PT85535B

PT85535B - Processo de preparacao de antibioticos a partir de myxococcus

Info

Publication number: PT85535B
Application number: PT85535A
Authority: PT
Inventors: Gerhard Hoefle; Hans Reichenbach; Wolfram Trowitzsch-Kienast; Klaus Gerth; Herbert Irschik; Rolf Jansen; Brigitte Kunze; Hermann Augustiniak; Norbert Bedorf; Heinrich Steinmetz
Original assignee: Biotechnolog Forschung Gmbh
Priority date: 1986-08-15
Filing date: 1987-08-13
Publication date: 1990-06-29
Also published as: DK423987A; EP0262085A1; PT85535A; JPS6349092A; AU605783B2; AU7687487A; IL83532A; AU6231690A; AU628643B2; US5023184A; IL83532A0; ZA876030B; DK423987D0; KR880003011A; NZ221442A

Description

PROCESSO DE PREPARAÇAO DE ANTIBIÓTICOS A PARTIR DE MYXOCOCCUS

em que

-I

R representa hidrogénio ou hidroxi.

R representa hidrogénio ou acilo e

A e B. independentemente um do outro, representam cada qual C=0 ou C-OH. e em que a linha ponteada representa uma ligação dupla C=C na posição da ligação intermédia quando A ou B representa C=0. ou na posição das duas ligações laterais quando A ou B representa C-OH. por fermentação de um novo microorganismo da especie Myxococcus xanthus.

Refere-se ainda ao microorganismo em si mesmo a preparações farmacêuticas que contem os novos compostos, e à utilização dos novos compostos como antibióticos e como agentes inibidores de tumores e para produção de preparações farmacêuticas.

invento diz respeito a novos alcaloides policiclicos possuindo propriedades antibióticas. a um processo para a preparação destes compostos mediante fermentação de um novo microorganismo da especie Myxococcus xanthus.ao proprio microrganismo, a preparações farmacêuticas contendo os novos compostos, e à utilização dos novos compostos como antibióticos e como agentes inibi dores da formaçao de tumores e para a produção de preparações farmacêuticas.

invento diz especialmente respeito a compostos de formula

CH3

(I) :h₃ em que

2

R representa hidrogénio ou hidroxi. R representa hidrogé nio ou acilo e A e B. independentemente um do outro, representam cada qual C=0 ou C-OH. e em que a linha ponteada representa uma ligaçao dupla C=C na posição de ligação do meio quando A ou B representa C=0. ou na posição das duas ligações das extremidades quando A ou B representa C-OH e a sais de tais compostos, em especial a sais farmaceuticamente aceitáveis.

Os compostos de fórmula I de acordo com o invento são aparentados dos compostos isolados de Streptomyces lavendulae. que são apelidados de saframicinas. Na Patente dos EUA no.4 248 863, por exemplo descreve-se a preparação por meio de fermentação das saframicinas A. B. C. D. e E. e na Patentes dos EUA No.4 372 947 descreve-se a preparação da saframicina S. A estrutura das saframicinas conhecidas é descrita por T. Arai, Antimicrobial Agents and Chemotherapy 28. 5 (1985). De acordo com esta publicação, os compostos de formula I de acordo com o invento diferem das saframicinas conhecidas pelo menos no radical alanilona cadeia lateral, em vez do qual, nas saframicinas conhecidas, se encontra o radical acilo de acido pirúvico ou outro radical acilo, e diferem também além disso, no significado do radical R e no grupo metoxi no núcleo biciclico. em que foi estabelecida uma ponte.

Derivados de saframicina com um radical alanilo na cadeia lateral são descritos no Pedido de Patente Europeia No.EP 173 649. mas diferem dos compostos de acordo com o invento no significado do radical R e por um grupo metoxi inexistente.

Os antibióticos Y-16482 e B que sao obtidos por fermentação de uma estirpe de pseudomonas Fluorescens.sao descritos no Pedido de patente Europeia No.EP 55 299 . Segundo Y. Ikeda et al J. Antibiotics 36, 1284 (1983). estes compostos também denominados soframicinas estão intimamente relacionados com as saframicinas e também portanto com os compostos de formula I de acordo com o inver[ to. Todavia, as safracinas diferem dos novos compostos quaii to ao significado de B (um dos composto/grupo Bé C-H) e pelo facto de nao existir um grupo metoxi no núcleo bicíclico em que se estabeleceu uma ponte.

Outros compostos aparentados podem ser isolados a partir do fungo Reniera sp. Estes compostos denominados renieramicinas por J ,M.Faulkner, J. Am. Chem. Soc. 104. 265 (1982) diferem dos compostos de formula I de acordo com o invento pelo menos na cadeia lateral, que. em vez de alanilaminometil. é (Z)-2-meti1-2-butenoi1 oximetil (um éster de acido angélico) nas renieramicinas.

A configuração nos centros quiral dos compostos de formula I de acordo com o invento nao é conhecida com absoluta certeza. Indicações quanto ãs configurações relativas nos vários centros quiral emergem^ contudo, do Nuclear Overhauser Effect. (efeito Overhauser Nuclear) nos espectros de resonância nuclear protónica e da análise da alanina libertada durante a hidrólise. Por analogia com a configuração absoluta conhecida, determinada por análise estrutural de raios-X, de saframicina C (T. Arai et al.. Tetrahedron Letters 1979,2355) e de saframicina A com bromo (I. Ueda et al _; Acta Cryst. C 40, 1578 (1984)). é de admitir que os compostos de acordo com o invento têm a seguinte estrutura especial, de acordo com a formula

Em compostos de fórmulas I e II,

2

R representa hidrogénio ou acilo. R é acilo, é, em especial. o grupo acilo um semiester de acido carboxílico ou acido carbonico com átomos de carbono em numero que pode ir ate vinte, por exemplo C₁-C₂₀-alcanoí lo, C₂-Cy-alcano_í lo substituído com hidroxi. oxo ou halogénio, aroílo ou -Cy-alcoxicarbonilo.

Cj-C₂g -alcanoílo é de preferencia CpC₇-alcanoilo. por exemplo formilo, acetilo, propionilo. n-butirilo. 2-metilpropioni lo . n-pentanoílo , 2,2-dimeti Ipropioni lo . 2-metilbutirilo . 3-metilbutiri lo ou n-hexanoilo. ou ^C8~^C20

-alcanoilo de mero par de átomos de carbono, por cadeia linear com um n£ exemplo n-octanoílo, n-decanoilo. n-dodecanoilo. n-tetradecanoílo, n-hexadecanoilo. n-octadecanoi lo ou n-icosanoí lo , C₂-C? -alcanoílo substituído com hidroxi. oxo ou halo. é. por exemplo, trifluo roacetilo. mono- di- ou tricloroacetilo. glicoloílo, gliceroilo. lactoílo. glioxiloilo ou piruvoilo, Aroílo é, por por exemplo, benzoilo ou 1- ou 2-naftoílo em que o anel fenilo ou naftilo pode estar substituído com nitro, amino, halogénio. por exemplo cloro ou bromo, hidroxi e/ou com C^-C^-alcoxi. por exemplo metoxi. por exemplo 4-nitrobenzoí lo. 3.5-dinitrobenzoilo . antraniloílo. 2,6-diclorobenzoilo saliciloilo. galoilo ou 2-. 3- ou 4-anisoílo, C^-Cy-alcoxicarbonilo é. por exemplo, metoxi- etoxi-, n-propoxi-, isopropoxi-. n-butoxi-. isobutoxi-, ou terc.-butoxicarboni_ lo.

radical R acilo preferido é C^-Cj -alcanoilo. em especial, acetilo. São preferidos os compostos de formula I em que R^ representa hidrogénio ou hidroxi. R representa hidrogénio. A repreesnte C=0, e B repreesnta C=0 ou C-OH e a linha ponteada tem o significado atras mencionado, e aos sais farmaceuticamente acej_ táveis de tais compostos.

São também preferidos os compos1 2 tos de formula I em que R representa hidroxi, R representa hidrogénio. A representa C-OH e B representa C-OH e a linha ponteada tem o significado atras mencionado, e também os compostos de formula I em que R repreesnta hidro xi. R repreesnta acetilo. A representa C=0 e B represen ta C=0 e a linha ponteada tem o significado atras mencionado. e aos sais farmaceuticamente aceitáveis destes compostos .

invento diz especialmente res1 peito a compostos de formula I em que R representa hidro2 genio ou hidroxi. R representa hidrogénio, A representa

C=0 e B repreesnta C-OH e a linha ponteada tem o significado atras mencionado, e aos sais farmaceuticamente aceitáveis de tais compostos.

No que se segue, os compostos de acordo com o invento são chamados saframicina Mx 1 (R =0H) e saframicina Mx 2(R =H). Sem qualquer referencia estes nomes indicam compostos de formula I em que A é C=0 e B e C-OH. Com a referencia BC (bis-quinona) estes nomes sao usados para compostos em que A representa C=0 e B representa C=0. A saframicina Mx 1 BHC(bis-hídroquinona)

2 e um composto de formula I em que R é OH. R é hidrogénio A é C-OH e B é C-OH. A referencia acilo indica compostos correspondentes em que R repreesnta acilo.

Os sais de compostos de formula

I de acordo com o invento são. em especial, sais de adição de ácidos não toxicos farmaceuticamente aceitáveis. São exemplos de sais de adição de acido com ácidos não tóxicos, fisiologicamente bem tolerados, sais com ácidos inorgânicos por exemplo ácido clorídrico. ácido sulfurico ou acido fosfó rico, ou com ácidos inorgânicos carboxi1icos, sulfónico ou sulfo. por exemplo, ácido formico. ácido acético, ácido propionico. ácido glicolico. acido succínico, ácido maleico. ácido hidroxilmaleico. ácido metilmaleico , ácido fumárico.acido málico. ácido tartãrico. ácido citrico, acido benzoico. acido cinâmico. ácido mandélico, acido sali cilico. acido 4-aminossalicilico.. ácido 2-fenoxibenzoico, ácido 2-caetoxibenzoico. acido embónico, ácido nicotínico ou isonicotinico e também aminoácidos. por exemplo -aminoácidos. bem como acido metanossulfónico, ácido etanossulfónico. acido 2-hidroxietanossulfonico. ácido etano-1,2dissulfonico . ácido.benzenossulfónico. ácido 4-metilbenzeno^ sulfonico ou acido naftaleno-2-sulfónico. ou com outros com postos orgânicos ácidos, tal como ácido ascórbico.

Para efeitos de isolamento ou purificação, é também possível usar sais que não sao farmaceuticamente adequados.

Os compostos de formula I são de acordo com o invento e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis possuem valiosas propriedades farmacológicas. Por exemplo, os compostos de fórmula I em que A representa C=0 sao eficazes, em concentrações baixas que vão de 0.004 yug/ml a 0.3 jug/ml. em relação a varias bactérias, por exemplo, em relaçao a Staphylocuccus aureus, Bacillus subti1 is. Micrococcus luteus e Escherichia coli. Para além de propriedades antibióticas, os compostos possuem também propriedades inibitórias da formação de tumores, por exemplo em relação aos tumores experimentais leucemia L 1210/S2. carcinoma pulmonar humano MBA 9812. adenocarcinoma do colon 26 e reticulosarcoma M5076.

Se murganhos com leucemia L 1210/ S2 forem tratados com injecções intraperitoneais de 2,5 ou 5 mg/kg de saframicina Mx2 durante quatro dias sucessivos, o seu tempo de vida é significativamente prolongado por um factor igual ou superior a 1.6. Se tratados com quatro injecções de 0.625. 1.25 ou 2.5 mg/kg de saframicina Mx 1, o seu tempo de vida é prolongado por um factor igual ou superior a 1.7. A saframicina Mx2 em 7 doses diárias intra peritoneais de 2.5 ou 5.0 mg/kg reduz significativamente o peso do carcinoma pulmonar humano MBA 9812, implantado experimentalmente em murganhos sem pelo balb/c, para um valor igual ou inferior a 62%. em comparação com animais náo tratados.

A dose única maxima tolerável de saframicina Mxl e Mx2 em murganhos é de 12,5 mg/kg e superior a 25 mg/kg. respectivamente.

invento diz também respeito a processos para a preparação de compostos de formula I. Compostos de formula I são produzidos fazendo crescer a estirpe Mx x48 da especie Myxococcus xanthus, ou um mutante obtido a partir desta que produza compostos de formula I, numa cultura contendo compostos de carbono e azoto e sais inorgânicos essenciais numa forma facilmente assimilável. a uma temperatura entre 15°C e 40°C e um pH entre 5 e 9. sob condiçoes aeróbicas . isolando os compostos de formula I resultantes e. caso tal seja desejado, convertendo um composto de formula I resultante num composto de formula I diferente e/ou convertendo um composto resultante num sal e/ou convertendo um sal resultante no composto livre ou num sal diferente.

invento diz também respeito ao microorganismo Myxococcus Xanthus. estirpe Mx x48. Foi isolada de uma amostra de terra do Oásis Gabis, na Tunísia e registada na National Collection of Industrial and Marine. Bactéria (Colecçao Nacional de Bactérias Industriais e Marinhas). Aberdeen. Escócia, sob o numero NCIB 12 268.

A estirpe Mx x48 tem a capacidade de dar origem espontâneamente a mutantes naturais que produzem compostos de formula I. Mutantes artificiais podem, por exemplo, ser produzidos quimicamente, por exemplo, medi ante tratamento com compostos que causam alquilação ou azotaçao. por exemplo N-meti1-N‘-nitro-N-nitrosoguanidina ou com um nitrito alcalino, tal como nitrito de sodio, ou -mediante irradiação, por exemplo com radiação de alta energic tal como radiacção ultravioleta. raios-X ou radioactividade 0 invento diz também respeito aos mutantes da estirpe Mx x48 que produzem compostos de formula I.

No processo de produção de compo£ tos de formula I. o microorganismo Myxococcus xanthus, estirpe Mx x48 é cultivado sob condições adequadas.

meio de cultura usado tem de conter uma fonte de carbono e azoto e também sais inorgânicos essenciais. São fontes de carbono e azoto aminoácidos. peptidos e proteinas e também os produtos da degradação destes., tal como peptona ou triptona e também extractos de carne, cereais pulverizados, por exemplo milho, ou trigo, leguminosas, em especial soja, farinha de peixe, sementes, por exemplo de algodoeiro, resíduos de destilação obtidos no processo de produção de álcool extracto de levedura, etc. Os sais inorgânicos essenciais existentes na solução nutritiva podem ser. por exemplo, cloretos carbonatos, sulfatos, fosfatos de metais alcalinos ou de metais alcalino-terrosos, por exemplo, sodio, potássio, magnésio e cálcio, e também sais de ferro, zinco, manganêsio molibdeno e cobre. A cultura é realizada de preferencia em meio liquido, especialmente em meio aquoso.

Um meio de cultura líquido adequado é. em especial. MD1 0.3% de peptona a partir de case£ na. digerida tripticamente; 0,05% de CaC^.ZI^O ;

0.2% de MgSO^,7H₂0). Outros meio de cultura líquidos adequados consistem, por exemplo, em 0,05% de peptona a partir de caseina. 0.05% de CaC^^F^O; 0.02% de MgSO^.71^0, a que podem ser adicionados, caso se deseje, 0,05% de proteína de célula única, licor de macerado de milho, extra£ to de levedura, hidrolisato de aminoácidos de caseína, ou proteína a partir de farinha de peixe.

A cultura faz-se a temperaturas

entre 15°C e 40°C. de preferencia a temperaturas entre 25°

C e 35°C. por exemplo, a cerca de 30°C. São valores de pH adequados aqueles que se situam entre 5 e 9, de preferên^ cia entre 6.5 e 8.5.

A cultura pode ser realizada em etapas, por exemplo mediante uma unica ou varias adições de solução nutritiva, ou pode ser realizada de modo contínuo- pela adição contínua de solução nutritiva. De preferência a cultura é realizada em varias etapas, como se segue: primeiro, produz-se uma pré-cultura por exemplo, num dos meios de cultura referidos (inoculum), o qual, apõs fermentação durante um ou dois dias, é usado para inocular uma cultura de maiores dimensões, por exemplo, numa diluição na proporção de 1:10 a 1:500. Esta cultura pode, por sua vez. apos fermentação durante dois ou três dias, ser usada para inocular uma cultura principal de dimensões ainda maiores, por exemplo numa diluição na proporção de 1:10 a 1 :1000.

A primeira pré-cultura pode também ser obtida mediante o cresciemnto durante vários dias da estirpe Mx x48 num meio de cultura solido ou líquido, por exemplo agar contendo um dos meios de cultura líquidos referidos. Sao meios de cultura adequados,, por exemplo, 1.5% de agar. 0.1% de Cac^^E^O. contendo 0,5% de fermento de padeiro ou 0.3% de peptona a partir de caseína e extrac to de levedura.

decurso da fermentação pode ser seguido analiticamente mediante a realização de amostragens durante a fermentação, por exemplo, mediante a medição do valor de pH da cultura que. durante a fermentação aumenta de cerca de pH 7.2 para cerca de pH 8,0 mediante

-13w

a medição da densidade optica que é uma medida do crescimento da estirpe, gravimetricamente, determinando o peso seco da biomassa formada, mediente cromatografia de camada fina, mediante cromatografia liquida de alta pressão e fase invertida ou mediante determinação da actividade antibiótica dos componentes contidos no filtrado da cultura. Por exemplo, o material sobrenadante da cultura isento de células. sob a forma nao diluída ou diluída, pode ser testado num teste de difusão de agar relativamente Staphylococcus aureus„ isolamento dos compostos de for mula I de acordo com o invento do licor de cultura é realizado de acordo com métodos em si mesmo conhecidos, tendo em conta as suas propriedades químicas, físicas e biológicas. Cromatografia de camada fina, por exemplo em gel de silica com clorèto de metileno/metanol, cromatografia de alta pressão, por exemplo em gel de silica de fase invertida e/ou a actividade relativamente a Staphylococcus aureus no teste de difusão em agar. podem ser usadas para determinar a concentração dos compostos de acordo com o invento nas etapas individuais do processo de isolamento.

Para isolar os compostos de acordo com o invento do licor de fermentação em bruto, este é agitado, de preferência durante varias horas, com resinas de adsorçao nao ionicas macroporosas, por exemplo, com resinas sintéticas possuindo uma estrutura bãsica aromática, por exemplo copolimeros de estireno/divinilbenzeno.

Tais resinas podem ser caracterizadas segundo varias parâmetros estatísticos usuais, por exemplo volume dos poros, área superficial especifica, volu

-14me medio dos poros, diâmetro de poros de maior frequência distribuição das dimensões dos poros, distribuição das dimensões das partículas, entre outros. Resinas de adsorçâo adequados têm poros com um volume entre cerca de 0,5 e cerca de 4.5 ml/g. entre cerca de 100 e uma área superficial especifica o

1000 m /g e um diâmetro médio dos poros entre cerca de 4 do . por exemplo. sob XAD-2. XAD-4.

e cerca de 130 nm. e existem no mercacomerciais AMBERLITE® XAD-1, os nossos

XAD-1180 e ER 180 de Rohm & Haas, DIAIOhP

HP-10. HP-20. HP-21 . HP-30. HP-40. HP-50, de Mitsubishi

DUOLITE®S-861 . S-862. S-863 e ES-866 de Dia-Prosium

IMA(®Syn 46 e Syn 72 de Akzo Chemie, KASTEL® S-111 , S-112, S-114 de Montedison. LEWATIT^OC. 1031 de Bayer e RELITE®

ADS de Resindion.

Após separação do licor de fermen taçao da resina de adsorção. por exemplo, mediante passagem por um crivo, esta é lavado com água e depois eluida com um solvente orgânico ou uma mistura de agua e um solvente orgânico que seja inerte em relação à resina de adsorção usada- por exemplo isopropanol. Os eluatos são. caso seja desejado, tratada um ácido orgânico ou inorgânico, e concentrados no vacuo.

E também possível processar a mistura de fermentação de um modo convencional. 0 licor de cultura é. com este fim em vista, separado da biomassa de um modo usual, por exemplo mediante filtração ou centrifugação, e o filtrado da cultura é extraído com um solvente orgânico que não é miscivel oué apenas levemente miscivel com agua, por exemplo cloreto de metileno, cloroformio ou. de preferencua- acetato de etilo. A concentração mediante evaporação no vacuo dá origem a um extracto em bruto. Dividindo o extracto em bruto entre as duas fases

-15de um sistema consistindo em dois solventes orgânicas imisciveis. por exemplo metanol/heptano, os produtos de fermentação. em especial os compostos de formula I de acordo com o invento, acumulam-se na fase polar.

Os extractos em bruto são purificados de preferencia por métodos cromatográficos, por exemplo mediante cromatografia numa substancia de permuta ionica possuindo grupos funcionais acidicos, por exemplo, numa substancia de permuta ionica possuindo grupos carboxi mediante cromatografia de adsorção de/ou partiçãp e/ou cromatografia liquida de alta presão em superfícies não pola_ res. por exemplo em gel de silica contendo grupos alquilo em longas cadeias (fase invertida)(reversed phase) ou em agarose com grupos alquilo ou fenilo ( interacção hidro fóbica (hydrophobic interaction). São também adequados outros métodos cromatograficos por exemplo, cromatografia de afinidade, cromatografia liquida de pressão rápida, (fast pressure liquid chromatography) e também distribuição contracorrente por exemplo cromatografia contracorrente de goticulas (droplet countercurrent chromatography) ou cromatografia contracorrente rotacional (rotational locular countercurrent chromatography).

São veículos adequados para cromatografia de permuta ionica polímeros orgânicos, por exemplo agarose de ligações cruzadas- dextrano. poliacrílamida, copolimero de estireno/diviniIbenzeno ou celulose. De prefe rência. um tal material possui grupos funcionais levemente acidicos. por exemplo grupos carboxi. São substancias de permuta ionica preferidas os veículos de dextrano de ligações cruzadas contendo radicais carboxialquilo, por exemplo, radicais carboximetilo. tais como os que existem no mercado sob o nome comercial de CM-Sephadex .

Um material de permuta ionica pos suindo grupos carboxi é pré-tratado numa solução tampão aquosa adequada, por exemplo uma adsorção tampão com um pH entre 5 e 7. por exemplo tampão fosfato pH5. Depois são adicionados os extractos em bruto contendo os compostos de acordo com o invento, por exemplo mediante colocação destes extractos numa coluna contendo o material de permuta ionica pre-tratado. As substâncias e impurezas que se seguem nao tivessem ligado sao extraídas mediante lavagem da coluna de permuta ionica com solução tampão, caso seja necessário sob pressão, e as saframicinas sào eluidos da coluna usando soluções tampao que contêm uma concentração crescente de sal. por exemplo, tampao fosfato de pH 5 contendo concentra ções crescentes de cloreto de sodio. A cromatografia de permuta ionica descrita pode, caso seja desejado, ser também realizada em colunas adequadas para cromatografia liqui da de alta pressão.

São veículos adequados para croma tografia de adsorçao e partição, por exemplo, polímeros orgânicos. por exemplo agarose. dextrano ou celulose com ligaçao cruzadas. Os dextranos com ligações cruzadas que podem possuir grupos funcionais adequados, por exemplo grupos hidroxialquilo. sao preferidos para a purificação dos safra micinas por meio de cromatografia de adsorção e partição. E especialmente preferido um dextrano com ligações cruzadas que possui grupos hidroxipropilo e que existe no mercado sob o nome de comercial de Sephadex^LH-20.

De preferencia, os extractos pré-purificados mediante cromatografia de permuta ionica são introduzidos numa coluna contendo um veiculo que possui grupos hidroxipropilo e eluidos com misturas de solventes

orgânicos de composição constante ou variavel. São usados de preferencia metanol ou misturas de metanol com um outro solvente orgânico de baixa polaridade, por exmeplo cloreto de metileno. com a adição de um ácido orgânico, por exemplo acido formico ou acético, por exemplo uma mistura de metanol/ cloreto de metileno contendo aproximadamente 0,1% de ãcido acético. Tal como acontecia na cromatografia de permuta ionica. também a cromatografia de adsorção e partição pode ser realizada em colunas, adequadas para cromatografia liquida de alta pressão.

Para separar os compostos de formula I. extractos pré^spurifiçados mediante cromatografia de permuta ionica e/ou cromatografia de adsorção são submetidos de preferencia a uma cromatografia liquida de alta pressão numa superfície não-polar, a chamada cromatografia de 'fase invertida. 0 veiculo usado é de preferencia um veiculo baseado em gel de silica possuindo grupos alquilo em longas cadeias, por exemplo grupos alquilo com 14 a 22 átomos de carbono, por exemplo 18 átomos de carbono.

Tais veículos podem ser obtidos (ff) (õ) no mercado sob nomes comerciais HD-Si b-⁷ 18-10-60 , Nucleosir^⁷C-18. Bio-Sil® 0DS-10 ou Hi-Pore® RP-318. A mistura de saframicinas a ser tratada é introduzida numa coluna de cro matografia liquida de alta pressão e a fase invertida e processada em soluções organicas aquosas contendo acido, por exemplo em misturas de agua com metanol, acetonitrilo ou tetrahidrofurano contendo um acido orgânico sulfónico, por exemplo ácido heptanossulfónico. ácido trifluoroacetico ou um acido inorgânico fraco, por exemplo fosfato de dihidrogenio. Preferem-se as misturas metanol/água com a adição de tampao fosfato pH 6.5.

A purificação dos extractos em bruto pode também ser levada a cabo mediante cromatografia de distribuição contracorrente. por exemplo mediante croma tografia contra-corrente de goticulas. São fases aquosas adequadas soluções tampao levemente acidas, por exemplo soluçoes tampao de pH entre 4 e 7. de preferencia fosfato pH 5. A fase organica usada é. por exemplo, um clorohidrocarboneto. por exemplo cloroformio ou cloreto de metileno, com o qual se mistura, caso seja desejado, um alcanol inferi or. por exemplo n-butanol. iso- ou n-propanol, ou metanol, de preferencia uma mistura de cloreto de metileno e isopropanol .

Um composto de formula I é convertido num composto de formula I diferente por métodos que são em si mesmo conhecidos, por exemplo mediante oxidação redução ou acilaçao.

A conversão de uma hidroquinona (A e/ou B representam C-OH) na quinona correspondente (A e/ ou B representam C=0) por oxidação e a conversão de uma quinona numa hidroquinona por redução, pode ser realizada por exemplo, de modo analogo aos processos que são descritos em Methoden der Organischen Chemie (Houben-Wey1), 4th edition. volume VII/3a.(Métodos de Química Organica), Thie me Verlag. Estugarda 1977. São agentes suaves de oxidação adequados, por exemplo, sais de metais e oxidos de metais, por exemplo oxido de prata (I) em eter dietilico, benzeno ou tolueno na presença de um agente secante, por exemplo sulfato de sodio. sais de ferro (III). tal como cloreto de ferro· (III) em água ou etanol aquoso, sais de cobre ou sais de talio. por exemplo trifluoroacetato de talio (III). Um outro agente de oxidaçao adequado é o oxigénio atmosférico

numa solução neutra, por exemplo, numa solução tampão de pH entre 7 e 8. São agentes de redução adequados, por exemplo. hidrogénio na presença de catalisadores heterogéneos, por exemplo, oxido de platina ou paládio sobre carbono, ou catalisadores homogéneos, por exemplo cloreto de tris(trife nilfosfina) ródio (I). e também hidretos metálicos, por exemplo borohidretos. tal como borohidreto de sodio ou hidr£ tos de aluminio. tal como hidreto de alumínio e litio, sais redutores, por exemplo ditionito de sodio. e também luz na presença de um dador de hidrogénio, por exemplo, a luz ambiente e metanol. A conversão de quinonas e hidroquinonas umas nas outras pode também realizar-se por métodos electro químicos, por exemplo electrólise em soluções salinas levemen te ácidas, por exemplo soluções tampão de pH entre 4 e 6.

A acilação de um composto de for2 mula I em que R representa hidrogénio é levada a cabo de acordo com métodos em si mesmo conhecidos, por exemplo, com um acido da formulaR -OH ou com um derivado funcional reactivo desse ácido.

Quando se usa um ácido carboxilico livre para a acilaçáo. a reacção tem vulgarmente lugar na presença de um agente de condensação adequado, por exemplo, uma carbodiimida. por exemplo diciclohexil- ou, de preferencia. N-eti1-N’-3-dimetilaminopropilcarbodiimida. A condensação é realizada numa mistura solvente organica aquosa ou num tampão aquoso com um pH proximo da neutralidade, por exemplo, entre 6 e 8. facultativamente com arrefecimen_ to ou aquecimento e numa atmosfera de gás inerte, por exemplo sob azoto.

Um derivado funcional reactivo de um acido carboxilico ou de um semi-éster de acido carbónico

é um anidrido correspondente. por exemplo um anidrido simétrico. por exemplo anidrido acético, um anidrido misto do ácido R -OH. com um ácido inorgânico ou orgânico, por exemplo. com um ácido halidrico. tal como ácido clorídrico ou ácido bromídrico. isto é. por exemplo, um cloreto de ou bro meto de acido carboxilico. ou um éster de acido clorofórmio, ou um anidrido misto de um ácido carboxilico com um semiéster de acido carbónico, por exemplo, o semiéster etílico ou iso butilico de acido carbónico. Um outro derivado funcional reactivo de um acido carboxilico ou de um semiéster de ácido carbónico é. por exemplo, um éster activado, por exem pio um N-hidroxiéster. tal como o éster com N-hidroxipiperidina. N-hidroxisuccinimida. N-hidroxiftalimida ou 1-hidroxibenzatriazole.

As reacções de acilação com deri2 vados funcionais reactivos de R -OH sao realizadas de preferencia em misturas solventes organicas aquosas funcionais/homogeneas ou de duas fases, caso seja desejado, com arrefecimento ou aquecimento ligeiro, por exemplo, numa gama de temperaturas entre cerca de 0°C e cerca de 40°C, de preferência a uma temperatura próxima da temperatura amabiente. e. facultativamente, numa atmosfera de gás inerte, por exemplo sob azoto. Neste caso adiciona-se um aceitador de acido, por exemplo uma base orgânica adequada, por exemplo. uma amina. por exemplo trimetilamina, trietilamina, N-metilmorfolina. 1 .5-diazabiciclo /“4.3.07non-5-eno , .8-diazab1cic1 o/“5_4.07undec-7-eno ou piridina, ou uma base inorgânica, por exemplo um hidroxido de metal alcalino ou de metal alcalino terroso, por exemplo hidroxido de sodio. potássio ou cálcio, um carbonato de metal alcalino, ou de metal alcalino-terroso, por exemplo carbonato de sodio, hidrogenocarbonato de sodio ou carbonato de cálcio, ou um fosfato de metal alcalino, por exemplo fosfato ou hidrogenofosfato de sodio ou potássio. De preferencia, a reacção

-21de acilaçao é realizada num tampão aquoso com um valor de pH proximo da neutralidade, por exemplo, entre 6 e 8,assumin do a base do tampão o papel de aceitador de acido. Para inibir a acilação de um grupo hidroxi fenolico A e/ou B e, onde tal for aplicavel. de um grupo hidroxi R , por exemplo, ul álcool, por exemplo metanol ou etanol, é adicionado ã mistura solvente orgânica aquosa.

Sais de compostos de formula I podem ser preparados de um modo em si mesmo conhecido, por exemplo fazendo eragir o composto livre com, de prefe rência. quantidades estequiométricas ou um pequeno excesso de acido que dá origem a formação de um sal de adição de ácido.

Os sais podem ser convertidos nos compostos livres de modo usual, por exemplo, mediante tratamento com uma quantidade equimolar de uma base livre, por exemplo um hidroxido. tal como um hidroxido alcalino, por exemplo hidroxido de lítio. potássio ou sodio, um hidróxido alcalino-terroso. por exemplo hidroxido de cálcio ou hidroxido de magnésio ou um hidroxido de amonio, por exemplo, hidroxido de amonio não substituído ou hidroxido de benziltrimetilamonio. ou uma amina organica terciária, por exemplo trietilamina. Deve notar-se, todavia, que o composto livre de formula I tem apenas uma limitada estabilidade e. para efeitos de armazenamento, tem de ser convertido num sal de adição de acido.

Os sais de compostos de formula I sao convertidos noutros sais de um modo em si mesmo conhecido. De preferencia, a conversão de sais noutros sais é realizada com materiais de permuta ionica que são

carregados com o anião desejado, ou mediante cromatografia de adsorçáo num solvente que contem o ácido do sal de adição de acido desejado em excesso.

invento diz também respeito às execuções do processo em que um extracto obtido em qualquer etapa do isolamento é usado como material de par- . tida e as restantes etapas são levadas a cabo, o processo é interrompido em qualquer etapa e/ou um composto obtido de acordo com o processo com o invento é ainda adicionalmente processado in situ.

Os compostos do presente invento e os seus sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser usados por exemplo, para a produção de preparações farmacêuticas que contêm uma quantidade eficaz do ingrediente activo de preferencia misturado com uma quantidade significativa de veículos farmaceuticamente aceitáveis, inorgânicos e /ou orgânicos, solidos ou líquidos. 0 presente invento diz também respeito a preparações farmacêuticas â sua produção e uso.

As preparações farmacêuticas de a cordo com o invento sao adequados para administração oral, ou. de preferencia parenterica. por exemplo intravenosa, intramuscular ou tópica.

Por exemplo, os ingredientes actj. vos de formula I do presente invento são usadas sob a forma de preparações ou soluções de infusão que podem ser admi nistradas por via intravenosa, intramuscular, intradérmica, ou subcutânea.

Tais soluções são, de preferencia soluções ou suspensões aquosas isotónicas que podem ser preparadas antes da sua utilização, por exemplo, a partir de preparações liofilizadas contendo apenas o ingrediente activo ou o ingrediente activo juntamente com um veiculo, por exemplo dextrano. manitol ou albumina. As preparações farmacêuticas para utilização oral podem ser. caso se deseje, ser esterilizadas, e podem conter adjuvantes, por exemplo conservantes, estabi1izantes. agentes molhantes e/ou emulsio^ nantes. agentes de solubi1izaçâo. sais para a regulação da pressão osmótica e/ou soluções tampão. São também adequa_ das as suspensões oleosas parainjecção. nas quais solventes ou veículos lipofilicos. por exemplo, óleos gordos, por exemplo, oleo de sésamo, triglicéridos, ou ésteres de ácidos gordos sintéticos, por exemplo oleato de etilo, são usados como veículos.

As preparações farmacêuticas injectáveis que. caso seja desejado, podem conter outras subs_ tâncias farmacologicamente valiosas, por exemplo outros iii gredientes activos. contêm entre cerca de 0,1% a 100%, em especial entre 1% e 50%. e. no caso de 1iofi1izatos, até 100%. do ingrediente activo.

Sáo veículos adequados para preparações orais, por exemplo drageias. comprimidos, ou comprimidos revestidos com laca. em especial agentes de ench£ mento, tal como açucares, por exemplo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol. preparações de celulose e/ou fosfatos de cálcio, por exemplo fosfato de tricálcio ou hidrogenofos^ fato de cálcio, agentes ligantes. tal como pastas de amido, a base de. por exemplo, amido de milho trigo, arroz ou batata. gelatina, metilcelulose . hidroxipropilmetilcelulose ,

hidroxipropilcelulose- e/ou polivinilpirrolidona e/ou, caso seja desejado, agentes de desintegração, tal como os amidos atras referidos, e também carboximetilamido, polivinij_ pirrolidona com ligações cruzadas, agar. acido algínico ou um seu sal. tal como alginato de sodio, ou carboximetiH celulose de baixo peso molecular. São adjuvantes em especial os agentes de regulação do fluxo e os lubrificantes, por exemplo, silica. talco, acido esteárico, ou seus sais, tal como estearato de magnésio ou cálcio, e/ou polietílenoglicol.

Os núcleos das drageias são proviadas de revestimentos que podem ser resistentes aos sucos gástricos. Outras preparações farmacêuticas administrá veis oralmente sáo as cápsulas cheias d seco, de gelatina, e capsula moles seladas, de gelatina e um agente plastificante. tal como glicerina ou sorbitol. São preparações farmacêuticas administráveis por via rectal adequadas, por exemplo, supositórios que consistem numa condição/combinaçao do ingrediente activo com um material de base para supositórios .

As preparações administráveis por via oral e rectal contêm cerca de 0.1% e cerca de 50%. em especial entre cerca de 1% e cerca de 10% do ingre diente activo e. caso seja desejado, outros compostos farmacologicamente valiosos.

As preparações farmacêuticas para utilização tópica sao. em especial, os cremes, geles, unguentos, pastas, espumas, tinturas e soluções que contêm entre cerca de 0.05% e cerca de 10%. em especial entre cerca de 0.5% e cerca de 5% do ingrediente activo.

As preparações farmacêuticas sao produzidas de um modo em si mesmo conhecido, por exemplo mediante processo de, dissolução, suspensão, mistura ou liofilizaçao convencionais descritos na farmacopeia.

invento diz também respeito â utilização dos compostos de formula I ou de seus sais como medicamentos, por exemplo sob a forma de preparações farmacêuticas para o tratamento de infecções de origem bacteriana causadas por bactérias gram-positivas e para o tratamento de tumores, especialmente tumores pulmonares e gastro-intes tinais e leucemia, em animais de sangue quente, por exemplo em seres humanos e outros mamíferos, mediante a administração por via entérica, por exemplo oral, de preferencia parenterica. de doses terapeuticamente eficazes.

De acordo com a especie, idade, estado individual, gravidade da doença e método de administração as doses diárias entre cerca de 0.01 mg e cerca de 10 mg. em especial entre cerca de 0.1 mg e cerca de 1 mg, por quilograma de peso corpóreo, de acordo com aquilo que o médico que reecitou o tratamento achar conveniente.

Os exemplos que se seguem ilustram o invento, nao pretendendo todavia limitar de modo algum o seu âmbito.

Exemplo 1

Bactéria Myxococcus xanthus Mx x48

a) Origem e disponibi1 idade da estirpe usada no processo de produção

A bactéria Myxococcus xanthus, estirpe Mx x48 da família Myxococcaceae da ordem Myxobacterales foi isolada em Maio de 1980 de uma amostra de solo do Oásis Gabes, na Tunísia. A estirpe MxX48 foi depositada na National Collection of Industrial and Marine Bactéria (Colecçào Nacional de Bactérias Industriais e Marinhas), Aberdeen. Escócia, em 26 de Maio de 1986. sob o no.NCIB 12 268 para efeitos de acordo de patente com o tratado de Budapeste.

b) Descrição da estirpe usada no processo de produção

Pequenos bastonetes vegetativos, cilíndricos, com as extremidades abruptamente afiladas, com forma de charuto. 0.8 χ 3.5- 5um. movem-se sobre superfícies de um modo que é um misto de rastejar e deslizar. Em meios adequados, por exemplo VY/2-agar (ver adiante), o organismo forma na superfície de agar corpos multiplicantes (fruiting bodies). com 50-150 um de diâmetro, sob a forma de gotas, vesículas ou capítulos moles e pegajosos com uma cor que pode ir do vermelho alaranjado intenso até ao azul acinzentado. No interior destes existem myxoesporos esfericos 1.8-1.9 um. em diâmetro, que refractam fortemente

-27a luz. As colónias tendem a espalhar-se como enxames flu tuantes sobre a superfície de agar. podendo atingir dimensões de vários centímetros. Nalguns meios, têm uma cor que pode ir de amarelo esverdeado intenso ao laranja.

c) Condições de Cultura organismo desenvolve-se bem em agar de peptona. por exemplo CY-agar (0,3% de Casitone /~Difco70.1% de extracto de levedura /Difco? 0,1% de CaCl₂.2H₂0. 1.5% de agar. pH 7.2).. ou em agar de levedura por exemplo. VY/2 agar (0.5% de levedura de padeiro, com base no peso quando fresca 0.1% de CaCl₂.2H₂0, 1,5% de agar pH 7.2). Em meios líquidos Mx X48 cresce em suspensões celulares homogéneas tanto em frascos mantidos sob agitação ( a 160 revoluções/mim. aproximadamente) como em bioreactores. Um meio de cultura adequado é. por exemplo MD1 1 .m. 0.3% de peptona a partir de caseína, digerida tripticamente (Merck. Damstadt7 0.2% de MgS0₄.7H₂0. 0,05% de CaCl₂.2H₂0, pH 7.2). A estirpe Mx X48 é estritamente aeróbica.

Todas as culturas são mantidas a

30°C. 0 tempo necessário para o aparecimento de uma nova ge ração em MD1 l.um.é de aproximadamente 6.5 horas (u =0,15 por hora). A densidade optica máxima conseguida (623 um, distancia percorrida pela radiação na célula a 1cm) situa-se entre 1.3 e 1.5. A concentração da peptona a partir da caseína pode também ser aumentada, por exemplo, pa. ra 0.5 ou 1%. 0 tempo necessário para o aparecimento de uma nova geração não varia neste caso. mas. em contrapartida a densidade optica aumenta para aproximadamente 2 ou 3,5

28respectivamente. A medida que aumenta a concentração de peptona. todavia, a produção de antibiótico relativamente ã produção em MD1 1.m. Sao também meios de cultura adequados para o crescimento da estirpe com a formação de antibióticos. os seguintes: 0.05% de casitona, 0,2% de MgS0₄-7H₂0 e 0.05% de CaCl₂-2H₂0. pH 7,2, contendo ou 0.5% de Probion S (proteína de célula única Hoechst) ou 0,5% de licor de macerado de milho ou 0,5% de Protaminal (concentrado de proteínas de peixe. Asta) ou 0,5% de extracto de levedura ou 0.3% de ácidos de casamino (Difco).

d) Possíveis métodos de conservação

1. Mediante congelamento de células vegetativas de culturas em pratos ou líquidos numa solução de peptona a -80°C (viável durante vários anos) 2. Mediante secagem dos corpos multiplicantes (fruiting bodies) sobre papel de filtro (viável durante vários anos à temperatura ambiente). 3 Mediante secagem dos corpos multiplicantes (fruiting bodies) em leite, e armazenamento sob azoto â temperatura ambiente em ampolas seladas ao calor (viável durante vários anos). 4. Mediante suspensão de células vegetativas de culturas em pratos ou líquidas em solução de peptona e congelamento em azoto liquido (viável durante vários anos ).

Exemplo 2

Preparaçao de material sobrenadante celular com actividade antibiótica

a) Condições de Produção:

E possível detectar a actividade contra Staph. aureus no final de fase de crescimento logarítmico (densidade óptica 0.9-1). usando o teste de difusão de agar em frascos agitados. A actividade mais intensa é obtida no inicio da fase estacionaria. 0 pH da cultura é. nessa altura, de cerca de 8. e após incubação aumenta para cerca de 8.5 sem que a densidade optica aumente mais. No final da fase estacionaria, em contrapartida, as células acumulam-se e ocorre o fenomeno de lise celular. A actividade antibiótica volta neste caso a decrescer.

b) Produção num aparelho de fermentação

1. Pré-cultura: 50 ml de MD1 1.m. são inoculados com 0,5 ml e mantidos a 30°C e 160 revoluções/min durante 2 dias.

2. Pré-fermentaçao: um bioreactor de 25 litros, produzido por Braun. Melsungen e possuindo um sistema de pâs para agitação, é cheio com meio MD1 1.m. e inoculado com a pré-cultura (no.1). A temperatura é mantida a 30°C. A velo-30-

cidade de rotação do agitador é de 200 revoluções/mim e o arejamento de 0.1 Nm /h. Sem quaisquer outras alterações a fermentação efectua-se ao longo de um período de 66 horas.

Após este intervalo de tempo obtém-se uma densidade óptica (623 nm) de 1-1 e um pH de 7.9.

3. Fermentação Principal: um bioreactor com uma capacidade de 700 litros, produzido por Giovanola. Monthey, Switzerland Suiça e possuindo um sistema de pas para agitação é cheio com meio MD1 1.m. Após inoculação com o produto de pré-fermentação (n^s.2) . são regulados uma velocidade de rotação de 150 revoluções/mim e um arejamento de 1 Nm /h. Aumentando o arejamento e a velocidade de rotação mantem-se a pressão parcial de oxigénio acima de 60% do valor de satu_ raçao no decorrer do processo de cultura. Após 50 horas obtem-se uma densidade optica de 1 .3 e um pH de 8. 0 materj_ al sobrenadante da cultura contém agora o antibiótico. No teste de difusão em agar contra Staph. aureus , uma aureóla de inibição (aproximadamente 7 mm de diâmetro) que está no limite da visibilidade, é obtida quando o sobrenadante da cultura é diluído na proporção 1:64.

Exemplo 3

Isolamento e Purificação das Saframicínas

a) Processamento de uma fermentação de 700 litros

Quando termina a fermentação do

Exemplo 2b). 4.0 litros de resina XAD, ER-180^(comercializada por Ròhm & Haas) são introduzidas no licor de cultura. A mistura e agitada lentamente durante 5 horas. A resina é separada das células em que não há antibiótico e do meio usando um crivo. E transferida para uma coluna de cromatografia e eluida de uma so vez com 12 litros ( 1 litro/hora/ de isopropanol. Mais de 90% do complexo antibiótico é eluj^ do com os primeiros 6 litros de isopropanol. Adiciona-se imediatamente 0.1% (v/v) de acido acético Tas fracções contendo saframicinas e o todo é concentrado num evaporador rotativo em frascos de vidro castanho. - Ó extracto de XAD concentrado pesa 72 g.

As saframicinas MX1 e MX2 são derivados de hidroquinona/quinona básicos, sensíveis- â luz e à oxidação, que sao estáveis apenas a valores de pH inferiores a 7. A purificação é por isso realizada de modo substancial, com a exclusão de luz e a valores de pH proximo' de 5. 0 armazenamento temporário das fracções contendo a substancia faz-se em recipientes de vidro castanho,e o arma_ zenamento a longo prazo faz-se a -70°C.

b) Purificação das saframicinas extracto em bruto é dissolvido em 300 ml de tampao fosfato pH 5 0.07M e introduzido numa coluna aberta cheia com! litro de CM-Sephadex^-⁷ C-25 inchado. comercializado por Pharmacia em tampão fosfato pH 5 0.07 M. Em primeiro lugar, qualquer material que não tenha sido adsorvido é eluido com 2 litros de tampão fosfato. Numa outra etapa, o material fracamente adsorvido é retirado por lavagem com 1 litro de tampão fosfato pH 5

0.07Μ/ cloreto de sodio 0.2M. 0 complexo antibiótico é eluído da coluna completamente usando 2 litros de tampão fosfato pH5 0.07M/NaCI 0.5M. sendo visível a migração de uma banda amarelada. Após concentração do eluato e extracção repetida do resíduo com etanol. obtem-se aproximadamente

2.5 g de material altamente activo. Este contem ainda resíduos do sal fosfato.

Para remoção do sal realiza-se cromatografia numa coluna de Sephade^® LH-20 com metanol e 1% de acido form ico ou acido acético como eluente, sendo o fosfato substituido por formato ou acetato, respectivamente. Impurezas basicas ainda existentes no eluato, tal como 2-feniletilamina e 2-(4-hidroxifenil )-etilamina sao eliminadas por cromatografia em Sephadex® LH-20 com diclorometano/metanol 1:1/1% de acido formico ou acido acético. Obtem-se 700 mg de um produto que. de acordo com uma analise com base em cromatografia liquida de alta pressão (Nucleosi 1® C-18. 7.5 um. metanol/água 60:40/ácido hept£ nossulfónico 0-005M)contem como produtos principais as duas saframicinas Mx1 e Mx2. e também os derivados de bis-quinona saframicina Mx1BC e Mx2 BC e o derivado de bis-hidroquinona Mx1 BHC.

c) Separaçao das saframicinas

A mistura de saframicina é separ^ da por meio de cromatografia liquida de alta pressão em HD-Sil® 18-10-60(comercializaçãò por Organogen, 25cm χ 16mm) com metanol/água 1:1/0.5% de tampão formato de trietilamonio pH 6.0.. com um fluxo de 25 ml/min. Mx1 é eluida após 6,4 minutos e Mx2 após 9.2 minutos.

-33Ambas as substancias são obtidas sob a forma de oleos castanho-avermelhadas viscosos. 0 componente secundaria Mx1 BHC é eluído antes de Mx1, e os componentes secundários Mx1BC e Mx2BC são eluidos por esta ordem depois de Mx2.

í-	CM	o	l£>	LO
4-		CM	00	CO
ctí	X	·-	·*
CO	s:	O O	O	o

X Ο

II <ϋ τ— C QÍ

ω 05 C
das Saframici	CM
Ο	X
rG	2E
Ο 05	Φ
Ν •t—I	T~
ίφ	X
+J	Σ
cj ro	ÍU
$-	c
tu	•i—l
O	o
	•i—4 E
=4-	05
o	S_ 4-
—1	05
CL	00
s:
LU X
LU

o	ç—		00		Γχ.
• r—4		4-		CM	=4^-	CD
E	X	Qí		-»	—	—
<Ú	s:		o	O	o	O
i-		m
4-		Φ
<u		í-
co		o
		r—4
		05
		>>

		<	o
		Z	l—	• ·
		Η-1	•r—4	σ>
		Ll.	+J
			Φ	X		• ·
		<		O		=4^-
		α	Φ	oo
		<C	X>	X		O
		s:		O		CM
		<c	O	\		X
		o	-p	CM		—
			rc	·——1	ZE	X
		s:	P	O	O	o
		LU	Φ	CM	00	00
			CJ	ZE	X	X
		O	05	O	O	o
		<
		CJ»
		1—1	<·			CZ5
		X	LO			O
		—1	(XI			=—
		LU				1
						co
		s:	Ll.			•7—
		o	o			O
		o	CD
						r—1
		o	<U			•i—4
		1—	CJ			00
		z	•r-<
		LU	>- -ί			o
		s:	•f—1			c
		<	co			cú
		ι-				2:
		οί	Φ
		o	o			co
		CL				V—
		s:	r—1			1
		o	Φ			CL.
		o	CD			cm

Ξ £Z	1^.
	=4				cn
	lo			•	<_
CU	CM			cz	oo
4->	ε-			♦ r·“4	*—'
Φ	Ο			E	E
«“—4	>				c
O •i—H >	•rH >			C0 00	oo
1	O			—	r^.
O	!-----1			co	CM
XZ	Φ
i 1	í-
Φ	<u
e	E
S-	Π5				= *
φ	• ·				LO
>					α
	1—(				c
tu	1—1 1—<				00
C	—			¹	'—'
•r—<				s=
í-	O			•1—4	E
X	í-			E	c
•f—4	S-
XZ	Φ
c	4-
• i-H				cn
	Φ			—
	x				00
V)	o
05	4->				CM
c	Φ
• i—4	ί-		o
o	Ο		co
•i—4	r~ —j		a
E 05	CJ		1 o		X
S-	<u		V—		o
M-	c		1		oo
05	• i—4		co		X
(/)	E 05				CJ
ω	t· -t
ro	‘r—4		> 1		E
	X		♦1—4		Φ
co	o		co I
co	s-
_Q	X				CM
Ξ	•i—4		o
CO	xz		X	ZE
				00	II
(O				o	o
S- 05	o ΤΊ		s:	to
CL	cu		LU	lo
	xz			T“	'—'
rú	i—1		CL	X
CJ -p	Φ E S-		< —1	CJ
c	Φ	(0	CJ		CD
Φ	>	·>—4		s:	O
Ό	tu	cj	LU	LO	i 1
♦f-H		c	O	o	>___z
	o	<Φ
U_	x	CJ		co
CJ	c	(Ό	O		X
CJ	ca	Φ	c	o	rU
	+->	ί-	CJ»	—	E
E Φ	ω <u CJ	ο X f—f	z LU	CM	Á
Ι-		4—	1—	00
Ο	*		IXl		>
CJ		Φ	Qí		x
	4-	XI		O	\|
Φ x	4— ίΟ	O cO	LU O	CM X	o cc
o	XI	CJ»			H
tu	c	c	O	X	CJ
CJ»	Φ	•f—4	Cl.	o	LU
CJ tu	σ> (U	Φ -P	S	oo	CL
Φ	ί-	X	LU	X	co,
Qí	α	Φ	1—	CJ	LU,

Ο C0

ROTACÇAO OPTICA /_~ot I -70,7°

CM

H	h	CM
			mj	r—	r—
			in	kO	r—
	πα		mo	M¹
(ϋ				r—	H
£=	II	o			σ»
•rH		o			LA
Φ	r—	σι		-	*—
• r—I	Pí	CM	r	x:
E			to	to
no		·»		·—*	π
s_	CM	o	o	cn	kO
q-		o	00	CN	cn
nO	X	CM	MO	kO	CN
<Λ	s	cn	r—·		r—

	x:
	PC		ω
	o	H		K	•
05		o	σι	O	00
C	II	o		O	in
•1—<		00	kD	cn	*-
o		CM	r—	Γ-	Γ-
•i—i
E		K	H	Η	Η
<σ	r—	O	Γ-	O	k£>
í-		O	ΙΑ	IA	cn
q-	X	CM	kO	5f	CN
<σ	s	cn		»—
1/0

ro

K I o I s, oo MO m

EXEMPLO 4 (cont) dP dP

o	M·
		Γ-	00
		Ι'- — MO 00	ta 00
		o Z	2
		T M> o	o
		MO	Γ-
		·—	ta
	O C\1	— MO	MO
as 1	nz	r—	M
	o te
£	•
	o	Z O	MO
cn	•P <0	CM CM	cn
MO	E	r-
in	í-	ffi MO	MO
O	o m	in
Φ	q-	cn
\	o c	ο o	U
e	o
	E	dP	dP

	Γ—	MO
		00	MO
	r—	ta	•ta
	•	Γ—	r—
	CM O	Z	Z
	Γ—	r-	cn
O	di	•ta	cn •ta
CM X	>*	MO	MO
O	O~	as	tC
+J <ϋ	z	MO	r-
q— <Λ o	cn	in	r—
	r~	ta
q-	tú	σ>	o
o	σο	<·	in
c o E	(M O	U	O

Σ3

Q	UI	G0
•r-t	l r*		Ο	ο
i 1		>	>
Φ	ε		•I—<	·<—I
υ		+J	4->
Q.			CÚ	·<—Ι
			ΟΟ	ν>
Φ			Φ	Ο
TO			^C	d
cO	Η		00	ω
		Φ	φ
E		Μ	:θ	ο
s-		Φ	• γΗ	•ι-Η
fo		Ό Γ~\|	V) ο	V) Ο
		3	το	ΤΟ
Π5		Ο
		Λ	φ	φ
_Q		ω	φ	φ
		C	C	—J
O			C0	ηθ	<
(/)		II	φ	Φ	Η·
			«—ι	r—ί	Ζ
>		Λ	<	<	LU
•r—í		ω			ΞΖ
					UJ —1
O					LU
s-
P			00		LU
O					00
Φ			CQ		_ί
CL				<
ω			<		ΖΞΞ
LU			Lu		<

ω
(0	07	•r-H <ο -Ρ G Φ
ο	O	Ε
•rd	Φ	•ι-Η
ί-	•r—1	ί-
•f—1	ί-	φ
Ο.	ο	CL
Ε	Φ	X
LU	1—	LU
ΠΟ	ω	<Λ
ι——í	Φ	Φ
Z5	ί-	ί-
E	ο	Ο
ί-	ι—Η	r—Η
ο	05	05
Lu		>

in

cn

ESPECTRO RMN: 15mg de monofosfato em 0.5 ml de CD^OD s - singleto d= dubleto. t=tripleto. q=quarteto. m= multipleto. dd=dubleto duplo <ϋ c.

CM

X

	·*
N	lA
	·—
	cn	X—*	·<*
		£>	r—
		CM	r—
		CM
O		\|
+-³c	1	a-	x>
Φ			Ν'
E			1
<ϋ		·*	cn			·*
i 1 ζ—\	·*		—			lA
1—L o	ia	·—			co	a^.
o	*_	cn	·*		F—	r·
			cn	cn
						z-*
Φ “7—l		(0	***		Λ	cn
	aJ	CM	KJ	«—	Ν'	»—
cn		CM	n<		1	1
Φ	1	1	1	1	ra
P			cn	cn	Ν'	T—

Π5
•P
cn
c
o
o

cn (0

CN


·*	·—
cn	n>	·%
		·—
		r-
Ό	Xí
	CM
CM	CM	in
	1	CM
(Q	(0	l
	CM	Ν'
CM	CN	CN

Ê

TJ TJ TJ CN

TJ TJ TJ Ν' o

TJ TJ TJ cn in

TJ Ό o <Ti

Ul CO CO

TJ cn

Ul m cn

TJ TJ

TJ r-

TJ TJ cn o

Π3 Ό << cn

tJ¹ co co

cn 1A

E

r·-

r~

r

r'

r*

v-

c~

·—

·*—

»—

CX

cn

—

Ν'

CN

Tf

Ν'

cn

Ν'

cn

m

Q.

n ·* & ° 7

Φ	ra
E	CN		x>					in
<o «—i CX O	CN 1		T 1 cn
O	—*		—		·*
<o					lA		·«>	-P
Φ *o		in	• H	•w	r	o	co
O ·<	CN	LD r·	o	r* r··	•X.	4*- CM	0) m
ω	cn		CN	r—				•H
Φ							x—x.	zs
-P		XI			X»	m	Tf	r*·
c Π5	XI	CN	<0		Ν'		Τ-	CM
P	Ν'	CN	Ν'		1	1	Ι	1
cn	1	1	1	\|	ra	T—·	cn	cn
c		r-	cn	cn	Ν'	*—	»—	—-
o	—s	—>
o

TJ		TJ
TJ	TJ	no	TJ
TJ	TJ	TJ	TJ	Ul
o	CN	r—	m	Ν'
in	9—	in	r*	CO
9~			.·-	*-
m	cn	Ψ—	Ν'	CN

XI CM

CM

I

CM CM

O t

in

CM

I N* CM

ω	TJ	U)	TJ TJ	TJ TJ	σ
o	CN	00	Γ-	m	cn
CM	00	Γ-	r~	CN	co
	r*	·“ J	·—	·—	·<
N·	N·	Ν'	cn	cn	cn

cn

		X
ra	X) X	o	ffi
X	X 1	1	1
1	1 —	CN	cn
N·	Tf V*·

	ra	£	<β	XJ
X	X	X	X	X	X
1	1	1	1	I	1
N¹	r·		CN	CN	Ν'
r·	CN	CN	CN	CN	CN

37OJ

X fO c:

•1—<

CJ •rH

E <o

S9Π5

CO

(CONT )

X

<Q

C •rH o •t—1

E

Π5

S<Ú co o -p c Φ E <ϋ r—1

CL

O cj <c o -P c

Φ E <σ

I—i

CL

O CJ

Π5

Φ TJ (Λ Φ P c rd P

CO

C O o

E d CL

Ό	ω	ω	ω	ω	tn
CM	CM	in	σ>	lo	co
CO	o	r~	lo	CM	σι
			r~	<*·	r
O		CO	en	CM	r·“

TJ	ω	M	(Q	U)	ω
co	CM	in	CM	tn	co
σι	O	r-	r-	CM	σ\
			<—	e
o	•M·	m	co	CM	T—

	co SC co u	co w u	co	co 03
03 CJ	CO 03
	o	03 O	O	O	O	O
s:	ra	\| \|	1	1	1	1
	-P	in r-»	r-	<1	LO	LO
1	o	CM	·—	—	·—

ZC. P

Cl.

¹³C-RMN Saframicina Mx 1

Atomo de C (ppm)

Saframicina Mx 2 (ppm)

1	54,63	d	61,11	d
3	51,80	d	57,07	d
4	25,60	t	26,19	t
5	186,95	s	187,17	s
6	129,33	s	128,87	s -
7	157,23	s	157,37	s
8	182,77	s	182,91	s
9	143,10	s	143,04	s
10	138,43	s	137,63	s
11	58,19	d	58,15	d
12-CH₃	42,15	q	41,39	q
13	59.98 (	d	59,38	d
14	72,98 147,16 123,.44	d	75,39	d
15	s	146,58	s
16	5	123,36	s
17	148,07	S	147,75	s
18	142,74	S	143,04	s
19	112,20	S	113,04	s
20	119.36	s	120,75	s
21	89,23	d	54,44	t
22	41,39	t	39,36	t
23	170,85	s	170,65	s
24	50,02	d	49,85	d
25	17,16	q	17,08	q
6~^CH3	8,76	q	8.81 f	q
16-CH₃	9,87	q	9,98	q
7-OCH₃	61 ,45	q	61,04 q
17-OCH₃	61 ,02	q	61,44 q
14-OCH₃	58,19	q	58,07 q

to

ro

4x o X CQ

Φ

O

CO

CM

CJ>

C “r4 ε in m

C •H

CO	*—	LO	LO
LO	Lf»	in	00
·—	·”*
o o	O	o	O

•'f in in » r

O o

lo o

»

Tf <3LD CM

Lu ε o φ LO

Π3 O •r—( ω

OJ

C£>

	cn
X «	ro
	γ	e
	r-	1	co
		r-	X r }
	te	te	8
pj	X	X	T
α	m	lo	Tf
►«	te	te	r—
	ω	ω
04		'-‘,
CN	co	ο
	r*	r~
		·—	<u
	ΓΏ	ro

m

	s
		a
CM	CM	I	ro
C0 «s.	O	r-
	Tf	te X	8 1
		co	r·
	c	te
	<3	ω
	m	(ϋ
k0 CM	o	’δ	Q)

— nj M¹ O

ro X	^?0 s	*7o 5	fO SC I
	CM	1 k0	1	1 in
			k0	CM
	te	te	te
	SE	SC	SC	SC
	CO	CO	CO	co
	te	te	te	te
	ω	ω	tn	Ό

	LA	r-	r-	CM
	04	CM		CM
		·—	·-	r*
	CM	CM	CM	»—
Λ
co	X
ΣΕ	ro	co	<-te
	ffi	tu	co	ro
8	Y	D	δ	SC 1
1	I CM	1 k0	1	1 LO
	r-	—	kO	CM
te	te	te	te	te
SC	rc	SC	SC	SC
ro	co	co	co	CO
	te	te	te	te
tn	ω	(fl	cn	Ό
		*“'
CT4	kO	o	Tf	04
LO		o	cn	CM
r~-	*-	r-	te—	r-
C0	CM	CM	·—

			X r \
	CM Γ0 ·— Tf	Tf O <·	8 1 r- te
		·§	X
	—	co
c *H	E	<8	u ω
E ^1/1O u~\|	Tf LO CM	in o ·-	rO 'S 03

(Z) ι

Q

Φ

CU <C —I CJ

Φ Ό

O (O <J C Φ

4- >

Φ

Φ u o CL ε φ

in

\)

o sP CJ Φ CL CO LxJ

Exemplo 5

Conversão de saframícinas

a) Oxidação de saframicina Mx 1 para dar origem a Mx 1 com oxigénio atmosférico mg de saframicina Mx 1 (sob a forma do monofosfato) sao dissolvidos em 2 ml de tampão fo£ fato pH 7.3 e o todo é agitado durante 20 minutos num recipj_ ente aberto. 0 valor do pH é ajustado para cerca de 6 com ácido fosfórico diluído e a solução é concentrado sob vacuo obtido com uma bomba de oleo. 0 resíduo é recolhido repetidamente em isopropanol. permanecendo neste os sais do tampão. A solução de isopropanol contem 9,5 mg de saframicina Mx 1BC- A saframicina Mx2 é oxidada para dar origem a saframicina Mx 2 BC de modo analogo.

b) Redução de saframicina Mx 1 para dar origem a Mx 1BHC com hidrogénio:

Num recipiente de hidrogenação, 10 mg de saframicina Mx 1 (sob a forma de monofosfato) são dissolvidos em 0.5 ml de metanol e 0.5 ml de agua, uma ponta de espátula de paládio sobre carbono activado (10% de Pd) é adicionada e o todo é gitado durante 10 minutos numa corrente fraca de hidrogénio. 0 catalisador é subsequentemente retirado por meio de filtração sob uma atmosfera de azoto e a solução que contem 10 mg de Mx 1 BHC. é concentrada.

A saframicina Mx 1 BHC é instável e instalavel e é re-oxidada de um modo que é especifico em re_ laçáo a determinadas regiões para dar origem a saframicina Mx 1 quinona/hidroquinona em presença de oxigénio atmosférico .

C ) Acetilaçào de Saframicina Mx 1 mg de saframicina Mx 1 são dissolvidos em 2 ml de metanol e 2 ml de tampão fosfato pH 7.3. 0.05 ml de anidrido acético são adicionados e o todo e agitado de um dia para o outro à temperatura ambiente. A solução de reacçao é concentrada . recolhida numa pequena quantidade de água e introduzida numa coluna de XAD-2.

sais são retirados mediante lavagem com 2 volumes de leito de agua. 0 produto é depois^Aeluido com um volume de leito de metanol. A solução de metanol contendo 15 mg de aceti1-saframicina Mx 1BC é concentrada no vácuo.

Espectro UV em metanol : λ 266 nm. log έ 4,32 max

FAB-MS in positive ions range:
teorico	m/e	627	(M + H) ⁺
Encontrado:	m/e	613	(100%), /M	+ 2χΗ	-1x07 +H
	m/e	615	(30%) . /“M	+ 4χΗ	-1x07+ H
Resolução elevada para	^C31^H41	^N4°9

Teoria 613,2873.

Experimental: 613,2859 ¹H-RMN em CDgOD: 4,05 e 4,0 (cada s, 3H, 7-OCHg e

17-0CH₃). 3,55 ( s. 3H, 14-0CH₃)_; 2,43 (s, 3H, 12-CH₃),

2,00 (s. 3H. 16-CH₃). 1,95 (s, 3H, 6-CH₃), 1,75 (s, 3H, acetil-CHg). 1,10 (d_; 3H , 25-H₃).

-44Exemplo 6

Determinação da concentração inibitória mínima das saframicinas Mx 1 e Mx 2.

Os oraganismos usados no teste, com uma densidade celular de 10 celulas/ml (Myxococcus xanthus: 10? celulas/ml )cada . são colocados no meio de nutrj_ ção. adequados em tubos de ensaio.

Os meios usados, para Myxococcus xanthus : MD 1 1_m. para outras bactérias : 0,5% de peptona a partir de caseína, digerida tripticamente (Merck); 0.5% de proteose-peptona (Difco). 0,1% de extracto de carne (Oxoid). pH 7; para as leveduras: 1% de bacto-peptona (Difco). 1% de extracto de levedura (Difco), 2% de glicerina. pH 6.3.

Uma sequencia de concentrações das saframicinas Mx 1 e Mx2 dissolvidas em metanol é adicionada às suspensões dos organismos usados no teste, e os tubos de ensaio são incubados por um periodo que pode ir de 18 a 40 horas a 30°C.

As concentrações inibitórias minimas das saframicinas Mx 1 e Mx2 são indicadas no Quadro que se segue . :

-45Organismo usado no Teste

Saframicina Mx1 (|ig/ml)

Saframicina Mx2

Staphylococcus aureus GBF 16 Bacillus subtilis DSM 10	0,004 0_t063 0_?001 0_?08 0_f32 1_T25 20	0,5 1
Micrococcus luteus DSM 348	0_?063 5
Escherichia coli CG 164
Escherichia coli tol C	20
Proteus morganii CG 166	>20
Myxococcus xanthus Mx x48	não testado
Saccharomyces cerevisiae GBF 26	>20	>20

Em relação a Staph.aureus, as bis-quinonas Mx1 BC e Mx2 BC apresentam actividades semelhantes as de Mx1 e Mx2. A bis-hidroquinona Mx 1 BHC não é estável sob as condições do teste.

Exemplo 7

Preparações Farmacêuticas para Administraç^:ao parenterica

Porções de 5 ml de uma solução aquosa esterilizada de 1% de saframicina Mx1 (sob a forma de monohidrato fosfato) são introduzidas sob condições assé|3 ticas em ampolas ou frasquinhos de 5 ml e secas por congelação. As ampolas ou frasquinhos são selados sob azoto e inspeccionados.

Soluções de saframicina Mx2, Mx1

BC. Mx 2BC. Mx 1 BHC e acetil-Mx 1 BC são processados de modo analogo.

-47compostos de formula

Claims

1-.- Processo de preparação de (I) em que

1 2

R representa hidrogénio ou hidroxi. R representa hidrogénio ou acilo e A e B. independentemente um do outro, representam cada qual C=0 ou C-OH. e em que a linha ponteada representa uma ligação dupla C=C. na posição da ligação intermédia quando A ou B representa C=0, ou na posição das duas ligações laterais quando A ou B representa C-oH, e de sais de tais compostos, caracterizado por se fazer cres cer a estirpe Mx x48 da especie Myxococcus xanthus, ou um mutante obtido a partir desta que produza os compostos de formula I- numa cultura contendo compostos de carbono e azoto e sais inorgânicos essenciais numa forma facilmente assimilável a uma temperatura entre 15°c e 40°c e um valor de pH entre 5 e 9. sob condições aeróbicas, se isolar os

-48compostos de formula I resultantes, e, caso seja desejado, se converter um composto de fórmula I resultante num compos^ to de formula I diferente e/ou se converter um composto resultante num sal e/ou se converter um sal resultante no composto livre ou num sal diferente.

2^â.~ Processo de acordo com a rej^ vindicaçào 1 . caracterizado por se isolar compostos de formula I do licor de fermentação em bruto mediante adsorção sobre resinas nao-ionicas macroporosas e purificação por métodos cromatograficos.

3^â„- Processo de acordo com a rej. vindicaçao 1 ou 2·. caracterizado por se purificar compostos de formula I mediante cromatografia numa substancia de permuta iónica com grupos funcionais fracamente ácidos, cro matografia de adsorção ou partição e/ou cromatografia líquida de alta pressão em superfícies não polares.

4^{4 5}.- Processo de acordo com a reivindicação 1. 2. ou 3. caracterizado por se preparar compostos com a estrutura especial de acordo com a formula

CH₃ ch₃ (II).

5^â.- Processo de acordo com a reivindicaçao 1. 2. ou 3.caracterizado por se preparar compostos de formula I em que R representa hidrogénio ou hidro xi. R representa hidrogénio. A representa C=0 e B representa C-0 ou C-OH e a linha ponteada tem o significado atras referido, e de sais farmaceuticamente aceitáveis de tais compostos63,- Processo de acordo com a reivindicaçao 1. 2 ou 3. caracterizado por se preparar com1 2 postos de fórmula I em que R representa hidroxi. R represent hidrogénio. A representa C-OH e B representa C-OH e a linha ponteada tem o significado atrás referido, e de sais farmaceuticamente aceitáveis deste composto.

7^â.- Processo de acordo com a reivindicação 1. 2 ou 3. caracterizado por se preparar com-501 postos de fórmula I. em que R representa hidrogénio ou hi9 droxi. R representa hidrogénio. A representa C=0 e B representa C-OH e a linha ponteada tem o significado atrás referido, e de sais farmaceuticamente aceitáveis destes compostos9^ã.- A estirpe Mx X48 do microorganismo Myxococcus xanthus. depositada na National Collection of Industrial and Marine Bactéria (Colecção Nacional de Bactérias Industriais e Marinhas), Aberdeen, Escócia sob o numero NCTB 12 268. ou um mutante derivado dessa estirpe que produza um composto de fórmula I.

10^ã.- Processo de produção de preparações farmacêuticas caracterizado por incluir compostos de fórmula I ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis de acordo com a. reivindicação 1. opcionalmente em mistura com veiculos farmaceuticamente aceitáveis.