JPS63307895A - 環状抗凝固ペプチド類 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 抗凝固剤は、例えば急性の深部静脈血栓、肺塞栓症、急
性の四肢動脈塞栓症、心筋梗塞、及び伝染した血管向凝
固の薬理学的な治療に於て有用な治療剤である。抗凝固
剤の予防的な投与はリュウマチ性の又は動脈硬化性心臓
病を有する患者の塞栓症の再発を防止し、ある種の外科
手術の血栓塞栓の合併症を防止すると信じられる。抗凝
固剤の投与は又冠状動脈及び大脳静脈病の治療において
治療が出来ることが示されている。動脈の血栓、特に心
筋及び脳に供給している動脈における血栓は死亡の主要
な原因である。

（従来の技術〕 ヒルディン（ｈｉｒｕｄｉｎ）は蛭の唾液線から単離さ
れる６５の残基のポリペプチドである。これは抗凝固剤
てあ′つて、トロンビン特異性阻害剤である。

〔発明が解決しようとするｒ４題〕 ヒルディンは非常に強力ではあるが、その量が限定され
ていること、高価なこと、一般に任意のその寸法の外来
蛋白質投与後に起きる様なアレルギー反応があること等
の為、蛭抽出物から単離されたヒルディンの臨床的な使
用はできそうもないことである。

帽１を解決する手段〕 出願人はヒルディンの特定の領域が少なくとも部分的に
でもその抗凝固活性の原因になるものであることを発見
した。この領域は化学的に合成され、その類似体のある
種のものはトロンビンの認識位置に結合するがそこから
空間的に離れている酵素開裂位置には結合しない０合成
ペプチドが結合すると、フィブリン生産及び凝固形成の
必要条件であるフィブリノゲンのトロンビン認識位置へ
の結合を競走的に防止する０本発明のペプチドは有意義
な抗凝固活性を有し、トロンビンの開裂位置に結合する
ことなく認識位置のみに結合する並外れたその能力は化
学的に興味があり、治療上有意義な抗凝固療法への補助
を提供する。

本発明は構造式ｌを有するヒルディンの誘導体〔式中Ｘ
は水素、１〜６個の炭素原子のアルキル基の１．又は２
個、２〜１０個の炭素原子のアシル基の１又は２個、カ
ルボベンジロキシ又はｔ−ブチロキシカルボニルからな
る群から選ばれるアミノ末端残基であり、 Ａ１は結合であるか、又は１〜５個の任意のアミノ酸残
基を含むペプチド断片であり、 Ａ２はＰｈｅ、　５ｕｂＰｈｅ、β−（２−及び３−チ
エニル）アラニン、β・（２−及び３−フラニル）アラ
ニン、β−（２−１３−及び４−ピリジル）アラニン、
β−（ベンゾチェニル−２−及び−３−イル）アラニン
、β−（ｌ−及び２−ナフチル）アラニン、Ｔｙｒ又は
Ｔｒｐであり、 Ａ３はＧｌｕ又はＡｓｐであり、 Ａ４は任意のアミノ酸であり、 Ａ、はｌｌｅ、　Ｖａｌ、Ｌｅｕ％Ｎｌｅ又はＴｈｒで
あり、Ａ７は任意のアミノ酸であり、 一一一 ＡＩｌはＧｌｕ又はＡｓｐであり、 ＡＩＯはＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＳＯＪ）、Ｔｒｐ、　Ｐｈｅ
、　Ｌｅｕ、　Ｎｌｅ、　　Ｉ　ｌｅ。

Ｖａｌ、旧Ｓ及びＰｒｏから選ばれる親油性のアミノ酸
であるか、又はそれらの親油性のアミノ酸を少なくとも
１つ含有しているジペプチドであり、Ａｌｌは結合であ
るか、又は１〜５個の任意のアミノ酸の残基を含有して
いるペプチドの断片であり、■は０■、（Ｃ＋〜Ｃａ）
アルコキシ、アミノ、モノ又はジ（Ｃ＋〜Ｃ４）アルキ
ル置換アミノ又はベンジルアミノから選ばれるカルボキ
シ末端残基であり、Ｒ，Ｒ’、Ｒ７、及びＲ，Ｉはそれ
ぞれ水素又は（Ｃ＋〜Ｃ，）アルキル基から選ばれ、 Ｂは−５−１−Ｓ−Ｓ−１又は−５−Ａｌｋ３−５−か
ら選ばれ、Ａｌｋｌ、Ａｌｋ、、及びＡｌｋ３はそれぞ
れ（Ｃ＋〜Ｃａ）メチレン又はエチレン基から選ばれ、 「Ｏ」及び「Ｌ」は示された炭素の立体化学がそれぞれ
Ｄ−システィン及びＬ−システィンに対応するものであ
ることを示す〕並びにこれらのペプチド誘導体の二量体
、及びそれらの混合物、及びこれらのペプチド誘導体、
その二量体、及び混合物の抗凝固剤としての用途に間す
るものである。

この明細書を通じて次の一般的なアミノ酸の省略形が使
用される。

ｃｔｙ　　　　　−グリシン Ａｌａ　　　　　−アラニン Ｖａｌ　　　　　−バリン Ｌｅｕ　　　　　−ロイシン １１ｅ　　　　　−イソロイシン Ｐｒｏ　　　　　　−プロリン Ｐｈｅ　　　　　−フェニルアラニン Ｔｒｐ　　　　　−トリプトファン Ｍｅｔ　　　　　−メチオニン Ｓｅｒ　　　　　−セリン Ｔｈｒ　　　　　−スレオニン Ｃｙｓ　　　　　−システィン Ｔｙｒ　　　　　−チロシン Ａｓｎ　　　　　−アスパラギン Ｇｌｎ　　　　　−グルタミン Ａｓｐ　　　　　−アスパラギン酸 Ｇｌｕ　　　　　−グルタミン酸 Ｌｙｓ　　　　　−リジン Ａｒｇ　　　　　−アルギニン 旧Ｓ　　　　−ヒスチジン Ｎｌｅ　　　　　−ノルロイシン Ｈｙｐ　　　　　−ヒドロキシプロリン３．４−テ”ヒ
ト”口Ｐｒｏ−３，４−デヒドロプロリン”ｙｒ（ＳＯ
３１１）　　−チロシンサルフェートＰｇｌ　　　　　
−フェニルグリシン ＮＭｅＰｇｌ　　　　−Ｎ−メチルフェニルグリシンＳ
ａｒ　　　　　−サルコシン（Ｎ−メチルグリシン）ｐ
ＳｕｂＰｔｖｅ　　　−バラ置換フェニルアラニン５ｕ
ｂＰｈｅ　　　　−オルソ、メタ又はパラのモノ又はジ
置換フェニルアラニン ＤＡｌａ　　　　　−Ｄ−アラニン Ａｃ　　　　　　−アセチル Ｓｕｃ　　　　　−サクシニル ｐｃＩＰｈｅ　　　　−パラクロロフェニルアラニンｐ
Ｎｏ２Ｐｈｅ　　　−パラニトロフェニルアラニンＤＣ
ｙｓ　　　　　−Ｄ−システィン アルキル基及びアルコキシ基のアルキル部分は直鎖、分
枝鎖、又は環状のアルキル基を含み、例えばメチル、エ
チル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、
第三ブチル、ペンチル、イソペンチル、第二ペンチル、
シクロペンチル、ヘキシル、イソヘキシル、シクロヘキ
シル及びシクロペンチルメチルを含む、２〜１０個の炭
素原子を有するアシル基は直鎖、分枝鎖、環状の飽和及
び不飽和アシル基であって、１〜２個のカルボニル部分
を基当り有するもの、例えばアセチル、ベンゾイル及び
サクシニルを含むものとする−　　’（ｃ＋〜Ｃ８）メ
チレン又はエチレン基」という用語は、１〜８個の炭素
原子の非環式又は環式、飽和又は不飽和アルキル基から
炭素原子の一つから又はアルキル基の隣接する炭素原子
の二つから二つの水素原子を概念的に除去することによ
って誘導される二価の基を指す、（Ｃ１〜Ｃｓ）メチレ
ン又はエチレン基の本発明における例は、メチレン又は
メチリデン（・ＣＨ２−）　、エチリデン（ＣＨ２Ｃｌ
＜　）　、ｌ−メチルエチリデン（ＣＨ３Ｃ（Ｃ）１３
）　＜　）、１−メチルプロピリデン又は　第二ブチリ
デン（Ｃ１，：ＩＣＨ２Ｃ（ＣＨ３）＜）　、２．２−
ジメチルプロピリデン又はネオペンチリデン（ＣＨｉＣ
（ＣＨ３）２ｃＨ＜　）　、エチレン又はジメチレン（
−ＣＨ２ＣＨ２−）　、メチルエチレン（−ＣＨｔＣ）
Ｉ（ＣＨ３）−）、エチルエチレン（−ＣＨ２Ｃｌ（Ｃ
２Ｈｓ）−）、エテニレン又はビニレン（−ＣＨ：ＣＨ
−）　、１．１−エテニリデン（ＣＨ２＝Ｃ＜）　、１
．１−シクロへキシリデン（ＣａＨ＋ｏ＜）、及び１．
２−シクロペンチリデン（ＣｓＨｅ＜）である。

ハロゲン基はフルオロ、クロロ、アロモ、又はヨード基
である。

「任意のアミノ酸」という用語は本明細書では天然のア
ミノ酸並びにペプチド化学技術に於て天然のペプチドの
合成類似体を製造する時に使用される他の非蛋白α−ア
ミノ酸を含む、天然のアミノ酸はグリシン、アラニン、
バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン
、スレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプト
ファン、システィン、プロリン、ヒスチジン、アスパラ
ギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、ア
ルギニン、オルニチン、及びリジンである。非蛋白α−
アミノ酸の例はノルロイシン、ノルバリン、７０イソロ
イシン、ホモアルギニン、チアプロリン、デヒドロプロ
リン、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、ホモセリン、シ
クロへキシルグリシン（Ｃｈｇ）、α−アミノ−ｎ−酪
酸（Ａｂａ）、シクロへキシルアラニン（＋Ｊａ）、ア
ミノフェニル酪酸（Ｐｂａ）、フェニル部分のバラ位置
で（Ｃ＋〜Ｃ４）アルキル、（Ｃ＋〜Ｃ４）アルコキシ
、ハロゲン、又はニトロ基で置換されたフェニルアラニ
ン、β−（２−及び３−チエニルアラニン、β−（２−
及び３−フラニル）アラニン、β−（２−１３−及び４
−ピリジル）アラニン、β−（ベンゾチェニル−２−及
び３−イル）アラニン、β−（ｌ−及び２−ナフチル）
アラニン、セリン又はスレオニン又はチロシンの０−プ
ルキル化誘導体、Ｓ−アルキル化システィン、チロシン
の０−サルフェートエステル、３．５−ショートチロシ
ン、及び天然のアミノ酸の〇−異性体である。

「親油性のアミノ酸」という用語にはＴｙｒ、Ｔｙｒ（
ＳＯ３Ｎ）、Ｐｈｅ、　Ｌｅｕ、Ｎ１ｅｘ　ｌｉｅ、　
Ｖａｌ、Ｈｉｓ及びＰｒ。

が含まれる。

グリシンを例外として天然のアミノ酸は不斉炭素原子を
含んでいる。それ以外に特定して記−載されていなけれ
ば本明細書で述べられる光学活性アミノ酸はＬ−立体配
置である０例えば、Ａ、又はＡ１゜群の任意のアミノ酸
は０−又はＬ−立体配置であり得る。萱通そうであるよ
うに、本明細書で記載されているペプチドの構造は慣習
に従ってアミノ末端が鎖の左側で、カルボキシ末端が鎖
の右側である。

「二量体」という用語は、二つの別々の線状のペプチド
が頭と頭、又は頭としっぽの形式のいずれかで環上段階
の間に結合することによって生じるペプチドを意味する
。「８」グループを経る所望の内部理化を実施する過程
で線状ペプチド出発物質の幾つかは、それ自体でなくっ
て別の線状ペプチド出発物質と結合する。生じるペプチ
ドは線状の出発ペプチドの二つからなっているという意
味で「二量体」であるが、モノマーの分子式を正確に二
倍した二量体の分子式という意味では二量体ではない０
本発明のペプチド誘導体の二量体は以下の構造式を有す
るであろう。

頭としっぽの二量体 頭と頭の二量体 式中置換基は、構造式１で定義した通りである。

本明細書を通じて、ペプチド誘導体という場合にはその
文脈がそうでないということを要求していない限り二量
体及び混合物を含むものとする。環化反応から生じるモ
ノマー及び二量体の混合物は当業者によって良く知られ
た手段により容易に分離できるが、混合物は分離する必
要なしに本発明の抗凝固組成物中に使用することができ
る。

式ｌのポリペプチドは任意の非毒性有機又は無機酸と製
薬上受入れられる塩を形成することが出来る。ａ当な塩
を形成する無機酸の例には塩酸、臭化水素酸、硫酸、燐
酸、及びナトリウム−水素オルト燐酸及び硫酸水素カリ
ウム等の酸金属塩が含まれる。）ｌ！当な塩を形成する
有機酸の例は、モノ、ジ、及びトリカルボン酸を含む、
そのような酸の例は例えば酢酸、グリコール酸、乳酸、
ピルビン酸、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、フマー
ル酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、
マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、安息香酸、ヒドロ
キシ安息香酸、フェニル酢酸、桂皮酸、サリチル酸、２
−フェノキシ安息香酸、及びメタンスルホン酸や２・ヒ
ドロキシェタンスルホン酸等のスルホン酸が含まれる。

カルボキシ末端アミノ酸部分の塩には任意の適当な無機
又は有機塩基と形成される非毒性のカルボン酸が含まれ
る。

例示すれば、これらの塩にはアルカリ金属、例えばナト
リウム及びカリウムのもの、アルカリ土類金属、例えば
カルシウム及びマグネシウムのもの、アルミニウムを含
めた■ａ族の軽金属のもの、及び有機第１級、第２級及
び第３級アミン、例えばトリエチルアミンを含めたトリ
アルキルアミン、プロ力イン、ジベンジルアミン、ｌ・
エタナミン、Ｎ、「・ジベンジルエチレンジアミン、ジ
ヒドロアビエチルアミン、Ｎ−（低級）アルキルピペリ
ジンのもの、及び他の適当なアミンのものが含まれる。

化合物の任意の一般基がそうであるように、ある種の基
が好ましい、出願人はＸが水素、アセチル又はサクシニ
ルの式１のペプチド誘導体が好ましいと考えている。

又Ａ１が −Ｈｉｓ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−５−Ａｓ
ｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−１−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａ
ｓｐ−１ −Ｇｌｙ−Ａｓ１１−１ −Ａｓｐ−１又は結合、 Ａ２が好ましくはＰｈｅ、β−（２−又は３・チェニル
）アラニン、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、又はｐＣＩＰｈｅ、Ａ３
が６１ｕ１ Ａ４がＧｌｕＳＡｓｐ、　Ｐｒｏ又はＡ　Ｉ　ａ　ｓＡ
、が１１ｅ。

Ａ７がＧｌｕ、　Ａｓｐ又はＡ　Ｉ　ａ　５ＡＩ５が６
１１１又はＡｓｐ。

Ａ、。がＬｅｕ。

ＡｌｌがＰｒｏ、　Ｇｌｎ、　Ａｓｐ又はＡｓｐ−Ｇｌ
ｕ、Ａｌｋ、及びＡｌｋ２がそれぞれメチレン基、モし
てＹがＯ）Ｉ又はＮＯ３、及び Ｂが−５−５−である式ｌの１ヒ合物も好ましい。

特に好ましいのは、Ｘがアセチル、Ａ、が・Ｇｌｙ−Ａ
ｓｐ−又は−Ａｓｐ・であるか、又は×がサクシニルで
Ａ１が結合の何れかであり、そして Ａ２がＰｈｅ、β−（２−チエニル）アラニン、Ｔｙｒ
％Ａ３がＧ１１１％ Ａ４がＧＩＩＪ又はＰｒｏ。

Ａ５がＩｌｅ、 八〇がＰｒｏ、 Ａ７が６１ｕ１ Ａ８がＧｌｕ又はＡｓｐ。

Ａ、がＴｙｒ、Ａｌａ−Ｔｙｒ又はＧｌｕ−Ｌｅｕ。

ＡＩＯがＬｅｕ−Ｇｌｎ−１−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−１Ａｌ
ｌがＰｒｏ、　Ｇｌｎ％Ａｓｐ又はＡｓｐ−Ｇｌｕ。

Ｒ，Ｒ’、Ｒ７、及びＲ，ｌはそれぞれ水素であり、Ａ
ｌｋ＋及びＡｌｋ２がそれぞれメチレン基、Ｂが・Ｓ−
５−１そして ＹがＯＨ れた種々の手順によって製造される。そのような手順に
は固相・シーケンシャル及びブロック合成、遺伝子クロ
ーニング及びこれらの技術の組合せが含まれる。

固相、シーケンシャル手順は自動ペプチド合成機による
など確立された自動化された方法を使用して実施できる
。この手順ではα−アミノ保護アミノ酸が樹脂支持体に
結合される。使用される樹脂支持体は任意の適当な固相
ペプチド調製にこの技術で都合良く使用される任意の適
当な樹脂であり得、好ましくは０．５〜３％のジビニル
ベンゼンで架橋されているポリスチレンであワて、クロ
ロメチル化されているかヒドロキシメチル化されて、最
初に導入されたα・アミノ保護アミノ酸とエステル形成
の為の位置を与えているものである。

ヒドロキシメチル樹脂の例はボダンスキー等、Ｃｈｅｍ
、　Ｉｎｄ、　（ロンドン）３８．１５９７−９８　（
１９６６）によって記載されている。クロロメチル化樹
脂はカリフォルニア州すッチモンド、バイオラドラボラ
トリーズから商業的に人手出来、そのような樹脂の調製
はステワード等「固相ペプチド合成」　（フリーマンア
ンドカンパニー、１９６９年サンフすンシスコ）第１章
、１〜６頁に記載される。保護されたアミノ酸はギシン
（Ｇｉｓｉｎ）、Ｈｅ１ｖ、　Ｃｈｅｗ　Ａｃｔａ、　
５６゜１４７６（＋９７３）の手順によって樹脂に結合
できる。多くの樹脂に結合された保護されたアミノ酸が
市販されている０例として、カルボキシ末端がＴｈｒ残
基である本発明のポリペプチドを製造する為にベンジル
化ヒドロキシメチル化フェニルアセトアミドメチル（Ｐ
ＡＭ）樹脂に結合された第三級ブチルオキシカルボニル
（Ｂｏｃ）で保護されたＴｈｒを使用出来、商業的に入
手し得る。

α−７ミノ保護アミノ酸を樹脂支持体に結合するに続い
て、例えば塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸、トリフ
ルオロ酢酸単独、又はジオキサン中のＨＣＩなど任意の
適当な手順を用いて保護基を除去する。脱保護は０℃と
室温の間の温度に於て実施される。特定のα−アミノ酸
保護基の除去の為の他の標準の開裂試薬及び条件を使用
できる。

α−アミノ保護基の除去の後、他のアミノ保護アミノ酸
が所望の順序で段階的に結合される。別の方法として、
複数のアミノ酸基を樹脂支持されたアミノ酸配列と結合
するに先立って溶液方法で結合することが出来る。

ポリペプチド配列中に導入される各アミノ酸に使用され
るα−７ミノ保護基は任意のこの技術で知られた保護基
であり得る。考慮に入れられるα−アミノ保護基の類の
中でも、（１）アシル型保護基、例えばホルミル、トリ
フルオロアセチル、フタリル、トルエンスルホニル（ト
シル）、ベンゼンスルホニル、ニトロフェニルスルフェ
ニル、トリチルスルフェニル、０−ニトロフェノキシア
セチル、及びα−クロロブチリル、（２）芳香族ウレタ
ン型保護基、例えばベンジルオキシカルボニル及び置換
ベンジルオキシカルボニル、例えばｐ−クロロベンジル
オキシカルボニル、ｐ−ニトロベンジルカルボニル、ｐ
−ブロモベンジルオキシカルボニル、ｐ−メトキシベン
ジルオキシカルボニル、１−（ｐ−ビフェニリル）−１
−メチルエトキシカルボニル、α、α−ジメチルー３，
５−ジメトキシベンジロキシカルボニル、及びペンズヒ
トリロキシ力ルボニル、（３）脂肪族ウレタン保護基、
例えば第三ブトキシカルボニル（Ｒｏｅ）、ジイソプロ
ピルメトキシカルボニル、イソプロビロキシカルボニル
、エトキシカルボニル、及びアリロキシカルボニル、（
４）シクロアルキルウレタン型保護基、例えばシクロペ
ンチロキ′ジカルボニル、アダマンチロキシカルボニル
、及びシクロへキシロキシカルボニル、（５）チオウレ
タン型保護基、例えばフェニルチオカルボニル、（６）
アルキル型保護基、例えばトリフェニルメチル（トリチ
ル）及びベンジル、及び（７）トリアルキルシラン基、
例えばトリメチルシランがある。好ましいα−アミノ保
護基は第三ブチルオキシカルボニルである。

適当な結合試薬の選択はこの技術の通常の知識を有する
者が行い得る範囲内である。加えられるアミノ酸がＧｌ
ｎ、　Ａｓｎ又はＡｒｇである場合の特に適した結合試
薬は、Ｎ、Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド及びｌ
−ヒドロキシベンツトリアゾールである。これらの試薬
の使用は、ニトリル及びラクタム形成を防止する。他の
結合試薬は（１）カルボジイミド類、例えばＮ、Ｎ’−
ジシクロへキシルカルボジイミド及Ｔ、ＦＮ−エチル−
Ｎ’（γ−ジメチルアミノプロとル力ルポジイミド）、
（２）シアナミド類、例えばＮ、Ｎ’−ジベンジルシア
ナミド、（３）ケテンイミン類、（４）イソキサゾリウ
ム塩（例えばＮ−エチル−５−フェニルイソキサゾリウ
ム−３′−スルホネート・（５）環中に１〜４個の窒素
を含有している芳香族性の単環式窒素含有複素環アミド
類、例えばイミダゾリド類、ビリジリド類及び１．２．
４−　）リアゾリド類である。有用である特定の複素環
アミド類にはＮ　、　Ｎ’−カルボニルジイミダゾール
、及びＮ、Ｎ−カルボニル−ジー１．２．４−　）リア
ゾール、（６）アルコキシル化されたアセチレン（例え
ばエトキシアセチレン）　、（７）アミノ酸のカルボニ
ル部分と混合無水物を形成する試薬、例えばエチルクロ
ロホルメート及びイソブチルクロロホルメート、又は結
合されるべきアミノ酸の対称無水物（例えばＢｏｃ−Ａ
ｌａ−０−＾１ａ−Ｂｏｃ）、及び（８）一つの環の窒
素上にヒドロキシ基を有している窒素含有複素環化合物
（例えばＮ・ヒドロキシフタルイミド、Ｎ−ヒドロキシ
コハク酸イミド及Ｕ１−ヒドロキシベンゾトリアゾール
）が含まれる。ペプチド結合に使用される他の活性化試
薬及びそれらの用途はカブール（にａｐｏｏｒ）、Ｊ、
　Ｐｈａｒａ＋。

Ｓｃｉ、　５９．１〜２７頁（１９７０）に記載されて
いる。出願人はＡｒｇ、　Ａｓｎ及びＧｌｎを除いて全
てのアミノ酸に対して結合試薬として対称の無水物を使
用するのが好ましいと考える。

各々の保護されたアミノ酸又はアミノ酸配列は約４倍過
剰で同相反応器に導入され、結合がジメチルホルムアミ
ド対塩化メチレン（１：１）又はジメチルホルムアミド
単独、又は好ましくは塩化メチレン単独の媒体中で実施
される。不完全な結合が起きた場合には、結合手順はα
−アミノ保護基を除去する前に、同相反応器中の次のア
ミノ酸の結合の前に繰り返される０合成の各段階に於け
る結合反応の成功は、イー、カイザー、等、Ａｎａｌｙ
ｔ。

Ｂｉｏｃｈｅｍ、　３４．５９５　（１９７０）に記載
されるようにニンヒドリン反応によってモニターされる
。

所望のアミノ酸配列が得られた後、ペプチドを樹脂から
除去する。これは樹脂に結合したポリペプチドを活水性
弗化水素酸中のジメチルスルフィド、ｐ−クレゾール及
びチオクレゾールの溶液で処理するなどして加水分解す
ることによりなしうる。

固相ペプチド合成の技術に於て知られるように多くのア
ミノ酸は鏡開製の間に保護を必要とする官能基を有して
いる・適当な保護基の使用及び選択はこの技術の当業者
の能力の範囲内であり、保護されるべきアミノ酸及びペ
プチド上の他の保護されたアミノ酸残基の存在に依存す
るであろう。

そのような側鎖保護基の選択はα−アミノ部分の保護基
の開裂の間開裂によって除去されないものでなければな
らないという点で臨界的である０例えばリジンに対する
適当な側鎖保護基はベンジルオキシカルボニル及び置換
ベンジルオキシカルボニルであり、その置換基はハロ（
例えばクロロ、ブロモ、フルオロ）及びニトロ（例えば
°２−クロロベンジロキシカルボニル、ｐ−ニトロベン
ジロキシカルボニル、３．４−ジクロロベンジロキシカ
ルボニル）、トシル、ｔ−アミロキシカルボニル、ｔ−
ブチルオキシカルボニル、及びジイソプロピルメトキシ
カルボニルから選ばれる。スレオ−ニン及びセリンのア
ルコール性ヒドロキシル基はアセチル、ベンゾイル、第
３１チル、トリチル、ベンジル、２゜６−ジクロロベン
ジル又はベンジルオキシカルボニル基で保護できる。好
ましい保護基はベンジルである。

これらの基はこの技術で良く知られた手順によフて除去
できる。典型的な保護基除去はペプチド鎖合成が完了し
た後に為されるが、保護基は任意の他の適当な時間に除
去することが出来る。

一般に環化されたペプチドは、固体支持体から線状のペ
プチドを除去する前又は後のいずれかに於いて適当な線
状の誘導体から製造される。Ｂが−５−５−基である構
造式１の化合物は、対応する遊離スルフヒドリル含有線
状ペプチドから良く知られた酸化的結合技術によって製
造され、例えばスチュワートら「固相ペプチド合成」　
（フリーマンアンド　カンパニー、サンフランシスコ　
１９６７）、１章９５頁に記載される様なフェリシアン
化カリで線状ペプチドを酸化すること等による。Ｂが・
５−Ａｌｋ３−５−基であフて、Ａｌｋ３が（Ｃ＋〜Ｃ
ａ）エチレン基である構造式ｌの化合物は、遊離スルフ
ヒドリル含有線状ペプチドから適当な非環式又は環式、
飽和又は不飽和アルキルの１．２−ジブロモ誘導体との
反応によりエッチ、アイ、モスベルブ及びジエイ・アー
ル、オムナース、Ｊ、　Ａｍｅｒ、　Ｃｈｅｗ、　Ｓｏ
ｃ、　１０７．２９８６〜２９Ｂ？　（＋９８５）に記
載されたのと類似の方法で製造することが出来る。Ｂが
−５−Ａｌｋ３−５−基であって、Ａｌｋ、が（Ｃ＋〜
Ｃ８）メチレン基である構造式１の化合物は、遊離スル
フヒドリル含有線状ペプチドの適当な非環式又は環式、
飽和又は不飽和アルキルケトン又はアルデヒドとの反応
によりＪ、Ａｌ１ｅｒ、　Ｃｈｅｓ、　Ｓｏｃ、　７６
、＋９４５　（、１９５４）中に記載された方法と類似
の方法で製造される。Ｂが−Ｓ−基である構造式ｌの化
合物の製造は、ケイ、ジョスト、Ｃ０ｆｌｅｅｔ、　Ｃ
ｚｅｃｈ、　Ｃｈｅｗ、　Ｃｏａ＋ｍｕｎ、　３６．２
１８　（＋９７１）及び米国特許第４１６１５２１に記
載された方法で達成できる。

本発明のペプチド誘導体の抗凝固投与量は１日当り患者
体重にｇあたり０．２Ｂ〜２５０Ｂであるが、患者、処
置されるべき血栓症状のひどさ、および選ばれるペプチ
ド誘導体に依存する。特定の患者に対する適当な投与量
は容易に決定できる。好ましくは１〜４回の毎日の投与
が典型的には５ｍｇ〜１００　ｍｇの投与当りの活性化
合物とともに投与される。

抗凝固療法は多種多様の血栓症状、特に冠状動脈及び脳
血管病の治療及び予防の為に示唆されている。この分野
に於けるこれらの経験は抗凝固療法を要求する状況を容
易に気づく０本明細書で使用する「患者」という用語は
、人を含めた霊長類、羊、馬、牛、豚、犬、ラット及び
マウス等の哺乳類を意味する。

ペプチド誘導体の幾つかは経口投与の後に胃腸を通過す
ることによって残り得るが、出願人は非経口投与が好ま
しいと考え、例えば皮下、静脈内、筋肉内、又は腹腔内
、デボ−注射による投与、移植製剤による投与、又は粘
膜に対する適用、例えばスプレー又は乾燥粉末形に於け
る本発明のペプチド誘導体を含有しているエロゾル缶と
して例えば鼻の粘膜、喉の粘膜、気管支の粘膜に投与す
るのが好ましい。

非経口投与の為には化合物は水、及び油等の滅菌液体で
あり得、表面活性剤及び他の製薬上受入れられる助剤の
添加をした又はしない製薬担体を有する生理学上受入れ
られる希釈剤中の化合物のｆ８液又は懸濁液の注射可能
な投与物として投与できる・これらの製剤中で使用でき
る油の例は石油、動物油、植物油、又は合成起源のもの
、例えばビーナツツ油、大豆油、及び鉱油である。一般
に水、塩水、水性デキストロース及び関連するｗＮ溶液
、エタノール、及びグリコール類、 例えばプロピレングリコール又はポリエチレングリコー
ルが好ましい液体担体で、特に注射溶液に好ましい。

化合物は活性成分の持続した放出を可能とする方法で処
方し得るデボ−注射又は移植製剤の形態で投与できる。

活性成分はペレット又は小シリンダーに圧縮され、皮下
又は筋肉内にデポ−注ｎ１又は移植物として移植される
。移植物は不活性物質、例えば生物分解可能な重合体又
は合成シリコーン類、例えばダウコーニングコーポレー
ションによって製造されるシリコーンゴムであるシラス
チックを使用できる。

〔実施例〕

本発明は次の非限定実施例によって説明される。

Ｘ濾」Ｌ−１ Ｇｉｎ−ＯＨの製造 ペプチドを０．１ミリモルの０．６６ｍモル／ｇ　Ｂｏ
ｃ−Ｇｌｎ−ＰＡＭ樹脂を使用して固相法で合成した。

　ＤＣＣ／）ＩＯＢＴ方法によって結合されたＨｏｅ−
Ｇｌｎの場合を除いて、２．０ｍモルのＮａ−Ｂｏｃ・
アミノＭ（ベブタイズインターナショナル）でダブルシ
ンメトリカル（二重対称）無水物カップリングを実行し
た。使用された側鎖保護はＡＳＩ）（Ｃｈｘ）、Ｃｙｓ
（ｐＭｅＢｚｌ　）、Ｇｌｕ（Ｂｚｌ）であった０合成
の完了後、Ｎａ−Ｂｏｃ保護を塩化メチレン中の５０％
トリフルオロ酢酸で除去した。樹脂を３回塩化メチレン
で洗浄し、塩化メチレン中の１０％ジイソプロピルエチ
ルアミンの３回の洗浄によって中和し、塩化メチレンで
３回洗浄し、塩化メチレン中のＮ−アセチルイミダゾー
ルでアセチル化し、塩化メチレンで３回洗浄し、真空で
乾燥した。

ペプチドを脱保護させ、そして樹脂から水及び少量の３
０％酢酸水溶液で開裂させた。抽出物を２１容量に水で
希釈し、ρ■を水酸化アンモニウムで８．５に調整した
。フェリシアン化カリウム（０，０１Ｎ）を黄色が持続
するまで溶液に加えた。溶液を３０分間攪拌し、次にｐ
Ｈを酢酸で４と５の間に調整した。

混合物を次に２時間バイオ−ラド　ＡＣ３−Ｘ４Ａイオ
ン交換樹脂と攪拌した。混合物を濾過し、ｗｉ液を凍結
乾燥した。

このペプチドを９２に２．６　ｃｍセファデックスＧ−
１５カラム上で５χ酢酸水溶液中に於て脱塩することに
より精製し、凍結乾燥した０分離用ＨＰＬＣをＣｌ８Ｖ
ｙｄａｃ　２１８ＴＰＩ０１０（２５０ｘ　１０ｖｗ）
カラム上で０．１％トリフルオロ酢酸水溶液中の２４％
アセトニトリルで５１７分において実施した。主要なピ
ークを集め、凍結乾燥し、２４ｍｇの所望生成物を残し
二量体を後の溶離ビークとして単離した（　１４．２Ｂ
）。均質性は）ＩＰＬＣ及びＴＬＣによって決定した。

　ＨＰＬＣＶｙｄａｃ　２１８ＴＰ５４　（２５０ｘ　
４．６ａ＋ａ＋）Ｃ１ｓカラム、２ｍｌ／分、　　ｔｏ
＝１．８分：０．Ｉ！）リフルオロ酢酸中の２５〜５０
％アセトニトリル線形勾配での溶離時間は１％／分（Ｈ
ＰＬＣ）において５．５分であった。　ＦＡＲ−ＭＳ：
　（Ｍ＋）Ｉ）＝１４１１．７±ｉｏ＋７１（計算＋４
１０）　、アミノ酸分析：（６ＮＨＣＩ加水分解；２４
時間、１０６℃）を表１に示す。

５７重量パーセントのペプチド含量であった。

表１ ”ａｌｌｏｌｌｅへの変喚は加水分解中定量なし。

出願人　メレルダウ　ファーマスーティ力ルズインコー
ボレーテッド

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式 ▲数式、化学式、表等があります▼１ のペプチド誘導体 〔式中Ｘは水素、１〜６個の炭素原子のアルキル基の１
   又は２個、２〜１０個の炭素原子のアシル基の１又は２
   個、カルボベンジロキシ又はｔ−ブチロキシカルボニル
   からなる群から選ばれるアミノ末端残基であり、 Ａ＿１は結合であるか、又は１〜５個の任意のアミノ酸
   残基を含むペプチド断片であり、 Ａ＿２はＰｈｅ、ＳｕｂＰｈｅ、β−（２−及び３−チ
   エニル）アラニン、β−（２−及び３−フラニル）アラ
   ニン、β−（２−、３−及び４−ピリジル）アラニン、
   β−（ベンゾチエニル−２−及び−３−イル）アラニン
   、β−（１−及び２−ナフチル）アラニン、Ｔｙｒ又は
   Ｔｒｐであり、 Ａ＿３はＧｌｕ又はＡｓｐであり、 Ａ＿４は任意のアミノ酸であり、 Ａ＿５はＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ又はＴｈｒで
   あり、Ａ＿７は任意のアミノ酸であり、 Ａ＿８はＧｌｕ又はＡｓｐであり、 Ａ＿１＿０はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＳＯ＿３Ｈ）、Ｔｒｐ、
   Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｎｉｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ及び
   Ｐｒｏから選ばれる親油性のアミノ酸であるか、又はそ
   れらの親油性のアミノ酸を少なくとも１つ含有している
   ジペプチドであり、Ａ＿１＿１は結合であるか、又は１
   〜５個の任意のアミノ酸の残基を含有しているペプチド
   の断片であり、ＶはＯＨ、（Ｃ＿１〜Ｃ＿６）アルコキ
   シ、アミノ、モノ又はジ（Ｃ＿１〜Ｃ＿４）アルキル置
   換アミノ又はベンジルアミノから選ばれるカルボキシ末
   端残基であり、Ｒ、Ｒ′、Ｒ＿１、及びＲ＿１′はそれ
   ぞれ水素又は（Ｃ＿１〜Ｃ＿４）アルキル基から選ばれ
   、 Ｂは−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、又は−Ｓ−Ａｌｋ＿３−Ｓ−
   から選ばれ、Ａｌｋ＿１、Ａｌｋ＿２、及びＡｌｋ＿３
   はそれぞれ（Ｃ＿１〜Ｃ＿８）メチレン又はエチレン基
   から選ばれ、 「Ｄ」及び「Ｌ」は示された炭素の立体化学がそれぞれ
   Ｄ−システイン及びＬ−システインに対応するものであ
   ることを示す〕。 ２、Ａ＿２がＰｈｅ、β−（２−又は３−チエニル）ア
   ラニン、又はＴｙｒである特許請求の範囲第１項に記載
   のペプチド誘導体。 ３、Ａ＿３がＧｌｕである特許請求の範囲第１項に記載
   のペプチド誘導体。 ４、Ａ＿４がＧｌｕである特許請求の範囲第１項に記載
   のペプチド誘導体。 ５、Ａ＿５がＩｌｅである特許請求の範囲第１項に記載
   のペプチド誘導体。 ６、Ａ＿７がＧｌｕ又はＡｌａである特許請求の範囲第
   １項に記載のペプチド誘導体。 ７、Ａ＿８がＧｌｕ又はＡｓｐである特許請求の範囲第
   １項に記載のペプチド誘導体。 ８、Ａ＿１＿０がＬｅｕである特許請求の範囲第１項に
   記載のペプチド誘導体。 ９、Ａ＿１＿１がＰｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ａｓｐ−Ｇ
   ｌｎである特許請求の範囲第１項に記載のペプチド誘導
   体。 １０、ＸがＨ、アセチル、又はサクシニルである特許請
   求の範囲第１項に記載のペプチド誘導体。 １１、ＹがＯＨ又はＮＨ＿２である特許請求の範囲第１
   項に記載のペプチド誘導体。 １２、Ｒ、Ｒ′、Ｒ＿１、Ｒ＿１′がそれぞれ水素であ
   る特許請求の範囲第１項に記載のペプチド誘導体。 １３、Ｂが−Ｓ−Ｓ−基である特許請求の範囲第１項に
   記載のペプチド誘導体。 １４、Ａｌｋ＿１及びＡｌｋ＿２がそれぞれ式−（ＣＨ
   ＿２）−のメチレン基である特許請求の範囲第１項に記
   載のペプチド誘導体。 １５、特許請求の範囲第１〜１４項に記載のペプチド誘
   導体の抗凝固有効量、及び製薬上受入れられる担体を含
   む、必要とする患者の血液凝固を減少させる薬剤。 １６、式 ▲数式、化学式、表等があります▼１ のペプチド誘導体 〔式中Ｘは水素、１〜６個の炭素原子のアルキル基の１
   又は２個、２〜１０個の炭素原子のアシル基の１又は２
   個、カルボベンジロキシ又はｔ−ブチロキシカルボニル
   からなる群から選ばれるアミノ末端残基であり、 Ａ＿１は結合であるか、又は１〜５個の任意のアミノ酸
   残基を含むペプチド断片であり、 Ａ＿２はＰｈｅ、ＳｕｂＰｈｅ、β−（２−及び３−チ
   エニル）アラニン、β−（２−及び３−フラニル）アラ
   ニン、β−（２−、３−及び４−ピリジル）アラニン、
   β−（ベンゾチエニル−２−及び−３−イル）アラニン
   、β−（１−及び２−ナフチル）アラニン、Ｔｙｒ又は
   Ｔｒｐであり、 Ａ＿３はＧｌｕ又はＡｓｐであり、 Ａ＿４は任意のアミノ酸であり、 Ａ＿５はＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ又はＴｈｒで
   あり、Ａ＿７は任意のアミノ酸であり、 Ａ＿８はＧｌｕ又はＡｓｐであり、 Ａ＿１＿０はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＳＯ＿３Ｈ）、Ｔｒｐ、
   Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ及び
   Ｐｒｏから選ばれる親油性のアミノ酸であるか、又はそ
   れらの親油性のアミノ酸を少なくとも１つ含有している
   ジペプチドであり、Ａ＿１＿１は結合であるか、又は１
   〜５個の任意のアミノ酸の残基を含有しているペプチド
   の断片であり、ＹはＯＨ（Ｃ＿１〜Ｃ＿６）アルコキシ
   、アミノ、モノ又はジ（Ｃ＿１〜Ｃ＿４）アルキル置換
   アミノ又はベンジルアミノから選ばれるカルボキシ末端
   残基であり、Ｒ、Ｒ′、Ｒ＿１、及びＲ＿１′はそれぞ
   れ水素又は（Ｃ＿１〜Ｃ＿４）アルキル基から選ばれ、 Ｂは−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、又は−Ｓ−Ａｌｋ＿３−Ｓ−
   から選ばれ、Ａｌｋ＿１、Ａｌｋ＿２、及びＡｌｋ＿３
   はそれぞれ（Ｃ＿１〜Ｃ＿８）メチレン又はエチレン基
   から選ばれ、 「Ｄ」及び「Ｌ」は示された炭素の立体化学がそれぞれ
   Ｄ−システイン及びＬ−システインに対応するものであ
   ることを示す〕を製造する方法に於いて固相のシーケン
   シャル又はブロック合成、遺伝子クローニング、又はこ
   れらの組合せにより遊離スルフヒドリル含有線状ペプチ
   ドを製造し、そして線状ペプチドを酸化カップリングに
   かけることからなる方法。 １７、式 ▲数式、化学式、表等があります▼１ のペプチド誘導体を製造する固相シーケンシャル又はブ
   ロック合成において 〔式中Ｘは水素、１〜６個の炭素原子のアルキル基の１
   又は２個、２〜１０個の炭素原子のアシル基の１又は２
   個、カルボベンジロキシ又はｔ−ブチロキシカルボニル
   からなる群から選ばれるアミノ末端残基であり、 Ａ＿１は結合であるか、又は１〜５個の任意のアミノ酸
   残基を含むペプチド断片であり、 Ａ＿２はＰｈｅ、ＳｕｂＰｈｅ、β−（２−及び３−チ
   エニル）アラニン、β−（２−及び３−フラニル）アラ
   ニン、β−（２−、３−及び４−ピリジル）アラニン、
   β−（ベンゾチエニル−２−及び−３−イル）アラニン
   、β−（１−及び２−ナフチル）アラニン、Ｔｙｒ又は
   Ｔｒｐであり、 Ａ＿３はＧｌｕ又はＡｓｐであり、 Ａ＿４は任意のアミノ酸であり、 Ａ＿５はＩｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ又はＴｈｒで
   あり、Ａ＿７は任意のアミノ酸であり、 Ａ＿８はＧｌｕ又はＡｓｐであり、 Ａ＿１＿０はＴｙｒ、Ｔｙｒ（ＳＯ＿３Ｈ）、Ｔｒｐ、
   Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｈｉｓ及び
   Ｐｒｏから選ばれる親油性のアミノ酸であるか、又はそ
   れらの親油性のアミノ酸を少なくとも１つ含有している
   ジペプチドであり、Ａ＿１＿１は結合であるか、又は１
   〜５個の任意のアミノ酸の残基を含有しているペプチド
   の断片であり、ＹはＯＨ、（Ｃ＿１〜Ｃ＿６）アルコキ
   シ、アミノ、モノ又はジ（Ｃ＿１〜Ｃ＿４）アルキル置
   換アミノ又はベンジルアミノから選ばれるカルボキシ末
   端残基であり、Ｒ、Ｒ′、Ｒ＿１及びＲ＿１′はそれぞ
   れ水素又は（Ｃ＿１〜Ｃ＿４）アルキル基から選ばれ、 Ｂは−Ｓ−、−Ｓ−Ｓ−、又は−Ｓ−Ａｌｋ＿３−Ｓ−
   から選ばれ、Ａｌｋ＿１、Ａｌｋ＿２、及びＡｌｋ＿３
   はそれぞれ（Ｃ＿１〜Ｃ＿８）メチレン又はエチレン基
   から選ばれ、 「Ｄ」及び「Ｌ」は示された炭素の立体化学がそれぞれ
   Ｄ−システイン及びＬ−システインに対応するものであ
   ることを示す〕を製造する方法に於いて、適当に保護さ
   れた式Ａ＿１アミノ酸を活性化樹脂支持体に結合させ、
   次にＡ＿２〜Ａ＿１＿１の他のアルファアミノ保護アミ
   ノ酸を生長するペプチド鎖の末端アミノ基に結合させる
   が、その生長しているペプチド鎖は、その間アミノ保護
   基を除去することによって露出させ、そして最後に線状
   ペプチドを酸化的カップリングにかけることからなる方
   法。