CZ11798A3 - Způsob stabilizace bílkovin, rekombinantní enzym a sekvence nukleotidů - Google Patents

Description

(57) Anotace:

Způsob stabilizace bílkovin spočívá v přídavku blokovým způsobem enzymaticky deesterifikovaného pektinu, kterým Je vysoce esteriflkovaný pektln, do kyselého prostředí obsahujícího alespoň jeden protein. Rekombinantní enzym pektlnmethylesteráza Je používán k výrobě pektinu. Sekvence nukleotidu dódující rekombinantní enzym je získatelná z NCIMB 40 749 nebo NCIMB 40 750.

• · · · · · *· • ·

Způsob stabilizace bílkovin, rekombinantní enzym * <» a sekvence nukleotidů

ií 'í

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu a enzymu pro použití s v tomto způsobu. Předkládaný vynález se zvláště týká způsobu výroby a použití enzymaticky modifikovaného pektinu.

Dosavadní stav techniky

Pektin je důležitou komoditou dnešního průmyslu. Může být 10 například používán v potravinářském průmyslu jako zahušťující nebo gelující prostředek, jak je tomu například při výrobě džemů.

Pektin je strukturní polysacharid, který se běžně nachází ve stěnách rostlinných buněk ve formě protopektinú. Pektinová kostra obsahuje a-1-4-propojené zbytky kyseliny galakturonové, které jsou 15 přerušovány malým počtem 1,2-propojených jednotek a-L-rhamnózy.

Navíc obsahuje pektin vysoce rozvětvené oblasti, kde se téměř střídají rhamno-galakturononanové řetězce. Tyto vysoce rozvětvené oblasti obsahují také jednotky jiných cukrů (jako je D-galaktóza, L-arabinóza a xylóza) připojené glykosidickými vazbami k C3 nebo C4 atomům 2o rhamnózové jednotky nebo C2 nebo C3 atomům jednotek kyseliny galakturonové. Dlouho řetězce a-1-4-propojených zbytků kyseliny galakturonové se obvykle nazývají jako hladké („smooth“) oblasti, zatímco vysoce rozvětvené oblasti se obvykle označují jako rozvětvené („hairy“) oblasti.

Některé karboxylové skupiny zbytků kyseliny galakturonové jsou esterifikovány (například karboxylové skupiny jsou methylovány).

Typicky probíhá estěrifikace karboxylových skupin po polymerizaci \ zbytků kyseliny galakturonové. Je však extrémně vzácné,,že by byly ν·Ι« ·· «*«« ·««4 • · · · · · * · ·· •v*··· ·♦····· • · · · · · · · * *

-2-............* karboxylové skupiny esterifikovány (například methylovány) všechny. Obvykle je stupeň esterifikace v rozmezí od 0 do 90 %. Jestliže je esterifikováno 50 % karboxylových skupin nebo více, výsledný pektin se označuje jako vysoce esterifikovaný pektin a („high ester pectin“). s zkratka „pektin HE“ nebo „vysoce methoxylovaný pektin“. Jestliže je esterifikováno méně než 50 % karboxylových skupin, potom se výsledný pektin označuje jako nízkoesterifikovaný pektin („low ester pectin“), „zkratka pektin LE“ nebo „nízkomethoxylovaný pektin“. Jestliže pektin neobsahuje žádné esterifikované skupiny nebo jich io obsahuje pouze malé množství, označuje se obvykle jako kyselina pektová.

Struktura pektinu, zvláště stupeň esterifikace (například methylace) určuje mnoho výsledných fyzikálních a/nebo chemických vlastností pektinu. Například gelování pektinu závisí na chemické 15 povaze pektinu, zvláště stupni esterifikace. Navíc však gelování pektinu závisí také na obsahu rozpustných pevných látek, pH a koncentraci vápenatých iontů. Co se týče vápníkových iontů, předpokládá se, že ionty vápníku vytvářejí komplexy s volnými karboxylovými skupinami, zvláště skupinami v pektinu LE.

2o Pektinové enzymy se třídí podle způsobu napadení galakturonanové Částí pektinové molekuly. Přehled některých pektinových enzymů je možno nalézt v Pilník a Voragen (Food Enzymolůgy, red. P. F. Fox: Elsevier; (1991); str. 303 - 337). Konkrétně pektínmethylesterázy (EC 3.1.1.11), jinak označované jako 25 PME, deesterifikují pektiny HE na pektiny LE nebo kyseliny pektové.

Naopak například pektindepolymerázy štěpí glykosidícké vazby mezi galakturonosylmethylesterovými zbytky.

Ještě podrobněji, aktivita PME vytváří volné karboxylové kyseliny a volný methanol. Přírůstek obsahu volných karboxylových 30 skupin je možno snadno monitorovat automatickou titrací. V tomto· ohledu ukázaly dřívější studie, že některé PME deesterifikují pektiny ·· ·· · · náhodným způsobem v tom smyslu, že deesterifikují jakékoliv z esterifikovaných (například methylovaných) zbytků kyseliny galakturonové na více než jednom pektinovém řetězci. Příklady PME, které náhodně deesterifikují pektiny, je možno získat z houbových 5 zdrojů, jako je Aspergillus aculeatus (víz WO 94/25575) a Aspergillus japonicus (Ishii a další, J. Food Sci., 44, str. 611 - 614). Baron a další (Lebensm. Wiss. M-Technol. 13, str. 330 - 333) zřejmě izolovali houbovou PME z Aspergillus niger. Pro tuto houbovou PME se udává, že má molekulovou hmotnost 39 000 D, izoelektrický bod 3,9, io optimální pH 4,5 a hodnotu K_m (mg/mi) 3.

U některých PME je však naopak známo, že deesterifikují pektiny po blocích v tom smyslu, že se předpokládá, že napadají pektiny vždy na neredukujících koncích nebo těsně u volných karboxylových kyselin a potom postupují podél molekul pektinu is jednořetězcovým mechanismem a tím vytvářejí bloky neesterifikované kyseliny galakturonové, které jsou velmi citlivé na vápník. Příklady takových enzymů, které deesterifikují pektin blokovým způsobem, jsou rostlinné PME. Předpokládá se, že v citrusových plodech existuje až 12 izoforem PME (Pilník W. a Voragen A. G. J. (Foód Enzymology 20 (red. P. F. Fox); Elsevier; (1991), str. 303 -337). Tyto izoformy mají různé vlastnosti.

Versteeg a další (J. Food Sci. 45, str. 969 - 971) zřejmě izolovali PME z pomerančů. Tato rostlinná PME se má vyskytovat v početných izoformách s různými vlastnostmi. Izoforma I má molekulovou 25 hmotnost 36 000 D, izoelektrický bod 10,0, optimální pH 7,6 a hodnotu K_m (mg/ml) 0,083. Izoforma II má molekulovou hmotnost 36 200 D, izoelektrický bod 11,0, optimální pH 8,8 a hodnotu Km (mg/ml) 0,0046. Izoforma III (HMW-PE) má molekulovou hmotnost 54 000 D, izoelektrický bod 10,2, optimální pH 8 a hodnotu K_m (mg/ml) 0,041. 3o O sekvencích těchto PME jsou však dosud pouze velmi omezené údaje. . * ♦ ♦·♦ ·« • · · · 9

-4Podle autorů Pilník a Voragen (výše) je možno najít PME u velkého počtu dalších vyšších rostlin, jako jsou jablka, broskve, avokádo, banány, bobuloviny, limety, grepfruity, mandarinky, třešně, rybízy, hrozny, mango, papája, kivi, meruňky, hrušky, švestky, lusky, s karotka, květák, okurka, pórek, česnek, hrách, brambor, ředkev a rajče. Stejně tak pro tyto PME však dodnes existují pouze omezená data o sekvencích.

Náhodné nebo blokové rozdělení volných karboxylových skupin je možno rozlišit pomocí vysoce účinné iontoměnicové chromatografie io (Schols a další, Food Hydrocolloids 1989, 6, str. 115 - 121). Testy se také používají pro kontrolu nežádoucí zbytkové aktivity PME v citrusových džusech po pasterizaci, protože zbytková PME může způsobit tzv. ztrátu zákalu („cloud loss“) u pomerančového džusu navíc ke tvorbě methanolu v džusu.

PME mají v průmyslu důležitá použití. Mohou být například používány jako sekvestrační prostředky pro vápenaté ionty. V tom ohledu je možno například připravovat krmivo pro dobytek přídavkem kaše hydroxidu vápenatého k citrusovým dužinám po extrakci džusu (Pilník a Voragen (výše). Po přídavku vysoké pH a vápenaté ionty aktivují jakoukoli přítomnou PME v dužině a způsobují rychlou deesterifikaci pektinu za dosažení koagulace pektátu vápenatého. Navázaná kapalná fáze se uvolňuje a snadno vylisuje, takže pouze část původního obsahu vody je třeba odstraňovat nákladným termálním sušením. Vylisovaná šťáva se potom používá jako krmivo 25 pro zvířata.

Pilník a Voragen (výše) vyjmenovávají použití endogenních ' PME, která zahrnují jejich přídavek k ovocným džusům pro snížení viskozity džusu v případě, že obsahuje příliš mnoho pektinu z ovoce, jejich přídavek ve formě roztoků pektináz k plynovým bublinám 3o v albedu citrusových plodů, které bylo zahráto na teplotu Jádra 20 až 40 °C, aby bylo' možno “ odstranit * slupku a jiné membrány í

···· ··

• ·	* · ··	··	«·
	• ·	• ·	Φ ·
•	• «	• ·	• ·
*	• · ·	• ·	• ·
•	• · «	•	* *
• ·	•	··	« ·

I í

• 10 k

r , · · » • * · • · * · - 5 - ·· ·· z neporušených dílku se Šťávou (US-A-4284651) a jejich použití při ochraně a zlepšování textury a jemnosti zpracovaného ovoce a zeleniny jako jsou jablka (Wiley & Lee 1970, Food Technol. 24, 1168 70), konzervovaná rajčata (Hsu a další 1965, J. Food Sci. 30. str. 583 - 588) a brambory (Bartolome & Hoff 1972, J. Agric. Food Chem. 20, str. 262 - 266).

Glahn a Rolin (1994 Food Ingredients Europe, materiály z konference str. 252 - 256) uvádějí hypotetické použití průmyslového přípravku „GENU pectin type YM-100“ pro reakce s nápoji z kyselého mléka. Neuvádí se žádné podrobnosti o tom, jak se přípravek GENU pectin type YM-100 připravuje.

EP-A-0664300 popisuje způsob chemické frakcionace pro výrobu pektinu citlivého na vápník. Tento pekťm citlivý na vápník má být výhodný pro použití v potravinářském průmyslu.

Pektiny a deesterifikované pektiny navíc k PME mají tedy důležité použití v průmyslu. Je však stále zapotřebí zlepšovat známé způsoby stabilizace proteinů v kyselém prostředí bez nepříznivého ovlivňování viskozity tohoto prostředí. V tomto směru může vyvážit nepříznivý vliv na viskozitu prostředí celkový vzhled a/nebo texturu a/nebo chuťovou přijatelnost a/nebo pocit v ústech u výsledného produktu.

Podstata vynálezu

Podle prvního hlediska předkládaného vynálezu se poskytuje způsob zahrnující přídavek blokovým způsobem enzymaticky deesterifikovaného pektinu do kyselého prostředí, obsahujícího alespoň jeden protein, přičemž pektinem je výšeesterifikovaný pektin.

Podle druhého hlediska předkládaného vynálezu se poskytuje = způsob enzymatické deesterifikace pektinu blokovým způsobem, který

-6ι* ř

í t

zahrnuje působení rekombinantního enzymu obsahujícího některou ze sekvencí aminokyselin uvedenou jako SEQ.I.D. No. 1 nebo SEQ.I.D. No. 2 nebo jejich varianty, derivátu nebo homologu, včetně jejich kombinací, na pektin.

Podle třetího hlediska předkládaného vynálezu se poskytuje rekombinantní enzym obsahující některou ze sekvencí aminokyselin ukázanou jako SEQ.I.D. No. 1 nebo SEQ.I.D. No. 2 nebo jejich variantu, derivát nebo homolog, včetně jejich kombinací.

Podle čtvrtého hlediska předkládaného vynálezu se poskytuje nukleotidová sekvence kódující rekombinantní enzym podle předkládaného vynálezu, kde nukleotidová sekvence obsahuje některou ze sekvencí uvedenou jako SEQ.I.D. No. 3 nebo SEQ.I.D. No. 4 nebo jejich variantu, derivát nebo homolog.

Podle pátého hlediska předkládaného vynálezu se poskytuje nukleotidová sekvence kódující rekombinantní enzym podle předkládaného vynálezu, přičemž nukleotidová sekvence je získatelná z NCIMB 40749 nebo NCIMB 40750 nebo její varianta, derivát nebo homolog.

Podle šestého hlediska předkládaného vynálezu se poskytuje konstrukt exprimující nebo obsahující rekombinantní enzym podle předkládaného vynálezu nebo nukleotidovou sekvenci podle předkládaného vynálezu.

Podle sedmého hlediska předkládaného vynálezu se poskytuje vektor exprimující nebo obsahující konstrukt podle předkládaného vynálezu nebo rekombinantní enzym podle předkládaného vynálezu nebo nukleotidovou sekvenci podle předkládaného vynálezu.

Podle osmého hlediska předkládaného vynálezu se poskytuje kombinace konstruktů obsahující alespoň první konstrukt exprimující nebo obsahující rekombinantní enzym podle předkládaného vynálezu : 25 • * · 9 a · »· ····

-7nebo nukleotidovou sekvenci podle předkládaného vynálezu; a druhý konstrukt obsahující GOI (gene of interest).

Podle devátého hlediska předkládaného vynálezu se poskytuje buňka, tkáň nebo orgán exprímující nebo obsahující vektor podle 5 předkládaného vynálezu nebo konstrukt podle předkládaného vynálezu nebo rekombinantní enzym podle předkládaného vynálezu nebo nukleotidovou sekvenci podle předkládaného vynálezu nebo kombinaci_konstruktů podle předkládaného vynálezu.

Podle desátého hlediska předkládaného vynálezu se poskytuje io tranšgenický organismus exprímující nebo obsahující jakékoliv z výše uvedených hledisek předkládaného vynálezu.

Podle jedenáctého hlediska předkládaného vynálezu se poskytuje NCIMB 40749 nebo NCIMB 40750.

Podle dvanáctého hlediska předkládaného vynálezu se poskytuje rekombinantní enzym PME, který imunologicky reaguje s protilátkou proti čištěnému rekombinantnímu enzymu podle třetího hlediska předkládaného vynálezu, ale ne enzym PME rajčat.

Podle třináctého hlediska předkládaného vynálezu se poskytuje použití rekombinantního enzymu podle předkládaného vynálezu pro 20 snížení počtu esterových skupin pektinu.

Podle čtrnáctého aspektu předkládaného vynálezu se poskytuje použití rekombinantního enzymu podle předkládaného vynálezu pro deesterifikaci pektinu blokovým způsobem.

Podle patnáctého hlediska předkládaného vynálezu se 25 poskytuje použití rekombinantního enzymu podle předkládaného vynálezu pro ovlivnění citlivosti pektinu vůči vápníku.

Podle šestnáctého hlediska předkládaného vynálezu se poskytuje použití rekombinantního enzymu podle předkládaného vynálezu pro esterifikaci pektinu obsahujícího volné karboxylové 30 skupiny.

• * 4 4

-8Podle sedmnáctého hlediska předkládaného vynálezu se poskytuje pektin získaný použitím rekombinantního enzymu podle předkládaného vynálezu stejně jako způsobem podle předkládaného vynálezu.

Podle osmnáctého hlediska předkládaného vynálezu se poskytuje kombinace enzymů obsahující rekombinantní enzym podle předkládaného vynálezu a houbový PME a/nebo jiný pektin degradující enzym (například pektinlyázu).

Další hlediska předkládaného vynálezu zahrnují použití pektinu io podle předkládaného vynálezu pro výrobu potravin; a použití pektinu podle předkládaného vynálezu pro stabilizaci proteinu v kyselém prostředí bez nepříznivého ovlivnění viskozity prostředí;

a rekombinantní sekvenci nukleotidů kódující enzym podle předkládaného vynálezu.

Předkládaný vynález se tedy týká nového použití deesterifikovaných pektinu. Předkládaný vynález se také týká nové rekombinantní PME pro výrobu těchto pektinú.

Některé z hlavních výhod předkládaného vynálezu spočívají v tom, že deesterifikovaný pektin podle předkládaného vynálezu 20 propůjčuje proteinům v kyselém prostředí stabilitu bez nepříznivého ovlivnění viskozity prostředí.

Výhodné provedení prvního hlediska předkládaného vynálezu je způsob, který zahrnuje přídavek blokovým způsobem enzymaticky deesterifikovaného pektinu připraveného použitím technik 25 rekombinantní DNA, kde pektinem je vysoce esterifikovaný pektin, do kyselého prostředí.

Termín „blokovým způsobem enzymaticky deesterifikovaný pektin připravený použitím technik rekombinantní DNA“ znamená pektin obsahující blokovým způsobem .deesterifikované skupiny, 30 přičemž pektin se připravuje působením (např. uvedením do styku) ·*·· a·

pektinu obsahujícího esterifikované skupiny s enzymem, který byl připraven použitím technik rekombinantní DNA.

Některé z hlavních výhod tohoto výhodného hlediska předkládaného vynálezu jsou, že deesterifikovaný pektin je možno 5 snadno připravit s požadovaným stupněm tuhosti. V tomto ohledu může být sama rekombinantní PME připravena také poměrně jednoduše a snadno a také s vysokým stupněm homogenity. To narozdíl .od přípravků PME podle dosavadního stavu techniky znamená, že výsledná aktivita PME je stejnoměrnější a homogennější 10 a tak umožňuje snadněji řídit celkový průběh deesterifikace.

Použití blokovým způsobem enzymaticky deesterifikovaného pektinu - který je s výhodou připraven použitím technik rekombinantní DNA - ve způsobu podle předkládaného vynálezu pro stabilizaci alespoň jednoho proteinu v kyselém prostředí je výhodné, protože 15 dovoluje proteinům jako jsou proteiny syrovátky a mléka fláko např. kasein) být stabilní v kyselých roztocích. To je důležité při výrobě nápojů, jako je odstředěné mléko, ovocné džusy a nápoje ze syrovátkového proteinu, u kterých bylo dosud pouze možno zachovat chuť nejdůležitějších proteinů za poměrně vysoce kyselých podmínek 20 jako je pH 4,2 - a v přítomnosti vysokých množství stabilizátorů.

Nyní bylo zjištěno, že pro některé aplikace mohou být použita malá množství deesterifikovaného pektinu podle předkládaného vynálezu. V těchto nízkých množstvích nepůsobí deesterifikovaný pektin podle předkládaného vynálezu pouze jako stabilizátor, ale 25 nemá také nepříznivý vliv na hotový výrobek.

V případě potřeby by použití deesterifikovaného pektinu podle předkládaného vynálezu umožnilo výrobcům potravin zvyšovat pH potravin, jako například nápojů. V tomto ohledu může být v některých případech méně kyselá povaha nápojů přijatelnější pro lidi, zvláště pro . 30 děti. Narozdíl od postupů podle dosavadního stavu techniky je nyní možné zachovat chuť těchto proteinů při podmínkách pH vyššího než

-104,2, jako například až do 5,5 (např. pH 5,2) použitím blokovým způsobem enzymaticky deesterifikovaného pektinu, zvláště blokovým způsobem enzymaticky deesterifikovaného pektinu připraveného použitím technik rekombinantní DNA.

Iř >

Navíc se předpokládá, že i při nízkém pH, jako je pH 4,2 nebo nižší, stabilizuje blokovým způsobem enzymaticky deesterifikovaný pektin - zvláště blokovým způsobem enzymaticky deesterifikovaný pektin připravený použitím technik rekombinantní DNA - protein (proteiny) více než stabilizátory podle dosavadního stavu techniky, io které se při těchto hodnotách pH používají.

Další výhodou je to, že rekombinantní PME je schopna vytvářet v podstatě homogenní blokovým způsobem deesterifikovaný pektin. Tím se míní, že v podstatě všechny řetězce pektinu obsahují alespoň dvě sousedící deesterifikované karboxylové skupiny. Pro některá 15 použití však nemusí být nutné připravovat nebo používat takový v podstatě homogenní blokovým způsobem deesterifikovaný pektin.

Aniž by bylo třeba vázat se teorií, předpokládá se, že blokovým způsobem enzymaticky deesterifikovaný pektin - zvláště pektin připravený použitím technik rekombinantní DNA - stabilizuje protein 20 (proteiny) obklopením proteinu (proteinů) do membrány negativních nábojů a tím vytvořením stabilní emulze.

Rekombinantní enzym PME podle předkládaného vynálezu je použitelný pro blokovou deesterifikaci pektinu, jestliže se pektiny uvedou do styku s rekombinantním enzymem ve v podstatě vodném 25 prostředí. V některých případech může zvýšit deesterifikace pektinu citlivost pektinu k iontům vápníku, což může naopak být výhodné.

Alternativně je rekombinantní enzym PME podle předkládaného vynálezu použitelný pro esterifikaci pektinu při uvedení pektinu do styku s rekombinantním enzymem ve v podstatě nevodném médiu, 3o jako v přítomnosti methanolu nebo v přítomnosti vysokých koncentrací.

• · · * ·ι ·· ···· síranu amonného. Toto hledisko je výhodné, jestliže je například žádoucí snížit citlivost pektinu k vápníku.

Tento způsob esterifikace pektinů je výhodný, protože se stává zbytečnou potřeba vysoké teploty a podmínek esterifikace 5 methanolem spojená s postupy podle dosavadního stavu techniky. Předkládaný vynález tedy také zahrnuje použití takových esterifikovaných pektinů při přípravě potravin, stejně jako při přípravě pektinu jako takového.

Podle předkládaného vynálezu je výhodný deesterifikovaný 10 pektin podle předkládaného vynálezu pro přípravu potravin.

Mezi typické potraviny patří mlékárenské produkty, masové produkty, drůbeží produkty, rybí produkty a pekařské výrobky. S výhodou je potravinou nápoj.

Deesterifikovaný pektin podle předkládaného vynálezu je také 15 výhodný pro použití jako stabilizátor a/nebo modifikátor viskozity při přípravě farmaceutických látek, farmaceutických dávkovačích prostředků, kosmetiky a kosmetických dávkovačích prostředků.

Kyselým prostředím je s výhodou vodný roztok.

Vodným prostředím je s výhodou nápoj.

Nápojem je s výhodou jogurtový nápoj, ovocný džus nebo nápoj obsahující protein syrovátky.

Protein je s výhodou odvozen nebo je odvoditelný z mlékárenských produktů, jako je mléko nebo sýr.

Proteinem je s výhodou kasein nebo protein syrovátky.

Kyselé prostředí má s výhodou pH od přibližně 3,5 do přibližně

5,5. Kyselé prostředí má.s výhodou pH od 4 do přibližně. 5,5. Kyselé prostředí má s výhodou pH přibližně 4.

? Blokovým způsobem enzymaticky deestérifikovaným pektinem, zvláště'připraveným technikami rekombinantní DNA, je s výhodou

9· 9 9 *

-12-* *: 9

vysoce esterifikovaný pektin obsahující přibližně 80 % esterových skupin nebo méně (tj. stupen esterifikace (DE) 80 % nebo méně), s výhodou přibližně 75 % esterových skupin nebo méně (tj. DE přibližně 75 % nebo méně). V tomto ohledu je poměr volných karboxylových skupin k esterifikovaným karboxylovým skupinám u pektinu od 1 : 1 do 1 : 4, s výhodou od 1 : 2 do 1 : 3.

S výhodou obsahuje blokovým způsobem enzymaticky deesterifikovaný pektin přibližně 76 % esterových skupin.

V některých případech je blokovým způsobem enzymaticky io deesterifikovaný pektin citlivý na ionty Ca²⁺. Citlivost vůči vápníku je možno určit protokolem jak se uvádí v příkladech. Výhodněji je však blokovým způsobem enzymaticky deesterifikovaný pektin, zvláště jestliže je připraven technikami rekombinántní DNA, necitlivý na ionty Ca²⁺. Necitlivost vůči iontům vápníku je možno rovněž určit 15 protokolem, který se uvádí v příkladech.

S výhodou má blokovým způsobem enzymaticky deesterifikovaný pektin vyšší molekulovou hmotnost.

Tato vyšší molekulová hmotnost je typicky v rozmezí od přibližně 50 kD do přibližně 150 kD.

S výhodou se blokovým způsobem enzymaticky deesterifikovaný pektin připravuje reakcí pektinu s rekombinántní pektinmethylesterázou, která deesterifikuje dva nebo více sousedních zbytků kyseliny galakturonové pektinu nebo alespoň v podstatě všechny pektinové řetězce.

Rekombinántní pektinmethylesteráza se s výhodou odvozuje z PME získatelné z rostlin.

Termín „odvozený z PME získatelné z rostliny“ znamená, že rekombinántní PME má podobnou sekvenci jako PME získatelné z rostlin za předpokladu, že rekombinántní PME může deesterifikovat 30 pektin blokovým způsobem.

···· ·· ·· ·«·· ··Μ • · · ·· · · · ·fr ♦ · ♦·· · · « ·· * φ * ♦ · · . · *·· * ··'

-13-............

Rostlinou je s výhodou ovoce.

Ovocem je s výhodou citrusové ovoce.

Citrusovým ovocem je s výhodou pomeranč.

Rekombinantní pektinmethylesteráza se s výhodou odvozuje z PME získatelné z lamely nebo albeda pomeranče. Pro srovnání je průřez citrusovým plodem ukázán v obr. 1, kde je označena lamela a albedo. Termín „odvozený z PME získatelné z lamely nebo albeda pomeranče“ znamená, že rekombinantní PME má podobnou sekvenci jako sekvence PME, která je získatelné z lamely nebo albeda io pomeranče za předpokladu, že rekombinantní PME může pektin deesterifikovat blokovým způsobem.

S výhodou se blokovým způsobem enzymaticky deesterifikovaný pektin vyrábí působením rekombinantního enzymu obsahujícího kteroukoliv sekvenci aminokyselin uvedenou v SEQ.I.D. No. 1 nebo

SEQ.I.D. No. 2 nebo její variantu, derivát nebo homolog, včetně jejich kombinací, na pektin.

S výhodou se připravuje blokovým způsobem enzymaticky deesterifikovaný pektin působením rekombinantního enzymu, který je možno získat expresí nukleotidové sekvence obsahující nukleotidové 20 sekvence uvedené jako SEQ.I.D. No. 3 nebo SEQ.I.D. No. 4 nebo jejich varianta, derivát nebo homolog nebo jejich kombinace na pektin.

S výhodou se blokovým způsobem enzymaticky deesterifikovaný pektin připravuje působením rekombinantního enzymu, získatelného expresí sekvence kódující PME, obsažené v NCIMB 40749 nebo 25 NCIMB 40750 nebo jejich variantě, derivátu nebo homologu, nebo jejich kombinací na pektin.

S výhodou se blokovým způsobem enzymaticky deesterifikovaný pektin připravuje působením rekombinantní pektinmethylesterázy v přítomnosti iontů sodíku na pektin. * >

-14-* ·* • ♦ ·* ····

S výhodou se blokovým způsobem enzymaticky deesterifikovaný pektin připravený technikami rekombinantní DNA vyrábí působením rekombinantní pektinmethylesterázy v přítomnosti NaCI, NaNO₃ nebo Na₂SO₄ na pektin.

Rekombinantní enzym obsahuje s výhodou veškeré sekvence uvedené jako SEQ.I.D. No. 1 nebo SEQ.I.D. No. 2.

Rekombinantní enzym se s výhodou exprimuje nukleotidovou sekvencí, která obsahuje veškeré sekvence ukázané jako SEQ.I.D. No. 3 nebo SEQ.I.D. No. 4.

io Předkládaný vynález také zahrnuje sekvence, které jsou k výše uvedeným sekvencím komplementární.

Termín „pektin“ znamená pektin v jeho normálním smyslu, stejně jako jeho frakcionované podíly a deriváty stejně jako modifikované pektiny (např. chemicky modifikované pektiny a enzymaticky modifikované pektiny),

S výhodou není pektinem pektin, který byl vystaven působení enzymu polygalakturonázy podle dosavadního stavu techniky pro dosažení podstatného snížení délky pektinové kostry.

Termíny „varianta“, „homolog“ nebo „fragment“ ve vztahu

2o k rekombinantnímu enzymu podle předkládaného vynálezu zahrnuje jakoukoliv substituci, variaci, modifikaci, nahrazení, deleci nebo adici jedné (nebo více) aminokyselin z nebo do sekvence za předpokladu, že výsledná aminokyselinová sekvence má aktivitu PME, s výhodou má alespoň stejnou aktivitu rekombinantního enzymu obsahujícího jakoukoliv nebo více sekvencí uvedených jako SEQ.I.D. No. 1 a SEQ.I.D. No. 2. Konkrétně termín „homolog“ zahrnuje homologii co se týče struktury a/nebo funkce za předpokladu, že výsledný rekombinantní enzym má aktivitu PME. Ve vztahu k homologii ; sekvence (tj. .podobnosti) je alespoň 75 %, výhodněji alespoň 85 % 30 a ještě výhodněji alespoň 90 % homologie vzhledem k sekvencím, fi í .15 '· '. t ' ·· • ř • » » i ♦' ' · · -15-** v t. i V ¹ *« p>3

*.5

Výhodněji je „alespoň '·* ’ * ^L uvedeným r v připojených & výp isech - sekvencí

95_x%**a· ještě^hvýhodněji alespoň 98^ %;í homplogie >vzhledem k sekvencím; uvedeným,v připojených.výpisech sekvencí;

. TěVmíríp^ varianta“?^ ve’ vztahu k”seícvěňči WuWtfótidu^kódující*^r*řekomlJÍnántňí· M%hžým’^'podl^Ae * * * 11 I / 'i' ' ^ϊτΙ' -Ví***¹' ·*$#' .·* A i >··>.< , ' ·MU.. ,,.,.--A'b«í- Μ^·*·,A* , předkládaného’ výnalezu zahrnujrjakoukoliv^substituci; f variaci, , modifikaci, ^áhr^ď0j’áěWci*neb&’ⁱáclicr jeiihe ^(ňebo^vícej-múfclěovýchkysělin z tiebo dó^sekvence po'skytující^výslečíňé^ťkódý riůkleóticioVé ¹. 'sekvence⁵pró^í!TekomHiňahím enzym £ aktivitou PME? kterýms výhodou 'ma^valěšpoň sťejřiou^Tt aktivitu^'jako^rekombinantiii ³ enžým obsahující jednu· nébo-víčé že sekvencí³ uvé^denýčh^v^ŠEQÍírÓFŇoPl^aiSÉQyiíD: No. 2. Konkrétně' térmín%Rbmolog^“žáhmuje^íiom ohledem má

5, strukturu a/funkci za předpokladu, že výsledná sekvence nukleotidů kóduje rekombinaňtní enzyme aktivitou j.í?ME^Co se týčeíhomologiě •sekvence (tj.«podobnosti) ,*( je $ sn výhodou ^alespoň 7 5 * % ;&výhodněji alespoň 85· % a ještě .výhodněji; alespoň;90g%.-íⁱ<Ještěivýhpdnéj.i je tato homologie alespoň 95 % a ještějépe,alespoň 98 '.%·? írvoF’· Vt? *V -¾ ;

^ Vyse’uvedene terminy ijsou synonymý^fs alelickými variacemi 'sekvencí?^Jí^^ * >a^ií* 3. . ;žu. tK.' Vb- ’ ·^v· ·** ?' *.

. WÍA7V Α·άί'»βίΊ& h·:* ťAvfcMÁrt · ’ ’(*»>·' W<< , F -.'

Termín „komplementární“ znamená, že předkládaný vynález C4td. nyg -amytiň, kar r- ;y». m 3 ' také zahrnuje sekvence nukleotidů, které mohou hybridizovat s nuklěbtiHóvýmršekvenčémi³kódujíčí^šěkvenče.·^v '^{4 ΐ?}' ' ’ ”

A'..,,;/.·

Termín „nukleotid“ ve vztahu k předkládanému vynálezu zahrnuje 'genomovou¹ DNA, cDNA, syntetickou DNA a RNA. Pro kódújící sekvence podle předkládaného vynálezu znamená s výhodou DNA ještě.výhqdnějicpNA.v _v._ a.

í ý·*_?.\:Terminť_il‘ciťrusůvé.^fovoc’é žnamena druh rodu Citrus a zahrnuje ? limetu, citroň^pbrnérahč/ grapefruit, maíoplodý pomeranč, pómpel a^?mandarinku? Š’tfýhódóu znamená pomeranč. / < · !, .1,. ' x

4'

Ί

-it

L «·· ·* • · ·♦ ···· • · · · » ·· • · · · · ·. »♦ ····· ••·· · · · · · · *

-16-............

Termín „konstrukt“, který je synonymem termínů jako „konjugát“, „kazeta“ a „hybrid“, znamená sekvenci nukleotidů podle předkládaného vynálezu, nebo v případě kombinace konstruktů, GOI přímo nebo nepřímo připojený k promotoru. Příkladem nepřímého 5 připojení je poskytnutí vhodné mezerníkové skupiny jako je intronová sekvénce, jako je intron Sh1 nebo intron ADH, meziproduktu promotoru a nukleotidové sekvence podle předkládaného vynálezu nebo GOI. Totéž platí pro termín „fúzovaný“ ve vztahu k předkládanému vynálezu, který zahrnuje přímé nebo nepřímé 10 připojení. V každém případě tyto termíny nezahrnují přírodní kombinaci genu kódujícího enzym normálně spojeného s genovým promotorem standardního typu, jestliže jsou oba ve svém přirozeném prostředí.

Konstrukt může dokonce obsahovat nebo exprimovat markér, 15 který dovolí selekci genetického konstruktu například ve vláknité houbě, s výhodou rodu Aspergillus, jako například Aspergiilus niger, nebo v rostlinách, jako jsou brambory, cukrová řepa apod., do kterých byl konstrukt přenesen. Existují četné použitelné geny, jako například geny kódující mannóza-6-fosfát izomerázu (zvláště u rostlin) nebo 2o markéry, které poskytují rezistenci na antibiotika - například rezistenci na G418, hygromycin, bleomycin, kanamycin a gentamycin.

Termín „vektor“ zahrnuje expresní vektory a transformační vektory.

Termín „expresní vektor“ znamená konstrukt schopný exprese in 25 vivo nebo in vitro.

Termín „transformační vektor“ znamená konstrukt schopný přenosu z jednoho druhu do jiného, jako například z plazmidu E. coli do vláknité houby, s výhodou rodu Aspergillus. Může dokonce jít o konstrukt schopný přenosu z plazmidu E. coli do rodu Agrobacterium 30 do rostliny. ’ ' ^ř

1< ·♦.

• · ♦ * · » 4 « · • · · · · ····· ·»··-·· *«····· ♦ · · · · · · · * · ·

-17-............

Termín „tkáň“ zahrnuje tkáň jako takovou a orgán.

Termín „organismus“ ve vztahu k předkládanému vynálezu zahrnuje jakýkoliv organismus, který by mohl obsahovat sekvenci nukleotidů kódující rekombinantní enzym podle předkládaného vynálezu a/nebo z ní získané produkty, přičemž pokud je přítomen v organismu promotor, může dovolit expresi nukíeotidové sekvence podle předkládaného vynálezu.

Organismem je s výhodou vláknitá houba, s výhodou roku Aspergiilus, ještě výhodněji Aspergiilus niger.

io Termín „transgenický organismus“ ve vztahu k předkládanému vynálezu zahrnuje jakýkoliv organismus, který obsahuje sekvenci nukleotidů kódující rekombinantní enzym podle předkládaného * vynálezu a/nebo z ní získaných produktů, přičemž promotor může dovolit expresi sekvence nukleotidů podle předkládaného vynálezu v organismu. S výhodou je nukleotidová sekvence zahrnuta v genomu organismu.

Transgenickým organismem je s výhodou vláknitá houba, s výhodou rodu Aspergiilus, ještě výhodněji Aspergiilus niger,

Transgenický organismus podle předkládaného vynálezu proto zahrnuje organismus, obsahující některý z nebo kombinaci promotoru, nukíeotidové sekvence kódující rekombinantní enzym podle předkládaného vynálezu, konstrukty podle předkládaného vynálezu (včetně jejich kombinací), vektory podle předkládaného vynálezu, plazmidy podle předkládaného vynálezu, buňky podle předkládaného vynálezu, tkáně podlé předkládaného vynálezu nebo jejich produkty.

Termín „transgenický organismus“ nezahrnuje přírodní nukleotidy kódující sekvenci podle předkládaného vynálezu v jejím přirozeném prostředí, kdy je pod kontrolou svého přirozeného ^r - promotoru, který, je rovněž ve svém přirozeném prostředí. 'Navíc fŤ^r 30 předkládaný vynález*nezahrnuje nativnr enzym podle předkládaného

-18* «« · ·· fe · *· • · · t· vynálezu, pokud je ve svém přirozeném prostředí, a pokud byl exprimován svou nativní nukleotidovou kódující sekvencí, která je rovněž ve svém přirozeném prostředí, a když je nukleotidová sekvence pod řízením svého nativního promotoru, který je rovněž ve s svém přirozeném prostředí.

Transformovaná buňka nebo organismus by mohla připravit přijatelná množství požadované sloučeniny, které by mělo být z buňky nebo organismu snadno získatelné.

S výhodou zahrnuje konstrukt podle předkládaného vynálezu 10 nukleotidovou sekvenci podle předkládaného vynálezu a promotor.

Termín „promotor“ se zde používá ve svém obvyklém smyslu v oboru, například vazebné místo RNA polymerázy podle JacobMonodovy teorie genové exprese.

V jednom hledisku je nukleotidová sekvence podle 15 předkládaného vynálezu řízena promotorem, kterým může být pro buňku nebo pro tkáň specifický promotor. Jestliže je například organismem rostlina, potom může být promotor jedním z těch, které ovlivňují expresi sekvence nukleotidů v jedné nebo více rostlinných částí, jako je hlíza, stonek, klíček, kořen a listové tkáně.

2o Promotorem pro nukleotidovou sekvenci podle předkládaného vynálezu může být například promotor a-Amy 1 (jinak známý jako Amy 1 promotor, Amy 637 promotor nebo a-Amy 637 promotor), jak se popisuje v naši související UK patentové přihlášce No. 9421292.5, podané 21. 10. 1994. Alternativně může být promotorem pro nukleotidovou sekvenci podle předkládaného vynálezu promotor aAmy 3 (jinak známý jako Amy 3 promotor, Amy 351 promotor nebo a- ⁴ Amy 351 promotor), jak se popisuje v naší související UK patentové přihlášce No. 9421286.7, podané 21. 10. 1994.

Promotor by navíc mohl zahrnovat vlastnosti, které zajišťují 3o nebo zvyšují expresi u vhodného hostitele. Těmito vlastnostmi by v v • · · · • · · · * t * · · e · · · »

-19- ’* • · · · · · • · · · »» • · · ·* * * • · · ·» · mohly být konzervované oblasti, jako je Pribnowův box nebo TATA box. Promotor muže dokonce obsahovat další sekvence pro ovlivnění (jako například udržování, zvýšení, snížení) úrovní exprese nukleotidové sekvence podle předkládaného vynálezu, nebo v případě 5 kombinace konstruktů, GOI. Vhodné další sekvence například zahrnují intron Sh1 nebo intron ADH. Jinými sekvencemi jsou inducibilní prvky, jako například prvky indukovatelné teplotou, chemickými vlivy, světlem nebo stresem. Mohou být také přítomny vhodné prvky pro zesílení transkripce nebo translace. Příkladem posledně uvedeného 10 prvku je signální sekvence TMV 5’ (viz Sleat, Gene 217 [1987] 217 225; a Dawson, Plant Mol. Biol. 23 [1993] 97).

Předkládaný vynález také zahrnuje kombinace promotorů a/nebo nukleotidových sekvencí kódujících proteiny nebo rekombinantní enzymy a/nebo prvky.

Předkládaný vynález zahrnuje také použití promotorů pro expresi nukleotidové sekvence kódující rekombinantní enzym podle předkládaného vynálezu nebo GOI, přičemž část promotoru je inaktivována, ale promotor může stále ještě fungovat jako promotor. Částečná inaktivace promotoru je v některých případech výhodná.

Konkrétně s promotorem Amy 351 uvedeným drive je možné inaktivovat jeho část tak, že částečně inaktivovaný promotor exprimuje nukleotid podle předkládaného vynálezu nebo GOI specifičtějším způsobem, jako právě v jedné specifické tkáni nebo orgánu.

Termín „inaktivovaný“ znamená částečnou inaktivaci v tom smyslu, že expresní obraz promotoru je modifikován, ale částečně inaktivovaný promotor stále ještě funguje jako promotor. Jak je však uvedeno výše, modifikovaný promotor je schopen exprimovat nukleotid podle předkládaného vynálezu nebo GOI v alespoň jedné (ale ne< všech) specifických tkáních původního promotoru. Jedním takovým promotorem je promotor Amy 351 popisovaný výše. Příklady • · · · · · ···· ··· «* ···· ·· · · · ·: ·» ··· · · • · · · · ·· · · · *

-20částečné inaktivace zahrnují změnu způsobu skládání sekvence promotoru nebo látek schopných se navázat na části nukleotidové sekvence, takže nukleotidové sekvence například není rozpoznána RNA polymerázou. Dalším a výhodným způsobem částečné inaktivace s promotoru je jeho zkrácení do formy fragmentů. Další cestou by byla mutace alespoň části sekvence, takže RNA polymeráza se nemůže vázat na tuto Část nebo jinou Část, Další modifikací je mutace vazebných míst pro regulační proteiny, například protein CreA, známý z vláknitých hub jako vykonávající katabolickou represi uhlíkem, a tím 10 zrušit katabolickou represi nativního promotoru.

Termín „GOI“ (gene of interest) ve vztahu ke kombinaci konstruktů podle předkládaného vynálezu znamená jakýkoliv gen, o který může být předmětem zájmu. GOI může být jakýkoliv nukleotid, který je organismu buď cizí nebo vlastní (například vláknité houby, is s výhodou rodu Aspergillus nebo rostliny). Typické příklady daných genů jsou geny kódující proteiny a enzymy, modifikující metabolické a katabolické procesy, GOI může kódovat prostředek pro zavedení nebo zvýšení rezistence vůči patogenům. GOI může dokonce být kódující (antisense) konstrukt pro modifikaci exprese přírodních 2o transkriptů přítomných v relevantních tkáních. GOI může dokonce kódovat nepřirozený protein vláknité houby, s výhodou roku Aspergillus nebo sloučeninu, která je prospěšná pro zvířata nebo rostliny.

Příklady daných genů jsou jiné pektinázy, pektindepolymerázy, 25 polygalakturonázy, pektátlyázy, pektinlyázy, rhamno-galakturonázy, hemicelulázy, endo-beta-glukanázy, arabinázy nebo acetylesterázy . nebo jejich:kombinace, stejně jako jejich kódující sekvence.

GOI může být protein, který potravině nebo obilovině dává nutriční hodnotu. Typickými příklady jsou rostlinné proteiny, které 3o mohou inhibovat vytváření antinutričních faktorů a rostlinné proteiny, -které mají výhodnější složení aminokyselin (například :vyšší obsah

4 ·· · · * · · 4 4 · · ·4 *4*4··4 · * * • j ·· 44 44 4444 lyzinu než netransgenní rostlina). GOI může dokonce kódovat enzym, kterého je možno použít při zpracování potravin, jako je chymozin, thaumatin a α-galaktosidáza. GOI může být gen kódující některý škodlivý toxin, kódující transkript jako například pro patatin nebo a- amylázu, ADP-giukózofosforylázu (např. viz EP-A-0455316), kódující proteázu, glukanázu nebo genomovou PME.

GOI může dokonce kódovat intron konkrétního enzymu, u kterého však může být intron v kódující nebo nekódující orientaci. V případě kódující orientace by mohla být konkrétním enzymem io genomická PME. Kódující exprese genomických exonových nebo intronových sekvencí jako je GOI by znamenala, že přirozená exprese PME by se snížila nebo zastavila, ale exprese rekombinantní PME by nebyla ovlivněna. To platí zvláště pro expresi kódujícího intronu nebo nekódujícího intronu.

is GOI může být nukleotidová sekvence kódující enzym a-amylázu, který je předmětem naší související UK patentové přihlášky No.

9413439.2 podané 4. 7. 1994. GOI může být sekvence nukleotidů kódující enzym α-amylázu, která je předmětem naší související UK patentové přihlášky No. 9421290.9, podané 21. 10. 1994. GOI může být jakákoliv nukleotidová sekvence kódující enzymy ADPglukózofosforylázy, které jsou předmětem naší související PCT patentové přihlášky PCT/EP 94/01082, podané 7, 4. 1994. GOI může být jakákoliv z nukleotidových sekvencí kódující enzym a-glukanlyázu, které se popisují v naší související PCT patentové přihlášce PCT/EP

94/03397, podané 15. 10. 1994.

Hostitelským organismem může být prokaryotický nebo eukaryotický organismus. Příklady vhodných prokaryotických hostitelů jsou E. coli a Bacillus subtilis. Způsoby transformace prokaryotických hostitelů jsou v oboru dobře dokumentovány, viz například Sambrook a další (Molecular Cloning: _rA Laboratory Manual, 2. vydání, 1989, . / Cold Spring Harbor Laboratory Press). Jestliže se použije • « • ♦ 4 · 4 * · V I « « 4 • 4» * · . · 4 · ϊ»

- 22 prokaryotického hostitele, může být potřeba gen před transformací vhodně modifikovat, například odstraněním intronů.

Jak bylo uvedeno výše, výhodným hostitelským organismem je rod Aspergillus, jako například Aspergillus niger.

Transgenní Aspergillus podle předkládaného vynálezu je možno připravit podle postupů: Rambosek, J. a Leach, J. 1987 (Recombinant DNA in filamentous fungi: Progress and Prospects. CRC Crit. Rev. Biotechnol. 6: 356 - 393), Davis R, W. 1994 (Heterologous gene expression and protein secretion in Aspergillus. V: Martinelli S. D., io Kinghorn J. R. (vyd.) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology díl 29. Elsevier Amsterdam 1994, str. 525 - 560), Ballance, D. J. 1991 (Transformation systems for Filamentous Fungi and an Overview of Fungal Gene structure. V: Leong, S. A., Berka R. M. (vyd.) Molecular Industrial Mycology. Systems and Applications for is Filamentous Fungi. Marcel Dekker lne. New York 1991, str. 1 - 29) a Turner G 1994 (Vectors for genetic manipulation. V: Martinelli S. D., Kinghorn J. R. (vyd.) Aspergillus: 50 years on. Progress in industrial microbiology díl 29. Elsevier Amsterdam 1994, str. 641 - 666). Následující komentář však poskytuje souhrn těchto znalostí vytváření 2o transgenních druhů Aspergillus podle předkládaného vynálezu.

Již téměř jedno století se vláknité houby široce používají v mnoha oborech průmyslu pro výrobu organických sloučenin a enzymů. Rodu Aspergillus využívaly například tradiční japonská kojí a fermentace sóji. Rovněž v tomto Století se používal Aspergillus niger 25 pro výrobu organických kyselin, zvláště kyseliny citrónové a pro výrobu různých enzymů pro použití v průmyslu.

Existují dva hlavní důvody, proč byly vláknité houby v průmyslu tak široce používány. Za prvé, vláknité houby mohou produkovat vysoká množství extracelulárních produktů, například enzymů a :.3o . organických sloučenin, jako jsou antibiotika nebo organické kyseliny. Za druhé, vláknité houby mohou růst na laciných substrátech, jako je

« 9

-23šrot, otruby, vyloužené řepné řízky apod. Ze stejných důvodů jsou vláknité houby výhodnými organismy jako hostitelé heterologní exprese podle předkládaného vynálezu.

Pro přípravu transgenních druhů rodu Aspergillus se připravují expresní konstrukty vložením nukleotídové sekvence podle předkládaného vynálezu (nebo dokonce GOI) do konstruktu určeného pro expresi ve vláknité houbě.

Bylo vyvinuto několik typů konstruktů používaných pro heterologní expresi. Tyto konstrukty obsahují s výhodou promotor, io který je v houbě aktivní. Příklady promotorů zahrnují houbový promotor pro ve velké míře exprimovaný extracelulární enzym, jako je promotor giukoamylázy nebo promotor α-amylázy. Nukleotidová sekvence podle předkládaného vynálezu (nebo dokonce GOI) může být fúzována k signální sekvenci, kterou se dosáhne směřování 15 proteinu kódovaného nukleotldovou sekvencí podle předkládaného vynálezu (nebo dokonce GOl) k sekreci. Obvykle se používá signální sekvence houbového původu. Expresní systém je zakončen terminátorem aktivním v houbách.

U hub byl vyvinut další typ expresního systému, ve kterém může 20 být nukleotidová sekvence podle předkládaného vynálezu (nebo dokonce GOI) fúzována k menší nebo větší části houbového genu kódujícího stabilní protein. To může stabilizovat protein kódovaný nukleotidovou sekvencí podle předkládaného vynálezu (nebo dokonce GOI). V takovém systému může být zavedeno mezi houbový protein a 25 protein kódovaný nukleotidovou sekvencí podle předkládaného vynálezu (nebo dokonce GOI) místo štěpení, rozpoznávané specifickou proteázou, takže vytvořený fuzní protein může být specifickou proteázou v tomto místě odštěpen a tím může být protein kódovaný nukleotidovou sekvencí podle předkládaného vynálezu 30 (nebo dokonce GOI) uvolněn^, Například je možno zavést míst rozpoznávané KEX-2 -podobnou peptidázou, nalézanou alespoň

C t C^Jc*

Čí t<»c «<· c. e<íč

4ír ·*?'ě·· ««t ΛΓ štěpení in k·

4· ^Ί10 <** některých druzích rodu Áspergillus. Taková fuze *véde’ke ^v/vó a má ža následek^ ochranu exprimovaného produktu a nikoliv většího fuzního proteinu?*· - ^Γ ‘ ' p Γ 4. -.-/i (? Ύ * ·* ^; ..Ίΐί . 0 ·

Heterologm exprese u rodu Áspergillus byla hlášena pro několik genů kódujících bakteriální, houbové, savčí a rostlinné proteiny.

’’ o'-W'? C.4ií i'¹ 7 .. & Γ Νύχι ?. ”

Proteiny mohou být ukládány intracelulárně, pokud nukleotidová νχΐ5·'⁽·χ , .)7 - 1J3 .. f 4 *·. .,· sekvence podle předkládaného vynálezu (nebo dokonce GOI) není fúzována’^ signální sekvenci.⁷'Takové*proteiny s‘é*budoiřHromadit-v ^v čýtoplažměV á obvyklé ^J,nébudóu ”glýkošyldvány?-cóž'<· může - být pro ‘ některé^ bakteriální^ proteiny výhodné.; Jestližé^jě ‘nukleotidová sekvence ^xrpodie^{f r}předkládahého^t: vynálěžu* (nebo < dokonce * GÓI) .μ 7 \i ^”· u řv * j*¹. * opatřena signální sekvencí, protein sebude hromadit extracelulárně.* . . CP“ ►<Mru ¹ v-aiV:· : , ...€.τ·ι%-·/

Co se týče stability produktu a modifikací hostitelského kmene,

.. jí, .r.í.., v<-„ -.te 7 .,.<·^ř /..

nektere heterologm proteiny nejsou pri sekreci do kultivačního media

·. ýS··'#· ?.* f*ťt. 7* .Γ ř ‘ *’ ^r {· .'* hub příliš stabilní: Většina^ hub produkuje několik extraóelulárních r , - ' ·„ ’ V?· '«·;·ί«1;ΓΠ n proteaz, ktere degraduji? heterologm proteiny. Aby bylo možno vyhnout se' tomuto·'problému,' jako hostitelé pro ^heterologní produkci

- byly použitý zvláštní houbové kmeny sé sníženou produkci přoteáz;

Pro transformaci vláknitých hub bylo pro mnoho případu '· ’ Ví ' 'X íJ \ 4, í*rqv ?’ 7... · ó *·>'’ ' ' ' vláknitých hub vyvinuto několik transformačních protokolů (Ballance ' .ji, ·*·*:-.. ·. Ltrí.

1991, vyse). Mnoho z nich je založeno na přípravě protoplastu a zavedení DNA do protoplastů' s použitím’¹ PEG a iontů vápníku. Transformované¹ protoplasty se potom regenerují a pomocí různých selektivních markérů se vybírají transformované houby. Mezi markéry používané pro transformaci patří řada auxotrofních markérů, jako je argB- trpC, niaD a pyrG, markérů-rezistence na antibiotika, jako je rezistence na benomyl,- hygromycin a phleomycin. Běžně používaným transformačním markérem je gen andS A. nidulans, který při vysokém počtu kopií dovolí houbě růst v akrylamidu jako jediném zdroji dusíku.

iV--/dalším provedení^έ může být transgeníckým organismem L kvasinka. V tomto ·směru- byly¹ kvasinky také široce používány-jako , «2 .X f

• *

-25nosič pro expresi heterologních genů. Druh Saccharomyces cerevisiae má dlouhou historii průmyslového použití včetně použití pro expresi heterologních genů. Přehled exprese heterologních genů je možno nalézt v Goodey a další (1987, Yeast Bíotechnology, D. R. Berry á s další, vyd., str. 401 - 429, Allen and Unwin, Londýn) a v King a další (1989, Molecular and Cell Biology of Yeasts, E. F. Walton a G. T. Yarronton, red., str. 107 - 133, Blackie, Glasgow).

Saccharomyces cerevisiae je pro expresi heterologních genů vhodná z několika důvodů. Za prvé je nepatogenní pro člověka io a neschopná vytvářen některé endotoxiny. Za druhé má dlouhou historii bezpečného používání po stoletích komerčního využití k různým účelům. To vedlo k široké přijatelnosti veřejností. Za třetí extenzivní komerční použití a výzkum věnovaný tomuto organismu měl za následek velké množství znalostí o genetice a fyziologii, stejně jako 15 vlastností týkajících se charakteristik Saccharomyces cerevisiae z hlediska fermentace ve velkém měřítku.

Přehled principů exprese heterologních genů v Saccharomyces cerevisiae a sekrece genových produktů se uvádí v E. Hinchcliffe, E. Kenny (1993, „Yeast as a vehicle for the expression of heterologous 20 genes“, Yeasts, díl 5, Anthony H. Rose a J. Stuart Harrison, red.,

2. vydání, Academie Press Ltd.).

K dispozici je několik typů kvasinkových vektorů, včetně integrativních vektorů, které pro své zachování vyžadují rekombinaci s genomem hostitele, a autonomně se replikujících plazmidových 25 vektorů.

Aby bylo možno připravit transgenní Saccharomyces, připraví se expresní konstrukty vložením nukleotidové sekvence podle předkládaného vynálezu do konstruktu určeného pro expresi v kvasinkách. Bylo vyvinuto několik typů konstruktů používaných pro ··/. 30. ..heterologní expresi. Konstrukty obsahují promotor aktivní u kvasinek ’ fúzovaný k sekvenci nukleotidů podle předkládaného vynálezu,'.

• · • · to · to · • · t ♦ · * «toto¹- · · · * to to * ·« «-to «* ·« · · · :

-26 obvykle se používá promotor kvasinkového původu, jako je promotor GAL1. Obvykle se používá signální sekvence kvasinkového původu, jako je sekvence kódující signální peptid SUC2. Expresní systém je zakončen terminátorem aktivním u kvasinek.

s Pro transformaci kvasinek bylo vyvinuto několik transformačních protokolů. Například transgenní kvasinka Saccharomyces podle předkládaného vynálezu může být připravena podle prací Hinnen a další (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, J. D. (1978, Nátuře, Londýn, 275, 104);

io a Ito, H. a další (1983, J. Bacteriology 153, 163 - 168).

Selekce transformovaných kvasinkových buněk se provádí s použitím různých selektivních markérů. Mezi markéry použitými pro transformaci patří řada auxotrofních markérů jako je LEU2, HIS4 a TRP1 a markéry dominantní antibiotické rezistence jako jsou 15 markéry aminoglykosidových antibiotik, například G418.

Dalším hostitelským organismem je rostlina.

Ačkoliv enzymy a sekvence nukleotidů kódující rostliny nejsou v EP-B-0470145 a CA-A-2006454 popisovány, tyto dva dokumenty poskytují určité užitečné základy týkající se typu technik, kterých je 2o možno použít pro přípravu transgenních rostlin podle předkládaného vynálezu. Některé z_; těchto základních přístupů se nyní diskutují v následujícím komentáři.

Základním principem konstrukce geneticky modifikovaných rostlin je vložit genetickou informaci do rostlinného genomu, aby se 25 dosáhlo stabilního udržování vloženého genetického materiálu.

Pro vkládání genetické informace existuje několik technik, přičemž dvěma hlavními principy jsou přímé zavádění genetické informace a zavádění genetické informace použitím vektorového systému. Přehled obecněl, používaných způsobů je možno ^nalézt 3o v článcích Potrykus (Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. [1991]

-27 42: 205 - 225) a Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27).

V jednom hledisku se předkládaný vynález týká vektorového systému nesoucího nukleotidovou sekvenci nebo konstrukt podle 5 předkládaného vynálezu a schopného zavádění nukleotidové sekvence nebo konstruktu do genomu organismu, jako je rostlina.

Vektorový systém může zahrnovat jeden vektor, ale může obsahovat i dva vektory. V případě dvou vektorů se vektorový systém obvykle označuje jako binární vektorový systém. Binární vektorové io systémy se podrobněji popisují v Gynheung, An a další (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1-19.

Jedním často využívaným systémem pro transformaci rostlinných buněk daným promotorem nebo nukleotidovou sekvencí nebo konstruktem je systém založený na použití plazmidu Ti 15 z Agrobacteriumtumefaciens nebo plazmid Ri z Agrobacteríum rhizogenes An a další (1986), Plant Physiol. 81, 301 - 305 a Butcher

D. N. a další (1980), Tissue Culture Methods far Plant Pathologists, red.: D. S. Ingrams a J. P. Helgson, 203 - 208.

Bylo zkonstruováno několik různých plazmidů Ti a Ri, které jsou 2o vhodné pro konstrukci výše uvedených rostlin nebo rostlinných buněk. Neomezujícím příkladem takového plazmidu Ti je pGV3850.

Nukleotidová sekvence nebo konstrukt podle předkládaného vynálezu by měly být s výhodou vloženy do plazmidu Ti mezi terminální sekvence T-DNA nebo v blízkosti sekvence T-DNA, aby se 25 zabránilo přerušení sekvencí bezprostředně obklopujících hranice ΤΟ. NA, jestliže se alespoň jedna z těchto oblastí jeví jako nezbytná pro vložení modifikované T-DNA do rostlinného genomu.

Z výše uvedeného vysvětlení je jasné, že jestliže je organismem rostlina,'potom je vektorem podle předkládaného vynálezu s výhodou 30 vektor, který obsahuje sekvence, nezbytné pro infekci rostliny

Λ 9 9 φ · · » · · · .

fr · · » 9 9 99 9 9 9

999999 9 9 9 9

-28(například oblast vir) a alespoň jednu hraniční část sekvence T-DNA, přičemž hraniční část je umístěna na stejném vektoru jako genetický konstrukt. S výhodou je vektorovým systémem plazmid Ti Agrobacterium tumefaciens nebo plazmid Ri Agrobacterium 5 rhizogenes nebo jejich derivát, protože tyto plazmidy jsou dobře známy a široce používány při konstrukci transgenních rostlin, a existuje mnoho vektorových systémů založených na těchto plazmidecb nebo jejich derivátech.

Při konstrukci transgenní rostliny může být nukleotidová io sekvence nebo konstrukt podle předkládaného vynálezu nejprve zaveden do mikroorganismu, ve kterém se může vektor replikovat a s kterým lze před vložením do rostliny snadno manipulovat. Příklad použitelného mikroorganismu je E. coli, ale může být použito i jiných organismů s výše uvedenými vlastnostmi. Jestliže je vektor nebo 15 vektorový systém v E.. coli vytvořen, převede se v případě potřeby do vhodného kmene rodu; Agrobacterium, například Agrobacterium tumefaciens. Plazmid Ti nesoucí nukleotidovou sekvenci nebo konstrukt podle vynálezu je tedy s výhodou převeden do vhodného kmene Agrobacterium, například 4. tumefaciens, aby tak byla získána 2o buňka Agrobacterium nesoucí sekvenci nukleotidů nebo konstrukt podle vynálezu, jehož DNA se potom převede do rostlinné buňky určené k modifikaci. r

Jak se uvádí v CA-A-2006454, je dostupný velký počet klonovacích vektorů, které obsahují replikační systém v E. coli 25 a markér, který umožňuje selekci transformovaných buněk. Vektory obsahují například pBR322, řadu pUC, řadu M13 mp, pACYC 184 apod.

Tímto způsobem může být nukleotid nebo konstrukt podle předkládaného vynálezu zaveden do vhodné restrikční polohy ve 30.. véktoru.'Obsažený plazmid se používá pro transformaci E. coli. Buňky f E. coli se kultivují, ve vhodném živném médiu a potom- se sklidí

a lyžují. Potom se získá plazmid. Jako způsoby analýzy se obvykle používají analýza sekvence, restrikční analýza, elektroforéza a další biochemicko-molekulárně genetické metody. Po každé manipulaci může být použitá sekvence DNA restrikčně štěpena a spojena s další 5 sekvencí DNA. Každá sekvence může být klonována do stejného nebo různého plazmidu.

Po každém zavedení požadovaného promotoru nebo konstruktu nebo sekvence nukleotidů podle předkládaného vynálezu do rostlin může být nutné přítomnost a/nebo vložení dalších sekvencí DNA.

Jestliže se například použije pro transformaci rostlinných buněk plazmid Ti nebo Rí, mohou být připojeny jako obklopující oblasti zavedených genů alespoň pravá hranice a často pravá i levá hranice T-DNA Ti a Ri plazmidu. Použití T-DNA pro transformaci rostlinných buněk bylo intenzívně studováno a popisuje se v EP-A-120516;

Hoekema, v: The Binary Planí Vector Systém Offset-drukkerij Kanters

B. B., Alblasserdam,1985; kapitola V; Fraley, a další, Crit. Rev. Plant Sci., 4: 1 - 48; a v An a další, EMBO J. (1985) 4: 277 - 284.

Přímá infekce rostlinných tkání bakterií Agrobacteríum je jednoduchou technikou, která se široce používá a která se popisuje 20 v Butcher D. N. a další (1980), Tissue Cu/ture Methods for Plant Pathologists, red.: D. S. Ingrams a J. P. Helgeson, 203 - 208. Pro další informaci na toto téma je možno použít Potrykus (Annu, Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. [1991] 42: 205 - 225) a Christou (AgroFood-lndustry Hi-Tech March/April 1994 17 - 27). Touto technikou 25 může být na určité části tkáně nebo rostliny provedena infekce, tj. například na části listu, kořene, stonku nebo jiné části rostliny.

Při přímé infekci rostlinných tkání bakterií Agrobacteríum nesoucí promotor a/nebo GOI se typicky rostlina určená k infekci poraní, například naříznutím rostliny žiletkou nebo napíchnutí rostliny 3o jehlou nebo odřením rostliny abrazivní látkou. Rána se potom ‘ > · zaočkuje bakterií Agrobacteríum. Zaočkovaná rostlina nebo část « ·

-30rostlíny se potom pěstuje na vhodném kultivačním médiu a ponechá se vyvinou na zralou rostlinu.

Při konstrukci rostlinných buněk se mohou buňky pěstovat a udržovat podle dobře známých způsobů kultivace tkání, jako například 5 kultivací buněk ve vhodném kultivačním médiu doplněném nezbytnými růstovými faktory, jako jsou aminokyseliny, rostlinné hormony, vitaminy apod. Regeneraci transformovaných buněk na geneticky modifikované rostliny je možno provádět s použitím známých způsobů regenerace rostlin z buněčných nebo tkáňových kultur, například 10 volbou transformovaných buněk s použitím antibiotika a subkultivaci těchto buněk na médiu obsahujícím příslušné živiny, rostlinné hormony apod.

Další informace o transformaci buněk je možno nalézt v EP-A0449375.

V souhrnu tedy předkládaný vynález poskytuje způsob stabilizace alespoň jednoho proteinu v kyselém prostředí, který zahrnuje uvedení proteinu do styku s blokovým způsobem enzymaticky deesterifikovaným pektinem, zvláště s blokovým způsobem enzymaticky deesterifikovaným pektinem připraveným 20 technikami rekombinantní DNA.

_r. Navíc poskytuje předkládaný vynález rekombinantní enzym použitelný při tomto způsobu.

Výhodné provedení podle předkládaného vynálezu se týká způsobu stabilizace alespoň jednoho proteinu v kyselém prostředí 25 zahrnující uvedení proteinu do styku s blokovým způsobem enzymaticky deesterifikovaným pektinem připraveným technikami rekombinantní DNA, přičemž blokovým způsobem enzymaticky deesterifikovaný pektin se připravuje použitím rekombinantního enzymu, a kde rekombinantní enzym obsahuje jakoukoliv, ze sekvencí 3o ; aminokyselin uvedenou v SEQ.l.D. No. 1 nebo SEQ.I.D. No. 2 nebo • ·

-31 jejich variantě, derivátu nebo homologu včetně jejich kombinací, a má následující vlastnosti:

1. molekulární hmotnost od přibližně 36 kD do přibližně 64 kD;

2. optimum pH 7 - 8 při měření s 0,5 % Kmetovým pektinem s v 0,15 M NaCI; .

3. optimum teploty alespoň 50 °C;

4. teplotní stabilitu v rozmezí od 10 °C do alespoň 40 °C;

5. hodnotu K_m 0,07 %;

6. maximum aktivity při koncentraci přibližně 0,25 M NaCI;

io 7. maximum aktivity při koncentraci přibližně 0,2 M Na₂SO₄; a

8. maximum aktivity při koncentraci přibližně 0,3 M NaN0₃.

Další výhodné provedení předkládaného vynálezu se týká způsobu enzymatické deesterifikace pektinu blokovým způsobem, který zahrnuje působením rekombinantního enzymu obsahující 15 některou ze sekvencí aminokyselin uvedenou v SEQ.I.D. No. 1 nebo SEQ.I.D. No. 2 nebo· jejich variantě, derivátu nebo homologu včetně jejich kombinací na pektin, přičemž rekombinantní enzym má následující vlastnosti:

1. molekulární hmotnost od přibližně 36 kD do přibližně 64 kD;

2. optimum pH 7 - 8 při měření s 0,5 % limetovým pektinem v 0,15 M NaCI;

3. optimum teploty alespoň 50 °C;

4. teplotní stabilitu v rozmezí od 10 °C do alespoň 40 °C;

5. hodnotu K_m 0,07 %;

6. maximum aktivity při koncentraci přibližně 0,25 M NaCI;

7. maximum aktivity při koncentraci přibližně 0,2 M Na₂SO₄; a

8. maximum aktivity při koncentraci přibližně 0,3 M NaNO₃.

Další výhodné provedení podle předkládaného vynálezu se týká rekombinantního enzymu obsahující >některou aminokyselinovou 30 sekvenci uvedenou jako SEQ.I.D. No. 1 nebo SEQ.I.D. No. 2 nebo její ·, ' -i

-32variantu, derivát nebo homolog včetně jejich kombinací, přičemž rekombinantní enzym má následující vlastnosti:

1. molekulární hmotnost od přibližně 36 kD do přibližně 64 kD;

. 2. optimum pH 7 - 8 při měření s 0,5 % limetovým pektinem s vO,15MNaCI;

3. optimum teploty alespoň 50 °C;

4. teplotní stabilitu v rozmezí od 10 °C do alespoň 40 °C;

5. hodnotu K_m 0,07 %;

6. maximum aktivity při koncentraci přibližně 0,25 M NaCI;

io 7. maximum aktivity při koncentraci přibližně 0,2 M Na₂SO4; a

8. maximum aktivity pří koncentraci přibližně 0,3 M NaNO3.

Výhodnější provedení předkládaného vynálezu se týkají výše uvedeného výhodného způsobu, způsobu a rekombinantního enzymu, is a kde byl rekombinantní enzym exprimován nukleotidovou sekvencí obsahující sekvenci uvedenou jako SEQ.I.D. No. 3 nebo SEQ.I.D. No. 4 nebo jejích variantu, derivát nebo homolog.

V souladu s Budapešťskou úmluvou byl uložen v uznané sbírce The National Collections of Industrial and Marině Bacteria Limited (NCIMB), 23 St Machar Drive, Aberdeen, Skotsko, AB2 1RY, UK, vzorek dne 6. 7. 1995 jako NCIMB 40749 (který odpovídá plazmidu pO34).

V souladu s Budapešťskou úmluvou byl uložen ve sbírce The National Collections of Industrial and Marině Bacteria Limited

2s (NCIMB), 23 St Machar Drive, Aberdeen, Skotsko, AB2 1RY, UK, vzorek dne 12. 7. 1995 jako NCIMB 40750 (který odpovídá plazmidu pO17).

Výhodnější provedení předkládaného vynálezu se proto týkají : výše uvedeného způsobu stabilizace, deesterifikace a

-33• · ♦ ·’ • · > ♦

rekombinantního enzymu, kde rekombinantní enzym může být exprimován NCIMB 40470 nebo NCIMB 40750.

Předkládaný vynález také poskytuje sekvenci aminokyselin :

obsahující sekvenci uvedenou jako SEQ.I.D. No. 5 nebo její variantu, ' | derivát nebo homolog, vhodnou pro použití při propůjčení nebo zvýšení tepelné stability proteinu.

Navíc předkládaný vynález poskytuje nukleotidovou sekvenci obsahujícísekvenci uvedenou v SEQ.I.D. No. 6 nebo její variantu, derivát nebo homolog, vhodnou pro použití při expresi sekvence io aminokyselin pro propůjčení nebo zvýšení tepelné stability proteinu.

Vzhledem k těmto posledním hlediskům výše uvedený komentář týkající se variant, derivátů, homologů, konstruktů, vektorů a transformace hostitelských organismů je stejně dobře použitelný, ačkoliv samozřejmě sekvence aminokyselin a nukleotidů v tomto 15 případě ovlivňuje teplotní stabilitu proteinů.

V tomto ohledu se předpokládá, že aminokyselinová sekvence uvedená jako SEQ.I.D. No. 5 je schopna propůjčit nebo zvýšit teplotní stabilitu proteinu, jako je rekombinantní PME podle předkládaného i ϊ vynálezu. Sekvence aminokyselin může také zvýšit nebo propůjčit

2o teplotní stabilitu jiným proteinům včetně proteinů PME z jiných zdrojů.

Přehled obrázků na výkresech

V následujících příkladech budou používány odkazy na následující obrázky:

Obr. 1 je schematické znázornění citrusového ovoce, jako je pomeranč;

Obr. 2 ukazuje gel ŠDS PAGE rekombinantního enzymu podle

-předkládaného vynálezu;

Obr, 3 je graf pro určení optima pH;

• « · ·

-34Obr. 4 je graf pro určení optima teploty;

Obr. 5 je graf pro určení teplotní stability;

Obr. 6 je graf pro určení hodnoty K_m;

Obr: 7 je graf pro určení aktivity v přítomnosti nebo nepřítomnosti s NaCI;

Obr. 8 je graf pro určení aktivity v přítomnosti nebo nepřítomnosti Na₂SO4;

Obr. 9 je graf pro určení aktivity v přítomnosti nebo nepřítomnosti NaNO₃;

io Obr. 10 je plazmidová mapa pO17;

Obr. 11 je plazmidová mapa pO34;

Obr. 12 je znázornění dvou genů ve formě diagramu;

Obr. 13 je plazmidová mapa pJK10;

Obr. 14 je plazmidová mapa pJK11;

Obr. 15 je plazmidová mapa pJK12;

Obr. 16 je plazmidová mapa pJK20;

Obr. 17 je plazmidová mapa pJK21; a

Obr. 18 je plazmidová mapa pJK22.

Obr. 1 byl již zmiňován ve výše uvedeném popisu a další obrázky jsou diskutovány v následující části.

Příklady provedeni vynálezu

Experimentální část

Materiály a metody pro biochemii

Rostlinný materiál: nezralé španělské pomeranče varieta .Navelina třída I bez semen byly použity pro izolaci PMR.. Z pomerančů ' byly ručně odstraněny slupky, které byly skladovány při - 80 °C.

'« « · * · « ·♦ .

-35• · * · « · • * · · · · ···» ·♦ · · · · «»·· • ♦ 04* * * .. > 9 . ·>Ι » « * » φ ν' ·

Extrakce ΡΜΕ ze slupky pomerančů

PME byla čištěna podle následujícího postupu. Všechny operace byly prováděny při 4 °C. 600 g zmrzlých pomerančových slupek bylo rozmraženo a rozkrájeno na menší kousky. Byly 5 homogenizovány v mixéru Warring 2 min v 1200 ml pufru (100 mM jantaran sodný pH 6,2, 2 mM DTT). Do homogenátu bylo přidáno 36 g pevného NaCI pro dosažení konečné koncentrace 3 % (hmotnost/objem) pro izolaci na membrány navázaných proteinů (Versteeg a další (1978) Lebensmittel.-Wiss. u. Technol., 11: 267 io 274). Po dvouhodinové inkubaci za mírného míchání při teplotě 4 °C byla směs zfiltrována nylonovým sítem a filtrát byl centrifugován při 10 000 ot/min po dobu 20 min pro odstranění nerozpustných zbytků.

Supernatant byl potom frakcionován použitím srážení (NH^SCk Supernatant byl nejprve srážen za mírného míchání po dobu 30 min 15 30 %.(NH₄)₂SO4. Po, centrifugaci při 20 000 ot/min po dobu 10 min byl supernatant dále srážen; 30 min 60 % (NH₄)₂SO4. Suspenze byla centrifugována jako předtím a sraženina byla resuspendována v 50. ml 50 mM MES, 1 mM DTT pH 6,8 a dialyzována pres noc proti stejnému pufru.

Chromatoqrafie

Dialyzovaný vzorek byl dále separován kationtovou iontoměničovou chromatografií. 40 - 50 ml vzorek byl nanesen na kolonu (1,5 x 15 cm) CM-Sepharose™ CL-6B ve dvou dávkách s 30 min proplachováním mezi dávkami pufrem A: 50 mM MES, 1 mM 2s DTT pH 6,8. Po odmytí nenavázaných proteinů pufrem A byly navázané proteiny eluovány vzrůstající koncentrací NaCI od 0 do ... 0,4 M NaCI v celkovém objemu 500 ml. Průtok byl 25 ml/hod a byly shromažďovány frakce 8,33 ml. Absorpční profil proteinu byl měřen při 280 nm.

3Q / Všechny frakce byly analyzovány na aktivitu PME. a proteinu; .* Obsah proteinu byl měřen spektrofotometricky metodou BioRad.

				a·				• ·
«	•	«	9		« ♦	* . ·	•		a
	•	•	9		• «'	♦' 9		99
•	•	' · 9	•		• · ♦	99·	•		•
• 9	•	9	•		• ift ·	9	*		9
• ·		99		··	• •l	··

Frakce obsahující aktivitu PME byly spojeny a zakoncentrovány dialýzou pod tlakem s použitím filtračního systému Amicon. Na stejném systému byla provedena výměna pufru na 50 mM Tris, 1 mM DTT, 0,1 M NaCIpH 7.

9 ml koncentrovaného vzorku PME bylo potom naneseno na gelovou filtrační kolonu Sepharyl™ S-200 (2,6 x 70 cm). Kolona byla ekvilibrována 50 mM Tris, 1 mM DTT, 0,1 M NaCI pH 7. Průtok byl 40 ml/hoďa byly odebírány frakce 5,33 ml. Frakce obsahující aktivitu PME byly spojeny a zakoncentrovány.

io Enzymová aktivita

PME kataiyzuje štěpení methylesterových skupin pektinu. V průběhu purifikačních kroků byla PME detekována rychlou metodou s použitím testu s indikátorem methylčervení. V důsledku odštěpování methylových skupin ze zbytků kyseliny galakturonové v pektinovém 15 řetězci se tvořily karboxylové skupiny a pH při testu klesalo. Indikátor pH - methylčerveň - měnil barvu při poklesu pH ze žluté (pH 6,2) na růžovou (pH 4,2). Test obsahoval 1 ml 0,5 % Grindsted™ Pectin 1450 (DE 70 %) (dodávaný firmou Danisco Ingredients, Danisco A/S) rozpuštěný v 0,15 M NaCI pH 7 v objemu vzorku 125 μΙ. Vzorky, které 2o byly v testu s methylčervení pozitivní po 10 min inkubace při 30 °C byly potom dále měřeny titrační metodou (Versteeg a další (1978) Lebensmittel.-Wiss. U. Technol., 1_1_: 267 - 274).

Titrační metodou prováděný test obsahoval 10 ml 0,5 % limetového pektinu (Grindsted™ Pectin 1450 dodávaný firmou 25 Danisco Ingredients, Danisco A/S rozpuštěný v 0,15 M NaCI pH 6,8 v objemu vzorku 10 - 100 μΙ. Titrace byla prováděna 0,02 M NaOH a průběh reakce byl sledován při pokojové teplotě. Bylo použito automatického titrátoru (Versteeg a další (1978) Lebensmittel.-Wiss. u. Technol., It 267-274).

·Η· 9« 9«···« • ·. · « ·«' ♦ ♦ 9 9 ·9

9 9'. · 9 9 9'<* • .' · 9 ·'' 9 · φφ

999· • 999 φ 99 • · 9 »'· ·'·

-37SDS-PAGE/westernové Plotování

Čistota frakce PME byla testována elektroforézou SDS-PAGE s použitím systému Pharmacia PhastSystem™ s gradientovými gely 10 - 15 % SDS. Elektroforéza a barvení stříbrem proteinů byly 5 prováděny podle popisu v manuálech firmy Pharmacia. Pro stanovení pl IEF bylo použito 3-9 gelů PhastSystem™.

Pro charakterizaci polyklonáiních protilátek proti PME ze slupek ' pomerančů byla použita gelová imunoforéza. Frakce enzymů byly „ rozděleny na SDS - PAGE a převedeny na NC-papír polosuchým io blotovacím způsobem v jednotce Semidry transfer unit systému PhastSystem™. NC-papír byl inkubován s primární protilátkou zředěnou 1 : 50 a barven sekundární protilátkou navázanou na alkalickou fosfatázu (Dako A/S Glsotrup, Dánsko) použitou v ředění 1 : 1000.

Mapování peptidů.....

PME byl štěpen buď trypsinem nebo endoproteinázou Lys-C z Lysobacter enzymogenes (oba enzymové preparáty byly čistoty pro sekvenovány od firmy Boehringer Mannheim, Německo).

100 pg čištěné PME bylo karboxymethylováno jodacetamidem 20 pro ochranu redukovaných skupin SH. Potom byl protein Štěpen trypsinem (4 pg/20 - 100 pl). Hydrolytické štěpení probíhalo 2x3 hod při teplotě 40 °C. Reakce byla zastavena přídavkem 20 pl TFA. Po ; centrifugaci při 15 000 ot/min po dobu 5 min byly peptidy čištěny na

HPLC koloně s reverzní fází (kolona Vydac 10 C18), na kterou byly ⁴ 25 nanášeny vzorky 2 x 500 pl. Peptidy byly eluovány a separovány v gradientu se stoupající koncentrací acetonitrilu 0,05 - 0,35 % v 0,1 % TFA v průběhu-60 min. Peptidy byly ručně jímány do zkumavek Eppendorf.

Pro štěpení endoproteinázou Lys-C byla lyofilizovaná PME

- 30 ,· (0,1? mg) rozpuštěna v 50 pl 8 M močoviny, 0,4 M NH4HCO3 pH 8,4? Po

-38 »· »· ·· ···♦ • · · · · · • · · φ · ♦ • · ··· * ·. * • ♦ · · · ♦ φ φ' • φ ·« • φ ·· •· «φ φ«· '· ♦ φ· převrstvení dusíkem a přídavku 5 μΙ 45 mM DTT byl protein denaturován a 15 min při 50 °C redukován v atmosféře dusíku. Po ochlazení na pokojovou teplotu bylo přidáno 5 μΙ 100 mM jodacetamidu pro derivatizaci cysteinů prováděnou 15 min při 5 pokojové teplotě v temnu v atmosféře dusíku. Potom bylo přidáno 90 μΙ vody a 5 pg edoproteinázy Lys-C v 50 μΙ 50 mM tricinu a 10 mM EDTA pH 8,0 a štěpení bylo prováděno 24 h při 37 ’C pod dusíkem.

Výsledné peptidy byly odděleny jak bylo popsáno pro peptidy štěpené trypsinem.

io Vybrané peptidy byly dále čištěny na koloně Devosil 3 C₁₈ RPHPLC 0,46 x 10 cm (Novo Nordisk, Dánsko). Čištěné peptidy potom byly naneseny do sekvenátoru aminokyselin Applied Biosystems 476A v modu pulsed-liquid fast cycles.

Studie 1 is Při purifikaci PME bylo homogenizováno 600 g zmrazených pomerančových slupek a po srážení 30 - 60 % (NH₄)₂SO₄ a dialýze byly vzorky naneseny na kationtovou iontoměníčovou kolonu (CMSepharose™CL-6B). PME se silně váže na materiál kationtové iontoměničové kolony při pH 6,8, zatímco většina proteinů se neváže

2o a eluuje se do promývacího objemu. Se stoupající koncentrací NaCI se eluuje PME do dvou vrcholů s hlavní aktivitou v PME I (frakce 49 - 53) při koncentraci NaCI 0,25 M). Menší vrchol PME se eluoval při nižší koncentraci NaCI (frakce 25 - 32). Další čištění bylo prováděno pouze pro PME I, který obsahoval nejvyšší aktivitu.

Po koncentraci byla frakce PME dále čištěna s použitím chromatografie gelovou filtrací (kolona Sepharyl™S-200). Frakce obsahující nejvyšší aktivitu PME byly spojeny a zakoncentrovány filtrační dialýzou Amicon.

Celkem bylo, získáno ze 600 g pomerančových slupek 4 mg se PME, což odpovídá výtěžku proteinu 12 %;

···» ·· . ·· ··· ** • · · * * * *.·* * • ·· · · · · »· · · · ' · 4 til »*······· · • β··¹'·· r · · « «

-39SDS-PAGE ukázala u čištěné frakce PME pouze jeden proteinový pruh s molekulovou hmotností 36 000 D (obr. 2). Izoelektrická fokusace PME ukázala pl > 9.

Charakterizace a kinetická data s Charakterizace PME a určení optim bylo vždy prováděno titrační metodou popisovanou v části materiály a metody.

Optimální pH aktivity PME bylo měřeno 0,5 % limetovým pektinem (Grindsted™Pectin 1450 - dodávaný formou Danisco Ingredients, Danisco A/S) v 0,15 M NaCI. Data jsou uvedena v io obrázku 3. Bylo zjištěno optimum v okolí pH 7 - 8.

Teplotní optimum bylo nalezeno v okolí 50 °C - viz data ukázaná na obr. 4.

Tepelná (teplotní) stabilita PME byla určována inkubací vzorku enzymu ve zkumavkách Eppendorf při různých teplotách po dobu 15 15 minut. Po inkubaci byla měřena aktivita enzymu tradičním testem titrační metodou. Stabilita enzymové aktivity se projevovala mezi 10 °C - 40 °C - viz data v obr. 5.

Afinita pro limetový pektin (Grindsted™Pectin 1450 - dodávaný formou Danisco Ingredients, Danisco A/S) byla určována vynesením 20 podle Lineweavera-Burka různé koncentrace pektinu proti aktivitě. Data jsou uvedena v obr. 6. Hodnota K_m byla z křivky vypočtena jako 0,07 %.

Bylo rovněž zjištěno, že PME by mohl také deesterifikovat pektin cukrové řepy. Pektin cukrové řepy obsahuje 60 % zbytků 25 kyseliny gaiakturonové, u níž jsou některé karboxylové skupiny methylovány (přibližný DE 60 %) a navíc jsou některé kyselé skupiny kyseliny gaiakturonové acetylovány v poloze C-2 a/nebo C-3. Aktivita PME byla měřena podle popisu v části materiály a metody s tím , ‘ rozdílem, že v testu bylo použito jednoprocentního pektinu cukrové 30 řepy rozpuštěného v 0,15 M NaCI, protože pektin cukrové řepy

-40Μ ···· obsahoval přibližně 60 % pektinu. Výsledky ukázaly, že PME by mohla deesterifikovat pektin cukrové řepy, i když jsou kyselé zbytky kyseliny galakturonové v polohách C-2/C-3 acetylovány.

	Enzymová aktivita (ymol/min/ml)
0,5 % limetový (lime) pektin (Grindsted™Pectin 1450 - dodávaný formou Danisco Ingredients, Danisco A/S)	387
1,0 % pektin cukrové řepy	80

s Další experimenty ukázaly, že PME podle předkládaného vynálezu s výhodou vyžaduje pro aktivitu NaCl - viz data v obr. 7. Aktivita stoupá se stoupající koncentrací NaCl s optimem při 0,25 M NaCl. Vyšší, koncentrace aktivitu ve srovnání s maximální aktivitou snižují.

io Další experimenty ukázaly, že jiné soli, například Na₂SO₄ nebo

NaNO₃, mohou pro aktivitu PME NaCl nahradit Data jsou uvedena v r obr. 8 a 9. Optimální aktivita byla zjištěna při koncentraci 0,2 M Na₂SO₄, popřípadě 0,3 M NaNO₃.

N-koncová analýza

Studium ukázalo, že N-koncová sekvence nativního PME je blokována. Odblokování bylo dosaženo působením bezvodé TFA po dobu 4 minut při 45 °C ve zkumavkách na PME, blotovanou na membráně PVDF. Po odpaření většiny TFA byly zkumavky umístěny na 4 hod do teploty 65 °C (Wellner, D. a další (1990) Proč. Nati. Acad.

Sci. 87: 1947 - 1949). Získaná sekvence byla

SSSVTPNVVVAADSSGNFK a N-koncovým zbytkem PME je Nacetylserin.

b« ····

-41 Imunohistoloqická lokalizace

Pro přípravu tkáňových vzorků pro imunohistochemii byly řezy střední části zralého plodu fixovány ve dvouprocentním paraformaldehydu, 0,25 % giutaraldehydu a 3 % sacharóze pufrované s 0,05 M fosfátovým pufrem pH 7. Po inkubaci 21 hod při 25 °C a 63 hod při 5 °C byly vzorky promyty 3 x 20 min v 0,05 M fosfátovém pufru pH 7. Pomocí řady promývání ethanolem (50 %, 70 %, 80 % a 96 %) byla provedena dehydratace a potom následovala tři promytí 99 % ethanolem (30 min pro každou koncentraci ethanolu). Po io následném působení 2x2 hod petrolejového uhlovodíku (Shellsol™D70k, Q7712) a 2 x 2 hod v parafinu se 7 % včelího vosku byly vzorky zapuštěny do parafínu. Na přístroji Supercut 2050 Reíchart Jung pyramítome byly připraveny příčné řezy tloušťky 12,5 pm.

Imunologie; _r

Tkáňové řezy byly předem inkubovány s 20 % prasečím sérem v TBS (0,5 M Tris/HCI pH 7,6, 0,15 M NaCI, 0,1 % Triton X-100) po dobu 30 minut a potom byly na 1 hod přidány protilátky PME zředěné 1 ; 50 v TBS. Přebytek protilátky byl odstraněn promýváním TBS 5x5 min.

Po promytí byly řezy inkubovány 30 min se sekundárními protilátkami navázané na alkalickou fosfatázu 1 : 20 v pufru TBS. Přebytek sekundární protilátky byl odstraněn promytím TBS jak bylo uvedeno dříve. Před barvením byly řezy inkubovány s veronalacetátovým pufrem pH 9,2 po dobu 5 min a potom barveny 20 min barvivý Fast 25 Red a Naphtol AS-BI fosfát (Sigma no N4875). Přebytek reagencie byl odstraněn promytím vodou. Kontroly probíhaly paralelně a byly inkubovány s preimunním sérem.

Výsledky

Imunologická lokalizace protilátkou proti PME slupky ukázala, 3o že PME je ve velkých množstvích umístěna ve vnější buněčné vrstvě lamely mezi segmenty, v jádře a ve vnější vrstvě buněk obsahujících

-42 šťávu a rovněž ve vnitřní buněčné vrstvě albeda (viz obr. 1). Tyto výsledky ukazují, že protilátky proti PME kúry křížově reagují s PME dužiny (dužina se skládá ze segmentů, viz obr. 1), což ukazuje na to, že mezi PME ve slupce a v dužině je vysoká homologie.

Studie 2

PME ze slupky pomerančů byla vyčištěna ve velkém množství. Z 5 kg slupek pomerančů bylo izolováno přibližně 70 mg PME. Čištěná PME byla potom použita v testu použití s mléčným proteinem - tj, jogurtovým mlékem. V tomto testu zlepšoval blokovým způsobem enzymaticky deesterifikovaný pektin ve srovnání s nedeesterifikovaným pektinem stabilizační účinky na protein, patrně v důsledku vytvořené blokové struktury. Konečný produkt měl také přijatelnou viskozitu.

Izoformy enzymu

Aniž by bylo třeba vázat se teorií, předpokládá se, že PME podle předkládaného vynálezu může existovat alespoň ve dvou izoformách. Izoforma S má molekulovou hmotnost přibližně 36 kD a může být označována jako „krátká PME“. Izoforma L má molekulovou hmotnost přibližně 64 kD a múze být označována jako „dlouhá PME“.

Předpokládá se také, že izoforma L je stabilnější vůči teplotě než izoforma S. Předpokládá se také, že izoforma S zahájí počáteční krok deesterifikace blokovým způsobem a je pak nahrazena izoformou L. Jinými slovy, předpokládá se, že izoforma L může mít vyšší afinitu k částečně deesterifikovanému pektinu než izoforma S.

Předpokládá se, že teplotní stabilita izoformy L může být způsobena sekvencí aminokyselin představovanou jako SEQ.I.D. No.

5.

»? q r
	c r <r c r <· í t t <:· «: < r ζ>< Of

1/
k	< ’	C ς i?
V	ť	<?.· ti «Κ
íj	f vj	<><:·<< i;·
<	»· í! f:‘	d .!
ť·	♦. ftC	V 4', ». ¢.

f Další studie ukázaly, že gen pro izoformu L má prodloužení Nkonce^ proti směru .translace signální sekvence. To je ukázáno v diagramu na obr. 12.

<*š -C - ·*ί rir

C

Izolace á charakterizace cDNA kódujících pektinmethylesterátu ,¹ Nť ' V ' ú í -!P _e ziskatelnóu z pomerančů

ζ) i *

Materiálý_a metody pro molekulární biologii

1. Materiály

Ή. Γί»·'

Pomeranče (Citrus sinensis) var. Navě! pocházející z Maroka.

IQ

2. DNA ’ . Ufbe /Pf^ř ·

Genomicka. DNA byla izolována podle popisu v Dellaporta S. L . < *

a další (1983) Planí Mol; Biol. Rep. 1(4): 19 - 21. Plazmidová DNA i.

byla izolována jak bylo popsáno v EP-B-0470145. j

3. RNAT‘ri i

7 Celková RNAijbyla^izoloyána ze zralých plodu pomeranče:

Vnější, část dužiny a vnitřní část vrstvy albéda (viz obr. 1) plodů pomeranče Navel byly použity pro izolaci RNA podle postupu popsaného v Lo^émann J., Schell J. a Wiilmitzer L. (1987) Anal. Biochem. 163: 16 - 20. „Improved Methód for the isolation of RNA

2o ^from PlantTissues“·, _r ů_r

*. · v v' · ť' i 4 i ' , 5 τ; ďí *·. .·, -^J ·, x

PCR

Celková, RNAC pomerančů byla použita pro provedení reverzní •;PCR použitím λ krtu řTth Reverse PCR Kit (Perkin Elmer) podle doporučení výrobce s následujícím cyklováním teplot:

' Ti'·, , · .ía. z 4 U -hj· w ííff*^- Λ’Χί

Reverzní transkripce: ‘ ‘ ^v 70 °C ^z'2rnin ' . _;fl.._ϊ{ί W-Jt .'Q .

-44----- -- —- www»· wW ♦ * · 4 4 · « » ·4

4 4 4 4 <, 4 444 • · »44 4 44 4« ·,44

44 4 4 44 4 4 4·

	60 °C	2 min
	50 °C	2 min
	45 eC	5 min
	40 °C	5 min
5	30 °C	10 min
	42 °C	10 min
	70 °C	2,5 min
	5 °C	máčení
10	Amplifikace (PCR):
	94 °C	2 min
	92 °C	1 min
	45 °C	2 min
	72 °C	2 min ve 40 cyklech
15	72 °C	5 min
	5 °C	máčení

5. Klonování fragmentů PCR

Fragmenty PCR byly klonovány do místa EcoRV vektoru 20 pT7Blue (Novagen) podle doporučení výrobce.

6. Sekvenování DNA

Dvojřetězcová DNA byla sekvenována dideoxy metodou Sanger a další (1979) s použitím kitu Auto Read Sequencing Kit (Pharmacia) a přístroje Pharmacia LKB A. L. F. DNA sequencer (viz: Sanger, F., 25 Nicklen, S.,. á) Coulson, A. R. (1979). Dna sequencing with chaindeterminating inhibitors. Proč. Nat. Acad. Sci. USA 74: 5463 - 5467);

···· ·· • 4 * 4· • · 4 4«·'

4 · · 4· ·

-45-” “”

Μ ···*

44 • 4 4 44 • · 444 44

4 44

Příměry použité pro sekvenování jsou uvedeny níže (uvedeny ve směru 5'až 3’):

UNI (M13-20 Primer) -17 Mer

GTAAACGACGGCČAGT1 i

⁵ í

REV -19 MER

GGAAACAGCTATGACCATG · 20 MER

GACAACGGCAACGAGCCTCA · 22 MER

GCACTTGTAAxAACCCTAAAT

-20 MER . ·

CAGGGTAGTTTCCCGACGTA ¹⁵ 04- 20 MER

TACGTCGGGAAACTACCCTG

- 21 MER

CTCCTGGAAGCTTCATTGCTG _a 06-20 MER

GAAGCTTCTTGAAGAGAACG

-20 MER

CGTTCTCTTCAAGAAGAAGCTTC

- 22MER

GAGGATAGCATGATGAGGCTCG

- 22 MER

GCAGTTCACAAAGAACTGGCGG

·♦ a a ♦a ···♦

-46 010 - 22 MEK

CCTCATGATCATCATGTCAGTG

011-21 MER

GCTCCTCAGGGAGGCACTAAG

012-21 MEK

CAGCAATGAAGCTTCCAGGAG

013 - 21 MER

CTTAGTGCCTCCCTGAGGAGC to

014 - 13 MER

GCCACCGCCTGGTGCTTT

015 -18 MER

AAAGCACCAGGCGGTGGC

016 - 20 MER

GCGGGATGCGTTGTCAGACG

017 - 20 MER

GAGGCACTAAGCGGTATATT ²⁰ 018 -18 MER

GCAACTGTAGCAGACTTG

019 - 20 MER

CACTGACATGATGATCATGA

020 - 20 MER

2S

CAATTAAGCAGTTCACAAAG

rj

í.

i, *·

·..

f» t.

CC čť ei

r.i.

n <

*©, U· J .-i ' Γ- .

> i íU. ‘ í . V'

AATATACCGCTTAGTGCCTC ..... ......

v i W ¹ I Έ ’ 4 * , -'(•Λ +: 'F-i * ,F' ·

Π? _4b* . V.„„. ... ’ H iP' l·

C f ř„ <.

r· r. r> c

Cf <?

< «·’· <·<

p£ -i 4* •ύ'ΐ - j. ? Ρ'.'Ή

ΓΤ. .< i λ Sekveňovaná sekvence nukleotidůJéíukázáňá jako‘SEQ.l.D) No. (,3' (odvozená od pO17) a SEQ.l.D. No. 4 (odvozená z pO34). N... koncová sekvence je ukázána jako SEQ.I·.D. No. 6.

· ! r, ' *> ,ll · * é .- · , ' · «V F ' f

7. Screeninq_knihovnv ^_rň.₍ .... .> _ř> ·.. :.j_n<.

5* Byl ..prováděn- screéning. knihovny ČDNA v lanibda zapil - (Stratagene),, která' byla 'připravena z mRNA^-izolované ž^r dužiny a < vrstvy albeda plodu’pomeranče'pomocí vhodné radioaktivně značené i sondy PCRDScreening byl prováděn podle doporučení výrobce s tím rozdílem, že.prehybridizačé a.hybridizače^bylaíprováděna v 2 x'SSC.

O,r%.SDS;:lO.'x.Denhardtúv roztok a 100 pg/ml denaturované'DNA spermatu lososa^tHybřidizáce-byla prováděna přes -noc'při-60*’C.' f!Filtry.byly dvakrát prómyty'vé2 xSSC, O,1:%^H,SDS; dvakrát v^;1 x SSC’ bQ;.1 % SDS a dvakrát v 0,1x'SSC,^! O.WSDŠ.'' *'· ^r ' ^gPsSnda T ' Λ’ώνΐν ^pT!W; p CX/ť'· ”-^u· ^Klonovaný fragment PCR byl izolován^-z vektoru pT7blue štěpením/vhodnými restrikčnímÍ^F enzymy. Fragment byl ód vektoru i/oddělen elektroforézou na agarózovém gelu a potom byl čištěii ra radioaktivně značen pomocí kitu Ready to Go™ DNA labelling kit Ď(Pharmacia).

^O/Southernova analýza í '.i' .. I .

Genomická DNA pomeranče nebo plazmidová DNA byly Štěpeny

Γή-^?4Μ H' *- Á ·< w*·- wiWltiUi Uh-* 4^ -- mUU ‘<^..4 ‘-UfcS· · vhodnými restrikčními enzymy, převedeny na membrány HybondN*™ a hybridizovány podle doporučeni výrobce (Amersham).

S i

I ··«· ·· a « 4 · 4 « ····

4* ·· 9 · * ; *«· 4 4 «44 · 4 4 4 4 444*4 44 44 ·· 44 ·*^Λ

10. Experimenty s hvbridizací in šitu

Technika hybridizace in šitu je založena na principu hybridizace kódující ribonukleové sekvence s mRNA. Technika se používá pro vizualizaci oblastí v mikroskopických řezech, ve kterých je přítomna 5 uvedená mRNA. V tomto konkrétním případě byla technika použita pro lokalizaci mRNA kódující enzym pektinmethylesterázu v řezech C. sinensis.

Příprava vzorků tkáně pro hvbridizací in šitu

Tenké řezy střední části zralého plodu pomeranče byly fixovány io fixačním roztokem FAA (45 % ethanol, 5 % formalin (40 % paraformaldehyd) a 5 % kyselina octová) s inkubací 2 hod při 25 Ό a 63 hod při 5 °C. Vzorky byly promyty 3 x 20 min v 0,05 M fosfátovém pufru pH 7, Dehydratace byla prováděna s použitím řady promývání ethanolem (50 %, 70 %, 80 % a 96 %) a potom následovala tři promytí 15 99 % ethanolem: (30 min pro každou koncentraci ethanolu). Po následném působení 2x2 hod petrolejového uhlovodíku (Shellsol™D70k, Q7712) a 2 x 2 hod v parafinu se 7 % včelího vosku byly vzorky ponořeny v parafínu. Na přístroji Supercut 2050 Reichart Jung pyramitome byly připraveny příčné řezy tloušťky 12,5 pm.

Příprava sond značených ³⁵S pro hvbridizací in šitu

Fragment PCR 501 bp z druhé amplifikace PCR byl klonován v obou směrech do vektoru pT7blue (Novagen). Vektor pT7 obsahuje promotor T7. Transkripce kódující a nekódující RNA byly řízeny promotorem SP7 po štěpení plazmidú BamHl. Pro následující 25 modifikace byl použit kit Maxiscript Kit™ (Ambion). Transkripty byly rozděleny na 6 % sekvenačním gelu pro odstranění inkorporovaného nukleotidu a eluovány elučním pufrem dodávaným s kitem T7 RNA polymerase in vitro transcription kit (Ambion). Transkripty obsahovaly . 55. nekódujících nukleotidů na jednom konci a 9 nekódujících.

Λ; .i 30. . nukleotidů na druhém konci. Pro hybriďizaci bylo použito .10? cpm/ml sondy značené ³⁵S.

4·*· ··

-49 Hybrídizace in šitu byla prováděna podle popisu Langdale J. A. (1994) v Maize Handbook-M. Freeling a V. Walbot, red., str. 265 180, Springer-Verlag, New York, lne. Teplota hybrídizace byla zjištěna jako optimální při 57 “C. Po promytí při 57 ⁰C byly řezy pokryty s fotografickou emulzí Kodak K-5 a ponechány 3 dny při 5 °C v temnu.

11. Výsledky

Pro vytváření primerů pro PCR byla použita pro dále uváděné reakce PCR a pro kontrolu aminokyselinové sekvence vytvářené jednotlivými sekvencemi nukleotidů následující informace o sekvenci io viz přiložené SEQ.I.D. No. 7-19.

Peptidové sekvence pektinmethylesterázy použité pro vytváření primerů

Asn Cys Asp Met Leu Ala Tyr Gin Asp Thr Leu Tyr (PE492B)

Val lle Thr Ser Ala Thr Glu Ala Gin Ala Phe Thr Pro Gly Ser Phe is lle Ala Gly Ser Ser Trp Leu Gly Ser Thr Gly Phe (PE701)

Aminokyselinové sekvence (PE492B.4-7) použité pro vytváření primerů A (Met Leu Ala Tyr Gin Aso Thr)

Primer A

ATG(CT)T(GATC)GC(GATC)TA(TC)CA(AG)GA(TC)AC 256 mix

Aminokyselinová sekvence (PE701.7-13) použitá pro vytváření primerů B (Glu Ala Gin Ala Phe Thr Pro)

Primer B

GT(AG)AA(GATC)GC(TC)TG(GATC)GC(TC)TC 128 mix (sekvence odpovídají komplementárnímu řetězci.

Vytváření DNA fragmentu PCR částečně kódujícího pektínmethylesterázu

Aminokyselinové sekvence dvou nepřekrývajících se peptidů (popsané výše) byly použity pro vytváření směsných oligonukleotidů.

• · · * ···«·······«· • ♦ · · · ·· » · · i

-50Tyto byly použity jako primery pro reverzní transkripci a následující amplifikaci (PCR) celkové DNA. Výsledný klon PCR byl sekvenován a obsahoval inzert 501 bp. Z nukleotidové sekvence odvozená sekvenci aminokyselin odpovídala téměř úplně peptidovým sekvencím 5 uvedeným v SEQ.I.D. No. 7 -19.

Hvbridizační analýza in šitu

Hybridizační experimenty in šitu (viz Část Materiály a metody) s ribonukleotidovými sondami (vyrobenými z příslušných klonů PCR) proti mRNA pektinmethylesterázy ukázaly silnou hybridizaci ve vnější io buněčné vrstvě lamely mezi dílky (viz obr. 1). Silné signály byly také získány z vnější buněčné vrstvy buněk obsahujících šťávu (juise sacs), vnitřní buněčné vrstvy albeda a jádra. Tyto výsledky velmi dobře odpovídají imunologickým lokalizacím, které byly provedeny protilátkou proti PME slupky jak bylo popsáno výše.

Southernova: analýza

Southernova analýza ukázala, že v genomu C. sinensis jsou přítomny další kopie izolovaných genů PME (představované klony cDNA). Tyto jiné geny PME byly spíše homologní s geny představovanými pO17 a pO34. V tomto ohledu byl pozorován 2o v každé dráze jeden pruh silného hybridizačního signálu, dva pruhy středního hybridizačního signálu a alespoň ještě dva pruhy slabého signálu ve srovnání se zbytkem. Tento obraz ukazuje, že C. sinensis má v genomu alespoň mezi 5 a 7 kopiemi genů PME.

Izolace a charakterizace nových cDNA PME

Knihovna cDNA v lambda zapil (Stratagene) připravená podle popisu v části Materiály a metody byla testována screeningem s radioaktivně značeným inzertem 501 bp z klonu PCR. Bylo identifikováno několik hybridizujících klonů a plazmidová DNA byla vyříznuta in vivo podle doporučení výrobce. Velikost inzertů cDNA v 30 klonech byla stanovena štěpením EcoRV a Smál, následovaným • · ·

-51 elektroforézou na agarózovém gelu. Jeden klon pO34 měl velikost inzertu přibližně 2 kb, zatímco další klon pO17 měl velikost inzertu přibližně 1,4 kb. Tyto klony byly vybrány pro další analýzu. Byly určeny jejich nukleotidové sekvence, které jsou ukázány jako SEQ.I.D.

No. 3, popřípadě SEQ.I.D. No, 4 pro pO17, popřípadě pO34.

Otevřený čtecí rámec v pO34 počínající nukleotidem 29 a končící nukleotidem 1780 kóduje PME o 584 aminokyselinách včetně domnělého signálního peptidu. Možné štěpící místo mezi glycinem v poloze 46 a izoleucinem v poloze 47 může být předpovězeno podle io pravidel v: von Heijne, G. (1986) Nucl. Acids Res. 14, 4683 - 4690 „A new method for predicting signál sequence cleavage sites“ a tím vznikl dlouhý maturní enzym PME o délce 538 aminokyselin s vypočtenou molekulovou hmotností 58 386 daltonů. Molekulová hmotnost dlouhého PME včetně signální sekvence byla vypočtena na 15 63 502 daltonů.. Nukleotidová sekvence pO34 obsahuje nepřekládanou'oblast'5* o délce 29 nukleotidů a nepřekládanou oblast 3‘ □ délce 186 nukleotidů, končící úsekem póly A.

Otevřený čtecí rámec v 017 začíná u nukleotidu 18 a končí nukleotidem 1103. Kóduje krátkou PME o délce 362 aminokyselin 20 včetně signálního peptidu o délce 44 aminokyselin. Domnělé štěpící místo může být předpovězeno mezi glutaminem v poloze 44 a serinem v poloze 45 a odštěpuje se zralá krátká PME začínající sekvencí aminokyselin Ser-Ser-Ser-Val-Thr-Pro. Tato N-koncová aminokyselinová sekvence je identická k N-koncové aminokyselinové 25 sekvenci získané sekvenováním čištěného krátkého typu PME, jak se popisuje v biochemické části. Sekvence aminokyselin získané z čištěného enzymu byly porovnány s odvozenou sekvencí aminokyselin zralého peptidu z pO17. U peptidových fragmentů byla nalezena úplná identita.

Téměř úplná identita byla mezi (všemi sekvenovanými peptidy a odvozenou sekvencí aminokyselin v pO17 a také s • 9 ♦ · · · · · 9 9 99 · · * * ·' ·« »V • · ··· * ·· ·«·· ·

4··· * · « ····

-52 ' · '* aminokyselinovou sekvencí odvozenou z pO34, dlouhou PMÉ. V tomto ohledu se pO17 liší v jedné poloze aminokyseliny (No 24 v sekvenci kódující maturní polypeptid). Maturní krátký protein PME má vypočtenou molekulovou hmotnost 33 954 daltonů. Vypočtená 5 molekulová hmotnost krátké PME včetně signálního peptidu je 39 088 daltonů. 017 zahrnuje 5’ nepřekládanou oblast 17 nukleotidů a 3’ nepřekládanou oblast 180 nukleotidů, končící úsekem póly A.

Hlavní rozdíl mezi dlouhým a krátkým enzymem PME je Nkoncové prodloužení o délce 220 aminokyselin přítomné v maturním io enzymu odvozené z 034 a uvedené jako SEQ.I.D. No. 5. Odpovídající nukleotidové sekvence kódující tuto oblast dlouhého enzymu PME je ukázána jako SEQ.I.D. No. 6.

Exprese PME v mikroorganismech

Sekvence DNA kódující buď dlouhou nebo krátkou formu PME 15 pomerančů’ byla: zavedena do mikroorganismů pro výrobu rekombinantního enzymu ve velkých množstvích, který má vysokou specifickou účinnost pro použití pro enzymatické štěpení pektinu.

Exprese v Pichia pastorís

Konstrukce pJK10, pJK11 a pJK12 (viz obr. 13-15)

Jako templátová DNA při reakci PCR byla použita DNA plazmidu pO34 s následujícím souborem primerú: 5’-GAATTCATTGTCGCCGGAGTGAAC-3’ s místem EcoRI na jednom konci a

5’-AAGACCAGAGACCTATGGATCCAC-3’ s místem BamHI v blízkosti 25 konce.

V následujícím pufru byla smísena AmpliTaq® DNA Polymerase (Perkin Elmer), templátová DNA, dATP, dGTP, dCTP a dTTP a dva příměry:

. . í L , 60 mM Tris-H.CI (pH 8,5), 15 mM (NH₄)₂SO₄ a 1,5 mM. MgCI₂

3o a bylo použito následujících cyklů teplot:

°C 2 min °C 1 min °C 2 min

72 °C 2 min ve 35 cyklech °C 7 min °C máčení

Byl vytvořen očekávaný produkt PCR o délce 1690 bp, který byl čištěn a subklonován do vektoru pT7Blue (Novagen) podle doporučení io výrobce.

Výsledné klony (nazvané pT7-O34) obsahující fragment EcoRI BamHI očekávané velikosti byly dále Ověřovány DNA sekvenováním (viz část Materiály a metody v molekulární biologii). Subklon pT7-O34 obsahující správnou sekvenci byl štěpen EcoRI a BamHI a fragment 15 o velikosti 1685 bp byl čištěn a subklonován do vektoru Pichia pastoris pHIL-S1 (Invitrogen) štěpeného stejnými enzymy.

Sekvence kódující maturní dlouhou formu PME byla tímto způsobem klonována v rámci se sekrečním signálem (S) PHO1 ve vektoru. Výsledný plazmid se nazývá pJK10 a je ukázán na obr. 13.

2o Pro vytvoření pJK11 (viz obr. 14) byl fragment EcoRI - BamHI klonu pT7-O34 dále subklonován do vektoru pBSK (Stratagene) štěpeného stejnými enzymy. Potom byl subklonován fragment EcoRI Noh z jednoho z výsledných klonů (ověřeného sekvenováním DNA) do expresního vektoru pPIC9 Pichia pastoris (Invitrogen) štěpeného 25 stejnými enzymy. Tím byl umístěn čtecí rámec kódující maturní protein dlouhé formy PME po směru translace a ve správném čtecím rámci se sekrečním signálem (S) alfa-faktor v pPIC9, viz obr. 14.

* Naúíc byl fragment EcoRÍ-A/ofl ž pT7-O34 také subklonován do vektoru pPIC9K (Invitrogen) za vytvoření plazmidu pJK12 ukázaného

X

-54na obr. 15. Jediným rozdílem mezi pJK11 a pJK12 je gen kódující .yflH rezistenci na kanamycin, který je umístěn v pJK12.

Jak sekreční signál PH01 v pJK10, tak i sekreční signál alfavl pJK11 a pJK12 může řídit sekreci maturního polypeptidu kódujícího! ‘v dlouhou formu PME.

Konstrukce pJK20, pJK21 a pJK22

Jako templátová DNA při reakci PCR byla použita plazmidová DNA pO17 s následujícími primery: 5’-GAATTCTCCTCGTCGGTGACACCG-3’ s místem EcoRI na jednom konci a 5’-AAGACCAGAGACCTATGGATCCAC-3’ s místem BamHI v blízkosti konce.

V následujícím pufru byla smísena AmpliTaq® DNA Polymerase (Perkin Elmer), templátová DNA, dATP, dGTP, dCTP a dTTP: 60 mM

Tris-HCI (pH 8,5), 15: mM;, (NH₄)2SO₄ a 1,5 mM MgCI₂, směs byla vložena do termálního bloku a bylo použito následujících cyklů teplot:

	94 °C 2 min
20	94 °C 1 min 55 °C 2 min

°C 2 min ve 35 cyklech ^eC 7 min ’C máčení

Byl vytvořen očekávaný pruh PCR o délce 1008 bp, který byl . čištěn a subklonován do vektoru pT7Blue (Novagen). Výsledné klony byly ověřeny sekvenováním DNA jak bylo vysvětleno výše. Plazmid se správnou sekvencí byl štěpen EcoRI a SamHI a výsledný fragment byl r dále subklonován do vektoru pHIL-S1 (lnvitrogen) a výsledný’plazmid : :>. . .;·; ,;J byl..nazván pJK20 (ukázaný na obr. 16),; ve .kterémJe oblast kódující .

···« ♦· • 4 4 · · · maturní polypeptid krátké formy PME umístěna ve správném čtecím rámci a po směru translace vzhledem k sekrečnímu signálu PH01.

Plazmidy pJK21 a pJK22 byly konstruovány stejným způsobem jak bylo vysvětleno pro pJK11 a pJK12 s tím rozdílem, že fragment s EcoRI-A/ofl byl získán z klonu pBSK-017. Obr. 17 a 18 ukazují výsledné plazmidy, kde oblast kódující maturní polypeptid je umístěna po směru translace a ve správném čtecím rámci vzhledem k sekrečnímu signálu alfa v pPIC9, popřípadě pPIC9K.

Zavedení dlouhé nebo krátké formy PME do Pichia pastorís ·> io vytvořením sféroplastů a transformací

Plazmidy pJK10, pJK11, pJK12, pJK20, pJK21 a pJK22 byly zavedeny v oddělených experimentech do buněk Pichia pastorís GS115.

V tomto ohledu byly sféroplasty připraveny z buněk GSH5 15 rostoucích v médiuikvasničný extrakt - pepton - dextróza (YPD) při 28 - 30 ^eC.

Příprava sféroplastů a transformační postup byly prováděny podle návodu v expresním kitu P/ch/a (Instruction Manual Invitrogen). Výsledné transformanty Muf nebo Mut⁵ Pichia pastorís potom byly 20 analyzovány na expresi rekombinantního genu PME testováním supernatantu na aktivitu PME s použitím metod popsaných v části Materiály a metody pro biochemii.

Screeninq transformantů na vysokou expresi dlouhé nebo krátké formy PME ⁴ ' 25 Předpokládané pozitivní transformanty byly dále pěstovány v minimálním médiu (buď Minimal Dextrose Medium nebo Minimal Glyčerol Medium jak je uvedeno v návodu k expresnímu kitu Pichia, Invitrogen), a byla izolována genomová DNA a analyzována PCR ; : podle popisu v návodu. . ·;· · φφφφ φφ ·φ Φ·ΦΦ ·« φφ ··.· φ · · ♦ · φ φ • · · ι t V Φ, φ φφφ • · Φ · φ φ ί» Φφφ « φ

-56- *♦.*·..·' ·.♦’·,.*

Pozitivní klony nalezené při počátečním screeningu, které také produkovaly pruh PCR očekávané velikosti, byly selektovány a dále rostly v baňce při 28 - 30 °C podle postupu popisovaného v návodu Pichia.

Byl proveden screening alespoň 10 ověřených rekombinantních klonů každého konstruktu (pJK10, pJK11, pJK12, pJK20, pJK21 a pJK22) na sekreci PME a relativní míra exprese byla měřena v průběhu času odebíráním vzorků každé 2 až 6 hodin. Buňky ve vzorcích byly zcentrifugovány a supernatant testován na aktivitu PME io metodou popsanou v části Materiály a metody pro Biochemii.

Byla provedena předběžná selekce klonů získaných po transformaci buď s pJK12 nebo pJK22 s použitím integrovaného genu rezistence na kanamycin jako selektorového genu, jak se popisuje v Scorer C. A. a další (1994) Bio/Technology díl 12, str. 181 - 184 a

Laroche Y. a další (1994) Bio/Technology díl 12, str. 1119 - 11'24. Tímto způsobem, byiy získány. integrační transformanty s více kopiemi a byl prováděn jejich další screening jak bylo popsáno výše.

Transformanty představující buď dlouhou nebo krátkou formu PME, u kterých bylo zjištěno, že ve vysoké míře exprimují

2o rekombinantní protein, byly selektovány a dále analyzovány analýzou westernovým blotem (viz Materiály a metody pro biochemii).

Purifikace a charakterizace rekombinantní PME

Rekombinantní protein PME byl čištěn z supernatantů kultur s. použitím postupů popsaných v části Materiály a metody pro biochemii podle potřeby.

Předpokládaná vysoká teplotní stabilita dlouhé formy PME byla .,..:1.-,.- . j i u ověřena testováním aktivity enzymu po inkubací při různých teplotách, ; v ¹ jak bylo vysvětleno v části Charakterizace a kinetická data. Čištěné ., rekombinantní enzymy (dlouhá i krátká forma PME) byly dále íú ,; i i:-.30. charakterizovány jak je vysvětleno v části Charakterizace a kinetická: i, ··* ·4 , 57 - *<·* ‘μ’ *99* data. Tyto analýzy ukázaly, že oba typy měly optimum pH v okolí 7 - 8 a teplotní stabilita krátké rekombinantní PME byla zjištěna mezi 10 a 40 °C, v případě dlouhé rekombinantní PME až do 80 °C.

Exprese v Aspergillus niger

V dalším provedení byl plazmid pO34 nebo pO17 štěpen vhodnými restrikčními enzymy a sekvence kódující dlouhou nebo krátkou formu PME podle předkládaného vynálezu byla klonována do expresního vektoru pBAMTEI Aspergillus (obsahujícího promotor methyltryptofanové rezistence z Neurospora crassa) pro expresi v io Aspergillus niger (Pall a další (1993) Fungal Genet. Newslett. díl 40, str. 59 - 62).

Protoplasty byly připraveny metodou Daboussi a další (Curr. Genet (1989) díl 15, str. 453 - 456) s použitím lyzačních enzymů Sigma L-2773 a lytikázy Sigma L-8012. Transformace protoplastů 15 probíhala podle protokolu uvedeného v Buxton a další (Gene (1985) díl 37, str. 207 - 214) s tím rozdílem, že vysévání (plating) transformovaných protoplastů probíhalo podle protokolu uvedeného v Punt a další (Methods in Enzymology (1992) díl 216, str. 447 - 457) s použitím 0,6 % osmoticky stabilizované top agarózy.

Výsledky ukázaly, že z kultur Aspergillus niger bylo možno získat aktivitu čištěné PME pomerančů.

Použiti

Vliv pektinu upraveného PME pomerančů na viskozitu a stabilitu proteinových nápojů

Metody

Enzymatické štěpeni pektinu PME odvozenou z pomerančů

Následujícím způsobem byla- připravena šarže enzymaticky štěpeného pektinu:

125 g pektinu bylo za důkladného míchání rozpuštěno v horké vodě. Bylo přidáno 45,3 g NaCI (reagenční čistota) a objem byl nastaven vodou na 4,0 I. Roztok byl míchán, dokud se sůl nerozpustila. Roztok pektinu byl ochlazen na 40 °C a pH bylo zvýšeno· 5 1 N NáOH (reagenční Čistota) na 7,0 za důkladného míchání. Byl přidán vhodný vzorek PME pomerančů a enzymatická reakce pokračovala až do dosažení požadovaného stupně esterifikace. pH bylo udržováno na konstantní hodnotě 7 automatickým dávkováním 1 N NaOH (reagenční čistota) v průběhu inkubace a enzymatická io reakce byla sledována pomocí spotřeby NaOH.

Když dosáhl vzorek pektinu požadovaného stupně deesterifikace, přidávání NaOH bylo zastaveno, pH roztoku sníženo přídavkem 2 % HCI na přibližně 3,0. Roztok pektinu byl potom zahřát na 5 min na teplotu 70 °C pro úplnou inaktivaci enzymu. Upravený 15 pektin byl srážen jedním objemem izopropylalkoholu, promyt 60· % izopropylalkoholem a.vylisován na přibližně 50 % sušiny. Enzymaticky ošetřený pektin byl potom sušen na vzduchu při 40 °C a nakonec rozemlet na suchý prášek.

Protokol

2o Stanovení indexu citlivosti na vápník (CF) u vzorků pektinu

Citlivost na vápník se měří jako viskozita pektinu rozpuštěného v roztoku s 57,6 mg vápníku/gram pektinu dělená viskozitou stejného množství pektinu v roztoku, ale bez přídavku vápníku. Pektin, který není citlivý na vápník má hodnotu CF1.

4,2 g vzorku pektinu se rozpustí za důkladného míchání v

550 ml. horké vody. Roztok se ochladí na přibližně 20 °C a- pH se nastaví 1 N HCI na 1,5. Objem roztoku pektinu se doplní vodou na 700 ml a míchá. 145 g tohoto roztoku se jednotlivě měří ve 4 zkumavkách pro měření viskozity. Do 2 zkumavek se přidá 10 ml vody . n. .. ( ?; sů ·., (dvojité stanovení) a do dalších 2 zkumavek se za míchání přidá 10 ml? 250 mM roztoku CaCI₂.

ItM 9· ··<· ·· ·· • · · *· · a · a a ml acetátového pufru (0,5 M, pH přibližně 4,6) se přidá do všech čtyř zkumavek pro měření viskozity za důkladného magnetického míchání a tím se pH roztoku pektinu zvýší nad hodnotu 4,0. Magnety se odstraní a zkumavky se ponechají přes noc při 20 °C.

, s Viskozity se měří další den Brookfieldovým viskozimetrem. Index citlivosti na vápník se vypočte následujícím způsobem:

Viskozita roztoku s 57,6 mg Ca^z+/g pektinu

CF = ---------------------------------io Viskozita roztoku s 0,0 mg Ca²⁺/g pektinu •Ϊ

Stanovení stupně esterifikace (% DE) vzorků pektinu

K 50 ml 60 % izopropylalkoholu a 5 % roztoku HCI se přidá 2,5 g vzorku pektinu a míchá se 10 min. Roztok pektinu se zfiltruje 15 skleněným filtrem a šestkrát promyje 15 ml roztoku 60> % izopropylalkohol/5.% HCI, a potom se dále promývá roztokem 60 % izopropylalkoholu; dokud, není filtrát prostý chloridů. Filtrát se suší přes noc při 80 °C.

V kuželové baňce se smísí 20,0 ml 0,5 N NaOH a 20,0 ml 0;5 N 20 HCI a přidají se 2 kapky fenolftaleinu. Směs se titruje 0,1 N NaOH, dokud se nezíská trvalá změna barvy. 0,5 N HCI by měla být mírně silnější než 0,5 N NaOH. Přidaný objem 0,1 N NaOH se zaznamená jako V_o.

0,5 g vzorku sušeného pektinu (filtrát) se odměří do kuželové 25 baňky a vzorek se navlhčí 96 % ethanolem. Přidá se 100 ml čerstvě . převařené a ochlazené destilované vody a výsledný roztok se míchá do úplného rozpuštění pektinu. Potom se přidá 5 kapek fenolftaleinu a roztok-se· titruje 0,1 N NaOH¹ (dokud nenastane změna barvy a pH je 8,5). Množství 0,1 N NaOH, které se zde použije, se zaznamená jako

3o Vj. 20,0 ml 0,5 N NaOH se přidá do baňky, baňka se důkladně ⁷ protřepé a ponechá se stát ..15 min. Přidá sě.:20,0 ml 0,5 NHCla .¹; τ':; -baňkaise třepe, dokud nezmizí růžová barva. Potom.se přidají 3 kapky:

···· ·· *·

9· •· • *

fenolftaleinu a výsledný roztok se titruje 0,1 N NaOH. Použitý objem ů 0,1 N NaOH se zaznamená jako V₂.

Stupeň esterifikace (% DE: % celkových karboxyiových skupin) se vypočte podle následujícího vzorce:

V₂-V₀ % DE = ---------Vj + (V₂ - V_o)

Výroba jogurtu

Standardizované odstředěné mléko (připravené smísením práškového mléka s odpovídajícím množstvím vody) bylo 5 min zahříváno na 90 °C a potom homogenizováno při tlaku 20 MPa a ochlazeno na 31 °C. Byla přidána jogurtová kultura a mléko bylo fermentováno do pH přibližně 4,0. Jogurt byl ochlazen na přibližně ; írl 20 ’C a byl přidán vzorek pektinu jako nasycený roztok v cukru . .X (přibližně 65 % cukru) a míchán 15 min. pH bylo kyselinou mléčnou nastaveno na 4,0. Jogurt byl 15 s pasterizován při 88 °C a homogenizován při 15 MPa, potom ochlazen na 20 °C a plněn do sterilních 250 ml lahvičék s modrým víčkem (200 ml/láhev).

Složení konečného produktu bylo: 7,6 % MSNF (obsah mléčné sušiny), 9,15 % cukru a 0,25 % nebo 0,35 % vzorku pektinu při dosažení celkového obsahu sušiny 17,0, popřípadě 17,10 %.

Stanovení viskozity jogurtového nápoje

Viskozita vzorku jogurtu byla stanovena (dvojí stanovení) s použitím buď přístroje Bohlin Rheometer™ (dodávaného firmou Bohlin Instruments) se smykovou rychlostí 18,5 - 46,0 nebo s použitím přístroje StressTech™ (Rheologica Instruments AB) se *·«· 4Φ ·« «· ««

Φ * · · « · * Φ · · ♦ Φ 4 Φ 4 φ φφ • 4 444 4 Φ · · 4 Φ φ 4

-61- *..*’.·* *..**..* *♦*.«*

Stabilita proteinu měřená v testu centrifugace stejnými smykovými rychlostmi.

g vzorku (například jogurtového nápoje) se centrifuguje při 10 °C, 2300 x g po dobu 20 min. Supernatant se odlije a centrifugační s kyveta' obrátí dnem vzhůru na dobu 30 min. Kyveta se zváží a procenta sedimentace se vypočtou následujícím způsobem:

Hmot, kyvety po centrifugaci - hmot, kyvety % sedimentace -----------------------------------------x 100

Hmot, vzorku

Stabilita proteinu posuzovaná jako distribuce velikosti částic ve vzorku

Distribuce velikosti částic vzorku jogurtu byla určena použitím přístroje Malvern 2600 Easy™ sizer. Velikost částic se stanoví v této metodě rozptylem světla. Jeden ml vzorku jogurtu byl přidán k 9 ml 15 odvzdušněného roztoku pufru (30,7 % 0,1 M kyselina citrónová, 19,3 % 0,2 M Na₂HPO₄ a 50,0 % vody) a rozmíchán. Ódvzdušněný pufr se přidá do měřicí zkumavky a směs vzorek/pufr se přidává po kapkách do dosažení optimální koncentrace. Změřením se vypočte průměrná velikost částic.

Jogurt s průměrnou velikostí částic nižší než přibližně 3 pm. se pokládá za spíše stabilní zatímco jogurt s průměrnou velikostí částic vyšší než přibližně 10 pm se pokládá za nestabilní pro dlouhodobé skladování.

Určení dlouhodobé stability

Vzorky byly skladovány při 4 °C nebo pokojové teplotě a bylo měřeno oddělování syrovátky (v mm syrovátky v horní Části vzorku v láhvi). Vzorek byl naplněn do 250 ml lahví s modrým uzávěrem (dvojnásobné určení). Hloubka vzorku v každém případě, byla přibližně , ' . *· · '1 mm - což odpovídalo značce 200 ml na láhvi.

n ... J «· ···*

-62** bb • · · B B · • · * B BB

B B B BB B B · • B B B B ♦ .

Příklad 1

Nápoj z kyselého mléka

Účel přidávání pektinu do nápoje z kyselého mléka (například jogurtového nápoje) je vyrobit nápoj, který v průběhu bakteriologické a organoleptické skladovatelnosti zůstává fyzikálně homogenní. Navíc ošetření jogurtového nápoje pro dlouhodobé skladování destabilizuje protein v nápoji a tak vzniká v nepřítomnosti pektinu nápoj s pískovitým pocitem v ústech, který vykazuje poměrně rychlou synerézi. Štěpení pektinu

Jako matečný pektin byl zvolen komerčně dostupný vysoce esterifikovaný pektin; Grindsted™Pectin URS (pektin typu Ultra Rapid Set) pro svůj vysoký podíl esterifikace (procenta DE = 82, viz obr. 19). Působení enzymu PME pomerančů na tento matečný pektin je vysvětleno v části Metody.

Enzymatická reakce byla zastavena a výsledný experimentální pektin (nazvaný pektin No 1944-96-2) byl testován na stupeň esterifikace způsobem popsaným v části Metody. Navíc byl do těchto experimentů pro srovnání dvou typů pektinu, matečného pektinu a upraveného pektinu, s dobře známým pektinem pro jogurtové nápoje, zahrnut pektin Grindsted™Pectin AM453.

Relativní citlivost na vápník tří zvolených pektinů byla stanovena jak bylo vysvětleno v části Metody: Stanovení indexu citlivosti vzorků pektinu na vápník (CF) a výsledky jsou ukázány v následující tabulce.

Typ pektinu	Δ CF	DE %
Grindsted™Pectin URS	1,1	82
Pectin 1944-96-2	1.4	76
Grihdsted™Pectin AM453	>20:	72 :

Ά ..ZL . ν '- φ t· r. ;·ί . , .Λ

-63Deesterifikace matečného pektinu Grindsted™Pectin URS z 82 % DE na 76 % DE neposkytla téměř žádnou změnu v citlivosti na vápník pro tyto dva pektiny (Δ CF 1 znamená žádná citlivost). Pektin s měřitelnou citlivostí na vápník by mohl být produkován dalším působením enzymem PME pomerančů na matečný pektin až na 70 % DE, protože tento pektin měl Δ CF 14.

Výsledky analýzy ioqurtu/ioqurtovvch nápojů

Jogurt byl vyroben jak bylo popsáno v části Metody. Tri druhy io pektinu (Grindsted™Pectin URS, Pectin 1944-96-2 a Grindsted™Pectin AM453) byly použity jednotlivě podle následujících předpisů:

7,6 % MSNF (obsah sušiny mléka), 9,15 % cukru a 0,25 % nebo

0,35 % vzorku pektinu poskytne celkový obsah sušiny v konečném produktu 17,0, popřípadě 17,10 %.

Kvalita jednotlivých vyrobených jogurtů byla testována jejich procenty sedimentace v testu centrifugace, měřením velikosti Částic s jogurtu, měřením viskozity a sledováním možného oddělování s syrovátky v průběhu dlouhodobého skladování, jak se popisuje v části metody.

Sedimentace vyrobených jogurtů se třemi typy pektinu se uvádí v následující tabulce.

Sediment (v %) v jogurtu

Typ pektinu	Koncentrace 0,25 %	Koncentrace 0,35 %
Grindsted™Pectin URS	29,40	21,02
Pectin 1944-96-2	1,53	2,95
Grindsted™Pectin AM453	2,20 . ;	. 1;85 .

•a·· ·· ··♦·

·· • *· • ·· ·» aa aa • · ♦ · a a· • · « a aaa • · · a ··· aa • · · a a aa a? »« aa at

Výsledky jsou průměrem ze Čtyř jednotlivých výrob..

Je jasné, že matečný pektin (typ URS) má vysoké procento sedimentace a vyprodukovaný jogurt tedy odděluje syrovátku a byl nestabilní jak při použitých koncentracích pektinu 0,25, tak i 0,35 %.

To není překvapující, protože normálně se pektin typu URS nedá používat pro stabilizaci teplem ošetřených typů jogurtů pro dlouhodobé skladování.

Jogurt vyrobený s použitím přípravku Pectin 1944-96-2 byl stabilní při obou dávkách pektinu a mel nízkou sedimentaci jak je vidět io z výše uvedených výsledků a po 75 dnech skladování u něj nenastalo oddělení syrovátky. Ve srovnání vynikající přípravek Grindsted™Pectin AM453 normálně používaný při výrobě jogurtů měl také nízkou sedimentaci jak bylo očekáváno a vytvářel stabilní jogurty, u kterých nedocházelo k oddělování syrovátky (viz výsledky výše).

Působením PME pomerančů na matečný pektin URS byl vyroben z nevhodného pektinu pektin vhodný jako stabilizační činidlo do jogurtu a tento upravený pektin se choval stejně dobře jako vynikající komerční stabilizátor.

Dále byly prováděny testy vyrobených jogurtů určením velikosti 20 částic (viz část Metody), jejichž výsledky jsou ukázány v následující tabulce.

Velikost částic (um) jogurtu

Typ pektinu	Koncentrace 0,25 %	Koncentrace 0,35 %
Grindsted™Pectin URS	9,32	6,41
Pectin 1944-96-2	1,33	1,55
Grindsted™Pectin AM453	1,40	1,53

Průměrná velikost částic (je uvedeno číslo odpovídající frakci

D(4.3) s·použitím přístroje Malvern) vyrobeného jogurtu s matečným

-65 ·· «Η»

4*44 «4* · · ··«* * 4 · 4 4 44*44

4 444 4 4· 444« * · 4 4 4*44444 pektinem URS je podle očekávání vysoká. Výsledky jsou opět průměrem ze čtyř výrob.

Průměrná velikost částic jogurtu vyrobeného jak z pektinu 194496-2, tak i pektinu Grindsted™Pectin AM453 je malá u obou použitých 5 dávek pektinu (viz výsledky výše). Opět se ukazuje, že jogurt vyrobený s těmito typy pektinu je vhodný pro výrobu stabilních jogurtů.

Nakonec byla měřena viskozita, což je velmi důležitý faktor v případě výroby jogurtových nápojů pro dlouhodobé skladování, jejíž výsledky jsou uvedeny v následující tabulce.

io Viskozita (v mPas) jogurtu

Koncentrace/Typ pektinu	Koncentrace 0,25 %	Koncentrace 0,35 %
Grindsted™Pectin URS	55	40
Pectin 1944-96-2	12	18
Grindsted™Pectin AM453	24	43

Protože matečný pektin URS nemohl jogurt stabilizovat, získaná viskozita je podle očekávání pro obě koncentrace pektinu poměrně vysoká. Vynikající přípravek Grindsted™Pectin AM453, který vytvářel stabilní jogurty s nízkou sedimentací a malou velikostí Částic měl 15 viskozitu přibližně poloviční než viskozita s pektinem Grindsted™Pectin URS při dávce 0,25 % pektinu a přibližně stejnou jako pektin URS v dávce 0,35 % pektinu bez ohledu na skutečnost, že pouze pektin AM453 vytvářel stabilní jogurt.

Jak v případě URS tak i AM453 zjištěná vyšší viskozita by mohla 20 být částečně přičítána množství přidaného pektinu, jak je tomu patrně zvláště u pektinu AM453, protože zvětšení množství přidaného pektinu .'(z 0,25 na 0,35 %) poskytlo jogurt s téměř dvojnásobnou viskozitou.

Viskozita získaná s pektinem 1944-96-2 štěpeného PME f pomerančů ukazuje dramatický pokles- viskozity ye srovnání 25 ? s matečným pektinem URS při koncentraci 0,25 %. To je částečně

-66 t« ···♦ • *to to toto to ♦ * to · «« ♦ · »· ♦ < ·· ♦ toto « to · toto ···· ♦ • * to to* ·· způsobeno stabilizací jogurtu pektinem 1944-96-2, ale není to jediný důvod, protože jogurt AM453 má při této dávce pektinu dvojnásobnou viskozitu. Přídavek 0,35 % pektinu 1944-96-2 do jogurtu pouze zvýší viskozitu o 6 jednotek (ve srovnání s dávkou 0,25 %), zatímco 5 viskozita vzrůstá v případě AM453 se zvětšením koncentrace z 0,25 % na 0,35 % o 19 jednotek.

Pektin 1944-96-2 štěpený PME pomerančů může stabilizovat jogurt s vejmi nízkou viskozitou bez ohledu na použitou dávku pektinu (0,25 % nebo 0,35 %), které poskytují téměř dvojnásobnou viskozitu io při použití jiných neštěpených pektinu, například Grindsted™Pectin AM453.

To je nový a velmi důležitý posun při výrobě nápojů z kyselého mléka.

Štěpení pektinu Grinsted™Pectin URS PME pomerančů se 15 vytvoří nový typ pektinu, který oproti matečnému pektinu může stabilizovat jogurt a, což je nejdůležitější, vykazuje mnohem nižší viskozitu, než normálně používané pektiny. Štěpením PME pomerančů mohou být také zlepšeny jiné vysoce esterifikované pektiny.

Příklad 2

Nápoj typu syrovátkový džus

Modifikovaný pektin podle předkládaného vynálezu (jak byl připraven výše) byl následujícím způsobem použit při přípravě nápoje typu syrovátkového džusu:

-67•aiv ·· • ·· • ·4

44

4 44 • 44«

4· ···· ♦ 44

44 • · 44 • 4 «4

4444

4»4* • 4 44

444 • 4.44 4 * ¹ 4 44 tfc4«

Sladká nebo kyselá syrovátka	42,00 %
Ovocný džus	40,00 %
Cukr	8,00 %
Citrát sodný	0,20 %
Pektin modifikovaný PME	0,20 %
Příchuť Grindsted	+
Voda	9,6%

Suchý pektin modifikovaná PME, citrát sodný a cukr byly smíseny a potom rozpuštěny ve vodě při 80 °C. Tento roztok pektinu byl ochlazen na teplotu nižší než 5 °C a při teplotě 5 °C> byla přidána;.

s syrovátka. Pomalu byla přidána příchuť Grindsted Flavouring’ (dodávaná firmou Danisco Ingredients. Danisco A/S) a džus a pHť směsi bylo nastaveno kyselinou citrónovou nebo kyselinou mléčnou na 4,0. Směs byla ponechána zrát za míchání po dobu, přibližně 30< minut. Byla provedena pasterizace při 80 °C/15 s a homogenizace při?;.

io 20 MPa. Vzorky byly ochlazeny na 20 °C a asepticky plněny do nádob.

Vzorky byly analyzovány po 24 hodinách v jednom měsíci a šesti měsících inkubace při pokojové teplotě. Analýzy zahrnovaly měření viskozity, index stability velikostí částic a dlouhodobou stabilitu, jejichž protokoly se popisují výše.

Výsledky ukázaly zlepšenou stabilitu a dlouhodobou stabilitu u nápoje typu syrovátkový džus s pektinem modifikovaným PME ve ..srovnání s referenčním pektinem použitým v kontrolních testech: . Navíc měl nápoj typu syrovátkového džusu přijatelnou viskozitu, která byla nižší než u kontrolních nápoj.

Nápoj typu syrovátkového džusu byl rovněž zpracován ^k ΐλγ m _r ^: í s liňíétovým á citrónovým pektinem·, které bylý modifikovaný, rostlinnou υλ.' - .

« ♦ v ’ C '	• c r · e	• c r C *' C	<t rl 4 < c-y.	1* < e · c	4 c c ’ e
J c	<· H		<1 ' ’ 1	č 1 «.·	.mc
<	< 11		,J c* c	r»oC*	C c
< f'	f i.'·	* <; . * ¢4	c t-	C	r; · I;
• r	*	· ¢.	' * c	I»c	< « c:

'íPMEl- tj. PMEt podle předkládaříého(^řvynáležu. Výsledky ukazují, že pektin <modifikovaný PMĚ Iposkytl fzlepšenůu*stabilitu ^proteinu, ve 'srovnání s.nemodifikovanýmipektinem a také ve srovnání s pektinem ; referenčním.^^ · hýt . tevj · .«íýi;. .

‘Příkladě^nůM

Nápoj typu mléko/ovocný džus

Pj ., . ’ —•^Pektin Grindsted™URS (firma Danisco Ingredients, Danisco .^rA/S),i. byl v modifikován PME jak bylo popsáno pro jogurtový nápoj, ip Modifikovaný,pektin byl použit.v .nápoji typu, mléko/ovocný džus,*který V «·!»·; ».♦·* ’ -l»V '.»», O ·<; ;«-··. * i · J*.

rczhků' p3;'i^;j bylo ίο 4(. pr-.ur-f Γ'0/ί . .4

Odstředěné· mléko1** ^7' n	n .·, ^ 45{qQ %í/ tlSU· ťUAV
Lkoriciv^dcl» 0;? · 0,^ *X3yly tmh	Ví-*^ťfi puf	r í víz.
Ovocný džus	40,00 %
-a -rcMUčhM lyrtwátky- (vte níi«) a <	i '.η jiti . ύ .( <hu	. .-’O
	5,00 % • « ’ i i < C >
Pektin modifikovaný,PME -	0,25 %
Příchuť Grindsted, - . * p-Jwvý JenriM-uv puu	?p. -+ -.z···	«· V» ·
Voda,, Přepon ř a ?	t Sí?A9,75 % <- - v-	**

ΠΜ u/tTPiW*'· *'*Š£iOři ^!·, .

Pektin modifikovaný PME a cukr byly smiseny a potom v 153-1«/ .

rozpusteriy ve vodě pri 80 °C. Roztok pektinu byl ochlazen pod 5 ’C a při 5 “C bylo přidáno mléko. Pomalu byly přidány příchuť Grindsted 15 a džus a pH směli bylo^r nastaveno (v případě potřeby) kyselinou citrónovou nebo mléčnou na pH 4,0. Vzorky směsi byly ponechány zrát, byly pasterizovány a homogenizovány jak bylo popsáno pro nápoj typu syrovátkový džus. Vzorky byly ochlazeny na 20 °C a asepticky naplněny do nádob.

«•«I.·. ;.

Výsledky ukázaly zlepšenou stabilitu - včetně dlouhodobé ^:í stability - u nápojů typu mléko/ovocný džus zpracovaných pektinem i * n '’ i : : modifikovaným PME vé srovnání :s referenčním pektinem, použitým »··· ·· ·· ··♦· * + «·

9 9 9 9 « · · « · ·*·«·*«·····* Crt · . · · . · · ·· · ♦· ·

- QO - a· ♦· «· i· · 9· v kontrolních testech. Navíc měl nápoj typu mléko/ovocný džus přijatelnou viskozitu, která byla nižší než u kontrolních nápojů. Byla také pozorována zlepšená funkčnost

Nápoj typu mléko/ovocný džus může být také zpracován slimetovým a citrónovým pektinem modifikovaným PME podle předkládaného vynálezu.

Příklad 4

Stabilita syrovátky io Enzymaticky modifikované pektiny byly testovány při pH 4,0. pH výsledných roztoků pektinu bylo nastaveno na 4,0 pomocí KOH/HCI. Koncentrace pektinu byla nastavena na 1,0 %. Pektiny byly testovány v koncentracích 0,1 - 0,25 %. Byly smíseny pektin, Jennessův pufr (viz níže) a roztok syrovátky (viz níže) a zahřátý na 96 °C 25 minut. Po ochlazení na pokojovou teplotu se měří absorbance při 500 nm.

Suchá směs Jennessova pufru

Suchý práškový Jennessův pufr (popsaný v Jenness, R. a Koops, J. Preparation and Properties ofa salt soiution which simulates milk uitrafiltrate, Nederlands Melk-en Zuiveldijdschrift, díl 16, č. 3, str.

153 - 164, 1962):
15,80 g	KH2PO4
5,08 g	K3 citrát
17,91 g	Na3 citrát . 2 H2O
1.80 g	K2SO4
13.20 g	CaCI2 . 2 H20
5,02 g	Mg3 citrát . H2O
3,00 g	K2CO3
' 10,78 g	KCI

• · · ·

-70Roztok puf ru:

Vodný roztok 7,5900 g/l suchého práškového pufru Jenness s pH 4,0.

Roztok syrovátky:

Koncentrát syrovátkového proteinu se lyofilizuje a práškuje.

Roztok 0,40 % hmotnostních syrovátkového proteinu se připraví v Jennessově pufru při pH 4,0.

Roztoky pektinu:

Připraví se vodné roztoky pektinů 1 % hmotnostní s pH 4,0.

io Koncentrace směsi:

Pektin, Jennessův pufr a roztok syrovátky se smísí jak je uvedeno v tabulce níže. Směsi se zahřívají 25 minut při 96 °C a po ochlazení na pokojovou teplotu se vzorky měří na spektrofotometru při 500 nm.

Roztok pektinu Ml	Jennessův pufr μι	Roztok syrovátky μΙ	Celkový objem μΙ
500	2000	2500	5000
750	1750	2500	5000
1000	1500	2500	5000
1250	1250	2500	5000

Výsledky

Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce. Uvedená ábsorbance při 500 nm je střední hodnota ze dvou měření. Pro porovnání mezi různými typy pektinu a enzymaticky modifikovanými 2o pektiny podle předkládaného vynálezu je index pro nemodifikovaný

-71 pektin Grindsted™Pectin 3450 (firmy Danisco íngredients, Danisco A/S) položen roven 100.

Index > 100 označuje horší stabilitu proteinu než při použití vzorku 3450. Index 10é označuje podobnou stabilitu jako vzorek 3450. s Index < 100 označuje lepší stabilitu proteinu než při použití vzorku 3450. Index 95 nebo < 95 označuje velmi dobrou stabilitu proteinu.

Typ pektinu	Pektin 0,10%	Pektin 0,15%	Pektin 0,20%	Pektin 0,25%
Grindsted™ Pectin 3450	100	100	100	100
Grindsted™ Pectin URS	127	140	155	161
5 min. enz.	100	108	115	113
10 min. enz	98	106	111	111
15 min. enz.	92	94	100	100
20 min. enz.	90	95	100	99

Jak je vidět z výsledků, má Grindsted™Pectin URS modifikovaný podle předkládaného vynálezu výhodné vlastnosti a v některých případech velmi dobré vlastnosti při porovnání io s referenčním pektinem Grindsted™Pectin 3450 a nemodifikovaným pektinem Grindsted™Pectin URS.

Příklad 5

Nápoj Laban s dlouhou skladovatelností a nízkým pH i i5 Nápoj Laban je okyselený mléčný nápoj s hodnotou pH nižší než

4,2. Nápoje Laban sestávají ze základu Laban smíšeného s roztokem pektinu. Složení základu Laban je následující:

»|·· ♦ · • 4 · ·

-7210 '20;.

'20;.

Bezvodý mléčný tuk

Práškové odstředěné mléko

Příchuť Grindsted

Voda

2,8 %

10,0 %

87,2 %

Standardizované úplné mléko (bezvodý mléčný tuk a práškové odstředěné mléko) se homogenizuje při 75 - 80 °C a tlaku 20 MPa a pasteruje 5 -10 minut při 90 - 95 °C. Po kultivaci na pH přibližně 4,0 se nastaví pH kyselinou citrónovou nebo mléčnou na 3,8 - 4,2. Potom se přidá roztok pektinu. Směs se potom míchá až do dosažení homogenní směsi. Potom se 10 - 15 s pasterizuje při 90 - 95 ’C a dále homogenizuje při 15 - 20 MPa. Po ochlazení na 20 - 25 °C se produkt asepticky plní do nádob.

Po několika dnech vykazuje nestabilizovaný nápoj Laban synerézi.

Po přídavku enzymaticky modifikovaného pektinu podle předkládaného vynálezu však syneréze nenastává a zlepší se viskozita.

Navíc měl produkt vyjádřenou jogurtovou chuť a dlouhou skladovatelnost.

Příklad 6

Pomerančový džus (obohaceny proteinem)

Pomerančový džus je okyselený nápoj (pH přibližně 4) obsahující 2 %.přípravku DANPRQLACT 40™ (Centrál Soya, Aarhus A/S), 6 % cukru, 10 % pomerančového koncentrátu, 0,4 % citrónového koncentrátu, 0,2 % pektinu a.81,4 % vody. Produktem je pomerančový idžus. obohacený sojovým proteinem. Výrobek se / pasterizuje a homogenizuje. Pó ochlazení na 20 - 25 *C se produkt asepticky plní do nádob a při pokojové teplotě může být skladován přibližně 6 měsíců. Přídavek enzymaticky modifikovaných pektinů podle předkládaného vynálezu do pomerančového nápoje obohaceného proteinem ukázal výhodné vlastnosti, jako je dlouhodobá stabilita, 5 a poskytl dobrý pocit v ústech.

Příklad 7

Výroba protilátky

Protilátky proti enzymu podle předkládaného vynálezu byly io připraveny injekcí čištěného enzymu králíkovi a izolací imunoglobulinů z antiséra podle postupů popsaných v N. Harboe a A. Ingild („immunization, Isolation of Immunogiobulins, Estimation of Antibody Titre“ In A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Methods and Applications, N. H. Axelsen a další (red.), Universitetsforiaget, 15 Oslo, 1973) a v T. G. Cooper („The Tools of Biochemistry“, John Wiley & Sons, New York, 1977).

Odborníkům v oboru budou zřejmé další modifikace předkládaného vynálezu, aniž by došlo k odchýlení od předmětu předkládaného vynálezu.

Na následujících stranách se uvádějí výpisy sekvencí, které byly postupně číslovány od SEQ.I.D. No. 1 do SEQ.I.D. No. 19, přičemž jde o sekvence nukleotidů a sekvence aminokyselin.

ΙΊ 6 ft C	<1 C	PC	ο φ	4C	* C\
c.	C ©; j;	G	. čt · c	ϋ	c V
Γ	c t? f	t·	e ·, ... fti	I t	Π' G -
r	< »Γ*ι <, Ϊ-.	t-	. ·Γ	ftC c	C í
I4 t	t íj Éí	h	Q fc	ť;	*
6í	vn C	ηξ		t) č	o;f;r

ř . Jirritw· ffc ηι Rr-^· · --1»^ +

SEQ^I.D. hó.^i* ' ,9 . -χ,ΐ’ w4é<-*^· - M·

MIKNMTOTOM^MIMRTSIWRK UESTSTVDG WPAWLSTGDR RLLQSSSVTP NvýmoGSG npztvaaava aapqggtkry xiriicagvyr ⁴envetokhk ____' Ϊ ' . JT ' *4?'⁷ ' 7 . i T -.^4. . i íiu . NIMFIGDGRT^RTIITGSIINV^VDGSTTFKSA TVAWGEGFL ARDITFQNTA .

ti- ·, í..j .< ‘ ..... -..-. ' ¹0-4 i; ' j j. '.. .. . v. .. ->.*-. ..

GPS1EQAVM, RVGADLSAFY* NCTMLAYQDT _u LYVHSNRQFF, VNCÚxAGTVD FÍFGJaAAVÍ*QNCDXHARKP. WSGQKNMVTA QGRMJPNQNT GIVIQKSRIG ¹ ' 'l _β i . ί' lir, ;..s ' ,^· · ' . LÉ.Í i. 4, . * 4 -i ' a·' L J· í Λ. Λ . '

ATSDLRRVQG^SFPTYIiGRPW KEYSRTVIMq, SSITDVIHFA GWHEWDGWFA LNTLFYGEHQ JJAGAGAGTSg’ BVKWKGFRVI_t TSATEAQAFT ’ PGS7ZAGSSW ’ i '.J^ :. -f — . , 'l. Av»v · ¹ * i ' b i 4' ) - . «b-'_n_, > ·· ·· Ih ·· η: .|

LGSTGFPFSL GL .

·* — ·. -/.. *.; ,VíZ-A“— ΛΜ so' * rnirw -^4ioo

150

2oa“

2S0

3oa

35θ

362

SZQ.Z.D. WO. 2 ”'

MTRXKZFFTK LSESS5NQWI. SNÍPRmEL^FLALFATLůV .VAAVIGZVAGSO *4 **· · ·- V .-V-fc ,-¼.^ K»<* «,-π β“4τ». Xj, · χ· ,

VNSRKNSGDN GWEBH^IX^SSeSSTRYPP.LCFSAlAAVP EASKKVTSQK100 • 4 * *’i * ''·** -J J ‘vw4ft^J - *·i

DVIEMSLNIT TXAVEHNYFG, IQKLLKRXNI, TKREKVALHD' CLSTIDETUD150 ________ “ -*#*· A » * 4 H· X *-*' i >< I. » > w 'τ’ · . < . ‘ J<

SLHKAVEDLZ EYPNKKSLSQ,HADDLKTLMS,AAMTNQGTCI. DGFSHDDANK200 __ .·’* ’>. >J iVi 'M|V ·'.., ?. ej^p M„-A-'b*- ·“ « 'i_s '

HVRDALSOGQ VHVEKMCSNA LAMIKNMTDT DMMIMRTSNN. RKLIRRTSTV250 dgwpawlstg drrllqsssv TPNVŤVAMG^GNFKTVA^30Ó~

RYIIRIKAGV YREWVTráŽ^HKNIMFTGDG RŤRTÍXŤGŠŘ WWDGSTTFK350

SATVAWGHG FIARDirFQNJTAGPSKHQAV. ALRVGADLSA., FYNG3MLAYQ.400 ___ -¹ ·' Λ» F -4. e ·. ·/ . ,, Vwrtíóó ' < i * □TLYVHSNRQ FFWCLIAGT^VDFXFGNAAA VLQNCDIHAR _b KPNSGQKWMV450

TAQGRADPNQ^WTGIVXQKSR IGATSDLKPV QGSFPTYLGR PWKSYSRTVI500 * <, rJ· Véh tV^,: 4 ·4 4** •'V¹ 4^4 - š* 4

MQSSITpVIH PAGWHEWDGN FALNTLFYGF. HQNAGAGAGT. SGRVXHKGSR550

VITSATEAQA.FTSGSFIAGS.SWLGSTGFPF^SLGLS84

.. . _t ,4 .’·*...· í· ^ítr···

- •'•r“·'' 4« K «n -W »., .. -r, u |

30.

C3í£·CXTXTGATC V-ŽC-V-’' O'

GTAGCAATGC GCTTGCTATG ATCAAGAACA TGACTGACAC TGACATGATG ^«**t-U*š* KW-.M óavwANMdMife ·*ν·ί \ϊ ‘ 'b \ s- f ^Λ

A.TCATGAGGA CTTCAAACAA CAGGAAGCTG ATAGAGGAGA CCAGTACGGT '*»/·· ;! **·' · _r 4. V· . (UfV;

' TGATGGGTGG CCGGCGTGGC TGTCCACCGG AGACAGGAGG CTGTTGCAGT cctcgtcggt.gacaccgaac.gtggÍggtgg CAGCAGATGG CAGCGGAAAC • I· >I> 4. .¼ . rt-· «iíidWř - * · I. , 1

TTTAAGACGG TGGCGGCAGC. GGTGGCGGCG GCTCCTCAGG. GAGGCACTAA

Kh>m«jA4 - ·* + ψ· * · *^x *'

GCGGTATATT ATTAGGATTA AAGCCGGTGT TTATCGGGAA AATGTTGAGG ” ' * ' 4 - 4r <4 7»>

TGACAAAGAA GCATAAAAAT ATAATGTTCA TGGGTGACGG GAGGACTAGA *V > 4 * ** · **ρ.φ Μ«Α 4r4 -··

ACTATCATCA CAGGAAGTAG. AAATGTGGTT GATGGAAGCA CAACTITCAA

GTCIGCTACXJJIEKJEfflrTrSGTGAAfiG ATTCTTGGCC CGAGACAITA >wpr «π-ΜΠΜΗ-* · '••'r « * U fc-^:1

CATTCCAAAA CACAGCCGGC, CCCTCAAAGC ACCAGGCGGT GGCACTACGA # i 4._ Hkw-Š. .41

GTGGGAGCTG ACCTrTCAGC, ATTTTACAAT TGCGATATGT TAGCTTACCk «* T Z>. , . y ’ · «4 IV .· 4 . 1 » /· '’

AGACACACTC TACGTCCACT. CGAACCGCCA GTTCinOTG AACTGCTTAA

TTGCTGGCAC _Ť GGTTGATTTT, ATTTTTGGTA ACGCTGCAGC. CG7GTIACAA AATTGTGAeA^TCCATGC^.AAAfiácAÁT TCCGGCCAAA AAAAZATGGr

Ά .»bv -'W· fc 1 :γ'> -τ*·Α ·. i A ·4

CACAGCGCAA GGCAGGGCTG ACC7XAACCA AAACACCGGC ATTGTGATTC >«. 4 b.^v ‘ J·* 4·'·μ - .

100

LSO

200

25Q

300

350

400

450

500

550

600 .650 i 4

700

7S0

-7510

AAAAATCTAG GATTGGTGCC ACCTCCGATT TTCCCGACGT ACCTCGGCAG GCCCTGGAAG CATGCAGTCA TCGATTACTG ACGTGATCCA GGGATGGTAA CTTCGCGTTG AACACATTGT GCCGGAGCCG GTGCCGGAAC TTCAGGGAGA GGTTATTACA AGTGCTACCG ASGCTCAAGC TTGCTGGTAG TAGCTGGCTG GGCTCCACTG TTGTAAIATT CACTAGGAGT ΤΤΤΑΑΤΤΆΑΤ CATAGGTCTC TGGTCTTTCA ATTTGTAATA TCGTGGCTTC GATTTCACAA ATACTATTGT TAGCATGGOA AGAATAATAA TTTCCGGCTT AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA

TAAAACCGGT TCAGGGTAGTgoo

GACTACTCGA GGACGGTGAT350

CCCTGCCGGG TGGCACGAGT900

TTTACGGAGA GCATCAGAAC950

GTGAAATGGA AGGGATTTAG1000

TTraCTCCT GGAAGCTTCA ' 1050 GTTTCCCATT CTCCCTTGGT1100

ATGTTTTGTA TTAGTGGATC1150

TTTGATTGAS CGTGTCTEAT1200

GTGATTAACA AGAAATAAAA125 o

CTTTAAAAAA ΑΑΑΑΑΑΑΑΑΑ1100

1323

I*·

SEQ.I.D. HO. 4

CTTTTGTTCT CTCTTATCGA

TCACAAAACT TTCTGAATCT

AAGAAAAAAA AGAAACTATT

CGCTGCCGTA ATCGGCATTG

GCGACAACGG CAACGAGCCT

AGCACAAGGT ACCCGGACTT

GGCOTCCAAA AAGGTGACAA

ACATCACAAC AACAGCCGTG

TTGAAGAGAA CGAAICTCAC

TCTTGAGACG ATCGATGAGA

ATCTTGAGGA GÍACCCGAAC

CTCAAAACCC TAATGAGTGC

TGGGTTCTCT CATGATGATG

GAAAAAAAAT GACCCGCATA AAAGAATTCT TCTACCAACC AAAACATTTC CAATATTCCC CTTAGCTCTT TTTGCAACGC TACTCGTTGT TCGCCGGAGT GAAC7CAAGA AAAAACTCCG CATCATGCTA tcctcaaatc atcatgiagc ATGCTTTTCG GCTATTGCTG CCGTTCÍAGA GCCAAAAGGA CGTTATTGAG ATGTCCTTAA GAACACAACT ACTTCGGGA7 TCAGAAGCTC CAAACGGGAA AAGGTTGCTC TCCATGACTG CTCTTGATGA GTTACACAAA GCCGTCGAGG AAGAAATCTT TATCACAGCA TGCGGATGAT CGCGATGACC AATCAGGGGA CGTGTCTTGA CTAATAAGCA CGTGCGGGAT GCGTTGTCAG

100

150

200

250

300

350

400

450

500

550

500

550 .30

ACGGCCAGG

AAGAACATGA CTGACACTGA CATGATGATG GAAGCTGATA GAGGAGACCA GTACGGTTGA CCACCGGAGA CAGGAGGCTG TTGCAGTCCT GTGGTGGCAG CAGATGGCAG CGGAAACTTT GGCGGCGGCT CCTCAGGGAG GCACTAAGCG CCGGTGTTTA TCGGGAAAAT GTTGAGGTGA ATGTTGATCG GTGACGGGAG GACTAGAACT TGTGGTTGAT GGAAGCACAA CTTTCAAGTC GTGAAGGATT CTTGGCCCGA GACATTACAT

700

TGCTATGATC'

ATGAGGACTT	CAAACAACAG	750
TGGGTGGCCG	GCGTGGCTGT	aoo
CGTCGGTGAC	ACCGAACGTG	eso
AAGACGGTGG	CGGCATCGGT.	500
GTATATTATT	AGGATTAAAG	950
CAAAGAAGCA	ΤΆΆΑΑΑΙΑΤΑ	1000
ATCATCACAG	GGAGTAGAAA '	1050
TGCTACAGTT	GCTGTTGTTG .	1100
TCCAAAACAC	AGCCGGCCCC	1150

TCAAAGCACC AGGCGGTGGC ACTXCGAGTG GGAGCTGACC TTTCAGCATT 1200

TTACAATTGC GATATGTTAG CTTACCAAGA CACACTCTAC GTCCACTCGA 1250

4.

ACCGCCAGTTCTTTGTGAAC

TGCTTAATTG

CTGGCACGGT

TGATTTTATT ··. · 1300

- TTTGGTAACG

CTGCAGCCGT

GTTACAAAAT

TGTGACATCC

ATGCACGAAA uso :..

.t GCCCAATTCC- GGCCAAAAAA

ATATGGTCAC

AGCCCAAGGC

AGGGCTGACC . ‘ . 1400

CTAACCAAAA CACGGGCATT GTCATTCAAA AATCTAfiGAT TGGTGCCACC 1450

TCCGATTTAA AACCGGTTCA GGGTAGTTTC CCGACGTACC TCGGCAGGCC 1500 φ♦· · • Φ

Φβ«· ·· • ·

CTGGAAGGAG TACTCGAGGA CGGTGATCAT GCAGTCATCG ATTACTGACG1550

TGATCCACCC. TGCCGGGTGG CACGAGTGGG ATGGTAACTT CGCG7TGAAC1500

ACATTGTTTT· ACGGAGAGCA TCAGRACGCC GGAGCCGGTG CCGGAACTTC1550

AGGGAGAGTT AAATGGAAGG GATTTAGGGT TATTACAAGT GCTACCGAGG1700 . 7.:.,.:5:^ . .. CTCAAGCTTr. TACTCCTGGA AGCTTCATTG CTGGTAGTAG CTGGCTGGGC.175.0 'j. *TCCACTGGTT- TCCCATTCTC'.CCTTGGTTTG·· TAATATTCAC TAGGAGTTTT ·'1800AATTAATATG TTTTGTATTA GTGGATCCAT AGGTCTCTGG TCTTTCAATT1850

TGTAATATTT GATTGAGCGT GTCTTATTCG TGGCTTCGAT TTCACAAATA1500

CTATTGTGTG: ATrAACAAGA- AATAAAATAG CATGGGAAGA ATAATAATTT ' 1550 '

CCGGCTTCTT TAAATTAAAA AAAAA .1975

SEQ.X.D. NO. 5 rVAGVNSRKN SGDNGNEPHH AILKSSCSST RYPDLCFSAI AAVPEASW50

TSQKDVIZMSfLNITmVEfrWfFSIQKttK RTNLTKREKV ALHDCLETID'100'

ETLDELHKAV ΕΠΙΞΞΥΡΝΚΚ SLSQHADDIX TXMSAAMTNQ GTCLDGFSED .150 . . OANKHVRDAL SDGQVHVEKM CSNALAMIKN MTDTDMMIMR TSNNRKLIEE200

TSTVDGWPAW LSTGDRRLLQ220

SEQ.I.D. HO. S

ATTGTCGCCG GAGTGAACTC AAGAAAAAAC TCCGGCGACA· ACGGCAACGA- 50

GCCTCATCAr GCTAXCCXCA AATCATOATG TAGCAGCACA AGGIACCCGG100

ACTTATGCTT TTCGGCTATT GCTGCCGTTC CAGAGGCCTC CAAAAASGXG 15.0 .25 . ACAAGCCAAA. AGGACGTTAT TGAGATGTCC TTAAACATCA CAACAACAGC 200 .i

CGTGGAAOAC AACTACTTCG GGATTCAGAA GCTCTXAAG AGAACGAATC250

TCACCAAACG GGAAAAGGTT GCTCTCCATG ACTGTCTTGA GACGATCGAT300

GAGACTCTTG ATGAGTTACA CAAAGCGGTC GAGGATCTTG AGGAGTACCC350 gaacaagaaa tctttatcac agcatgcgga TGATCTCAAA ACCCTAATGA400

GTGCCGCGAT GACCAATCAG GGGACGTGTC TTGAXGGGTT CTCTCATGAT450

GAXGCTAATA AGCACGTGCG GGATGCGTTG TCAGACGGCC AGGTTCATGT500

TGAGAAGATG TGTAGCAATG CGCTTGCTAT GATCAAGAAC ATGACTGACA550

CTGACATGAT GATGAXGAGG ACTTCAAACA ACAGGAAGCT GATAGAGGAG600

ACCAGTACGG TTGATGGGTG GCGGGCGTGG CTGTCCACCG GAGACAGGAG550

GCTGTTGCAG650

	szg.i.o. NO. 7 PE511 (14 aa)	Ser ’ ala-thr-val -ala- val - val -gly-glu-gly- phe -1 eu - al a -
40
	3ZQ.X.D. NO. 3

ΡΞ2252 (4 aa)

Tyr-íle-ile-arg

SEQ.I.D. NO.

ΡΞ3 (3 aa)

SZQ.I.D. NO.

Asa- ile-tnec-prie-ile-gly-asp-gly

PE21 (21 aa)

Ile-gly-ala-Chr-ser-asp-leu-lys-pro-val-gin-gly-gerphe-pro-thr·eyr-leu-gly-arg-pro

SEQ.I.D.-NO

PE492D (15 aa) jcoe-5 er-ala-ehr-val - ala-val - val-gly-glu-gly-phe-1 euala-arg

SEQ.I.D. NO. 12

PE492C (11 aa} xxx-ala- eyr-pro-gly-gln-ile-chr-ser-asn-rtiet:

SEQ.I.D. NO. 12

PE492H (12 aa)

Asn-cys-asp-met-Leu-ala-cyr-gin-aap-Chř-leu-cy?

SEQ.I.D. NO. 14

PE492A (15 aa)

Val-ile-ehr-ser-ala-ehr-glu-ala-gln-ala-phe-chr-progly-ser-phe

SEQ.I.D. NO. 15

PE7Q1 (23 aa)

Val-ile-chr-ger-ala-ehr-glu-ala-gln-ala-phe-eiur-progly-ser-phe-ile-ala-gly-ser-ser-erp-leu-gly-ser-chr· gly-phe

Seq.i.d. χα. 15 . PE594 (12 aa)

Ile-ala-gly-ser-ser-crp-leu-gly-ser-chr-gly-phe-prO

SEQ.I.D. NO. 17

- . PE7; (19 aaL- Asn-meE-val-clwala-gln-gly-arg-ala-asp-pra-ásn-gln . . · ... . asn-thr-gly-ile-.val-ile .. ·· · «4 44 4 4 4 4 *·*·, *♦··

4 · 9 · 9' · 4 ·9 ♦ ·ι 4 · » · ·· ♦ ·’ · * 4 4 4 «|· Ι * • 444 · · ·· · · ··'

SSQ.I.D. NO. 13

-78 9E.2S1 (38, aa) xxx-arg- ile-gly-ala- chr- ser- asp-leu-lys -pro-val -glngly-ser-phe-pra-thr-cyr-leu-gly-arg-pro- (trp) -lysglu-eyr- (ser) -arg- (thrl -val-ile-Bec-gln-ser-ser-ile thr

SEQ.I.O. NO. 13

PS 201 (27 aa) xxx- noc- ile-gly- ala- ciir -ser-asp-Ieu- lys - pro - val -gin gly-ser-phe-pro-chr - cyr -1 eu-g 1 y - arg-pr o - x»t - lys-glutyr

SEQ.I.D, HO, 20

PE 22 (21 aa)

Ser-arg-ile-gly-ala-chr-ser-asp-leu-lys-pro-val-glngly-ser-phe-pro-chrcyr-1eu-gly aa 2 (arg) could ,be replaced wich val aa 3 (ile) could be replaced with utec aa 5 (thr) could be replaced with val

Claims (5)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob, vyznačující se tím, že zahrnuje přídavek blokovým způsobem enzymaticky deesterifíkovaného

   5 pektinu, kde pektinem je vysoce esterifikovaný pektin, do kyselého prostředí.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, ž e blokovým způsobem enzymaticky deesterifikovaný pektin io je připraven technikami rekombinantní DNA.
3. 3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že kyselým prostředím je vodný roztok, a tímto vodným roztokem je s výhodou nápoj.
4. 4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, ž e nápojem je jogurtový nápoj, ovocný džus nebo nápoj_: obsahující protein syrovátky.

   20 5. Způsob podle některého z nároků 1až4, vyznačující se tím, že protein je odvozen nebo je odvoditelný z mléčného produktu, jako je mléko nebo sýr, nebo se v něm nachází.

   25 6. Způsob podle nároku 5, v y z n a č u j í c í s e tím, ž e proteinem je kasein nebo protein syrovátky.

   -80• · ·>·· φ · * φφφ · · • · · · · φ · · φ · «'

   7. Způsob podle některého z nároku 1 až 6, vyznačující s e t í m , ž e kyselé prostředí má pH od přibližně 3,5 do přibližně 5,5, s výhodou od 4 do přibližně 5,5.

   s 8. Způsob podle některého z nároků 1až7, vyznačující se tím, že kyselé prostředí má pH přibližně 4.

   9. Způsob podle některého z nároků 1až8, vyznačující se tím, že blokovým způsobem enzymaticky io deesterifikovaný pektin připravený technikami rekombinantní

   DNA obsahuje od přibližně 70 % do přibližně 80 % esterových skupin, s výhodou přibližně 76 % esterových skupin.

   10. Způsob podle některého z nároků 1 až 9, vyznačující

   15 se tím, že blokovým způsobem enzymaticky deesterifikovaný pektin připravený technikami rekombinantní DNA je při postupu podle Protokolu uvedeného v Příkladech * necitlivý na ionty Ca²\

   2o 11. Způsob podle některého z nároků 1 až 10, vyznačující se tím, že blokovým způsobem enzymaticky deesterifikovaný pektin připravený technikami rekombinantní DNA má vysokou molekulovou hmotnost.

   25 -12. Způsob podle některého z nároků 1 až 11, vyznačující se tím, že blokovým způsobem enzymaticky deesterifikovaný pektin připravený technikami rekombinantní DNA se vyrábí působením rekombinantní ' pektinmethylestérázy, která deesterifikuje dva nebo více

   -81 ···· ·· sousedních zbytků kyseliny galakturonové pektinu na alespoň v podstatě všech řetězcích pektinu, na pektin.

   13. Způsob podle některého z nároků 1 až 12,. s vyznačující se tím, že rekombinantní pektinmethylesteráza je odvozena z pektinmethylesterázy získatelné z rostlin.

   10 14. Způsob podle nároku 13, ž e rostlinou je ovoce. vyznačující se tím 15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím ž e ovocem je citrusové ovoce. 15 16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím

   ž e citrusovým ovocem je pomeranč.

   17. Způsob podle některého z nároků 13 až 16, vyznačující se tím, že rekombinantní 33 pektinmethylesteráza je odvozená z pektinmethylesterázy získatelné z lamely nebo albeda pomeranče.

   18. Způsob _podle_, některého. „„„z_____nároků.. _1........až—1-7, vyznačující se tím, že blokovým způsobem enzymaticky deesterifikovaný pektin se připravuje působením rekombinantního enzymu obsahujícího kteroukoliv^ sekvenci aminokyselin uvedenou jako SEQ.I.D. No. 1 nebo SEQ.I.D. ; í No. 2 nebo její variantu, derivát nebol homolog; včetně ijejich kombinací, na pektin. · ·*«· ··

   19. Způsob podle některého z nároků 1 až 18, vyznačující se tím, že blokovým způsobem enzymaticky degradovaný pektin se připravuje působením
5. 5 rekombinantního enzymu, získatelného expresí sekvence kódující pektinmethylesterázu obsažené v NCIMB 40749 nebo NCIMB 40750 nebo její varianty, derivátu nebo homologu, i nebo jejich kombinaci; nebo expresí nukleotidové sekvence obsahující nukleotidovou sekvenci uvedenou jako SEQ.I.D. No.

   * io 3 nebo SEQ.I.D. No. 4 nebo její varianty, derivátu nebo homologu, nebo jejich kombinací, na pektin.

   20. Způsob podle některého z nároků 12 až 19, vyznačující se tím, že se blokovým

   15 způsobem, enzymaticky, deesterifikovaný pektin připravuje působením rekombinantní^ pektinmethylesterázy na pektin v přítomnosti sodných iontů.

   21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím,

   20 ž e se blokovým způsobem enzymaticky deesterifikovaný pektin připravuje působením rekombinantní pektinmethylesterázy na pektin v přítomnosti NaCI, NaNO₃ ; nebo Na₂SO4.

   »

   ..... - -- - --- '2’2. Způsob enzymatické deesterifikace pektinu blokovým í i - ’< ; - způsobem, vyznačující se tím, že zahrnuje působení rekombinantního enzymu obsahujícího kteroukoliv ze sekvencí aminokyselin uvedenou jako SEQ.I.D. No. 1 nebo ’»·’ - ' ' 'r. í SEQ.I.D. No. 2 nebo její variantu, derivát nebo hómolog,

   30 včetně jejich kombinací, na pektin.

   ··«· ·· ·« »*M *· ♦ · * « · t · * »· ♦ · « ·* · * · <·« · • ·' ♦ « · · · 9·« .83. “ ·· ” ·’’·

   23. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že se blokovým způsobem enzymaticky degradovaný pektin připravuje působením rekombinantního enzymu, získatelného s expresí sekvence kódující pektinmethylesterázu, obsažené v NCIMB 40749 nebo NCIMB 40750 nebo její varianty, derivátu nebo homologu, na pektin.

   24. Způsob podle některého z nároků 22 až 23, io vyznačující se tím, že blokovým způsobem enzymaticky deesterifikovaný pektin se připravuje působením rekombinantní pektinmethylesterázy na pektin v přítomnosti sodných iontů,

   15 25. Způsob podle nároku 24, vyznačující se tím, že se blokovým způsobem enzymaticky deesterifikovaný pektin připravuje působením rekombinantní pektinmethylesterázy na pektin v přítomnosti NaCI, NaNO₃ nebo Na₂SO₄.

   26. Rekombinantní enzym obsahující kteroukoliv aminokyselinovou sekvenci uvedenou jako SEQ.I.D. No. 1 nebo SEQ.I.D. No. 2 nebo její variantu, derivát nebo homolog, včetně jejich kombinací.

   27. Sekvence nukleotidů kódující rekombinantní enzym podle nároku 26, kde nukleotidová sekvence obsahuje kteroukoliv ze

   ....... .... sekvencí uvedenou jako SEQ.I.D. No. 3 nebo.SEQ.I.D. No..4 i nebo jejích variantu, derivát nebo homolog.: . »; ; -

   5'

   29.

   ··«· 44 • · * • 4 * •· · ♦ • 4 4· •*i4 44 4

   44 4· • · «4 » 4

   4 4

   29.

   30.

   30.

   31.

   31.

   Sekvence nukleotidů kódující rekombinantní enzym podle nároku 26, kde nukleotidová sekvence je získatelná z NCIMB 40749 nebo NCIMB 40750 nebo její varianty, derivátu nebo homologu, nebo její varianta, derivát nebo homolog.

   Konstrukt vyznačující se tím, že exprimuje nebo obsahuje rekombinantní enzym podle nároku 26 nebo sekvenci nukleotidů podle nároku 27 nebo 28.

   Vektor, vyznačující se tím, že exprimuje nebo obsahuje konstrukt podle nároku 29 nebo rekombinantní enzym podle nároku 26 nebo sekvenci nukleotidů podle nároku

   27 nebo nároku 28.

   Kombinace konstruktů, vyznačující se t í.m , ž e obsahuje alespoň první konstrukt exprimující nebo < obsahující rekombinantní enzym podle nároku 26 nebo sekvenci nukleotidů podle nároku 27 nebo 28; a druhý konstrukt obsahující gen který může být předmětem zájmu a promotor.

   Buňka, tkáň nebo orgán, vyznačující se tím, že- exprimuje -nebo-obsahuje -vektor- podle- nároku-30“ nebo -----’ konstrukt podle nároku 29 nebo rekombinantní enzym podle enároku 26 nebo nukleotidovou sekvenci podle nároku 27 nebo

   28 nebo kombinaci konstruktů podle nároku 32.

   i. -4· «··· ·· ·· ·*♦·ν· · • · · · · *···* \ · · ·, · · · * «.- · · • · ·. ·' · · · · ♦·.·'· ♦ • ·· * ····.··»

   -85- *’ ** ·* -“ ·*

   33. Transgenický organismus, vyznačující se tím, ž e exprimuje nebo obsahuje předmět vynálezu podle některého z nároků 26 až 32.

   s 34. NCIMB 40749 nebo NCIMB 40750.

   35. Rekombinantní enzym pektinmethylesteráza, vyznačující se tím, že je imunologicky reaktivní s protilátkou proti čištěnému rekombinantnímu io enzymu podle nároku 26, ale ne proti enzymu pektinmethylesterázy rajčat.

   36. Použití rekombinantního enzymu podle některého z nároků 26 nebo 35 pro snížení počtu esterových skupin v pektinu.

   37. Použití rekombinantního enzymu podle nároku 26 nebo nároku 35 pro deesterifikaci pektinu blokovým způsobem.

   38. Použiti rekombinantního enzymu podle nároku 26 nebo nároku

   20 35 pro ovlivnění citlivosti pektinu na vápník.

   39. Použití rekombinantního enzymu podle nároku 26 nebo nároku

   35 pro esterifikaci .pektinu..obsahujícího- volné, karboxylové skupiny.

   40. Pektin, vyznačující se tím, ž e byl získán

   V;·,·*···)?2-í použitím rekombinantního enzymu podle;nároku 26 nebo 35. .

   ti ···· ··

   • 9 9 9 • 9 9 • 9 9 9 9 9

   ·· ···· • ♦

   9 9 9'

   9 9 9 9

   9 9 9 9

   9999

   Φ β 9

   9 999

   99 9 99 • · *

   41. Použití pektinu podle nároku 40 pro výrobu potraviny.

   42. Použití pektinu podle nároku 40 pro stabilizaci proteinu

   5 v kyselém prostředí bez nepříznivého ovlivnění viskozity prostředí.

   43. Kombinace enzymů obsahující rekombinantní enzym podle nároku 26 nebo nároku 35 a houbovou pektinmethylesterázu io nebo jiný pektin degradující enzym.

   44. Sekvence aminokyselin obsahující sekvenci uvedenou jako SEQ.I.D. No. 5 nebo její variantu, derivát nebo homolog, vhodná pro použití- při propůjčování teplotní stability proteinu

   15 nebo její zvyšování.

   45. Sekvence aminokyselin obsahující sekvenci uvedenou jako SEQ.I.D. No. 6 nebo její variantu, derivát nebo homolog, vhodná pro použití při expresi aminokyselinové sekvence pro

   20 propůjčování teplotní stability proteinu nebo její zvyšování.

   46. Rekombinantní nukleotidové sekvence kódující enzym podle nároku 26.

   25 ^L 47. Rekombinantní enzym pektinmethyiesteráza v podstatě tak, jak se zde popisuje.