PT839006E - Processo para a estabilizacao de proteinas num meio ambiente acido com uma pectina com um grau elevado de ester - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA A ESTABILIZAÇÃO DE PROTEÍNAS NUM MEIO AMBIENTE ÁCIDO, COM UMA PECTINA COM UM GRAU ELEVADO DE ÉSTER" A presente invenção refere-se a um processo e a uma enzima para utilização nesse processo.

Em particular, a presente invenção refere-se a um processo para a preparação e utilização de uma pectina modificada enzimaticamente. A pectina é uma utilidade importante na indústria de hoje. Por exemplo, pode ser utilizada na indústria alimentar como agente espessante ou gelificante, tal como na preparação de geleias. A pectina é um polissacárido estrutural, comummente encontrado na forma de protopectina na parede celular de plantas. 0 esqueleto da pectina compreende resíduos de ácido galacturónico ligados em a-1-4, que são interrompidos com um pequeno número de unidades de α-L-ramnose, ligadas em 1,2. Além disso, a pectina compreende regiões altamente ramificadas, com uma cadeia quase alternada de ramno-galacturonano. Estas regiões altamente ramificadas contêm também outras unidades de açucares (como a D-galactose, L-arabinose, L-arabinose e xilose) ligadas por ligações glicosídicas aos átomos C.3 e C4 das unidades de ramnose, ou aos átomos C2 ou C3 das unidades de ácido galacturónico. As cadeias longas de resíduos de ácido galacturónico ligados em a-1-4, são vulgarmente referidas como regiões "lisas", enquanto que as regiões altamente ramificadas são designadas por regiões "cabeludas". 1 1

Alguns dos grupos carboxilo dos resíduos galacturónicos são esterificados (e.g. os grupos carboxilo são metilados). A esterificação típica dos grupos carboxilo ocorre após polimerização dos resíduos de ácido galacturónico. No entanto, é MUITO raro que todos os grupos carboxilo sejam esterifiçados (e.g. metilados). Normalmente, o grau de esterificação variará de 0-90%. Se 50% ou mais dos grupos carboxilo são esterificados, então a pectina resultante é designada por "pectina com um grau elevado de éster" ("pectina HE (high ester) " para abreviatura) ou uma "pectina com um grau elevado de metoxilo". Se menos de 50% dos grupos carboxilo estão esterificados, então a pectina resultante é designada por "pectina com um grau baixo de éster" ("pectina LE (low ester)", para abreviatura) ou "pectina com um grau baixo de metoxilo". Se a pectina não contém, ou contém apenas alguns grupos esterificados, é normalmente designada por ácido péctico. A estrutura da pectina, em particular o grau de esterificação (e.g. metilação) dita muitas das propriedades físicas e/ou químicas resultantes da pectina. Por exemplo, a gelificação da pectina depende da natureza química da pectina, especialmente do grau de esterificação. Além disso, no entanto, a gelificação da pectina depende também do conteúdo de sólidos solúveis, do pH e concentração de iões cálcio. No que se refere a esta última, pensa-se que os iões cálcio formam complexos com grupos carboxilo livres, particularmente os existentes na pectina LE.

As enzimas pécticas são classificadas de acordo com o seu modo de ataque à porção de galacturonano da molécula de pectina. Uma revisão de algumas enzima pécticas foi preparada por Pilnik e Voragen (Food Enzymology, Ed: P.F.Fox; Elsevier; (1991); pp: 303-337). Em particular, metilesterases de pectina (EC 3.1.1.11), referidas também como PMEs, des-esterificam pectinas HE em pectinas LE ou ácidos pécticos. Pelo contrário, e a título de exemplo, as despolimerases de peotina quebram as 2 f u K—t ligações glicosidicas entre resíduos de éster de galacturinosilmetilo.

Em pormenor, a actividade de PME produz grupos carboxilo livres e metanol livre. 0 aumento em grupos carboxilo livres pode ser facilmente monitorizado por titulação automática. A este respeito, estudos anteriores mostraram que algumas PMEs des-esterificam as pectinas de um modo ao acaso, no sentido em que des-esterificam qualquer dos resíduos de ácido galacturónico esterifiçados (e.g. metilados), em uma ou mais das cadeias de pectina. Exemplos de PMEs que des-esterif icam pectinas ao acaso, podem ser obtidos de fungos, como

Aspergillus aculeatus (veja-se WO 94/25575) e Aspergillus japonicus (Ishii et al. J Food Sei 4£ pp 611-14) . Baron et al. (Lebensm. Wiss. M-Technol 1^3 pp 330-333) isolaram, aparentemente, uma PME fúngica de Aspergillus niger. Esta PME fúngica é descrita como tendo um peso molecular de 39.000 D, um ponto isoeléctrico de 3,9, um pH óptimo de 4,5 e um valor de Km (mg/ml) de 3.

Pelo contrário, algumas PME são conhecidas por des- esterif içarem pectinas de um modo em blocos, no sentido em que se pensa que atacam as pectinas, ou em extremidades não reductoras, ou próximo de grupos carboxilo livres e prosseguem então ao longo das moléculas de pectina por um mecanismo de cadeia simples, criando assim blocos de unidades de ácido galacturónico não esterificado, que são muito sensíveis ao cálcio. Exemplos destas enzimas que des-esterificam a pectina enzimaticamente de um modo em blocos, são as PMEs de plantas. Foram sugeridas até 12 isoformas de PME em citrinos (Pilnik W. e Voragen A.G.J. (Food Enzymology (Ed.: P.F.Fox); Elsevier; (1991); pp: 303-337). Estas isoformas têm propriedades diferentes.

Versteeg et al. (J Food Sei j£5 pp969-971) isolaram aparentemente uma PME de laranja. É referido que esta PME de planta ocorre em isoformas múltiplas, com diferentes 3 propriedades. A isoforma I tem um peso molecular de 36000 D, um ponto isoeléctrico de 10,0, um pH óptimo de 7, 6 e um valor de Km (mg/ml) de 0,083. A isoforma II tem um peso molecular de 36.200 D, um ponto isoeléctrico de 11,0, um pH óptimo de 8,8 e um valor de Km (mg/ml) de 0,0046. A isoforma III (PE-EPM) tem tem um peso molecular de 54.000 D, um ponto isoeléctrico de 10,2, um pH óptimo de 8 e um valor de Km (mg/ml) de 0,041. No entanto, até agora têm havido muitos poucos dados de sequência para estas PMEs.

De acordo com Pilnik e Voragen (ibid) , as PMEs podem ser encontradas em várias outras plantas superiores, como a maçã, damasco, abacate, banana, bagas, lima, toranja, tangerina, cerejas, groselha, uvas, manga, papaia, maracujá, pêssego, pêra, ameixas, feijões, cenoura, couve-flor, pepino, alho porro, cebola, ervilha, batata, rábano e tomate. No entanto, igualmente, até à data têm havido poucos dados de sequência para estas PMEs. A distribuição ao acaso ou em blocos de grupos carboxilo livres pode ser distinguida por cromatografia de troca iónica de alta eficiência (Schols et ai. Food Hydrocolloids 1989 6 pp 115-121) . Estes testes são muitas vezes utilizados para pesquisar uma actividade de PME indesejável, residual, em sumos de citrinos, após pasteurização, dado que a PME residual pode originar a designada "floculação" no sumo de laranja, em adição à formação de metanol no sumo.

As PMEs têm utilidades importantes na indústria. Por exemplo, podem ser utilizadas em, ou como agentes de sequestro de iões cálcio. A este respeito, de acordo com Pilnik e Voragen (ibid), o alimento para gado pode ser preparado por adição de uma lama de hidróxido de cálcio a cascas de citrinos, após extracção do sumo. Após a adição, o pH elevado e os iões de cálcio activam qualquer PME nativa existente nas cascas, provocando a rápida des-esterificação da pectina, ocorrendo a coagulação do pectalu de cálcio. A fase liquida

ligada é libertada e é facilmente pressionada de modo a que apenas é necessário remover uma fracçâo do conteúdo original em água, por meio de secagem térmica, dispendiosa. 0 liquido do pressionamento é então utilizado como alimento animal.

Pilnik e Voragen (ibid) enumeram as utilizações das PMEs endógenas, que incluem a sua adição a sumos de frutos, para reduzir a viscosidade do sumo, se este contiver muita pectina derivada do fruto, a sua adição como soluções de pectinase a bolhas de gás no albedo do citrino que foi aquecido a uma temperatura de 20 a 40 °C, de modo a facilitar a remoção da casca e outras membranas dos segmentos de sumo intactos (US-A-4284 651) e sua utilização na protecção e melhoramento da textura e firmeza de vários frutos e vegetais processados, tal como a maçã (Wiley & Lee 1970 Food Technol 24 1168-70) , tomates enlatados (Hsu et al. 1965 J Food Sei ^30 pp 583-588) e batatas (Bartolome & Hoff 1972 J Agric Food Chem 2_0 pp 262-266) .

Glahn e Rolin (1994 Food Ingredients Europe, Conf Proceedings pp 252-256) referem a aplicação hipotética da "pectina tipo YM-100 GENU" industrial, para interagir com bebidas de leito azedo. Não são apresentados quaisquer pormenores sobre o modo como a pectina tipo YM-100 GENU é preparada. A EP-A-0664300 descreve um método de fraccionamento químico para a preparação de pectina sensível a cálcio. É referido que esta pectina sensível a cálcio é vantajosa na indústria alimentar.

Assim, as pcctinas e pectinas des-esterifiçadas, além das PMEs, têm importância industrial. No entanto, persiste a necessidade de melhorar os métodos conhecidos para estabilizar proteínas em meio ácido, mas sem afectar de forma adversa a viscosidade desse meio. A este respeito, um efeito adverso na viscosidade do ambiente pode comprometer a aparência e/ou 5

textura e/ou paladar e/ou a sensação na boca, gerais, do produto resultante.

De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, proporciona-se um processo que compreende a adição a um meio ácido, que contém pelo menos uma proteína, de uma pectina des-esterificada enzimaticamente, do modo em blocos, em que a pectina é uma pectina com um grau elevado de éster.

Assim, a presente invenção refere-se a uma nova utilização de pectinas des-esterifiçadas. A presente invenção refere-se também a uma nova PME recombinante, para preparar estas pectinas.

Algumas das vantagens chave da presente invenção são as de a pectina des-esterifiçada da presente invenção proporcionar estabilidade a proteínas em meio ácido, sem afectar de forma adversa a viscosidade do meio.

Uma forma de concretização preferida do primeiro aspecto da presente invenção é um processo que compreende a adição a um ambiente ácido, que contém pelo menos uma proteína, de uma pectina des-esterifiçada enzimaticamente, do modo em blocos, preparada por utilização de técnicas de ADN recombinante, em que a pectina é uma pectina com um grau elevado de éster. 0 termo "pectina des-esterificada enzimaticamente, do modo em blocos, preparada por utilização de técnicas de ADN recombinante" significa uma pectina que contém grupos des-esterifiçados do modo em bloco, em que a pectina é preparada tratando (e.g. contactando) a pectina que contém grupos e3tcrificados com uma enzima que foi preparada por utilização por técnicas de ADN recombinante.

Algumas das vantagens chave deste aspecto preferido da presente invenção são as de a pectina des-esterificada poder se preparada com facilidade e com um grau relativo de 6

consistência. Neste aspecto, a própria PME recombinante pode ser preparada de um modo relativamentc simples e fácil e, também, com um grau elevado de homogeneidade. Isto por sua vez, e contrariamente às preparações de PME da arte anterior, significa que a actividade de PME resultante é mais consistente e homogénea, permitindo assim que o processo geral de des-esterificação seja mais controlado. A utilização de pectina des-esterifiçada do modo em blocos - que é de preferência preparada por utilização de técnicas de ADN recombinante - no processo da presente invenção, para a estabilização de pelo menos uma proteína num meio ácido tem benefícios, dado que permite que as proteínas como as proteínas de soro de leite e do leite (tais como a caseína), sejam estáveis em soluções ácidas. Isto tem importância para o mercado das bebidas, tais como o leite em pó, sumos de fruta e bebidas de proteína de soro de leite, em que antes apenas era possível reter o sabor das proteínas chave em condições de acidez relativamente elevada - tais como pH 4,2 - desde que estivessem presentes quantidades elevadas de estabilizante.

Os requerentes verificaram agora, que para algumas aplicações se podem utilizar pequenas quantidades de pectina des-esterifiçada de acordo com a presente invenção. A estes níveis baixos, a pectina des-esterifiçada de acordo com a presente invenção actua não só como um estabilizador, mas não possui igualmente nenhum efeito adverso no produto final.

Se desejado, a utilização da pectina des-esterifiçada da presente invenção irá permitir que os produtores de alimentos aumentem o pH dos alimentos, tais como bebidas. Neste aspecto, nalguns casos a natureza menos acídica das bebidas poderá torná-los mais apreciados pelas pessoas, especialmente pelas crianças. Assim, em contraste com os processos da arte anterior, é agora possível reter o sabor das proteínas a condições de pH superiores a 4,2, até pH 5,5 (tal como pH 7

5,2), utilizando pectina des-esterificada enzimaticamente do modo em blocos, particularmente pectina des-esterificada enzimaticamente, do modo em blocos, preparada por utilização de técnicas de ADN recombinante.

Além disso, pensa-se que mesmo em condições de pH baixo, como pH 4,2 ou inferior, a pectina des-esterificada enzimaticamente do modo em blocos - particularmente pectina des-esterificada enzimaticamente, do modo em blocos, preparada por utilização de técnicas de ADN recombinante - estabiliza a(s) proteína (s), mais do que os estabilizantes da arte anterior que são utilizados nessas condições de pH.

Uma outra vantagem é a de a PME ser capaz de produzir uma pectina des-esterificada do modo em blocos, substancialmente homogénea. Isto significa que substancialmente todas as cadeias de pectina compreendem pelo menos dois grupos carboxilo des-esterifiçados, adjacentes. No entanto, para algumas aplicações, poderá não ser necessário preparar ou utilizar esta pectina des-esterificada, do modo em blocos, substancialmente homogénea.

Sem pretender estar cingido à teoria, pensa-se que a pectina des-esterificada enzimaticamente do modo em blocos -particularmente a preparada utilizando técnicas de ADN recombinante - estabiliza a(s) proteína(s), envolvendo a(s) proteína(s) num manto de cargas negativas, formando assim uma emulsão estável. A enzima PME recombinante da presente invenção é útil para pectinas des-esterifiçadas do modo em blocos, quando as pectinas contactam com a enzima recombinante num meio substancialmente aquoso. Nalguns casos, as pectinas des-esterificadas podem aumentar a sensibilidade de uma pectina ao ião cálcio - o que por sua vez pode ser vantajoso. 8 i

Alternativamente, a enzima PME recombinante da presente invenção é útil para esterificar pectinas, quando as pectinas são contactadas com a enzima recombinante, num meio substancialmente não-aquoso, tal como na presença de metanol ou na presença de concentrações elevadas de sulfato de amónio. Este aspecto é vantajoso, por exemplo, se é desejável reduzir a sensibilidade de uma pectina ao cálcio.

Este método de esterificação de pectinas é vantajoso, pois obvia a necessidade de condições de temperatura elevada e esterificação do metanol, associadas com a arte anterior. Assim, a presente invenção inclui também a utilização daquelas pectinas esterifiçadas, na preparação de um alimento, bem como a pectina per se.

De acordo com a presente invenção, a pectina des-esterificada da presente invenção é vantajosa para a preparação de um alimento.

Os alimentos típicos incluem lacticínios, produtos de carne, produtos de aviário, produtos de peixe e produtos de padaria. De preferência o alimento é uma bebida. A pectina des-esterificada da presente invenção também é vantajosa para utilização como estabilizador e/ou modificador de viscosidade, na preparação de medicamentos, aplicações farmacêuticas, cosméticos e aplicações cosméticas.

De preferência o meio ácido é uma solução aquosa.

De preferência a solução aquosa é uma bebida.

De preferência a bebida é um iogurte bebível, um sumo de fruta ou uma bebida que compreende proteína de soro de leite.

De preferência a proteína é derivada, ou derivável a partir de lacticinios, como o leite ou queijo. 9

De preferência a proteína é caseína ou proteína de soro de leite.

De preferência o meio ácido tem um pH de cerca de 3,5 a cerca de 5,5.

De preferência o meio ácido tem um pH de 4 a cerca de 5,5.

De preferência o meio ácido tem um pH de cerca de 4.

De preferência, a pectina des-esterifiçada enzimaticamente pelo modo em blocos, particularmente a preparada por técnicas de ADN recombinante, é uma pectina com um grau elevado de éster, contendo cerca de 80% de grupos éster, ou menos (i.e. um grau de esterificação (GE) de 80% ou menos), de preferência cerca de 75% de grupos éster (i.e. um GE de cerca de 75% ou menos) . A este respeito, a razão entre grupos carboxilo livres e grupos carboxilo esterificados na pectina é de 1:1 a 1:4, de preferência de 1:2 a 1:3.

De preferência, a pectina des-esterificada enzimaticamente pelo modo em blocos, contém cerca de 76% de grupos éster.

Nalguns casos, de preferência a pectina des-esterificada enzimaticamente pelo modo em blocos é sensível a iões Ca2+. A sensibilidade ao cálcio pode ser determinada de acordo com o protocolo mencionado nos exemplos.

Mais preferencialmente, no entanto, a pectina des-esterificada enzimaticamente dr> modo em blocos, particularmente a preparada por técnicas de ADN recombinante, é insensível a iões Ca2+. a insensibilidade ao cálcio pode ser determinada seguindo o protocolo mencionado nos exemplos. 10

De preferência a Γ \

pectina des-esterificada enzimaticamente pelo método em bloco tem um peso molecular elevado.

Tipicamente, o peso molecular é entre cerca de 50 kD a cerca de 150 KD.

De preferência a pectina des-esterificada enzimaticamente, pelo método em blocos é preparada tratando uma pectina com uma metil esterase de pectina, recombinante, que des-esterif ica dois ou mais resíduos de ácido galacturónico adjacentes da pectina, em pelo menos substancialmente todas as cadeias de pectina.

De preferência, a metil esterase de pectina recombinante é derivada de uma PME obtida a partir de uma planta. 0 termo "derivada de uma PME obtida a partir . de uma planta" significa que a PME recombinante tem uma sequência semelhante à de uma PME obtida a partir de uma planta, desde que a PME recombinante possa des-esterificar a pectina de um modo em blocos.

De preferência a planta é um fruto.

De preferência o fruto é um citrino.

De preferência o citrino é uma laranja.

De preferência, a metil esterase de pectina recombinante é derivada de uma PME que se pode obter a partir da lamela ou albedo de uma laranja. Para referência, mostra-se uma secção transversal de um citrino típico na figura 1, em que estão indicados a lamela e o albedo. O termo "derivado de uma PME que se pode obter a partir da lamela ou albedo de uma laranja", significa que a PME recombinante tem uma sequência semelhante à de uma PME que se obtém a partir da lamela ou 11

albedo de uma laranja, desde que a PME recombinante possa des-esterificar a pectina de um modo em blocos.

De preferência, a pectina des-esterificada enzimaticamente de um modo em blocos é preparada tratando uma pectina com uma enzima recombinante, que compreende qualquer das sequências de aminoácidos apresentadas na SEQ ID No. 1 ou SEQ ID No. 2, ou uma sua variante, derivado ou homólogo, incluindo combinações destes.

De preferência, a pectina des-esterificada enzimaticamente do modo em blocos é preparada tratando uma pectina com uma enzima recombinante, que se pode obter por expressão de uma sequência nucleotidica compreendendo a sequência nucleotidica apresentada na SEQ ID No. 3 ou SEQ ID No. 4, ou uma variante, derivado ou homólogo ou combinações destes.

De preferência, a pectina des-esterificada enzimaticamente do modo em bloco é preparada tratando uma pectina com uma enzima recombinante, que se pode obter por expressão da sequência codificante da PME contida em NCIMB 40749 ou NCIMB 40750 ou uma variante, derivado ou homólogo, ou combinações destes.

De preferência, a pectina des-esterificada enzimaticamente do modo em blocos é preparada tratando a pectina com a metil esterase de pectina, recombinante, na presença de iões sódio.

De preferência, a pectina des-esterificada enzimaticamente do modo em blocos, preparada por técnicas de ADN recombinante é preparada tratando a pectina com a metil esterase de pectina recombinante, na presença de NaCl, NaNC>3 ou Na2S04. 12

I

De preferência, a enzima recombinante compreende todas as sequências apresentadas como SEQ ID No.l ou SEQ ID No. 2.

De preferência, a enzima recombinante é expressa por uma sequência nucleotidica que compreende todas as sequências apresentadas como SEQ ID No. 3 ou SEQ ID No. 4. A presente invenção também engloba sequências que são complementares às sequências acima mencionadas. 0 termo "pectina" inclui pectina no sentido normal, bem como fracções e derivados desta, bem como pectinas modificadas (e.g. pectinas modificadas quimicamente e pectinas modificadas enzimaticamente).

De preferência, a pectina não é uma pectina que foi anteriormente tratada com a enzima poligalacturonase para reduzir substancialmente o comprimento do esqueleto de pectina.

Os termos "variante", "homólogo" ou "fragmento", em relação à enzima recombinante da presente invenção, incluem qualquer substituição, variação, modificação, substituição, delecção ou adição de um (ou mais) aminoácidos de, ou para a sequência, desde que a sequência de aminoácidos resultante tenha actividade de PME, tendo, de preferência, pelo menos a mesma actividade que uma enzima recombinante que compreende qualquer uma ou mais das sequências apresentadas como SEQ ID No.s 1 e 2. Em particular, o termo "homólogo" engloba homologia em relação à estrutura e/ou função, desde que a enzima recombinante resultante tenha actividade de PME. No que se refere à homologia de sequência, (i.e. semelhança), há pelo menos 75%, mais preferencialmente pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90% de homologia com as sequências apresentadas na listagem de sequências. Mais preferencialmente, há pelo menos 95%, mais preferencialmente 13 pelo menos 98% de homologia com as sequências apresentadas na listagem de sequências.

Os termos "variante", "homólogo” ou "fragmento", em relação à sequência nucleotidica que codifica para a enzima recombinante da presente invenção, incluem qualquer substituição, variação, modificação, substituição, delecção ou adição de um (ou mais) ácidos nucleicos da ou para a sequência, desde que a sequência nucleotidica resultante codifique para uma enzima recombinante com actividade de PME, tendo, de preferência, pelo menos a mesma actividade que uma enzima recombinante compreendendo qualquer uma ou mais das sequências apresentadas como SEQ ID No.s 1 e 2. Em particular, o termo "homólogo" engloba homologia em relação à estrutura e/ou função, desde que a sequência nucleotidica resultante codifique para uma enzima recombinante com actividade de PME. No que se refere à homologia de sequência (i.e. semelhança), de preferência, há pelo menos 75%, mais preferencialmente, pelo menos 85%, mais preferencialmente pelo menos 90% de homologia. Mais preferencialmente há pelo menos 95%, mais preferencialmente pelo menos 98% de homologia.

Os termos acima são sinónimos, com variações alélicas das sequências. 0 termo "complementar" significa que a presente invenção também engloba sequências nucleotidicas que podem hibridar com a sequência de nucleótidos da sequência codificante. O termo "nucleótido", em relação à presente invenção, inclui ADN genómico, ADNc, ADN sintético e ARN. De preferência significa ADN, mais preferencialmente ADNc para a sequência codificante da presente invenção. 0 termo "citrino" significa uma espécie do género Citrus e inclui lima, limão, laranja, toranja, kumquat, pomelo e tangerina. De preferência, significa laranja. 0 termo "construção" - que é sinónimo de termos como "conjugado", "cassete" e híbrido" - inclui α sequência nucleotídica de acordo com a presente invenção ou, no caso da combinação de construções, o GOI directa ou indirectamente ligado a um promotor. Um exemplo de uma ligação indirecta é a existência de um grupo espaçador adequado, tal como uma sequência de intrão, como o intrão Shl ou o intrão ADH, que intermedeia o promotor e a sequência nucleotídica da presente invenção, ou o GOI. 0 mesmo se aplica para o termo "fundido", em relação à presente invenção, que inclui uma ligação directa ou indirecta. Em cada caso, os termos não cobrem a combinação natural do gene que codifica para a enzima vulgarmente associada com o promotor do gene do tipo selvagem e quando estão ambos no seu ambiente natural. A construção pode até conter ou expressar um marcador que permite a selecção da construção genética em, por exemplo, um fungo filamentoso, de preferência do género Aspergillus, tal como Aspergillus niger, ou plantas, tais como batatas, beterraba, etc., para as quais foi transferido. Existem vários marcadores que podem ser utilizados, tais como, por exemplo, os que codificam para a manose-6-fosfato isomerase (especialmente para plantas) ou os marcadores que proporcionam resistência a antibióticos - e.g. resistência a G418, higromicina, bleomicina, canamicina e gentamicina. 0 termo "vector" inclui vectores de expressão e vectores de transformação. 0 termo "vector de expressão" significa uma construção capaz de expressão in vivo ou in vitro. 0 termo "vector de transformação" significa uma construção capaz de ser transferida de uma espécie para outra tal como de um plasmídeo de E. coli para um fungo filamentoso, de preferência do género Aspergillus. Pode até U κ Λ. \

ser uma construção capaz de ser transferida de um plasmideo de E. cull para uma planta Agrobacterium. 0 termo "tecido" inclui tecido per se e orgão. 0 termo "organismo", em relação à presente invenção, inclui qualquer organismo que poderá compreender a sequência nucleotidica que codifica para a enzima recombinante de acordo com a presente invenção e/ou produtos obtidos a partir desta, em que um promotor pode permitir a expressão da sequência nucleotidica de acordo com a presente invenção, quando presente no organismo.

De preferência, o organismo é um fungo filamentoso, de preferência do género Aspergillus, mais preferencialmente Aspergillus niger. 0 termo "organismo transgénico" em relação à presente invenção, inclui qualquer organismo que compreende a sequência nucleotidica que codifica para a enzima recombinante de acordo com a presente invenção e/ou produtos obtidos a partir desta, em que o promotor pode permitir a expressão da sequência nucleotidica da presente invenção, no organismo. De preferência, a sequência nucleotidica é incorporada no genoma do organismo.

De preferência, o organismo transgénico é um fungo filamentoso, de preferência do género Aspergillus, mais preferencialmente Aspergillus niger.

Assim, o organismo transgénico da presente invenção inclui um organismo que compreende qualquer um, ou uma combinação de, um promotor, a sequência nucleotidica que codifica para a enzima recombinante de acordo com a presente invenção, construções de acordo com a presente invenção (incluindo suas combinações), vectores de acordo com a presente lnvençSo, plasmideos de acordo com a presente 16 I \ u, invenção, células de acordo com a presente invenção, tecidos de acordo com a presente invenção, ou produto3 seuo derivados. 0 termo "organismo transgénico" não inclui a sequência nucleotídica codificante, nativa, de acordo com a presente invenção, no seu ambiente natural quando está sob o controlo do seu promotor nativo, que está também no seu ambiente natural. Além disso, a presente invenção não engloba a enzima nativa de acordo com a presente invenção quando esta está no seu ambiente natural e quando foi expressa pela sua sequência nucleotídica nativa, que está também no seu ambiente natural e quando a sequência nucleotídica está sob o controlo do seu promotor nativo, que está também no seu ambiente natural. A célula ou organismo transformado pode preparar quantidades aceitáveis do composto desejado, que será facilmente recuperável da célula ou organismo.

De preferência, a construção da presente invenção compreende a sequência nucleotídica da presente invenção e um promotor. 0 termo "promotor" é utilizado no sentido normal da arte, e.g. um local de ligação de uma polimerase de ARN na teoria de expressão genética de Jacob-Monod.

Num aspecto, a sequência nucleotídica de acordo com a presente invenção está sob o controlo de um promotor que pode ser um promotor específico de células ou tecido. Se, por exemplo, o organismo é uma planta, então o promotor pode ser um que afecte a expressão da sequência nucleotídica num ou mais tecidos de entre tubérculo, caule, qrelo, raiz e folha. A titulo de exemplo, o promotor da sequência nucleotídica da presente invenção pode ser o promotor a-Amy 1 (também designado por promotor Amy 1, promotor Amy 637 ou promotor a-Amy 637) como descrito no pedido de patente UK co-pcndcnte, 17

No. 9421292,5 apresentado em 21 de Outubro de 1994. Alternativamente, o promotor para a sequência nucleotídica da presente invenção pode ser o promotor a-Amy 3 (também conhecido como promotor Amy 3, promotor Amy 351 ou promotor a-Amy 351), como descrito no pedido de patente UK co-pendente No. 9421286.7, apresentado em 21 de Outubro de 1994. 0 promotor poderia incluir adicionalmente características para assegurar ou aumentar a expressão num hospedeiro adequado. Por exemplo, as características podem ser regiões conservadas, como uma caixa Pribnow ou uma caixa TATA. 0 promotor pode inclusive conter outras sequências para afectar (tal como manter, aumentar, diminuir) os níveis de expressão da sequência nucleotídica da presente invenção ou, no caso da combinação de construções o GOI. Por exemplo, outras sequências adequadas incluem o intrão Shl ou um intrão ADH. Outras sequências incluem elementos inductíveis - tais como elementos inductíveis por temperatura, químicos, luz, ou stresse. Também podem estar presentes elementos para aumentar a transcrição ou tradução. Um exemplo deste último elemento é a sequência de sinal TMV 5' (veja-se Sleat Gene 217 [1987] 217-225 e Dawson Plant Mol. Biol. 23 [1993] 97).

Além disso, a presente invenção também engloba combinações de promotores e/ou sequências nucleotídicas que codificam para proteínas, ou enzimas e/ou elementos recombinantes. A presente invenção também inclui a utilização de promotores para expressar uma sequência nucleotídica que codifica para a enzima recombinante de acordo com a presente invenção, ou para GOI, em que uma parte do promotor é inactivada mas em que o promotor ainda pode funcionar como promotor. A inactivação parcial de um promotor nalguns casos é vantajosa. Em particular, com o promotor Amy 351 acima mencionado, é possível inactivar uma parte deste de modo que o promotor parcialmente inactivado expressa o nucleótido da 18

presente invenção ou um GOI de um modo mais específico, tal como em apenas um tipo de tecido, ou órgão especifico. 0 termo "inactivado" significa inactivação parcial, no sentido em que o padrão de expressão do promotor é modificado, mas em que o promotor parcialmente inactivado ainda funciona como promotor. No entanto, como mencionado acima, o promotor modificado é capaz de expressar o nucleótido da presente invenção, ou um GOI, em pelo menos um (mas não todos) os tecidos específicos do promotor original. Um destes promotores é o promotor Amy 351, acima descrito. Exemplos de inactivação parcial incluem alterar o padrão de empacotamento da sequência promotora, ou ligar espécies a partes da sequência nucleotídica, de modo que parte da sequência nucleotídica não é reconhecida, por exemplo, pela polimerase de ARN. Um outro, e preferido, modo de inactivar parcialmente o promotor é truncá-lo, para formar fragmentos seus derivados. Um outro modo seria mutar pelo menos uma parte da sequência, de modo que a polimerase de ARN não se pudesse ligar a essa parte, ou a outra parte. Uma outra modificação é mutar os locais de ligação para proteínas reguladoras, por exemplo a proteína CreA, conhecida de fungos filamentosos por exercer uma repressão de catabolitos de carbono e abolir, assim, a repressão do promotor nativo por catabolitos. 0 termo "GOI" em relação à combinação de construções de acordo com a presente invenção significa qualquer gene de interesse. Um GOI pode ser qualquer nucleótido que é, ou estranho, ou natural ao organismo em questão (e.g. fungos filamentosos, de preferência do género Aspergillus, ou uma planta). Exemplos típicos de um GOI incluem genes que codificam para proteínas e enzimas que modificam processos metabólicos e catabólicos. 0 GOI pode codificar para um agente para introduzir ou aumentar a resistência a patogéneos. 0 GOI pode ainda ser uma construção de sentido inverso para modificar a expressão de transcritos naturais presentes em tecidos relevantes. O GOI pode mesmo codificar para uma 19

proteína não nativa de um fungo filamentoso, de preferência do género Aspergillus, ou um composto que é benéfico para animai3 ou humanos.

Exemplos de GOIs incluem outras pectinases, despolimerases de pectina, poligalactorunases, ligases de pectato, ligases de pectina, ramno-galacturonases, hemicelulases, endo-p-glucanases, arabinases ou acetil esterases ou suas combinações, bem como sequências de sentido inverso suas derivadas. O GOI pode ser uma proteína que forneça valor nutricional a um alimento ou colheita. Exemplos típicos incluem proteínas de plantas que podem inibir a formação de factores anti-nutritivos e proteínas de plantas que têm uma composição de aminoácidos mais desejável (e.g. um maior conteúdo em lisina do que uma planta não transgénica) . 0 GOI pode mesmo codificar para uma enzima que pode ser utilizada no processamento de alimentos como a quimosina, taumatina e α-galactosidase. 0 GOI pode ser um gene que codifica para qualquer de uma toxina de uma praga, um transcrito de sentido inverso, tal como o de patatina e α-amilase, ADP-glucose pirofosforilase (e.g. veja-se EP-A-0455316), uma protease de sentido inverso, uma glucanase ou PME genómica. 0 GOI pode mesmo codificar para um intrão de uma enzima particular, mas em que o intrão pode ser em sentido directo ou inverso. No último caso, a enzima particular pode ser PME genómico. Uma expressão de sentido inverso de sequências de exão ou intrão genómico como, o GOI, significaria que a expressão de PME natural seria reduzida ou eliminada, mas em que a expressão de PME recombinante não seria afectada. Isto é particularmente verdade para a expressão de intrão de sentido inverso ou intrão de sentido directo. 0 GOI pode ser uma sequência nucleotídica para a enzima α-amilase, que é o objecto do pedido de patente UI< co-pendcnte 20

t 941343.2, dos requerentes, apresentada em 4 de Julho de 1994. O GOI pode ser a sequência nucleotidica que codifica para α enzima α-amilase, que é o objecto do pedido de patente co-pendente UK 9421290.9, dos requerentes, apresentado em 21 de Outubro de 1994. 0 GOI pode ser qualquer das sequências de nucleótidos que codificam para as enzimas ADP-glucose pirofosforilase que são o objecto do pedido de patente PCT co-pendente PCT/EP94/01082, dos requerentes, apresentado em 7 de Abril de 1994. 0 GOI pode ser qualquer das sequências de nucleótidos para a enzima α-glucan-ligase, que estão descritas no pedido de patente PCT co-pendente PCT/EP94/03397, dos requerentes, apresentado em 15 de Outubro de 1994. 0 organismo hospedeiro pode ser um organismo procariótico ou eucariótico. Exemplos de hospedeiros procarióticos adequados incluem E. coli e Bacillus subtilis. Os ensinamentos sobre a transformação de hospedeiros procarióticos estão bem documentados na arte, por exemplo veja-se Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edição, 1989, cold Spring Harbor Laboratory Press). Se o hospedeiro procariótico é utilizado, então poderá ser necessário modificar o gene de forma adequada antes da transformação - tal como por remoção de intrões.

Como referido acima, um organismo hospedeiro preferido é do género Aspergillus, tal como Aspergillus niger.

Pode-se preparar um Aspergillus transgénico de acordo com a presente invenção, seguindo os ensinamentos de Rambosek, J. e Leach, J. 1987 (Recombinant DNA in filamentous fungi: Progress and Prospects. CRC Crit. Rev. Biotechnol. 6:357-393), Davis R.W. 1994 (Heterologous gene expression and protein secretion in Aspergillus. In: Martinelli S.D. Kinghorn J. R. (Editors) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology vol 29. Elsevier Amsterdão 1994, pp. 525-560), Ballance D.J. 1991 (Transformation Systems for Filamentous Fungi and an OverView of Fungai Gene Structure. In: Leong, 21

S.A. Berka R.M. (Editors) Molecular Industrial Mycology. Systems and ApplicaLions for Filamentous Fungi. Mareei Dckkcr Inc. New York 1991, pp 1-29) e Turner G. 1994 (Vectors for genetic manipulation. In: Martinelli S.D. Kinghorn J.R. (Editors) Aspergillus: 50 years on Progress in industrial microbiology vol 29. Elsevier Amsterdão 1994, pp. 641-666). No entanto, o comentário seguinte fornece um sumário sobre os ensinamentos para a produção de Aspergillus transgénico de acordo com a presente invenção.

Durante quase um século, os fungos filamentosos têm sido utilizados em muitos tipos de indústria para a produção de compostos orgânicos e enzimas. Por exemplo, as fermentações japonesas tradicionais, de koji e soja têm utilizado o Aspergilus sp. Também neste século, o Aspergillus niger tem sido utilizado para a produção de ácidos orgânicos, em particular ácido cítrico, e para a produção de várias enzimas para utilização na indústria. Há duas razões principais para o facto de os fungos filamentosos terem sido tão amplamente utilizados na indústria. Em primeiro lugar, os fungos filamentosos podem produzir quantidades elevadas de produtos extracelulares, por exemplo enzimas e compostos orgânicos, como antibióticos ou ácidos orgânicos. Em segundo lugar, os fungos filamentosos podem crescer em substratos de baixo custo como grão, farelo, polpa de beterraba, etc. As mesmas razões tornaram os fungos filamentosos organismos atractivos como hospedeiros para a expressão heteróloga, de acordo com a presente invenção.

De modo a preparar o Aspergillus transgénico, prepararam-se construções de expressão inserindo a sequência nucleotídica de acordo com a presente invenção (ou mesmo o GOI) numa construção concebida para a expressão de fungos filamentosos.

Foram desenvolvidos vários tipos de construções para a expressão heteróloga. EsLas construções contêm, dc 22 preferência, um promotor que é activo em fungos. Exemplos de promotores incluem um promotor fúngico para uma enzima extracelular altamente expressa, tal como o promotor da glucoamilase ou o promotor da α-amilase. A sequência nucleotídica de acordo com a presente invenção (ou mesmo o GOI) pode ser fundida a uma sequência sinal que direcciona a proteína codificada pela sequência nucleotídica de acordo com a presente invenção (ou mesmo o GOI) a ser segregada. Normalmente, utiliza-se uma sequência sinal de origem fúngica. Um terminador activo em fungos termina o sistema de expressão.

Desenvolveu-se um outro tipo de sistemas de expressão em fungos, em que a sequência nucleotídica de acordo com a presente invenção (ou mesmo o GOI) pode ser fundida a uma parte menor ou maior de um gene fúngico, que codifica para uma proteína estável. Este pode estabilizar a proteína codificada pela sequência nucleotídica de acordo com a presente invenção (ou mesmo o GOI). Num sistema deste tipo, pode-se introduzir um local de clivagem, reconhecido por uma protease específica, entre a proteína fúngica e a proteína codificada pela sequência nucleotídica de acordo com a invenção (ou mesmo o GOI), de modo que a proteína de fusão pode ser clivada nesta posição, pela protease específica, libertando assim a proteína codificada pela sequência nucleotídica de acordo com a presente invenção (ou mesmo o GOI). A título de exemplo, pode-se introduzir um local que é reconhecido por um péptido tipo KEX-2, encontrado em pelo menos alguns Aspergilli. Esta fusão conduz à clivagem in vivo, resultando na protecção do produto expresso e não numa proteína de fusão maior. A expressão heteróloga em Aspergillus tem sido referida para vários genes que codificam para proteínas de bactérias, fungos, vertebrados e plantas. As proteínas podem ser depositadas intracelularmente, se a sequência nucleotídica de acordo com a presente invenção (ou o GOI) não estiver fundida a uma sequência sinal. Estas proteínas irão acumular-se no citoplasma e não serão, normalmente, glicosiladas, o que pode

t ser uma vantagem para algumas proteínas bacterianas. Se a sequência nucleotídica de acordo com a presente invenção (ou mesmo o GOI) estiver equipada com uma sequência sinal, a proteína irá acumular-se extracelularmente.

No que respeita à estabilidade do produto e modificações da estirpe hospedeira, algumas proteínas heterólogas não são muito estáveis quando são segregadas para o fluido de cultura ou fungos. A maioria dos fungos produz algumas proteases extracelulares que degradam proteínas heterólogas. Para evitar este problema, têm-se utilizado estirpes de fungos especiais, com uma produção de protease reduzida, como hospedeiros para a produção heteróloga.

Para a transformação de fungos filamentosos, têm-se desenvolvido alguns protocolos de transformação para muitos fungos filamentosos (Ballance 1991, ibid) . Muitos destes baseiam-se na preparação de protoplastos e introdução de ADN em protoplastos, utilizando PEG e iões Ca2+. Os protoplastos transformados são então regenerados e os fungos transformados são seleccionados utilizando vários marcadores selectivos. De entre os marcadores utilizados para a transformação estão um número de marcadores auxotróficos, como argB, trpC, niaO e pyrG, marcadores de resistência a antibióticos, como resistência a benomilo, resistência a higromicina e resistência a fleomicina. Um marcador de transformação vulgarmente utilizado é o gene amdS de A. nidulans, que num número de cópias elevado, permite que o fungo cresça com acrilamida como única fonte de azoto.

Noutra forma de concretização, o organismo transgénico pode ser uma levedura. A este respeito, a levedura tem sido também amplamente utilizada como veículo para a expressão de genes heteróloga. A espécie Saccharomyces cerevisiae tem uma longa história de utilização industrial, incluindo a sua utilização para a expressão de genes heterólogos. A expressão de genes heterólogos em Saccharumyces cerevisiae foi revi3ta 24

por Goodey et al. (1987, Yeast Biotechnology, D R Berry et al., eds, pp 401-429, Allen e Unwin, Londres) e por King et al. (1989, Molecular and Cell Biology of Yeasts, E F Wlaton e G T Yarronton eds, pp 107-133, Blackie, Glasgow).

Por vários motivos, a Saccharomyces cerevisiae é bem adequada para a expressão de genes heterólogos. Primeiro, é não patogénica para humanos e é incapaz de produzir algumas endotoxinas. Segundo, tem uma longa história de utilização segura após séculos de exploração comercial para vários fins. Isto conduziu a uma grande aceitabilidade pública. Terceiro, a utilização comercial extensiva e pesquisa dedicada ao organismo resultaram num conhecimento acerca da genética e fisiologia, bem como sobre as caracteristicas de fermentação em grande escala de Saccharomyces cerevisiae.

Uma revisão dos princípios da expressão de genes heterólogos em Saccharomyces cerevisiae e secreção de produtos de genes é dada por E Hinchcliffe e Kenny (1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Vol 5, Anthony H Rose e J Stuart Harrison eds, 2a edição, Academic Press Ltd.).

Estão disponíveis alguns tipos de vectores de levedura, incluindo vectores integrativos, que requerem a recombinação com o genoma hospedeiro para sua manutenção e vectores plasmídeos de replicação autónoma.

De modo a preparar a Saccharomyces transgénica, prepararam-se construções de expressão inserindo a sequência nucleotídica da presente invenção numa construção concebida para expressão em levedura. Foram desenvolvidos alguns tipos de construções utilizadas para a expressão heteróloga. As construções contêm um promotor activo em levedura fundido com a sequência nucleotídica da presente invenção, normalmente um promotor de origem de levedura, tal como o promotor GAL1. Normalmente utiliza-se uma sequência sinal de origem dc 25

levedura, tal como uma sequência que codifica para o péptido sinal SUC2. Um terminadui activo em levedura termina o 3Íotcma de expressão.

Para a transformação de levedura, foram desenvolvidos vários protocolos de transformação. Por exemplo, uma Saccharomyces transgénica de acordo com a presente invenção pode ser preparada de acordo com os ensinamentos de Hinnen et al. (1978, Proceedings of The National Academy os Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, J D (1978, Nature, Londres, 275, 104) e Ito, H et al. (1983, J Bacteriology 153, 163-168).

As células de levedura transformadas são seleccionadas utilizando vários marcadores selectivos. De entre os marcadores utilizados para a transformação fazem parte um número de marcadores auxotróficos como o LEU2, HIS4 e TRP1 e marcadores de resistência a antibióticos dominantes, como marcadores do antibiótico aminoglicósido, e.g. G418.

Um outro organismo hospedeiro é uma planta.

Embora a enzima e sequência nucleotidica que a codifica não estejam descritas na EP-B-0470145 e CA-A-2006454, estes dois documentos proporcionam alguma informação de fundo útil, sobre os tipos de técnicas que podem ser utilizadas para preparar plantas transgénicas de acordo com a presente invenção. Alguns destes ensinamentos base são agora incluídos nos seguintes comentários. 0 princípio básico na construção de plantas geneticamente modificadas é inserir a informação genética no genoma da planta, de modo a obter uma manutenção estável do material genético inserido.

Existem algumas técnicas para inserir a informação genética, sendo os dois princípios fundamentais a introdução directa da informação genética e a introdução de informação 26 !

> !

I ά Μ genética utilizando um sistema vector. Uma revisão das técnioas gerais pode ser encontrada no3 artigos de Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Mol Biol [1991] 42:205-225) e Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech Março/Abril 1994 17-27).

Assim, num aspecto, a presente invenção refere-se a um sistema vector que transporta uma sequência nucleotídica ou construção de acordo com a presente invenção e que é capaz de introduzir a sequência nucleotídica, ou construção, no genoma de um organismo, como uma planta. O sistema vector compreende um vector, mas pode compreender dois vectores. No caso de dois vectores, o sistema vector é normalmente referido como sistema vector binário. Os sistemas vector binários são descritos em maior pormenor em Gynheung An et al. (1980), Binary Vectors, Plant Moleular Biology Manual A3, 1-19.

Um sistema bastante utilizado para a transformação de células de plantas com um dado promotor ou sequência nucleotídica, ou construção baseia-se na utilização de um plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens ou um plasmídeo Ri de Agrobacterium rhizogenes An et al. (1986), Plant Physiol. 81, 301-305 e Butcher D.N. et al.(1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D.S. Ingrams e J.P. Helgeson, 203-208.

Construíram-se alguns plasmídeos Ti e Ri diferentes, que são adequados para a construção da planta ou construções de células de planta acima descritas. Um exemplo não limitante de um plasmídeo Ti deste tipo é pGV3850. A sequência nucleotídica ou construção da presente invenção deverá ser preferencialmente inserida no plasmídeo Ti, entre as sequências terminais de T-ADN ou adjacentes à sequência de T-ADN, de modo a impedir a disrupção das sequências imediaLamente em torno dos bordoo do T-ADN, dado 27 1 que pelo menos uma destas regiões parece ser essencial para a inserção de T-ADN modificado, no genoma da planta.

Como se entenderá pela explicação acima, se o organismo é uma planta, então o sistema vector da presente invenção é de preferência um que contém as sequências necessárias para infectar a planta (e.g. a região vir) e pelo menos um parte de bordo de uma sequência de T-ADN, estando a parte do bordo localizada no mesmo vector que a construção genética. De preferência, o sistema vector é um plasmideo Ti de Agrobacterium tumefaciens, ou um plasmideo Ri de Agrobacterium rhizogenes, ou um seu derivado, dado que estes plasmideos são bem conhecidos e amplamente utilizados na construção de plantas transgénicas e existem muitos sistemas vector baseados nestes plasmideos, ou nos seus derivados.

Na construção de uma planta transgénica, a sequência nucleotidica ou construção da presente invenção pode ser primeiro construída num microorganismo em que o vector se pode replicar e que é fácil de manipular, antes da inserção na planta. Um exemplo de um microorganismo útil é a E. coli, mas podem-se utilizar outros microorganismos com as propriedades acima. Quando um vector de um sistema vector como acima definido, foi construído em E. coli, este é transferido, se necessário, para uma estirpe adequada de Agrobacterium e.g. Agrobacterium tumefaciens. 0 plasmideo Ti que engloba a sequência nucleotidica, ou construção da invenção é assim, de preferência, transferido para uma estirpe adequada de Agribacterium , e.g. A. tumefaciens, de modo a obter uma célula de Agrobacterium que inclui a sequência nucleotidica ou construção da invenção, cujo ADN é subsequentemente transferido para a célula de planta a ser modificada.

Como referido na CA-A-2006454, está disponível uma grande quantidade de vectores de clonagem que contêm um sistema de replicação em E. coli e um marcador que permite uma selecção 28

das células transformadas. Os vectores contêm por exemplo a série pBR 322 e pUC, a série M13 mp, pACYC 184, etc.

Deste modo, o nucleótido ou construção da presente invenção pode ser introduzido numa posição de restrição adequada, no vector. 0 plasmideo contido é utilizado para a transformação em E. coli. As células de E. coli são cultivadas num meio nutriente adequado e em seguida colhidas e lisadas. 0 plasmideo é então recuperado. Como método de análise, utiliza-se geralmente análise de sequência, análise de restrição, electroforese e outros métodos bioquímicos-biologia molecular. Após cada manipulação, a sequência de ADN utilizada pode ser restringida e ligada com a próxima sequência de ADN. Cada sequência pode ser clonada no mesmo, ou num plasmideo diferente.

Após cada método de introdução do promotor, ou construção, ou sequência nucleotídica, desejados, de acordo com a presente invenção, em plantas, a presença e/ou inserção de outras sequências de ADN pode ser necessária. Se, por exemplo, para a transformação se utiliza o plasmideo Ti- ou Ri das células de plantas, pode-se ligar pelo menos o limite da direita e muitas vezes, no entanto, o limite esquerdo e direito do T-ADN do plasmideo Ti e Ri, como sequências flanqueadoras dos genes introduzidos. A utilização de T-ADN para a transformação de células de plantas tem sido intensivamente estudada e está descrita na EP-A-120516; Hoekema, in: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B.B., Alblasserdam, 1985, Capítulo V; Fraley, et al., Crit. Rev. Plant. Sei., 4:1-46; e An et al., EMBO J. (1985) 4:277-284. A infecção directa de tecidos de plantas por Agrobacterium é uma técnica simples que tem sido amplamente utilizada e que está descrita em Butcher D.N. et al. (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D.S. Ingrams e J.P. Helgeson, 203-208. Para outros ensinamentoo 29 i

sobre este tópico, veja-se Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) e Christou (Agro—Food-

Industry Hi-Tech Março/Abril 1994 17-27). Com esta técnica, a infecção de uma planta pode ser feita numa certa parte, ou tecido da planta, i.e. numa parte de uma folha, uma raiz, um caule ou outra parte da planta.

Tipicamente, na infecção directa de tecidos de planta por Agrobacterium que transporta o promotor e/ou o GOI, a planta a ser infectada é ferida, e.g. cortando a planta com uma lâmina, ou fazendo uma punção com uma agulha, ou esfregando a planta com um abrasivo. A ferida é então inoculada com o Agrobacterium. A planta inoculada ou parte da planta, é então crescida num meio de cultura adequado e deixada a desenvolver em planta madura.

Quando as células de planta são construídas, estas células podem ser crescidas e mantidas de acordo com métodos de cultura de tecidos, bem conhecidos, tais como fazendo a cultura de células num meio de cultura adequado, suplementado com os factores de crescimento necessários, tais como aminoácidos, hormonas de plantas, vitaminas, etc. A regeneração das células transformadas em plantas geneticamente modificadas, pode ser realizada utilizando métodos conhecidos para a produção de plantas a partir de culturas de células ou tecidos, por exemplo seleccionando rebentos transformados utilizando um antibiótico e fazendo a sub-cultura dos rebentos num meio contendo os nutrientes adequados, hormonas de plantas, etc.

Outros ensinamentos sobre transformação de plantas podem ser encontrados na EP-A-0449375.

Em resumo, a presente invenção proporciona um processo para estabilizar pelo menos uma proteína num ambiente acídico, que compreende o contacto da proteína com uma pectina des-esLerifiçada enzimaticamente, em particular uma pectina dc3- 30

esterificada enzimaticamente do modo em blocos, preparada por técnicas de ADN recombinante.

Além disso, a presente invenção proporciona uma enzima recombinante útil nesse processo.

Uma forma de concretização da presente invenção preferida, refere-se a um processo para a estabilização de pelo menos uma proteína num meio ácido, que compreende contactar a proteína com uma pectina des-esterificada enzimaticamente do modo em blocos, preparada por técnicas de ADN recombinante, em que a a pectina des-esterificada enzimaticamente do modo em bloco, é preparada utilizando uma enzima recombinante e em que a enzima recombinante compreende qualquer uma das sequências de aminoácidos apresentadas na SEQ ID NO. 1 ou SEQ ID No. 2 ou uma variante, derivado ou homólogo seu derivado, incluindo suas combinações, e tem as seguintes características: 1. um peso molecular de cerca de 36 kD a cerca de 64 kD; 2. um pH óptimo de 7-8, quando medido com 0,5% de pectina de lima em NaCl 0,15 M; 3. uma temperatura óptima de pelo menos 50 °C; 4. uma estabilidade à temperatura na gama de cerca de 10° a pelo menos 40 °C; 5. um valor de Km de 0,07%; 6. um máximo de actividade a níveis de cerca de NaCl 0,25 M; 7. um máximo de actividade a níveis de cerca de Na2S04 0,2 M; e 8. um máximo de actividade a níveis de cerca de NaNC>3 0,3M,

Uma outra forma de concretização da presente invenção preferida, refere-se a um método para des-esterificar uma pectina enzimaticamente, do modo em blocos, que compreende tratar a pectina com uma enzima recombinante que compreende qualquer uma das sequências de aminoácidos apresentadas na SEQ ID No.l OU SEQ 1L) No. 2, ou uma sua variante, derivado ou 31

i! ¥ homólogo, incluindo combinações destes, em que a enzima recombinante tem ds seguintes características: 1. um peso molecular de cerca de 36 kD a cerca de 64 kD; 2. um pH óptimo de 7-8, quando medido com 0,5% de pectina de lima em NaCl 0,15 M; 3. uma temperatura óptima de pelo menos 50 °C; 4. uma estabilidade à temperatura na gama de cerca de 10° a pelo menos 40 °C; 5. um valor de Km de 0,07%; 6. um máximo de actividade a níveis de cerca de NaCl 0,25 M; 7. um máximo de actividade a níveis de cerca de Na2S04 0,2 M; e 8. um máximo de actividade a níveis de cerca de NaN03 0,3M.

Uma outra forma de concretização preferida da presente invenção, refere-se a uma enzima recombinante que compreende qualquer uma das sequências de aminoácidos apresentadas na SEQ ID N0.1 ou SEQ ID No. 2, ou uma sua variante, derivado ou homólogo, incluindo combinações destes, em que a enzima recombinante tem as seguintes características: 1. um peso molecular de cerca de 36 kD a cerca de 64 kD; 2. um pH óptimo de 7-8, quando medido com 0,5% de pectina de lima em NaCl 0,15 M; 3. uma temperatura óptima de pelo menos 50 °C; 4. uma estabilidade à temperatura na gama de cerca de 10° a pelo menos 40 °C; 5. um valor de Km de 0,07%; 6. um máximo de actividade a níveis de cerca de NaCl 0,25 M; 7. um máximo de actividade a níveis de cerca de Na2S04 0,2 M; e 8. um máximo de actividade a níveis de cerca de NaN03 0,3M.

Outras formas de concretização da presente invenção preferidas, referem-se ao processo, método e enzima recombinante preferidos acima mencionados, e em que a enzima 32 i ι i * j recombinante foi expressa por uma sequência nucleotídica compreendendo a sequência apresentada como seq id NO. 3 ou 3EQ ID NO.4, ou uma sua variante, derivado ou homólogo. A amostra seguinte foi depositada de acordo com o tratado de Budapeste no depósito reconhecido, The National Collections of Industrial and Marine Bactéria Limited (NCIMB) em 23 St Machar Drive, Aberdeen, Escócia, AB2 1RY, Reino Unido era 6 de Julho de 1995: NCIMB 40749 (que corresponde ao plasmideo p034). A amostra seguinte foi depositada de acordo com o tratado de Budapeste, no depósito reconhecido, The National Collections of Industrial and Marine Bactéria Limited (NCIMB) em 23 St Machar Drive, Aberdeen, Escócia, AB2 1RY, Reino Unido em 12 de Julho: NCIMB 40750 (que corresponde ao plasmideo P017).

Assim, outras formas de concretização da presente invenção preferidas, referem-se ao processo, método e enzima recombinante, acima mencionados e em que a enzima recombinante é capaz de ser expressa por NCIMB 40749 ou NCIMB 40750. A presente invenção proporciona também uma sequência de aminoácidos que compreende a sequência apresentada como SEQ ID No. 5, ou uma sua variante, derivado, homólogo, adequado para utilização em diminuir ou aumentar a estabilidade de uma proteína ao calor.

Além disso, a presente invenção proporciona uma sequência nucleotídica que compreende a sequência apresentada como SEQ ID NO. 6, ou uma sua variante, derivado ou homólogo, adequado para ser utilizado na expressão de uma sequência de aminoácidos para diminuir ou aumentar a estabilidade de uma proteína ao calor. 33

I I

No que se refere a estes últimos aspectos, o comentário acima a respeito de variantco, derivados, homólogos, construções, vectores, transformação de organismos hospedeiros é igualmente aplicável, embora, a sequência de aminoácidos e a sequência nucleotidica neste caso afectem, obviamente, a estabilidade das proteínas ao calor. A este respeito, pensa-se que a sequência de aminoácidos apresentada na SEQ ID NO. 5 é capaz de diminuir ou aumentar a estabilidade de uma proteína ao calor, tal como a PME da presente invenção. A sequência de aminoácidos pode também aumentar ou diminuir a estabilidade de outras proteínas, incluindo PMEs de outras fontes. A presente invenção será em seguida descrita apenas a título de exemplo, em que se faz referência às Figuras seguintes:

Figura 1, que é um diagrama esquemático de um citrino, como uma laranja;

Figura 2, que é um gel de SDS PAGE da enzima recombinante da presente invenção;

Figura 3, que é um gráfico para determinar o pH óptimo;

Figura 4, que é um gráfico para determinar a temperatura óptima;

Figura 5, que é um gráfico para determinar a estabilidade à temperatura;

Figura 6, que é um gráfico para determinar o valor de Km;

Figura 7, que é um gráfico para determinar a actividade na presença ou ausência de NaCl; 34 i

. «. I ι.... ! - \ί

Figura 8, que é um gráfico para determinar a actividade na presença ou ausência de Na2S04;

Figura 9, que é um gráfico para determinar a actividade na presença ou ausência de NaN03;

Figura 10, que é um mapa do plasmideo p017;

Figura 11, que é um mapa do plasmideo p034;

Figura 12, que é um diagrama de dois genes;

Figura 13, que é um mapa do plasmideo pJKlO;

Figura 14, que é um mapa do plasmideo pJKll;

Figura 15, que é um mapa do plasmideo pJK12;

Figura 16, que é um mapa do plasmideo pJK20;

Figura 17, que é um mapa do plasmideo pJK21; e

Figura 18, que é um mapa do plasmideo pJK22. A Figura 1 foi discutida na descrição acima. As outras figuras são discutidas a seguir.

SECÇÃO EXPERIMENTAL

MATERIAIS E MÉTODOS PARA BIOQUÍMICA

Material de planta: Uti1izaram-se laranjas espanholas imaturas da variedade Navelina classe I, sem sementes, para isolar a PME. As laranjas foram descascadas manualmente e as cascas armazenadas a -80 °C. 35 íí— Li.y ^ f

Extracção de PME da casca de laranja A PME foi purificada de acordo com o processo seguinte. Todas as operações foram realizadas a 4 °C. 600 g de cascas de laranja congeladas foram descongeladas e cortadas em pedaços menores. Em seguida, estes foram homogeneizados num misturador Warring durante 2 min, em 1200 ml de tampão (succinato de Na 100 mM pH 6,2, DTT 1 mM) . Adicionaram-se 36 g de NaCl sólido ao homogenato para se obter uma concentração final de 3% (p/v), de modo a isolar as proteínas ligadas a membranas (Versteeg et al. (1978) Lebensmittel-Wiss. u. Technol., 11^267-274). Após 2 horas de incubação com agitação suave a 4 °C, a suspensão foi filtrada através de uma malha de nylon e o filtrado foi centrifugado a 10.000 rpm durante 20 min, para remover os resíduos insolúveis. O sobrenadante foi então fraccionado utilizando precipitação com (NH4)2S04. O sobrenadante foi primeiro precipitado com 30% de (NH4)2S04, sob agitação lenta, durante 30 min. Após centrifugação a 20.000 rpm durante 10 min, o sobrenadante foi ainda precipitado com 60% de (NH4)2S04, durante 30 min. A suspensão foi centrifugada como anteriormente e o precipitado foi ressuspendido em 50 ml de MES 50 mM, DTT 1 mM, pH 6,8 e dialisado contra o mesmo tampão, durante a noite.

Cromatografia A amostra dialisada foi ainda separada por cromatografia de troca catiónica. Aplicou-se uma amostra de 40-50 ml a uma CM-Sepharose™ CL-6B (1,5 x 1,5 cm) em dois ciclos, com uma lavagem de 30 min entre os ciclos com tampão A: MES 50 mM, DTT 1 mM pH 6,8. Após lavagem das proteínas não ligadas, com tampão A, as proteínas ligadas foram eluídas com um gradiente de NaCl crescente de 0 - 4 M de NaCl, num total de 500 ml. O fluxo era de 25 ml/h e recolheram-se fraeções de 8,33 ml. O perfil de absorção de proteínas foi medido a 280 nm. 36

Todas as fracções foram analisadas quanto α actividadc dc PME e proteína. O conteúdo em proteína foi medido espectrofotometricamente com o método BioRad.

As fracções que contêm actividade de PME foram reunidas e concentradas por diálise de pressão, utilizando um sistema de filtros Amicon. Fez-se a permuta de tampão para Tris 50 mM, DTT 1 mM, NaCl 0,1 M pH 7, no mesmo sistema.

Aplicaram-se então 9 ml de amostra de PME concentrada a uma coluna de filtração em gel Sephacryl™ S-200 (2,6 x 70 cm) . A coluna foi equilibrada com Tris 50 mM, DTT 1 mM, Nacl 0,1 M, pH 7. O fluxo era de 40 ml/h e recolheram-se fracções de 5,33 ml. As fracções contendo actividade de PME foram recolhidas e concentradas.

Actividade enzimática A PME cataliza a clivagem de grupos metiléster da pectina. Durante os passos de purificação, a PME foi detectada por um método rápido, utilizando o teste indicador de vermelho de metilo. Devido à clivagem dos grupos metilo dos resíduos de ácidos galacturónico na cadeia de pectina, formaram-se grupos carboxilo e o pH desceu no teste. O indicador de pH - vermelho de metilo - muda de cor na descida de pH, de amarelo (pH 6,2) para rosa (pH 4,2). O teste continha 1 ml de Grinsted™ pectina 1450 (DE 70%) a 0,5% (fornecida pela Danisco Ingredients, Danisco A/S) solubilizada em NaCl 0,15 M pH 7 e 125 μΐ de amostra. As amostras que apresentaram um teste de vermelho de metilo positivo, após 10 min de incubação a 30 °C foram então medidas pelo método de titulação (Versteeg et al. (1978) Lebensmittel.-Wiss. u. Technol., 11:267-274) .

Com o método de titulação, o teste continha 10 ml de pectina de lima a 0.5% (Grinsted™ pectina 1450 - fornecida pela Danisco IngredienLs, Danisco A/3) solubilizada em NaCl 37 0,15 Μ ρΗ 6,8 e 10 - 100 μΐ de amostra. A titulação foi realizada com NaOH 0,02M e a reacçao foi medida à temperatura ambiente. Utilizou-se um titulador automático (Versteeg et ai. (1978) Lebensmittel. - Wiss. u. Technol., 11:267-274) . SDS-PAGE/transferência de manchas Western A pureza da fracção de PME foi analisada por SDS-PAGE utilizando Phastsystem™ da Pharmacia, com geles de 10-15% de gradiente de SDS. A electroforese e coloração com prata das proteínas foram realizados como descrito nos folhetos informativos da Pharmacia. Para determinação do pi utilizaram-se geles IEF 3-9 PhastSystem™.

Utilizou-se imunoelectroforese em gel, para a caracterização de anticorpos policlonais produzidos contra a PME de casca de laranja. As fracções enzimáticas foram separadas em SDS-PAGE e transferidas para papel-NC por técnicas de transferência semi-secas, numa unidade de transferência Semidry da PhastSystem™. 0 papel de NC foi incubado com um primeiro anticorpo diluído 1:50 e corado com o segundo anticorpo, acoplado a fosfatase alcalina (Dako A/S Glsotrup, Dinamarca) utilizado a uma diluição de 1:1000.

Mapeamento de péptidos A PME foi digerida, ou com tripsina, ou com endo-proteinase Lys-C de Lysobacter enzymogenes (ambas as preparações de enzima eram de grau de sequenciação, adquiridas da Boehringer Manheim, Alemanha).

Metilaram-se em carboxi, 100 μς de PME purificada com iodoacetamida, para proteger os grupos SH reduzidos. Em seguida, a proteína foi clivada com tripsina (4 pg/20-100 μΐ). A clivagem hidrolítica foi realizada a 40 °C durante 2x3 horas. A reacção foi parada com adição de 20 μΐ de TFA. Após centrifugação a 15.000 rpm durante 5 min, os péptidos foram i

purificados numa coluna de HPLC de fase inversa (coluna C18 Vydac 10). Aplicaram-se amostras de 2 X 000 μΐ. Os péptidoo foram eluidos e separados com um gradiente crescente de acetonitrilo de 0,05 - 0,35% em 60 min, em TFA a 0,1%. Os péptidos foram recolhidos manualmente em tubos Eppendorf.

Para digestão com a endoproteinase Lys-C, dissolveu-se PME liofilizada (0,1 mg) em 50 μΐ de ureia 8 M, NH4HCO3 0,4 M, pH 8,4. Após sobreposição com N2 e adição de 5 μΐ de DTT 45 mM, a proteína foi desnaturada e reduzida durante 15 min a 50 °C sob N2. Após arrefecimento à temperatura ambiente, adicionaram-se 5 μΐ de iodoacetamida 100 mM para derivatizar as cisteínas, durante 15 min à temperatura ambiente, no escuro, sob N2. Subsequentemente, adicionaram-se 90 μΐ de água e 5 μg de endo-proteinase Lys-C em 50 μΐ de tricina 50 mM e EDTA 10 mM, pH 8,0, e a digestão foi realizada durante 24 horas a 37 °C, sob N2.

Os péptidos resultantes foram separados como descrito para péptidos digeridos com tripsina.

Os péptidos seleccionados foram ainda purificados numa coluna Devosil 3 Cj8 RP-HPLC de 0,46 x 10 cm (Novo Nordisk, Dinamarca) . Os péptidos purificados foram então aplicados num sequenciador de aminoácidos, Applied Biosystems 476A, utilizando ciclos rápidos líquidos com pulso. ESTUDO 1

Durante a purificação de PME, 600 g de casca de laranja foram homogeneizados e após precipitação com (NH4)2S04 a 30 -60% e diálisc, a amostra foi aplicada a uma coluna de troca catiónica (CM-Sepharose™ CL-6B). A PME liga-se fortemente a uma coluna de permuta catiónica a pH 6,8, enquanto que a maioria das proteínas não se liga à coluna e elui no volume de lavagem. Com um gradiente de NaCl crescente, a PME eluiu em dois picos, com a actividade principal em PME I (Iracção 4 9- 39

53) a uma concentração de NaCl de 0,25 M. Um pico menor de PME eluiu a uma concentração mais baixa de Nacl (fracção 25-32). Λ outra purificação foi apenas realizada para a PME 1, que continha a actividade maior.

Após concentração, a fracção de PME foi ainda purificada utilizando cromatograf ia de filtração em gel (coluna Sephacryl™ S-200) . As fracções que contêm a actividade de PME mais elevada foram reunidas e concentradas por diálise em filtros amicon.

No total, obtiveram-se aproximadamente 4 mg de PME a partir 600 g de cascas de laranja, que corresponde a um rendimento em proteína de 12%.

Por SDS-PAGE observou-se apenas uma banda de proteína na fracção de PME purificada com um PM de 36000 D (Figura 2) . A focagem isoeléctrica de PME mostrou que o PI era > 9.

Caracterização e dados cinéticos A caracterização da PME e determinação de valores óptimos foram realizadas com o método de titulação descrito em Materiais e Métodos. O pH óptimo da actividade de PME foi medido com pectina de lima a 0,5% (Grinsted™ pectina 1450 - fornecido pela Danisco Ingredients, Danisco A/S) em NaCl 0,15 M. Os dados são apresentados na Figura 3. O pH óptimo foi encontrado ente 7 -8. A temperatura óptima foi encontrada a 50 °C - veja-se os dados apresentados na figura 4. A estabilidade da PME ao calor (temperatura) foi determinada incubando a amostra de enzima em tubos Eppendorf, a diferentes temperaturas, durante 15 min. Após incubação, a actividade enzlmâtlca foi deLerminada por teste tradicional 40

I 1 ri~ L-^ ^-B. U \ x pelo método de titulação. A estabilidade da actividade da enzima era entre 10-40°c - veja-se dados na liyura 5. A afinidade para pectina de lima (Grinsted™ pectina 1450 fornecido pela Danisco Ingredients, Danisco A/S) foi determinada por meio de um gráfico de Lineweaver Burle de diferentes concentrações de pectina versus actividade. Os dados são apresentados na figura 6. O Km foi calculado a partir da curva como sendo de 0,07%.

Os requerentes verificaram também que a PME podia também des-esterificar a pectina de beterraba. A pectina de beterraba contém 60% de resíduos de ácido galacturónico, estando alguns dos seus grupos carboxilo metilados (uma DE de aproximadamente 60%) e, além disso, alguns dos grupos de ácido galacturónico estão acetilados em C-2 e/ou C-3. A actividade de PME foi medida como descrito em Materiais e Métodos, excepto que se utilizou 1% de pectina de beterraba solubilizada em NaCl 0,15 M neste teste, dado que a pectina de beterraba continha aproximadamente 60% de pectina. Os resultados mostraram que a PME pode des-esterificar a pectina de beterraba, mesmo apesar dos resíduos de ácido galacturónico estarem acetilados nas posições C-2/C-3.

Actividade da enzima (Hmol/min/ml) pectina de lima a 0,5% 387 (Grinsted™ pectina 1450 fornecida pela Danisco Ingredients, Danisco A/S) pectina de beterraba a 1,0% 80

Outras experiências mostraram que a PME da presente invenção requer preferencialmente NaCl para actividade vejam-se dados na figura 7. A actividade aumenta com o aumento da concentração de NaCl, com um óptimo a NaCl 0,25 M. 41 I !

I

ί ν rf—' «i y actividade, em

Concentrações mais elevadas reduzem a comparação com a actividade máxima.

Outras experiências mostraram que outros sais, e.g. Na2S04 ou NaN03 podem substituir o NaCl para a actividade de PME. Os dados são apresentados nas figuras 8 e 9. Δ actividade óptima foi encontrada a Na2S04 0,2 M e NaN03 0,3 M, respectivamente.

Análise do terminal-N

Estudos mostraram que a sequência de terminal-N da PME nativa estava bloqueada. O desbloqueamento foi conseguido tratando a PME transferida para uma membrana de PVDF com TFA anidro, durante 4 min a 45 °C em tubos, após evaporação da maioria do TFA, os tubos foram colocados a 65 °C durante 4 h (Wellner, D. et al. (1990) Proc. Natl Acad. Sei. 87: 1947- 194 9) . A sequência obtida era SSSVTPNVWAADSSGNFK e a N-acetilserina é o resíduo do terminal-N de PME.

Ixnunohisto localização

Para a preparação de amostras de tecido para imunohistoquímica, fixaram-se fatias finas da parte intermédia do fruto maduro com 2% de paraformaldeído, 0,25% de gluteraldeído e 3% de sucrose tamponada com tampão fosfato 0,05M pH 7. Após incubação durante 2 horas a 25 °C e 63 horas a 5 °C, os espécimes foram lavados 3 x 20 min em tampão fosfato 0,05M pH 7. A desidratação foi realizada utilizando uma série de lavagens com etanol (50%, 70%, 80% e 96%), seguido de 3 lavagens com etanol a 99% (30 min para cada concentração de etanol). Após um tratamento adicional com 2 x 2 h em petróleo (Shellsol™ D70k, Q7712) e 2 x 2 h em parafina com 7% de cerca de abelha, as amostras foram embebidas em parafina. Fizeram-se secções transversais de 12,5 μιη num Supercut 2050 Reichart Jung pyramitome. 42 \

Imunologia

Pré-incubaram-se secções de tecido com 20% de soro de suíno em TBS (Tris/HCl 0,5 M pH 7,6, NaCl 0,15 M, Triton X-100 a 0,1%) durante 30 min, antes de tratamento durante 1 hora com PME, os anticorpos foram diluídos a 1:50. O excesso de anticorpos foi removido por lavagem com TBS durante 5x5 min. Após lavagem as secções foram incubadas durante 30 minutos com anticorpos secundários acoplados com fosfatase alcalina 1:20 em tampão TBS. O excesso de anticorpo secundário foi removido por lavagem com TBS, como acima descrito. Antes da coloração, as secções foram tratadas com tampão acetato de veronal pH 9,2 durante 5 min e em seguida coradas com Fast Red e fosfato de Naftol As-BI (Sigma no N4875)(durante 20 min). O excesso de reagente foi removido por lavagem com água. Os controlos foram corridos em paralelo e tratados com soro pré-imune.

Resultados

Localizações imunológicas com o anticorpo produzido contra PME de casca mostraram que a PME se situa em grandes quantidades na camada celular externa da lamela entre os segmentos, no núcleo e na camada celular externa dos sacos de sumo e também na camada celular interna do albedo (veja-se Figura 1). Estes resultados demonstram que o anticorpos contra a PME da casca reagem com a PME da polpa (a polpa consiste de segmentos, veja-se Figura 1) indicando uma homologia elevada entre a PME localizada na casca e na polpa, respectivamente. ESTUDO 2 A PME de casca de laranja foi purificada em qrandes quantidades. A este respeito, aproximadamente 70 mg de PME foram isoladas a partir de 5 kg de cascas de laranja. A PME purificada foi então utilizada no teste de aplicação utilizando proteína de leite - i.e. um iogurte bebível. Neste teste, a pectina des-esterlfiçada enzimaLicamente, do modo em 43 \ U, p blocos melhorou as propriedades de estabilização de proteína, em comparação com a pectina não des-esterificada, presumivelmente devido à estrutura do bloco formado. 0 produto final também tina uma viscosidade favorável.

Isoformas de enzima

Apesar de não pretender estar cingido à teoria, pensa-se que a PME da presente invenção pode existir em pelo menos duas isoformas. A isoforma S tem um peso molecular de cerca de 36 kD e pode ser referida como "PME curta". A isoforma L tem um peso molecular de cerca de 64 kD e pode ser referida como "PME longa".

Pensa-se também que a isoforma L é mais estável ao calor do que a isoforma S. Além disso, pensa-se que a isoforma S começa o passo de des-estertificação inicial de um modo em blocos e é então seguida pela isoforma L.

Por outras palavras, pensa-se que a isoforma L pode ter uma afinidade maior para a pectina des-esterificada do que a isoforma S.

Pensa-se que a estabilidade da isoforma L ao calor poderá ser devida à sequência de aminoácidos representada como SEQ ID No. 5.

Outros estudos mostraram que o gene para a isoforma L tem uma extensão N-terminal a montante da sequência sinal. Isto é apresentado em diagrama na figura 12.

ISOLAMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE ADNc QUE CODIFICAM PARA A METIL ESTERASE DE PECTINA, QUE SE OBTÉM A PARTIR DA LARANJA

MATERIAIS E MÉTODOS PARA BIOLOGIA MOLECULAR

1. MATERIAIS 44 3

LJtilizaram-se laranjas (Citrus sinensis) var. Navel, provenientes de Marrocos.

2. ADN O ADN genómico foi isolado como descrito por Dellaporta S.L. et al. (1983) Plant Mol Biol Rep 1(4):19-21. Isolou-se ADN de plasmideo como descrito em EP-B-0470145.

3. ARN

Isolou-se ARN total a partir de frutos de laranja maduros. Utilizou-se a parte exterior da polpa e a porção interior da camada do albedo (veja-se Figura 1) de um fruto de laranja Navel para o isolamento de ARN, seguindo o processo descrito por Logeman J., Schell J. e Willmitzer L. (1987) Anal. Biochem 163:16-20. "improved Method for the isolation of ARN from Plant tissues".

4. PCR

Utilizou-se ARN total de laranja para realizar PCR inversa com o kit de PCR inverso rTth (Perkin Elmer) de acordo com as instruções do fabricante, com o seguinte ciclo de temperatura:

Transcrição inversa: 70 °C 2 min 60 °C 2 min 50 °C 2 min 45 °C 5 min 40 °C 5 min 30 °C 10 min 42 °C 10 min 70 °C 2,5 min 5 °C ensopar 45 i -

Amplificação (PCR)

94 o Π min 92 °C 1 min 45 °C 2 min 72 O O K3 min em 40 ciclos 72 °C 5 min 5 °C ensopar 5. CLONAGEM DE FRAGMENTOS

Os fragmentos de PCR foram clonados no local EcoRV do vector pT7Blue (Novagen), de acordo com as instruções do fabricante.

6. SEQUENCIAÇÃO DE ADN

Sequenciou-se ADN de cadeia dupla, essencialmente de acordo com o método didesoxi de Sanger et al. (1979), utilizando o kit Auto Read Sequencing (Pharmacia) e o sequenciador de ADN A.L.F. Pharmacia LKB (Ref: Sanger, F. Nickeln, S. e Coulson, A.R. (1979). DNA sequencing with chain-determinant inhibitors. Proc. Nat. Acad. Sei. USA 74:5463-5467). Os iniciadores de síntese utilizados para a sequenciação estão enumerados a seguir (apresentados de 5' para 3')

UNI (Iniciados de síntese M13-20) - 17 MER GTAAACGACGGCCAGT

REV - 19 MER GGAAACAGCTATGACCATG

01 - 20 MER GACAACGGCAACGAGCCTCA

02 - 22 MER 46 ^\ι

GCACTTGTAATAACCCTAAAT

03 - 20 MER CAGGGTAGTTTCCCGACGTA

04 -.20 MER TACGTCGGGAAACTACCCTG

05- 21 MER

CTCCTGGAAGCTTCATTGCTG

06 - 20 MER GAAGCTTCTTGAAGAGAACG

07 - 20 MER

CGTTCTCTTCAAGAAGAAGCTTC

08 - 22 MER

GAGGATAGCATGATGAGGCTCG

09 - 22 MER

GCAGTTCACAAAGAACTGGCGG

010 - 22 MER CCTCATGATCATCATGTCAGTG

011 - 21 MER GCTCCTCAGGGAGGCACTAAG

012 - 21 MER CAGCAATGAAGCTTCCAGGAG

013 -21 MER CTTAGTGCCTCCCTGAGGAGC

014 - 18 MER 47

GCCACCGCCTGGTGCTTT

015 - 18 MER AAAGCACCAGGCGGTGGC

016 - 20 MER GCGGGATGCGTTGTCAGACG

017 - 20 MER GAGGCACTAAGCGGTATATT

018 - 18 MER GCAACTGTAGCAGACTTG

019 - 20 MER

C AC T GACAT GAT GAT CAT GA

020 - 20 MER

CAAT TAAGCAGTT CACAAAG

021 - 20 MER AATATACCGCTTAGTGCCTC A sequência de nucleótidos sequenciada é apresentada como SEQ ID No. 3 (derivada de p017) e SEQ ID No. 4 (derivada de p034). A sequência N-terminal é apresentada como SEQ ID NO. 6

7. PESQUISA DA BIBLIOTECA

Uma biblioteca de ADNc em lambda zapll (Stratagene) , que foi preparada a partir de ARNm isolado da polpa e albedo do fruto da laranja foi pesquisada com a sonda de PCR radiomarcada, adequada. A pesquisa foi realizada de acordo com as instruções do fabricante, excepto que a pré-hibridação e a hibridação foram realizadas em 2 x SSC, 0,1% de SDS, 10 x Denhardt e 100 pg/ml de ADN de esperma de salmão desnaturado. A hibridação foi realizada durante a noite a 67 nc. Os filtros

foram lavados duas vezes em 2 x SSC, 0,1% de SDS, duas vezes em 1 X SSC, 0,1 % de SDS e duas vezes em 0,1 x SSC, 0,1 % SDS.

8. SONDA O fragmento de PCR clonado foi isolado a partir do vector pT7 blue, por digestão com as enzimas de restrição adequadas. 0 fragmento foi separado a partir do vector por electroforese em gel de agarose e o fragmento foi purificado e radiomarcado utilizando o kit de marcação de ADN Ready to Go™ (Pharmacia) .

9. ANÁLISE SOUTHERN

Digeriu-se ADN genómico de laranja ou ADN de plasmideo com as enzimas de restrição adequadas, transferiu-se para membranas HybondN*™ e hibridou-se de acordo com as instruções do fabricante (Amersham).

10. EXPERIÊNCIAS DE HIBRIDAÇÃO IN SITU A técnica de hibridação in situ baseia-se no principio de hibridação de uma sequência de ribonucleótidos de sentido inverso com o ARNm. A técnica é utilizada para visualizar áreas em secções microscópicas em que o referido ARNm está presente. Neste caso particular, a técnica foi utilizada para localizar o ARNm que codifica para a enzima metilesterase de pectina em secções de C. sinensis.

Preparação de amostras de tecido para hibridação in situ

Fixaram-se fatias finas da parte intermédia de um fruto de laranja maduro por fixação com fixação por FAA (etanol a 45%, formalina a 5% (paraformaldeido a 40%) e ácido acético a 5%) e incubação durante 2 h a 25 °C e 63 h a 5 °C. As amostras foram lavadas durante 3 x 20 min num tampão fosfato 0,05 M, pH 7. A desidratação foi realizada utilizando uma série de lavagens com etanol (50%, 70%, 80%, 96%) terminando com 3 49 1 1

-Λ \ lavagens em etanol a 99%. Cada lavagem foi de 30 min. As amostras foram então traladas com petróleo (Shellsol™ D70k, Q7712) em 2 x 2h e por mais 2 x 2h em parafina com 7% de cera de abelha. Em seguida, as amostras foram embebidas em parafina. Fizeram-se cortes transversais de 12,5 μπι utilizando um Supercut 2050 Reichart Jung pyramonite.

Preparação de sondas marcadas com 35S para hibridação in si tu

Clonou-se um fragmento de PCR de 501 pb de uma segunda amplificação de PCR, no vector pT7blue (Novagen) em ambas os sentidos. O vector pT7 contém um promotor de T7. A transcrição de ARN de sentido inverso e de ARN de sentido directo foram conduzidas pelo promotor SP7, após digestão dos plasmideos com BamHI. Utilizou-se um Maxiscript Kit™ (Ambion) com as seguintes modificações. Os transcritos foram corridos num gel de sequenciação a 6% para remover os nucleótidos incorporados e eluidos com o tampão de eluição fornecido com o kit de transcrição in vitro de polimerase de ARN de T7 (Ambion) . Os transcritos continham 55 nucleótidos não codificantes numa extremidade e também 9 nucleótidos não codificantes na outra extremidade. Para hibridação, utilizaram-se 107 cpm/ml de sonda marcada com 35S.

Realizou-se hibridação in situ, essencialmente como descrito por Langedale J.A. (1994) no Maize Handbook. M. Freeling e V. Walbot, eds. pp 165-180 Springer-Verlag, Nova Iorque, Inc. Verificou-se que a temperatura de hibridação era óptima a 57 °C. Após lavagem a 57 °C, as secções foram cobertas com emulsão fotográfica K-5 da Kodak e deixadas durante 3 dias a 5 °C no escuro.

11. RESULTADOS

Utilizou-se a seguinte informação de sequência para produzir iniciadores de síntese para as reacções de PCR a seguir mencionadas e para verificar a sequência de aminoácidos 50 I .

t i ' (Τ' \1 produzida pelas respectivas sequências de nucleótidos - veja-se SEQ ID No.S 7 - 19.

Sequências de péptidos de metilesterase de pectina utilizadas para a produção de iniciadores de síntese

Asn Cys Asp Met Leu Ala Tyr Gin Asp Thr Leu Tyr (PE492B)

Vai Ile Thr Ser Ala Thr Glu Ala Gin Ala Phe Thr Pro Gly Ser Phe Ile Ala Gly Ser Ser Trp Leu Gly Ser Thr Gly Phe (PE701)

Sequência de aminoácidos (PE492B,4-7) utilizada para produzir o iniciador de síntese A (Met Leu Ala Tyr Gin Asp Thr)

Iniciador de síntese A ATG (CT) T (GATC) GC (GATC) TA (TC) CA (AG) GA (TC) AC 256 mix

Sequência de aminoácidos (PE701,7-13) utilizada para produzir o iniciador de síntese B (Glu Ala Gin Ala Phe Thr Pro)

Iniciador de síntese B GT (AG)AA(GATC)GC(TC)TG(GATC)GC(TC)TC 128mix (a sequência corresponde à cadeia complementar)

Produção de um fragmento de ADN de PCR que codifica parcialmente para a metilesterase de pectina

Utilizaram-se as sequências de aminoácidos dos dois péptidos não sobreponíveis (acima descritos) para produzir oligonucleótidos mistos. Estes foram utilizados como iniciadores de síntese para a transcrição inversa e amplificação seguinte (PCR) do ARN total. O clone de PCR resultante foi sequenciado e tinha uma inserção de 501 pb. A sequência de aminoácidos deduzida a partir da sequência de 51

nucleótidos corresponde quase perfeitamente às sequências de péptidos dadas nas SEQ ID No.s 7-19.

Análise de hibridação in situ

As experiências de hibridação in situ (veja-se materiais e métodos) com as ribosondas (produzidas a partir dos clones de PCR adequados) contra o ARNm de metilesterase de pectina, mostraram uma hibridação forte na camada de células exterior da lamela entre os segmentos (veja-se Figura 1) . Também se obtiveram sinais fortes na camada celular externa dos sacos de sumo, na camada de células interna do albedo e no núcleo. Estes resultados correspondem muito bem aos resultados das localizações imunológicas, observados com anticorpos produzidos contra PME da casca, como descrito anteriormente.

Análise Southern A análise Southern mostrou que estão presentes cópias adicionais dos genes de PME isolados (representados pelos clones de ADNc) no genoma de C. sinensis. Estes outros genes de PME eram bastante homólogos aos representados em p017 e p034. A este respeito, observa-se em cada coluna uma banda de um sinal de hibridação forte, duas bandas de um sinal de hibridação médio e pelo menos duas outras bandas de um sinal mais fraco, em comparação com os restantes. Este padrão indica que o C. sinensis tem pelo menos entre 5 e 7 cópias de genes de PME no genoma.

Isolamento e caracterização de novos ADNc de PME

Pesquisou-se uma biblioteca de ANDc em Lambda zapll (Stratagene) que foi preparada como descrito em Materiais e métodos, com a inserção de 501 pb radiomarcada, do clone de PCR. Identificaram-se alguns clones que hibridam e o ADN dc 52 1 κ. plasmídeo foi excisado in vivo, de acordo com as instruções do fabricante. 0 tamanho das inserções de ADN nos clones foi determinado por digestão com EcoRV e Smal, seguido de electroforese em gel de agarose. Um dos clones, o p034, tinha um tamanho de inserção de aproximadamente 2 kb enquanto que um outro clone, o p017, tinha um tamanho de inserção de aproximadamente 1,4 kb. Estes clones foram seleccionados para posterior análise. As sequências nucleotídicas foram determinadas e são apresentadas como SEQ ID NO. 3 e SEQ ID No. 4, para p017 e p034, respectivamente. A sequência de leitura aberta em 034 que começa no nucleótido 29 e termina no nucleótido 1780, codifica para uma PME de 584 aminoácidos, incluindo um péptido sinal putativo. Pode-se prever um local de clivagem possível entre a glicina de posição 46 e a isoleucina de posição 47, de acordo com as regras de von Heijne, G. (1986) Nucl. Acids Res 14, 4683-4690 "A new method for predicting signal sequence cleavage sites”, originando assim uma enzima PME madura, longa, de 538 aminoácidos, com um peso molecular calculado em 58386 dalton. 0 peso molecular da PME longa incluindo a sequência sinal, pode ser calculado em 63502 dalton. A sequência de nucleótidos p034 inclui uma região 5' não traduzida de 29 nucleótidos e uma região 3' não traduzida de 186 nucleótidos, que termina numa cauda poli A. A sequência de leitura aberta em 017 começa no nucleótido 18 e termina no nucleótido 1103. Esta codifica para uma PME curta de 362 aminoácidos, incluindo um péptido sinal de 44 aminoácidos. Pode-se prever um local de clivagem putativo entre a glutamina na posição 44 e a serina na posição 45, resultando numa PME curta, madura, que começa com a sequência de aminoácidos Ser-Ser-Ser-Val-Thr-Pro. Esta sequência de aminoácidos de terminal-N é idêntica à sequência de aminoácidos de terminal-N da PME do tipo curto purificada, como descrito na secção bioquímica. As sequências de aminoácidos obtidao a partir da enzima purificada foram 53 η \! I . ι___ alinhadas com a sequência de aminoácidos madura deduzida para p017. Verificou-se haver uma identidade total entre os fragmentos de péptido.

Observou-se uma identidade quase total entre todos os péptidos sequenciados e a sequência de aminoácidos deduzida em p017 e também com a sequência de aminoácidos deduzida a partir de p034, a PME longa. A este respeito, ο P017 difere numa posição de aminoácido (no. 24 na sequência que codifica para o polipéptido maduro). A proteína PME curta, madura tem um peso molecular calculado de 33954 daltons. 0 peso molecular calculado da forma curta de PME, incluindo o péptido sinal, é de 39088 daltons. A 017 inclui a região não traduzida 5' de 17 nucleótidos e a região não traduzida 3' de 180 nucleótidos, terminando numa cauda poliA. A principal diferença entre a enzima PME longa e curta é uma extensão de terminal-N de 220 aminoácidos, presente na enzima madura derivada de 034 e apresentada como SEQ ID No. 5. A sequência nucleotídica correspondente que codifica para esta região da enzima PME longa, é apresentada como SEQ ID No. 6.

EXPRESSÃO DE PME EM MICROORGANISMOS A sequência de ADN que codifica quer para a forma longa, quer curta da PME de laranja foi introduzida em microorganismos para produzir uma enzima recombinante em grandes quantidades, com uma actividade específica elevada, a ser utilizada para tratamento enzimático da pectina.

EXPRESSÃO em PICHIA PASTORIS

Construção de pJKlO, pJKll e pJK12 (veja-se Fiqs. 13-15)

Utilizou-se ADN de plasmídeo p034 como ADN modelo numa reacção de PCR, com o seguinte conjunto de iniciadores de síntese: 54 i

I

I ; <

II v 5'-GAATTCATTGTCGCCGGAGTGAAC-3' com um local EcoRI numa extremidade e 5'-AAGACCAGAGACCTATGGATCCAC-3 1 com um local BamHI próximo da extremidade.

Combinando a polimerase de ADN AmpliRaqR (Perkin Elmer), ADN modelo, dATP, dGTP, dCTP e dTTP e os dois iniciadores de síntese no seguinte tampão:

Tris-HCl 60 mM (pH 8,5), (NH4)2S04 15 mM e MgCl2 1,5 mM e utilizando o seguinte ciclo de temperatura: 94 °C 2 min 94 °C 1 min 55 °C 2 min 72 °C 2 min em 35 ciclos 72 °C em 7 min 5 °C ensopar obteve-se o produto de PCR de 1690 pb esperado, que foi purificado e subclonado no vector pT7Blue (da Novagen) de acordo com as instruções do fabricante.

Os clones resultantes (designados por pT7-034) contendo um fragmento EcoRI-BamHI do tamanho esperado, foram ainda verificados por sequenciação de ADN (veja-se Materiais e métodos para Biologia Molecular). Um subclone de pT7-034 contendo a sequência r.orrecta foi digerido com EcoRI e BamHI e o fragmento de 1685 pb foi purificado e subclonado no vector pHIL-Sl de Pischia pastoris (da Invitrogen), digerido com as mesmas enzimas. 55 \ 5 1 li

t A sequência que codifica para a forma longa, madura, de PME foi clonada deste modo em sequência com o sinal de secreção de PH01 (S) no vector. 0 plasmideo resultante é designado por pJKlO e é apresentado na figura 13.

Para criar pJKll (veja-se figura 14), o fragmento EcoRI-BamHl do clone pT7-034 foi ainda subclonado num vector pBSK (da Stratagene), digerido com as mesmas enzimas. Em seguida, subclonou-se um fragmento EcoRI-Wotl de um dos clones resultantes (verificado por sequenciação de ADN) no vector de expressão de Pichia pastoris, pPIC9 (da Invitrogen), digerido com as mesmas enzimas. Isto coloca a sequência de leitura aberta que codifica para a proteína madura, da forma longa de PME, a jusante e em sequência com o sinal de secreção do factor alfa (S) em pPIC9, veja-se figura 14.

Além disso, o fragmento EcoRI-Atotl de pT7-034 também foi subclonado no vector pPIC9K (Invitrogen), criando o plasmideo pJK12 apresentado na figura 15. A única diferença entre o plasmideo pJKll e pJK2 é um gene que codifica para resistência a canamicina e que está situado em pJK12.

Tanto o sinal de secreção de PHOl em PJKlO, como o sinal de secreção alfa em pJKll e pJK12 podem direccionar a secreção do polipéptido maduro que codifica para a PME de forma longa.

Construção de pJK20, pJK21 e pJK22

Utilizou-se ADN de plasmideo p017 como ADN modelo numa reacção de PCR com os seguintes iniciadores de síntese: 5' -GAATTCTCCTCGTCGGTGACACCG-3' com um local EcoRI numa extremidade e 5'-AAGACCAGAGACCTATGGATCCAC-3' com um local BamEI próximo da extremidade. 56

\ Ο ADN modelo, polimerase AmpliTaqR, dATP, dGTP, dCTP e dTTP foram combinados com o tampao (Tris-HCl GO mM, pD 8'1 2' (NH4)2S04 15 mM e MgCl2 1,5 mM) e colocados num termobloco com o seguinte ciclo de temperatura: 94 °C 2 min 94 °C 1 min 55 °C 2 min 72 °C 2 min em 35 ciclos 57 1 72 °C em 7 min 2 °C ensopar

Obteve-se uma banda de PCR de 1008 pb esperada, que foi purificada e subclonada em pT7Blue (Novagen). Os clones resultantes foram verificados por sequenciação de ADN como explicado acima. Um plasmideo com a sequência correcta foi digerido com ecoRI e RamHI e o fragmento resultante foi ainda subclonado no vector pHIL-Sl (Invitrogen), sendo o plasmideo resultante designado por pJK20 (apresentado na figura 16) e neste, é a região que codifica para o polipéptido maduro da forma curta de PME, situado em sequência e a jusante do sinal de secreção de PH01.

Os plasmideos pJK21 e pJK22 foram construídos do mesmo modo que o explicado para pJKll e pJK12, excepto que se obteve o fragmento £coRI-NofcI para o clone pBSK-017. As figura 17 e 18 apresentam os plasmideos resultantes, em que a região que codifica para o polipéptido maduro se situa a jusante e em sequência com o sinal de secreção alfa, respectivamente em pPIC9 e pPIC9K.

Introdução da foram longa e curta de PME em Pichia pastoris por formação e transformação de esferoplastos

Os plasmídeos pJklO, pJkll, pJkl2, pJK20, pJK21 e pJk22 foram introduzidos em experiências separadas, em células Pichia pastoris GS115 A este respeito, os esferoplastos foram preparados a partir de células GS115 a crescer em meio de extracto de levedura peptona dextrose (YPD) a 28-30 °C. A preparação de esferoplastos e o processo de transformação foram realizados como descrito no kit de expressão de Pichia: Manual de instrução (Invitrogen). Os transformantes de Pichia pastoris resultantes, Mut+ ou Muts, foram analisados quanto à expressão do gene de PME recombinante, testando o sobrenadante quanto a actividade de PME, utilizando os métodos descritos em Materiais e Métodos para bioquímica.

Pesquisa de transformantes para expressão elevada da forma longa ou curta de PME

Os transformantes positivos, putativos, foram ainda crescidos em meio mínimo (quer meio de dextrose mínimo, quer meio de glicerol mínimo, como especificado nos Manual de instrução do kit de expressão Pichia, Invitrogen) e o ADN genómico foi isolado e analisado por PCR, como descrito no Manual de instruções.

Os clones positivos encontrados na pesquisa inicial, que também produziram uma banda de PCR do tamanho esperado, foram seleccionados e crescidos num frasco a 28-30 °C, de acordo com o procedimento descrito no manual de instruções de Pichia.

Pelo menos 10 clones recombinantes verificados, de cada construção (pJklO, pJkll, pJkl2, pJk20, pJk21 e pJk21) foram pesquisados quanto à secreção de PME e os seus níveis de expressão relativa foram medidos ao longo do tempo, por amostragem a cada 2 a 6 horas. As células nas amostras foram sedimentadas e os sobrenadantes testados quanto a actividade 58

de PME, de acordo com os métodos explicados em Materiais e métodos para bioquímica.

Os clones obtidos após transformação quer com pJkl2, quer pJk22 foram pré-seleccionados utilizando o gene de resistência a canamicina integrado como gene selector, como descrito por Scorer C.A. et al. (1994) Bio/Technology vol 12, ppl81-184 e Laroche Y. et al.{1994) Bio/Technology vol 12, pp 1119-1124. Deste modo, obtiveram-se múltiplas cópias de transformantes de integração e estes foram pesquisados como descrito acima.

Os transformantes que representam quer a forma longa, quer a forma curta de PME e que se verificou expressarem a proteína recombinante em níveis elevados, foram seleccionados e analisados por análise de transferência de manchas Western (veja-se Materiais e métodos para bioquímica) .

Purificação e caracterização de PME recombinante

Purificou-se a proteína PME recombinante a partir do sobrenadante de culturas, utilizando os processos descritos em Materiais e métodos para bioquímica, como necessário. A presumível estabilidade a temperaturas elevadas da forma longa de PME foi verificada testando a actividade enzimática após incubação a diferentes temperaturas, como explicado na secção: caracterização e dados cinéticos. As enzimas recombinantes purificadas (quer a forma longa, quer a forma curta de PME) foram ainda caracterizadas como explicado em: secção de caracterização e dados cinéticos. Estas análises mostraram que ambos os tipos tinham um pH óptimo de cerca de 7-8 e verificnn-se que a estabilidade à temperatura, da PME recombinante curta era entre 10 e 40 °C e até 80 °C para a PME recombinante longa. 59

ί V

EXPRESSÃO EM ASPERGILLUS NIGER

Noutra forma de concretização, digeriu-se o p034 ou p017 com as enzimas de restrição adequadas e a sequência codificante para a forma longa ou forma curta de PME da presente invenção foi clonada no vector de expressão de Aspergillus pBAMTEl (que contém o promotor de resistência a metil triptofano de Neurospora crassa), para a expressão em Aspergillus niger (Pall et al. (1993) Fungai Genet Newslett. vol 40 pp 59-62) .

Os protoplastos foram preparados de acordo com Daboussi et al. (Curr Genet (1989) vol 15. pp453-456) utilizando enzimas de lise Sigma L-2773 e a liticase Sigma L-8012. A transformação dos protoplastos foi realizada de acordo com o protocolo estabelecido por Buxton et al. (Gene (1985) vol 37 pp 207-214), excepto que para plantar os protoplastos transformados, se seguiu o protocolo descrito em Punt et al. (Methods in Enzymology (1992) vol 216 pp447-457), mas utilizando 0,6% de agarose estabilizada osmoticamente.

Os resultados mostraram ser possível obter actividade de PME de laranja purificada, a partir de culturas de Aspergillus niger.

UTILIZAÇÕES

EFEITO DA PECTINA TRATADA COM PME NA VISCOSIDADE E ESTABILIDADE DE BEBIDAS PROTEICAS

MÉTODOS

Tratamento enzimático de pectina com PME derivado de laranja

Preparou-se um lote de pectina tratada enzimaticamente como se segue: 60 I ’\

Dissolveram-se 125 g de pectina em água quente, com agitação eticiente. Adiclonaram-se 45,3 g de NaCl (grau de reagente) e o volume foi ajustado para 4,0 1 com água. Esta solução foi agitada até à dissolução do sal. A solução de pectina foi arrefecida a 40 °C e o pH foi aumentado para pH 7,0, utilizando NaOH IN (grau de reagente) e agitação eficiente. Adicionou-se uma amostra adequada de PME de laranja e a reacção enzimática foi continuada até se obter o grau desejado de esterificação. O pH foi mantido constante a pH 7 por dosagem automática de NaOH IN (grau de reagente), durante o período de incubação e a reacção enzimática foi seguida pelo consumo de NaOH.

Quando a amostra de pectina atingiu o grau desejado de des-esterificação, parou-se a adição de NaOH, o pH da solução foi diminuído para cerca de 3,0, por adição de HC1 a 2%.Aa solução de pectina foi então aquecida a 70 °C durante 5 min, para inactivar completamente a enzima. A pectina tratada foi precipitada com 1 volume de isopropanol, lavada com 60% de isopropanol e comprimida até 50% de matéria seca. O lote de pectina tratado enzimaticamente foi então seco ao ar a 40 °C e por fim moído até um pó seco.

PROTOCOLO

Determinação de amostras de pectina para índice de sensibilidade ao cálcio (CF) A sensibilidade ao cálcio é medida como a viscosidade de uma pectina dissolvida numa solução com 57,6 mg cálcio/g de pectina, dividida pela viscosidade de exactamente a mesma quantidade de pectina em solução, mas sem adição de cálcio. Uma pectina não sensível a cálcio tem um valor de CF de 1.

Dissolvem-se 4,2 g de amostra de pectina em 550 ml de água quente com agitação eficiente. A solução é arrefecida a cerca de 20 °C e o pH é ajustado para 1,5 com HC1 IN. A solução de pectina ê ajustada para 700 ml com água e agitada. 61

f ^

Medem-se 145 g desta solução individualmente em 4 vidros de viscosidade. Adicionam-se 10 ml de áyua a dois dos vidros (determinações em duplicado) e adicionam-se 10 ml de uma solução de CaCl2 250 mM aos outros dois vidros, com agitação.

Adicionam-se 50 ml de tampão acetato (0,5 M, pH de cerca de 4,6) a todos os 4 vidros de viscosidade, com agitação magnética eficiente, levando assim o pH da solução de pectina para pH 4,0. Os magnetes são removidos e os vidros são deixados durante a noite a 20 °C. As viscosidades são medidas no dia seguinte com um viscosimetro Brookfield. O índice de sensibilidade ao cálcio é calculado como se segue:

Viscosidade de uma solução com 57, 6 mg de Ca2+/ g de pectina CF = _

Viscosidade de uma solução com 0,0 mg de Ca2*/ g de pectina

Determinação do grau de esterificação de amostras de pectina (% DE "deqree of esterification") A 50 ml de uma solução de isopropanol a 60% e HC1 a 5% adicionam-se 2,5 g de amostra de pectina e agita-se durante 10 min. A solução de pectina é filtrada através de um filtro de vidro e lavada com 15 ml de isopropanol a 60%/HCl a 5%, 6 vezes, seguido de mais lavagens com isopropanol a 60%, até o filtrado estar livre de cloretos. 0 filtrado é seco durante a noite a 80 °C.

Combinam-se 20,0 ml de NaOH 0,5 N e 20,0 ml de HC1 0,5 N num frasco cónico e adicionam-se 2 gotas de fenolftaleína. Titula-se com NaOH 0,1N até se obter uma alteração de cor permanente. O HC1 0,5 N deverá ser ligeiramente mais forte do que o NaOH 0,5 N. O volume adicionado de NaOH 0,1 N anotado como V0.

Medem-se 0,5 g de amostra de pectina seca (o filtrado) num frasco cónico e a amostra é humedecida cum etanol a 96%. 62

Adicionam-se 100 ml de água destilada arrefecida e fervida à pouco tempo e a solução resultante é agitada até a pectina estar completamente dissolvida. Em seguida, adicionam-se 5 gotas de fenolftaleína e a solução é titulada com NaOH 0,1 N (até uma alteração de cor e pH 8,5). A quantidade de NaOH 0,1 N aqui utilizada é registada como Vj.. Adicionam-se 20,0 ml de NaOH 0,5 N e o frasco é agitado vigorosamente e em seguida deixado em repouso durante 15 min. Adicionam-se 20,0 ml de HC1 0,5 N e o frasco é agitado até a cor rosa desaparecer. Adicionam-se então 3 gotas de fenolftaleína a solução resultante é titulada com NaOH 0,1 N. O volume de NaOH 0,1 N é registado como V2. O grau de esterificação (% DE: % grupos carboxi totais) é calculada como se segue: v2-v0 %DE = _

Vi+(V2-V0)

Produção de iogurte

Aqueceu-se leite desnatado convencional (preparado por mistura de leite em pó com um volume adequado de água) a 90 °C em 5 min e em seguida homogeneizou-se a 200 kp/cm2 e o leite foi arrefecido a 31 °C. Adicionou-se cultura de iogurte e o leite fermentou a cerca de pH 4,0. O iogurte foi arrefecido a cerca de 20 °C e a amostra de pectina foi adicionada como uma solução de açúcar saturada (cerca de 65% de açúcar) e agitada durante 15 min. O pH foi ajustado para pH 4,0 com ácido láctico. O iogurte foi pasteurizado a 88 °C durante 15 segundos e homogeneizado a 150 kp/cm2, em seguida arrefecido a 20 °C e inserido em garrafas de tampa azul de 250 ml, estéreis (200 ml/garrafa). 63

i V

A composição do produto final era: 7,6% de MSNF (conteúdo em leite sólido), 9,15 % de açúcar e 0,25% ou 0,35% de amostra de pectina, originado um total em sólidos de 17,0% ou 17,10%, respectivamente.

Determinação da viscosidade da bebida de iogurte

Determinou-se a viscosidade de uma amostra de iogurte (determinações em duplicado) utilizando ou um Bohlin

Rheometer™ (fornecido pela Bohlin Instruments) com velocidades de corte de 18,5 - 46,0 ou utilizando um

StressTech™ (Rheologica Instruments AB), com as mesmas velocidades de corte.

Estabilidade da proteína medida por um teste de centrifugação

Centrifugam-se 20 g de uma amostra (e.g. iogurte líquido) a 10 °c, 2300xg durante 20 min. O sobrenadante é desprezado e o tubo de centrífuga colocado de cabeça para baixo, durante 30 min. O tubo é pesado e a % de sedimentação é calculada como se segue: peso do tubo após centr - peso do tubo % Sedimentação = _ X 100 peso da amostra em que centr = centrifugação

Estabilidade da proteína avaliada pela distribuição de tamanho de partícula na amostra A distribuição de tamanho de partícula de uma amostra de iogurte foi determinada utilizando um dimensionador Malvern 2600 Easy™. O tamanho de partícula é determinado por dispersão de luz laser, por este método. Adiciona-se 1 ml de iogurte a 9 ml de solução tampão desarejada (30,7 % de ácido cítrico 0,1 M, 19,3% de Na2HPC>4 0,2 M e 50,0% de água) e mistura-se. O tampão desarejado é adicionado ao tubo de medida 64

i u-. e a mistura de amostra/tampão é adicionada gota a gota até se atingir a concentração óptima. O tamanho de partícula médio c calculado a partir das medições.

Um iogurte com um tamanho de partícula médio inferior a cerca de 3 μη é considerado bastante estável, enquanto que um iogurte com um tamanho de partícula médio de cerca de 10 μιη e superior é considerado não estável para armazenamento a longo prazo.

Determinação de estabilidade a longo prazo

As amostras foram armazenadas a 4 °C ou à temperatura ambiente e mediu-se a separação do soro de leite (em mm de soro de leite no topo da amostra, no frasco) . A amostra foi inserida em frascos de tampa azul de 250 ml (determinações em duplicado) . A espessura da amostra em cada caso era de aproximadamente 70 mm - o que correspondia à marca de 200 ml de cada frasco. EXEMPLO 1

BEBIDA DE LEITE AZEDO A finalidade de adicionar pectina a uma bebida de leite azedo (e.g. uma bebida de iogurte), é produzir uma bebida que permaneça fisicamente homogénea durante o tempo de vida de armazenamento, bacteriológico e organoléptico, da bebida. Além disso, o tratamento da bebida de iogurte para um armazenamento a longo prazo destabiliza a proteína na bebida, originando uma bebida com uma textura arenosa e que apresenta rapidamente a separação de líquido, no caso de não se adicionar a pectina.

Tratamento da pectina

Escolheu-se uma pectina, com um grau elevado de éster, disponível no mercado; Grindsted™ Pectin URS (tipo de pectina Ultra Rapid Set) como pectina mãe, devido ao seu nível elevado 65

pi ί de éster (% DE de 82, veja-se figura 19) . O tratamento desta pectina mãe com a enzima PME de laranja é explicado na secção de métodos. A reacção enzimática foi parada e a pectina experimental resultante (designada por pectina no 1944-96-2) foi analisada quanto ao seu grau de esterificação, pelo método descrito na secção dos métodos. Além disso, para comparar os dois tipos de pectinas, a pectina mãe e a pectina tratada, com um tipo de pectina de iogurte bebível comercial, conhecido, a pectina Grindsted™ AM453 foi incluída nas experiências. A sensibilidade relativa ao cálcio das três pectinas escolhidas foi determinada como explicado na secção de métodos: A determinação do índice de sensibilidade das amostras de pectina ao cálcio (CF) e os resultados são apresentados na tabela a seguir

Tipo de pectina ACF DE% Pectina Grindsted™ URS 1,1 82 Pectina 1944-96-2 1,4 76 PectinaGrindsted™ AM543 >20 72 A des-esterificação da pectina mãe Grindsted™ URS de DE 82% para DE 76% não originou praticamente nenhuma alteração na sensibilidade ao cálcio destas duas pectinas (um ACF de 1 não tem sensibilidade) . A pectina com uma sensibilidade ao cálcio mensurável pôde ser produzida por novo tratamento com a enzima PME de laranja na pectina mãe até 70% de DE, uma vez que esta pectina tinha um ACF de 1,4.

Resultados da análi3e dc ioqurte/ioqurte bebível

Produziu-se iogurte como explicado na secção de métodos. As três pectinas (Pectina Grindsted™ URS, Pectina 1944-96-2 e Pectina Grindsted™ AM543)foram utilizadas individualmente nas seguintes receitas: 66

L-C 7,6% de MSNF (conteúdo sólido do leite), 9,15% de açúcar e 0,25% ou 0,35% de amostra de pecLina, dando um total de sólidos de 17,0% ou 17,10%, respectivamente, no produto final. A qualidade do iogurte individual produzido foi investigada pela sua % de sedimentação observada no teste de centrifugação, medindo o tamanho de partícula no iogurte, medindo a viscosidade e examinando a possível separação do soro de leite durante um tempo de armazenamento longo, como descrito na secção de métodos. A sedimentação do iogurte produzido com os três tipos de pectina é apresentada na tabela a seguir

SEDIMENTO (EM %) DO IOGURTE

Tipo de pectina concentração- 0,25% concentração -0,35% Pectina Grindsted™ URS 29,40 21,02 Pectina 1944-96-2 1,53 2,95 Pectina Grindsted™ AM543 2,20 1,85

Os resultados são a média de uma a quatro produções individuais. É claro que a pectina mãe (tipo URS) tinha uma % de sedimentação elevada e consequentemente o iogurte produzido apresentava separação de soro de leite e era instável a ambas as concentrações de pectina utilizadas (0,25 e 0,35%). Isto não é surpreendente, uma vez que normalmente a pectina do tipo URS não pode ser utilizada para estabilização de tipos de iogurte traLados pelo calor, para um tempo de armazenagem longo. O iogurte produzido com a pectina 1944-96-2 apresentava estabilidade a ambas as dosagens de pectina utilizadas e uma sedimentação baixa, como se pode observar pelos resultados 67 ί \ί

κ. acima e nenhuma separação de soro de leite, após mais de 75 dias de armazenamento. Em comparação, a pectina Cnndsted AM453 excelente, normalmente utilizada na produção de iogurte também apresentava uma sedimentação baixa, como esperado, e produziu iogurtes estáveis sem separação de soro de leite (vejam-se resultados acima).

Tratando a pectina URS mãe com PME de laranja, transformou-se uma pectina inadequada numa pectina adequada como agente estabilizante no iogurte e esta pectina tratada comportou-se tão bem como um estabilizante comercial, excelente.

Realizaram-se outras avaliações dos iogurtes produzidos por determinação do tamanho de partícula (veja-se secção de métodos) e os resultados são apresentados na tabela a seguir.

TAMANHO DE PARTÍCULAS (EM um) DO IOGURTE

Tipo de pectina concentração- 0,25% concentração -0, 35% Pectina Grindsted™ URS 9,32 6,41 Pectina 1944-96-2 1,33 1,55 PectinaGrindsted™ AM543 1,40 1,53 0 tamanho de partículas médio (apresenta-se o número correspondente à fracção D(4,3)) utilizando o aparelho Malvern) do iogurte produzido com a pectina URS mãe é elevado, como esperado. Mais uma vez, os resultados são uma média de uma a quatro produções. O tamanho dc partícula médio do iogurte produzido a partir de ambas, a pectina 1944-92 e a pectina Grindsted™ AM543 é pequeno para ambas as dosagens de pectina utilizadas (veja-se resultados acima). Mais uma vez mostra que o iogurte produzido com estes tipos de pectina é adequado para a produção de iogurtes estáveis. 68 i

Finalmente, e de importância, no caso da produção de iogurte bebível para armazenamento prolongado, a viscosidade foi determinada e os resultados são apresentados na tabela a seguir.

VISCOSIDADE (EM MPas) DO IOGURTE concentração / Tipo de pectina concentração- 0,25% concentração -0,35% Pectina Grindsted™ URS 55 40 Pectina 1944-96-2 12 18 PectinaGrindsted™ AM543 24 43

Uma vez que a pectina URS mãe não conseguiu estabilizar o iogurte, a viscosidade obtida é, como esperado, bastante elevada para ambas as concentrações de pectina. A pectina Grindsted™ AM543, excelente que produziu iogurtes estáveis com baixa sedimentação e um tamanho de partícula pequeno, apresentou uma viscosidade de cerca de metade da viscosidade observada com a pectina Grindsted™ URS, à dosagem de 0,25% de pectina e aproximadamente a mesma que a pectina URS à dosagem de 0,35% de pectina - independentemente do facto de apenas a pectina AM543 produzir um iogurte estável.

Em ambos os casos, URS e AM543, a viscosidade mais elevada observada pode ser atribuída, em parte, à quantidade de pectina adicionada, parecendo ser especialmente a situaçao no caso da pectina AM54 3, uma vez que um aumento na quantidade de pectina adicionada (de 0,25 a 0,35%) produziu um iogurte quase duas vezes mais viscoso. A viscosidade obtida com a pectina 1944-92 tratada com PME de laranja, mostra uma queda drástica na viscosidade, em comparação com a pectina URS mãe, a uma concentração de 0,25%. Isto deve-se em parte, à estabilização do iogurte com a pectina 1944-96-2 mas não é esta a única razão, uma vez que o iogurte AM543 tem uma viscosidade duas vezes maior a essa 69

V

t-—

A dosagem de pectina. De facto, adicionando 0,35% da pectina 1944-956-2 ao iogurte, apenas aumenta a vÍ3coaidade em 6 unidades (comparado com a dosagem de 0,25%), enquanto que a viscosidade aumenta em 19 unidades de 0,25% a 0,35%, no caso do AM453. A pectina 1944-96-2 tratada com PME de laranja pode estabilizar o iogurte com uma viscosidade muito baixa, apesar da dosagem de pectina ser 0,25% (ou 0,35%), o que originou uma viscosidade quase duas vezes maior utilizando outras pectinas não tratadas - e.g. pectina Grindsted™ AM543.

Isto constitui um desenvolvimento novo e muito importante para a produção de bebidas de leite azedo.

Tratando a pectina Grindsted™ URS com PME de laranja cria-se um novo tipo de pectina que, ao contrário da pectina mãe, pode estabilizar o iogurte e, de maior importância, apresenta uma viscosidade muito mais baixa do que as pectinas normalmente utilizadas. Outra pectina de éster elevado pode também ser melhorada por tratamento com a PME de laranja. EXEMPLO 2

Bebida de sumo de soro de leite

Utilizou-se a pectina modificada de acordo com a presente invenção (preparada como acima) numa bebida de sumo de soro de leite, como se segue:

Soro de leite doce ou ácido 42,00% Sumo de fruta 40,00% Açúcar 8,00% Citrato de sódio 0,20% Pectina modificada com PME 0,20% Aromatizante Grindsted + Água 9, 60% 70

Misturou-se pectina modificada com PME seca, citrato de sódio e açúcar e em seguida dissolveu-se em água a 80 °C. Esta solução de pectina foi arrefecida abaixo de 5 °C e adicionou-se soro de leite a 5 °C. Adicionou-se aromatizante Grindsted (fornecido pela Danisco Ingredients, Danisco A/S) e adicionou-se sumo lentamente e o pH da mistura amostra foi ajustado com ácido cítrico ou láctico para pH 4,0. A mistura amostra foi amadurecida durante aproximadamente 30 min sob agitação. A pasteurização foi realizada a 80 °C/15 segundos e homogeneização a 200 bar (2900 psi) As amostras foram arrefecidas a 20 °C e inseridas, de forma asséptica, em recipientes.

As amostras teste foram analisadas após 24 horas, 1 mês e 6 meses de incubação à temperatura ambiente. A análise da investigação incluía medidas de viscosidade, índice de estabilidade de tamanho de partícula e estabilidade a longo prazo - os protocolos para estas estão descritos acima.

Os resultados mostraram uma melhor estabilidade e uma estabilidade a longo prazo na bebida de sumo de soro de leite processada com pectina modificada com PME, em comparação com a pectina referência utilizada nos testes controlo. Além disso, a bebida de sumo de soro de leite tinha uma viscosidade favorável que era inferior à de outras bebidas controlo. A bebida de sumo de soro de leite foi também processada com pectina de lima e limão modificada com PME de planta, respectivamente - i.e. modificada com a PME da presente invenção. Os resultados demonstram que a pectina modificada com PME tem uma estabilidade proteica melhorada, em comparação com a pectina não modificada e também em comparação com a pectina referência. 71 ή~ * j \i v EXEMPLO 3

BEBIDA DE LEITE/ SUMO DE FRUTA A Grindsted™ (obtida da Danisco Ingredients, Danisco A/S) foi modificada com a PME, como descrito para a bebida de iogurte. A pectina modificada foi utilizada numa bebida de Leite/ sumo de fruta, que continha:

Leite desnatado 45,00% Sumo de fruta 40,00% Açúcar 5,00% Pectina modificada com PME 0,25% Aromatizante Grindsted + Água 9,75%

Misturou-se pectina modificada com PME seca e açúcar e em seguida dissolveu-se em água a 80 °C. A solução de pectina foi arrefecida abaixo de 5 °C e adicionou-se leite a 5 °C.

Adicionou-se aromatizante Grindsted e sumo, lentamente, e o pH da mistura amostra foi ajustado (se necessário) com ácido cítrico ou láctico para pH 4,0. A mistura amostra foi amadurecida, pasteurizada e homogeneizada como descrito para a bebida de soro de leite. As amostras foram arrefecidas a 20 °C e inseridas, de forma asséptica em recipientes.

Os resultados mostraram uma estabilidade melhorada incluindo estabilidade e longo prazo - na bebida de leite/sumo de fruta processada com pectina modificada com PME, em comparação com a pectina referência, utilizada nos testes controlo. Além disso, a bebida de leite/sumo de fruta tinha uma viscosidade favorável que era inferior à das bebidas controlo. Também se observou uma funcionalidade melhorada. A bebida de leite/sumo de fruta também pode ser processada com pectina de lima e limão, modificada com a PME da presente invenção. 72 s

EXEMPLO 4

Estabilidade do soro de leite

As pectinas modificadas enzimaticamente foram testadas a pH 4,0. O pH das soluções de pectina resultantes foi ajustado para pH 4,0 com KOH/HC1. A concentração de pectina foi ajustada para 1,0%. As pectinas foram testadas em concentrações de 0,1% - 0,25%. Misturou-se pectina, tampão de Jenness (veja-se a seguir) e solução de soro de leite (veja-se a seguir) e aqueceu-se a 96 °C durante 25 min. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, a absorvência é medida a 500 nm.

Tampão de Jenness de mistura seca Pó seco Jenness (descrito em Jenness, R e Koops, J Preparation and properties of a salt solution wich stimulates milk ultrafiltrate, Holanda Melk- en Zuiveltijdschrift, vol 16 nr 3, pp 153-164, 1962): 15,80 g KH2P04 5,08 g de K3 citrato 17,91 g de Na3 citrato, 2 H20 1,80 g de K2S04 13,20 g de CaCl2, 2.H20 5,02 g Mg3 citrato, H20 3,00 g K2C03 10,78 g KC1

Solução tampão:

Solução aquosa de 7,5900 g/1 de pó seco Jenness com um pH de 4,0.

Solução de soro de leite

Um concentrado de soro de leite é liofilizado e pulverizado. Uma solução de 0,40% p/p de proteína de soro de leite é preparada eui tampão Jenness a pll 4,0. 73 A. \

Soluções de pectina

Fazem-se soluções aquosas de pectina a 1% p/p, com um pH de 4,0.

Concentrações de mistura

Misturam-se pectina, tampão Jenness e solução de soro de leite como indicado na tabela a seguir. As misturas são aquecidas a 96 °C durante 25 minutos e após arrefecimento à temperatura ambiente, as amostras são medidas num espectrofotómetro a 500 nm. μΐ de solução de pectina μΐ de tampão Jenness μΐ de solução de soro de leite μΐ volume total 500 2000 2500 5000 750 1750 2500 5000 1000 1500 2500 5000 1250 1250 2500 5000

Resultados

Os resultados são apresentados na tabela a seguir. O valor de absorvência apresentado a 500 nm é um valor médio de duas medidas. Para comparação entre os diferentes tipos de pectina e as pectinas modificadas enzimaticamente de acordo com a presente invenção, o índice para a pectina não modificada, pectina Grindsted™ 3450 (fornecida pela Danisco Ingredients, Danisco A/S), é ajustado para 100.

Um indice >100 indica uma estabilidade proteica mais baixa do que utilizando a amostra 3450. Um índice de 100 indica uma estabilidade semelhante à amostra 3450. Um índice <100 indica uma melhor estabilidade proteica do que utilizando a amostra 3450. Um índice de 95, ou < 95 indica uma estabilidade proteica muito boa. 74

Lc }^Ξ&. tipo de pect i na 0,10% de pectina 0,15% de pectina 0,20% de pectina 0,25% de pectina pectina Grindsted™ 3450 100 100 100 100 pectina Grindsted™ URS 127 140 155 161 5 min enz. 100 108 115 113 10 min enz. 98 106 111 111 15 min enz. 92 94 100 100 20 min enz. 90 95 100 99

Como se pode ver pelos resultados, a pectina Grindsted™ URS, modificada de acordo com a presente invenção, exibe propriedades favoráveis e nalguns casos propriedades muito boas para aumentar a estabilidade, em comparação com a pectina Grindsted™ 3450 referência e a pectina, pectina Grindsted™ URS não modificada. EXEMPLO 5

Bebida de Laban com uma vida de armazenamento longa, pH baixo A bebida de Laban é uma bebida de leite acidificada com um valor de pH inferior a 4,2. A bebida de Laban consiste de base de Laban .misturada com solução de pectina. A formulação para a base de Laban é:

Gordura de leite anidra 2,8 % Leite em pó desnatado 10,0% Aromatizante Grindsted + Água 87,2%%

Homogeniza-se leite completo convencional (gordura de leite anidra e leite em pó desnatado) a 75-80 °C e a uma pressão de 200 bar (2900 psi) seguido de pasteurização a 90-95 °c durante 5-10 min. Após cultura a pH de cerca de 4,0, o pH é ajustado para 3,8-4,2 com ácido cítrico ou ácido láctico. 75

Adiciona-se então solução de pectina. A mistura é então agitada até se obter uma mistura homogénea. Eota é então pasteurizada a 90-95 °C durante 10-15 segundos e ainda homogeneizada a 150-200 bar . Após arrefecimento a 20· -25 O O o produto é inserido de forma asséptica em recipientes.

Após alguns dias, a bebida de laban não estabilizada apresenta muitas vezes separação de liquido.

No entanto, a adição da pectina modificada enzimaticamente de acordo com a presente invenção previne a separação de liquido e melhora a viscosidade.

Além disso, o produto tem um sabor a iogurte pronunciado e uma vida de armazenamento longa. EXEMPLO 6

Sumo de laranja (enriquecido em proteína) A bebida de sumo de laranja é uma bebida acidificada (pH de aproximadamente 4) contendo 2% de DANPROLACT 40™ (Central Soya, Aarhus A/S), 6% de açúcar, 10% de concentrado de laranja, 0,4% de concentrado de limão, 0,2 5 de pectina e 81,4% de água. O produto é uma bebida de sumo de laranja enriquecida com proteína de soja. O produto é pasteurizado e homogeneizado. Após arrefecimento a 20-25 °C, o produto é inserido, de forma asséptica, em recipientes e pode ser armazenado durante aproximadamente 6 meses, à temperatura ambiente. A adição de pectina modificadas enzimaticamente de acordo com a presente invenção, numa bebida de laranja (enriquecido com proteína) mostrou propriedades favoráveis -tais como estabilidade a longo termo e uma boa sensação na boca. EXEMPLO 7

Produção de anticorpos 76 I - I -

Γ

Produziram-se anticorpos contra a enzima da presente invenção infectando coelhos com a enzima purificada c isolando as imunoglobulinas de antisoro, de acordo com os processos descritos de acordo com N HArobe e A Ingild ("Immunization, Isolation of Immunoglobulins, Estimation of Antibody titre" In a Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Methods and Applications, N H Axelsen et al. (eds), Universitetsforlaget, Oslo, 1973) e por T G Cooper ("The Tools of Biochemistry", John Wiley & Sons, Nova Iorque, 1977) .

Outras modificações da presente invenção serão evidentes para os peritos na arte, sem que se afastem do âmbito da presente invenção.

Nas páginas seguintes, apresentam-se várias listagens de sequência que foram consecutivamente numeradas de SEQ ID No.l - SEQ ID No. 9, que representam as sequências de nucleótidos e sequências de aminoácidos.

SEQUÊNCIAS SEQ.I.D. NO. 1 MIKNMTDTDM MIMRTSNNRK LIEETSTVDG WPAWLSTGDR RLLQSSSVTP 50 NVWAADGSG NFKTVAAAVA AAPQGGTKRY IIRIKAGVYR ENVEVTKKHK 100 NIMFIGDGRT RTIITGSRNV VDGSTTFKSA TVAWGEGFL ARDITFQNTA 150 GPSKHQAVAL RVGADLSAFY NCDMLAYQDT LYVHSNRQFF VNCLIAGTVD 200 FIFGNAAAVL QNCDIHARKP NSGQKNMVTA QGRADPNQNT GIVIQKSRIG 250 ATSDLKPVQG SFPTYLGRPW KEYSRTVIMQ SSITDVIHPA GWHEWDGNFA 300 LNTLFYGEHQ NAGAGAGTSG RVKWKGFRVI TSATEAQAFT PGSFIAGSSW 350 LGSTGFPFSL GL 362 SEQ. I.D. NO. 2 MTRIKEFFTK LSESSTNQNI SNIPKKKKKL FLALFATLLV VAAVIGIVAG 50 VNSRKNSGDN GNEPHHAILK SSCSSTRYPD LCFSAIAAVP EASKKVTSQK 100 DVIEMSLNIT TTAVEhNYFG IQKLLKRTNL TKREKVALHD CLETIDETLD 150 77 ELHKAVEDLE EYPNKKSLSQ HADDLKTLMS AAMTNQGTCL DGFSHDDANK 200 HVRDALSDGQ VHVEKMCSNA LAMIKNMTDT DMMIMRTSNN RKLIEETSTV 250 DGWPAWLSTG DRRLLQSSSV TPNVWAADG SGNFKTVAAS VAAAPQGGTK 300 RYIIRIKAGV YRENVEVTKK HKNIMFIGDG RTRTIITGSR NWDGSTTFK 350 SATVAWGEG FLARDITFQN TAGPSKHQAV ALRVGADLSA FYNCDMLAYQ 400 DTLYVHSNRQ FFVNCLIAGT VDFIFGNAAA VLQNCDIHAR KPNSGQKNMV 450 TAQGRADPNQ NTGIVIQKSR IGATSDLKPV QGSFPTYLGR PWKEYSRTVI 500 MQSSITDVIH PAGWHEWDGN FALNTLFYGE HQNAGAGAGT SGRVKWKGFR 550 VITSATEAQA FTPGSFIAGS SWLGSTGFPF SLGL 584 SEQ. I.D. NO. 3 GTAGCAATGC GCTTGCTATG ATCAAGAACA TGACTGACAC TGACATGATG 50 ATCATGAGGA CTTCAAACAA CAGGAAGCTG ATAGAGGAGA CCAGTACGGT 100 TGATGGGTGG CCGGCGTGGC TGTCCACCGG AGACAGGAGG CTGTTGCAGT 150 CCTCGTCGGT GACACCGAAC GTGGTGGTGG CAGCAGATGG CAGCGGAAAC 200 TTTAAGACGG TGGCGGCAGC GGTGGCGGCG GCTCCTCAGG GAGGCACTAA 250 GCGGTATATT ATTAGGATTA AAGCCGGTGT TTATCGGGAA AATGTTGAGG 300 YGACAAAGAA GCATAAAAAT ATAATGTTCA TCGGTGACGG GAGGACTAGA 350 ACTATCATCA CAGGAAGTAG AAATGTGGTT GATGGAAGCA CAACTTTCAA 400 GTCTGCTACA GTTGCTGTTG TTGGTGAAGG ATTCTTGGCC CGAGACATTA 450 CATTCCAAAA CACAGCCGGC CCCTCAAAGC ACCAGGCGGT GGCACTACGA 500 GTGGGAGCTG ACCTTTCAGC ATTTTACAAT TGCGATATGT TAGCTTACCA 550 AGACACACTC TACGTCCACT CGAACCGCCA GTTCTTTGTG AACTGCTTAA 600 TTGCTGGCAC GGTTGATTTT ATTTTTGGTA ACGCTGCAGC CGTGTTACAA 650 AATTGTGACA TCCATGCACG AAAGCCCAAT TCCGGCCAAA AAAATATGGT 700 CACAGCCCAA GGCAGGGCTG ACCCTAACCA AAACACCGGC ATTGTCATTC 750 AAAAATCTAG GATTGGTGCC ACCTCCGATT TAAAACCGGT TCAGGGTAGT 800 TTCCCGACGT ACCTCGGCAG GCCCTGGAAG GAGTACTCGA GGACGGTGAT 850 CATGCAGTCA TCGATTACTG ACGTGATCCA CCCTGCCGGG TGGCACGAGT 900 GGGATGGTAA CTTCGCGTTG AACACATTGT TTTACGGAGA GCATCAGAAC 950 GCCGGAGCCG GTGCCGGAAC TTCAGGGAGA GTGAAATGGA AGGGATTTAG 1000 GGTTATTACA AGTGCTACCG AGGCTCAAGC TTTTACTCCT GGAAGCTTCA 1050 TTGCTGGTAG TAGCTGGCTG GGCTCCACTG GTTTCCCATT CTCCCTTGGT 1100 TTGTAATATT CACTAGGAGT TTTAATTAAT ATGTTTTGTA TTAGTGGATC 1150 CATAGGTCTC TGGTCTTTCA ATTTGTAATA TTTGATTGAG CGTGTCTTAT 1200 TCGTGGCTTC GATTTCACAA ATACTATTGT GTGATTAACA AGAAATAAAA 1250

TAGCATGGGA AGAATAATAA TTTCCGGCTT CTTTAAAAAA AAAAAAAAAA 1300 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA 1323 SEQ. I.D. NO. 4 CTTTTGTTCT CTCTTATCGA GAAAAAAAAT GACCCGCATA AAAGAATTCT 50 TCACAAAACT TTCTGAATCT TCTACCAACC AAAACATTTC CAATATTCCC 100 AAGAAAAAAA AGAAACTATT CTTAGCTCTT TTTGCAACGC TACTCGTTGT 150 CGCTGCCGTA ATCGGCATTG TCGCCGGAGT GAACTCAAGA AAAAACTCCG 200 GCGACAACGG CAACGAGCCT CATCATGCTA TCCTCAAATC ATCATGTAGC 250 AGCACAAGGT ACCCGGACTT ATGCTTTTCG GCTATTGCTG CCGTTCCAGA 300 GGCCTCCAAA AAGGTGACAA GCCAAAAGGA CGTTATTGAG ATGTCCTTAA 350 ACATCACAAC AACAGCCGTG GAACACAACT ACTTCGGGAT TCAGAAGCTC 400 TTGAAGAGAA CGAATCTCAC CAAACGGGAA AAGGTTGCTC TCCATGACTG 450 TCTTGAGACG ATCGATGAGA CTCTTGATGA GTTACACAAA GCCGTCGAGG 500 ATCTTGAGGA GTACCCGAAC AAGAAATCTT TATCACAGCA TGCGGATGAT 550 CTCAAAACCC TAATGAGTGC CGCGATGACC AATCAGGGGA CGTGTCTTGA 600 TGGGTTCTCT CATGATGATG CTAATAAGCA CGTGCGGGAT GCGTTGTCAG 650 ACGGCCAGGT TCATGTTGAG AAGATGTGTA GCAATGCGCT TGCTATGATC 700 AAGAACATGA CTGACACTGA CATGATGATC ATGAGGACTT CAAACAACAG 750 GAAGCTGATA GAGGAGACCA GTACGGTTGA TGGGTGGCCG GCGTGGCTGT 800 CCACCGGAGA CAGGAGGCTG TTGCAGTCCT CGTCGGTGAC ACCGAACGTG 850 GTGGTGGCAG CAGATGGCAG CGGAAACTTT AAGACGGTGG CGGCATCGGT 900 GGCGGCGGCT CCTCAGGGAG GCACTAAGCG GTATATTATT AGGATTAAAG 950 CCGGTGTTTA TCGGGAAAAT GTTGAGGTGA CAAAGAAGCA TAAAAATATA 1000 ATGTTCATCG GTGACGGGAG GACTAGAACT ATCATCACAG GGAGTAGAAA 1050 TGTGGTTGAT GGAAGCACAA CTTTCAAGTC TGCTACAGTT GCTGTTGTTG 1100 GTGAAGGATT CTTGGCCCGA GACATTACAT TCCAAAACAC AGCCGGCCCC 1150 TCAAAGCACC AGGCGGTGGC ACTACGAGTG GGAGCTGACC TTTCAGCATT 1200 TTACAATTGC GATATGTTAG CTTACCAAGA CACACTCTAC GTCCACTCGA 1250 ACCGCCAGTT CTTTGTGAAC TGCTTAATTG CTGGCACGGT TGATTTTATT 1300 TTTGGTAACG CTGCAGCCGT GTTACAAAAT TGTGACATCC ATGCACGAAA 1350 GCCCAATTCC GGCCAAAAAA ATATGGTCAC AGCCCAAGGC AGGGCTGACC 1400 CTAACCAAAA CACCGGCATT GTCATTCAAA AATCTAGGAT TGGTGCCACC 1450 TCCGATTTAA AACCGGTTCA GGGTAGTTTC CCGACGTACC TCGGCAGGCC 1500 CTGGAAGGAG TACTCGAGGA CGGTGATCAT GCAGTCATCG ATTACTGACG 1550 TGATCCACCC TGCCGGGTGG CACGAGTGGG ATGGTAACTT CGCGTTGAAC 1600 79 ! í ^ ú u K- t ACATTGTTTT ACGGAGAGCA TCAGAACGCC GGAGCCGGTG CCGGAACTTC 1650 AGGGAGAGTT AAATGGAAGG GATTTACCCT TATTACAAGT GCTACCGAGG 1700 CTCAAGCTTT TACTCCTGGA AGCTTCATTG CTGGTAGTAG CTGGCTGGGC 1750 TCCACTGGTT TCCCATTCTC CCTTGGTTTG TAATATTCAC TAGGAGTTTT 1800 AATTAATATG TTTTGTATTA GTGGATCCAT AGGTCTCTGG TCTTTCAATT 1850 TGTAATATTT GATTGAGCGT GTCTTATTCG TGGCTTCGAT TTCACAAATA 1900 CTATTGTGTG ATTAACAAGA AATAAAATAG CATGGGAAGA ATAATAATTT 1950 CCGGCTTCTT TAAATTAAAA AAAAA 1975 SEQ. I.D. NO. 5 AILKSSCSST RYPDLCFSAI AAVPEASKKV 50 NYFGIQKLLK RTNLTKREKV ALHDCLETID 100 SLSQHADDLK TLMSAAMTNQ GTCLDGFSHD 150 CSNALAMIKN MTDTDMMIMR TSNNRKLIEE 200 220

IVAGVNSRKN SGDNGNEPHH TSQKDVIEMS LNITTTAVEH ETLDELHKAV EDLEEYPNKK DANKHVRDAL SDGQVHVEKM TSTVDGWPAW LSTGDRRLLQ SEQ. I.D. NO. 6 ATTGTCGCCG GAGTGAACTC AAGAAAAAAC TCCGGCGACA ACGGCAACGA 50 GCCTCATCAT GCTATCCTCA AATCATCATG TAGCAGCACA AGGTACCCGG 100 ACTTATGCTT TTCGGCTATT GCTGCCGTTC CAGAGGCCTC CAAAAAGGTG 150 ACAAGCCAAA AGGACGTTAT TGAGATGTCC TTAAACATCA CAACAACAGC 200 CGTGGAACAC AACTACTTCG GGATTCAGAA GCTCTTGAAG AGAACGAATC 250 TCACCAAACG GGAAAAGGTT GCTCTCCATG ACTGTCTTGA GACGATCGAT 300 GAGACTCTTG ATGAGTTACA CAAAGCCGTC GAGGATCTTG AGGAGTACCC 350 GAACAAGAAA TCTTTATCAC AGCATGCGGA TGATCTCAAA ACCCTAATGA 400 GTGCCGCGAT GACCAATCAG GGGACGTGTC TTGATGGGTT CTCTCATGAT 450 GATGCTAATA AGCACGTGCG GGATGCGTTG TCAGACGGCC AGGTTCATGT 500 TGAGAAGATG TGTAGCAATG CGCTTGCTAT GATCAAGAAC ATGACTGACA 550 CTGACATGAT GATCATGAGG ACTTCAAACA ACAGGAAGCT GATAGAGGAG 600 ACCAGTACGG TTGATGGGTG GCCGGCGTGG CTGTCCACCG GAGACAGGAG 650 GCTGTTGCAG 660 80 SEQ.I.D. NO. 7 PE511 (14 aa) SEQ.I.D. NO: 8 PE 3252 (4 aa) SEQ.I.D. NO: 9 PE 8 (8 aa) SEQ.I.D. NO: 10 PE 21 (21 aa) SEQ.I.D. NO: 11 PE 492D (15 aa) SEQ.I.D. NO: 12 PE 492C (11 aa) SEQ.I.D. NO: 13 PE 492B (12 aa) SEQ.I.D. NO: 14 PE 492A (16 aa)

ff i: V

Ser-ala-thr-val-ala-val-val-gly-glu-gly-phe- leu-ala-arg

Tyr-ile-ile-arg

Asn-ile-met-phe-ile-gly-asp-gly

Ile-gly-ala-thr-ser-asp-leu-lys-pro-val-gln- gly-ser-phe-pro-thr-tyr-leu-gly-arg-pro xxx-ser-ala-thr-val-ala-val-val-gly-glu-gly- phe-leu-ala-arg xxx-ala-tyr-pro-gly-gln-ile-thr-ser-asn-met

Asn-cys-asp-met-leu-ala-tyr-gln-asp-thr-leu- tyr

Val-ile-thr-ser-ala-thr-glu-ala-gln-ala-phe- thr-pro-gly-ser-phe 81 1 f- ΤΙ»^β· 13

SEQ.I.D. NO: 15 PE 701 (28 aa) SEQ.I.D. NO: 16 PE 594 (13 aa) SEQ.I.D. NO: 17 PE 7 (19 aa) SEQ.I.D. NO: 18 PE 251 (38 aa) SEQ.I.D. NO: 19 PE 201 (27 aa) SEQ.I.D. NO: 20 PE 22 (21 aa) aa 2 (arg) aa 3 (ile) aa 6 (thr)

Val-ile-thr-ser-ala-thr-glu-ala-gln-ala-phe- thr-pro-gly-ser-phe-ile-ala-gly-ser-ser-trp- leu-gly-ser-thr-gly-phe

Ile-ala-gly-ser-ser-trp-leu-gly-ser-thr-gly- phe-pro

Asn-met-val-thr-ala-gln-gly-arg-ala-asp-pro- asn-gln-asn-thr-gly-ile-val-ile xxx-arg-ile-gly-ala-thr-ser-asp-leu-lys-pro-val-gln-gly-ser-phe-pro-thr-tyr-leu-gly-arg-pro-(trp)-lys-glu-tyr-(ser)-arg-(thr)-val-ile-met-gln-ser-ser-ile-thr xxx-xxx-ile-gly-ala-thr-ser-asp-leu-lys-pro- val-gln-gly-ser-phe-pro-thr-tyr-leu-gly-arg- pro-xxx-lys-glu-tyr

Ser-arg-ile-gly-ala-thr-ser-asp-leu-lys—pro- val-gln-gly-ser-phe-pro-thr-tyr-leu-gly pode ser substituído por vai pode ser substituído por met pode ser substituído por vai 82

INDICAÇÕES RELATIVAS A UM MICROORGANISMO DEPOSITADO (norma PCT 13bis)

A. As indicações feitas a seguir referem-se ao microorganismo referido na descrição na página_35_linhas_2 a 14_ B. IDENTIFICAÇÃO DO DEPÓSITO Outros depósitos são identificados numa folha adicional D Nome da instituição depositária The National Collections of Industrial and Marine Bactéria Limited (NCIMB) Morada da Instituição depositária (incluindo código postal e país) 23 St. Machar Drive Aberdeen Escócia AB2 1RY

Reino Unido

Data de depósito Número de concessão 6 de Julho 1995, 12 de Julho de 1995* NCIMB 40749; * NCIMB 40750 C.INDICAÇÕES ADICIONAIS (deixar em branco se não aplicável) Esta informação continua numa folha adicional D A respeito das designações em que uma patente europeia é solicitada, e qualquer outro estado designado com legislação equivalente, disponibilizar-se-á uma amostra do microorganismo depositado até â publicação da menção de concessão da patente europeia, ou até à data em que o pedido tenha sido recusado ou retirado, ou destinado a ser retirado, apenas por apresentação dessa amostra a um perito nomeado pela pessoa que requer a amostra (regra 28(4) EPC) D. ESTADOS DESIGNADOS PARA OS QUAIS SE FAZEM INDICAÇÕES (cãsÕ~ãs~índIcãçõês~nãõ~sêjãm~pãrã todos os estados designados) E. FORNECIMENTO SEPARADO DE INDICAÇÕES (deixar em bianco se nâo aplicável) As indicações enumeradas a seguir serão submetidas ao gabinete internacional mais tarde (especificar a natureza geral das indicações, e.g. "Número de concessão do depósito")

Apenas para uso do qabinete receptor I-1 Apenas para uso do gabinete Internacional_ 1_|Esta folha foi recebida com o pedido □ Esta folha foi recebida pelo gabinete internacional internacional em: Oficial autorizado Oficial autorizado Modelo PCT/RO/134 (Julho 1992) 83

ί I

recepçAo no caso de um depósito original emitido de acorao com a norma 7,1 peia AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL identificada no fundo desta página I. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO Referência de identificação dada pelo Número de concessão dado pela UbFUSlTÁKlO AUTORIDADE DEFODITÁMA INTERNACIONALi Escherichia coli K12 SOLR-p034 NCIMB 40749 II. DESCRIÇÃO CIENTÍFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONÓMICA PROPOSTA O microorganismo identificado sob I acima era acompanhado de: uma descrição cientifica uma designação taxonômica proposta (marcar com uma cruz onde aplicável) III. RECEPÇÃO E ACEITAÇÃO Esta autoridade depositária internacional aceita o microorganismo identificada sob I acima, que foi recebido por este em 6 de Julho de 1995 (data do depósito original) IV. RECEPÇÃO DE PEDIDO DE CONVERSÃO 0 micoorganismo identificado em I acima foi recebido por esta autoridade depositária internacional em (data de depósito original) e um pedido para converter o depósito original para um depósito sob o tratado de Budapeste foi recebido em (data de recepção do pedido de conversão) V. AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL Nome: NCMBI Ltd Assinatura(s) da(s) pessoa(s) com poder para representar a Autoridade depositária Internacional ou de um oficial(ais) autorizado(s) :Morada: 23 St Machar Drive Data 11 de Julho de 1995Aberdeen Escócia UK AB2 1RY 1 Quando se aplica a norma 6,4 (d), esta data é a data em que se adquiriu o estatuto de autoridade depositária Internacional

Modelo BP/4 (página única) 84 5¾ ν

U

TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSAMENTO DE PATENTE

Danisco Biotechnology, MODELO INTERNACIONAL

Langebrogade 1, PO Box 17, DK-1001 Copenhaga K,

Dinamarca DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE emitida de acordo com a norma 10.2 pela AUTORIDADE DEPOSITARIA INTERNACIONAL identificada na página seguinte

NOME E MORADA DA PARTE A QUEM É EMITIDA A DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE I. DEPOSITÁRIO II. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO Nome: Número de concessão dado pela AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL Morada: COMO ACIMA NCIMB 40749 Data de depósito ou da transferência: 6 de Julho de 1995 III. DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE Testou-se a viabilidade do microorganismo identificado em II acima em 7 de Julho de 1995 2. Nessa data, o referido microorganismo era 1 13 1 viável Π1 2 1_1 não mais viável 1 Indica a data de depósito original ou, quando foi realizado um novo depósito ou transferência, a data relevante mais recente (data do novo depósito ou data de transferência). 85 1

Nos casos referidos na norma 10.2(a)(ii) e (iii), refere-se ao teste de viabilidade mais recente 2

Marcar com uma cruz a caixa aplicável

Modelo RP/q (primeira páina) V. CONDIÇÕES EM QUE FOI REALIZADO O TESTE DE VIABILIDADE* V. CONDIÇÕES EM QUE FOI REALIZADO O TESTE DE VIABILIDADE* V. AUTORIDADE DEPOSITARIA INTERNACIONAL Nome: NCMBI Ltd

Assinatura(s) da(s) pessoa(s) com poder para representar a Autoridade depositária Internacional ou de um oficial(ais) autorizado(s): Data: 11 de Julho de 1995

Morada: 23 St Machar Drive Aberdeen Escócia UK AB2 1RY 1 Preencher nõ caso de ã informação ter sido pedida e os resultados do teste terem sido negativos

Modelo BP/9 (segunda e última página) RECEPÇÃO NO CASO DE UM DEPÓSITO ORIGINAL emitido de acordo com a norma 7,1 pela AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL identificada no fundo desta página I. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO Referência de identificação dada pelo Número de concessão dado pela DEPOSITÁRIO AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL:Escherichia coli K12 SOLR-p017 NCIMB 40750 II. DESCRIÇÃO CIENTÍFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONÓMICA PROPOSTA O microorganismo identificado sob I acima era acompanhado de: uma descrição científica uma designação taxonómica proposta (marcar com uma cruz onde aplicável) III. RECEPÇÃO E ACEITAÇÃO Esta autoridade depositária internacional aceita o microorganismo identificada sob I aima, que recebido por este em 12 de Julho de 1995 (data do depósito original) IV. RECEPÇÃO DE PEDIDO DE CONVERSÃO 0 micoorganismo identificado em I acima foi recebido por esta autoridade depositária internacional em (data de depósito original) e um pedido para converter o depósito original para um depósito sob o tratado de Budapeste foi recebido em (data de recepção do pedido de conversão) V. AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL Nome: NCMBI Ltd Assinatura(s) da(s) pessoa(s) com poder para representar a Autoridade depositária Internacional ou de um oficial(ais) autorizado(s):Morada: 23 St Machar Drive Data 21 de Julho de 1995Aberdeen Escócia UK AB2 1RY 1 Quando se aplica a norma 6.4 (d), esta data é a data em que se adquiriu o estatuto de autoridade depositária Internacional

Modelo BP/4 (página única)

TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSAMENTO DE PATENTE

Danisco Biotechnology, MODELO INTERNACIONAL

Langebrogade 1, PO Box 17, DK-1UUI Copennaga K,

Dinamarca DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE emitida de acordo com a norma 10.2 pela AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL identificada na página seguinte

NOME E MORADA DA PARTE A QUEM É EMITIDA A DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE I. DEPOSITÁRIO II. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO Nome: COMO ACIMA Número de concessão dado pela AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL Morada: NCIMB 40750 Data de depósito ou da transferência: 12 de Julho de 1995 III. DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE Testou-se a viabilidade do microorganismo identificado em II acima em 19 de Julho de 1995 □3 ... 2. Nessa data, o referido microorganismo era □ 3 1_1 não mais viável 1 Indica a data de depósito original ou, quando foi realizado um novo depósito ou transferência, a data relevante mais recente (data do novo depósito ou data de transferência). 2 Nos casos referidos na norma 10.2(a) (ii) e (iii), refere-se ao teste de viabilidade mais recente 3 Marcar com uma cruz a caixa aplicável

Modelo BP/9 (primeira páina) 88 V. CONDIÇÕES EM QUE FOI REALIZADO O TESTE DE VIABILIDADE’

V. AUTORIDADE DEPOSITARIA INTERNACIONAL

Nome: NCMBI Ltd

Morada: 23 St Machar Drive Aberdeen Escócia UK AB2 1RY

Assinatura(s) da(s) pessoa(s) com poder para representar a Autoridade depositária Internacional ou de um oficial(ais) autorizado(s):Data: 21 de Julho de 1995 * Preencher no caso de a informação ter sido pedida e os resultados do teste terem sido negativos

Modelo BP/9 (segunda e última página)

Lisboa, 10 de Outubro de 2001

O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

89

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Processo que compreende a adição a um meio ácido, que contém pelo menos uma proteína, de uma pectina des-esterificada enzimaticamente do modo em blocos, em que a pectina é uma pectina com um grau elevado de ésteres.
2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que a pectina des-esterifiçada enzimaticamente do modo em blocos é preparada por técnicas de ADN recombinante.
3. 3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que o meio ácido é uma solução aquosa, de preferência em que a solução aquosa é uma bebida.
4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 3, em que a bebida é um iogurte bebível, um sumo de fruta ou uma bebida que compreende proteína de soro de leite.
5. 5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a proteína é derivada ou é derivável a partir de um lacticínio, como o leite ou queijo.
6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 5, em que a proteína é caseína, ou proteína de soro de leite.
7. 7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o meio ácido tem um pH de cerca de 3,5 a cerca de 5,5, de preferência em que o meio ácido tem um pH de 4 a cerca de 5,5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o meio ácido tem um pH de ccrca dc 4.
8. 8. 1
9. 9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a pectina de3-C3tcrifiçada enzimaticamente do modo em blocos, preparada por técnicas de ADN recombinante contém de cerca de 70% a cerca de 80% de grupos éster, de preferência cerca de 76% de grupos éster.
10. 10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a pectina des-esterifiçada enzimaticamente do modo em blocos, preparada por técnicas de ADN recombinante é insensível a iões Ca2+ de acordo com o Protocolo, descrito a seguir: PROTOCOLO Determinação de amostras de pectina para índice de sensibilidade ao cálcio (CF) A sensibilidade ao cálcio é medida como a viscosidade de uma pectina dissolvida numa solução com 57,6 mg de cálcio/g de pectina dividida pela viscosidade de exactamente a mesma quantidade de pectina em solução, mas sem cálcio adicionado. Uma pectina não sensível a cálcio tem um valor de CF de 1. Dissolvem-se 4,2 g de amostra de pectina em 550 ml de água quente, com agitação eficiente. A solução é arrefecida a cerca de 20 °C e o pH é ajustado para 1,5 com HC1 IN. A solução de pectina é ajustada para 700 ml com água e agitada. Medem-se 145 g desta solução, individualmente, em 4 vidros de viscosidade. Adicionam-se 10 ml de água a dois dos vidros (determinações em duplicado) e adicionam-se 10 ml de uma solução de CaClj 250 mM aos outros dois vidros, com agitação. Adicionam-se 50 ml de tampão acetato (0,5 M, pH de cerca de 4,6) a todos os quatro vidros de viscosidade, com agitação maynéLica eficiente, levando o pll da solução de 2

    pectina até um valor superior a 4,0. Os magnetes são removido3 e 03 vidroo deixados durante a noite a 20 °C. As viscosidades são medidas no dia seguinte com um viscosimetro Brookfield. 0 índice de sensibilidade ao cálcio é calculado como se segue: Viscosidade de uma solução com 57,6 mg de Ca2+/g de pectina CF = _ Viscosidade de uma solução com 0, 0 mg de Ca2+/g de pectina
11. 11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a pectina des-esterificada enzimaticamente do modo em blocos, preparada por técnicas de ADN recombinante tem um peso molecular elevado.
12. 12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a pectina des-esterificada enzimaticamente do modo em blocos, preparada por técnicas de ADN recombinante, é preparada tratando uma pectina com uma metil esterase de pectina recombinante, que des-esterifica dois ou mais resíduos de ácido galacturónico adjacentes, da pectina, em pelo menos substancialmente todas as cadeias de pectina.
13. 13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a metil esterase de pectina recombinante é derivada de uma PME que se pode obter a partir de uma planta.
14. 14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a pectina des-esterificada enzimaticamente do modo em blocos, é preparada tratando uma pectina com uma enzima recombinante compreendendo uma ou mais das sequências de aminoácidos apresentadas na SEQ ID N0.1 ou SEQ ID NO. 2, ou um seu variante, derivado ou homólogo, que tem pelo menos 75% de homologia com aquelas, incluindo suas combinações. 3
15. 15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a pectina des-esterifiçada enzimaticamente do modo em blocos, é preparada tratando uma pectina com uma enzima recombinante que se pode obter por expressão da sequência codificante da PME em NCIMB 4074 9 ou NCIMB 40750, ou uma sua variante, derivado ou homólogo, ou suas combinações, ou por expressão de uma sequência nucleotidica que compreende a sequência nucleotidica apresentada como SEQ ID NO. 3 ou SEQ ID No. 4, ou uma sua variante, derivado ou homólogo que tem pelo menos 75% de homologia com aquelas, ou suas combinações. Lisboa, 10 de Outubro de 2001 O AGENTE OFICIAL DA PROPRIEDADE INDUSTRIAL

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