JP2006262905A - 酸性環境中において高エステルペクチンを用いてタンパク質を安定化するためのプロセス - Google Patents
酸性環境中において高エステルペクチンを用いてタンパク質を安定化するためのプロセス Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】以下:a)ペクチンをブロックワイズで酵素的に脱エステル化し得る精製PME酵素を、該ペクチン骨格の長さを実質的に減少するために酵素ポリガラクツロナーゼで事前に処理されていないペクチンに添加する工程;b)ペクチンをブロックワイズで酵素的に脱エステル化し得る精製PMEによって、該ペクチンからブロックワイズの酵素的に脱エステル化したペクチンを調製する工程;c)該ブロックワイズの酵素的脱エステル化したペクチンを少なくとも1つのタンパク質を含む酸性環境に添加する工程;およびd)該ブロックワイズの酵素的に脱エステル化したペクチンによって、該タンパク質を安定化する工程を包含する、プロセス。
【選択図】なし
Description
。遊離のカルボキシル基の増加は、自動化滴定によって容易にモニターされ得る。これに関して、初期の研究は、いくつかのPMEが、1つより多くのペクチン鎖上のエステル化し
た(例えば、メチル化した)ガラクツロン酸残基のいずれかを脱エステル化するという意味で、ランダムな様式でペクチンを脱エステル化することを示している。ペクチンをランダムに脱エステル化するPMEの例は、Aspergillus aculeatus(WO 94/25575を参照のこと
)およびAspergillus japonicus(Ishiiら J Food Sci 44 611-14頁)のような真菌供給
源から得られ得る。Baronら(Lebensm. Wiss. M-Technol 13 330-333頁)は明らかに、Aspergillus nigerから真菌PMEを単離している。この真菌PMEは、39000Dの分子量、3.9の等電点、4.5の至適pH、および3のKm値(mg/ml)を有することが報告されている。
でのいずれかでペクチンを攻撃し、次いで一本鎖メカニズムによってペクチン分子にそって続行し、それによって非常にカルシウム感受性である非エステル化ガラクツロン酸単位のブロックを生成すると考えられているという意味で、ブロックワイズ様式でペクチンを脱エステル化することが公知である。ペクチンをブロックワイズに酵素的に脱エステル化するこのような酵素の例は、植物PMEである。PMEの12までのイソ形態は、柑橘類中に存在することが示唆されている(PilnikW.およびVoragen A.G.J. (Food Enzymology (P.F.Fox編); Elsevier; (1991); 303-337頁)。これらのイソ形態は、異なる特性を有する。
態Iは、36000Dの分子量、10.0の等電点、7.6の至適pH、および0.083のKm値(mg/ml)
を有する。イソ形態IIは、36200Dの分子量、11.0の等電点、8.8の至適pH、および0.0046
のKm値(mg/ml)を有する。イソ形態III(HMW-PE)は、54000Dの分子量、10.2の等電点、8の至適pH、および0.041のKm値(mg/ml)を有する。しかし、今日までのところ、このようなPMEについては非常に限定された配列データがあった。
。これらのテストは、低温殺菌後に柑橘類果汁中の望ましくない残りのPME活性について
チェックするためにしばしば使用される。なぜなら、残りのPMEは、果汁中のメタノール
の構成の他に、オレンジ果汁中に「曇りなし(cloud loss)」と呼ばれるものを生じ得るからである。
る封鎖剤にまたは封鎖剤として使用され得る。これに関して、ならびにPilnikおよびVoragen(同上)によれば、家畜の餌は、果汁抽出後に水酸化カルシウムのスラリーを柑橘類
の皮に添加することによって調製され得る。添加後、高いpHおよびカルシウムイオンは、皮において任意の天然のPMEを活性化してペクチンの迅速な脱エステル化を引き起こし、
そしてペクチン酸カルシウム凝集を生じる。結合した液相は放出され、そして容易に押し出されて、その結果、元の水含有物の画分のみが高価な熱乾燥によって除去される必要がある。次いで圧搾液体は動物の餌として使用される。
、未処理の果汁袋からの皮および他の膜の除去を容易にするために、20〜40℃の中心温度に加熱されている柑橘類の果物のアルベドにおいて気泡へペクチナーゼ溶液としてそれらを添加すること(US-A-4284651)、ならびにいくつかの加工した果物および野菜(例えば、リンゴ(WileyおよびLee1970 Food Technol 24 1168-70)、缶詰にしたトマト(Hsuら1965 J Food Sci 30583-588頁)、およびポテト(BartolomeおよびHoff 1972 J Agric Food Chem 20 262-266頁))の構造および堅さを保護および改良することにおいてそれら
を使用することを包含する。
有する。しかし、酸性環境であるがその環境の粘度に不利な影響を及ぼすことなくタンパク質を安定化する公知の方法を改良するということが継続して求められている。これに関して、この環境の粘度への不利な影響は、得られる産物の全体の外観および/または構造および/または風味の良さおよび/または口当たりを悪くし得る。
のヌクレオチド配列を発現するまたは含むベクターが提供される。
モーターを含む第2の構築物を含む構築物の組み合わせが提供される。
製組換え酵素に対して惹起した抗体と免疫学的に反応する組換えPME酵素が提供される。
ペクチン分解酵素(例えば、ペクチンライアーゼ)を含む酵素の組み合わせが提供される。
ここでペクチンは、組換えDNA技法の使用によって調製された高エステルペクチンである
、プロセスである。
化されたペクチン」とは、ブロックワイズに脱エステル化された基を含むペクチンを意味し、ここでこのペクチンは、組換えDNA技法の使用によって調製されている酵素でエステ
ル化した基を含むペクチンを処理(例えば、接触)することによって調製される。
体は、かなり簡単および容易に、ならびに高い程度の均一性まで調製され得る。これは次に、および先行技術のPME調製物とは異なり、得られるPME活性がより一致しそして均質であるため、全体の脱エステル化プロセスがより制御されることが可能となることを意味する。
ば、カゼイン)のようなタンパク質を酸性溶液中で安定にさせるので、有用である。これは、スキムミルク、果汁、および乳清タンパク質飲料のような飲料市場に重要である。この分野では、以前は、高量の安定化剤が存在したならば、pH4.2のようなかなり高い酸性
条件下で重要なタンパク質の風味を保持することのみが可能であった。
脱エステル化されたペクチンの使用によって、pH5.5までのような4.2よりも高いpH条件(例えば、pH5.2)でそれらのタンパク質の風味を保持することが可能である。
素的に脱エステル化されたペクチン−特に組換えDNA技法の使用によって調製されたブロ
ックワイズに酵素的に脱エステル化されたペクチン−は、これらのpH条件に使用される先行技術の安定化剤よりもタンパク質を安定化すると考えられている。
ンを産生し得ることである。これによって、実質的にすべてのペクチン鎖が、少なくとも2つの隣接する脱エステル化されたカルボキシル基を含むことを意味する。しかし、いくつかの適用については、このような実質的に均質なブロックワイズの脱エステル化ペクチンを調製または使用することが必要であり得ない。
ブランケットでタンパク質を取り囲んで、そうして安定な乳濁物を形成することによって
タンパク質を安定化する。
合、ペクチンをブロックワイズに脱エステル化するために有用である。いくつかの場合、ペクチンを脱エステル化することは、ペクチンのカルシウムイオン感受性を増加させ得る−これは同様に有利であり得る。
メタノールの存在下、または高濃度の硫酸アンモニウムの存在下で、組換え酵素と接触する場合、ペクチンをエステル化するために有用である。この局面は、例えば、ペクチンのカルシウム感受性を減少させることが所望される場合、有利である。
技法の使用によって調製されたペクチンは、約80%またはそれより少ないエステル基(すなわち、80%またはそれより少ないエステル化(DE)の程度)、好ましくは約75%またはそれより少ないエステル基(すなわち、75%またはそれより少ないDEの程度)を含む高エステルペクチンである。これに関して、エステル化カルボキシル基に対するペクチンにおける遊離のカルボキシル基の比は、1:1〜1:4、好ましくは1:2〜1:3である。
る。
し、ここにはラメラおよびアルベドを示す。用語「オレンジのラメラまたはアルベドから得られ得るPMEに由来する」とは、組換えPMEがブロックワイズの様式でペクチンを脱エステル化し得るならば、組換えPMEがオレンジのラメラまたはアルベドから得られ得るPMEの配列と類似の配列を有することを意味する。
合わせでペクチンを処理することによって調製される。
またはNCIMB 40750に含まれるPMEコード配列の発現によって得られ得る組換え酵素、またはその改変体、誘導体、もしくはホモログ、あるいはそれらの組み合わせでペクチンを処理することによって調製される。
化されたペクチンは、NaCl、NaNO3、またはNa2SO4の存在下で組換えペクチンメチルエステラーゼでペクチンを処理することによって調製される。
項目1.少なくとも1つのタンパク質を含む酸性環境に、ブロックワイズに酵素的に脱エステル化されたペクチンを添加する工程を包含するプロセスであって、ここで該ペクチンが高エステルペクチンである、プロセス。
項目2.前記ブロックワイズに酵素的に脱エステル化されたペクチンが、組換えDNA技法
によって調製される、項目1に記載のプロセス。
項目3.前記酸性環境が水溶液であり、好ましくは、該水溶液が飲料である、項目1または項目2に記載のプロセス。
項目4.前記飲料が、飲用ヨーグルト、果汁、または乳清タンパク質を含む飲料である、項目3に記載のプロセス。
項目5.前記タンパク質が、ミルクまたはチーズのような乳製品に由来する、または由来し得る、または乳製品中に存在する、項目1〜4のいずれか一項に記載のプロセス。
項目6.前記タンパク質が、カゼインまたは乳清タンパク質である、項目5に記載のプロセス。
項目7.前記酸性環境が約3.5〜約5.5のpHを有し、好ましくは、該酸性環境が4〜約5.5
のpHを有する、項目1〜6のいずれか一項に記載のプロセス。
項目8.前記酸性環境が約4のpHを有する、項目1〜7のいずれか一項に記載のプロセス。
項目9.組換えDNA技法の使用によって調製された前記ブロックワイズに酵素的に脱エス
テル化されたペクチンが、約70%〜約80%のエステル基、好ましくは約76%のエステル基を含む、項目1〜8のいずれか一項に記載のプロセス。
項目10.組換えDNA技法によって調製された前記ブロックワイズに酵素的に脱エステル
化されたペクチンが、実施例に記載されるようなプロトコルのCa2+イオンに非感受性で
ある、項目1〜9のいずれか一項に記載のプロセス。
項目11.組換えDNA技法によって調製された前記ブロックワイズに酵素的に脱エステル
化されたペクチンが、高分子量を有する、項目1〜10のいずれか一項に記載のプロセス。
項目12.組換えDNA技法によって調製された前記ブロックワイズに酵素的に脱エステル
化されたペクチンが、少なくとも実質的にすべてのペクチン鎖におけるペクチンの2つ以上の隣接するガラクツロン酸残基を脱エステル化する組換えペクチンメチルエステラーゼを用いてペクチンを処理する工程によって調製される、項目1〜11のいずれか一項に記載のプロセス。
項目13.前記組換えペクチンメチルエステラーゼが、植物から得られ得るPMEに由来す
る、項目1〜12のいずれか一項に記載のプロセス。
項目14.前記植物が果物である、項目13に記載のプロセス。
項目15.前記果物が柑橘類の果物である、項目14に記載のプロセス。
項目16.前記柑橘類の果物がオレンジである、項目15に記載のプロセス。
項目17.前記組換えペクチンメチルエステラーゼが、オレンジのラメラまたはアルベドから得られ得るPMEに由来する、項目13〜16のいずれか一項に記載のプロセス。
項目18.前記ブロックワイズに酵素的に脱エステル化されたペクチンが、配列番号1もしくは配列番号2に示すアミノ酸配列のいずれか1つを含む組換え酵素、またはその改変体、誘導体、もしくはホモログ、それらの組み合わせを含むものを用いてペクチンを処理する工程によって調製される、項目1〜17のいずれか一項に記載のプロセス。
項目19.前記ブロックワイズに酵素的に分解されたペクチンが、NCIMB 40749もしくはNCIMB 40750に含まれるPMEコード配列の発現によって得られ得る組換え酵素、またはその
改変体、誘導体、もしくはホモログ、またはそれらの組み合わせ;あるいは、配列番号3もしくは配列番号4に示すヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列の発現によって得られ得る組換え酵素、またはその改変体、誘導体、もしくはホモログ、またはそれらの組み合わせを用いてペクチンを処理する工程によって調製される、項目1〜18のいずれか一項に記載のプロセス。
項目20.前記ブロックワイズに酵素的に脱エステル化されたペクチンが、ナトリウムイオンの存在下で前記組換えペクチンメチルエステラーゼを用いてペクチンを処理する工程によって調製される、項目12〜19のいずれか一項に記載のプロセス。
項目21.前記ブロックワイズに酵素的に脱エステル化されたペクチンが、NaCl、NaNO3、またはNa2SO4の存在下で前記組換えペクチンメチルエステラーゼを用いてペクチンを処理する工程によって調製される、項目20に記載のプロセス。
項目22.ペクチンをブロックワイズに酵素的に脱エステル化する方法であって、配列番号1もしくは配列番号2に示すアミノ酸配列のいずれか1つを含む組換え酵素、またはその改変体、誘導体、もしくはホモログ、それらの組み合わせを含むものを用いてペクチンを処理する工程を包含する、方法。
項目23.前記ブロックワイズに酵素的に分解されたペクチンが、NCIMB 40749もしくはNCIMB 40750に含まれるPMEコード配列の発現によって得られ得る組換え酵素、またはその
改変体、誘導体、もしくはホモログを用いてペクチンを処理する工程によって調製される、項目22に記載の方法。
項目24.前記ブロックワイズに酵素的に脱エステル化されたペクチンが、ナトリウムイオンの存在下で前記組換えペクチンメチルエステラーゼを用いてペクチンを処理する工程によって調製される、項目22〜23に記載の方法。
項目25.前記ブロックワイズに酵素的に脱エステル化されたペクチンが、NaCl、NaNO3、またはNa2SO4の存在下で前記組換えペクチンメチルエステラーゼを用いてペクチンを処理する工程によって調製される、項目24に記載の方法。
項目26.配列番号1もしくは配列番号2に示すアミノ酸配列のいずれか1つを含む組換え酵素、またはその改変体、誘導体、もしくはホモログ、それらの組み合わせを含むもの。
項目27.前記ヌクレオチド配列が配列番号3もしくは配列番号4に示す配列のいずれか1つを含む項目26に記載の組換え酵素をコードするヌクレオチド配列、またはその改変体、誘導体、もしくはホモログ。
項目28.前記ヌクレオチド配列がNCIMB 40749もしくはNCIMB 40750から得られ得る項目26に記載の組換え酵素をコードするヌクレオチド配列、またはその改変体、誘導体、もしくはホモログ。
項目29.項目26に記載の組換え酵素、あるいは項目27または28に記載のヌクレオチド配列を発現するまたは含む構築物。
項目30.項目29に記載の構築物、あるいは項目26に記載の組換え酵素、あるいは項目27または28に記載のヌクレオチド配列を発現するまたは含むベクター。
項目31.項目26に記載の組換え酵素あるいは項目27または28に記載のヌクレオチド配列を発現するまたは含む少なくとも1つの第1の構築物;ならびに目的の遺伝子(GOI)およびプロモーターを含む第2の構築物を含む構築物の組み合わせ。
項目32.項目30に記載のベクター、あるいは項目29に記載の構築物、あるいは項目26に記載の組換え酵素、あるいは項目27または28に記載のヌクレオチド配列、あるいは項目31に記載の構築物の組み合わせを発現するまたは含む細胞、組織、または器官。
項目33.項目26〜32のいずれか一項に記載の発明を発現するまたは含むトランスジェニック生物。
項目34.NCIMB 40749またはNCIMB 40750。
項目35.トマトPME酵素ではなく、項目26に記載の精製組換え酵素に対して惹起した
抗体と免疫学的に反応性である、組換えPME酵素。
項目36.ペクチンのエステル基の数を減少するための項目26または項目35に記載の組換え酵素の使用。
項目37.ブロックワイズの様式でペクチンを脱エステル化するための項目26または項目35に記載の組換え酵素の使用。
項目38.ペクチンのカルシウム感受性に影響を及ぼすための項目26または項目35に記載の組換え酵素の使用。
項目39.遊離のカルボキシル基を含むペクチンをエステル化するための項目26または項目35に記載の組換え酵素の使用。
項目40.項目26または項目35に記載の組換え酵素の使用によって得られ得るペクチン。
項目41.食料品を調製するための項目40に記載のペクチンの使用。
項目42.環境の粘度に不利な影響を及ぼすことなく酸性環境においてタンパク質を安定化するための、項目40に記載のペクチンの使用。
項目43.項目26または項目35に記載の組換え酵素および真菌PMEまたは他のペクチ
ン分解酵素を含む酵素の組み合わせ。
項目44.タンパク質に熱安定性を与えるまたは増加させることにおける使用に適切な、配列番号5に示す配列、またはその改変体、誘導体、もしくはホモログを含むアミノ酸配列。
項目45.タンパク質に熱安定性を与えるまたは増加させるためのアミノ酸配列を発現させることにおける使用に適切な、配列番号6に示す配列、またはその改変体、誘導体、もしくはホモログを含むヌクレオチド配列。
項目46.項目26に記載の酵素をコードする組換えヌクレオチド配列。
項目47.実質的に本明細書に記載される組換えPME酵素。
項目48.実質的に本明細書に記載される組換えPME酵素の使用によって調製されるペク
チン。
かつ、この環境の粘度への不利な影響を与えなず、得られる産物の全体の外観および/または構造および/または風味の良さおよび/または口当たりを悪くしない方法が提供された。
す配列のいずれか1つ以上を含む組換え酵素の少なくとも同一の活性を有するならば、配列からのまたは配列への1つ(またはそれより多くの)アミノ酸の任意の代用、変更、改変、置換、欠失、または付加が含まれる。特に、用語「ホモログ」は、得られる組換え酵素がPME活性を有するならば、構造および/または機能に関する相同性を包含する。配列
相同性(すなわち、類似性)に関しては、好ましくは、添付の配列表に示す配列に対して少なくとも75%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%の相同性である。より好ましくは、添付の配列表に示す配列に対して少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の相同性である。
好ましくは配列番号1および2に示す配列のいずれか1つ以上を含む組換え酵素の少なくとも同一の活性を有する組換え酵素をコードするならば、配列からのまたは配列への1つ(またはそれより多くの)核酸の任意の代用、変更、改変、置換、欠失、または付加が含まれる。特に、用語「ホモログ」は、得られるヌクレオチド配列がPME活性を有する組換
え酵素をコードするならば、構造および/または機能に関する相同性を包含する。配列相同性(すなわち、類似性)に関しては、好ましくは、少なくとも75%、より好ましくは少なくとも85%、より好ましくは少なくとも90%の相同性である。より好ましくは、少なくとも95%、より好ましくは少なくとも98%の相同性である。
が含まれる。好ましくは、DNA、より好ましくは本発明のコード配列についてのcDNAを意
味する。
ロン配列(例えば、Sh1-イントロンまたはADHイントロン)のような適切なスペーサー基
の用意であり、プロモーターと本発明のヌクレオチド配列またはGOIとを媒介する。同じ
ことは、直接的または間接的結合を含む本発明に関しての用語「融合した」について当てはまる。各場合において、そして両方とも天然に環境下にある場合、用語は、野生型遺伝子プロモーターに通常関連する酵素をコードする遺伝子の天然の組み合わせを含まない。
えば、Aspergillus niger)、または植物(例えば、ポテト、テンサイなど)における遺
伝子構築物を選択させるマーカーを含むまたは発現し得る。種々のマーカーが存在し、例えば、マンノース-6-リン酸イソメラーゼをコードするマーカー(特に植物について)、
または抗生物質耐性を与えるマーカー(例えば、G418、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、およびゲンタマイシンへの耐性)が使用され得る。
糸状菌(好ましくはAspergillus属)へ−移され得る構築物を意味する。E. coliプラスミドから植物のAgrobacteriumへ移され得る構築物でもあり得る。
より好ましくはAspergillus nigerである。
プロモーターとして知られる)であり得る。あるいは、本発明のヌクレオチド配列についてのプロモーターは、本発明者らの1994年10月21日に出願された同時係属中の英国特許出願第9421286.7号に記載されるようなα-Amy 3プロモーター(他に、Amy 3プロモーター、Amy 351プロモーター、またはα-Amy 351プロモーターとして知られる)であり得る。
た領域であり得る。プロモーターは、本発明のヌクレオチド配列の発現のレベルまたは構築物の組み合わせの場合、GOIの発現のレベルに影響を及ぼす(例えば、維持する、増強
する、減少させる)ための他の配列をさらに含み得る。例えば、適切な他の配列は、Sh1-イントロンまたはADHイントロンを含む。他の配列は、誘導性エレメント−例えば、温度
、化学、光、またはストレス誘導性エレメントを含む。また、転写または翻訳を増強するための適切なエレメントが存在し得る。後者のエレメントの例は、TMV 5'シグナル配列である(Sleat Gene 217 [1987] 217-225;およびDawson Plant Mol. Biol. 23 [1993] 97を参照のこと)。
るためのプロモーターの使用を包含し、ここでプロモーターの一部は不活性化されるが、プロモーターはなおプロモーターとして機能し得る。ある場合には、プロモーターの部分的不活性化は有利である。特に、先に述べたAmy 351プロモーターでは、部分的に不活性
化したプロモーターが、ほんの1つの特定の組織タイプまたは器官を発現するような、より特異的方法で、本発明のヌクレオチドまたはGOIを発現するように、その一部を不活性
することが可能である。
的に不活性化する他のそして好ましい方法は、そのフラグメントを形成するためにプロモーターを切断することである。他の方法は、RNAポリメラーゼがその部分または他の部分
に結合し得ないように配列の少なくとも一部を変異することである。他の改変は、調セクションタンパク質(例えば、炭素カタボライト抑制を発揮するための糸状菌から公知のCr
eAタンパク質)に対する結合部位を変異することであり、したがって、天然のプロモーターのカタボライト抑制を廃止する。
する。GOIは、問題の生物(例えば、糸状菌、好ましくはAspergillus属、または植物)に対して外来または生来のいずれかである任意のヌクレオチドであり得る。GOIの代表的な
例は、代謝およびカタボライトプロセスを改変するタンパク質および酵素をコードする遺伝子を含む。GOIは、病原体耐性を導入または増加するための因子をコードし得る。GOIは、関連の組織に存在する天然の転写物の発現を改変するためのアンチセンス構築物でもあり得る。GOIはさらに、糸状菌、好ましくはAspergillus属の非天然タンパク質、あるいは動物またはヒトに有益である化合物をコードし得る。
ペクテートリアーゼ、ペクチンライアーゼ、ラムノ−ガラクツロナーゼ、ヘミセルラーゼ、エンド-β-グルカナーゼ、アラビナーゼ、またはアセチルエステラーゼ、あるいはそれらの組み合わせ、ならびにそのアンチセンス配列が挙げられる。
栄養因子の形成を阻害し得る植物タンパク質、およびより望ましいアミノ酸組成を有する植物タンパク質(例えば、非トランスジェニック植物よりも高いリジン含量)が挙げられる。GOIはさらに、キモシン、タウマチン、およびα-ガラクトシダーゼのような食物加工に使用され得る酵素をコードし得る。GOIは、害虫トキシン、パタチンまたはα-アミラーゼに対するもののようなアンチセンス転写物、ADP-グルコースピロホスホリラーゼ(例えば、EP-A-0455316を参照のこと)、プロテアーゼアンチセンス、グルカナーゼ、またはゲノムPMEのいずれか1つをコードする遺伝子であり得る。
アンチセンス方向であり得る。後者の場合、特定の酵素はゲノムPMEであり得る。ゲノム
エクソンまたはイントロン配列のGOIとしてのアンチセンス発現は、天然のPME発現が減少または排除されるが、組換えPME発現は影響を受けないことを意味する。これは、アンチ
センスイントロンまたはセンスイントロン発現について特に真実である。
された本発明者らの同時係属中のPCT特許出願PCT/EP94/01082の主題であるADP-グルコー
スピロホスホリラーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列のいずれかであり得る。GOIは
、1994年10月15日に出願された同時係属中の本発明者らのPCT特許出願PCT/EP94/03397に
記載されるα-グルカンリアーゼ酵素をコードするヌクレオチド配列のいずれかであり得
る。
およびBacillus subtilisが含まれる。原核生物宿主の形質転換の教示は、当該分野で十
分に立証されており、例えば、Sambrookら(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第2版, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)を参照のこと。真核生物宿主が
使用されるならば、遺伝子は、形質転換前にイントロンの除去によるように適切に改変される必要があり得る。
得る。
を使用してきた。また、今世紀には、Aspergillus nigerは、有機酸、特にクエン酸の生
産に、および産業での使用のための種々の酵素の生産に使用されている。
チド配列(またはGOIも)を糸状菌での発現のために設計された構築物中に挿入すること
によって調製される。
現された細胞外酵素についての真菌性プロモーターが挙げられる。本発明のヌクレオチド配列(またはGOIも)は、分泌されるべき本発明のヌクレオチド配列(またはGOIも)によってコードされるタンパク質を指向するシグナル配列に融合され得る。通常、真菌起源のシグナル配列が使用される。真菌で活性なターミネーターは発現系を終結させる。
より大きな部分に融合され得る。これは、本発明のヌクレオチド配列(またはGOIも)に
よってコードされるタンパク質を安定化し得る。このような系において、特定のプロテアーゼによって認識される切断部位は、真菌のタンパク質と本発明のヌクレオチド配列(またはGOIも)によってコードされるタンパク質との間に導入され得、それにより、産生さ
れた融合タンパク質は特定のプロテアーゼによってこの位置で切断され得、従って、本発明のヌクレオチド配列(またはGOIも)によってコードされるタンパク質を遊離させる。
例として、少なくともいくつかのAspergillusで見いだされるKEX-2様ペプチダーゼによって認識される部位を導入し得る。このような融合物は、インビボの切断を導き、その結果、より大きな融合タンパク質ではなく、発現された産物の保護を生じる。
コードするいくつかの遺伝子について報告されている。タンパク質は、本発明のヌクレオチド配列(またはGOIも)がシグナル配列に融合されない場合、細胞内に堆積し得る。こ
のようなタンパク質は、細胞質内に蓄積し、そして通常はグリコシル化されず、このことはいくつかの細菌タンパク質にとって利点となり得る。本発明のヌクレオチド配列(またはGOIも)がシグナル配列に備え付けられると、タンパク質は細胞外に蓄積する。
にPEGおよびCa2+イオンを使用するプロトプラスト中へのDNAの導入に基づく。次いで、形質転換されたプロトプラストは再生し、そして形質転換された真菌は、種々の選択マーカーを使用して選択される。形質転換に使用されるマーカーの中では、argB、trpC、niaD、およびpyrGのような多くの栄養要求性マーカー、ベノミル耐性、ハイグロマイシン耐性、およびフレオマイシン耐性のような抗生物質耐性マーカーがある。通常使用される形質転換マーカーは、A.nidulansのamdS遺伝子であり、これは唯一の窒素供給源としてアク
リルアミドを用いて高コピー数で真菌を増殖させる。
母」, Yeasts, 5巻, Anthony H RoseおよびJ Stuart Harrison編, 第2版, Academic Press Ltd.)によって与えられる。
オチド配列を酵母での発現のために設計された構築物中に挿入することによって調製される。異種発現に使用されるいくつかのタイプの構築物が開発されている。構築物は、本発
明のヌクレオチド配列に融合される酵母中で活性なプロモーターを含み、通常は、GAL1プロモーターのような酵母起源のプロモーターが使用される。通常、SUC2シグナルペプチドをコードする配列のような、酵母起源のシグナル配列が使用される。酵母中で活性なターミネーターは、発現系を終結させる。
て調製され得る。
はAgrobacterium rhizogenes由来のRiプラスミドの使用に基づく。Anら(1986), Plant Physiol. 81,301-305およびButcher D.N.ら(1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists,D.S. IngramsおよびJ.P. Helgeson編, 203-208。
けるために、好ましくはT-DNAの末端配列間またはT-DNA配列に隣接するTiプラスミドに挿入されるべきである。なぜなら、少なくとも1つのこれらの領域が植物ゲノムへの改変されたT-DNAの挿入に必須であるようであるからである。
ミドまたはAgrobacterium rhizogenes Ri-プラスミド、あるいはそれらの誘導体であり、これらのプラスミドは周知でありそしてトランスジェニック植物の構築に広く用いられるので、これらのプラスミドまたはその誘導体に基づく多くのベクター系が存在する。
合、必要ならば、適切なAgrobacterium株、例えば、Agrobacterium tumefaciens中に移される。したがって、本発明のヌクレオチド配列または構築物を有するTi-プラスミドは、
本発明のヌクレオチド配列または構築物を有するAgrobacterium細胞を得るために、好ま
しくは、適切なAgrobacterium株、例えば、A. tumefaciens中に移され、DNAは続いて改変されるべき植物細胞中に移される。
。ベクターとして、例えば、pBR 322、pUCシリーズ、M13 mpシリーズ、pACYC184などが挙
げられる。
されそして次のDNA配列と連結され得る。各配列は、同じまたは異なるプラスミドにクロ
ーニングされ得る。
換について、植物細胞のTi-またはRi-プラスミドが使用される場合、Ti-およびRI-プラスミドT-DNAの少なくとも右の境界、しかししばしば右および左の境界が、導入された遺伝
子の領域に隣接するように、連結され得る。植物細胞の形質転換のためのT-DNAの使用は
集中的に研究されており、そしてEP-A-120516;Hoekema: The Binary Plant Vector System Offset-drukkerij Kanters B.B., Alblasserdam, 1985, 第5章;Fraleyら, Crit. Rev.Plant Sci., 4:1-46;およびAnら, EMBO J. (1985) 4:277-284に記載される。
tou(Agro-Food-Industry Hi-Tech 3月/4月 1994 17-27)を参照のこと。この技法で、植物の感染は、植物の特定の部分または組織、すなわち、葉、根、茎の一部、または植物の他の部分で行われ得る。
は、適切な培養培地で増殖され、そして成熟植物に発育させる。
クチン)とタンパク質とを接触させる工程を包含する。
素的に脱エステル化されたペクチンとタンパク質とを接触させる工程を包含する。ここで、ブロックワイズに酵素的に脱エステル化されたペクチンは、組換え酵素の使用によって調製され、そして組換え酵素は、配列番号1もしくは配列番号2に示すアミノ酸配列のいずれか1つ、またはその改変体、誘導体、もしくはホモログ(それらの組み合わせを含む)を含み、そして以下の特徴を有する:
1.約36kD〜約64kDの分子量;
2.0.15M NaCl中の0.5%ライムペクチンとともに測定した場合、pH7〜8の
至適pH;
3.最低でも50℃の至適温度;
4.10℃〜最低でも40℃の範囲における温度安定性;
5.0.07%のKm値;
6.約0.25M NaClのレベルでの最大活性;
7.約0.2M Na2SO4のレベルでの最大活性;および
8.約0.3M NaNO3のレベルでの最大活性。
1.約36kD〜約64kDの分子量;
2.0.15M NaCl中の0.5%ライムペクチンとともに測定した場合、pH7〜8の
至適pH;
3.最低でも50℃の至適温度;
4.10℃〜最低でも40℃の範囲における温度安定性;
5.0.07%のKm値;
6.約0.25M NaClのレベルでの最大活性;
7.約0.2M Na2SO4のレベルでの最大活性;および
8.約0.3M NaNO3のレベルでの最大活性。
1.約36kD〜約64kDの分子量;
2.0.15M NaCl中の0.5%ライムペクチンとともに測定した場合、pH7〜8の
至適pH;
3.少なくとも50℃の至適温度;
4.10℃〜少なくとも40℃の範囲における温度安定性;
5.0.07%のKm値;
6.約0.25M NaClのレベルでの最大活性;
7.約0.2M Na2SO4のレベルでの最大活性;および
8.約0.3M NaNO3のレベルでの最大活性。
る:NCIMB 40749(プラスミドpO34に対応する)。
んタンパク質の熱安定性に影響を及ぼすが、改変体、誘導体、ホモログ、構築物、ベクター、宿主生物の形質転換についての上記の説明は、等しく適用可能である。
ク質の熱安定性を与えるまたは増加させ得ると考えられる。このアミノ酸配列はまた、他の供給源由来のPMEを含む他のタンパク質の熱安定性を増加させまたは与え得る。
実験のセクション
生化学のための材料および方法
植物材料:種子を有さないNavelina変種クラスIの未成熟なSpanishオレンジをPMEの単離
のために用いた。このオレンジを手で皮をむき、そしてその皮を−80℃で保存した。
オレンジの皮からのPMEの抽出
PMEを以下の手順に従って精製した。全ての操作を4℃で行った。600gの冷凍したオレ
ンジの皮を解凍し、小片に切断した。次いで、それらを1200mlの緩衝液(100mM コハク酸Na pH 6.2、1mM DTT)中で2分間、Warringブレンダーでホモジナイズした。膜結合タンパク質を単離するために、36gの固体NaClをこのホモジネートに添加して、3%(w/v)
の最終濃度にした(Versteegら、(1978) Lebensmittel.-Wiss.u. Technol., 11:267-274
)。4℃で穏やかに撹拌しながら2時間インキュベートした後に、この懸濁物をナイロンメッシュで濾過し、濾液を10,000rpmで20分間遠心分離して、不溶性の残渣を除去した。
ら30%(NH4)2SO4で最初に沈殿した。20,000rpmで10分間遠心分離した後に、上清を30分間、60%(NH4)2SO4でさらに沈殿した。この懸濁物を上記のように遠心分離し、沈殿物を50mlの50mMMES、1mM DTT pH 6.8中に再懸濁し、そして同じ緩衝液に対して一晩透析した。
クロマトグラフィー
透析したサンプルを陽イオン交換クロマトグラフィーによりさらに分離した。40〜50mlのサンプルを、緩衝液A:50mM MES、1mM DTT pH 6.8でのラウンドの間に30分間の洗浄
を伴う2ラウンドで、CM-SepharoseTMCL-6B(1.5×15cm)にアプライした。緩衝液Aで非結合タンパク質を洗浄した後、結合タンパク質を、総量500mlの0〜0.4MNaClの漸増NaClグラジエントで溶出した。流速は25ml/hであり、8.33mlの画分を回収した。このタンパク質吸収プロフィールを280nmで測定した。
濃縮した。50mM Tris、1mM DTT、0.1M NaCl pH 7への緩衝液交換を同一のシステムで行った。
は40ml/hであり、5.33mlの画分を回収した。PME活性を含む画分をプールし、濃縮した。
酵素活性
PMEは、ペクチンからのメチルエステル基の切断を触媒する。精製工程の間、PMEを、メチルレッド指標試験を用いる迅速な方法によって検出した。ペクチン鎖中のガラクツロン酸残基からのメチル基の切断により、このアッセイにおいてカルボキシル基が形成され、そしてpHが低下する。pH指標-メチルレッド-は、pH低下時に黄色(pH6.2)からピンク(pH 4.2)に色が変化する。このアッセイは、0.15M NaCl pH 7中に可溶化された1mlの0.5% GrindstedTM Pectin1450(DE 70%)(Danisco Ingredients, Danisco A/Sにより供給される)および125μlのサンプルを含有した。次いで、30℃で10分間のインキュベーションの後にメチルレッド試験で陽性を示したサンプルを、滴定法(Versteegら(1978)Lebensmittel.-Wiss.u. Technol., 11: 267-274)によってさらに測定した。
される)および10〜100μlのサンプルを含有した。適定を0.02M NaOHを用いて行い、そして反応を室温で測定した。自動滴定機を用いた(Versteegら、(1978)Lebensmittel.-Wiss.u. Technol., 11: 267-274)。
SDS-PAGE/ウエスタンブロッティング
PME画分の純度を、10〜15%SDS-勾配ゲルを用いるPharmacia PhastSystemTMを用いるSDS-PAGEによって調査した。タンパク質の電気泳動および銀染色を、Pharmaciaのマニュア
ルに記載されるように行った。pIの決定のために、IEF 3-9 PhastSystemTMゲルを用いた
。
付けのために用いた。酵素画分を、SDS-PAGEで分離し、PhastSystemTMのSemidryトランスファーユニット上でのセミドライブロッティング技術によってNC-ペーパーに移した。こ
のNC-ペーパーを、1:50に希釈した一次抗体とともにインキュベートし、そして1:1000の
希釈度で用いられるアルカリホスファターゼ(Dako A/S Glsotrup, Denmark)に結合した二次抗体で染色した。
ペプチドマッピング
PMEを、トリプシンまたはLysobacter enzymogenes由来のエンド-プロテイナーゼLys-C
のいずれかで消化した(両酵素調製物は、Boerhinger Mannheim, Germanyから購入した配列決定用グレードであった)。
護した。次いで、このタンパク質をトリプシン(4μg/20〜100μl)で切断した。加水分解切断を、40℃で2×3時間行った。この反応を、20μlのTFAの添加により停止した。15,000rpmでの5分間の遠心分離の後、ペプチドを逆相HPLCカラム(Vydac10 C18カラム)で
精製した。2×500μlのサンプルをアプライした。ペプチドを、0.1%TFA中で60分間、0.05〜0.35%の漸増アセトニトリルグラジエントを用いて溶出し、そして分離した。ペプチ
ドを、Eppendorfチューブ中に手動で回収した。
後、このタンパク質をN2下で50℃にて15分間変性および還元した。室温に冷却した後、5μlの100mMヨードアセトアミドを添加し、N2下で暗所にて室温で15分間システインを誘導
体化した。続いて、90μlの水ならびに50μlの50mMトリシンおよび10mM EDTA, pH 8.0中
の5μgのエンド-プロテイナーゼLys-Cを添加し、N2下で37℃にて24時間消化を行った。
研究1
PMEの精製の間、600gの凍結したオレンジの皮をホモジナイズし、30〜60%(NH4)2SO4での沈殿および透析の後、サンプルを陽イオン交換カラム(CM-SepharoseTMCL-6B)にアプ
ライした。PMEはpH 6.8で陽イオン交換カラム材料に強固に結合したが、一方、タンパク
質のほとんどはそのカラムに結合せず、それ故洗浄容積中に溶出する。漸増NaClグラジエントにより、PMEは、0.25MのNaCl濃度でPME I(画分49〜53)において主要な活性を有す
る2つのピーク中に溶出した。微量なPMEピークが、より低濃度のNaCl(画分25〜32)で
溶出した。さらなる精製を、PME Iについてのみ行った。これは最も高い活性を含んでい
た。
おいて濃縮した。
当する。
た(図2)。PMEの等電点電気泳動は、そのPIが>9であることを示した。
特徴付けおよび動態学的データ
PMEの特徴付けおよび至適条件決定(optima determination)を、材料および方法に記
載されるような滴定方法で全て行った。
タを図3に示す。至適はpH7〜8付近に見出された。
プロットによって決定した。このデータを図6に示す。Kmは0.07%であることがカーブから計算された。
出した。サトウダイコンペクチンは、そのカルボキシル基のいくつかがメチル化されている60%のガラクツロン酸残基を含有し(約60%のDE)、さらに、ガラクツロン酸基の幾つかはC-2および/またはC-3でアセチル化されている。0.15 M NaCl中に可溶化された1%
サトウダイコンペクチンを、サトウダイコンペクチンが約60%のペクチンを含有するようなアッセイにおいて用いた以外は、PME活性を材料および方法に記載のように測定した。
結果は、ガラクツロン酸残基がC-2/C-3位でアセチル化されているとしてもPMEがサトウダイコンペクチンを脱エステル化し得たことを示した。
示した−図7のデータを参照のこと。活性は、漸増するNaCl濃度(0.25M NaClで至適である)で増大する。最大活性と比較して、より高い濃度が活性を減少させている。
N-末端分析
天然のPMEのN-末端配列がブロックされることが研究により示された。チューブ中で45
℃にて4分間、無水TFAでPVDF膜にブロットしたPMEを処理することにより、脱ブロック化を達成した。 TFAのほとんどの蒸発の後、チューブを65℃にて4時間置いた(Wellner,D.ら、(1990) Proc.Natl.Acad.Sci 87: 1947-1949)。得られた配列は、SSSVTPNVVVAADSSGNFKであった。そのN-アセチルセリンはPMEのN末端残基である。
免疫組織局在化
免疫組織化学のための組織サンプルの調製のために、成熟果物の中央部分の薄切片を、0.05Mのリン酸緩衝液pH 7で緩衝化した2%パラホルムアルデヒド、0.25%グルタルアル
デヒドおよび3%スクロース中で固定した。25℃で2時間および5℃で63時間のインキュベーションの後、検体を0.05Mリン酸緩衝液pH 7中で3×20分洗浄した。一連のエタノー
ル洗浄(50%、70%、80%および96%)、それに続く99%エタノールの3回の洗浄(各エタノール濃度について30分間)を用いて脱水を行った。石油(ShellsolTMD70k, Q7712)中で2×2時間および7%ビーズワックスを有するパラフィン中での2×2時間のさらなる処理の後、サンプルをパラフィン中に包埋した。12.5μmの横断面を、Supercut2050 Reichart Jung pyramitome上で作製した。
免疫学
PME抗体での1時間の処理の前に、組織切片をTBS(0.5M Tris/HCl pH 7.6, 0.15M NaCl, 0.1%Triton X-100)中の20%ブタ血清で30分間プレインキュベートし、TBS中に1:50で希釈した。過剰な抗体を、5×5分間のTBSでの洗浄により除去した。洗浄後、切片をTBS緩衝液中にて1:20のアルカリホスファターゼと結合した二次抗体で30分間インキュベートした。余剰の二次抗体を上述のようなTBS洗浄によって除去した。染色の前に、切片をベ
ロナールアセテート緩衝液pH 9.2で5分間処理し、次いでFast RedおよびNaphtol AS-BI
ホスフェート(Sigma no N4875)で20分間染色した。過剰な試薬を水での洗浄により除去した。コントロールを平行して実行し、免疫前の血清で処理した。
結果
皮PMEに対して惹起した抗体を用いた免疫学的局在化により、 PMEが袋間のラメラの外
側の細胞層、小胞(juice sac)の果心および外側の細胞層、アルベドの内側の細胞層に
も大量に位置することが示された(図1を参照のこと)。これらの結果は、皮PMEに対す
る抗体が果肉(袋からなる果肉、図1を参照のこと)由来のPMEと交差反応することを実
証し、皮および果肉それぞれに位置するPME間の高い相同性を示した。
研究2
オレンジの皮由来のPMEを大量に精製した。これに関して、約70mgのPMEを5kgのオレンジの皮から単離した。次いで、精製PMEをミルクタンパク質(すなわち、飲用ヨーグルト
)を用いる応用試験に用いた。この試験において、ブロックワイズの様式で酵素的に脱エステル化されたペクチンは、おそらくは形成されたブロック構造のために、非脱エステル化ペクチンと比較してタンパク質安定化特性を改善した。最終産物はまた、好適な粘度を有していた。
酵素イソ型
理論に束縛されることを意図しないが、本発明のPMEは少なくとも2つのイソ型で存在
し得ると考えられている。イソ型Sは約36kDの分子量を有し、「短PME」と称され得る。
イソ型Lは約64kDの分子量を有し、「長PME」と称され得る。
オレンジより入手可能であるペクチンメチルエステラーゼをコードするcDNAの単離および
特徴付け
分子生物学のための材料および方法
1.材料
Morocco起源のオレンジ(Citrus sinensis)var. Navelを用いた。
2.DNA
ゲノムDNAを、Dellaporta S.L.ら(1983)Plant Mol Biol Rep 1 (4):19-21に記載されるように単離した。プラスミドDNAを、EP-B-0470145に記載されるように単離した。
3.RNA
全RNAを、成熟オレンジ果物から単離した。 Logemann J., Schell J.およびWillmitzer
L. (1987) Anal. Biochem 163: 16-20、「植物組織からのRNAの単離のための改善方法」に記載される手順に従って、Navelオレンジ果物の果肉の外部部分およびアルベド層の内
部部分(図1を参照のこと)をRNA単離のために用いた。
4.PCR
全オレンジRNAを用いて、以下の温度サイクルで供給者の指示に従ってrTth Reverse PCR Kit(Perkin Elmer)で逆PCRを行った:
逆転写:
70℃ 2分
60℃ 2分
50℃ 2分
45℃ 5分
40℃ 5分
30℃ 10分
42℃ 10分
70℃ 2.5分
5℃ 浸漬
増幅(PCR):
94℃ 2分
92℃ 1分
45℃ 2分
72℃ 2分 40サイクル
72℃ 5分
5℃ 浸漬
5.PCRフラグメントのクローニング
PCRフラグメントを、供給者の指示に従ってベクターpT7Blue(Novagen)のEcoRV部位にクローン化した。
6.DNA配列決定
Auto Rad Sequencing Kit (Pharmacia)およびPharmacia LKB A.L.F. DNA sequencer(Ref:Sanger, F., Nicklen, S.、およびCoulson, A.R. (1979))を用いて、本質的にSangerら(1979) のジデオキシ法に従って、2本鎖DNAを配列決定した。DNA配列決定は鎖決定
インヒビターを用いて行った(Proc. Nat. Acad. Sci. USA 74:5463-5467)。配列決定に用いたプライマーを以下に列挙する(5’から3’に示す):
7.ライブラリーのスクリーニング
オレンジ果物の果肉およびアルベド層から単離されたmRNAから調製したλzapII(Stratagene)のcDNAライブラリーを、適切な放射標識PCRプローブでスクリーニングした。プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションを、2×SSC、0.1%SDS、10×Denhardt’sおよび100μg/mlの変性サケ精子DNA中で行った以外は、スクリーニングを供給者
の指示に従って行った。ハイブリダイゼーションは67℃で一晩であった。フィルターを、2×SSC、0.1% SDS中で2回、1×SSC、0.1% SDS中で2回、および0.1×SSC、0.1%SDS中で2回洗浄した。
8.プローブ
クローン化されたPCRフラグメントを、適切な制限酵素で消化することによりpT7 blue
ベクターから単離した。フラグメントを、アガロースゲル電気泳動により、ベクターから分離し、フラグメントを精製し、そしてReady to GoTMDNA標識化キット(Pharmacia)を用いて放射標識した。
9.サザン分析
オレンジゲノムDNAまたはプラスミドDNAを、適切な制限酵素で消化し、HybondN+TM膜に転写し、そして供給者(Amersham)の指示に従ってハイブリダイズした。
10.インサイチュハイブリダイゼーション実験
インサイチュハイブリダイゼーション技術は、mRNAへのアンチセンスリボヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションの原理に基づく。この技術は、上記のmRNAが存在する顕微鏡切片中の領域を可視化するのに用いられる。本願の場合には、この技術を、C.sinensisの切片中の酵素ペクチンメチルエステラーゼをコードするmRNAを局在化するのに用いた
。
インサイチュハイブリダイゼーション用の組織サンプルの調製
成熟オレンジ果物の中央部分の薄切片を、FAA固定法(45%エタノール、5%ホルマリ
ン (40%パラホルムアルデヒド)および5%酢酸)による固定および25℃で2時間および
5℃で63時間のインキュベーションによって固定化した。サンプルを、0.05Mリン酸緩衝
液、pH 7中で3×20分間洗浄した。一連のエタノール洗浄(50%、70%、80%、96%)を用いて脱水を行い、99%エタノール中で3回洗浄することにより終了させた。各洗浄は30分間であった。次いでこのサンプルを2×2時間石油(shellsolTMD70k, Q7712)中で、およびさらに2×2時間7%ビーズワックスを有するパラフィン中で処理した。この後、サンプルをパラフィン中に包埋した。Supercut 2050 Reichart Jung pyramitomeを用いて、12,5μmの断面を作製した。
2回目のPCR増幅由来の501bpのPCRフラグメントを、pT7blueベクター(Novagen)中に
両方向でクローン化した。pT7ベクターはT7プロモーターを含有する。アンチセンスRNAおよびセンスRNAの転写を、BamHIでプラスミドを消化した後にSP7プロモーターにより駆動
させた。Maxiscript KitTM(Ambion)を以下の改変を加えて行った。転写産物を6%配列決定用ゲルに泳動して、取り込まれたヌクレオチド取り出し、そしてT7RNAポリメラーゼインビトロ転写キット(Ambion)で供給される溶出緩衝液で溶出させた。転写産物は、一方の末端に55個の非コードヌクレオチドを、さらに他方の末端に9個の非コードヌクレオチドを含有していた。ハイブリダイゼーションのために107cpm/mlの35S標識プローブを
用いた。
記載されるように行った。ハイブリダイゼーション温度は、57℃で至適であることが見出
された。57℃での洗浄の後、切片をKodak K-5写真感光乳剤で被覆し、そして暗所で5℃
にて3日間放置した。
以下の配列情報を用いて、以下に記載したPCR反応のためのプライマーを生成し、そし
てそれぞれのヌクレオチド配列によって生成されたアミノ酸配列(添付の配列番号7〜19を参照のこと)をチェックした。
プライマーA
ATG(CT)T(GATC)GC(GATC)TA(TC)CA(AG)GA(TC)AC 256ミックス
プライマーB(Glu Ala Gln Ala Phe Thr Pro)を生成するために用いたアミノ酸配列(PE701, 7〜13)
プライマーB
GT(AG)AA(GATC)GC(TC)TG(GATC)GC(TC)TC 128ミックス
(配列は相補鎖に対応する)
ペクチンメチルエステラーゼを部分的にコードするPCR DNAフラグメントの生成
2つのオーバーラッしないペプチド(上記)のアミノ酸配列を用いて、ミックスオリゴヌクレオチドを生成した。これらを、逆転写および引き続く全RNAの増幅(PCR)のためのプライマーとして用いた。得られたPCRクローンを配列決定し、そしてそれは501bpの挿入物を有していた。ヌクレオチド配列から推定されたアミノ酸配列は、配列番号7〜19で与えられたペプチド配列とほとんど完全に一致した。
ペクチンメチルエステラーゼのmRNAに対するリボプローブ(適切なPCRクローンから産
生された)を用いるインサイチュハイブリダイゼーション実験(材料および方法を参照のこと)により、袋間のラメラの外側の細胞層における強固なハイブリダイゼーションが示された(図1を参照のこと)。強いシグナルをまた、小胞の外側の細胞層、albedoの内側の細胞層および果心から得た。これらの結果は、以前に記載された皮PMEに対して惹起さ
れた抗体で見られた免疫学的局在化の結果と非常に良好に一致する。
サザン分析により、単離されたPME遺伝子(cDNAクローンにより表される)のさらなる
コピーが、C.sinensisゲノム中に存在することが示された。これらの他のPME遺伝子は、pO17およびpO34中に表される遺伝子とかなり相同であった。
いシグナルの少なくとも2つのバンドを各レーンにおいて観察した。このパターンは、C.sinensisがゲノムに中に少なくとも5および7コピーのPME遺伝子を有することを示して
いる。
材料および方法に記載のように調製したλzapII(Stratagene)のcDNAライブラリーを
、PCRクローン由来の放射標識した501bp挿入物でスクリーニングした。いくつかのハイブリダイゼーションクローンを同定し、プラスミドDNAを供給者の指示に従ってインビボで
切り出した。クローン中のcDNA挿入物のサイズを、EcoRVおよびSmaIでの消化、それに続
くアガロースゲル電気泳動によって決定した。1方のクローンpO34は約2kbの挿入物サイ
ズを有し、一方、他方のクローンpO17は約1.4kbの挿入物サイズを有していた。これらの
クローンをさらなる分析のために選択した。ヌクレオチド配列を決定し、そしてpO17およびpO34についてそれぞれ配列番号3および配列番号4として示す。
ディングフレームは、推定上のシグナルペプチドを含む584アミノ酸のPMEをコードする。46位のグリシンと47位のイソロイシンとの間の可能な切断部位は、von Heijne, G. (1986) Nucl Acids Res 14, 4683-4690「シグナル配列切断部位を予測するための新規の方法」の規則に従って予測し、それによって58386ダルトンの計算分子量を有する538アミノ酸の長い成熟PME酵素を得た。シグナル配列を含む長PMEの分子量は、63502ダルトンとして計
算され得る。pO34ヌクレオチド配列は、29ヌクレオチドの非翻訳5’領域およびポリAテイルで終結する186ヌクレオチドの非翻訳3’領域を含む。
オチド1103で終結する。これは、44アミノ酸のシグナルペプチドを含む362アミノ酸の短PMEをコードする。推定上の切断部位は、44位のグルタミンと45位のセリンとの間に予測され得、アミノ酸配列Ser-Ser-Ser-Val-Thr-Proで開始する成熟短PMEを残す。このN末端アミノ酸配列は、生化学セクションに記載したような精製された短型のPMEのN末端アミノ
酸配列と同一である。精製酵素から得られたアミノ酸配列を、pO17の推定上の成熟アミノ酸配列と整列させた。完全な同一性をペプチドフラグメントについて見出した。
性が存在した。この点に関して、pO17は1つのアミノ酸位(成熟ポリペプチドをコードする配列における24番目)で異なる。成熟短PMEタンパク質は、33954ダルトンの計算分子量を有する。シグナルペプチドを含む短PME型の計算分子量は、39088ダルトンである。O17
は、17ヌクレオチドの5’非翻訳領域およびポリA尾部で終結する180ヌクレオチドの3’非翻訳領域を含む。
号5として表される220アミノ酸のN末端伸長部である。長PME酵素のこの領域をコードす
る対応するヌクレオチド配列を、配列番号6として示す。
オレンジPMEの長形態または短形態のいずれかをコードするDNA配列を微生物に導入し、ペクチンの酵素的処置のために使用すべき高い特異的活性を有する大量の組換え酵素を生産する。
pJK10、pJK11、およびpJK12の構築(図13〜15を参照のこと)
以下の対のプライマーを用いるPCR反応において、 pO34プラスミドDNAを鋳型DNAとして使用した:
5’-GAATTCATTGTCGCCGGAGTGAAC-3’(1つの末端にEcoRI部位を有する)、および
5’-AAGACCAGAGACCTATGGATCCAC-3’(末端の近くにBamHIを有する)。
、ならびに2つのプライマーを以下の緩衝液中で合わせ:
60mM Tris-HCl (pH 8.5)、15mM(NH4)2SO4、および1.5mMMgCl2、
そして以下の温度サイクルを用いた:
94℃ 2分
94℃ 1分
55℃ 2分
35サイクルにおいては72℃ 2分
72℃7分
5℃で浸漬
1690bpの予想されるPCR産物が生成され、これは、供給者の説明に従って、精製され、ベ
クターpT7Blue(Novagen由来)にサブクローン化した。
て1685bpのフラグメントを精製し、そして同一の酵素で消化したPchia pastorisベクターpHIL-S1(Invitrogen由来)にサブクローン化した。
図13に示す。
メントを、同じ酵素で消化したpBSK-ベクター(Straragene由来)にさらにサブクローン
化した。次いで、得られたクローンの1つに由来するEcoRI-NotIフラグメント(DNA配列
決定によって確認された)を、同じ酵素で消化したPichia pastoris発現ベクターpPIC9(Invitorogen由来)にサブクローン化した。これにより、長形態のPMEの成熟タンパク質をコードするリーディングフレームは、下流、およびpPIC9中のα因子分泌シグナル(S)の下流またはそれとインフレームで配置される。図14を参照のこと。
ターにサブクローン化して、図15に示すpJK12プラスミドを作製した。pJK11とpJK12との
間の差異は、カナマイシンに対する耐性をコードする遺伝子のみであり、そしてこれはpJK12中に位置する。
以下のプライマーを用いるPCR反応において、 pO17プラスミドDNAを鋳型DNAとして使用
した:
5’-GAATCCTCTCCTCGTCGGTGACACCG-3’(1つの末端にEcoRI部位を有する)、および
5’-AAGACCAGAGACCTATGGATCCAC-3’(末端の近くにBamHI部位を有する)。
94℃ 2分
94℃ 1分
55℃ 2分
35サイクルにおいては2℃ 2分
72℃7分
5℃浸漬
これにより1008bpの予想されるPCRバンドを産生し、これを精製し、そしてpT7Blue(Novagen)にサブクローン化した。得られたクローンを、上記に説明したようにDNA配列決定によって確認した。適正な配列を有するプラスミドを、EcoRIおよびBamHIで消化し、そして得られたフラグメントをさらにpHIL-S1ベクター(Invitrogen)にさらにサブクローン
化し、得られたプラスミドをpJK20(図16を参照こと)と呼ぶ。そしてこれにより、PMEの短形態の成熟ポリペプチドをコードする領域が、PHO1分泌シグナルのインフレームに、そしてその下流に配置される。
プラスミドpJK10、pJK11、pJK12、pJK20、pJK21、およびpJK22を、Pichia pastoris GS115細胞への分離実験において導入した。
中で、28〜30℃で増殖させたGS115細胞から調製した。スフェロプラストの調製および形
質転換手順を、Pichia発現キット:Instruction Manuzl(Invitrogen)に記載のように行った。次いで、得られたPchiapastoris Mut+またはMuts形質転換体を、組換えPME遺伝子の発現について、Biochemistryの材料および方法に記載の方法を用いてPME活性について
上清をアッセイすることによって分析した。
推定のポジティブな形質転換体を、最少培地(Pichia 発現キットInstruction Manual,Invitrogenに詳述されるMinimal Dextrose MediumまたはMinimal Glycerol Mediumのいずれか)中でさらに増殖させ、そしてゲノムDNAを単離し、そしてInstructionManualに記
載のPCRによって分析した。
手順に従って、28〜30℃でフラスコ中でさらに増殖させた。
な発現レベルを2〜6時間毎にサンプリングすることによって経時的に過剰時間を測定した。サンプル中の細胞をペレット化し、そしてMaterials and Methods for Biochemistryに説明された方法に従ってPME活性について上清をアッセイした。
質を発現することが示された形質転換対を選択し、そしてウェスタンブロット分析(Materials and Methods for Biocheistryを参照のこと)によってさらに分析した。
組換えPMEタンパク質を、必要に応じてMaterials and Methods for Biochemistryに記
載の手順を用いて培養上清から精製した。
℃〜40℃の間、そして組換え長PMEについては80℃までであることが見出されたことを示
した。
別の実施態様において、pO34またはpO17を適切な制限酵素で消化し、そして本発明のPMEの長形態または短形態のコード配列をAspergillusnigerでの発現のためにAspergillus
発現ベクターpBAMTE1(Neurospora crassas由来のメチルトリプトファン耐性プロモータ
ーを含む)にクローン化した(Pallら、(1993) Fungal Genet Newslett.第40巻 59〜62頁)。
の形質転換は、形質転換されたプロトプラストをプレーティングすることについてはPuntら(Methods in Enzymology (1992) 第216巻447〜457頁)に記載のプロトコルに従ったが0.6%の浸透左安定性のトップアガロースを用いた以外は、Buxtonら(Gene (1985) 第37巻
207〜214頁)に記載のプロトコルに従った。
ることを示した。
タンパク質飲料の粘度および安定性に対するペクチンで処置されたオレンジPMEの効果
方法
オレンジから誘導可能なPMEを用いたペクチンの酵素処理
酵素的に処理されたペクチンのバッチを以下のように調製した:
125gのペクチンを、有効な撹拌下で熱湯に溶解した。45.3gのNaCl(試薬グレード)を
添加し、そして容積を水で4.0 lに調整した。この溶液を、塩が溶解するまで撹拌した。
このペクチン溶液を40℃に冷却し、そして1NのNaOH(試薬グレード)を用い、そして有
効に撹拌してpHをpH7.0まで増加させた。オレンジPMEの適切なサンプルを添加し、そして所望の程度のエステル化が達成されるまで、酵素反応を続けた。インキュベーションの間、1NのNaOH(試薬グレード)の自動投与によってpHをpH7に一定に保ち、そして酵素反
応をNaOHの消費によって追跡した。
カルシウム感受性指標(CF)のためのペクチンサンプルの測定
ペクチン1gあたり57.6mgのカルシウムを有する溶液中に溶解したペクチンの粘度を、
溶液中の正確に同量のペクチンの粘度(しかし、カルシウムを添加しない)で割った比としてカルシウム感受性を測定する。非カルシウム感受性ペクチンは、1のCF値を有する。
℃に冷却し、そしてpHを1NのHClで1.5に調セクションする。ペクチン溶液を水で700mlに調セクションし、そして撹拌した。この溶液の145gを4つの粘度ガラス(viscosityglass)中に個々に測り入れる。10mlの水をこのガラスうちの2つに添加し(二重測定)、そ
して10mlの250mM CaCl2溶液を残りの2つのガラスに撹拌下で添加する。
スを20℃で一晩放置する。翌日に粘度をBrookfieldの粘度計を用いて測定する。カルシウム感受性指標を、以下のように計算する:
50mlの60%イソプロパノールおよび5%のHCl溶液に、2.5gのペクチンサンプルを添加
し、そして10分間撹拌する。ペクチン溶液をガラスフィルターを通して濾過し、そして15mlの60%イソプロパノール/5%HCl溶液で6回洗浄し、その後さらに60%のイソプロパノールでフィルターに塩素がなくなるまで洗浄した。フィルターを80℃で一晩乾燥する。
滴のフェノールフタレインを添加した。これを0.1NのNaOHで永久的な色素変化が得られるまで滴定した。0.5NのHClは、0.5NのNaOHよりわずかに強いはずである。0.1NのNaOHの添
加した容積をV0として表す。
ンプルを96%エタノールで湿らせる。最近ボイルし、そして冷却した100mlの蒸留水を添
加し、そして得られた溶液をペクチンが完全に溶解するまで撹拌する。次いで、5滴のフェノールフタレインを添加し、そしてその溶液を0.1NのNaOHで滴定する(色が変化し、そしてpHが8.5まで)。ここで使用した0.1NのNaOHの量を、V1として表す。20.0mlの0.5NのNaOHを添加し、そしてフラスコを強く振り、次いで15分間放置する。20.0mlの0.5NのHClを添加し、そしてピンク色が消えるまで振る。次いで、3滴のフェノールフタレインを添加し、次いで、得られた溶液を0.1NのNaOHで滴定する。使用した0.1NのNaOHの容積をV2として表す。
標準化した脱脂乳(粉状のミルクを適切な容量の水と混合して調整した)を、90℃で5分間加熱し、次いで200kp/cm2でホモジェナイズし、そしてミルクを31℃に冷却した。ヨ
ーグルト培養物を添加し、そしてそのミルクを約pH4.0まで発酵した。ヨーグルトを20℃
に冷却し、そしてペクチンサンプルを飽和糖溶液(約65%糖)として添加し、そして15分間撹拌した。pHを乳酸でpH4.0に調整した。ヨーグルトを88℃で15秒間低温殺菌し、そし
て150kp/cm2でホモジェナイズし、次いで20℃に冷却し、そして滅菌した250mlの青キャップボトル中に満たした(200ml/ボトル)。
クチンサンプルであり、総固形分はそれぞれ17.0%または17.10%であった。
ヨーグルトサンプルの粘度を、18.5〜46.0の剪断速度(shear rate)を有するBohlin RheometerTM(Bohlin Instrumentsより供給された)または同一の剪断速度を有するStressTechTM(Rheologica instrumentsAB)のいずれかを用いて決定(二重決定)した。
20gのサンプル(例えば、飲用ヨーグルト)を、10℃で20分間、2300×gで遠心分離する。上清を捨て、そして遠心分離ガラスを30分間逆さまにした。ガラスを計量し、そして沈降%を以下のように計算した:
サンプルにおける粒子サイズ分布によって判断されるタンパク質の安定性
ヨーグルトサンプルの粒子サイズ分布を、Malvern 2600 EasyTM サイズ測定器の使用により決定した。粒子サイズを、この方法によるレーザー光散乱によって決定する。1mlのヨーグルトサンプルを9mlの脱気(de-areated)緩衝溶液(30.7%の0.1Mクエン酸、19.3
%の0.2M Na2HPO4、および50.0%水)に添加し、そして混合した。脱気した緩衝液を測定するガラスに添加し、そしてサンプル/緩衝液の混合物を最適な濃度が得られるまで滴下によって添加する。平均の粒子サイズは、測定から計算される。
、約10μm以上を越える平均粒子サイズを有するヨーグルトは、長期保存において安定で
はないと考えられる。
サンプルを4℃または室温で保存し、そしてホエー分離を測定した(ボトル中のサンプルの上部におけるホエーのmmにおいて)。サンプルを250mlの青いキャップのボトル(二
重決定)に満たした。各場合におけるサンプルの深さは、約70mmであった(これは、各ボトルの200mlのマークに対応する)。
サワーミルク乳飲料
ペクチンをサワーミルク乳飲料(例えば、ヨーグルト飲料)に添加する目的は、飲料の細菌学的および感覚による有効期間の間、物理的に均一なままの飲料を生産することである。さらに、ペクチンを添加しない場合、長期貯蔵のためのヨーグルト飲料の処理により、飲料中のタンパク質が不安定化し、砂っぽい舌触りのある飲料となり、そしてかなり早期にシネレシスを示す。
市販の高エステルペクチン;GrindstedTMPectin URS(Ultra Rapid Setpectin型)を
、その高いエステルレベル(82の%DE、図19参照のこと)のために、母ペクチンとして選択した。この母ペクチンのオレンジPME酵素での処理を、方法のセクションで説明する。
に含めた。
ンジPME酵素での母ペクチンのさらなる処理によって生産され得る。なぜなら、このペク
チンは14のΔCFを有していたからである。
ヨーグルトを方法のセクションで説明したように生産した。3つのペクチン(GrindstedTM Pectin URS、ペクチン1944-96-2、およびGrindstedTMPectinAM453)を、以下の調製法において個々に用いた:
7.6%MSNF(乳固形分)、9.15%砂糖、および0.25%または0.35%ペクチンサンプルを
用いると、最終産物中で、それぞれ17.0%または17.10%の全固形分となった。
ヨーグルトの沈降(%)
離を示し、そして用いられた両方のペクチン濃度(0.25および0.35%)で不安定であったことが明らかである。これは驚くことではない。なぜなら、通常URSペクチンのタイプは
、熱処理されたタイプのヨーグルトの長期保存のための安定化に用いられ得ないからである。
れた両方のペクチン用量で安定性、および上記の結果に見られるように低い沈降を示し、そして乳清の分離は何ら示さなかった。これに対して、ヨーグルト生産に通常用いられる良質のGrindstedTMPectin AM453もまた、予想されたように低い沈降を示し、そして乳清の分離のない安定なヨーグルトを生産した(上記の結果を参照のこと)。
ヨーグルトの粒子サイズ(μM)
生産物の平均値である。
の平均の粒子サイズは、用いられた両方のペクチン用量において小さい(上記の結果を参照のこと)。これらのペクチンのタイプを用いて生産されたヨーグルトが、安定なヨーグ
ルトを生産するのに適していることがまた示される。
ヨーグルトの粘度(MPa)
両方のペクチン濃度でやや高い。沈降の度合いが低くそして小さい粒子サイズを有する安定なヨーグルトを生産した良質のGrindstedTMPectin AM453は、 0.25%ペクチン用量に
おいてGrindstedTM Pectin URSペクチンを用いたときに見られた粘度の約半分の粘度、そして0.35%ペクチン用量においてURSペクチンをほぼ同じ粘度(AM453ペクチンのみが安定なヨーグルトを生産したという事実とは無関係に)を示した。
。なぜなら、添加されたペクチンの量が増加(0.25から0.35%まで)すると、ほぼ2倍粘度の高いヨーグルトが生産されたからである。
単位増加するだけであるが、AM453の場合、0.25%から0.35%に変えると、19単位増加す
る。
乳清ジュース飲料
(上記のように調製された)本発明の改変されたペクチンを、以下のように乳清ジュース飲料において用いた:
水に溶解した。このペクチン溶液を5℃未満に冷却し、そして乳清を5℃において添加した。Grindsted着香料(Danisco Ingredients,Danisco A/Sにより供給される)およびジュースをゆっくり添加し、そしてサンプル混合物中のpHをクエン酸または乳酸でpH 4.0に調セクションした。サンプル混合物を、撹拌しながら約30分間熟成した。低温殺菌を80℃で15秒間行い、そして均質化を200bar(2900psi)で行った。サンプルを20℃にまで冷却し、
そして無菌的に容器に満たした。
された安定性および長期的安定性が、コントロール試験で用いた参照ペクチンに比較して示された。さらに、乳清ジュース飲料は、コントロール飲料よりも低い都合の良い粘性を有していた。
れ加工した(すなわち、本発明のPMEで改変した)。その結果により、PME改変ペクチンが
、非改変ペクチンと比較して、また参照ペクチンと比較して、改善されたタンパク質安定性を有することが実証された。
ミルク/果汁飲料
GrindstedTMURS(Danisco Ingredients, Danisco A/Sから入手した)を、ヨーグルト飲料について記載したように、PMEで改変した。改変ペクチンを、以下を含むミルク/果汁飲料において用いた:
溶液を5℃未満に冷却し、そしてミルクを5℃で添加した。Grindsted着香料およびジュ
ースをゆっくり添加し、そしてサンプル混合物中のpHを(必要であれば)クエン酸または乳酸でpH 4.0に調セクションした。サンプル混合物を、乳清ジュース飲料について記載のように熟成させ、低温殺菌し、そして均一化した。サンプルを20℃に冷却し、そして無菌的に容器に満たした。
を有していた。改善された機能性もまた観察された。
乳清安定性
酵素で改変されたペクチンをpH 4.0で試験した。得られたペクチン溶液のpHを、KOH/HClでpH 4.0に調セクションした。ペクチン濃度を、1.0%に調整した。ペクチンを濃度0.1
%〜0.25%において試験した。ペクチン、Jenness緩衝液(以下を参照のこと)、および
乳清溶液(以下を参照のこと)を混合し、そして96℃にて25分間加熱した。室温に冷却した後、吸光度を500nmで測定した。
乾燥混合Jennessの緩衝液:
乾燥粉末Jenness(Jenness, RおよびKoops, J Preparation and Properties of a salt
solution which simulates milk ultrafiltrate, Nederlands Melk-enZuiveltijdschrift、第16巻 nr3、153-164頁、1962):
15.80g KH2PO4
5.08g K3シトレート
17.91g Na3シトレート,2H2O
1.80g K2SO4
13.20g CaCl2,2H2O
5.02g Mg3シトレート,H2O
3.00g K2CO3
10.78g KCl
緩衝液:
pH 4.0の7.5900g/lの乾燥粉末Jennessの水溶液。
乳清溶液
乳清タンパク質の濃縮物を凍結乾燥し、そして粉末化した。0.40%w/wの乳清タンパク
質の溶液を、Jenness緩衝液中でpH 4.0で調製した。
ペクチン溶液
1%w/wのペクチン水溶液をpH 4.0で作製した。
混合物濃度:
ペクチン、Jenness緩衝液、および乳清溶液を、以下の表に示すように混合した。混合
物を、25分間96℃に加熱し、そして室温に冷却してから、サンプルを分光光度計で500nm
において測定した。
結果を以下の表に示す。上述の500nmでの吸光度の値は、2つの測定から得た平均値で
ある。種々の異なるタイプのペクチンおよび本発明の酵素的に改変されたペクチンの比較のために、非改変ペクチンであるGrindstedTMPectin 3450(Danisco Ingredients, Danisco A/Sから供給された)についての指標を100に設定する。
いタンパク質の安定性を示す。指標≦95は、非常によいタンパク質の安定性を示す。
して、安定性を増加するのに都合の良い特性、そしていくつかの場合には非常によい特性を示す。
長期の有効期間を有する低pHのラバン飲料
ラバン(Laban)飲料は、pH値が4.2より低い酸性化した乳飲料である。ラバン飲料は、ペクチン溶液と混合したラバンベースからなる飲料である。ラバンベースの処方は以下の通りである:
品を無菌的に容器に満たす。
オレンジジュース(タンパク質富化)
オレンジジュース飲料は、2%のDANPROLACT 40TM(Central Soya, Aarhus A/S)、6%の砂糖、10%のオレンジ濃縮物、0.4%のレモン濃縮物、0.2%のペクチン、および81.4%の水を含む酸性化された飲料(pHは約4)である。この製品は、大豆タンパク質を富化したオレンジジュースである。この製品は、低温殺菌および均質化されている。20〜25℃に冷却した後、この製品を無菌的に容器に満たし、そして約6ヶ月間、室温で貯蔵することが可能である。本発明の酵素的に改変されたペクチンをオレンジ飲料に添加(タンパク質添加)すると、都合の良い特性(例えば、長期安定性)を示し、そしてこれは良い口当たりであった。
抗体産生
抗体を本発明の酵素に対して生じさせた。つまり、N HarboeおよびA Ingild(「Immunnization, Isolation of Immunoglobulins, Estimation of Antibody Titre」In A Manualof Quantitative Immunoelectrophoresis, Methods and Applications, N H Axelsenら、(編)、Universitetsforlaget, Oslo, 1973)およびT G Cooper(「The Tools of Biochemistry」、JohnWiley & Sons, New York, 1977)に従って記載された手順に従い、精製された酵素をウサギに注射し、そして免疫グロブリンを抗血清から単離することにより抗体が生じた。
Claims (1)
- 明細書に記載のプロセス。
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