HU198512B - Process for producing peptide with anticoagulant effect and pharmaceutical composition comprising same - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás új ciklikus peptid előállítására, amely antikoaguláns hatással rendelkezik.

Az antikoaguláns szerek alkalmas terápiás hatóanyagok, például akut mélyvénás trombózis, tüdőembólia, akut artériás embólia, szívizom infarktus és elszórt éren belüli koaguláció gyógyszerészeti kezelésére. Az antikoaguláns szerek megelőző alkalmazása lehetővé teszí a reumatikus vagy ételmeszesedéses szívbetegségekben szenvedő betegek esetében az embólia visszatérésnek megakadályozását és megakadályozza sebészeti beavatkozások során bizonyos thrombus-embóHa kialakulását. Antikoagulánsok adagolása történik szívkoszorú verőér és agyérrendszeri betegségben szenvedők kezelése esetében is. Az artériás trombózis, különösen a szívizmot és az agyat ellátó artériák esetében az elhalozás egyik fő oka.

A hirudin egy 65 egységből álló polipeptid, amelyet pióca nyálmirigyébol izoláltak. Ez egy olyan antikoaguláns, amely thrombin specifikus inhibitor hatással rendelkezik. A hirudin ugyan igen-jó hatékonyságú, de a pióca nyálmirigyéből izolált anyag klinikai alkalmazása mennyiségénél fogva limitált. Ezen túlmenően az Izolált anyag drága és alkalmazását, mint minden ilyen méretű fehérje adagolását allergiás reakciók követik.

A szerzők felfedezték, hogy a hirudin egy specifikus részlete felelős, legalább részben antikoaguláns hatásáért. A részlet molekulát kémiai úton előállítottuk és ennek bizonyos ciklusos analógjairól kitűnt, hogy a thrombin felismerési helyére kötődnek, de nem kötődnek az ettől térben elkülönülő thromín enzimatikus hasítási helyére. A szintetikus peptidek kötődése tökéletesen meggátolja a ftbrinogén megkötődését a thrombin felismerési helyekre, ami előfeltétele a fibrin keletkezésének és a vérrög képződésének. A találmány szerinti eljárással előállított peptidek jelentős antikoaguláns aktivitással rendelkeznek és az a szokatlan jellemzőjük, hogy csak a thrombin felismerési helyhez kötődnek és nem kötődnek a thrombin enzimatikus hasítási helyéhez, lehetővé teszi egy tudományosan érdekes és terápiásán jelentősantikoaguláns gyógyítási eljárás megvalósítását.

A találmány tárgya eljárás új, (1) képletű. H-Glu-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-DCyÍOÍiT-Grü^ís-Leu-Gln-OH (1) pepiidnek szilárd fázisú szekvenciális vagy blokk szintézis eljárással történő előállítására.

A találmány szerinti eljárással előállított fenti vegyület antikoaguláns hatással rendelkezik.

A találmány szerinti eljárás leírásában az aminosavak rövidítésére az alábbi jelöléseket használjuk: Leu leucin

Ile - Izoleucin

Phe - fenil alanin

Glx - gluatminsav- vagy glutamin

Cys - cisztein

Gin — glutamin

Asp aszparginsav

Glu — glutaminsav

DCys - D-cisztein.

A fent említettek közül természetesen előforduló aminosavak a leucin, az izoleucin, a fenil alanin, a cisztein, a glutaminsav és a glutamin, lipofil aminosavak pedig a Phe, Leu és He mainosavak.

A természetesen előforduló aminosavak a glldn kivételével királis szénatomot tartalmaznak. Hacsak másképp nem jelezzük, a megadott optikailag aktív aminosavak alatt ezek Lkonfigurációját értjük. Mint a szakirodalomban ez szokásosan alkalmazott, a peptid szerkezetét úgy írtuk fel, hogy az amino terminális egység a lánc baloldalán és a karbocil terminális egység a jobb oldalán található.

A találmány szerinti eljárás során az (I) képletű peptidet szilárd fázisú szekvenciális szintézissel állítjuk elő. A szilárd fázis szekvenciális eljárást automata peptid szintetizátor alkalmazásával hajthatjuk végre. Ebben az esetben az a-amlnocsoporton védett aminosavat kötjük a gyanta hordozóhoz. Az alkalmazott gyanta hordozó lehet bármely polipeptid szilárd fázisú előállításban szokásosan alkalmazott gyanta, és előnyösen polisztírol, amely körülbelül 0.5-3% divinil-benzol keresztkötéseket tartalmaz, és amely vagy klórmetilezett vagy hidroximetilezett, amely funkciós csoportok alkalmasak a kezdetben bevezetett a-amlnocsoporton védett amlnosawal való észterkötés létrehozására.

Egy hidroxil-metil-gyantát írt le Bodanszky és csoportja Chem.Ind. (London), 38, 1597-98 (1966.) közleményében.

Egy klór metilezett gyanta kereskedelemben kapható, a Bio Rád Laboratories, Richmond, California terméke. A klór- metilezett gyanta előállítási eljárást közölték Stewart és mtsai. Solid Phase Peptide Synthesis (Freeman and Co., San Francisco 1969.), Chapter 1 ,pp.l-6 közleményükben. A védett aminosavat a gyantához Gisin, Hevl.Chim.Acta, 56, 1476 (1973) közleményében leírt eljárása szerint kapcsolhatjuk. Számos gyantához kötött védett aminosav kereskedelemben kapható.

Miután az α-amlnocsoporton védett aminosavat a gyanta hordozóhoz kötöttük, alkalmas eljárással, például diklórmetánban trifluor-ecetsavat alkalmazva, tiszta trifluor-ecetsavat alkalmazva, vagy dioxános sósavat alkalmazva, a védőcsoportot eltávolítjuk. A védőcsoport eltávolítását körülbelül 0 °C-szobahőmérséklet közötti hőmérsékleten végezzük. Más sepcíális α-aminosav védőcsoport eltávolításra alkalmas standard hasítási eljárások is alkalmazhatók. Miután a-aminocsoport védőcsoportot eltávolítottuk. a többi. aminocsoporton védett aminosav a kívánt sorrendben kapcsolható a molekulához. Más eljárás szerint több aminosavból álló fragmenseket állítunk elő oldatban kapcsolási eljárással, és ezt kapcsoljuk a gyantához kötött aminosav szekvenciához.

A polipeptid szekvenciába bevezetett egyes a-aminocsoporton védett aminosavak esetében az alkalmazott aminocsoport védőcsoport bármely ilyen, a szakirodalomban ismert védőcsoport lehet. Az alkalmazható α-amlnocsoport védőcsoportok az elábbiak lehetnek: (1) acil típusú védőcsoportok, mint például formilcsoport, trifluor-acetil-csoport, ftalil-csoport, toluol-szulfonil-csoport (tozilcsoport), benzilszulfonil-csoport, nltro-fenil-szulfenil-csoport, tritilszulfenil-csoport, o-nitro-fenoxl-acetil-csoport, és a-klór-butil-csoport, (2) aromás uretán típusú védőcsoportok, mint például benziloxi-karbonil-csoport, szubsztituált benziloxl-karbonil-csoportok, mint például p-klór-benziloxl-kaibonil-csoport, p-nitro-benziloxl-karbonil-csoport, p-bróm-benziloxi-karbonll-csoport, p-métoxl-benzil-oxl-karbonll-csoport, 1 -(p-bifenil)-1 -metil-etoxi-karbonll-csoport, α a-dimetil-3,5-dlmetoxi-benziloxi-karbonil-csoport, és benzhidriloxi-karbonll-cso-21 port, (3) alifás uretán típusú védőcsoportok, mint például t-butoxi-karbonil-csoport (Boc), diizopropil-metoxi-karboníl-csoport, izopropoxí-karbonil-csoport, etoxi-karbonil-csoport, és alliloxi-karbonil-csoport, (4) dkloalkil uretán típusú védőcsoportok, mint például ciklopentiloxi-karbonll-csoport, adamantiloxi-karbonil-csoport, és ciklohexiloxi-karbonil-csoport (Chx), (5) tiouretán típusú védőcsoportok, mint például feniltio-karbonil-csoport, (6) alkil típusú védőcsoportok, mint például trifenií-jnetil-csoport (tritil-csoport) és benzilcsoport, és (7) trialkil-szilil-csoportok, mint például trímetíl-szilíl-csoport. Az előnyösen alkalmazható α-aminocsoport védőcsoport a t-butoxi-karbonil-csoport.

A megfelelő kapcsoló reagens kiválasztása a szakember előtt ismert. Különösen alkalmas kapcsoló reagensek, amennyiben a kapcsolt aminosav Gin, az Ν,Ν -diizopropil-karbodiimid és az 1-hidroxi-benzotriazol. Ezeknek a reagenseknek az alkalmazásával elkerülhető a laktam és nitril melléktermékek keletkezése. Más kapcsoló reagensek: (1) a karbodiimidek (például az Ν,Ν’-diciklohexíl-karbodiimid és az N-etil-N -(7)-dimetil-amino)-propil-karbodiimid), (2) a ciánamidok (például az Ν,Ν-dibenzil-ciánamid), (3) a keténiminek, (4) az izoxazólium sók (például az N-etil-5-fenil-izoxazólium-3 -szulfonát), (5) monociklusos aromás jellegű nitrogén tartalmú vegyületek, amelyek 1—4 nitrogénatomot tartalmazhatnak, mint például Imidazolidek, pirazolidok, és 1,2,4-triazolidok. Például alkalmas heterociklusos amidokon az N,N -karbonil-diimidazol, és az N,N-karbonil-di-(l,2,4-triazot), (6) alkoxilezett acetilének (mint például etoxi-acetilén), (7) az aminosav karboxilcsoportjával vegyes anhidridet képző reagensek (mint például etil-klór-formiát, és izobutil-klór-formiát), vagy a kapcsolandó aminosav szimmetrikus anhidridjei (például Boc-AIa-O-Ala-Boc), és (8) nitrogéntartalmú heterociklusos vegyületek, amelyek a gyűrű nitrogénatomon hidroxilcsoportot tartalmaznak, mint az N-hidroxi-ftálinúd, az N-hidroxi-szukcinimid és az 1-hidroxi-benzotriazol. Más aktiváló peptid kapcsoló reagenseket írt le közleményében Kapoor, J.Pharm.Sci. 59. pp 1-27 (1970). Az előnyösen alkalmazható kapcsoló reagensek, az Arg, Asn és Gin aminosavak kivételével, a szimmetrikus anhidridek.

Valamennyi védett aminosavat vagy aminosav szekvenciát 4-5-szörös feleslegben visszük a szilárd fázisú reaktorba és a kapcsolást dimetil-formamid: diklórmetán (1:1) elegyben, vagy tiszta dimetil-formamidban, vagy előnyösen tiszta diklórmetánban hajtjuk végre. Amennyiben a kapcsolás nem teljesen történik meg, a kapcsolási eljárást megismételj ide mielőtt az a-amino-védőcsoportot eltávolítjuk és a következő aminosavat a szilárd fázisú reaktorba visszük. A kapcsolási reakció végbemenetelét a szintézis minden egyes lépésében ninhldrln tesztvizsgálattal ellenőrizzük, Kaiser és mtsai. által az Analyt Biochem., 34. 595 (1970) közleményében leírt eljárásnak megfelelően.

Miután a kívánt aminosav szekvenciát előállítottuk, a pepiidet eltávolítjuk a gyantáról. Ezt hidrolízis segítségével végezhetjük, és például a gyantához kötött polipeptidet dimetil-szulfld, p-krezol vagy tiokrezol híg vizes hidrogénfluoridos oldatával kezeljük.

Mint a szilárd fázisú szintézis szakirodalmában ismert számos aminosav olyan funkciós csoportokat tartalmaz, amelyeket a peptid lánc előállítása során védőcsoporttal kell ellátni. A megfelelő védőcsoport kiválasztása, alkalmazása, a szakember előtt ismert és a védőcsoporttal ellátandó aminosav minőségétől, valamint a pepiidben jelenlévő egyéb védőcsoporttal ellátott aminosavak minőségétől függ. Az ilyen oldalláncbani védőcsoportok megválasztása döntő befolyású, mert ezek olyanok kelllegyenek, amelyek nem hasadnak le az α-aminocsoport védőcsoportok eltávolítása során. Például alkalmas oldallánc funkciós csoport védőcsoportok a lizin esetében a benziloxi-karbonil-csoport és a szubsztituált benziloxi-karbonilcsoportok, ahol a szubsztituens lehet halogénatom (például klóratom, brómatom, fluoratom) és nitro csoport (például 2-klór-benzil-oxi-karbonil-csoport, pnitro-benziloxi-karbonil-csoport, 3,4-diklór-benziloxi-karbonil-csoport), a tozilcsoport, a t-amiloxi-karbonil-csoport, a t-butoxi-karbonil-csoport, és a diízopropil-metoxi-karbonil-csoport. A treonin és szerin alkoholos hidroxilcsoportja acetllcsoport, benozil-csoport, t-butil-csoport, tritil-csoport, benzilcsoport, 2,6-diklór-benzil-csoport, vagy benziloxí-karbonil-csoport védőcsoporttal védhető. Előnyösen alkalmazható védőcsoport a benzilcsoport.

Ezek a csoportok a szakirodalomban Ismert eljárásokkal távolíthatók el. Jellemzően a védőcsoport eltávolítást a teljes peptidlánc szintézisének befejezése után végezzük, de ezek bármely más megfelelő lépésben is eltávolíthatók.

A ciklikus peptideket általában a megfelelő lineáris származékból állítjuk elő a lineáris peptid szilárd fázisról való lehasítása után vagy ezt megelőzően. Az (1) képletű vegyületet, amely diszulfid-csoportot (-S-S-) tartamaz a megfelelő szabad tiolcsoportot tartalmazó lineráis pepiidből állíthatjuk elő ismert oxidatív kapcsolási eljárással, például a lineáris pepiidet káliumferricianiddal oxidálva, például Stewart és mtsai. Solid Phase Peptide Synthesis (Freeman and Co, San Francisco 1969), Chapter 1, p.95 közleményében leírt eljárása szerint.

A találmány szerinti eljárással előállított peptid antikiaguláns dózisa 0.2 mg/kg-250 mg/kg testtömeg nap, amely függ a kezelt betegtől és az alkalmazott pepiidtől. Az adott beteg esetében a szükséges dózist egyedileg kel! meghatározni. Előnyösen 1 M napi dózist adagolunk, jellemzően 5 mg-100 mg/dózis aktív hatóanyag alkalmazásával.

A jelzett antikoaguláns terápia számos trombózis megelőzésére alkalmas és különösen alkalmas a szívkoszoni verőér és agyi érrendszeri betegségek kezelésére. A szakember számára egyértelmű az ilyen jellegű betegségek kör, amelyek ilyen kezelést igényelnek. A beteg elnevezés alatt emlősöket, mint például főemlősöket, például embert, juhot, lovat, szarvasmarhát sertés, kutyát, macskát, patkányt és egereket értünk.

Általában a peptid stabil marad orálisan adagolva is, azonban a nem orális úton történő adagolás, például a szubkután, az intravénás, az intramuszkuláris vagy intraperitoneális adagolás alkalmazandó előnyösen, a tároló injekció, beültetett injekció, vagy nyálkamembránon keresztüli alkalmazás, mint például orr, torok és tüdő hörgőkön keresztüli alkalmazás előnyös, ami lehet például aeroszol formált alak, amely a találmány szerinti peptid származékot szpré, vagy száraz por formában tartalmazza.

Parenterális adagolás céljára a találmány szerinti

198.512 vegyület injektálható dózisokban oldat vagy szuszpenzió fómiában adagolható fiziológiásán elfogadható hígítóanyagba, gyógyszerészetileg elfogadható hordozó- 5 anyagokkal együtt, amelyek lehetnek steril folyadékok, mint például víz vagy olajok, és a formált alakban kívánt esetben más felületaktív anyagokat és más gyógyszerészetileg elfogadható adalékanyagokat is alkalmazhatunk. Alkalmazható olajok például ásványolaj, amely állati, növényi vagy szintetikus eredetű le- 1 θ hét, és lehet például földimogyoróolaj, szójaolaj, és ásáványi olaj. Folyékony hordozóanyagként különösen injektálható fomált alak esetében előnyösen víz fiziológiás sóoldat, dextróz oldat és hasonló cukoroldatok, etanol és glikolok, mint például propilén-gli- -jg kol vagy polietilén-gükol alklamazhatók.

A találmány szerinti vegyület mint tartalék injekció vagy mint beültetett készítmény adagolhatok és olyan formában készítendők, amely lehetővé teszi az aktív hatóanyag fenntartott kibocsátását. Az aktív hatóanyag labdacsokká vagy kis hengerekké préselhető 20 és szubkután vagy intramuszkulárisan beültethető, mint tartalék injekció vagy beültetett hatóanyag. A beültetett formált alakban inért anyagokat mint például biológiailag lebontható polimereket vagy szintetikus szilikonokat, például Silastlc-ot (egy szilikon gumi, amelyet a Dow-Corning Corporation állít elő) 25 alkalmazhatunk.

A találmány szerinti eljárást az alábbi példán részletesen bemutatjuk.

Példa _t___

H-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-DCys-Glu-Glu-Cys-Leu- 30

-Gln-OH előállítása

A pepiidet szilárd fázisú eljárással 0.1 mmól 0.66 mmó/g Boc-Gln-Pam gyanta alkalmazásával állítjuk elő. Kétszeres szimmetrikus anhidridet alkalmazó kapcsolást hatunk végre 2.0 mmól Na-Boc-aminosav (Peptides International) alkalmazásával, kivéve hogy a Boc-Gln esetében DCC/HOBT módszert alkalmazunk a kapcsolásra. Az oldalláncban alkalmazott védőcsoportok az alábbiak: Asp(Chx), Cys(pMeBzl), Glu(Bzl).

Miután a szintézis befejeződött a Na-Boc védőcsoportot 50%-os diklórmetános trifluor-ecetsav segítségével távolítjuk el. A gyantát háromszor diklórmetánnal mossuk, háromszoros 10%-os diizopropil-etíl-aminos diklórmetános oldattal történő mosással semlegesítjük, majd háromszor diklórmetánnal mossuk. Ezután N-acetil-imidazollal diklórmetánban acetilezzük, majd háromszor diklórmetánnal mossuk és vákuumban megszárítjuk.

A peptidet a gyantáról lehasítjuk és egyben a védőcsoportokat eltávolítjuk. Ezt a műveletet vízzel végezzük, amelynek pH értékét ammóniumhidroxiddal 8.5 értékre állítjuk be. Ezután káliumferricianidot adunk az oldathoz (0.01 n) amíg a sárga szín állandóvá nem válik. Az oldatot 30 percig keverjük, majd a pH értéket ecetsawal 4- 5 értékre állítjuk be. Ezután az elegyet Bio-Rad AG3-X4A ioncserélő gyantával keveijük 2 óráig. A keveréket leszűijük és a szürletet liofilizáljuk.

A peptidet 92x2.6 cm Sephadex G-15 oszlopon 5%-os ecetsavval történő átfolyatással sómentesítjük, majd liofilizáljuk. Ezután HPLC segítségével C¹* Vydac 21BTP1010 (250x10 mm) oszlopon, 0.1% vizes trifluorecetsavban készült acetonitril-eluens és 5 ml/ perc sebesség alkalmazásával tisztítjuk. A fő komponenst gyűjtjük és liofilizáljuk és így a kívánt terméket kapjuk. A termék homogenitását HPLC és VRK analízissel határozzuk meg. HPLC Vydac 21BTP54 (250 x4.6 mm) C^{l 1} oszlop, 2 ml/perc, t.'.=l .8 perc:eluációs idő 25 50% acetonitril tartalmú 0.1%-os trifluorecetsav alkalmazásával lineáris gradiens mellett, amely 1%/ perc. (HPLC) 5.5 perc.

FAB-MS: (M»H) — 1411.7 ± I mikron (számított 1.410). Aminosav analízis: (6n sósavas hidrolízis, 24 óra időtartamig, 106 °C hőmérsékleten), lásd az 1. táblázatot, 1.58 tÖmeg% peptid tartalom.

1. táblázat

Aminósav analízis (6n HG, hidrolízis: 24 óra, 1O6°C)

His	Asx Ser	Glx Pro Alá	Gly Ilex	Leu Tyr	Phe
—	1.00(1) -	5.05(5) -	0.95(1) 0.60(1)	1.00(1) -	1.02(1)

^xAz allo-Ile átalakulás a hidrolízis időtartama során nem teljes.

Claims (2)

1. Szabadalmi igénypontok

   1. Eljárás az (1) képletű |-j

   H-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-DCys-Glu-Glü-Cys-Leu-Gln-OH (1) peptid előállítására, azzal jellemezve , hogy a védett 1. aminosavat valamely aktivált gyanta hordozóhoz kapcsoljuk, majd a többi védett amino-savat a növekvő peptid lánc aminocsoport- 55 jához kapcsoljuk, a peptid láncról a védőcsoportokat és a gyantát eltávolítjuk, végezetül a lineáris peptidet oxidatív kapcsolási reakciónak vetjük alá.
2. 2. Eljárás antikoaguláns hatású gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy hatóanyagként az 1. igénypont szerinti eljárással előállított (1) képletű peptidet gyógyszerészetileg elfogadható hordozóanyaggal és kívánt esetben adalékanyaggal összekeverjük és gyógyszerkészítménnyé feldolgozzuk.