PT86191B - Processo de preparacao controlada de glucosaminoglicanos de baixo peso molecular e de composicoes farmaceuticas - Google Patents

Processo de preparacao controlada de glucosaminoglicanos de baixo peso molecular e de composicoes farmaceuticas Download PDF

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Description

Processo de preparação controlada de glucosaminoglicanos de baixo peso molecular através do tratamento de glucosaminoglicanos de alto peso molecular convencionais no es. tado sólido ou em solução, com um feixe rectilíneo de raios gama em doses de 2,5 a 2C Mrad, fornecidos em passos sucessivos de irradiação com intervalos de arrefecimento entre um passo de irradiação e o seguinte, na fase dinâmica.
A mistura obtida é submetida a fraccionamento, purificação, neutralização e liofilização. Cs glucosaminoglicanos obtidos têm um peso molecular entre 1CCG e 35CCG daltons e são usados na preparação de composições farmacêuticas com actividade antitrombótica, fibrinolítica, antiatero génica e de activação do cofactor II da heparina,
967
Ref: MED. 11
-2MEMÓRIA DESCRITIVA
Este invento refere-se a um processo de preparação controlada de glucosaminoglicanos de baixo peso molecular e de composições farmacêuticas correspondentes.
referido processo é especificamente baseado no tra tamento da glucosaminoglicanos convencionais com raios gama em doses adequadas, de fornia a obter glucosaminoglicanos de peso molecular controlado, de preferência entre 100C e 35000 daltons.
processo de acordo com o invento é aplicável a glu cosaminoglicanos em geral, e em particular a heparina, hep_a rina de fluxo lento, heparina de fluxo rápido, sulfato de heparano, sulfato de dermatano, condroitina-4-sulfato, condroitina-6-sulfato, sulfato de queratano, ácido hialurónico, ácido algínico e mesoglicano, isoladamente ou em misturas dos vários compostos.
Sabe-se que as heparinas convencionais são agentes antitrombóticos eficazes, mas o seu uso é limitado devido a um nível de complicações hemorrágicas relativamente alto.
Por esta razão, a atenção científica e clínica tem sido dirigida nos últimos anos para o estudo de formas particulares de heparinas dispolimerizadas, as quais têm revelado possuir, na investigação farmacológica, características antitrombóticas e fibrinolíticas interessantes associadas a um baixo poder hemorrágico, como descrito por exemplo em J. F., Cade, Thrombosis Research, 613-625 (1984).
No que diz respeito aos outros glucosaminoglicanos, a redução do peso molecular altera a absorção oral e melhora a actividade farmacológica.
Um grande número de patentes e publicações descreve processos de preparação de heparinas de baixo peso molecular.
Estes processos baseiam-se no tratamento químico ou enzimático de heparinas convencionais.
tratamento químico inclui por exemplo o tratamento
967
Ref: NED. 11 —3com oxidantes como peréxido de hidrogénio, ácido nítroso, peréxido de sódio e permanganato de potássio, ou com deriva dos da piridina; ou alternativamente a desesterificação e reesterificação, desaminação e reanimação, e sulfuração.
Este tratamento está descrito por exemplo na USP 4500519; USP 4351938 e patente francesa 2538404,
No tratamento enrimático, foram usadas várias encimas purificadas (heparinase) ou não purificadas (extractos pancreáticos), como se descreve por exemplo na USP 3766167,
Cs processos de dispolimerização da heparina conheci, dos têm como problema a impossibilidade de controlo da divi são molecular de modo a manter as estruturas activas. Assim estes processos conduzem à formação de uma série não reprodutível de derivados que têm de ser separados por purificação e fraccionamento sucessivos, de acordo com os pesos moleculares de interesse terapêutico,
A técnica anterior descreve também o tratamento de heparina com raios gama, por exemplo em Chawla e Hayward (Pharmacology 2C, 224, 198C) e Edwards (Carbohyd, Polymers 5,473,1985).
Este tratamento inclui a produção de membranas de he parina com acetato de Ν,Ν-dietilaminoetilcelulose e a esterilização das soluções de heparina. As conclusões destes trabalhos reivindicam um baixo nível de divisão molecular e uma perda mínima de actividade anticoagulante.
Surpreendentemente, descobrimos que tratando os glucosamincglicanos com raios gama pelo processo de acordo com o invento, as alterações de peso molecular dos glucosaminoglicanos pretendidas são obtidas,mantendo embora suficiente estabilidade nas estruturas activas sulfatadas, isto é, são obtidos agregados moleculares específicos de glucosaminogli canos caracterizados pela presença de grupos com uma alta actividade antitrombótica, uma actividade anticoagulante re duzida, um efeito hemorrágico baixo e uma actividade de agregação plaguetária baixa.
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Ref: NED. 11
,. <* -4Ma prática, estas características são determinadas pela redução do peso molecular e pela preservação dos grupos funcionais, activos em relação à antitrombina III e ao cofactor II.
processo de preparação controlada de glucosaminoglicanos de baixo neso molecular de acordo com o presente invento é caracterizado pelo tratamento de glucosaminoglicanos convencionais de alto peso molecular, no estado sóli do ou em solução, com um feixe rectilíneo de raios gama em doses entre 2,5 Mrad e 20 Mrad, fornecidos em etapas suces sivas de irradiação, com intervalos de arrefecimento entre uma etapa de irradiação e a seguinte, sujeitando então a solução obtida a fraccionamento químico de maneira a elirrà nar as fracções de alto peso molecular, purificando a frac ção base desejada por osmose inversa, fraccionando ainda a solução purificada através de uma coluna de resina Sephacryl, transferindo as fracções obtidas para resinas catiónicas, neutralizando-as com soluções alcalinas e liofilizando-as.
Estas e outras características e vantagens do processo de acordo com o presente invento serão mais evidentes a partir da descrição detalhada apresentada seguidamen te, relativo às concretizações preferidas do processo e da da a título de exemplo não limitativo.
C processo de acordo com a invenção pode utilizar heparinas produzidas industrialmente possuindo características estruturais variáveis com uma actividade anticoagulante variando entre ICO U/mg e 25o U/mg USP. Esta diferen ça de actividade anticoagulante é uma função da pureza e integridade molecular e depende das operações utilizadas na separação dos glucosaminoglicancs da matriz proteica e dos métodos de remoção dos componentes contaminantes.
Mo que diz respeito aos outros glucosaminoglicanos, podem ser usados compostos com características físicas e químicas normais, por exemplo, dermatano de Ρ. M'. 24COC-3 5000 dal tons e heparano de Ρ. M. 13COC-16OOO daltons.
967
Ref: NED. 11 ''..X ·!>?»—«si* *- 4í -r
-5Estas matérias primas podem ser usadas no estado só lido na forma de pó, ou como soluções aquosas, eventualmen te tamponadas a pH 2-8 de maneira a que, quando necessário, se evite a formação de um meio ácido que interfira no arranjo estrutural da molécula.
As concentrações da matéria prima em solução situam -se entre 1% e 30% (p/v) consoante o tipo de produto usado.
Antes do tratamento, as soluções são desarejadas e purgadas com azoto puro de forma a eliminar o ar residual.
C tratamento com raios gama é conduzido em recipien tes de vidro pyrex para evitar a característica mudança de cor, para acastanhada ou castanha, que teria lugar durante o tratamento com o vidro comercial vulgar.
Podem usar-se vários radionuclíd.eos como fonte de
6c 241 137 226 raios gama, como o Co ', Am , Cs e Ra . usa-se prefe ζς rencialmente o Co L, que emite raios de alta energia (1,25 MeV) de trajectória rectilínea. Estes raios são de alta fre quência, monocromáticos e não induzem fenómenos de radioactivação nos compostos sujeitos à sua acção.
Cs raios gama são aplicados numa sucessão de tratamentos parciais a doses de 2-3 Nrad com vários intervalos entre o fim de um tratamento e o inicio do seguinte, de modo a obter uma dose total de irradiação de 2,5 a 20 Erad, fornecidos na fase estática ou preferencialmente na fase di. nâmica.
A razão do intervalo entre um tratamento e o seguinte é evitar que o sistema sobreaqueça, o que conduziria a alterações indesejáveis nas características químicas e físi. cas do produto. C processo é consequentemente conduzido a uma temperatura entre 20 e 55°C e preferencialmente entre 2C e 40°C.
No final do tratamento de irradiação, as soluções são sujeitas a fraccionamento químico de modo a eliminar as fracçÕes de alto peso molecular. Esta operação é conduzida em soluções diluídas em âgua a 2-5% (p/v), por tratamento
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Ref: MED. 11
-6com solventes como o metanol, etanol ou acetona numa quanti dade de 10-30% (v/v) relativamente à solução. As fracções precipitadas são separadas por decantação e o líquido decan tado é alimentado com mais solvente de modo a recuperar a fracção base desejada.
precipitado base, depois de dissolvido em água, é purificado por osmose inversa até à remoção total das fracções de baixo peso molecular, inferiores a 500, e dos compo nentes salinos.
A solução purificada 4 posteriormente fraccionada através de colunas Sephacryl S.2C0 ou Sephadex 50 na presença de salinidade cuja concentração varia de acordo com o glucosaminoglicano em questão.
Às fracções activas recolhidas após esta passagem através da resina são finalmente despirogenadas, filtradas em condições de esterilidade e liofilizadas.
Alternativamente, as fracções activas recolhidas após esta passagem através da resina podem ser transferidas para resinas catiónicas Castel C/3CC ou C/2C e depois neutralizadas com soluções alcalinas de Na, Ca, K, Mg, ou Li de modo a converter os glucosaminoglicanos nos sais correspondentes .
As soluções obtidas são purificadas por osmose inver sa com eliminação dos compostos de peso molecular inferior a 500, de modo a eliminar os elementos alcalinos em excesso.
As fracções recolhidas, são fina-lmente despirogenadas filtradas em condições de esterilidade e liofilizadas.
Operando sob as condições descritas, formam-se, com boa reprodutibilidade fracções moleculares de glucosaminoglicanos que possuem uma actividade farmacológica bem definida .
Em particular, operando sob as condições descritas, o grau de despolimerização aumenenta em função do aumento da dose de raios gama administrada, e correspondentemente obtém-se uma redução da actividade anticoagulante juntamen/7
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Ref: MED. 11
-7te com um aumento da razão anti-Xa/APTT, isto é, a razão tempo de tromboplastina parei.
entre a actividade anti-Xa e almente activa
Os resultados obtidos quando se opera nas condiçdes
descritas sobre heparinas de valores iniciais de U/mg USP
variados, são apresentados como ilustração nas tabelas 1,
2 e 3 seguintes
TABELA . 1 - ACTIVIDADE ANTICCAGULaNTE Ε1 Ί USP
Mrad 0 2,5 5 7,5 10 12,5 15 17,5
HP 1 160 14 5 130 94 80 75 65 55
HP 2 167 136 120 88 75 64 53 47
HP 3 156 130 120 103 78 63 53 42
TABELA 2 -PESOS MOLECULARES (valores x 1C3)
Mrad C 2,5 5 7,5 10 12,5 15 17,5
HP 1 15 13,6 12,1 11 9,1 7,5 7,3 6,6
HP 2 15, 6 14,3 12,7 10,9 8,5 7,3 6,6 5,7
HP 3 15, 2 14 12,3 10,9 8,1 7,7 6,6 5,1
TABELA 3 - ACTIVIDADE BICLCGICA das fracçces
PURIFICaDAS, TRATADaS CCM 17 ,5 Mrad
APTT anti-Xa Razão
HP 1 12 108 9
HP 2 13 98,8 7,6
HP 3 15 120 8
ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS RESULTADOS
A figura 1 apresenta os valores relativos à variação da actividade (USP) das heparinas com a irradiação em Megarads.
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Ref: MED. 11
-8A função matemática significante adequada à interpolação da correlação entre estes parâmetros é uma linha recta, com um coeficiente de correlação de significância P.COl (linearidade excelente).
A figura 2 mostra os valores relativos à variação do peso molecular com a irradiação em Megarads.
A função matemática mais adequada à interpolação da correlação é uma linha recta com coeficiente de correlação R da significância P.COl (linearidade excelente).
A acção das heparinas despolimerizadas com raios gama de acordo com o invento foi avaliada através do tempo de hemorragia por confronto com o das heparinas convencionais.
Cs testes foram realizados seguindo o método descrito por Dejana et al. £ Thromb. Haemostasis (1982) 48,108/7 em ratazanas anestesiadas às quais se cortaram 2 mm da ponta da cauda.
Mediu-se o tempo que decorria até que a cauda deixa_s se de sangrar (sem que voltasse a sangrar nos 30 segundos imediatos).
as heparinas foram administradas 15 minutos antes do corte na cauda.
Cs resultados são apresentados na tabela 4.
TABELA 4 (MINUTCS)
HEPARINA
CCMTRCLC
0,25 mg/Kg8
0,5 mg/Km12 mg/Kg2 5
7,5
CONTROLO
No. de animais por dose = 10
Foram obtidos resultados análogos aos apresentados, aplicando a despolimerização e purificação descritas a soluçSes de vários glucosaminoglicanos tais como sulfato de
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Ref: MSD. 11
-9heparano, sulfato de dermatano condroitina-4-sulfato, condroitina-6-sulfato, ácido hialurónico e ácido algínico.
No caso do sulfato de dermatano, extensão da despolimerização em função da irradiação em Nrad, confirma a va lidade do sistema.
a Tabela 5 mostra os pesos moleculares obtidos para intensidades de irradiação diferentes.
TABELA 5 - SULFATO D3 DRRNATaNC DESPOLINERIZADC
2'rad__0______2,5_____5___7,5 1C 12,5 15
P.M. (x 1000) 31,2 24,8 18 12 10,4 3,5 5
A Figura 3 mostra a função estatisticamente represen tativa relativa à relação entre P. F. e yrads como sendo uma linha recta com um coeficiente de correlação R de signi ficância P.0C1.
Isto constitui um sinal evidente de boa linearidade entre a redução do peso molecular e a irradiação em Mrad.
A despolimerização dos glucosaminoglicanos, incluindo a heparina, pode ser levada a cabo tratando com raios g_a ma a matéria prima no seu estado sólido na forma de pó, de modo a obter produtos despolimerizados com o peso molecular pretendido.
Cs glucosaminoglicanos despolimerizados de acordo com o presente invento, tendo um peso molecular de 1CCC a 35CCC daltons e na forma de sais de Na, Ca, K, Fg ou Li, quer sózinhos quer em associação com outros produtos, são úteis na prevenção do tratamento de tromboses incluindo patologias oculares. São também úteis como agentes fibrinolíticos, antiinflamatórios, anticomplemento e antiaterogénicos e como activadores do cofactor II da heparina.
Os referidos glucosaminoglicanos são usados terapêuticamente como componentes de composições farmacêuticas na preparação de comprimidos, cápsulas, gotas, soluções para administração oral, colírios, supositórios, pomadas, formas
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Ref: MED. 11
-10para injecção intravenosa intradérmica e intramuscular e de preparações especiais para absorção intradérmica com libertação controlada.
Os exemplos seguintes são dados como ilustrações não limitativas da preparação de glucosaminoglicanos de acordo com o presente invento.
EXEMPLO 1
Dissolvem-se 16 g de heparina de sódio da mucosa intestinal possuindo 17o U/mg USP e um peso molecular de 14C0C daltons numa quantidade suficiente de solução tampão de fosfato de pH 7 para obter um volume total de 100 ml.
A solução é transvazada para um recipiente de vidro pyrex de 15c ml, desarejada sob vácuo e purgada com azoto puro.
recipiente é fechado hermeticamente e sujeito a tra tamentos sucessivos de 2,5 Mrad até um total de 17,5 Mrad, por exposição a raios gama emitidos pelo nuclrdeo radioactivo Cobalto^0.
Depois da irradiação, a solução, é diluída a 5% com água destilada e lentamente tratada com 15 ml de etanol sob agitação enérgica. Depois de uma ncite a +5°c, o líquido sobrenadante é decantado e clarificado por filtração. Sendo adicionados 25 ml de metanol ao filtrado sob agitação, e a suspensão obtida é mantida durante 12 horas a +5°C.
precipitado recolhido após decantação é seco sob vá cuo a 4o°C.
C pó obtido é dissolvido em água a uma concentração de 2% (p/v) e a solução é purificada por osmose inversa, atra vés de uma membrana MWCC 5cc, por concentração, diluição e no va concentração.
concentrado é diluído em água a 1% (p/v) da heparina e adiciona-se NaCl até uma concentração de 1M.
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Ref: MED. 11 /? .ί,.
L....
z
-11A solução é passada através de uma coluna de 10 cm de diâmetro e 2 cm de altura contendo 5 Kg de Sephadex 50 e a um caudal de 50 ml/h.
São recolhidas várias fracçoes de acordo com leituras efectuadas a 23c nm e com as actividades APTT e anti-Xa.
As fracçoes activas são misturadas, despirogenadas durante uma noite a alta temperatura, filtradas através de um filtro de membrana 0,45 e liofilizadas,
A quantidade de produto obtida é de 5 g.
Alternativamente, passam-se as fracçoes activas misturadas através de uma resina catiónica C/20 e neutralizam-se na forma de sais alcalinos de Ca, K, Mg ou Li.
As soluções neutralizadas são purificadas por osmose inversa com 500 MWCO, concentradas, despirogenadas, filtradas sob condições de esterilidade e liofilizadas.
O sal de sódio obtido tem as seguintes característi-
- Actividade heparínica
- Actividade APTT
- Actividade anti-Xa
- Razão
- Enxofre orgânico
- Ácidos urónicos
- Poder rotatório
- Peso molecular
U/mg USP u/mg
135 U/mg USP
10,8%
24,7%
5C0C daltons
Exemplo 2
Dissolvem-se 5 g de sulfato de dermatano, correspondente a uma banda única após electroforese, com um poder ro tatório específico de -67° e um peso molecular de 32OCO dal. tons, numa solução tampão de fosfato de pH 7,5 usando uma quantidade suficiente para que o volume total seja de 100 ml ·
Esta solução é depois tratada como no exemplo 1
967
Ref: MED. 11
-12obtêm-se cerca de 2,5 g de dermatano despolimerizado com as seguintes características químicas:
- Enxofre orgânico 7,2%
- Ácidos urónicos 28 %
- Razão de sulfato/carboxilo 1,45
- Poder rotatório -63°
- Peso molecular 6 30C daltons
EXEMPLO 3
Dissolvem-se 15 g de sulfato de heparina, correspondente a uma banda única após electroforese, com um poder ro tatório de +5C° e um peso molecular de 13000 a 16000 daltons, numa solução tampão de fosfato de pH 6,5 usando uma quantidade suficiente para que o volume total seja de 100 ml.
Esta solução é depois tratada como no Exemplo 1. Obtêm-se cerca de 9 g de heparano despolimerizado com csracterísticas electroforétices idênticas às do material de partida mas com peso molecular de cerca de 6000 daltons.
EXEMPLO 4
Dissolvem-se 5 g de sulfato de condroitina, correspon dente a uma banda única após electroforese, com poder rotató rio de -29°, numa solução tampão de fosfato de pH 7 usando uma quantidade suficiente para que o volume total seja de 100 ml. Segue-se então o procedimento do exemplo 1.
Obtêm-se cerca de 3 g de um produto com as caracterís ticas electroforéticas e químicas da substância de partida mas com um peso molecular de cerca de 7000 daltons.
EXEMPLO 5
Dissolvem-se 16 g de mesoglicano com a seguinte composição:
967
Ref: M3D. 11
Heparina de fluxo lento 10— 5%
Sulfato de heparano 52-5%
Sulfato de dermatano 30-5%
Sulfato de condroitina 8-2%
obtido como descrito na USP 4 489 066 de 18.12.84 e contendo 8% de enxofre orgânico e 24% de ácidos urónicos, em 1CC ml de tampão de fosfato de pH 7,5. A solução é irradiada e fraccionada unicamente por tratamento alcoólico, co mo no exemplo 1.
produto purificado e liofilizado (10 g) tem 7,8% de enxofre orgânico e 22,8% de ácidos urónicos.

Claims (15)

1 - Processo de preparação controlada de glucosamino glicanos de baixo peso molecular, caracterizado por se tratar glucosaminoglicanos convencionais de alto peso molecular no estado sólido ou em solução, com um feixe rectilíneo de raios gama em doses entre 2,5 e 20 P'rad, fornecidos na fase estática ou preferencialmente na fase dinâmica, através de passos sucessivos de irradiação com intervalos de arrefe cimento entre um passo de irradiação e o seguinte, após o que se sujeita a solução obtida a fraccionamento químico de modo a eliminar as fracções de alto peso molecular, purificando a fracção base pretendida por osmose inversa, fraccio nando a solução purificada através de Sephacryl ou outro ti po de resina em coluna, transferindo as fracções obtidas pa ra resinas catiónicas e neutralizando-as com soluções alcalinas e liofilizando-as.
2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto de os glucosaminoglicanos usados como matéria-prima serem heparinas com uma actividade anticoagulan te de 10C a 250 U/mg USP.
3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado por os glucosaminoglicanos usados como matéria-prima compreenderem heparina de fluxo lento, heparina de fluxo rápido, sulfato de heparano, condroítina-4-sulfato, condroítina-6-sulfato, sulfato de queratano, ácido hialurónico, ácido algínico ou mesoglicano, quer sozinhos quer em mistura.
4 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracte rizado pelo facto do referido tratamento com raios gama se realizar com glucosaminoglicanos em solução aquosa, eventual mente tamponada a pH 2-8.
66 967
Ref: ΜΕΏ. 11
5 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido tratamento com raios gama ser conduzido em soluções aquosas de glucosaminoglicanos, de concentração 1-30% (p/v), desarejadas e purificadas com azoto.
6 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de cada um dos sucessivos passos de ir radiação mencionados fornecer uma dose de 2-3 Frad.
7 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de os intervalos de arrefecimento serem intercalados entre o fim de um passo de irradiação e o início do passo seguinte,
8 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido tratamento com raios gama ser conduzido a uma temperatura de 20 a 55 C e preferencia Imente entre 20 e 40°C.
9 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o referido fraccionamento ouímico ser conduzido numa solução aquosa 2-5% (p/v) por tratamento com solventes tais corno, metanol, etanol, o acetona numa quantidade de lo a 30% (v/v).
,
10 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a referida purificação da fracção base ser conduzida por osmose inversa até se conseguir a eliminação total das fracções de baixo peso molecular inferior a 500 (cutoff) e dos compostos salinos.
11 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se realizar o fraccionamento da solução purificada em colunas de Sephacryl, Sephadex 50 ou de outro tipo de resinas.
66 967
Ref: NED. 11
12 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto da referida neutralização ser efectuada com soluções alcalinas de Na, Ca, K, Mg ou Li.
13 - Processo de acordo com as reivindicações 1 a 12, caracterizado por os glucosaminoglicanos terem um peso mole cular entre 1000 e 35OCC daltons e possuírem uma actividade anticoagulante entre 10 e 25C U/mg USP e uma relação anti-Xa/APTT entre 1 a 15, ou superior.
14 - Processo de preparação de composições farmacêuticas à base de glucosaminoglicanos, quando preparados de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por se associarem os seus sais de Na, Ca, K, Mg ou Li com exci pientes farmacêuticos, de modo a obter composições farmacêu ticas activas como agentes antitrombóticos, fibrinolíticos, anti-inflamatórios, anticomplemento ou antiaterogénicos ou como activadores do cofactor II da heparina.
15 - Processo de acordo ccm a reivindicação 14, cara cterizado por as composições farmacêuticas serem preparadas na forma de comprimidos, cápsulas, gotas, soluções para administração oral, colírio, pomadas, formas para injecçoes intravenosas, intradérmicas ou intramusculares e preparações especiais para absorção intradérmica com libertação controlada.
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