FI88045B - Foerfarande foer kontrollerad framstaellning av glukosaminoglykaner med laog molekylvikt - Google Patents
Foerfarande foer kontrollerad framstaellning av glukosaminoglykaner med laog molekylvikt Download PDFInfo
- Publication number
- FI88045B FI88045B FI875185A FI875185A FI88045B FI 88045 B FI88045 B FI 88045B FI 875185 A FI875185 A FI 875185A FI 875185 A FI875185 A FI 875185A FI 88045 B FI88045 B FI 88045B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- molecular weight
- glucosaminoglycans
- process according
- sulphate
- carried out
- Prior art date
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J19/08—Processes employing the direct application of electric or wave energy, or particle radiation; Apparatus therefor
- B01J19/081—Processes employing the direct application of electric or wave energy, or particle radiation; Apparatus therefor employing particle radiation or gamma-radiation
- B01J19/082—Gamma-radiation only
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
- C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
- C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
- C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
- C08B37/0063—Glycosaminoglycans or mucopolysaccharides, e.g. keratan sulfate; Derivatives thereof, e.g. fucoidan
- C08B37/0075—Heparin; Heparan sulfate; Derivatives thereof, e.g. heparosan; Purification or extraction methods thereof
- C08B37/0078—Degradation products
Description
1 88045
Menetelmä pienen molekyylipainon omaavien glukosaminogly-kaanien kontrolloiduksi valmistamiseksi
Esillä oleva keksintö koskee menetelmää, jolla 5 kontrolloidusti valmistetaan pienen molekyylipainon omaa- via glukosaminoglykaaneja.
Erityisesti tämä menetelmä perustuu tavallisten glukosaminoglykaanien käsittelemiseen gammasäteillä sopivana annoksena, jolloin saadaan glukosaminoglykaaneja, 10 joilla on kontrolloitu molekyylipaino, edullisesti välillä 1000 - 35000 daltonia.
Keksinnön mukaista menetelmää voidaan käyttää glu-kosaminoglykaaneille yleisesti ja erityisesti hepariinil-le, hitaasti liikkuvalle hepariinille, nopeasti liik-15 kuvalle hepariinille, heparaanisulfaatille, dermataani- sulfaatille, kondroitiini-4-sulfaatille, kondroitiini-6-sulfaatille, kerataanisulfaatille, hyaluronihapolle, al-giinihapolle ja mesoglykaanille joko yksin tai seoksina eri aineosien kanssa.
20 Tavanomaiset hepariinit tunnetaan tehokkaina veri suonten tukkeutumista vastustavina aineina, mutta niiden käyttöä rajoittaa suhteellisen suuri verenvuotokomplikaa-tioiden taso.
Tämän vuoksi tieteellisen ja kliinisen mielenkiin-25 non kohteena ovat viime vuosina olleet depolymeroidut hepariinit, joilla on farmakologisissa tutkimuksissa todettu olevan kiinnostavia antitromboottisia ja fibrinolyyttisiä ominaisuuksia liittyneenä matalaan verenvuototaipumukseen, kuten on kuvattu esimerkiksi julkaisussa J.F. Cade, Throm-30 bosis Research, 1984, s. 613-625.
Muilla glukosaminoglykaaneilla molekyylipainon pienentäminen muuttaa suussa tapahtuvaa absorptiota ja parantaa farmakologista aktiivisuutta.
Pienen molekyylipainon omaavien hepariinien valmis-35 tusmenetelmiä esitetään lukuisissa patenteissa ja julkaisuissa .
2 88045
Kaikki nämä menetelmät perustuvat tavallisten hepa-riinien kemialliseen tai entsymaattiseen käsittelemiseen.
Kemialliseen käsittelemiseen kuuluu esimerkiksi käsitteleminen hapettomilla, kuten vetyperoksidilla, typ-5 pihapokkeella, natriumperoksidilla ja kaliumpermanganaa tilla, tai pyridiinijohdannaisilla; tai vaihtoehtoisesti de-esteröinti ja uudelleenesteröinti, de-aminointi ja uu-delleenaminointi ja rikitys.
Tällaisia menetelmiä on esitetään esimerkiksi pa-10 tenttijulkaisuissa US 4 500 519, US 4 351 938 ja FR 2 538 404.
Entsymaattisessa käsittelyssä on käytetty lukuisia puhdistettuja entsyymejä (heparinaasi) ja raakaentsyymejä (haimauutteet), kuten on esitetty esimerkiksi patentissa 15 US 3 766 167.
Tunnetuissa hepariinin depolymerointimenetelmissä on ongelmana se, ettei voida kontrolloida molekyylien hajoamista ja säilyttää aktiivisia rakenteita. Tämän takia nämä menetelmät johtavat ei-toistettaviin sarjoihin joh-20 dannaisia, jotka on erotettava peräkkäisellä puhdistuksella ja fraktioinnilla terapeuttisesti kiinnostavien mole-kyylipainojen mukaisesti.
Alalla on kuvattu myös hepariinin käsitteleminen gammasäteillä esimerkiksi julkaisuissa Chawla ja Hayward, 25 Pharmacology, 20 (1980) s. 224; ja Edwards, Carbohyd.
Polymers, 5 (1985) s. 473.
Tähän käsittelyyn kuuluu hepariinimembraanien tuottaminen N,N-dietyyliaminoetyyliselluloosa-asetaatin avulla ja hepariiniliuosten sterilointi. Näiden tutkimusten 30 yhteenvedossa esitetään vähäinen molekyylien hajoaminen ja koaguloitumista vastustavan aktiivisuuden minimihäviöt.
Nyt on yllättäen havaittu, että käsittelemällä glu-kosaminoglykaaneja gammasäteillä keksinnön mukaisen menetelmän mukaisesti, saadaan toivotut muutokset glukasamino-35 glykaanin molekyylipainossa samalla kun säilytetään aktii- I: 3 8 8 O 4 'j visten sulfatoitujen rakenteiden riittävä stabiilisuus; siis saadaan tiettyjä glukosaminoglykaanimolekyyliaggre-kaatteja, joille on ominaista, että niissä on ryhmiä, joilla on suuri antitromboottinen aktiivisuus, pienempi S antikoagulanttiaktiivisuus, vähäinen verenvuotovaikutus ja mahdollisimman pieni verihiutaleiden aggregoitumisaktii-visuus.
Käytännössä nämä ominaisuudet määräytyvät molekyy-lipainon pienentymisestä ja funktionaalisten ryhmien säi-10 lymisestä aktiivisina antitrombiini III:n ja kofaktori II:n suhteen.
Keksinnön mukaiselle menetelmälle pienen molekyyli-painon omaavien glukosaminoglykaanien kontrolloiduksi valmistamiseksi on tunnusomaista, että tavanomaisia suuren 15 molekyylipainon omaavia glukosaminoglykaaneja käsitellään vesiliuoksessa, joka on puskuroitu pH-arvoon 2 - 8 ja josta on ilma poistettu ja joka on puhdistettu typellä, lämpötilassa 20 - 55 °C suoraviivaisella gammasädesuihkulla annoksena 2,5 - 20 Mrad johdettuna staattisessa tai dynaa-20 misessa faasissa peräkkäisinä säteilytysvaiheina, jolloin peräkkäisten säteilytysvaiheiden välillä on jäähdytysjak-• : : sot, saadulle liuokselle suoritetaan sen jälkeen kemial linen fraktiointi suuren molekyylipainon omaavien fraktioiden poistamiseksi, haluttu perusfraktio puhdistetaan : 25 käänteisosmoosilla, puhdistettu liuos fraktioidaan edel leen hartsipylväiden läpi ja lyofilisoidaan.
Käänteisosmoosilla puhdistettu liuos fraktioidaan edelleen ajamalla se Sephacryl-hartsipylvään läpi, siir-. . tämällä saadut fraktiot kationihartseihin ja neutraloimal- .'30 la ne emäsliuoksella ennen lyofilisointia.
Nämä ja muut keksinnön mukaisen menetelmän ominaisuudet ja edut tulevat selvemmin esille seuraavaksi esitetyssä keksinnön mukaisen menetelmän edullisten toteutus-muotojen kuvauksessa ja esimerkeissä, jotka annetaan pel-35 kästään havainnollistamaan keksintöä.
4 88045
Keksinnön mukaisessa menetelmässä voidaan käyttää teollisesti valmistettuja hepariineja, joilla on erilaisia rakenteellisia ominaisuuksia koaguloitumista vastustavan aktiivisuuden vaihdellessa välillä 100 U/mg - 250 U/mg 5 USP. Tämä koaguloitumista vastustava aktiivisuus vaih-telee puhtauden mukaan ja molekyylieheyden mukaan ja siihen vaikuttavat menetelmät, joita on käytetty erotettaessa glukosaminoglykaanit proteiinimatriisista ja menetelmät, joita on käytetty epäpuhtauksien poistamiseen.
10 Mitä tulee muihin glukosaminoglykaaneihin, voidaan käyttää yhdisteitä, joilla on tavalliset kemialliset ja fysikaaliset ominaisuudet, esimerkiksi dermataania, jonka molekyylipaino on 24000 - 35000, ja heparaania, jonka mo-lekyylipaino on 13000 - 16000 daltonia.
15 Näitä raaka-aineita käytetään vesiliuoksina, jotka on puskuroitu pH-arvoon 2-8, jotta mikäli tarpeellista, estetään happaman ympäristön muodostuminen, joka mahdollisesti vaikuttaisi molekyylin rakenteelliseen järjestäytymiseen.
20 Raaka-aineen pitoisuudet liuoksessa ovat välillä 1 - 30 % (paino/tilavuus) riippuen käytettävästä tuotetyy- : pistä. Ennen käsittelyä liuoksista poistetaan ilma ja ne puhdistetaan sitten puhtaalla typellä jäljellä olevan il- ·:*·: man poistamiseksi.
| 25 Gammasäteilykäsittely suoritetaan pyrex-lasiasti- oissa, jolloin estetään tyypillinen värin muuttuminen kas tanjanruskeaksi tai ruskeaksi, mikä tapahtuisi käytettäessä tavallista lasia käsittelyn aikana.
. . Erilaisia radionuklideja voidaan käyttää gammasä- 30 delähteenä, kuten esimerkiksi Co60, Am241, Cs137 ja Ra226.
Edullisesti käytetään Co60:ta, koska se emittoi suuriener-gistä (1,25 MeV) suoraviivaista säteilyä. Näillä säteillä on suuri taajuus, ne ovat monokromaattisia eivätkä ne aiheuta radioaktivointi-ilmiöitä yhdisteisiin, joihin ne ; 35 kohdistetaan.
5 38045
Gammasäteitä käytetään peräkkäisinä osakäsittelyi-nä, joiden annokset ovat 2-3 Mrad, käyttäen erilaisia väliaikoja käytetään yhden käsittelyn lopettamisen ja seu-raavan aloittamisen välillä, siten että säteilytyksen ko-5 konaisannos on välillä 2,5 - 20 Mrad staattisessa tai edullisesti dynaamisessa faasissa.
Käsittelyjen välillä olevien väliaikojen tarkoituksena on estää systeemin ylikuumeneminen, joka johtaisi epäedulliseen tuotteen kemiallisten ja fysikaalisten omi-10 naisuuksien muuttumiseen. Tämä menetelmä suoritetaan siten lämpötilassa välillä 20 - 55 °C ja edullisesti 20 - 40 °C:ssa.
Säteilytyskäsittelyn loputtua liuoksille suoritetaan kemiallinen fraktiointi suuren molekyylipainon omaa-15 vien fraktioiden poistamiseksi. Tämä toimenpide suoritetaan liuoksilla, jotka on laimennettu veteen pitoisuuteen 2 - 5 % (paino/tilavuus), käsittelemällä niitä liuottimilla kuten metanolilla, etanolilla tai asetonilla, jonka on 10 - 30 % (tilavuus/tilavuus) liuoksesta. Saostuneet frak-20 tiot erotetaan dekantoimalla ja dekantoituun nesteeseen syötetään lisää liuotinta toivotun perusfraktion talteen-ottamista varten.
Perussakka liuotetaan veteen, minkä jälkeen se puhdistetaan käänteisosmoosilla, jonka raja-arvo on 500, kun-- 25 nes pienen molekyylipainon omaavat fraktiot ja suolakom- ponentit ovat kokonaan poistuneet.
Puhdistettu liuos fraktioidaan edelleen Sephacryl S200:lla tai Sephadex 50:llä täytettyjen pylväiden läpi . . sellaisessa suolapitoisuudessa, joka vaihtelee kyseisen 30 glukosaminoglykaanin mukaisesti.
Lopuksi näistä hartsipylväistä läpi ajetut talteen-otetut aktiiviset fraktiot depyrogenoidaan, suodatetaan steriileissä olosuhteissa ja lyofilisoidaan.
Vaihtoehtoisesti nämä hartsin läpi tulevat talteen-; 35 otetut aktiiviset fraktiot voidaan siirtää kationihartsiin 6 88045
Castel C/300 tai C/20 ja neutraloida sitten emäksisillä Na-, Ca-, K-, Mg- tai Li-liuoksilla glukosaminoglykaanien muuttamiseksi vastaaviksi suoloiksi.
Saadut liuokset puhdistetaan käänteisosmoosilla, 5 jonka raja-arvo on 500, ylimääräiset emäksiset alkuaineet poistamiseksi.
Talteenotetut fraktiot depyrogenoidaan lopuksi, suodatetaan steriileissä olosuhteissa ja lyofilisoidaan.
Kun toimitaan esitetyissä olosuhteissa, moleky-10 laarisia glukosaminoglykaanifraktioita, joilla on hyvin määrätty farmakologinen aktiivisuus, muodostuu hyvällä toistettavuudella.
Toimittaessa esitetyissä olosuhteissa kasvaa erityisesti depolymeroitumisen määrä kasvaa annostellun gam-15 masäteilyn määrän kasvaessa ja vastaavasti havaitaan pieneneminen koaguloitumista vastustavassa aktiivisuudessa samalla kun suhde anti-Xa/APTT, so. anti-Xa-aktiivisuuden suhde aktiiviseen osittaiseen tromboplastiiniaikaan, suurenee.
20 Seuraavissa taulukoissa 1, 2 ja 3 esitetään tulok set, jotka on saatu esitetyissä olosuhteissa hepariineil-le, joilla on erilaiset alkuperäiset U/mg USP arvot.
Taulukko 1
Koaguloitumista vastustava aktiivisuus yksikköinä USP : : 25 Mrad 0 2,5 5 7,5 10 12,5 15 17,5 HP 1 160 145 130 94 80 75 65 55 HP 2 167 136 120 88 75 64 53 47 HP 3 156 130 120 103 78 63 53 42 ; 30 Taulukko 2
Molekyylipainot (arvot x 103)
Mrad 0 2,5 5 7,5 10 12,5 15 17,5 HP 1 15 13,6 12,1 11 9,1 7,5 7,3 6,6 HP 2 15,6 14,3 12,7 10,9 8,5 7,3 6,6 5,7 ... 35 HP 3 15,2 14 12,3 10,9 8,1 7,7 6,6 5,1 i 7 88045
Taulukko 3 17,5 Mrad:11a käsiteltyjen puhdistettujen fraktioiden aktiivisuus _APTT_anti-Xa_Suhde_ 5 HP 1 12 108 9 HP 2 13 98,8 7,6 HP 3 15 120 8
Tulosten tilastollinen arviointi 10 Kuviossa 1 esitetään tulokset, jotka osoittavat hepariini-aktiivisuuksien (USP) vaihtelun säteilyn suhteen (Mrad) funktiona.
Merkittävä matemaattinen funktio, joka interpoloi parametrikorrelaatiota, on suora viiva, jonka korrelaatio-15 kerroin (R) on P 0,001 merkitsevyydellä (erinomainen lineaarisuus ).
Kuviossa 2 esitetään tulokset molekyylipainon vaihtelulle säteilyn (Mrad) funktiona.
Matemaattinen funktio, joka parhaiten interpoloi 20 korrelaatiota, on suora viiva, jonka korrelaatiokerroin R on P 0,001 merkitsevyydellä (erinomainen lineaarisuus).
Lisäksi tutkittiin keksinnön mukaisesti gammasä-teillä depolymeroidun hepariinin vaikutusta verenvuoto-aikaan verrattuna tavanomaisen hepariinin vaikutukseen.
: 25 Koe suoritettiin seuraten menetelmää, jonka ovat esittäneet Dejana et ai. [Thromb. Haemostasis 48 (1982) s. 108], nukutetuilla rotilla, joilta oli leikattu 2 mm hännän päästä.
. . Mitattiin verenvuotoaika täydelliseen vuodon ehty- 30 miseen asti (ei uutta vuotoa 30 sekuntiin).
Hepariinit annosteltiin 15 minuuttia ennen hännän leikkaamista.
Tulokset esitetään taulukossa 4.
8 88045
Taulukko 4
Vuotoaika (minuutteja)
Annos_Hepariini Depolymeroitu hepariini Vertailu 0,25 mg/kg 8 4 5 0,5 mg/kg 12 5 1 mg/kg 25 7,5
Vertailu_5_ eläinten lukumäärä annosta kohti = 10 10 Esitettyjen tulosten kanssa analogiset tulokset saatiin käyttämällä esitettyä depolymerointia ja puhdistamista erilaisten glukosaminoglykaanien liuoksille kuten heparaanisulfaatin, dermataanisulfaatin, kondroitiini-4-sulfaatin, kondroitiini-6-sulfaatin, hyalyronihapon ja 15 algiinihapon liuoksille.
Dermataanisulfaatin tapauksessa depolymeroinnin määrä säteilyn (Mrad) funktiona vahvistaa systeemin arvon.
Taulukossa 5 esitetään erilaisilla säteilyintensi-teeteillä saadut molekyylipainot.
20 Taulukko 5
Depolymeroitu dermataanisulfaatti : Mrad _0 2,5 5 7,5 10_12,5 15 molekyylipaino 31,2 24,8 18 12 10,4 8,5 5 (x 1000) : 25 Kuvio 3 esittää tilastollisesti edustavan molekyy- lipainon ja säteilyn (Mrad) välisen funktion, joka on suora viiva, jonka korrelaatiokerroin R on P 0,001 merkitsevyydellä.
Tämä on selvä osoitus lineaarisuudesta, joka on 30 molekyylipainon pienenemisen ja säteilyn (Mrad) välillä.
Keksinnön mukaisesti depolymeroidut glukosaminogly-kaanit, joiden molekyylipainot ovat 1000 - 35000 daltonia ja jotka ovat Na-, Ca-, K-, Mg- tai Li-suoloina, joko yksin tai yhdessä muiden tuotteiden kanssa, ovat käyttökel-35 poisia ehkäistäessä tai hoidettaessa verisuonitukoksia i 9 88045 mukaan lukien silmäsairaudet. Niitä voidaan käyttää myös fibrinolyyttisinä, tulehdusta ehkäisevinä, antikomplement-tisina, valtimohaurastumaa ehkäisevinä aineina ja heparii-ni kofaktori II:n aktivoijina.
5 Seuraavat esimerkit annetaan keksintöä rajoittamat ta havainnollistamaan glukoosiaminoglykaanien valmistamista keksinnön mukaisesti.
Esimerkki 1 16 g suolen limakalvolta saatua natriumhepariinia, 10 jossa on 170 U/mg USP:ta ja jonka molekyylipaino on 14000 daltonia, liuotetaan sellaiseen määrään pH:n 7 fosfaatti-puskuria, että saadaan kokonaistilavuudeksi 100 ml.
Liuos kaadetaan 150 ml:n pyrex-lasisäiliöön, ilma poistetaan tyhjössä ja liuos puhdistetaan puhtaalla typel-15 lä.
Hermeettisesti suljetulle säiliölle suoritetaan peräkkäin käsittelyt, joista kukin on 2,5 Mrad ja joiden kokonaismäärä on 17,5 Mrad, altistamalla se gammasäteille, joita emittoi radionuklidi koboltti60.
20 Säteilytyksen jälkeen liuos laimennetaan pitoisuu teen 5 % tislatulla vedellä ja lisätään hitaasti 15 ml : etanolia samalla sekoittaen voimakkaasti. Liuosta pidetään yön yli +5 °C:ssa, minkä jälkeen pinnalla oleva neste de-kantoidaan ja selkeytetään suodattamalla, suodokseen lisä-:: 25 tään 25 ml metanolia samalla sekoittaen ja saatu suspensio pidetään 12 tuntia +5 °C:ssa.
Dekantoinnin jälkeen talteenotettu sakka kuivataan tyhjössä 40 eC:ssa.
Saatu jauhe liuotetaan veteen pitoisuuteen 2 % . 30 (paino/tilavuus) ja liuos puhdistetaan käänteisosmoosilla 500 MWC0 -membraanin läpi, konsentroiden, laimentaen ja uudelleen konsentroiden.
Konsentraatti laimennetaan vedellä hepariinin pitoisuuteen 1 % (paino/tilavuus) ja NaCl:a lisätään pitoi-35 suuteen IM.
10 3 8 045
Liuos ajetaan pylvään läpi, jonka halkaisija on 10 cm ja korkeus 2 m ja jossa on 5 kg Sephadex 50:a, nopeudella 50 ml/h.
Otetaan talteen erilaisia fraktioita 230 nm:n luke-5 mien ja APTT- ja anti-Xa-aktiivisuuksien suhteen.
Aktiiviset fraktiot yhdistetään, depyrogenoidaan yön yli kuumissa olosuhteissa, suodatetaan 0,45 membraani-suodattimen läpi ja lyofilisoidaan.
Tuotetta saadaan 5 g.
10 Vaihtoehtoisesti yhdistetyt aktiiviset fraktiot kä sitellään C/20-kationihartsilla ja neutraloidaan emäksisiksi Ca-, K-, Mg- tai Li-suoloiksi.
Neutraloidut liuokset puhdistetaan käänteisosmoo-silla käyttäen 500 MWC0:ta, konsentroidaan, depyrogenoi-15 daan, suodatetaan steriileissä olosuhteissa ja lyofilisoi-daan.
Saadulla natriumsuolalla on seuraavat ominaisuudet: hepariiniaktiivisuus 20 U/mg USP
APTT-aktiivisuus 15 U/mg
20 anti-Xa-aktiivisuus 135 U/mg USP
suhde 9 orgaaninen rikki 10,8 % virtsahappoja 24,7 % kiertokyky +49° i 25 molekyylipaino 5000 daltöniä
Esimerkki 2 5 g elektroforeesi-monovyöhykedermataanisulfaattia, jonka ominaiskiertokyky on -67° ja jonka molekyylipaino on . . 32000 daltonia, liuotetaan pH:n 7,5 fosfaattipuskuriliuok- 30 seen, jota käytetään sellainen määrä, että kokonaistilavuudeksi tulee 100 ml.
Tämän jälkeen tätä liuosta käsitellään kuten esimerkissä 1.
Näin saadaan noin 2,5 g depolymeroitua dermataania, 35 jolla on seuraavat kemialliset ominaisuudet: “ 88045 orgaaninen rikki 7,2 % virtsahappoja 28 % sulfaatti/karboksyyli-suhde 1,45 kiertokyky -63° 5 molekyylipaino 6300 daltonia
Esimerkki 3 15 g elektroforeesi-monovyöhykeheparaanisulfaattia, jonka kiertokyky on +50° ja molekyylipaino 13000 - 16000 daltonia, liuotetaan pH:n 6,5 fosfaattipuskuriliuokseen, 10 jota käytetään sellainen määrä, että kokonaistilavuudeksi saadaan 100 ml.
Tätä liuosta käsitellään sitten kuten esimerkissä 1.
Näin saadaan 9 g depolymeroitua heparaania, jolla 15 on lähtöaineen elektroforeettiset ominaisuudet, mutta jonka molekyylipaino on noin 6000 daltonia.
Esimerkki 4 5 g elektroforeesi-monovyöhykekondroitiinisulfaat-tia C, jonka kiertokyky on -29°, liuotetaan pH:n 7 fosfaat-20 tipuskuriliuokseen, jota käytetään sellainen määrä, että kokonaistilavuudeksi saadaan 100 ml. Tämän jälkeen seurataan esimerkin 1 menetelmää.
Näin saadaan noin 3 g tuotetta, jolla on lähtöaineen elektroforeettiset ja kemialliset ominaisuudet, mutta '25 jonka molekyylipaino on noin 7000 daltonia.
Esimerkki 5 16 g mesoglykaania, jolla on seuraava koostumus: hitaasti liikkuva hepariini 10 ± 5 % hepariini- . - sulfaatti 52 ± 5 % . 30 dermataanisulfaatti 30 ± 5 % kondroitiinisulfaatti 8 ± 2 % ja joka on valmistettu US-patenttijulkaisun 4 489 066 (18.12.1984) mukaisesti ja jossa on 8 % orgaanista rikkiä ja 24 % virtsahappoja, liuotetaan 100 ml:aan pH:n 7,5 fos-35 faattipuskuria. Liuos säteilytetään ja fraktioidaan eril- 12 38045 lisellä alkoholikäsittelyllä kuten esimerkissä 1.
Puhdistetussa lyofilisoidussa tuotteessa (10 g) on 7,8 % orgaanista rikkiä ja 22,8 % virtsahappoja.
Claims (9)
1. Menetelmä pienen molekyylipainon omaavien glu-kosaminoglykaanien kontrolloiduksi valmistamiseksi, t u n- 5. e t t u siitä, että tavanomaisia suuren molekyylipainon omaavia glukosaminoglykaaneja käsitellään vesiliuoksessa, joka on puskuroitu pH-arvoon 2 - 8 ja josta on ilma poistettu ja joka on puhdistettu typellä, lämpötilassa 20 -55 °C suoraviivaisella gammasädesuihkulla annoksena 2,5 -10 20 Mrad johdettuna staattisessa tai dynaamisessa faasissa peräkkäisinä säteilytysvaiheina, jolloin peräkkäisten sä-teilytysvaiheiden välillä on jäähdytysjaksot, saadulle liuokselle suoritetaan sen jälkeen kemiallinen fraktiointi suuren molekyylipainon omaavien fraktioiden poistamiseksi, 15 haluttu perusfraktio puhdistetaan käänteisosmoosilla, puhdistettu liuos fraktioidaan edelleen hartsipylväiden läpi ja lyofilisoidaan.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtöaineina käytetyt glukos- 20 aminoglykaanit ovat hepariineja, joiden antikoagulantti-. . aktiivisuus on 100 - 250 U/mg USP.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lähtöaineina käytetyt tavanomaiset glukosaminoglykaanit koostuvat hitaasti liikkuvasta : 25 hepariinista, nopeasti liikkuvasta hepariinista, heparaa-nisulfaatista, dermataanisulfaatista, kondroitiini-4-sul-faatista, kondroitiini-6-sulfaatista, kerataanisulfaatis-ta, hyaluronihaposta, algiinihaposta tai mesoglykaanista joko yksin tai seoksina eri aineosien kanssa.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että gammasädekäsittely suoritetaan glukosaminoglykaanien vesiliuoksissa, joiden pitoisuus on 1 - 30 % (paino/tilavuus).
5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, -35 tunnettu siitä, että kunkin peräkkäisen säteily-tysvaiheen annos on 2-3 Mrad. i4 88045
6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että gammasädekäsittely suoritetaan lämpötilassa 20 - 40 °C.
7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että kemiallinen fraktiointi suoritetaan 2 - 5-%:isessa (paino/tilavuus) vesiliuoksessa käsittelemällä liuottimilla, kuten metanolilla, etanolilla ja asetonilla määränä 10 - 30 % (tilavuus/tilavuus).
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että perusfraktion puhdistaminen suoritetaan käänteisosmoosilla käyttäen molekyylipainon raja-arvoa 500, kunnes saavutetaan pienen molekyylipainon omaavien fraktioiden ja suolakomponenttien poistuminen kokonaan.
9. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että neutralointi suoritetaan emäksisellä Na-, Ca-, K-, Mg- tai Li-liuoksella. i is 8 8 0 4 5
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT8622434A IT1213384B (it) | 1986-11-24 | 1986-11-24 | Processo per la preparazione controllata di gilcosaminoglicani a basso peso molecolare. |
| IT2243486 | 1986-11-24 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI875185A0 FI875185A0 (fi) | 1987-11-24 |
| FI875185A FI875185A (fi) | 1988-05-25 |
| FI88045B true FI88045B (fi) | 1992-12-15 |
| FI88045C FI88045C (fi) | 1993-03-25 |
Family
ID=11196265
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI875185A FI88045C (fi) | 1986-11-24 | 1987-11-24 | Foerfarande foer kontrollerad framstaellning av glukosaminoglykaner med laog molekylvikt |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4987222A (fi) |
| EP (1) | EP0269937B1 (fi) |
| JP (1) | JPS63213502A (fi) |
| KR (1) | KR880005936A (fi) |
| AT (1) | ATE60924T1 (fi) |
| AU (1) | AU603622B2 (fi) |
| CA (1) | CA1305134C (fi) |
| DE (1) | DE3768074D1 (fi) |
| DK (1) | DK602387A (fi) |
| ES (1) | ES2020993B3 (fi) |
| FI (1) | FI88045C (fi) |
| GR (1) | GR3001670T3 (fi) |
| IT (1) | IT1213384B (fi) |
| NO (1) | NO874777L (fi) |
| PT (1) | PT86191B (fi) |
Families Citing this family (36)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0748559B2 (ja) * | 1988-11-30 | 1995-05-24 | シャープ株式会社 | 半導体装置 |
| IE64121B1 (en) * | 1989-10-04 | 1995-07-12 | Akzo Nv | Sulphated glycosaminoglycuronan with antithrombotic activity |
| IT1240615B (it) * | 1990-04-03 | 1993-12-17 | Mediolanum Farmaceutici Spa | Impiego del dermatan solfato nella prevenzione e terapia dell'invecchiamento cerebrale e degli stati di deficit funzionale del sistema nervoso centrale |
| FR2663639B1 (fr) * | 1990-06-26 | 1994-03-18 | Rhone Poulenc Sante | Melanges de polysaccharides de bas poids moleculaires procede de preparation et utilisation. |
| USRE38743E1 (en) | 1990-06-26 | 2005-06-14 | Aventis Pharma S.A. | Mixtures of particular LMW heparinic polysaccharides for the prophylaxis/treatment of acute thrombotic events |
| US5230832A (en) * | 1991-01-24 | 1993-07-27 | Brandeis University | Galactomannan-agarose binary gel for nucleic acid electrophoresis |
| IT1256236B (it) * | 1992-12-23 | 1995-11-29 | Mediolanum Farmaceutici Srl | Oligosaccaridi aventi attivita' biologica e procedimento per la loro preparazione di glicosaminoglicani |
| FR2718025B1 (fr) * | 1994-03-30 | 1996-06-21 | Paris Val Marne Universite | Médicament et composition pharmaceutique pour le traitement des lésions du système nerveux. |
| US5585361A (en) * | 1994-06-07 | 1996-12-17 | Genzyme Corporation | Methods for the inhibition of platelet adherence and aggregation |
| CN1174557A (zh) * | 1994-12-01 | 1998-02-25 | 生化学工业株式会社 | 硫酸角质素寡聚糖级分及含该级分的药剂 |
| DE19646901A1 (de) * | 1996-11-13 | 1998-05-14 | Helmut Prof Dr Heusinger | Verfahren zum Herstellen von Abbauprodukten polymerer Glycosaminoglycane mittels Ultraschall |
| DE29900874U1 (de) | 1999-01-20 | 1999-07-22 | Knoll Ag | Organprotektive Lösungen |
| DE19920688A1 (de) * | 1999-05-05 | 2000-11-23 | Manfred Kuhn | Radiolytisch modifizierte Heteropolysaccharide |
| IT1312107B1 (it) * | 1999-05-14 | 2002-04-04 | Umberto Cornelli | Glicosaminoglicani aventi peso molecolare medio di 2400 d atti altrattamento della demenza senile |
| CA2430277A1 (en) * | 1999-11-30 | 2001-07-06 | Chuanxing Yu | The alginate having low molecular weight, methods of manufacturing it and its use |
| US6383344B1 (en) * | 2000-07-19 | 2002-05-07 | Genzyme Corporation | Molecular weight reduction of polymer using irradiation treatment |
| US6969705B2 (en) * | 2000-07-21 | 2005-11-29 | Aventis Pharma S.A. | Compositions of polysaccharides derived from heparin, their preparation and pharmaceutical compositions containing them |
| US6610810B2 (en) | 2001-03-13 | 2003-08-26 | Glyn Owen Phillips | Biopolymers obtained by solid state irradiation in an unsaturated gaseous atmosphere |
| WO2002076475A2 (en) * | 2001-03-23 | 2002-10-03 | Bioparken As | Glycosaminoglycan anticoagulants derived from fish |
| EP1344781A1 (en) | 2002-03-12 | 2003-09-17 | Laboratori Derivati Organici S.P.A. | Process for the depolymerization of glycosaminoglycanes and products obtained therefrom |
| ITMI20021372A1 (it) * | 2002-06-21 | 2003-12-22 | Derivati Organici Lab | Processo per la depolimerizzazione fisica dei glicosamminogliacani e prodotti da esso ottenuti |
| US20040171819A1 (en) * | 2002-10-10 | 2004-09-02 | Aventis Pharma S.A. | Mixtures of polysaccharides derived from heparin, their preparation and pharmaceutical compositions containing them |
| EP1440683A1 (de) * | 2003-01-23 | 2004-07-28 | Cognis France S.A. | Verwendung von Oligoglucosaminen in kosmetischen oder dermatologischen Zubereitungen |
| US20040161476A1 (en) * | 2003-02-19 | 2004-08-19 | Hahn Sungtack Samuel | Cystitis treatment with high dose chondroitin sulfate |
| US7956046B2 (en) * | 2003-07-24 | 2011-06-07 | Aventis Pharma S.A. | Oligosaccharide mixtures derived from heparin, preparation thereof and pharmaceutical compositions containing them |
| EP1524276A1 (en) * | 2003-10-16 | 2005-04-20 | Laboratori Derivati Organici S.P.A. | Multistep process for the physical depolymerization of heparin and products obtained therefrom |
| US20050154196A1 (en) * | 2004-01-13 | 2005-07-14 | Seikagaku Corporation | Process for producing sugar in which molecular weight is lowered |
| US20050261241A1 (en) * | 2004-05-19 | 2005-11-24 | Celsus Biopharmaceuticals, Inc. | Use of dermatan sulfates and/or desulfated heparins to treat or prevent heparinoid-induced autoimmune responses |
| US7939512B2 (en) | 2004-10-13 | 2011-05-10 | Laboratori Derivati Organici Spa | Multistep process for the physical depolymerization of heparin and products obtained therefrom |
| WO2009141821A1 (en) * | 2008-05-20 | 2009-11-26 | Crystal Clear Partnership | Separation of polysaccharides by charge density gradient |
| MX2014009410A (es) * | 2012-02-17 | 2015-01-14 | Kimflexor S L | Sales de oro y plata de glicosaminoglicanos parcialmente despolimerizadas. |
| WO2014102332A1 (en) * | 2012-12-28 | 2014-07-03 | Dupont Nutrition Biosciences Aps | Depolymerisation of alginic acid |
| WO2020121179A1 (en) * | 2018-12-11 | 2020-06-18 | Universita' Degli Studi Di Salerno | Composition for the treatment of skin lesions |
| KR102240239B1 (ko) * | 2019-04-23 | 2021-04-14 | (주)티엠비 | 저분자량 히알루론산의 제조방법 및 이로부터 제조된 저분자량 히알루론산 |
| CA3144968A1 (en) | 2019-07-09 | 2021-01-14 | Optimvia Llc | Methods for synthesizing anticoagulant polysaccharides |
| CN111040047A (zh) * | 2019-12-11 | 2020-04-21 | 东营天东制药有限公司 | 一种酶-超滤法精制低分子硫酸皮肤素的工艺、应用 |
Family Cites Families (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE136572C (fi) * | 1902-12-05 | |||
| US3453194A (en) * | 1966-08-03 | 1969-07-01 | Dow Corning | Anticoagulant surfaces produced by radiation grafting heparin to a silicone substrate |
| US3766167A (en) * | 1971-03-26 | 1973-10-16 | Research Corp | Orally active anticoagulant |
| IT1075117B (it) * | 1977-02-14 | 1985-04-22 | Fedeli Gianfranco | Complesso polisaccaridico arterioso,processo per la sua preparazione e suo impiego in terapia umana |
| FR2440376A1 (fr) * | 1978-11-06 | 1980-05-30 | Choay Sa | Composition mucopolysaccharidique ayant une activite regulatrice de la coagulation, medicament la contenant et procede pour l'obtenir |
| CA1136620A (en) * | 1979-01-08 | 1982-11-30 | Ulf P.F. Lindahl | Heparin fragments having selective anticoagulation activity |
| IL61201A (en) * | 1979-10-05 | 1984-09-30 | Choay Sa | Oligosaccharides having no more than 8 saccharide moieties,their obtention from heparin and pharmaceutical compositions containing them |
| US4351938A (en) * | 1980-05-19 | 1982-09-28 | Riker Laboratories, Inc. | Anticoagulant substance |
| CA1171375A (en) * | 1980-09-15 | 1984-07-24 | Ulf P.F. Lindahl | Oligosaccharides having selective anticoagulation activity |
| FR2495935A1 (fr) * | 1980-12-15 | 1982-06-18 | Choay Sa | Fractions mucopolysaccharidiques possedant des proprietes biologiques, leur procede de preparation et leur application en tant que medicaments |
| ATE15142T1 (de) * | 1981-05-21 | 1985-09-15 | Akzo Nv | Antithrombotikum auf basis von polysacchariden, verfahren zur dessen herstellung und medizinale zusammensetzungen. |
| IT1195497B (it) * | 1983-03-08 | 1988-10-19 | Opocrin Spa | Procedimento per la preparazione di frazioni oligosaccaridiche dotate di proprieta' farmacologiche per degradazione chimica di eparina |
| US4788307A (en) * | 1986-04-30 | 1988-11-29 | Choay S.A. | Oligosaccharidic fractions devoid or practically devoid of antithrombotic activity |
| DK196986D0 (da) * | 1986-04-30 | 1986-04-30 | Novo Industri As | Fremstilling af polysaccharider |
-
1986
- 1986-11-24 IT IT8622434A patent/IT1213384B/it active
-
1987
- 1987-11-16 ES ES87116862T patent/ES2020993B3/es not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-16 EP EP87116862A patent/EP0269937B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-16 DE DE8787116862T patent/DE3768074D1/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-11-16 AT AT87116862T patent/ATE60924T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-11-16 US US07/120,953 patent/US4987222A/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-16 NO NO874777A patent/NO874777L/no unknown
- 1987-11-17 DK DK602387A patent/DK602387A/da not_active Application Discontinuation
- 1987-11-20 PT PT86191A patent/PT86191B/pt not_active IP Right Cessation
- 1987-11-23 CA CA000552481A patent/CA1305134C/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-11-23 AU AU81609/87A patent/AU603622B2/en not_active Ceased
- 1987-11-24 FI FI875185A patent/FI88045C/fi not_active IP Right Cessation
- 1987-11-24 JP JP62294255A patent/JPS63213502A/ja active Granted
- 1987-11-24 KR KR1019870013216A patent/KR880005936A/ko not_active Application Discontinuation
-
1991
- 1991-03-27 GR GR91400383T patent/GR3001670T3/el unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0588881B2 (fi) | 1993-12-24 |
| EP0269937A2 (en) | 1988-06-08 |
| PT86191B (pt) | 1990-11-07 |
| AU8160987A (en) | 1988-05-26 |
| FI875185A0 (fi) | 1987-11-24 |
| IT8622434A0 (it) | 1986-11-24 |
| DK602387D0 (da) | 1987-11-17 |
| AU603622B2 (en) | 1990-11-22 |
| IT1213384B (it) | 1989-12-20 |
| JPS63213502A (ja) | 1988-09-06 |
| US4987222A (en) | 1991-01-22 |
| PT86191A (en) | 1987-12-01 |
| EP0269937B1 (en) | 1991-02-20 |
| EP0269937A3 (en) | 1989-03-08 |
| DE3768074D1 (de) | 1991-03-28 |
| CA1305134C (en) | 1992-07-14 |
| ES2020993B3 (es) | 1991-10-16 |
| FI875185A (fi) | 1988-05-25 |
| GR3001670T3 (en) | 1992-11-23 |
| FI88045C (fi) | 1993-03-25 |
| DK602387A (da) | 1988-09-15 |
| NO874777D0 (no) | 1987-11-16 |
| KR880005936A (ko) | 1988-07-21 |
| ATE60924T1 (de) | 1991-03-15 |
| NO874777L (no) | 1988-05-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI88045B (fi) | Foerfarande foer kontrollerad framstaellning av glukosaminoglykaner med laog molekylvikt | |
| US5008253A (en) | Sulfoamino derivatives of chondroitin sulfates of dermatan sulfate and of hyaluronic acid and their pharmacological properties | |
| US5013724A (en) | Process for the sulfation of glycosaminoglycans, the sulfated glycosaminoglycans and their biological applications | |
| EP0014184B2 (en) | Heparin fragments having a selective anticoagulation activity and process for their preparation | |
| DK173818B1 (da) | Heparinderivat | |
| US5767269A (en) | Processes for the preparation of low-affinity, low molecular weight heparins useful as antithrombotics | |
| US4496550A (en) | Oligosaccharides having selective anticoagulation activity | |
| FI103050B (fi) | Menetelmä N,O-sulfatoituja heparosaaneja sisältävän koostumuksen valmi stamiseksi | |
| JPS63278901A (ja) | 通常の構造の低分子量のヘパリンとその製法並びに生物学的な応用 | |
| JPH0629282B2 (ja) | 解重合及び超硫酸化ヘパリン、その製造方法並びに製薬組成物 | |
| NO304991B1 (no) | FremgangsmÕte for fremstilling av blandinger av sulfaterte polysakkarider | |
| US4783447A (en) | Process for producing natural heparan sulphate and dermatan sulphate in substantially pure form, and their pharmaceutical use | |
| KR20030040364A (ko) | 헤파린-유래 폴리사카라이드 혼합물, 이의 제조방법 및이를 함유하는 약학 조성물 | |
| EP0483733B1 (en) | Process for preparing epoxy-heparides, the products obtained and pharmaceutical compositions containing them | |
| Linhardt et al. | Low molecular weight dermatan sulfate as an antithrombotic agent structure-activity relationship studies | |
| US5110918A (en) | Process for preparing EDTA-free heparins, heparin fractions and fragments | |
| US20020010152A1 (en) | Composition consisting of heparin fractions having reproducible characteristics with average molecular weight equal to 5200d | |
| ES2244929T3 (es) | Procedimiento para la despolimerizacion fisica de glicosaminoglicanos y productos relacionados. | |
| Vijayabaskar et al. | Low-molecular weight molluscan glycosaminoglycan from bivalve Katelysia opima (Gmelin) | |
| Liverani et al. | Heparins: process-related physico-chemical and compositional characteristics, fingerprints and impurities | |
| US7605242B2 (en) | Process for the physical depolymerization of glycosaminoglycanes and products obtained therefrom | |
| Rice | A sequencing strategy for heparin | |
| ITPD980022A1 (it) | Composti n-solfatati dell'acido ialuronico e dei suoi derivati ad atti vita' anticoagualante e antitrombotica e processo per la preparazione | |
| ITMI930736A1 (it) | Derivato epossidico dell'eparano solfato |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM | Patent lapsed |
Owner name: MEDIOLANUM FARMACEUTICI S.P.A. Owner name: LABORATORI DERIVATI ORGANICI SPA |