PT86600B

PT86600B - Processo para a preparacao de peptidos anticoagulantes

Info

Publication number: PT86600B
Application number: PT86600A
Authority: PT
Inventors: John Leonard Krstenansky; Simon Jen Tan Mao
Original assignee: Merrell Dow Pharma
Priority date: 1987-01-23
Filing date: 1988-01-22
Publication date: 1991-12-31
Also published as: FI89060B; ATE110743T1; NO880268D0; IE63547B1; DK31088A; HU199159B; AR245140A1; IE880167L; EP0276014A2; JP2709817B2; ES2063740T3; NO880268L; AU601801B2; JPS63215698A; DK173757B1; FI89060C; NZ223236A; IL85159A; CN88100260A; CA1341032C

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

I

Os anticoagulantes são agentes terapêuticos úteis no tratamento farmacológico de, por exemulo, trombose venosa profunda aguda, embolia pulmonar, embolia arterial aguda das extremidades, enfarte do miocárdio e coagulação intravascular disseminada. Crê-se que a administração profiláctica de anticoagulantes actue como preventivo no reaparecimento de embolia em pacientes com doença cardíaca reumática ou arteriosclerótica e evite determinadas complicações trombo-embólicas da cirur gia. A administração de anticoagulantes também tem sido indicada no tratamento de doença das artérias coronárias e doenças cerebrovasculares. A trombose arterial, particularmente nas ar terias que alimentam o músculo cardíaco e o cérebro é uma causa de morte.

hirudina é um polipéptido de resíduo 65 isolado a partir de glândulas salivares de sanguessugas. É um agente anticoagulante que é um inibidor específico datrombina. Apesar de ser consideravelmente potente, parece pouco -provável o uso clínico de hirudin isolado de extractos de sanguessugas devido à sua limitada disponibilidade, custo e reacções alérgicas que habitualmente se seguem à administração de qualquer proteína

-2L· estranha com esta dimensão.

Os requerentes descobriram uma região específica do hirudina que é responsável, pelo menos em parte, pela sua acti vidade anticoagulante. Sintetizou-se quimicamente esta região e alguns dos seus análogos parecem ligar-se ao local de reoonhe cimento da trombina mas não ao local de clivagem enzimática que está espacialmente separado. A ligação competitiva dos péptidos de síntese impede a ligação do fibrinogénio ao local de reconhe cimento da trombina, que é um requisito prévio para a produção de fibrina e formação de coágulo. Os péptidos da presente inven ção possuem uma actividade anticoagulante significativa e a sua capacidade pouco vulgar para se ligarem apenas ao local de reconhecimento sem se ligarem ao local de clivagem da trombina, pode considerar-se um auxiliar cientificamente interessante e terapeuticamente significativo na terapia anticoagulante.

RESUMO DA INVENÇÃO

Os derivados peptídicos de fórmula geral

na qual

X representa um resíduo de terminal amino seleccionado entre átomos de hidrogénio, um ou dois grupos alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, um ou dois grupos acilo de 2 a 10 átomos de carbono, carbo-benziloxi ou t-butiloxi-carbonilo;

A^ representa uma ligação ou representa um péptido que contêm de 1 a 5 resíduos de qualquer aminoáci do;

A₂ representa Phe, SubPhe, β-(2- e 3-tienil)alanina, (h-(2-e 3-furanil)alanina, p>-(2-, 3-, e 4-pi ridil)alanina,P-(benzotienil-2- e 3-il)al*nina, β-(1- e 2-naftil)alanina, Tyr ou Trp;

A^ representa Glu ou Asp;

A^ representa qualquer aminoácido;

A^ representa Ile, Vai, Leu, Nle, ou Phe;

Ag representa Pro, Hyp, 3,4-desidroPro, tiazolidina-4-carboxilato, Sar, NMePgl ou D-Ala;

Αγ representa qualquer aminoácido;

Ag representa qualquer aminoácido;

A^ representa um aminoácido lipofílico seleccionado entre Tyr, Tyr(SO^H), Trp, Phe, Leu, Nle, Ile, Vai, Cha e Pro ou é um dinéptido que contém, pelo menos, um destes aminoácidos lipofílicos;

Α^θ representa uma ligaçSo ou um fragmento de néptido que contém de um a cinco resíduos de qualquer aminoácido; e

Y representa um resíduo terminal carboxi seleccionado entre OH, alcoxi C^-Cg, amina, amino substi tuído por mono-ou dialquilo C-^-C^ ou benzilamino. sio úteis como agentes anticoagulantes.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Ao longo da presente memória, utilizaram-se as abreviaturas comuns dos aminoácidos, conforme se segue:

Gly - glicina

Ala - alanina

Vai - valina

Cha - ciclo-hexil-alanina

Orn - ornitina

Glt - glutãrilo

Mal - maleilo

Npa - -p’-(2-naftil)alanina

Leu - leucina

Ile - isoleucina

Pro - prolina

Phe - fenil-alanina

Trp - triptofano

Met - metionina

Ser - serina

Thr - treonina

Cys - cisteína

Tyr - tirosina

Asn - asparagina

Gin - glutamina

Asp - ácido aspártico

Glu - ácido glutâmico

Lys - lisina

Arg - arginina

His - histidina

Nle - norlencina

Hyp - hidroxi-rrolina

3,4-desidro Pro - 3,4-desidro-nrolina

Tyr(SO^H) - sulfato de tirosina

Pgl - fenilglicina

NMePgl - N-metil-fenil-glieina

Sar - sarcocina (N-metil-glicina) pSubPhe - fenil-alanina para substituída

-5/

SubPhe - fenil-alanina orto, meta, ou para, mono ou di-substituida

DAla - D-alanina

Ac - acetilo

Suc - succinilo pCIPhe - para-cloro-fenilalanina pNOgPhe - para-nitro-fenilalanina

Qualquer grupo alquilo e a porção alquilo de um grupo alcoxi inclui grupos alquilo de cadeia linear ou ramificada ou cíclicos, por exemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo, isobutilo, butilo terciário, pentilo, isopentilo, pentilo secundário, ciclopentilo, hexilo, iso-hexilo, cielohexilo e ciclopentilmetilo. Um grupo acilo de 2 a 10 átomos de carbono inclui grupos acilo de cadeia linear ou ramificados, cíclicos, saturados ou insaturados, que possuam 1 ou 2radicais carbonilo por grupo, por exemplo, acetilo, benzoílo, maleíco, glutamilo e succinilo. Um grupo halogéneo é um átomo de fluor, cloro_;bro mo ou iodo.

A expressão qualquer aminoácido”, conforme aqui se utiliza, inclui os aminoácidos naturais assim como outros o(-aminoácidos não-proteínas habitualmente utilizados pelos es pecialistas de química dos péptidos aquando da preparação de análogos de síntese de péptidos que ocorrem naturalmente. Os aminoácidos naturais stto a glicina, a alanina, a valina, a leu cina, a isoleucina, a serina, a metionina, a treonina, a fenilalanina, a tirosina, o triptofano, a cisteína, a prolina, a histidina, o ácido aspártico, a asparagina, o ácido glutâmico, a glutamina, a arginina, a ornitina e a lisina. Exemplos de χ-aminoácidos não proteínas são a norleucina, a norvalina, a

aloisoleucina, a homoarginina, tiarrolina, desidroprolina, hi droxiprolina (Hyp), homo-serina, ciclohexilglicina (Chg), ácido /-amino-n-butírico (Aba), oiclohexilalanina (Gha) ácido amino-fenil-butírioo (Pba) fenilalaninas substituídas nas posições orto, meta ou para do radical fenilo com um ou dois dos seguintes grupos: átomos de halogéneo ou alquilo (C-j-C^) alcoxi C-j-C^ ou grupos nitro ou substituídos com um grupo metilenodioxi, β-2- e 3-tienilalanina, -2- e3-furanilalanina, ^-2, 3-, e 4-piridilalanina, (5-(benzotienil-2 e 3-il)alanina, β-(1- e 2-naftil)-alanina, derivados O-alquilados de serina, treonina ou tirosina, S - cisteína alquilada, 0 - éster sulfato de tirosina, 3»5-di-iodotirosina e os isómeros D dos aminoácidos naturais. A expressão aminoácidos lipofílicos engloba Tyr, Phe, Leu, Nle, Vai, His e Pro.

Os aminoácidos naturais, com excenção da glicina, contém um átomo de carbono quirálico. A menos que se indique de outro modo, os aminoácidos or>ticamente activos aqui referidos, possuem configuração L. Por exemplo, qualquer dos aminoáci dos dos grupos A^ ou A₁₀ podem possuir configuração D ou L.

Como é hábito, a estrutura dos péptidos, escrita por extenso, e tal que a extremidade terminal amino está no lado esquerdo da cadeia e a extremidade terminal carboxi está no lado direito da cadeia.

Os polipéptidos de fórmula geral 1, podem formar sais farmacologioamente aceitáveis, com ácidos não tóxicos orgânicos ou inorgânicos. Exemplos de ácidos inorgânicos que formam sais apropriados englobam os ácidos clorídrico, bromidrico, sulfúrico e fosfórico e sais de ácidos metálicos tais como o mono-hidro geno ortofosfato de sódio e o hidrogeno sulfato de potássio.

-Ί-

Exemplos de ácidos orgânicos que formam sais adequados englobam os ácidos mono, di e tricarboxílicos. Exemplos de tais áci dos são, por exemplo, os ácidos acético, glicolico, láctico, pirúvico, malónico, succínico, glutárico, fumárico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, maleico, hidroximaleico, benzói co, hidroxibenzoico, fenilacético, cinâmico, salicílico, 2-fenoxi-benzóico e ácidos sulfónicos tais como o ácido metano-sul fónico e o ácido 2-hidroxi-etano-sulfónico. Os sais de radical ácido do terminal carboxi incluem os sais de ácido carboxílico não tóxico formados com quaisquer bases orgânicas ou inorgânicas apropriadas. A título de esclarecimento, estes sais englobam sais de metais alcalinos, como por exemplo, sódio e potássio; sais de metais alcalino-terrosos, tais como cálcio e magne sio; sais de metais leves do Grupo III A incluindo o alumínio; e aminas primárias, secundárias e terciárias, como por exemplo, trialquilaminas incluindo trietilamina, procaína, dibenzilamina, 1-etenamina, Ν-Ν’-dibenziletilenodiamina, di-hidro-abietil amina, N-alquil (inferior)-piperidina e outras aminas adequadas.

I)á-se preferência a alguns grupos, tal como sucede com alguns grupos dos compostos químicos. Os requerentes prefe rem os derivados peptídicos de fórmula geral 1 em que

Σ representa um átomo de hidrogénio, ou um grupo ace tilo ou succinilo

Também se dá preferência aos compostos de fórmula geral 1 em que

A^ é Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp; Thr-Pro-Asn-Pro-Glu-Ser-His-Asn-Asn-Gly-Asp;

-8Ser-Hi s-Asn-AspO-Gly-Asp. -His-Asn-Asp-Gly-Asp-,

-Asn-Asp-Gly-Asp-,

-Asp-Gly-Asp-,

-Gly-Asp-,

-Asp-, ou uma ligaçSo

A₂ representa de preferência Phe, (?-2- ou 3-tienil-alanina, Tyr, Trp Npa, ou pCIPhe;

Ag, Glu;

A^, Glu, Asp, Pro ou Ala;

A^, Ile, Leu

Ag, Pro, Sar, DAla, Hyp ou NMePgl;

Αγ, Glu, Asp ou Ala;

Ag, Glu Ala ou Asp;

A^, Pro,Ala-Tyr, Ala-Gha,Tyr-Gha, Tyr-Leu, Ala-Phe, Tyr-Tyr

A₁₀,Glu,Asn, Asp-Glu, Pro, Gin, Ala, uma monte, D-Lys,

Lys, D-Asp ou Orn

Da-se especial preferência aos derivados peptídioos de fórmula geral 1 em que ou X representa um grupo acetilo e

A^ representa Gly-Asp ou Asp ou X representa um grupo succinilo e A^ representa uma ligaçSo e em que

Ap, é Phe; |5-(2-tienil-alanina) ou Tyr;

Ag, Glu;

A^, Glu ou Pro;

A₅, Ile;

Ag, Pro;

Αγ, Glu;

Ag, Glu ou Asp;

^A9» Tyr-^Leu, Ala-Tyr, Tyr-Tyr, Ala-Phe, Ala-Cha, ou

-9L

Pro;

^A10’ ^Asp’ ^pro’ u®⁸· Ρ°^ηΐθ> Asp,-Glu, D-Asp, D-Lys ou D-Glu

Podem preparar-se as proteínas da presente invenção segundo diversos procedimentos conhecidos nelos especialistas na matéria. Tais procedimentos incluem a síntese sequencial de fase sólida e a síntese de bloqueio, clonagem genética e combi naçães destas técnicas. 0 procedimento sequencial de fase sóli da pode efectuar-se utilizando métodos automáticos estabelecidos, tal como a utilização de um sintetizador automático de péptidos. Neste procedimento, liga-se um aminoácido protegido no grupo ^-amino a um suporte de resina. 0 suporte de resina utilizado pode ser qualquer resina apropriada utilizada conven cionalmente na especialidade, para a preparação da fase sólida dos polipéptidos, de preferência poliestireno em que se efectuaram ligações reticulares com divinil benzeno numa quantidade compreendida entre 0,5 e 3 por cento, que tenha sido clorometilado ou hidroximetilado para proporcionar locais para a formação de éster com o aminoácido protegido no grupo (X-amino, inicialmente introduzido.

Bodanszky e outros, Chem. Ind (london)38, 1966; p. 1597-98, descreveram um exemplo de uma resina de hidroximetilo. Existe comercialmente disponível uma resina clorometilada dos Bio Rad laboratories, Richmond, Califórnia e a preparação de tal resina foi descrita por Stewart e outros, Solid Phase Peptide Syntesis (Freeman & Co., San Francisco 1969)» Capitulo 1, pp. 1-6. Podem ligar-se os aminoácidos protegidos à resina segundo o procedimento de Gisin, Helv.Chem. Acta,56., 1973; p· 1476. Existem comercialmente disponíveis muitos aminoácidos protegidos ligados a um suporte de resina. A título

de exemplo, para preparar um polipéptido da presente invenção em que a extremidade terminal carboxi é um resíduo de Thr, pode utilizar-se Thr protegida por butiloxicarbonilo terciário (BOC) ligada a uma resina de fenilacetamidometilo hidroximetilada benzilada (PAM), comercialmente disponível.

A seguir ao acoplamento do aminoácido protegido por ος-amine, à resina de suporte, elimina-se o grupo protector utilizando qualquer procedimento adequado, tal como utilizand· ácido trifluoro-acético em cloreto de metileno, ácido trifluoro-acético sozinho ou HG1 em dioxano. Efectua-se a desnrotecção a uma temperatura compreendida entre 0°C e a temperatura ambiente. Podem utilizar-se outros reagentes padrão de clivagem e outras condições para eliminar os grupos de protecção (X -amino. Após a eliminação do grupo de protecção^ -amino, acoplam-se passo a passo os outros aminoácidos protegidos por amino segundo a ordem desejada. Em alternativa, podem acoplar-se múltiplos grupos de aminoácidos segundo o método de soluÇSo antes de se efectuar o acoplamento com a sequência aminoáci da suportada pela resina.

grupo de protecção o{-amino utilizado com cada um dos aminoácidos introduzidos na sequência poliueptídica, pode ser qualquer dos grupos de protecção conhecidos na especialida de. De entre as classes dos grupos de protecção «X-amino contem plam-se (1) os grupos de protecção do tino acilo tais como: formilo, trifluoro-acetilo, ftalilo, tolueno-sulfonilo (tosil) benzeno-sulfonilo, nitrofenilsulfonilo, tritilsulfonilo, o-nitrofenóxiacetilo e X-clorobutirilo; (2) grupos de protecção do tipo uretanos aromáticos tais como benziloxicarbonilo e benziloxicarbonilo substituído tal como p-clorobenziloxicarbonilo, p-nitrobenzilcarbonilo, p-bromobenziloxicarbonilo, p-metoxiben

-11ziloxicarbonilo, l-(n-bifenil)-l-metiletoxicarbonilo, X,3-dimetil-3,5-dimetoxibenzil©xicarbonilo e benzidriloxicarbonilo, grupes de protecção do tipo uretana alifática tais como butiloxi-carbonilo terciário (BOC), di-isopro-pilmetoxicarbonilo, isopropilexicarbonilo, etoxicarbonilo e aliloxicarbonilo; (4) grupos de protecção de tipo uretano cicloalquílico tais como ciclopentiloxiaarbonilo, adamantiloxicarbonilo, e ciclohexiloxicarbonilo; (5) grupos de protecção do tipo tio-uretano tal como feniltiocarbonilo; (6) grupos de protecção de tipo alquilo tais como o trifenilmetilo (tritilo) e benzilo; e (7) grupoe trialquilsilano tal como o trimetilsilano. O grupo de protecção X-amino preferido é © butiloxicarbonilo terciário.

A escolha de um reagente de aconlamento apropriado é da competência do especialista. Um reagente de acoplamento especialmente apropriado em que o aminoácido a ser adi oionado é Glu, Asn ou Arg é * N,N’-di-isopropilcarbodi-imida e o l-hidroxibenzotriazol. A utilização destes reagentes evi ta a formação de nitrilos e de lactamas. Outros reagentes de acoplamento são (1) carbo-di-imidas (por exemplo, Ν,Ν'-diciclohexilcarbodi-imida e N-etil-N’-(^-dimetil-aminopropilcarbo di-imida); (2) cianamidas (por exemplo, N-N-dibenzilcianamida); (3) ceteniminas; (4) sais de isoxazólio (r>or exemplo, N-etil-5-fenilisoxazólio-3’-sulfonato);(5) amidas heterocíclicos de características aromáticas que contêm azoto monooíclico e que contêm um a 4 azotos no anel tal como os imidazolidas, pirazo lidas e 1,2,4-triazolidas. As amidas heterocíclicas específicas que são úteis englobam Ν,Ν’-carbonildi-imidazol e N,N-car bonil-di-l,2,4-triazol; (6) acetileno alcoxilado (por exemplo, etoxiacetileno); (7) reagentes que formam um anidrid© misto com o radical carboxilo do aminoácido (por exemplo etilclor· formato e isobutilcloroformato) ou o anidrido simétrico do aminoácido que será acoplado (por exemplo, Boc-Ala-O-Ala-Boc) e (8) compostos heterocíclicos que contêm azoto e que possuem um grupo hidroxi num anel com azoto (por exemplo, N-hidroxifta limida, N-hidroxi-succinimida e 1-hidroxibenzotriazol). Kapoor descreveu outros reagentes activadores e a sua utilização no acoplamento de péptidos no J.Pharm. Sei; 59; 1970; p 1-27. Os requerentes preferem utilizar o anidrido simétrico como um | reagente de acoplamento para todos os aminoácidos excepto Arg, Asn e Glu.

Introduz-se cada aminoácido protegido ou cada sequên cia de aminoácido num reactor de fase sólida com um excesso de cerca do quádruplo e efectua-se © acoplamento num meio de dimetilformamida: cloreto de metileno (1:1) ou em apenas dimetil formamida ou, de preferência, apenas em cloreto de metileno. Nos casos em que se verifica um acoplamento incompleto, repete-se o procedimento de acoplamento antes da eliminação do gru po de protecção de o(-amino, antes do acoplamento do aminoácido seguinte, no reactor de fase sólida, 0 êxito da reacção de acoplamento, em cada fase de síntese, controla-se por meio da reacção de ninidrina, conforme descrito por E. Kaiser e outros, Analyt. Biochem., 34, 1970, p. 595.

Quando se obtêm a sequência de aminoácido desejada, elimina-se o péptido da resina. Isto pode efectuar-se por hidrólise, pomo por exemplo, pelo tratamento do -nolinéptido ligado à resina como uma solução de sulfureto de dimetilo, p-cre sol e tiocresol em ácido fluorídrico em solução aquosa diluída

Conforme é conhecido pelos especialistas de síntese de fase sólida dos péptidos, muitos aminoácidos suportam funcionalidades que necessitam de protecção durante a preparação da cadeia. A utilização e a selecção do grupo de protecção adequado é da competência do especialista e dependerá do aminoácido a ser protegido e da presença no péptido de outros re síduos de aminoácidos protegidos. A selecção de um tal grupo de protecção de cadeia lateral é crítica pelo facto de ter de ser um grupo que não seja eliminado por clivagem durante a cli vagem do grupo de protecção do radical de íX-aniino. Por exemplo, grupos de protecção de cadeia lateral adequados para a lisina são o benziloxicarbonilo e o benziloxicarbonilo substituído, sendo e referido substituinte seleccionado entre átomos de halogéneo (por exemplo, cloro, bromo, fluor) e grupos nitro (por exemplo, 2-clorobenziloxicarbonilo , p-nitrobenziloxicarbonilo, 3,4-diclorobenziloxicarbonilo), tosilo, t-amiloxicarbonilo, t-butiloxicarbonilo e di-isopropilmetoxicarbonilo. 0 grupo alcoólico hidroxilo da treonina e da serina pode proteger-se com um grupo acetilo, benzoílo, butilo terciário, tritilo, ben zilo, 2,6-diclorobenzilo ou um grupo benziloxicarbonilo. 0 gru po de protecção preferido é o benzilo.

Podem eliminar-se estes grupos por procedimentos bem conhecidos pelos especialistas. Efectua-se, habitualmente, a eliminação do grupo de protecção depois da síntese da cadeia peptídica estar completa, mas, os grupos de protecção podem eliminar-se em qualquer outra altura apropriada.

A dose antiooagulante de um derivado peptídico da presente invenção varia entre 0,2 mg/kg e 250 mg/kg de peso do corpo do paciente, por dia, dependendo do paciente, da gravida

-14/ de da situação trombótica a ser tratada e do derivado peptídico seleccionado. A dose adequada para um paciente em particular pode determinar-se facilmente. Usualmente, administrar-se-ão de preferência, de 1 a 4 doses diárias com 5 mg a 100 mg do composto activo, por dose.

A terapia anticoagulante está indicada no tratamento de uma diversidade de situações trombóticas, especialmente, doenças das artérias coronárias e doença cerebrovascular. Os que possuem experiência neste campe reconhecem facilmente as situações em que é necessária uma terapêutica anti-coagulante. 0 termo paciente aqui utilizado diz respeito a mamíferos tais com© primatas, incluindo seres humanos, cabras, cavalos, gado, porcos, cães, gatos, ratazanas e ratos.

Apesar de alguns derivados peptídicos poderem resis tir à passagem através do intestino, após administração oral, os requerentes preferem a administração não oral, por exemplo, subcutânea, intravenosa, intramuscular ou intraperitoneal; a administração por injecções de acção prolongada; per implantação de preparações ou por aplicação nas membranas mucosas tais como a do nariz, garganta e brônquios, por exemplo, num recipiente para aerossol que contenha um derivado peptídico desta invenção na forma de um aerossol ou de um -nó seco.

Para administração parentérica podem administrar-se os compostos sob a forma de doses injectáveis de uma solução ou suspensão do composto num diluente fisiologicamente aceita vel, com um veículo farmacológico que pode ser um líquido estéril tal como água ou óleos com ou sem adição de um tensioae tivo ou. de outros adjuvantes farmacologicamente aceitáveis. Exemplos de óleos que podem utilizar-se nestas preparações são

-15c os oleos de petroleo, os de origem animal, vegetal ou de síntese, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de soja e óleo mine ral. A água, a solução salina, a solução aquosa de dextrose e soluções de açúcar afins, etanol e glicois tais como o propileno-glieol ou poli-etileno-glicol são, geralmente, os veículos líquidos preferidos, especialmente para soluções injectáveis.

Podem administrar-se os compostos sob a forma de in jeoções de acção prolongada ou de implantação de preparações | que podem ser formuladas de modo a permitir a libertação cons tante do ingrediente activo. Pode comprimir-se o ingrediente activo em grânulos ou pequenos cilindros e implantá-los subcu tânea ou intramuscularmente por meio de injecções de acção prolongada ou de implantações. Para implantação, deve utilizar-se materiais inertes tais como polímeros biodegradáveis ou silicones de síntese, por exemplo, Silastic e borracha de silicone produzida pela Dow-Corning Corporation.

Exemplos

Esta invenção é ilustrada pelos exemplos não limita tivos seguintes:

Exemplo I

Preparação de H-Gli-Asp-Phe-Glu-G-lu-Ile-Pro-G-lu-Glu-Tir-leu-Gln-OH

Sintetizou-se o péptido segundo os métodos de fase solida utilizando 0,1 mmole de resina Boc-Glu-PAM a 0,66 mmole/g. Efectuaram-se as ligações duplas de anidrido simétrico

-16L cem 2,0 mmole d© aminoácido Na-Boc (Peptides International) except© no caso de Boc-Gln em que se efectuou o acoplamento pelo método DGC/HOBT. A cadeia lateral de protecçSo que se utilizou foi: Asp(Chx), Glu (Bzl), Tyr(2-BrZ). Após ter-se realizado a síntese, eliminou-se a protecção Na-Boc cem acide trifluoroacético a 50% em clorete de metileno. Lavou-se três vezes a resina com cloreto de metileno, neutralizou-se com três lavagens de di-isopropiletilenamina a 10% em cloreto de metileno, lavou-se três vezes com cloreto de metileno e secou-se no vácuo. Desprotegeu-se e clivou-se o péptido no seio de resina com anisol a 2% contendo HF, a 0°C durante 35 minutos. Eliminou-se OHF no vácuo a 0°G, efectuou-se a precipitação do pe^zptido com éter etílico, extraíu-se no seio de resina com ácido acético aquoso a 30% e liofilizou-se.

Purificou-se o péptido por dessalinização numa coluna Sephadex G15 de 92x2,6 cm em ácido acético aquoso a 5% e liofilizou-se.

R Efectuou-se uma HPLC preparativa numa coluna C

Vydac 218TP1010 (250x10 mm) com acetonitrilo a 24% em ácido trifluoroacético aquoso a 0,1% à velocidade de 5 ml/minute. Recolheu-se o pico máximo e liofilizou-se proporcionando 101 mg do produto desejado (58% de rendimento com base na substituição da resina inicial). Determinou-se a homogeneidade por meio de HPLC e TLC. Utilizou-se uma coluna de HPLC Vydac C (250 x 4,6 mm), a uma velocidade de 2 ml/minuto, to = 1,9 minutos; o tempo de eluição, com acetonitrilo variando entre 15 e 40% em gradiente linear de ácido trifluoroacético a 0,1%, a 1%/minuto (HPCL) é de 14,4 minutos.

(

Cromatografia em camada fina (CCF): f60 placas de gel de sílica Merck 5715 20 x 20 cm (0,25 mm de espessura)_7 n-butanol/ /ácido acético/água/piridieno (6:1,2 : 4,8 : 6) (CCF I) Rf = = 0,42; isopronanol/hidroxido de amónia conc/água (3:1:1) (CCF II) Rf = 0,32; n-butanol/ácido acétieo/água (4:5:5) (CCF III) Rf = 0,70. FAB-MS: (M+H)-1468,4- ¹ T (°^alculad® 1468,6). Análise do aminoácido: (hidrólise HC1 6N; 24 horas a 106*C).

Asx 1,03 (1); Glx 5,05 (5); Pro 1,03 (1); Gly 1,00 (1); Ile 0,97 (1); Leu 1,01 (1); Tyr 0,93 (1)*, Phe 0,98 (1); NH^ 1,06 (1), ¢.280 = 1254» Teor de péptido de 85% em peso.

Os péptidos dos exemplos 2-32 seguintes rreparam-se segundo o mesmo processo.

Exemplo 2

Ao-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-GluGlu-Tyr-Leu-Gln-OH

Exemplo 3

H-Asn-Asp-Gly-Asp-Phe-Glu-Glu-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH

Claims

Reivindicações

1Processo para a preparação de um derivado de péptido de fórmula geral

X-A₁-A₂-A₃-A₄-A₅-A_g-A₇-A₈-A_g-A₁θ-Υ na qual X representa um átomo de hidrogénio, um ou dois grupos alquilo com 1 a 6 átomos de carbono, ou um ou dois grupos acilo com 2 a 10 átomos de carbono;

representa uma ligação ou um fragmento de péptido que contém entre um e onze resíduos de qualquer amino-ácido;

A₂ representa Phe, SubPhe, B-(2- e 3-tienil)-alanina, B-(2- e 3-furanil)-alanina, B-(2-, 3- e 4—piridil)-alanina, B-(benzo-tienil-2- e 3—il)-alanina, B—(1 — e 2-naftil)-alanina, Tyr ou Trp;

Ag representa Glu ou Asp;

A₄ representa qualquer amino-ácido;

Ag representa Ile, Vai, Leu, Nle ou Phe;

Ag representa Pro, Hyp, 3,4-de-hidro-Pro, tiazolidina-4-carboxilato, Sar, NMePgl ou D-Ala;

Αγ representa qualquer amino-ácido;

Αθ representa qualquer amino-ácido;

A_g representa um amino-ácido lipofílico escolhido entre Tyr, Trp, Phe, Leu, Nle, Ile, Vai, Cha e Pro ou representa um dipéptido que contém pelo menos um destes amino-ãcidos lipofílicos;

representa uma ligaçao ou um fragmento de péptido que contêm entre um e cinco resíduos de qualquer amino-ácido; e

Y representa um resíduo carboxi terminal escolhido entre os radicais OH, alcoxi(C^-Cg), amino, mono- ou di-alquil (C^-C^ -amino substituído, caracterizado por se sintetizar o referido péptido por métodos de fase sólida utilizando 0,1 mmole de uma resina Boc-Glu-PAM na concentração de 0,66 mmole/g, por se efectuarem as ligações duplas simétricas de anidrido com 2,0 mmoles de Nx-Boc-amino-ãcido e, completada a síntese, por se remover a protecção de Nx-Boc com ácido trifluoro-acético a 50% em cloreto de metileno.
2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Ag representar Phe, B-(2- ou 3
3. - Processo de acordo com a por A^ representar Glu.
4. - Processo de acordo com a por A^ representar Glu, Ala ou Pro
5. - Processo de acordo com a por Α^ representar Ile.
6. - Processo de acordo com a por Αθ representar Pro.
7. - Processo de acordo com a por Αγ representar Glu ou Ala.
8. - Processo de acordo com a por Αθ representar Glu ou Asp.
9. - Processo de acordo com a tienil)-alanina ou Tyr.

reivindicação 1, caracterizado reivindicação 1, caracterizado reivindicação 1, caracterizado reivindicação 1, caracterizado reivindicação 1, caracterizado reivindicação 1, caracterizado reivindicação 1, caracterizado por Α^ representar Tyr-Leu, Ala-Tyr ou Ala-Cha.
10. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por θ representar Gin, Asp, Pro, uma ligação, Asn, Asp-Glu, Glu, Ala, D-Lys, Lys, D-Asp, D-Glu ou Orn.
11. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por X representar H, acetilo ou succinilo.
12. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Y representar OH ou NH₂.
13. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por A^ representar

-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp,

Asn-Asp-Gly-Asp,

Asp-Gly-Asp,

Gly-Asp,

Asp ou uma ligação.
14. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por A^ representar

Thr-Pro-Lys-Pro-Gln-Ser-His-Asn-Asp-Gly-Asp.
15. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por A^ representar

Thr-Pro-Asn-Pro-Glu-Ser-His-Asn-Asn-Gly-Asp.
16.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por X representar um átomo de hidrogénio,

A₁ representar -Gly-Asp-,

A₂ representar Phe,

A3 representar Glu,

A4 representar Glu, ^A9 ^A7 ^A8 ^A5 ^A6

representar He, representar Pro, representar Glu, representar Glu, representar Tyr-Leu

f

Α^θ representar Gin e

Y representar OH.

17.- Processo de acordo com a reivindicação ΐ, caracterizado por por

X representar Suc, ^A1 representar uma ligação, ^A2 representar Phe, ^A3 representar Gly, ^A4 representar Glu, ^A5 representar Ile, ^A6 representar Pro, ^A7 representar Glu, ^A8 representar Glu, ^A9 representar Tyr-Leu, % representar Gin e Y representar OH. 18. - Processo de acordo com a reivindicação 1 X representar um átomo de hidrogénio ^A1 representar Gly-Asp, ^a2 representar Phe, ^A3 representar Glu,

, caracterizado

HP “‘22-

representar Pro, representar Ile, representar Pro, representar Glu, representar Asp, representar Ala-Tyr

representar Asp-Glu e representar

Processo acordo comreivindicação 1, caracterizado

representar Suc, representar uma ligação representar Phe, representar Glu, representar Pro, representar Ile, representar Pro, representar Glu, representar Glu, representar Tyr-Leu,

z representar Pro representar

Processo

-Tyr-Leu-Gln-OH.

21.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter um péptido de fórmula Suc-Phe-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Tyr-Leu-Gln-OH.
22. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter um péptido de fórmula Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Phe-D-Lys-NI^.
23. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter um péptido de fórmula Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Tyr-Lys-NI^.
24. - Processo de acordo com. a reivindicação 1, caracterizado por se obter um péptido de fórmula Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-Lys-NH₂.
25. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter um péptido de fórmula Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-Lys-NH2.
26. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter um péptido de fórmula Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Phe-Glu-OH.
27. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter um péptido de fórmula Suc-Tyr-Glu-Pro-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Phe-Gln-OH.
28. - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se obter um péptido de fórmula Suc-Tyr-Glu-Por-Ile-Pro-Glu-Glu-Ala-Cha-Asp-OH.