchar” e os lipossomas resultantes que são constituídos por vesículas multilamelares (MLVs) são dispersos por meios mecânicos. Esta técnica constitui a base para o desenvolvimento de pequenas vesículas unilamelares submetidas a tratamento sónico descritas por Papahadjopoulos et al. (Biochlm. Biophys, Acta., 1968, 135:624-638), e de grandes vesículas unilamelares.

As vesículas unilamelares podem ser produzidas usando um equipamento de extensão por um método descrito em Cullis et al., Pedido PCT N⁹ WO 86/00238, 16 de Janeiro 1986, de título Extrusion Technique for Producing Unilamellar Vesicles” incorporado aqui para referencia. As vesículas produzidas por esta técnica, designadas por 1UVETS, são extrusadas sob pressão atra vés de um filtro de membrana. As vesículas podem também ser produzidas por uma técnica de extrusão através de um filtro de 200 nm, sendo estas vesículas conhecidas como VET2qqS.

Outra técnica usada para a formação de lipossomas ê o pro cesso de evaporação em fase inversa” (REV) de Papahadjopoulos (Patente Americana N⁹ 4 235 871, concedida a 25 de Novembro de 1980). Este processo forma vesículas oligolamelares lipídicas em que o material aquoso a encapsular é adicionado a lípidos num solvente orgânico, de modo a formar uma emulsão do tipo água-em-óleo. 0 solvente orgânico é removido, formando um gel.

gel é disperso num meio aquoso convertendo-o numa suspensão. Ainda outra técnica consiste no processo de diálise com detergente (Enoch et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sei. 76:145).

Neste processo, o lípido é misturado com um detergente tal como o desoxicolato em solução aquosa, submetido a tratamento só nico, sendo o detergente removido por filtração em gel. Uma outra técnica é a técnica de infusão em etanol de Batzri et al. (1973, Biochim. Biophys. Acta., 298:1015), para a formação de vesículas unilamelares pequenas, em que uma solução de lípidos em etanol é injectada na fase aquosa desejada formando liposso mas com um diâmetro de cerca de 30 nm a cerca de 2 jim . 0 eta nol residual pode depois ser removido por rotoevaporação.

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Outra classe de lipossomas que pode ser utilizada no presente invento é a dos caracterizados por possuírem uma distribuição lamelar do soluto substancialmente igual. Nesta classe os lipossomas denominam-se vesículas plurilameiares estáveis (SPLV) como definido na Patente Americana N⁹ 4 522 803, Lenk, et al., vesículas monofásicas como descritas na Patente Americana N⁹ 4 558 579, Poutain et al., e vesículas muitilameiares congeladas e descongeladas (PATMLV) em que as vesículas são ex postas a pelo menos um ciclo de congelação e descongelação; es te procedimento é descrito em Bally et al., Publicação PCT N⁹87/00043, 15 de Janeiro de 1987, sob o título Kultilamellar Liposomes Having Improved Trapping Efficiencies”. Incorpora-se aqui para referência a parte mais importante destas referências.

Num sistema de distribuição de uma droga através de lipos somas, um agente bioactivo, tal como uma droga, ê retido no li possoma ou é-lhe associado sendo depois administrado ao pacien te a tratar. Ver por exemplo, Rahman et al., Patente Americana N⁹ 3 993 754; Sears, Patente Americana N⁹ 4 145 410; Papaha djopoulos et al., Patente Americana N⁹ 4 235 871; Schnieder, Patente Americana N⁹ 4 114 179; Lenk et al,, Patente Americana N⁹ 4 522 803; e Pountain et al., Patente Americana N⁹ 4 588 578.

uso de lipossomas na administração de drogas tem levantado problemas no que diz respeito tanto a encapsulação de dro ga como à libertação da droga durante a terapia. No que diz respeito à encapsulação, tem havido necessidade contínua de au mentar as eficiências de retenção de modo a minimizar a carga lipídica a apresentar ao doente. Adicionalmente, as eficiências de retenção elevadas significam que apenas uma pequena quantidade de droga foi perdida no processo de encapsulação, o que constitui uma vantagem importante quando se lida com drogas ca ras. No que diz respeito à libertação da droga, tem-se consta tado que muitas drogas são rapidamente libertadas dos lipossomas após encapsulação. Esta libertação rápida diminui os efei tos benéficos da encapsulação em lipossoma. Assim, têm-se sido feitos esforços contínuos pelos especialistas na matéria pa67 764 ^ef: ST.601

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-6ra encontrar maneiras de reduzir a velocidade de libertação das drogas dos lipossomas.

Para lá destes problemas da encapsulação e libertação, hâ o problema dominante de encontrar uma maneira comercialmente aceitável de fornecer lipossomas contendo droga ao clínico. Embora a produção e enchimento de lipossomas numa base ”à medida do necessário” seja um procedimento aceitável sob o ponto de vista experimental, é, em geral pouco exequível sob o ponto de vista clínico. Como tal, há uma necessidade significativa e constante destes métodos em que os lipossomas, com ou sem as drogas encapsuladas, podem ser expedidos, armazenados e, em ge ral, movimentados através dos canais de distribuição comercial convencionais sem danos substanciais.

SUMÁRIO DO INVENTO presente invento revela um procedimento de encapsulação que aumenta significativamente a partição e a subsequente retenção da prostaglandina no lipossoma, e a estabilidade da for mulação de prostaglandina retida no lipossoma, Mais especificamente, os lipossomas são formados inicialmente numa solução aquosa de pH relativamente básico, sendo o pH depois ajustado a um pH relativamente ácido. Depois da acidificação da solução lipossómica externa a prostaglandina fica associada aos li possomas. Esta associação pode efectuar-se por partição nas membranas lipossémicas e através delas. Este procedimento resulta surpreendentemente em 50 a 100% de retenção da prostaglan dina nos lipossomas. 0 sistema tampão usado para atingir esta retenção é portanto designado por tampão activador de partição.

Os lipossomas resultantes são reduzidos em tamanho a uma distribuição homogénea de tamanho. Após ajuste do pH, a solução resultante pode ser desidratada ou liofilizada e guardada até ao seu uso, altura em que pode ser re-hidratada usando uma solução aquosa. Este processo requer a adição de um protector de secagem antes do processo de secagem (desidratação ou liofi lização) que mantém o tamanho da partícula de lipossoma após

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-7re-hidratação. Na ausência deste protector de secagem as forças que mantêm a integridade do lipossoma quando numa suspensão aquosa são removidas. Este protector pode ser um sacarídeo como a sacarose, dextrose, maltose, manose, galactose, rafinose, tre-halose ou lactose. 0 manitol pode ser usado em conjunção com quaisquer dos sacarídeos. Podem também usar-se outras subs tâncias tais como a albumina, dextrano ou o álcool polivinílico.

Podem usar-se lípidos baratos no presente invento e podem atingir-se facilmente eficiências de retenção de cerca de 50% e superiores (preferêncialmente 80-100%) para uma grande gama de composições de lípidos. Outra vantagem única deste processo de incorporação dirigido pelo pH é a de que há uma redução na velo cidade à qual a droga ê libertada dos lipossomas resultando no aumento de estabilidade comparativamente aos lipossomas com pros. taglandina retida passivamente (sem gradiente de pH). Esta redução da velocidade de libertação do agente bioactivo retido é mediada pela diferença de pH das soluções aquosas (o sistema tampão activador da partição) usadas nas preparações. Como tal, o tampão ou sistema tampão activador de partição ajuda a retenção da prostaglandina nos lipossomas.

Como tal a presente invenção revela uma composição lipossémica que compreende um metabolito do ácido araquidónico que é preferencialmente uma prostaglandina, um lípido, um protector de secagem e um tampão ou sistema tampão activador de partição.

A prostaglandina é preferencialmente a prostaglandina E^. Os lipossomas podem possuir um potencial químico transmembranar tal como um gradiente de concentração, que ê preferencialmente um gradiente de pH. 0 sistema tampão activador de partição com preende duas soluções, sendo uma, uma solução de protector de secagem, preferencialmente uma solução de sacarídeo, e a segunda, preferencialmente uma solução de ácido cítrico. A solução de sacarídeo é preferencialmente de dextrose, sacarose ou maltose qualquer dos quais pode ser combinado com manitol. Podem usar-se outros protectores como o dextrano, álcool polivinílico ou albumina. 0 pH da solução protectora é preferencialmente re lativamente básico, a pH de cerca de 3-pH de cerca de 11, mais

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-8preferencialmente a pH de cerca de 7. A solução protectora de secagem, preferencialmente uma solução de sacarídeo, está presente em cerca de 5% a cerca de 20% em peso, mais preferencial mente em cerca de 10% a cerca de 12%. A solução de lipossoma pode depois ser reduzida em tamanho por por exemplo, um procedimento de extrusão ou homogeneização. A solução resultante pode ser seca por um procedimento de desidratação ou liofiliza ção. A solução de ácido cítrico tem preferencialmente um pH de cerca de 2,5 a cerca de 4,5 mais preferencialmente pH 5,0 .

Os lípidos compreendem preferencialmente os fosfolipidos, com mais preferência a fosfatidilcolina, com a maior preferência a fosfatidilcolina do ovo. Os lipossomas têm um diâmetro de, preferencialmente, 100 a 500 nm e com maior preferência de cerca de 200 nm. A retenção da prostaglandina nos lipossomas é de cerca de 50 a cerca de 100%, mais particularmente entre cerca de 60 e 100%. A composição lipossómica pode ser injecta da intravenosamente num paciente. As composições farmacêuticas das prostaglandinas lipossómicas podem ser feitas através da sua mistura com um veículo ou diluente farmacêutico.

A razão poderal lípido/prostaglandina nas composições do presente invento ê de cerca de 150:1 a 1000:1, de preferência de cerca de 500:1 a 800:1, preferencialmente cerca de 600:1.

As composições lipossómicas de prostaglandina do invento também podem ser liofilizadas.

Os lipossomas do invento podem ser preparados por associa ção da prostaglandina com o lípido por meio de um gradiente de pH transmembranar. Este gradiente pode ser obtido formando pri meiro os lipossomas num meio aquoso básico, adicionando a prostaglandina à suspensão aquosa, e acidificando, em seguida, o meio (aquoso) externo dos lipossomas. 0 meio básico externo po de ser uma solução de um sacarídeo, enquanto a acidificação pode ser conseguida pelo uso de uma solução ácida tal como uma so lução de ácido cítrico.

Os lipossomas do invento podem ser reduzidos em tamanho até uma distribuição uniforme de tamanhos extrusando-os através

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-•JC.ÍÍ

-9de filtros com trajectos lineares ou tortuosos, ou por homogeneização. Sste passo de redução de tamanho é executado, prefe rêncialmente, antes da adição da prostaglandina, do passo de secagem e da formação do gradiente de pH transmembranar.

Alternativamente, os lipossomas do invento, podem ser pre parados utilizando uma técnica passiva de enchimento, em que o lípido é misturado com uma solução aquosa do protector de seca gem que também contém a prostaglandina. Este lípido pode ter a forma de um filme seco de lípido. Estes lipossomas de enchi mento passivo também podem ser liofilizados.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

Os lipossomas deste invento apresentam metabolitos do áci do araquidónico, especificamente prostaglandinas, em associação com lipossomas. Esta associação inclui a retenção da prostaglandina no lipossoma, e a associação potencial da prostaglandina com a superfície da membrana externa ou interna do lipossoma.

Gomo foi discutido acima, os lipossomas da invenção podem ser formados por qualquer dos métodos conhecidos para formação de lipossomas, mas eles são preferencialmente cheios com agente bioactivo de acordo com os procedimentos para agentes antineoplásticos ionizáveis, referidos por Bally et al., Pedido PCT N² 86/01102 de 27 de Pevereiro de 1986 incorporado aqui eo mo referencia. Esta técnica permite o enchimento dos lipossomas com agentes bioactivos Ionizáveis em que se cria um gradiente de concentração transmembranar através das membranas dos lipossomas e a droga é introduzida nos lipossomas por meio de_s te gradiente. O gradiente de concentração transmembranar (iénico) é gerado por criação de um gradiente de concentração de uma ou mais espécies carregadas (p.e Na⁺, Cl”, K⁺, Li⁺, H⁺) através das membranas dos lipossomas. Estes gradientes iénicos são preferencialmente gradientes de pH (H⁺). Estes gradientes de pH podem levar à incorporação de agentes bioactivos ionizáveis (drogas, tais como prostaglandinas) através das membranas dos lipossomas.

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-10De acordo com o presente invento, preparam-se lipossomas que encapsulam um primeiro meio aquoso (relativamente acídico ou básico). No caso da PGE^, verificou-se que um esquema de encapsulação em que o primeiro meio aquoso é relativamente básico (em comparação com o segundo meio aquoso) resulta numa maior retenção.

Para criar o gradiente de concentração ajusta-se o primeiro meio externo (por ajuste do pH externo), ou adiciona-se um segundo meio externo (o qual pode ser por exemplo, ou rela tivamente básico ou ácido em comparação com o meio externo ori ginal). No caso da retenção da PGE-,, a adição do segundo meio que -*· externo/é ácido relativamente ao primeiro meio externo é prefe rida. Se o primeiro ou o segundo meio externo contiver um agen te bioactivo ionizável tal como uma prostaglandina ionizável, dar-se-á a partição da droga nos lipossomas pelo gradiente de pH (H⁺) transmembranar (no interior básico relativamente ao ex terior), de tal maneira que as razões entre os agentes bioacti vos livres associados as vesículas reflectem as razães entre ^^-Ant ^e /~X±7 _θχΐ · hantém-se um gradiente iónico nos lipossomas mesmo depois de se ter completado o enchimento.

método de enchimento por gradiente de pH transmembranar pode ser usado com praticamente qualquer prostaglandina que pos sa existir em estado ionizável quando dissolvida num meio aquoso apropriado. No caso das prostaglandinas, este grupo ionizável pode ser o grupo carboxilo na cadeia do ácido gordo (Ver I acima). É preferível que a prostaglandina seja também relativamente lipofílica de modo a que se efectue a partição nas mem branas dos lipossomas. São exemplos de algumas destas prostaglandinas que podem ser introduzidas nos lipossomas por este método e que portanto podem ser usadas neste invento as PGE^, PGEg, PGG e PGE, entre outras.

Para lá do enchimento dos lipossomas com uma prostaglandina simples, o método de enchimento por gradiente de pH pode ser usado para carregar várias prostaglandinas simultaneamente ou sequencialmente.

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-11De uma maneira geral, qualquer dos métodos de formação dos lipossomas referido nos Antecedentes do Invento pode ser usado na prática do invento embora se prefiram métodos que formam ve sícuias unilamelares, especialmente vesículas unilamelares gran des. Preferem-se dois métodos para a formação destas vesículas unilamelares: a primeira técnica é a associação de agente bioactivo (droga, especificamente prostaglandina) com o lípido em etanol semelhante a técnica de Batzri et al,, (1973, Biochim. et Biophys. Acta. 298:1015) usando um gradiente de concentração transmembranar como revelado em Bally et al., (supra) para introduzir o agente bioactivo. Nesta técnica o lípido e a prostaglandina são co-dissolvidos num solvente orgânico miscável em água, tal como o etanol a 5% do volume aquoso total, e depois adicionados lentamente a uma primeira solução aquosa. A primeira solução aquosa pode ser uma solução aquosa tal como, pre ferencialmente, uma solução do protector de secagem, ou um tam pão, por exemplo citrato ou fosfato. Esta solução tampão pode incluir, adicionalmente, um protector de secagem. 0 protector de secagem pode ser um sacarídeo tal como a sacarose, maltose, lactose ou dextrose ou uma combinação de sacarídeos tal como sacarose, maltose, lactose ou dextrose com manitol. Utiliza-se preferencialmente a maltose. Podem incluir-se outros sacarídeos, por exemplo, a manose, galactose, rafinose ou tre-halose. Alteraativamente podem usar-se outros protectores tais como o dextrano, a albumina ou o álcool polivinílico. 0 pH desta primeira solução aquosa é relativamente básico (comparado com o da segunda solução aquosa, ver abaixo) por exemplo cerca de 3,0 a cerca de 11,0, mais preferencialmente cerca de 7,0. Por outras palavras, em comparação com a segunda solução aquosa, a primeira é mais básica. Alternativamente este tampão pode ser relativamente ácido (em comparação com o da segun da solução aquosa).

A solução de lipossomas resultante de uma única fase, é reduzida em tamanho para uma população homogénea, por exemplo, por extrusão através de um filtro, de preferencia com um tamanho de poro de 0,2 micron, sendo o filtro do tipo de percurso

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-12linear ou de percurso tortuoso. Esta população pode ser forma da por procedimentos de extrusão de Cullis et al., Publicação POT R^s 86/00258, de 16 de Janeiro de 1986, incorporando-se aqui as passagens relevantes para referencia. Estes procedimentos de extrusão, em que os lipossomas passam através de um filtro sob pressão, permitem a formação de populações homogéneas de lipossomas no que diz respeito ao tamanho. A extrusão pode ser realizada por uma ou mais passagens através de um filtro; por exemplo um filtro de membrana de passagem linear (por exemplo, um filtro de policarbonato Rucleopore) ou um filtro de passagem tortuosa (por exemplo, um filtro membrafil Rucleopore (ésteres mistos de celulose) de 0,2 %im de tamanho). Quando se fazem passar os lipossomas mais de uma vez através do filtro, o número de passagens requerido será determinado pelo necessário para conseguir o tamanho de lipossomas desejado, isto é pre ferencialmente cerca de 0,20 yum.

Os tamanhos de filtro utilizados no invento são escolhidos de acordo com o tamanho desejado do lipossoma final. Ro presen te invento, por exemplo, preferera-se lipossomas tendo um diâmetro médio de cerca de 0,20 >um.

Os lipossomas do presente invento tem preferencialmente um diâmetro inferior a 500 nm, e preferencialmente têm um diâmetro de 100 nm a 500 nm. Ro presente invento, preferem-se os lipossomas de cerca de 200 nm uma vez que os lipossomas com aproximadamente este tamanho podem passar através do leito capilar do pulmão e são portanto capazes de passar para outros órgãos ou tecidos. Consequentemente, escolhe-se, para utiliza ção no passo da extrusão, um filtro com um tamanho de poro de cerca de 0,20 #m.

Outros métodos para a redução do tamanho dos lipossomas a uma distribuição de tamanho homogénea como definida acima são a exposição a ultrasons, a técnica da Prensa Prancesa, o corte hidrodinâmico, homogeneização usando por exemplo um moinho de coléides ou um homogeneizador de Gaulin, ou outras técnicas de redução de tamanho. Por exemplo quando se usa o método de ho67 764

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«τ'

-13mogeneização de Gaulin, os lipossomas a reduzir são recireulados continuamente a partir de um reservatório, por exemplo no homogeneizador, a um caudal de 2 L/min. de maneira a que para um lote de 1 litro, se recirculem os lipossomas durante 4 minu tos a cerca de 14 000 psi. Pode usar-se um permutador de calor para manter a temperatura do lote abaixo de cerca de 30°C.

Os lipossomas de tamanho reduzido resultantes são homogéneos no que diz respeito ao tamanho. Os lipossomas têm por ex emplo uma distribuição de Gauss em torno de uma média de 200 nm, com uma amplitude de cerca de 20 a cerca de 500 nm.

produto de tamanho reduzido resultante pode ser diluído com uma solução aquosa adicional, seco, e armazenado até uso, ou alternativamente, o pH pode ser alterado de modo a introduzir a droga através do gradiente de pH transmembranar. 0 procedimento de redução de tamanho deve no entanto ser realizado antes do ajuste final de pH.

segundo método, e o preferido, para a formação dos lipos somas do invento consiste, usando o método de injecção de etanol de Batzri et al., (acima), em misturar inicialmente o lípi do com um conservante, hidroxitolueno butilado (BHT), por exem pio, em etanol a 5% do volume aquoso total, adicionando-se depois esta mistura lentamente a um primeiro meio aquoso. Este primeiro meio aquoso pode ser qualquer dos descritos acima, mas é preferencialmente uma solução de sacarídeo tal como, por exem pio, maltose. 0 pH desta primeira solução aquosa é básico relativamente à segunda solução aquosa, e está compreendido preferencialmente entre pH 3,0 e 11,0, mais preferencialmente cer ca de 7,0. Este processo forma lipossomas que retêm a solução de sacarídeo.

A solução de lipossomas resultante ê reduzida em tamanho a uma população homogénea por qualquer dos métodos descritos acima, mas preferencialmente pelo método de homogeneização de Gaulin descrito. Formam-se lipossomas de cerca de 20-500 nm, de preferência tendo um diâmetro de cerca de 300 nm a cerca de 500 nm ou preferencialmente com um tamanho médio de 200 nm.

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-140 produto lipossoma de tamanho reduzido resultante pode ser filtrado esterilmente através de um filtro Millipak de 0,2 /im (Millipore, Inc,, Bedford, MA). Os lipossomas de tamanho reduzido e filtrados resultantes são depois misturados com o agente hioactivo que foi dissolvido em etanol. Por exemplo a prostaglandina, dissolvida em etanol, é adicionada a uma solução de lipossomas agitada. 0 produto prostaglandina-lipossoma pode então ser filtrado esterilmente através de um filtro de 0,2 ,0m. 0 produto também pode ser diluído com uma solução aquo sa adicional, e/ou seco (desidratado) e armazenado até ao seu uso. Nas concretizações preferidas, o produto de tamanho redu zido é introduzido em frascos, liofilizado, e armazenado até ao seu uso.

Imediatamente antes da sua utilização, pode reconstituir-se o produto liofilizado com uma solução aquosa de pH ácido ou básico relativamente ao primeiro meio aquoso. Este segundo meio aquoso é de preferência relativamente ácido. A adição des, te meio aquoso dá origem ao gradiente de pH.

Independentemente do procedimento de formação dos lipossomas usado, para formar o gradiente de pH transmembranar, adi ciona-se a uma solução lipossémica, um meio externo compreendendo uma solução aquosa com um segundo pH (um segundo meio ex terno) tendo um pH relativamente ácido em relação ao primeiro meio externo. 0 pH desta segunda solução aquosa é geralmen te de cerca de 2,5 a cerca de 4,5, preferencialmente de cerca de 3,0 a 3,5, mais preferencialmente pH de cerca de 3,0. Depois do ajuste do primeiro meio externo por, por exemplo, adição desta segunda solução aquosa o pH da solução de lipossoma é de cerca de 3,0 a cerca de 4,5, preferencialmente de cerca de 3,0. Alternativamente, se a primeira solução aquosa for relativamente ácida, a segunda solução aquosa será relativamente básica.

Este ajuste do pH do meio externo promoverá a partição do agente bioactivo (prostaglandina) para dentro e através das mem branas de lipossoma. Através do uso do par de tampões activa67 764

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-15dores de partição deste invento com os gradientes de pH descri tos acima, a eficiência de retenção da prostaglandina é de cer ca de 50 a 100%, mais especificamente de 60 a 100%, e mais pre ferencialmente de 80 a 100%.

Sem compromisso com nenhuma teoria, crê-se que o papel do protector de secagem na formulação é manter o tamanho e integridade dos lipossomas durante o processo de secagem, e depois da re-hidratação. Quando se omite o protector de secagem da formulação dos lipossomas, os lipossomas re-hidratados têm uma eficiência de retenção baixa (à volta de cerca de 50% e inferi or), e o tamanho dos lipossomas a seguir à liofilização não se mantém.

procedimento de liofilização ou desidratação pode ser levado a cabo antes ou depois do estabelecimento do gradiente de pH, É levado a cabo, preferencialmente, antes do estabelecimento do gradiente de pH, e muito preferencialmente, o primeiro meio aquoso é relativamente básico e o segundo relativamente ácido. Neste caso, realiza-se a re-hidratação da formulação lipossoma-prostaglandina seca usando a segunda solução (relativamente ácida), estabelecendo-se então o gradiente de concentrações introduzindo eficazmente a prostaglandina nos li possomas. Se a acidificação for levada a cabo antes da desidratação ou da liofilização, esta segunda solução também pode conter o protector de secagem e conservantes tais como o BHT, e/ou o ácido etilenodiaminotetra-acético (EDTA). 0 pH desta segunda solução aquosa (acidificação) é de cerca de 1,5 a cerca de 5,5, preferencialmente de cerca de 5,0. Se, no entanto, se realizar a acidificação a seguir à desidratação ou liofilização, a re-hidratação ê levada a cabo usando uma solução aquo sa de pH de cerca de 2,5 a cerca de 4,5, preferencialmente de cerca de 5,0, e sem o protector de secagem. Éste último mêto do, isto é a acidificação da solução apés o passo de seca gem, é o preferido.

Em ambos os métodos de formação dos lipossomas, os lipossomas associados à prostaglandina resultantes podem ser desi67 764 Ref: ST.601

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-16dratados ou liofilizados pelos métodos correntes na arte. Este procedimento de secagem requer a adição de um protector de secagem à suspensão de lipossoma. Este protector de secagem evita a reorganização dos lípidos no lipossoma, de modo a que o tamanho e conteúdo sejam mantidos durante o procedimento de secagem e através da re-hidratação. São qualidades apropriadas para estes protectores de secagem o serem fortes aceitado res de ligações de hidrogénio e o facto de possuírem características estereoquímicas que conservam o espaçamento intramolecular dos componentes da bicamada do lipossoma. Verificou-se que um grupo de protectores de secagem, os açúcares sacarídeos são especialmente úteis na manutenção do tamanho das partículas dos lipossomas após re-hidratação, quando incluídos nas for mulações de lipossomas. Este grupo específico de sacarídeos compreende, por exemplo, dextrose, sacarose e maltose, que podem ser usadas em cerca de 5 a 20 por cento, preferencialmente a cerca de 10 por cento em peso da fase aquosa. Outros sacarídeos que podem ser usados são os açúcares manose, galactose, rafinose, tre-halose, lactose ou trioses. Pode usar-se o manitol em conjunção com qualquer dos sacarídeos, mas verificou-se surpreendentemente, que, quando usado sozinho, o manitol não é eficaz na manutenção do tamanho dos lipossomas. Pode usar-se o manitol em conjunto com os sacarídeos numa concentração de cerca de 0-2%, preferencialmente numa concentração de 1%. A concentração total de sacarídeo usada varia entre cer ca de 5% e cerca de 20%, preferencialmente 10 e 12%, mais preferencialmente cerca de 10%. Podem incluir-se conservantes adi cionais tais com BHT ou EDTA nas formulações a, por exemplo, 0,02 mg de BHT por fil de etanol e, por exemplo, 0,01% de EDTA em 10% de dextrose. Podem usar-se outras substâncias como a ureia, albumina, dextrano ou álcool polivinílico.

Após re-hidratação do produto desidratado ou liofilizado, pode adicionar-se uma solução aquosa como por exemplo água des tilada (se se tiver estabelecido o gradiente de pH antes da lio. filizaçâo). No caso em que os lipossomas foram liofilizados na sua solução aquosa externa original, a re-hidratação é leva67 764

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TLO-135A —17— da a cabo usando uma segunda solução aquosa que estabelecerá o gradiente de pH como descrito abaixo (uma solução que seja relativamente ácida ou básica). No método preferido, o gradiente de pH estabelece-se pela adição de uma solução aquosa relativamente ácida à formulação, tal como, preferivelmente, uma solução de ácido cítrico. Em todos os casos, a reconstituição pode ser realizada a cerca de 20 a 30°C, preferencialmente a 25°C, sendo as soluções diluídas como for necessário e adminis. tradas.

No presente invento, o termo lípido como aqui usado refere-se a qualquer material adequado que resulte numa bicamada após mistura com um meio aquoso de tal maneira que uma porção hidrofóbica do material lipídico se oriente em direcção à bicamada enquanto uma porção hidrofílica se oriente em direcção à fase aquosa. Os lipidos incluem compostos altamente hidrofóbicos tal como os triglicerídeos, esteróis como o colesterol, e lipidos anfipáticos. Os lipidos preferidos para uso nas for mulações de lipossomas do presente invento são os fosfolípidos tais como a fosfatidilcolina (PG), fosfatidiletanolamina (PE), fosfatidilserina (PS), fosfatidilglicerol (PG), ácido fosfatídico (PA), fosfatidilinositol (Pi), esfingomielina (SPM), e si milares, sós ou em combinações. Os fosfolípidos podem ser sin téticos ou derivados de origens naturais tal como de ovo ou so ja. Nas concretizações preferidas, usa-se o fosfolípido, fosfatidilcolina do ovo (EPC). Os lipossomas também podem conter outros componentes esteróides tais como o coprostanol, colesta nol ou colestano, e combinações de EPC e colesterol. Os lipos somas também podem conter glicolípidos.

No caso do enchimento dos lipossomas através de um gradiente de pH em que o primeiro meio externo ê básico, os meios aquosos adequados incluem tampões e podem incluir embora não se limitem a, por exemplo, tampões de ácido cítrico, ácido succínico ou ácido maleico ajustados a pH 3,0 a cerca de 11,0, preferencialmente a cerca de pH 7,0. Noutros casos em que o primeiro tampão usado é básico, podem usar-se tampões tais como os tampões de fosfato ou cloreto de sódio aquoso a 0,9% a

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-18pH 7-9 . Pode usar-se em alternativa um tampão de carbonato ou bicarbonato de sódio. Podem ser incluídas nesta mistura ou tras soluções salinas tamponadas a cerca de pH 8 . Estas solu ções salinas tamponadas incluem solução salina tamponada com fosfato •'PBS,¹¹ tampões de hidrocloreto de tris-(hidroximetil)aminometano (^Mtris) ou ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N’2-etanossulfónieo (HEPES), ou glicina. Mais preferencialmente, a primeira solução aquosa é uma solução do protector de secagem, i.e,, a solução de sacarídeo, por exemplo, com cerca de 5 a 20% de maltose (preferencialmente com cerca de 10% de maltose) a pH de cerca de 7,0. Esta solução pode ainda incluir EDTA ou um conservante similar (BHT) em qualquer concentração aceitável para os produtos farmacêuticos (de preferência cerca de 0,01% em EDTA).

Para estabelecer o gradiente de pH, adiciona-se um segundo meio externo (preferencialmente depois do passo da desidratação), ou ajusta-se o pH do primeiro meio a um pH ácido. Estes segundos meios externos que podem substituir o primeiro meio externo podem incluir tampões tais como, por exemplo, o ácido cítrico, ácido láctico ou ácido fosfórico a cerca de pH

2,5 a 4,5, mais preferencialmente a cerca de pH 3,0 . Pode também usar-se uma solução salina (0,9%) que tenha sido ajusta da ao pH apropriado (como acima) com por exemplo ácido clorídrico aquoso 0,1 N. De preferência o pH do meio externo é ajus tado por adição de aproximadamente um volume igual de solução de ácido cítrico (pH de cerca de 2,5 a cerca de 4,5, preferencialmente 3,0) â solução de lipossomas. Em qualquer dos casos, o pH final da solução externa dos lipossomas é de cerca de 2,5 a cerca de 4,5, preferencialmente 3,0-3,5, mais preferencialmen te 3,0. Esta solução de ácido cítrico pode também conter cerca de 5% a 20% em peso de protector de secagem (o sacarídeo, de pre ferência maltose, de preferência a 10% em peso), e conservantes tais como o BHT e/ou EDTA em concentrações aceitáveis para produtos farmacêuticos (preferencialmente 0,01% de EDTA e 0,02 mg de BHT por ml de solução final).

No caso do primeiro meio externo ser relativamente ácido

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.....::aíS*

-19pode usar-se um tampão de ácido cítrico fosfato de pH entre cerca de 5 θ cerca de 6 ou cloreto de sódio aquoso a 0,9% com pH ajustado a cerca de 5,0 com HC1, ou qualquer das outras so luções ácidas mencionadas acima. 0 meio relativamente básico usado para estabelecer o gradiente de concentrações pode ser neste caso um tampão de fosfato a cerca de pH 8,0, cloreto de sódio aquoso, (0,9%) ajustado a pH de cerca de 7-10 com hidróxido de sódio, carbonato de sódio, tampão bicarbonato, ou qual quer das soluções básicas acima mencionadas.

Os lipossomas são preparados de preferência com um meio inicial básico, preferencialmente solução sacarídica básica de pH entre cerca de 7 e cerca de 8 mais preferencialmente a pH de cerca de 7,0. 0 gradiente de concentrações estabelece-se por adição do segundo tampão (relativamente ácido), de preferência ácido cítrico 0,01M, a pH de cerca de 2,5 a 4,5, o qual, quando adicionado ao primeiro meio externo (relativamente básico), origina um pH final de cerca de 3,0. Estes pares de soluções relativamente básicos/relativamente ácidos (pares de tampões) aumentam a partição da prostaglandina nos lipossomas.

gradiente de concentrações pode ser estabelecido antes ou de. pois da desidratação ou liofilização, embora, como referido acima, este passo de desidratação ou liofilização seja preferen cialmente levado a cabo antes da acidificaçâo da preparação.

No presente invento, pode alternativamente encher-se os lipossomas através de uma técnica passiva (sem gradiente de pH) em que a solução aquosa pode compreender soluções aquosas tais com a água destilada, tampões aquosos ou um protector de secagem, como por exemplo, uma solução de sacarídeo tal como uma solução de dextrose ou maltose. Estes métodos podem incluir aqueles que formam lipossomas conhecidos por vesículas multila melares (MLV), vesículas plurilamelares estáveis (SPCY), vesículas unilamelares grandes formadas por um procedimento de extrusâo (1UVETS) e outros procedimentos de formação de lipossomas conhecidos na arte. 0 processo de formação das SPIVs é re velado em Lenk et al., Patente Americana n^ 4 522 803, concedida a 11 de Junho de 1985 e o procedimente para LUVET revelado

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-20em Cullis, et al., Publicação PCT NS 86/00238 de 16 de Janeiro de 1986, incorporando-se aqui as porções relevantes dessas publicações para referencia. Reste caso, os lipossomas são formados sem a intervenção de um gradiente de concentrações.

Nesta técnica alternativa de formação dos lipossomas do invento, pode adicionar-se uma solução aquosa contendo o protector de secagem e a prostaglandina a um filme seco que contenha quais quer dos lipidos adequados, usados no invento como discutido acima. Este filme de lipido pode revestir um recipiente tal como um tubo, uma seringa ou um frasco. A suspensão de li possoma que resulta pode ser desidratada ou liofilizada como descrito anteriormente.

As razões ponderais lípido/prostaglandina usadas no presen te invento podem ser tão altas como 1000:1 . Situam-se preferencialmente entre cerca de 1000:1 a cerca de 150:1 mais prefe rencialmente entre cerca de 900:1 e 200:1; mais preferencialmente são de cerca de 600:1 . Razões ponderais lípido/droga de cerca de 150:1 ou superiores resultam em retenções de PGE, superiores a 60%, e podem resultar em retenções de 80-100% .

A desidratação ou liofilização dos lipossomas do presente invento pode ser levada a cabo por quaisquer dos métodos conhe eidos na arte para desidratação ou liofilização de lipossomas. Para a desidratação, por exemplo, os lipossomas podem ser secos de acordo com os procedimentos de Janoff et al., Publicação PCT NS 86/01103 de 27 de Fevereiro de 1986, incorporada aqui como referencia.

Os lipossomas da invenção são de preferencia liofilizados pipetando uma fracção alíquota dos lipossomas suspensos em água para frascos de soro (ver Exemplo 9), equipados com rolha de liofilizaçâo e colocando-os no liofilizador. Os frascos são mantidos durante cerca de 1 minuto a cerca de 24 horas, de preferencia cerca de 1 hora, a uma temperatura entre 0°C e 50°C, de preferencia a cerca de 10°C. A temperatura de prateleira é en tão descida a uma temperatura de cerca de -12°C a cerca de -80°C, de preferencia -40°C, a uma velocidade de cerca de 20°a 0,005°C

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,......

por minuto, de preferência a cerca de 1°C por minuto. Os fras cos foram mantidos a esta temperatura durante cerca de 0,1 horas a cerca de 120 horas, de, preferência 3 horas. Aplica-se um vácuo de cerca de 0,0 mm Hg a cerca de 100,0 mm Hg, de preferência de 0,005 mm Hg, decorridas cerca de 0,2 a cerca de 72 horas, de preferência cerca de 0,6 horas. A temperatura de pra teleira é depois aumentada até cerca de -40°C a 0°C, de preferên cia cerca de -25°C, a uma velocidade de cerca de 20°0 a cerca de 0,005°G por hora, de preferência de cerca de 10°C por hora.

Os frascos são mantidos à temperatura mencionada acima (de preferência cerca de -25°C) durante cerca de 0,1 a cerca de 120 horas, preferencialmente cerca de 12 horas, apés o que se aumen ta a temperatura de prateleira até uma temperatura de cerca de -20°C a cerca de 0°G, preferencialmente de cerca de -10°C, a uma velocidade de cerca de 20°C a cerca de 0,005°0 por hora, preferencialmente de cerca de 10°G por hora, e mantida durante cerca de 0,1 a cerca de 120 horas, preferencialmente cerca de 8 horas. A temperatura de prateleira é então aumentada para entre cerca de 2°C e cerca de 40°G, de preferência cerca de 10°C, a uma velocidade de cerca de 20°C a cerca de 0,005°G por hora, preferencialmente de cerca de 1O°C por hora, e mantida durante cerca de 0,1 a cerca de 120 horas, preferencialmente cerca de 8 horas. A temperatura de prateleira é então aumentada até cer ca de 20°C a cerca de 80°C, preferencialmente cerca de 40°G, e mantida durante cerca de 0,1, a cerca de 120 horas, preferencial mente cerca de 16 horas. Finalmente, a temperatura de pratelei ra é diminuída para entre cerca de 5°G a cerca de 30°G, de preferência cerca de 20°C, a uma velocidade de entre cerca de 20°C e cerca de 0,005°C, de preferência de cerca de 10°G por hora, mantendo-se esta temperatura até serem fechados. Os frascos são lavados com um jacto/hidrogénio e fechados.

Independentemente da técnica de desidratação ou liofilização, o procedimento reduz o conteúdo aquoso de uma amostra a menos de cerca de 2%, preferencialmente a menos de cerca de 1%. Utilizando os métodos correntes, a formulação de prostaglandina lipossómica é liofilizada até ao ponto de conter 0-2% de con67 764

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-22teúdo aquoso, de preferencia 0-1% de conteúdo aquoso (água).

As formulações de prostagladina-lipossoma liofilizadas podem ser estáveis durante pelo menos um ano quando armazenadas a cerca de 6°C-25°C. Conduziram-se estudos de estabilida de de acordo com os métodos do Exemplo 14 e a formulação foi analisada por cromatografia líquida de alta pressão (HPLC).

Não se detectaram produtos de degradação da PG-E^ apés um ano de armazenagem a 6°C.

Para utilizar os lipossomas liofilizados, procede-se à sua re-hidratação por adição de uma solução aquosa, por exemplo, água destilada, água para injecção, ou tampão ou solução aquosa de pH apropriado, como descrito acima, aos lipossomas, deixando-os em repouso a re-hidratar. Os lipossomas podem ser ressuspensos na solução aquosa através de uma agitação suave da solução. A re-hidratação pode ser levada a cabo a cerca de 25°C. Se a prostaglandina tiver sido incorporada nos lipossomas antes da desidratação, e não forem desejadas mais alterações da composição, podem usar-se os lipossomas re-hidratados directamente na terapia seguindo procedimentos conhecidos de adminis tração de drogas encapsuladas em lipossomas.

Durante a preparação dos lipossomas podem usar-se solventes orgânicos para suspender os lípidos. Os solventes orgânicos adequados são aqueles que apresentam uma variedade de polaridades e propriedades dieléctricas, que soluhilizam os lípidos, e que incluem mas não se limitam ao metanol, etanol, dimetilsulféxido (DMSO), cloreto de metileno, e misturas de solventes tais como o hexano:etanol (95:5). A mistura hexano:etanol (95:5) 6 de preferencia usada para a suspensão inicial dos lípidos, e o etanol é preferencialmente usado durante a co-mistura do lípido com a prostaglandina. Escolhem-se os solventes de acordo com a sua hiocompatihilidade, baixa toxicidade, e propriedades solubilizantes.

Os lipossomas resultantes dos processos do presente invento podem ser usados terapeuticamente em mamíferos, incluindo o homem, no tratamento de infecções ou em situações que requerem

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-23a distribuição controlada da droga na sua forma bioactiva.

Estas situações incluem mas não são limitadas a estados de doença tais como os que podem ser tratados com prostaglandinas.

modo de administração da preparação pode determinar os sítios e as células no organismo aos quais o composto será dis tribuído. Os lipossomas do presente invento podem ser adminis trados isoladamente mas são geralmente administrados em mistura com um veículo farmacêutico seleccionado de acordo com a via de administração pretendida e a prática farmacêutica clássica. As preparações podem ser injectadas parentericamente, por exem pio, intra-arterialmente ou endovenosamente. As preparações também podem ser administradas por via oral, subcutânea ou intramuscular. No que diz respeito à administração parentérica, podem usar-se, por exemplo, na forma de uma solução aquosa estéril que pode conter outros solutos, como por exemplo sais ou glucose suficientes para formar a solução isoténica. Os lipos somas de prostaglandina E^ do presente invento, por exemplo, podem ser dados parentericamente a uma dosagem de 5,0 ng por kg de peso do corpo por minuto, durante um período de duas horas, uma ou duas vezes por dia. Os peritos da arte podem considerar outros usos dependendo das propriedades particulares da preparação.

No que diz respeito ao modo oral da administração, as com posições de lipossoma com prostaglandina deste invento podem ser usadas na forma de comprimidos, cápsulas, pastilhas, pós, xaropes, elixires, soluções e suspensões aquosas e similares.

No caso dos comprimidos, os veículos que se podem usar incluem lactose, citrato de sódio e sais do ácido fosfórico. Usam-se geralmente nos comprimidos vários desintegrantes tais como o amido, e agentes lubrificantes tais como o estearato de magnésio. Rara a administração na forma de cápsula, diluentes úteis são a lactose e polietileno-glicóis de alto peso molecular. Quando se pretendem suspensões aquosas para uso oral, podem adi cionar-se agentes adocicantes e/ou aromatizantes.

Para administração a humanos no tratamento curativo de estados de doença que reagem à terapia com prostaglandina, o mé67 764 _f

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-24dico determinará em última análise a dosagem apropriada para cada sujeito humano, e esta variará de acordo com a idade, peso e reacção do indivíduo tal como a natureza e a gravidade da doença do paciente. A dosagem da droga na forma lipossómica se rá geralmente semelhante à usada para a droga livre. Contudo em alguns casos, poderá ser necessário administrar dosagens fora destes limites.

Os exemplos seguintes são dados apenas com objectivos ilus trativos sem constituirem de modo nenhum uma limitação ao âmbito do invento.

EXEMPLO 1

Evaporou-se rotativamente uma solução de fosfatidilcolina de ovo (200 mg) em hexano:etanol (95:5) sob pressão reduzida num banho de água regulado a 37°C até se obter um filme fino nas paredes do frasco. 0 filme foi ressuspenso em 200,0 /tl de etanol, aos quais se adicionou 1,0 mg de PGE% e 2,0 mg de BHT. Esta solução etanólica foi introduzida numa seringa de tubercu lina de 1,0 ml de capacidade e injectada através de uma agulha de medida 21 a cerca de 2 gotas/segundo numa solução agitada de 4,0 ml de solução aquosa de dextrose a 10% (peso/volume) com EDTA aquoso 0,01% (peso/volume), pH 7,0. Após a adição da mis tura de etanol/lípido, a solução torna-se turva; esta solução foi extrusada 5 vezes através de um filtro de policarbonato de 0,2 /(.m (tipo percurso linear), seguido por mais um segundo gru po 5 extrusões através de um segundo filtro de 0,2 ^m idêntico. 0 tamanho de partículas dos lipossomas resultantes foi determinado e foi de 0,24 >m - 22%, usando-se para o efeito dispersão da luz quase-elástica (QBLS) (Nicomp Particle Sizer). A suspen são foi então diluída a 100 ml com dextrose a 10%, EDTA a 0,01%, pH 7,0, pipetando-se fracções alíquotas de 1,0 ml para frascos e liofilizando-as de acordo com os procedimentos do Exemplo 9.

produto foi re-hidratado com 1,0 ml de citrato 0,01 K, ajustado a pH 3,0 com hidróxido de sódio (NaOH). 0 pH resultante da suspensão foi de cerca de 3,0. A retenção da PGEj nos lipos somas foi determinada por HPLC, de acordo com as técnicas do

Exemplo 8.

*rff

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-25EXEMPLO 2

Utilizaram-se os procedimentos e materiais do Exemplo 1, mas após a determinação do tamanho das partículas, a suspensão foi diluída duas vezes com 4,0 ml de ácido cítrico a 0,01% con tendo dextrose a 10% e EDTA a 0,01%, pH 2,3. Esta foi mais uma vez diluída a 100 ml com dextrose a 10% contendo EDTA a 0,01% a pH 4,5; o pH final da suspensão foi de cerca de 3,5. Pipetaram-se fracções aliquotas (1,0 ml) desta suspensão para frascos e liofilizaram-se de acordo com os procedimentos do Exemplo 9.

produto foi re-hidratado com 1,0 ml de água destilada até um pH final de cerca de 3,4. Determinou-se a retenção de acordo com as técnicas do Exemplo 8.

EXEMPLO 3

Utilizaram-se os procedimentos e materiais do Exemplo 1 usando uma solução aquosa agitada contendo 4,0 ml de dextrose a 10%, EDTA a 0,01%, manitol a 1% (11% de sacarídeo no total).

A retenção foi determinada de acordo com as técnicas do Exemplo

8. 0 tamanho das partículas de lipossoma foi determinado por

QELS e era de cerca de 0,247 /α í 10%.

EXEMPLO 4

Utilizaram-se os procedimentos e materiais do Exemplo 1 usando uma solução aquosa agitada de pH 7,4. A retenção foi determinada de acordo com as técnicas do Exemplo 8. 0 tamanho das partículas de lipossomas foi determinado por QELS e era de 0,288 ΐ 44% (diâmetro).

EXEMPLO 5

Seguiram-se os procedimentos do Exemplo 2 usando uma solu ção aquosa agitada de pH 7,4, e manitol a 2%, dextrose a 10% e EDTA a 0,01%. Determinou-se a retenção de acordo com as técni cas do Exemplo 8. Determinou-se o tamanho das partículas de li possomas por QELS e era de 0,288/tm í 44%.

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-26EXEMPLO 6

Seguiram-se os procedimentos e materiais do Exemplo 1 usan do uma solução aquosa agitada contendo 4,0 ml de dextrose a 10%,

EDTA a 0,01% e manitol a 2% (12% de sacarídeo no total). A retenção foi determinada de acordo com as técnicas do Exemplo 8.

EXEMPLO 7

Evaporou-se rotativamente fofatidilcolina do ovo (100 mg) em hexano:etanol (95:5) sob pressão reduzida até se obter um filme fino nas paredes do recipiente. 0 filme foi ressuspenso num misturador vortex em 1,0 ml de solução de ácido cítrico 0,3M (pH 3,0), deixando-se em seguida em repouso durante uma hora à temperatura ambiente. 0 pH final da solução de lipossoma era de 3,5. A suspensão foi extrusada cinco vezes através de um filtro de policarbonato de 0,2 /tm e de percurso linear, sendo o pH da suspensão resultante ajustado a 6,9 usando NaOH. A amos tra foi liofilizada e re-hidratada com água. 0 grau de associação da PGE^ com os lípidos foi determinado antes e depois da reconstituição pelo procedimento Ficoll utilizado no Exemplo 8.

EXEMPLO 8

Suspenderam-se os Iipossomas do Exemplo 1 em 1,0 ml de solução aquosa e transferiram-se para um tubo Oorex de 15 ml.

Os frascos que continham os Iipossomas foram lavados com 2x5 ml de uma solução de histopaque Picoll (Sigma Chemical Oo.) e esta foi misturada com o conteúdo do tubo Corex. O tubo foi centrifugado a 16 320xg durante 10 minutos numa centrífuga Sorvall. Os lípidos assentam no topo do Picoll. Removeu-se do tubo toda a solução de lavagem do fundo excepto 0,5-1,0 ml e a camada de lípido usando uma bomba peristáltica. Deve-se tomar cuidado para assegurar que não fica lípido agarrado ao tubo ex tractor da micropipeta. Adicionou-se tetra-hidrofurano (THF) (2,5 ml) à camada de lípido deixada no tubo, misturando-se com pletamente. Esta solução foi transferida para um tubo Oorex de 30 ml envolvido em folha de alumínio. Lavou-se o tubo Corex de 15 ml com 10,0 ml de ácido fosfórico a 0,1% e adicionou-se a

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-27solução de lavagem â solução de lipossoma. Adicionaram-se mais 7,0 ml de ácido fosfórico a 0,1% à solução de lipossomas. Esta solução de lipossomas foi passada através de um cartucho Sep -Pak C^g que tinha sido preparado por passagem através dele de 5,0 ml de metanol seguido de 10,0 ml de água destilada, a PGE.JL que se dissocia do lípido fica retida no cartucho. Pez-se passar metanol (7,0 ml) através do Sep-Pak para eluir a PGE^ e a PGE^ foi recolhida num pequeno frasco de fundo redondo. 0 metanol da preparação foi removido num evaporador rotativo sob pressão reduzida e a uma temperatura inferior a 35°G.

A PGE^ foi então dissolvida com 1,0 ml de uma fase móvel para HPLC (acetonitrilo:pH 20 (pH 2,2, com ácido fosfórico) 40:60 em volume) que continha um padrão interno de /3-naftol a uma concentração de 50 /tg/ml. Esta suspensão foi depois filtrada através de um filtro de ponta de seringa de 0,45 /xm (tipo Milli pore Millex HV^) antes de ser injectada no HPLC.

procedimento anterior foi repetido com os lipossomas dos Exemplos 2-7 anteriores.

EXEMPLO 9

Encheram-se frascos de liofilização âmbar com uma capacidade de 5,0 ml, rolhados com borracha butílica e de topo dividido (split-top) com 1,0 ml de lipossomas em suspensão aquosa, contendo PGE^ retida . Estes frascos foram colocados em tabuleiros de aço inoxidável num liofilizador (liofilizador PV-24 Stokes) equipado com um Programador de Controlo Digital Honeywell LCP77OO. Os frascos foram mantidos a 10°C durante uma ho ra. A temperatura de prateleira foi depois descida a -40°C a uma velocidade de 1°C por minuto. Os frascos foram mantidos a -40°C durante tres horas sendo-lhes aplicado um vácuo inferior a 0,005 mm Hg a 0,6 horas, depois de atingida a temperatura de -40°C. A temperatura de prateleira foi depois aumentada até -25°C a uma velocidade de 10°C por hora e sob um vácuo inferior a 0,005 mm Hg.

Os frascos foram mantidos a -25°C durante 12 horas a menos de 0,005 mm Hg. A temperatura de prateleira foi depois

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-28aumentada para -10°C a uma velocidade de 10°G por hora, e mantida durante 8 horas. A temperatura de prateleira foi ainda aumentada para +10°C a uma velocidade de 10°0 por hora e manti da durante 8 horas. A temperatura de prateleira foi depois au mentada para 40°C e mantida durante 16 horas, a menos de 0,005 mm Hg. A temperatura de prateleira foi finalmente descida até 20°0 a menos de 0,005 mm Hg a uma velocidade de 10°C por hora e mantida até ao fecho dos frascos. Os frascos foram submetidos a um jacto de azoto e fechados.

EXEMPLO 10

Mediram-se 41 ml de fosfaditilcolina do ovo numa solução 108 mg/ml em hexano:etanol (95:5) (4,428 mg EPC no total) para um frasco com uma capacidade de 500 ml, de fundo redondo, e removeu-se o hexano:etanol por evaporação rotativa num banho de agua regulado a 37°O. Adicionou-se etanol (2,0 ml) contendo 30 mg de BHT ao frasco e suspendeu-se o filme de lípido seco. Adicionou-se mais 1,0 ml de etanol para suspender completamente o EPC.

Preparou-se um litro de uma solução a 10% de maltose e ajustou-se o pH a 7,4 com hidróxido de sódio 1,0 N. A solução foi esterilizada fazendo-a passar através de um filtro Eillipak 40 de 0,22 /tm que foi previamente molhado com água estéril.

A solução de EPC/BHT/etanol foi adicionada gota a gota, com uma seringa de 1,0 ml equipada com uma agulha de medida 21, a uma velocidade de 1,0 ml/minuto, numa solução agitada de cer ca de 800 ml de maltose a 10%, numa proveta de 2000 ml. Repetiu-se esta operação para a totalidade do EPC/BHT/etanol, cerca de 8,0 ml. Depois de se ter adicionado todo o lípido, o frasco de fundo redondo foi passado duas vezes consecutivas com fracções alíquotas de cerca de 3,0 ml da solução de maltose, e adicionadas à proveta com maltose. A solução foi levada a 1000 ml por adição de solução de maltose a 10%.

EXEMPLO 11

Os lipossomas formados pelo processo do Exemplo 10 foram

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-29homogeneizados usando o homogeneizador Gaulin Modelo 50 CD.

Os lipossomas foram colocados num reservatório de 5 L fechado, ligado com tubagens ao Gaulin e um permutador de calor de 516 L, de tubo e invólucro sanitário, em aço inoxidável montado na extremidade a jusante do Gaulin, de forma a manter a temperatura de solução de lipossomas a menos de 50°C. Ligou-se uma fonte de azoto (158 KPa 20 psi) ao reservatório de 5L de modo a alimentar os lipossomas sob pressão ao Gaulin. A solução de lipojs somas foi circulada através do Gaulin a uma pressão de 96,524 x

-3KPa (14 000 psi) durante cerca de 4 minutos a um caudal de

-5 5

1,85 x 10 m (meio galão) por minuto. Os lipossomas tinham um diâmetro médio de cerca de 150-200 nm a seguir à homogeneização, com uma gama de distribuição de tamanhos de cerca de 20-500 nm,medidos pela dispersão da luz quase-elástica usando um medidor de partículas Nicomp (Nicomp Instruments, Inc., Goleta, CA).

EXEMPLO 12

Filtraram-se os lipossomas homogeneizados (700 ml) de acor do com os procedimentos do Exemplo 11 através de um filtro Millipak de 0,2/tm e agitaram-se numa proveta de 1500 ml numa placa agitadora. Adicionou-se gota a gota uma solução etanólica de prostaglandina E^ (5,85 mg de PGE^ em 1,4 ml de etanol) com uma pipeta de 5,0 ml. Após a adição da PGE^, a suspensão foi filtrada esterilmente através de um filtro Millipak de 0,2 /tm e colocaram-se fracções alíquotas de 1,0 ml em frascos de soro. Os frascos cheios foram liofilizados de acordo com o método do Exemplo 9.

EXEMPLO 15 frasco de lipossomas de PGE^ do Exemplo 12 foi reconstituído usando 1,0 ml de ácido cítrico estéril, pH 5,0 e o fras co foi agitado manualmente até à sua completa ressuspensão.

EXEMPLO 14

O frasco dos lipossomas liofilizados do Exemplo 12 foi re£ suspenso em 1,0 ml do padrão de HPLC em fase móvel (60% de água,

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TLC-135A pH 2,2, acetonitrilo a 40% para HPLC, contendo ^-Naftol a uma concentração de 50 yz-g/ml). A amostra foi filtrada através de um filtro Millipore HV^ de 0,45 #m de ponta de seringa para um frasco para HPLC com uma capacidade de 2,0 ml. A amostra foi passada no HPLC Rainin usando uma sobrecarga de equipamento de 50 ,ííl numa circulação de carga de 20 ul a um caudal de 1,25 ml/ /minuto numa coluna de fase inversa de 15 cm (coluna Rainin C-18), ligada a um detector Gilson 116 ajustado para 205 nm.

A coluna do cromatógrafo foi operada durante 13 minutos. Iden tificaram-se picos correspondentes à PGE^ e ao /S-naftol.

A concentração em PGE^ no frasco da amostra foi calculada através de uma análise de regressão linear padrão das áreas dos picos, e comparada com uma curva padrão da PGE-^ em HPLC. Foram considerados três frascos para cada amostra testada e calculou-se a concentração média.

EXEMPLO 15 método do Exemplo 14 foi repetido para os lipossomas preparados de acordo com os métodos do Exemplo 1 a intervalos de 1 semana, 2 semanas, 30 dias, 3 meses, 6 meses, 9 meses e 1 ano.

Claims

l^â. - Processo de preparação de uma composição lipossómica, caracterizado por compreender a mistura de um metabolito derivado do ácido araquidõnico, um lípido, um protector de secagem e um tampão activador de partição.
2⁵. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteri zado por o metabolito do ácido araquidõnico ser a prostaglandi na.
3^â. - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracteri zado por a prostaglandina compreender a prostaglandina E^.
4^â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteri zado por os lipossomas terem um gradiente de concentração trans membrana.
5^â. - Processo de acordo com a reivindicação 4, caracteri zado por o gradiente de concentração transmembrana ser um gradiente iónico.
6S. - Processo de acordo com a reivindicação 5, caracteri zado por o gradiente iónico ser um gradiente de pH.
7-. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteri zado por o tampão activador de partição compreender uma solução protectora de secagem e uma solução de ácido cítrico.
8â. - Processo de acordo com a reivindicação 7, caracteri zado por a solução protectora de secagem ser uma solução sacarídica.
9^â. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracteri zado por o pH da solução sacarídica estar situado entre cerca de 3,0 e cerca de 11,0.
10^. - Processo de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por o pH da solução sacarídica ser de cerca de 7,0.

llâ. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o pH da solução de ácido cítrico estar compreendido entre cerca de 2,5 e cerca de 4,5.

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-3212®. - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por o pH da solução de ácido cítrico ser de cerca de 3,0.
13^â« - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por a solução sacarídica compreender dextrose, sacarose ou maltose.
14^â. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracte rizado por o sacarídeo compreender maltose.
15^â. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracte rizado por a solução sacarídica compreender de cerca de 5 a cer ca de 20% de sacarídeo.
16^. - Processo de acordo com a reivindicação 13, caracte rizado por a solução sacarídica compreender cerca de 10 a cerca de 12% de sacarídeo.
17^â. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o lípido ser um fosfolípido.
18^, - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracte rizado por o fosfolípido compreender fosfatidilcolina.
19*. - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracte rizado por a fosfatidilcolina compreender fosfatidilcolina de ovo.
20&. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por os lipossomas terem um diâmetro entre cerca de 10 nm e cerca de 500 nm.
21â. - Processo de acordo com a reivindicação 20, caracte rizado por os lipossomas terem um diâmetro médio entre 150 e 200 nm.
22§. - Processo de acordo com a reivindicação 20, caracte rizado por a composição ser liofilizada.
23^â. - Processo de acordo com a reivindicação 22, caracte rizado por a composição lipossómica, liofilizada, de prostaglan dina, compreender um lípido, uma prostaglandina e cerca de 10% de protector de secagem.

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-3324^â. - Processo de acordo com a reivindicação 23, caracte rizado por o protector de secagem compreender um sacarídeo.
25^â. - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracte. rizado por o sacarídeo compreender dextrose, sacarose ou multo se.
26§, - Processo de preparação de uma composição lipossémi ca de prostaglandina, caracterizado por compreender o passo de associar a prostaglandina aos lipossomas através de um gradien te de pH transmembrana.
27-. - Processo de acordo com a reivindicação 26, caracte rizado por o gradiente de pH transmembrana ser obtido através dos seguintes passos:

a) formação dos lipossomas numa solução aquosa relativamente básica;

b) adição de uma prostaglandina à suspensão do passo (a) acima; e

c) acidificação do meio externo dos lipossomas.
28ã. - Processo de acordo com a reivindicação 27, caract£ rizado por o tamanho dos lipossomas do passo (a) ser reduzido.
29^â. - Processo de acordo com a reivindicação 28, caracte. rizado por os lipossomas serem filtrados através de um filtro do tipo de percurso sinuoso.
30â. - Processo de acordo com a reivindicação 28, caracte rizado por os lipossomas serem filtrados através de um filtro do tipo de percurso linear.
31-. - Processo de acordo com a reivindicação 28, caracte. rizado por os lipossomas serem homogeneizados.
32ã. - Processo de acordo com a reivindicação 51, caracte rizado por os lipossomas serem liofilizados.
33^â. - Processo de acordo com a reivindicação 32, caracte rizado por a razão ponderai de lípido/prostaglandina estar entre cerca de 300:1 e 1000:1.
34^â. - Processo de acordo com a reivindicação 33, caracte

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TIO-133A

-34rizado por a razão ponderai de lípido/prostaglandina estar entre cerca de 300:1 e 800:1.
35^â. - Processo de preparação de uma composição lipossómica de prostaglandina compreendendo um lípido, prostaglandina Ep e um protector de secagem, caracterizado por compreender o passo de mistura de uma solução aquosa do protector de secagem contendo a prostaglandina, com um filme de lípido, seco.
36§% - Processo de acordo com a reivindicação 35, caracte rizado por os lipossomas serem liofilizados.
37^â. - Processo de preparação de uma composição lipossómica de prostaglandina compreendendo um lípido, prostaglandina E^, um protector de secagem, e um tampão activador de parti ção, caracterizado por compreender os seguintes passos:

a) mistura de uma solução etanólica do lípido com uma solução relativamente básica de um protector de secagem;

b) redução do tamanho dos lipossomas;

c) mistura dos lipossomas com uma solução etanólica de pros taglandina E^;

d) liofilização dos lipossomas do passo c); e

e) reconstituição dos lipossomas com uma solução de ácido cítrico, relativamente ácida.
38ã. - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracte rizado por o lípido ser fosfatidilcolina de ovo.
39^â. - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracte rizado por o protector de secagem ser um sacarídeo.
40^â. - Processo de acordo com a reivindicação 39, caracte; rizado por o sacarídeo ser dextrose, sacarose ou maltose.

4l^â. - Processo de acordo com a reivindicação 40, carate rizado por o sacarídeo ser maltose.
42^. - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracte rizado por o tamanho dos lipossomas ser reduzido por homogenei zação.

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Ref: 5Τ.601 TLC-135A

-3543§. - Processo de preparação de uma conposiçSo farmacêuti ca , caracterizado por se misturarem os lipossomas preparados de acordo com a reivindicação 37, com un veículo farmacouticanente aceitável.