PT87537B

PT87537B - Processo para preparacao de peptidos ciclicos anticoagulantes

Info

Publication number: PT87537B
Application number: PT87537A
Authority: PT
Inventors: John Leonard Krstenansky; Simon Jen Tan Mao
Original assignee: Merrell Dow Pharma
Priority date: 1987-05-21
Filing date: 1988-05-19
Publication date: 1992-09-30
Also published as: AU608846B2; NO882239L; EP0291981A2; FI89064C; EP0291981A3; PT87537A; CN88103009A; ATE88190T1; ES2054732T3; NO882239D0; AU1634388A; FI89064B; DK278588A; FI882359A0; HUT47136A; ZA883444B; KR880013977A; IL86439A0; NZ224677A; FI882359A7

Description

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Em toda esta memória descritiva utilizam-se as seguintes abreviaturas habituais dos aminoácidos:

Gli - glicina Ala - alanina

Vai - valina

Leu - leucina

Ile - isoleucina Pro - prolina Een - fenilalanina

Trp - triptofano Met - metionina

Ser - serina

Tre - treonina

Cis - cisteína

Tir - tirosina Asn - asparagina Gin - glutamina

Asp - ácido aspártico

Glu - ácido glutâmico

Lis - lisina

Arg - arginina

His - histidina

Nle - norleucina

Hip - hidroxiprolina

3,4—desidro-Pro - 3,4-desidroprolina Tir(SO^H) - sulfato de tirosina Pgl - fenil-glicina

NMeFgl - N-metil-fenil-glicina Sar - sarcocina (N-metil-glicina) pSubPen - fenil-alanina para-substituída

SubPen - fenil-alanina orto, meta ou para, mono- ou di-substituída

DAIa - D-alanina

Ac - acetilo

Suc - succinilo pCIFen - para-cloro-fenil-alanina pNOpFen - para-nitro-fenil-alanina

Pen - penicilamina (J>,/3,-dimetil-cisteína)

DCis - D-cisteína

Um grupo alquilo do radical alquilo de um grupo alcoxi inclui grupos alquilo de cadeia linear, ramificada ou cíclicos, por exemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, terc-butilo, pentilo, isopentilo, sec-pentilo, ciclopentilo, hexilo, iso-hexilo e ciclopentilmetilo. Um grupo acilo comportando 2 a 10 átomos de carbono significa grupos

- ο acilo de cadeia linear, ramificada, cíclicos, saturados e insaturados possuindo um ou dois radicais carbonilo por grupo, por exemplo, acetilo, benzoílo,e succinilo. 0 termo grupo etileno ou metileno C^-Cg refere-se a um grupo bivaiente derivado de um grupo alquílico saturado ou insaturado, cíclico ou acíclico comportando 1 a 8 átomos de carbono por eliminação conceptual de 2 átomos de hidrogénio de um dos átomos de carbono ou de dois dos átomos de carbono adjacentes do grupo alquílico. Os exemplos de grupos etileno ou metileno 0.,-% da presente invenção são o metileno ou metilideno (-CH₂-), etilideno (CH^CH<), 1-metiletilideno (CH^C(CH^)<), 1-metilpropilideno ou sec-butilideno (CH^Cí^CCCH^X), 2,2-dimetilpropilideno ou neopentilideno (CH^CCCH^^CHc), etileno ou dimetileno (-CH_PCH₂-), metiletileno (-CH₂CH(CH₅)-), etiletileno (-CHgCHCC^H^)-), etinileno ou venileno (-CH=CH-), 1,1-etenilideno (GH₂=C<), 1,1-ciclo-hexilideno (θθΗ₁₀<), e 1,2-ciclopentilideno (C^Hg<). Um átomo de halogêneo significa um átomo de flúor, cloro, bromo ou iodo.

termo qualquer aminoácido, conforme utilizado nesta memória descritiva, engloba os aminoácidos que ocorrem naturalmente e bem assim os outros α-aminoácidos não proteicos vulgarmente utilizados por especialistas na química dos pêptidos quando se preparam compostos sintéticos análogos dos péptidos que ocorrem naturalmente. Os aminoácidos que ocorrem naturalmente são glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, serina, metionina, treonina, fenilalanina, tirosina, triptofano, cisteína, prolina, histidina, ácido aspártico, asparagina, ácido glutâmico, glutamina, arginina, ornitina e lisina.

norvalina, aloisoleucina, homoarginina, tiaprolina, desidroprolina, hidroxiprolina (Hip), homosserina, ciclo-hexilglicina (Chg), ácido -amino-n-butírico (Aba), ciclo-hexilalanina (Cha) ácido amino-fenilbutírico (Pba), fenilalanina mono- ou di-substituídas na posição orto, meta ou para do radical fenilo com alquilo C-j-C^, alcoxi G^-G^, átomos de halogéneo ou grupos nitro ou com um grupo metilenodioxi, ^-(2- e 3-tienil)-alanina, -(2- e 3-furanil)-alanina, -(2-, 3-, θ 4-piridil)-alanina, |5> -(benzotienil-2- e 3-il)-alanina, -(1e 2-naftil)-alanina, derivados O-alquilados de serina, treonina ou tirosina, cisteína S-alquilada, éster de O-sulfato de tirosina, 3»5-di-iodotirosina e os isómeros D dos aminoácidos que ocorrem naturalmente.

termo aminoácido lipofílico engloba Tir, Tir(SO^H),

Fen, Leu, Nle, Ile, Vai, His e Pro.

Os aminoácidos naturais, com excepção da glicina, contêm um átomo de carbono quirálico. Salvo quando especificado de outro modo, os aminoácidos opticamente activos referidos nesta memória descritiva, consideram-se na configuração L.

Por exemplo, qualquer dos aminoácidos do grupo A^ ou Α^θ pode estar na configuração D ou L. Conforme ê habitual, a estrutura dos pêptidos descrita apresenta-se de modo a que a extremidade amina fica do lado esquerdo da cadeia e a extremidade carboxi fica do lado direito da cadeia.

termo dimero refere-se aos pêptidos que resultam da ligação de dois pêptidos lineares separados durante o passo de ciclização quer pelo processo topo a topo quer pelo processo de ο -

unir ο topo de um com a parte final de outro. Ao efectuar-se a desejada ciclização interna através do grupo ”B”, algum do material peptídico linear de partida ligar-se-á com outro material peptídico linear de partida em vez de se ligar a ele próprio. 0 produto resultante constitui um dímero” no sentido em que é formado por dois péptidos lineares de partida, mas não é um dímero no sentido em que a forma molecular do dímero seja exactamente duas vezes a fórmula molecular do monómero.

Um dímero de derivados peptídicos da presente invenção apresentará a seguinte fórmula estrutural:

X-Aι-Αχ-Α 3-Af A 5

CO-A7 —Ag

NRf

N(Ri)-C-R I

Aíqi

I

B

I

ÃJq2

ΙχY-A11-A10 —CO-C-R'

I

NR/.

Ag —

RMXO-Aio-Au-Y

I

Ã132

I

B

I

Aiii

DR-C-N(Ri) -A5-A4-AJ-A2-A/-X

I

A7—CO

Dímero resultante da união do topo com a parte final

CO

Ά7 —Ae •D , NR/

X-ArAi-AfA^As — N(Ri)-C-R I

AJqi

I

B

I

AJqj

ΙχX-Ar-Ai-Aí-Ag-As — N(Ri)-C*R

I _n< , CO-A₇—Ag—NR/

Dimero resultante da união topo a topo

R'-C-CO - Aio-A_irY I

Aiq2

I

B

I

Aij2

R'-C-CO—A10-A11-Y I

em que os substituintes têm os significados anteriormente definidos para a estrutura 1. Ao longo desta memória descritiva, a referência aos derivados peptídicos engloba os dímeros e as suas misturas salvo quando o contexto implique especificação diferente. Apesar das misturas de monómeros e de dímeros resultantes da reacção de ciclização se poderem separar facilmente por meios bam conhecidos pelos especialistas na matéria, é possível utilizar as misturas da presente invenção sem separação em composições anti-trombóticas.

x Os polipéptidos de fórmula 1 podem formar sais farmaceuticamente aceitáveis com ácidos orgânicos ou inorgânicos não tóxicos. Os exemplos ilustrativos de ácidos inorgânicos que formam sais adequados são os ácidos clorídrico, bromídrico, sulfúrico e fosfórico e sais de metais ácidos tais como mono-hidrogeno, ortofosfato de sódio e sulfato ácido de potássio. Os exemplos de ácidos orgânicos ilustrativos que formam sais adequados englobam os ácidos mono-, di- e tri-carboxílicos. São exemplos os ácidos acético, glicólico, láctico, pirúvico, succínico, | glutárico, fumárico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, maleico, hidroximaleico, benzoico, hidroxibenzóico, fenilacético, cinâmico, salicílico, 2-fenoxibenzóico e os ácidos sulfónicos tais como o ácido metano-sulfónico e 2-hidroxietano-sulfónico.

Os sais do radical de aminoácido carboxi terminal englobam os sais de ácido carboxílico não tóxicos formados com bases inorgânicas ou orgânicas adequadas. De modo ilustrativo esses sais englobam os sais de metais alcalinos, por exemplo sódio e potássio; de metais alcalino-terrosos, tais como o cálcio e o magnésio; de metais leves do grupo IIIA incluindo o alumínio;

-· JLU e de aminas orgânicas primárias, secundárias e terciárias, por exemplo, trialquilaminas, incluindo trietilamina, procaína, dibenzilaraina, 1-etenamina, Ν,Ν’-dibenziletilenodiamina, di-hidroabietilamina, N-(alquil inferior)-piperidina ou qualquer outra amina adequada.

Tal como sucede com quaisquer grupos genéricos de compostos químicos, alguns grupos são preferidos. Os inventores preferem os derivados peptídicos de fórmula geral 1 na qual

X representa um átomo de hidrogénio ou um grupo acetilo ou succinilo.

Também são preferenciais os compostos de fórmula geral 1 na qual

Aj representa -His-Asn-Asp-Gli-Asp-,

-Asn-Asp-Gli-Asp-,

-Asp-Gli-Asp-,

-Gli-Asp-,

-Asp-, ou uma ligação.

A£ representa, de preferência, Pen, β -(2- ou 3-tienil)-alanina, Tir, Trp ou pCIPen,;

A^ representa Glu;

A^ representa Glu, Asp, Pro ou Ala;

Ag representa Ile;

Ar, representa Glu, Asp ou Ala;

Ag representa Glu ou Asp;

A₁₀ representa Leu;

^A11 ^reP^reserrta Pro, Gin, Asp ou Asp-Glu;

Alq^ e Alq£ representam, cada um, um grupo metileno;

Y representa um grupo OH ou ML?; e

B representa -S-S-.

São especialmente preferidos os derivados peptldicos de fórmula geral 1 na qual X representa um grupo acetilo e A^ representa Gli-Asp ou Asp ou X representa um grupo succinilo e A^ representa uma ligação e em que

A₂ representa Fen, -(2-tienil-alanina) ou Tir;

A^ representa Glu;

A^ representa Glu ou Pro;

A^ representa Ile;

Ar; representa Glu;

Αθ representa Glu ou Asp;

Ag representa Tir, Ala-Tir ou Glu-Leu;

A-^θ representa -Leu-Gln- ou Asp-Glu;

^A11 ^reP^reserrta £T*^oí Gin» ^AsP» ^ou Asp-Glu;

R, R’, R^^ e R·^ representam, cada um, um átomo de hidrogénio; Alq^ e Alq₂ representam, cada um, um grupo metileno;

B representa -S-S-; e

Y representa um grupo OH.

Os pêptidos da presente invenção podem ser preparados de acordo com uma diversidade de procedimentos conhecidos pelos especialistas na matéria. Tais procedimentos englobam a síntese de blocos e sequencial de fase sólida, a clonagem de genes e a combinação destas técnicas. 0 procedimento sequencial de fase sólida pode efectuar-se utilizando métodos automatizados normalizados tais como os que se praticam num sintetizador automático de pêptidos. Neste procedimento liga-se um aminoácido de radical -amino protegido a um suporte de resina. 0 suporte de resina utilizado pode ser qualquer resina adequada utilizada convencionalmente na especialidade para a preparação

- Í.Z. -

ferência poliestireno que tenha sido submetido a reticulação com 0,5 a 3/ de divinilbenzeno, que tenha sido clorometilado ou hidroximetilado para proporcionar locais para a formação de ésteres com o aminoácido introduzido inicialmente de radical <£-amino protegido.

Um exemplo de resina de hidroximetilo foi descrito por Bodanszky e outros.,Chem, Ind (London) 38? 1966, p. 1597-98. Encontra-se comercialmente disponível uma resina clorometilada, nos Bio Rad Laboratories, Richmond, Califórnia, e a preparação de tal resina foi descrita por Stewart e outros, Solid Phase Peptide Synthesis (Ereeman & Co., San Erancisco 1969)? capítulo 1, p. 1-6. 0 aminoácido protegido pode ser ligado à resina pelo procedimento de Gisin, Helv. Chem. Acta, 56, 1975? P· 14-76. Encontram-se comercialmente disponíveis diversos aminoácidos protegidos ligados a resina. A título de exemplo, para a preparação de um polipéptido da presente invenção em que a extremidade carboxi é um resíduo Tre, pode utilizar-se um resíduo Tre protegido por terc-butiloxicarbonilo (Boc) ligado a uma resina de fenilacetamidometilo (Eam) benzilada e hidroximetilada que se encontra comercialmente disponível.

A seguir ao acoplamento do aminoácido de radical -amino protegido ao suporte de resina faz-se a eliminação do grupo de protecção utilizando qualquer procedimento adequado, tal como a utilização de ácido trifluoroacético em cloreto de metileno, apenas ácido trifluoroacético ou HCI em dioxano. A desprotecção efectua-se a uma temperatura compreendida entre 0°C e a tempeLJ —

Λ ratura ambiente. Podem utilizar-se outros reagentes e condições de clivagem normalizados para a eliminação de grupos específicos de protecçâo de oL-amino. Após a eliminação do grupo de protecçâo de α-amino faz-se o acoplamento dos outros aminoácidos de radical amino protegido, passo a passo, pela ordem desejada. Em alternativa, pode fazer-se o acoplamento de múltiplos aminoácidos pelo método de solução antes do acoplamento com a sequência de aminoácido suportada em resina.

grupo de protecçâo de α-amino utilizado com cada aminoácido introduzido na sequência polipeptídica pode ser qualquer grupo de protecçâo conhecido na especialidade. Entre as classes dos grupos de protecçâo de α-amino contemplados estão (1) grupos de protecçâo do tipo acilo tais como: formilo, trifluoroacetilo, ftalilo, toluenossulfonilo (tosilo), benzenossulfonilo, nitrofenilsulfenilo, tritilsulfenilo, o-nitrofenoxiacetilo e «-clorobutirilo; (2) grupos de protecçâo do tipo uretano-aromático tais como benziloxicarbonilo e benziloxicarbonilo substituído, como p-clorobenziloxicarbonilo, p-nitro| benzilcarbonilo, p-bromobenziloxicarbonilo, p-metoxibenziloxicarbonilo, l-(p-bifenil-il)-l-metiletoxicarbonilo, oc , oc -dimetil-3,5-dimetoxibenziloxicarbonilo e benzidriloxicarbonilo;

(3) grupos de protecçâo do tipo uretano-alifático tais como terc-butiloxicarbonilo (Boc), di-isopropilmetoxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, etoxicarbonilo e aliloxicarbonilo; (4) grupos de protecçâo do tipo uretano ciclo-alquílico tais como ciclo-pentiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo e ciclo-hexiloxicarbonilo; (5) grupos de protecçâo do tipo tio-uretano tais como feniltiocarbonilo; (6) grupos de protecçâo do tipo alquí- 14

lico tais como trifenilmetilo (tritilo) e benzilo; e 7 grupos trialquilsilano tais como trimetilsilano. 0 grupo de protecção de -amino preferido é terc-butiloxicarbonilo.

A escolha de um reagente de acoplamento apropriado é do âmbito dos especialistas da matéria. Quando o aminoácido que se pretender adicionar fôr Gin, Asn ou Arg, o reagente de acoplamento particularmente adequado é a N,N’-di-isopropil-carbo-di-imida e o 1-hidroxibenzotriazol. A utilização destes reagentes evita a formação de nitrilo e de lactama. Outros reagentes de acoplamento são (1) carbo-di-imidas (por exemplo, N,N’-diciclo-hexilcarbo-di-imida e N-etil-N’-V-dimetilamino-propil-carbo-di-imida; (2) cianamidas (por exemplo, N,N-dibenzilcianamida); (3) ceteniminas; (4) sais de isoxazólio (por exemplo, N-etil-5-fenilisoxazólio-3’-sulfonato); (5) amidas heterocíclicas contendo azoto monocíclico, de carácter aromático, comportando entre 1 e 4 átomos de azoto no anel, tais como as imidazolidas, pirazolidas e 1,2,4-triazolidas. As amidas heterocíclicas específicas que são úteis englobam o Ν,Ν’-carbonil-di-imidazol e o N,N-carbonil-di-l,2,4-triazol; (6) acetileno alcoxilado (por exemplo, etoxiacetileno); (7) reagentes que formam um anidro misto com o radical carboxilo do aminoácido (por exemplo, cloroformato de etilo e cloroformato de isobutilo) ou o anidrido simétrico do aminoácido que se pretende acoplar (por exemplo, Boc-Ala-O-Ala-Boc) e (8) compostos heterocíclicos contendo azoto, que possuam um grupo hidroxi sobre um átomo de azoto do anel (por exemplo, N-hidroxiftalimida, N-hidroxissuccinimida e 1-hidroxibenzotriazol). Encontram-se descritos outros reagentes activadores e a sua utilização no acoplamento de

péptidos, em Kapoor, J. Pharm. Sei¹¹,, 59, 1970, p. 1-27. Os requerentes preferem a utilização do anidrido simétrico como reagente de acoplamento para todos os aminoácidos com excepção de Arg, Asn e Gin.

Cada aminoácido protegido ou sequência de aminoácido é introduzida no reactor de fase sólida com um excesso cerca de 4 vezes superior e efectua-se o acoplamento num meio de dimetilformamida: cloreto de metileno (1:1) ou apenas em dimetilformamida ou de preferência apenas em cloreto de metileno. Nos casos em que ocorra o acoplamento incompleto repete-se o procedimento de acoplamento antes da eliminação do grupo de protecção de a.-amino, antes do acoplamento do aminoácido seguinte, no reactor de fase sólida. Efectua-se o controlo do sucesso da reacção de acoplamento em cada estádio de síntese pela reacçâoefeninidrina conforme descrito por E. Kaiser e outros,Analyt.

Biochem.34, 1970, p. 595.

Depois de se ter obtido a desejada sequência de aminoácido elimina-se o péptido da resina. Isto pode efectuar-se por hidrólise, por exemplo por tratamento do polipéptido ligado à resina com uma solução de sulfureto de dimetilo, p-cresol e tio-cresol em ácido fluorídrico aquoso diluído.

Conforme é do conhecimento dos especialistas da síntese de péptidos pela técnica de fase sólida, muitos dos aminoácidos suportam funcionalidades que exigem protecção durante a preparação da cadeia. A utilização e selecção do grupo de protecção apropriado é da competência dos especialistas na matéria e dependerá do aminoácido que se pretende proteger e da presença de outros resíduos de aminoácidos protegidos no péptido.

ιυ

A escolha de tal grupo de protecção da cadeia lateral é crítica uma vez que este não se deve eliminar por clivagem durante a clivagem do grupo de protecção do radical -amino. Por exemplo, os grupos de protecção da cadeia lateral adequados para a lisina são o benziloxicarbonilo e o benziloxicarbonilo substituído, sendo o referido substituinte escolhido entre os átomos de halogéneo (por exemplo cloro, bromo ou flúor) e o grupo nitro (por exemplo, 2-clorobenziloxicarbonilo, p-nitrobenziloxicarbonilo, 3,4-diclorobenziloxicarbonilo), tosilo, t-amiloxicarbonilo, t-butiloxicarbonilo e di-isopropilmetoxicarbonilo. Pode proteger-se o grupo hidroxilo alcoólico da treonina e da serina com um grupo acetilo, benzoilo, terc-butilo, tritilo, benzilo, 2,6-diclorobenzilo ou benziloxicarbonilo. 0 grupo de protecção preferido é o benzilo.

Estes grupos podem ser eliminados por procedimentos bem conhecidos na especialidade. Normalmente efectua-se a eliminação do grupo de protecção depois de se completar a síntese da cadeia peptídica mas os grupos de protecção podem ser eliminados em qualquer momento apropriado.

Em geral, efectua-se a preparação dos péptidos a partir de um derivado linear apropriado, antes ou após a eliminação do pêptido linear do suporte sólido. Os compostos de estrutura geral 1 na qual B representa um grupo -S-S- preparam-se a partir dos correspondentes péptidos lineares contendo sulfidrilo livre, de acordo com técnicas de acoplamento por oxidação bem conhecidas, tal como a oxidação de péptidos lineares com ferrocianeto de potássio descrita por exemplo por Stewart e outros, Solid Phase Peptide Synthesis (Preeman & Co.,

San Francisco 1969), capítulo 1, p. 95· Os compostos de estrutura geral 1 na qual B representa um grupo -S-Alq^-S- e Alq^ representa um grupo etileno Ο-ρθδ P^{0<leD1 ser} Preparados a partir dos péptidos lineares contendo sulfidrilo livre por reacção com um derivado de 1,2-dibromo de um alquilo acíclico ou cíclico, saturado ou insaturado por um processo análogo ao descrito por Η. I. Mosberg e J. R. Omnaas, J, Amer. Chem, Soc, 107, 1985, p. 2986-2987· Os compostos de estrutura geral 1 na qual B representa um grupo -S-Alq^-S- e Alq^ representa um grupo metileno C]_-Og preparam-se por reacçao do péptido linear contendo sulfidrilo livre com um aldeído ou cetona alquílica acíclica ou cíclica, saturada ou insaturada, por um processo análogo ao descrito em J. Amer. Chem, Soc. 76, 1954, p. 1945· A preparação dos compostos de estrutura geral 1 na qual B representa um grupo -S- pode efectuar-se conforme descrito por K. Jost, Collect. Czech. Chem Commun. 56, 1971, p.218, e na patente de invenção norte-americana com o N° 4 161 521.

A dose anticoagulante de um derivado peptídico da presente invenção está compreendida entre 0,2 mg/Kg e 250 mg/Kg de peso do corpo do doente por dia, dependendo das condiçoes do doente, da gravidade do estado trombótico que se pretende tratar e do derivado peptídico escolhido. A dose adequada para um dado doente pode determinar-se facilmente. De preferência administrar-se-ão 1 a 4 doses diárias compreendidas normalmente entre 5 mg e 100 mg de composto activo por dose.

A terapêutica anticoagulante está indicada para o tratamento e prevenção de uma diversidade de estados trombóticos, particularmente no caso de doenças das artérias coronárias e cerebrovasculares. Os especialistas neste domínio estão aten-

tos às circunstâncias que exijam terapêutica anticoagulante.

termo doente” agora utilizado refere-se a mamíferos tais como os primatas, incluindo o homem, caprinos, equídeos, bovinos, suínos, cães, gatos, ratazanas e ratos.

Embora muitos dos derivados peptídicos possam sobreviver à passagem através do intestino após a administração oral, os requerentes preferem a administração não oral, por exemplo subcutânea, intravenosa, intramuscular ou intraperitoneal; administração por injecção depot; por implantação; ou por aplicação às membranas mucosas, tais como as do nariz, garganta ou brônquios, por exemplo, num recipiente para aerossol que contenha um derivado peptídico da presente invenção sob a forma de uma aspersão ou de pó seco.

Para administração parentérica é possível administrar os compostos com doses injectáveis de uma solução ou suspensão do composto num diluente fisiologicamente aceitável, com um veículo farmacêutico, o qual pode ser um líquido esterilizado como a água e óleos, com ou sem a adição de um agente tensio-activo ou de outros adjuvantes sob o ponto de vista farmacêutico. A título de exemplo, os óleos que se podem utilizar nestas preparações são os derivados de petróleo, de origem animal, vegetal ou de origem sintética, por exemplo óleo de amendoim, óleo de soja e óleo mineral. Em geral, a água, as soluções salinas, a dextrose aquosa e as soluçoes associadas ao açúcar, etanol e glicois tal como o propilenoglicol ou o polietilenoglicol são considerados veículos líquidos preferenciais, particularmente adequados para as soluções injectáveis.

Os compostos podem ser administrados sob a forma de uma injecção depot ou por implantação, formuladas de tal como que permitam uma libertação doseada do ingrediente activo, 0 ingrediente activo pode ser comprimido em aglomerados ou pequenos cilindros fazendo-se a implataçao subcutaneamente ou intramuscularmente sob a forma de injecções depot” ou de implantações. As implantações podem utilizar materiais inertes tais como os polímeros biodegradáveis ou os silicones sintéticos, por exemplo, Silastic, borracha de silicone preparada pela Dow-Corning Corporation.

EXEMPLOS

Ilustra-se a presente invenção pelos exemplos seguintes não limitativos.

EXEMPLO 1

PREPARAÇÃO DE

H-Gli-Asp-Een-Glu-Glu-Ile-DCis-Glu-Glu-Cis-Leu-Gln-OH

Sintetizou-se o pêptido por métodos de fase sólida utilizando 0,1 mmole de uma resina Boc-Gln-PAM a 0,66 mmole/g. Efectuaram-se os acoplamentos duplos por anidrido simétrico com 2,0 mmole de Noí-Boc-aminoácido (Peptides International) excepto no caso de Boc-Gln, o qual foi acoplado pelo método DCC/HOBT. A protecção da cadeia lateral utilizada foi: Asp(Ohx), Cis (pMeBzl), Glu(Bzl). Depois de se completar a síntese eliminou-se a protecção No(-Boc com ácido trifluoroacêtico a 50% em cloreto de metileno. Lavou-se a resina 5 vezes com cloreto

CZ\J —

de metileno, neutralizou-se com três lavagens de di-isopropiletilamina a 10% em cloreto de metileno, lavou-se 5 vezes com cloreto de metileno, acetilou-se com N-acetilimidazol em cloreto de metileno, lavou-se 3 vezes com cloreto de metileno e secou-se in vacuo. Desprotegeu-se o péptido e clivou-se a partir da resina com água e ajustou-se o pH para 8,5 com hidróxido de amónio. Adicionou-se à solução ferrocianeto de potássio (0,01 N) até persistir uma cor amarela. Agitou-se a solução durante 30 minutos e depois ajustou-se o pH para um valor entre 4 e 5 com ácido acético. Depois agitou-se a mistura com uma resina de permuta iónica Bio-Rad AG3-X4-A, durante 2 horas. Filtrou-se a mistura e liofilizou-se o filtrado.

Purificou-se o péptido dessalinizando-o numa coluna Sephadex G-15 de 92 x 2,6 cm com ácido acético aquoso a 5% e liofilizou-se. Efectuou-se a CLEP preparativa numa coluna C^⁸ Vydac 218TP1010 (250 x 10 mm) com acetonitrilo em ácido trifluoroacêtico aquoso a 0,1% à velocidade de 5ml/min. Recolheu-se o pico principal e liofilizou-se para se obter o produto desejado. Determinou-se a homogeneidade por CLEP e CCF.

A CLEP em coluna C¹⁸ Vydac 218TP54- (250 x 4,6 mm), 2 ml/min., t_Q « 1,8 min.: tempo de eluição com acetonitrilo a 25-50% em gradiente linear de ácido trifluoroacêtico a 0,1% à razão de 1%/min. (CLEP) de 5,5 min. FAB-EM: (Μ + H) = 1411,7 + 1 nyi (calculado 1410). No quadro 1 apresenta-se a análise de aminoácidos: (hidrólise HC1 6N; 24 horas a 106°C), ver no quadro 1 teor de 57% de péptidos em peso.

Claims

1Processo para a preparação de um derivado de pêptido de fórmula geral

CO A_? Αθ _NR^ ,

N(Ry)-Ç-R

R’-C-CO — AyQ-Ayy-Y

Alg.

Alcr, na qual X representa um radical amino terminal escolhido entre um átomo de hidrogénio, um ou dois grupos alquilo C^-Cg, um ou dois grupos acilo ^C2~^C1Q' um grupo carbobenziloxi ou um grupo t-butiloxi-carbonilo;

Ay representa uma ligação ou um pêptido que compor-22ta 1 a 5 radicais de qualquer amino-ácido;

A₂ representa Phe, SubPhe, JÒ-(2- e 3-tienil)-alanina, p-(2- e 3-furanil)-alanina, ^-(2-, 3-, e 4-piridil) -alanina, ‘p>-(benzotienil-2- e 3-il)-alanina, £>-(1- e 2-naftil)-alanina, Tyr, ou i

Trp;

Αθ representa Glu ou Asp;

A^ representa qualquer amino-ácido;

A_c representa Ile, Vai, Leu, Nle ou Thr;

O

A? representa qualquer amino-ácido;

Αθ representa Glu ou Asp;

representa um amino-ácido hipofílico escolhido entre Tyr, TyrfSO^H), Trp, Phe, Leu, Nle, Ile, Vai, His, e Pro ou representa um dipeptido que contém pelo menos um destes amino-ácidos lipofílicos;

A^ representa uma ligação ou um fragmento de péptido que possui um a cinco radicais de qualquer amino-ácido;

Y representa um radical carboxi terminal escolhido entre os grunos OH, alcoxi C^-Cg, amino, monoou di-(alquil (C^-C^)-amino substituído ou benzilamino;

R, R’, R^ e R^’ representam, cada um, um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo C^-C^;

3 representa -S-, -S-S- ou -S-Alq^-S-;

Alq^, Alq₂ e Alq^ representam, cada um, um grupo etileno ou metileno C^-Cg,· e em que D e ”L indicam que a estereoquímica do átomo de carbono indicado é a correspondente ã D-cisteína e L-cisteína, respectivamente, caracterizado pelo facto de se preparar o pêptido linear que contém sulfidrilo livre por síntese de blocos ou sequencial de fase sólida, clonagem de genes, ou uma sua combinação e de se submeter depois o pêptido linear a uma ligação oxidante.

2.- Processo de síntese de blocos ou sequencial de fase sólida para a preparação de um derivado peptídico de fórmula geral ^{C0 A}7 ^A8 NR₁,

X-A₁-A₂-A₃-A₄-A₅ - NÍRp-C-R

Alq,

R-C-CO — Α_1θ-Α_η-Υ

Alq na qual X, A^, A₂, Ag , A₄ , Aj-, A^ , Ag , A^ θ, A^ , Y, R, R', R₁, R.j ', B, Alq^ , Alq₂ ^{e Al<}?3 ^^{111 OS}significados definidos antes, e em que D e L indicam que a estereoquímica do ãtomo de carbono indicado é a correspondente à D-cisteína e L-cisteína, respectivamente, caracterizado pelo facto de se ligar um amino-ãcido protegido adequadamente de fórmula A^ a um suporte de resina activado, de se ligar subsequentemente os outros amino-ácidos X-amino protegidos de A₂ ^{a a}i ·] ^ao grupo amino terminal da cadeia peptídica crescente que entretanto foi exposta por remoção dos seus grupos amino protectores, e, finalmente, de se submeter o péptido linear a uma ligação oxidante.

>

3. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por A₂ representar Phe, ^-(2- ou 3-tienil)-alanina ou Tyr.

4. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por A_g representar Glu.

5. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por A^ representar Glu.

6. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por A_g representar Ile.

7. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por A^ representar Glu ou Ala.

8. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Αθ representar Glu ou Asp.

9. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Α^θ representar Leu.

1θ· — Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por A^ representar Pro, Gin, Asp ou Asp-Gln.

11. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por X representar um átomo de hidrogénio ou um grupo acetilo ou succinilo.

12. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Y representar um grupo OH ou NH₂·

13. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R, R’, R^ e R/ representarem, cada um, um ãtomo de hidrogénio.

>

14. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por B representar o grupo -S-S-.

15. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Alq^ e Alq₂ representarem, cada um, um grupo metileno de fórmula -(CH₂)-,