PT752860E - Androstanos e pregnanos para modulacao alosterica do receptor de gaba - Google Patents

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Haiji Xia
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Description

84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ
DESCRICÀO “Androstanos e pregnanos para modulação alostérica do receptor de GABA” O presente invento refere-se a métodos, composições e compostos para a modulação da excitabilidade cerebral animal (e humana), através do complexo ionóforo receptor do ácido gama-aminobutírico (GABA.O-cloreto (GRC). Especificamente, o presente invento refere-se a métodos, composições e compostos para a modulação da excitabilidade cerebral através da ligação ao local do receptor de neuroesteróides no GRC.
Antecedentes do invento A excitabilidade cerebral é definida como o nível de excitação num animal, um contínuo que varia entre o coma e convulsões, e que é regulado por vários neurotransmissores. Em geral, os neurotransmissores são responsáveis pela regulação da condutância dos iões através das membranas neuronais. Em repouso, a membrana neuronal possui um potencial (ou voltagem membranar) de aproximadamente -80 mV, sendo o interior da célula negativo em relação ao exterior da célula. O potencial (voltagem) é o resultado do balanço de iões (K~. Na~, Cl\ aniões orgânicos) através da membrana neuronal, semipermeável. Os neurotransmissores estão armazenados em vesículas pré-sinápticas e são libertados sob a influência de potenciais de acção neuronais. Quando libertados para a fenda sináptica, um transmissor químico excitatório, tal como a acetilcolina, irá provocar a despolarização da membrana (alteração do potencial de -80 mV para -50 mV). Este efeito é mediado pelos receptores nicotinicos pós-sinápticos, que são estimulados pela acetilcolina para aumentar a permeabilidade da membrana aos iões Na-. O menor potencial de membrana estimula a excitabilidade neuronal na forma de um potencial de acção pós-sináptico.
No caso do GRC, o efeito na excitabilidade cerebral é mediado pelo GABA, um neurotransmissor. O GABA tem uma influência marcada na excitabilidade total do cérebro, pois até 40% dos neurónios no cérebro utilizam o GABA como neurotransmissor. O GABA regula a excitabilidade de neurónios individuais, regulando a condutância dos iões cloreto através da membrana neuronal. O GABA interage com o seu local de reconhecimento no GRC para facilitar o fluxo de iões cloreto a favor de um gradiente electroquímico do GRC para dentro da célula. Um aumento intracelular nos níveis deste anião origina a hiperpolarização do potencial transmembranar, tomando o neurónio menos susceptível de "inputs" excitatórios (i.e. menor excitabilidade neuronal). Por outras palavras, quanto maior for a concentração de iões cloreto no neurónio, menor será a excitabilidade cerebral (o nível de excitação). 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ 2
Está bem documentado que o GRC é responsável pela mediação da ansiedade, actividade de ataques e sedação. Assim, o GABA e as drogas que actuam como o GABA ou que facilitam os efeitos do GABA (e.g. os barbitúricos de utilidade terapêutica e as benzodiazepinas (BZs) como o Valium) produzem os seus efeitos de utilidade terapêutica através da interacção com locais regulatórios específicos no GRC.
Também se observou que uma série de metabolitos esteróides interagem com o GRC para alterar a excitabilidade do cérebro (Majewska, M.D. et al, "Steroid hormone ruetabolites are barbiturate-like modulators of the GABA receptor", Science 232:1004-1007 (1986) ; Harrison, N.L. et al., Structure-activity relationships for steroid interaction with the gamma-aminobutyric acid-A receptor complex", J. Pharmacol. Exp. Ther. 241:346-352 (1987) ). Anteriormente ao presente invento, a utilidade terapêutica destes metabolitos esteróides não foi reconhecida pelos peritos na arte devido a uma compreensão incompleta da potência e local de acçào. O invento do requerente refere-se em parte a uma aplicação farmacêutica do conhecimento ganho a partir de uma maior compreensão da potência e local de acção de alguns compostos esteróides.
Verificou-se que a hormona do ovário progesterona e os seus metabolitos têm efeitos marcados na excitabilidade cerebral (Backstrom, T. et al.. "Ovarian steroid hormones: effects on mood, behaviour and brain excitability", Acta Obstei. Gynecol. Scand. Suppl. 730:19-24 (1985); Pfaff D.W. e McEwen, B.S., "Actions of estrogens and progestins on nerve cells" Science 279:808-814 (1983); Gyermek et ai. "Structure activity relationship of some steroidal hypnotic agents", J. Mecl. Chem. 77:1 17 (1968); Lambert, J. et ai, "Actions of synthetic and endogenous steroids on the GABA,\ receptor", Trends Pharmacol, 8:224-227 (1987)). Os níveis de progesterona e os seus metabolitos variam com as fases do ciclo menstrual. Está bem documentado que a progesterona e os seus metabolitos aumentam antes do início da menstruação. A recorrência mensal de alguns sintomas físicos antes do início da menstruação está também bem documentada. Estes sintomas, que foram associados com o sindrome pré-menstrual (PMS) incluem stress, ansiedade e enxaquecas (Dalton, K., Premenstrual Syndrome and Progesterone Therapy, 2a edição, Chicago: Chicago Yearbook, 1984). As pacientes com PMS têm uma recorrência mensal dos sintomas que estão presentes antes da menstruação e ausentes após a menstruação.
De modo semelhante, uma redução na progesterona tem sido também temporalmente correlacionada com um aumento na frequência dos ataques em fêmeas epilépticas (i.e. epilepsia catamenial; Laidlaw, J., "Catamenial epilepsy", Lancet, 1235-1237 (1956)). Foi observada uma correlação mais directa com um decréscimo nos metabolitos de progesterona (Rosciszewska et al., "Ovarian hormones. anticonvuisant drugs and seizures during the
84 866 ΕΡ Ο 752 860 ί ΡΤ λ J) menstrual cycle in women with epilepsy" J. Neurol. Neitrosurg. Psych. -/9:47-51 (1986)). Para além disso, para pacientes com epilepsia de "petit mal” primária generalizada, a incidência temporal de ataques tem sido correlacionada com a incidência de sintomas do síndrome prémenstrual (Backstrom, T. et al., "Endocrinological aspects of cvclical mood changes during the menstrual cycle or the premenstrual svndrome", J. Psychosom. Obstet. Cynaecol. 2:8-20 (1983)). Tem-se verificado que o esteróide desoxicorticoesterona é eficaz no tratamento de pacientes com episódios epilépticos, correlacionados com os seus ciclos menstruais (Aird, R.B. e Gordan. G.,11 Anticonvulsive properties of deoxycorticoesterone", J. Amer. Med. Soc. /45:715-719(1951)).
Um síndrome também relacionado com níveis baixos de progesterona é a depressão pós-natal (PND). Imediatamente após o nascimento, os níveis de progesterona descem drasticamente, levando ao aparecimento da PND. Os sintomas da PND variam desde uma depressão suave a psicose com necessidade de hospitalização; a PND está associada com uma ansiedade e irritabilidade graves. A depressão associada à PND não pode ser tratada com os anti-depressivos clássicos e as mulheres que sofrem de PND apresentam uma -.ncidência maior de PMS (Dalton. K., 1984).
Em conjunto, estas observações implicam um papel crucial para a progesterona e desoxicorticoesterona e mais especificamente dos seus metabolitos na regulação homeoestática da excitabilidade cerebral, que se manifesta como um aumento na actividade dos ataques ou sintomas associados com a epilepsia catamenial, PMS e PND. A correlação entre os níveis reduzidos de progesterona e os sintomas associados com o PMS, PND e epilepsia catamenial (Bacstrom et al., 1983; Dalton, K., 1984) levou à utilização de progesterona para o seu tratamento (Mattson et al.. "Medroxyprogesterone therapy of catamenial epilepsy", in Advances in epileptology: XVth Epilepsy International Symposium, Raven Press, New York, 279-282, 1984 e Dalton, K.. 1984). No entanto, a progesterona não é consistentemente eficaz no tratamento dos síndromes acima mencionados. Por exemplo, não existe nenhuma relação dose-resposta para a progesterona no tratamento do PMS (Maddocks et al., "A double-blind placebo-controlled trial of progesterone vaginal suppositories in the treatment of premenstrual svndrome", Obstet Gynecol. 154:573-581 (1986); Dennerstein, et al., British Meclical Journal 299:16-17 (1986)).
Sumário do invento
De acordo com um primeiro aspecto do presente invento, proporciona-se um composto de fórmula:
84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ
em que: R é hidrogénio, halogéneo, alcoxi inferior, dialquilamino, alquilo, 1-alcinilo opcionalmente substituído ou alquilo substituído;
Ri é hidrogénio, alquilo opcionalmente substituído, alcenilo opcionalmente substituído, arilo opcionalmente substituído, aralquilo opcionalmente substituído, alcinilo opcionalmente substituído, aralcinilo opcionalmente substituído, alcoxialquilo, aminoalquilo, ciano, cianoalquilo, tiocianoalquilo, azidoalquilo, aralcinilo substituído, arilalquilo, arilalcenilo, aralquilalcinilo opcionalmente substituído, alcanoíloxialcinilo, heteroariloxialcinilo opcionalmente substituído, oxoalcinilo ou um cetal seu derivado, cianoalcinilo, heteroarilalcinilo opcionalmente substituído, hidroxialcinilo, alcoxialcinilo, aminoalcinilo, acilaminoalcinilo, mercaptoalcinilo, hemi-éster de ácido hidroxialquinil dióíco ou um sal seu derivado, ou alciniloxialcinilo; R2 é hidrogénio, hidroxi, alcoxi, alcanoíloxi, carbalcoxilo, um grupo ceto ou grupo amino; R3 é um grupo heteroarilacetilo opcionalmente substituído; R4 é hidrogénio ou metilo, R5 é hidrogénio; Rí, é hidrogénio, alcanoílo, aminocarbonilo ou alcoxicarbonilo; R7 é hidrogénio, halogéneo, hidroxi, alcoxi, alcanoíloxi ou carbalcoxilo;
R-8 é hidrogénio ou halogéneo;
Ro é hidrogénio, halogéneo, alquilo, alcoxi. arilalcoxi ou amino e
Rio é hidrogénio, halogéneo, alquilo, halogenoalquilo, hidroxi, alcoxi, alcanoíloxi, carbalcoxilo, ciano, tiociano ou mercapto; n 11 ou um 3-éster seu derivado fisiologicamente aceitável, sendo os termos "alquilo", alcenilo", "alcinilo", "alcoxi". "arilo", "aralquilo", "alcanoíloxi", "carbalcoxi", dialquilamino", "amino", "opcionalmente substituído", "inferior" como aqui definido.
De acordo com um segundo aspecto do presente invento, proporciona-se uma composição farmacêutica que compreende um composto de acordo com o primeiro aspecto do invento e um transportador farmaceuticamente aceitável.
Noutros aspectos, o invento proporciona a utilização de um composto de acordo com o primeiro aspecto do invento na preparação de um agente para - modular o complexo ionóforo receptor de GABAA-cloreto num animal, através da ligação a um local de neuroesteróides, no referido complexo; - tratar ou prevenir o stress ou ansiedade num animal; - aliviar ou prevenir a actividade de ataques num animal; - aliviar ou prevenir a insónia num animal; - aliviar ou prevenir o PMS ou a PND num animal; - tratar ou prevenir desordens de disposição, de preferência depressão, num animal; e - induzir anestesia num animal. O presente invento é direccionado para métodos, composições e compostos para a modulação da excitabilidade cerebral. Mais particularmente, o invento refere-se à utilização de derivados esteróides hidroxilados em 3a, que actuam num local identificado de novo no complexo GR, para modular a excitabilidade cerebral de um modo que irá aliviar o stress, ansiedade, insónia, desordens de disposição (como depressão), que são tratáveis com agentes 6 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ activos no GR, e actividade de ataques. As composições e compostos eficazes para este tratamento estão no âmbito do invento.
Os compostos utilizados no, e que fazem parte do, invento são moduladores da excitabilidade do sistema nervoso central, mediado pela sua capacidade de regular os canais iónicos de cloreto associados com o complexo receptor de GABAa. As experiências do requerente estabeleceram que os compostos utilizados no, e do, invento têm uma actividade anticonvulsiva e ansiolítica semelhante às acções de agentes ansiolíticos conhecidos, como as BZs, mas actuam num local distinto no complexo GR. A relação entre os metabolitos endógenos de progesterona com processos associados com a reprodução (ciclo estral e gravidez) está bem estabelecida (Marker, R.E.. Kamm, O., e McGrew, R.V., "Isolation of epipregnanol-3-one-20 from human pregnancy urine", J. Am. Chem. Soc. 59:616-618 (1937)). Anteriormente ao presente invento não foi, no entanto, reconhecido o modo de tratar desordens através da modulação da excitabilidade cerebral, através da utilização de metabolitos de progesterona e seus derivados. Assim, o presente invento é direccionado para métodos, composições e compostos para tratar desordens, através da modulação da excitabilidade cerebral, utilizando os compostos do presente invento. As desordens representativas tratadas no presente invento são a epilepsia, ansieadade, síndrome pré-menstrual (PMS), depressão pós-natal (PND), desordens de disposição (como a depressão) que são tratáveis com agentes activos no GR, e insónia. Os compostos do invento também podem ser utilizados para induzir anestesia.
Descrição sumária das figuras O presente invento poderá ser melhor compreendido e as suas vantagens apreciadas pelos peritos na arte, reportando às figuras juntas, em que:
As FIGs IA e 1B são gráficos da percentagem de ligação de [3“S] t-butilbiciclofosforotionato ([''5S]TBPS) a membranas celulares de cérebro de rato vs. o log da concentração de alfaxalona (também designada por alfaxalona) e de GABA, em várias concentrações de (+)bicuculina. A FIG 2 mostra a dissociação em função do tempo de [J3S] TBPS 2 nM de homogenatos P2 corticais de rato, iniciada pela adição de TBPS 2 uM (), 3α5αΡ 1 μΜ (□), pentobarbital de Na 100 μΜ (·) e 3α5αΡ 1 μΜ + pentobarbital de Na 100 μΜ (o). A FIG. 3 é um gráfico que mostra 0 efeito de uma dose única de pentobarbital na 7 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ modulação por 3a-OH-5a-pregnan-20-ona (3α5α-Ρ) da ligação de [3H]-flunitrazepam em homogenatos de hipocampo de rato. A FIG. 4 é um gráfico do efeito da 3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona, 3a,21-di-hidroxi-5cc-pregnan-20-ona (5a-THDOC) e R5020 (promegesterona) na inibição da ligação de [j:>S]TBPS em homogenatos de córtex cerebral de rato. A FIG. 5 é um gráfico da correlação entre a ligação de TBPS e a actividade electroftsiológica de 15 esteróides hidroxilados em 3a diferentes. A FIG. 6 é um gráfico do efeito da 3a-OH-5a-pregnan-20-ona, 5a-pregnan-3a,20a-diol e 5P-pregnan-3a,20P-diol na inibição da ligação de [JiS]TBPS em homogenatos de córtex de rato. A FIG. 7 é um gráfico que mostra o efeito da 3a-OH-5a-pregnan-20-ona, 5a-pregnan-3a,20a-diol e 5p-pregnan-3a.20p-diol na corrente evocada pelo GABA em oócitos de Xenopus injectados com a subunidade α1β1γ2Ι_ do receptor de GABA recombinante humano. A FIG. 8 é um gráfico linear do número de transições de luz para escuro que ocorrem dentro de dez minutos após a injecção de 3a-OFI-5a-pregnan-20-ona e 3a-OH-5p-pregnan-20-ona. A FIG. 9A e 9B são dois gráficos lineares da percentagem de (A) entradas para e (B) o tempo de permanência nos braços abertos, durante um período de teste de cinco minutos de 3a-OH-5a-pregnan-20-ona e 3a-OFl-5p-pregnan-20-ona no teste do labirinto-mais elevado. A FIG. 10 é um gráfico linear da alteração em ratos punidos que respondem em relação à linha de base para 3a-OH-5a-pregnan-20-ona e 3a-OH-5P-pregnan-20-ona, no teste de Geller Seifter. A FIG. 11 é um gráfico do actividade anti-metrazol ao longo do tempo de várias pró-drogas de 3a-OH-5a-pregnan-20-ona.
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Descrição pormenorizada das formas de concretização preferidas
Os compostos do, e utilizados no, invento são derivados de vários pregnanos hidroxilados em 3a e androstanos hidroxilados em 3a e ésteres, éteres, sulfonatos, sulfatos, fosfonatos, fosfatos, oximas, tiosulfatos, seus derivados heterocíclicos e de heteroarilo e derivados referidos como pró-drogas. A expressão "pró-droga" refere-se a um derivado de uma droga conhecida que actua directamente, o qual tem características de entrega e valor terapêutico melhorados quando comparado com a droga e é transformado na droga activa por meio de um processo enzimático, ou químico; veja-se Notari, R.E., "Theory and Practice of Prodrug Kinetics", Methods in Enzymology. 7/2:309-323 (1985); Bodor, N., "Novel Approaches in Prodrug Design", Drugs of the Fuiure 6(3):165-182 (1981); e Bundgaard, H., "Design of Prodrugs: Bioreversible-Derivatives for Various Functional Groups and Chemical Entities" in Design of Prodrugs (H. Bundgaard, ed.), Elsevier, New York (1985). Deverá ter-se em conta que alguns derivados sintéticos que formam parte do presente invento, poderão não ser verdadeiras pró-drogas, pois além das características acima referidas, possuem também uma actividade intrínseca. No entanto, para os fins deste pedido serão designados como pró-drogas.
Os estudos do requerente (Gee, K.W. et ai, "GABA-dependent modulation of the Cl ionophore by steroids in rat brain", European Journal of Pharmacology 136: 419-423, 1987) demonstraram que os esteróides hidroxilados em 3a utilizados no invento são, em algumas ordens de grandeza, mais potentes que outros autores referiram (Majewska, M.D. et al. (1986) e Harrison, N.L. et al (1987)), como moduladores do complexo GR. Majewska et al e Harrison et al descrevem que os esteróides hidroxilados em 3a, reduzidos em 5 apenas são capazes de níveis de eficácia muito inferiores. Os dados experimentais in vitro e in vivo, do requerente, demonstram que a potência elevada destes esteróides permite que eles sejam terapeuticamente úteis na modulação da excitabilidade cerebral, através do complexo GR. Os esteróides mais potentes úteis no presente invento incluem derivados de metabolitos principais de progesterona e desoxicorticoesterona. Estes esteróides podem ser utilizados com benefício terapêutico, especificamente para modular a excitabilidade do cérebro em stress, ansiedade, insónia, desordens de disposição (como a depressão), que são tratáveis com agentes activos no GR, e desordens de ataques. Para além disso, o requerente demonstrou que estes esteróides interagem num único local no complexo GR, que é diferente de outros locais de interacção conhecidos (i.e. barbiturato, BZ e GABA), onde foram anteriormente produzidos efeitos terapêuticos benéficos no stress, ansiedade, sono, desordens de disposição e desordens de ataques (Gee. K.W. e Yamamura, H.I., "Benzodiazepines and Barbiturates: Drugs for the Treatment of Anxiety, Insomnia and 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ
9 S
Seizure Disorders" in In Central Nervous System Disorders, páginas 123-147, D.C. Horvell, ed. 1985; Lloyd, K.G. e Morselli, P.L., "Psychopharmacology of GABAergic Drugs", in Psychopharmacology: The Third Generation of Progress. páginas 183-195, H.Y. Meltzer, ed. Raven Press, N.Y., 1987). Estes compostos são desejáveis pela sua duração, potência e actividade oral (juntamente com outras formas de administração).
Os derivados esteróides do invento são os que têm a seguinte fórmula estrutural (I)
em que R, Ri, R2, R3, R4, Rj, R<„ R-, Rs, R9 e Rio são aqui definidos mais à frente e as linhas a tracejado são ligações simples ou duplas. A estrutura com a fórmula I inclui androstanos, pregnanos (R4 = metilo), 19-nor-androstanos, e norpregnanos (Ra= H). O presente invento inclui também ésteres e sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos de fórmula I, incluindo sais de adição de ácido. Pensa-se que o 3a-hidroxilo pode estar também mascarado como um éster farmaceuticamente aceitável, devido ao facto de o éster ser removido, quando a pró-droga é convertido na forma de droga. Estes são aqui referidos como ésteres cliváveis.
Definições
De acordo com o presente invento e tal como aqui utilizado, os termos seguintes são definidos com os seguintes significados, salvo indicação em contrário. O termo "alquilo" refere-se a grupos alifáticos saturados, incluindo grupos de cadeia linear, cadeia ramificada e cíclicos, podendo todos ser opcionalmente substituídos. Exemplos de grupos alquilo adequados incluem metilo, etilo, e semelhantes e podem ser opcionalmente substituídos. O termo "alcenilo" refere-se a grupos insaturados que contêm pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono e incluem grupos de cadeia linear, cadeia ramificada e
84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ cíclicos, podendo todos ser opcionalmente substituídos. O termo "alcinilo" refere-se a grupos hidrocarboneto insaturados que contêm pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono e incluem grupos de cadeia linear e cadeia ramificada que podem ser opcionalmente substituídos. Grupos alcinilo adequados incluem propinilo, pentinilo, e semelhantes, que podem ser opcionalmente substituídos por ciano, acetoxi, halogeno, hidroxi ou ceto. Grupos alcinilo preferidos têm cinco a dezoito átomos de carbono. Grupos alcinilo mais preferidos têm cinco a doze átomos de carbono. Os grupos alcinilo mais preferidos têm cinco a sete átomos de carbono. O termo "alcoxi" refere-se ao éter -OR, em que R é alquilo. O termo "ariloxi" refere-se ao éter -OR, em que R é arilo. O termo "arilo" refere-se a grupos aromáticos que têm pelo menos um anel, tendo um sistema de electrão pi conjugado e que incluem arilo e biarilo carbocíclico, podendo ser ambos opcionalmente substituídos. O termo "arilo carbocíclico" refere-se a grupos em que os átomos do anel no anel aromático são átomos de carbono. Os grupos arilo carbocíclicos incluem grupos fenilo e naftilo opcionalmente substituídos. O fenilo substituído tem de preferência um a três, quatro ou cinco substituintes, sendo com vantagem alquilo inferior, amino, amido, ciano, éster carboxilato, hidroxi, alcoxi inferior, halogéneo, acilo inferior e nitro. O termo "aralquilo" refere-se a um grupo alquilo substituído com um grupo arilo. Os grupos aralquilo adequados incluem benzilo e semelhantes e podem ser opcionalmente substituídos. O termo "alcanoíloxi" refere-se a -0-C(0)R, em que R é alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo ou aralquilo. O termo "carbalcoxilo" refere-se a -C(0)0R, em que R é alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo ou aralquilo. O termo "carboxamido" refere-se a -C(0)NRRi, em que R e Ri são independentemente seleccionados entre hidrogénio, alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo ou aralquilo.
84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ 11 Ο termo "dialquilamino" refere-se a -NRR". em que R e R" são independentemente grupos alquilo inferiores ou em conjunto formam o resíduo de um grupo morfolino. Exemplos de grupos dialquilamino adequados incluem dimetilamino, dietilamino e morfolino. O termo "acilo" refere-se ao grupo alcanoílo -C(0)R, em que R é alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo ou aralquilo. O termo "amino" refere-se a NRR', em que R e R' são independentemente hidrogénio, alquilo inferior ou são ligados um ao outro para originar um anel de 5 ou 6-membros, e.g. anéis pirrolidina ou piperidina. O termo "opcionalmente substituído" ou "substituído" refere-se a grupos substituídos por um a três, quatro ou cinco substituintes, independentemente seleccionados a partir de alquilo inferior (acíclico e cíclico), arilo (carboarilo e heteroarilo), alcenilo, alcinilo, alcoxi, halogeno, halogenoalquilo (incluindo tri-halogenoalquilo, e.g. trifluorometilo), amino, mercapto, alquiltio, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, nitro, alcanoílo, alcanoíloxi, alcanoíloxialcanoílo, alcoxicarboxi, carbalcoxi (-COOR, em que R é alquilo inferior), carboxamido (-CONRR1, em que R e R' são independentmente alquilo inferior), formilo, carboxilo, hidroxi, ciano, azido, ceto e cetais cíclicos seus derivados, alcanoílamido, heteroariloxi, heterocarbociclicoxi e sais de éster hemisuccinato. O termo "inferior" é aqui utilizado em relação aos radicais ou compostos orgânicos e define de um a, e incluindo, dez, de preferência até, e incluindo, seis, e vantajosamente de um a quatro átomos de carbono. Estes grupos podem ser de cadeia linear, cadeia ramificada ou cíclicos. O termo "heterocíclico" refere-se a radicais contendo carbono com anéis de quatro, cinco, seis ou sete membros e um, dois ou três heteroátomos de O, N, ou S, e.g. tiazolidina, tetra-hidrofurano, 1,4-dioxano, pirrolidina, piperidina, quinuclidina, ditiano, tetra-hidropirano, e-caprolactona, e-caprolactama, ω-tiocaprolactama e morfolina. O termo "heteroarilo" refere-se a radicais insaturados cíclicos de 5-14 membros contendo carbono, contendo um, dois, três ou quatro átomos de O, N ou S e tendo 6, 10 ou 14 electrões π deslocalizados num ou mais anéis, e.g. piridina, oxazolo, indolo, purina, pirimidina, imidazolo, benzimidazolo, indazolo, 2H-l,2,4-triazolo, 1,2,3-triazolo, 2H-1,2,3,4-tetrazolo, lH-l,2,3,4-tetrazolo, benzotriazolo, l,2,3-triazolo[4,5-b]piridina, tiazolo, isoxazolo, pirazolo, quinolina, citosina, timina, uracilo, adenina, guanina, pirazina, ácido
84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ 12 picolínico, picolina, ácido furóico, furfural, álcool furílico, carbazolo, 9H-pirido[3,4-bjindolo, isoquinolina, pirrolo, tiofeno. furano, 9(10H)acridona, fenoxazina e fenotiazina, podendo cada um ser opcionalmente substituído, como discutido acima. O termo "ácidos dióicos" refere-se a grupos alquileno Ciõ substituídos com dois grupos carboxi, por exemplo, ácido malónico. ácido succínico, ácido glutárico, ácido adípico, ácido pimélico e ácido subérico. Os sais hemi-éster dos ácidos dióicos incluem os sais seus derivados de sódio, lítio, potássio, magnésio e cálcio. O termo "sal β-acetil-tiosulfato" pretende incluir os sais seus derivados de sódio, lítio, potássio, magnésio e cálcio. O termo "ésteres ou sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se a ésteres ou sais de fórmula I derivados a partir da combinação de um composto do presente invento e de um ácido ou base orgânico ou inorgânico.
De acordo com o presente invento, os cetais incluem diéteres de alcanóis inferiores, e.g. cetais de dimetilo e dietilo, bem como cetais cíclicos que incluem diéteres de alcanodióis C2-3, e.g. cetais de etileno e cetais de propileno.
Os substituintes utilizados nos compostos de fórmula I são: R é hidrogénio, halogéneo, 1-alcinilo opcionalmente substituído, alcoxi inferior, alquilo, dialquilamino ou alquilo substituído;
Ri é hidrogénio, alquilo opcionalmente substituído, alcenilo opcionalmente substituído, arilo opcionalmente substituído, aralquilo opcionalmente substituído, alcinilo opcionalmente substituído, aralcinilo opcionalmente substituído, alcoxialquilo, aminoalquilo, ciano, cianoalquilo, tiocianoalquilo, azidoalquilo, aralcinilo substituído, arilalquilo, arilalcenilo, araíquilalcinilo opcionalmente substituído, alcanoííoxialcinilo, heteroariloxialcinilo opcionalmente substituído, oxoalcinilo ou um cetal seu derivado, cianoalcinilo, heteroarilalcinilo opcionalmente substituído, hidroxialcinilo, alcoxialcinilo, aminoalcinilo, acilaminoalcinilo, mercaptoalcinilo, hemi-éster do ácido hidroxialquinil dióico ou um sal seu derivado, ou alciniloxialcinilo; R2 é hidrogénio, hidroxi, alcoxi, alcanoíloxi, carbalcoxilo, um grupo ceto ou um grupo amino; 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ 13
R.3 é um grupo heteroarilacetilo opcionalmente substituído; R4 é hidrogénio ou metilo;
Rj é hidrogénio; Rô é hidrogénio, alcanoílo, aminocarbonilo ou alcoxicarbonilo;
Rré hidrogénio, halogénio, hidroxi, alcoxi, alcanoíloxi ou carbalcoxilo;
Rs é hidrogénio ou halogéneo; R<)é hidrogénio, halogéneo, alquilo, alcoxi, arilalcoxi ou amino; e
Rio é hidrogénio, halogéneo, alquilo, halogenoalquilo, hidroxi, alcoxi, alcanoíloxi, carbalcoxilo, ciano, tiociano ou mercapto.
Um grupo preferido de compostos de fórmula I são compostos em que R é hidrogénio ou alcoxi inferior. São mais preferidos os compostos em que R, Rs, R^, R?, Rs, R9 e Rio são hidrogénio.
Um outro grupo de compostos preferidos são os compostos de fórmula I em que Ri é aralcinilo substituído, e.g. Ri é fenilalcinilo substituído em 4, tal como 4-acetilfeniletinilo, 4-metoxifeniletinilo, 4,N,N-dimetilaminofeniletinilo, 4-cianofeniletinilo, éster etílico de 4-carboxifeniletinilo, 4,N,N-dialquilamidofeniletinil ou em que Ri é oxoalcinilo, hidroxialcinilo, acetoxialcinilo, cianoalcinilo ou alcoxialcinilo.
Um outro grupo de compostos preferidos são aqueles em que R3 é pirazolilacetilo ou imidazolilacetilo.
Outros compostos preferidos são os compostos de fórmula I que são grupos éster ou hidroxilo na posição 3. Os ésteres preferidos são os que são obtidos a partir dos seus ácidos correspondentes e ácidos dióicos: acético, propiónico, maleico, fumárico, ascórbico, pimélico, succínico, glutárico, bismetileno-salicílico, metanossulfónico, etano-di-sulfónico, oxálico, tartárico, salicílico, cítrico, glucónico, itacónico, glicólico, /?-aminobenzóico, aspártico, glutâmico, gama-aminobutírico, a-(2-hidroxietilamino)propiónico, glicina e outros α-aminoácidos, fosfórico, sulfúrico, glucorónico e l-metil-l,4-di-hidronicotínico.
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Os compostos preferidos são descritos nas reivindicações anexas e incluem 3a-hidroxi-21 -(l ’-imidazolil)-5P-pregnan-20-ona, 3a-hidroxi-3P-metil-21 -(1 '^'^'-triazolity-õa-pregnan-20-ona, 3a-hidroxi-3P-(4-hidroxibutin-l-il)-21-(l-imidazolil)-5P-pregnan-20-ona, 3a-hidroxi-3 p-(4-hidroxibutin-1 -il)-21 -(1 -imidazolil)-5 β-19-norpregnan-20-ona, 3a- hidroxi-3 p-(4-hidroxibutin-1 -i l)-21 -(1,2,3-triazol-2-il)-5 β-19-norpregnan-20-ona e 3a- hidroxi-21 -(1 -imidazolil)-5a-pregnan-20-ona
Os esteróides neuroactivos especialmente preferidos incluem 3a-hidroxi-21-(l-imidazol i l)-5 β-ρΓε§?ΐ3η-20-οη^ Métodos de síntese
Os compostos de acordo com o invento podem ser preparados por qualquer método conveniente, e.g. utilizando técnicas convencionais como as descritas em "Steroid Reactions", Djerassi, publicado em 1963 por Holden-Day, Inc., São Francisco, ou "Organic Reactions in Steroid Chemistrv", Fried e Edwards, publicado em 1972 por Van Nostrand-Reinhold Co., Nova Iorque. Métodos gerais
Prepararam-se 20-hidroxipregnanos por redução de 20-cetopregnanos com agentes reductores convencionais.
Prepararam-se 21-hemisuccinatos a partir de derivados de pregnan-20-ona que foram primeiro bromados com bromo molecular, para se obter os 21-bromo-pregnanos correspondentes. Os compostos bromo foram em seguida reagidos com vários ácidos dióicos, como o ácido succínico. na presença de uma amina, para se obterem os 21-hidroxi-ésteres. Os ésteres resultantes dos ácidos dióicos foram em seguida convertidos nos seus sais de sódio, por meios convencionais.
Podem-se preparar compostos 21-oxigenados deste tipo por meio de uma sequência de reacções, em que uma pregnan-20-ona é oxidada com tetracetato de chumbo para originar um derivado 21-acetoxi, hidrólise do acetato para orginar um 21-álcool e acilação com um derivado de ácido carboxílico adequado, por exemplo um anidrido ou cloreto ácido, ou outro reagente capaz de substituir o hidrogénio do grupo hidroxilo, tal como cloreto de metanossulfonilo.
Os pregn-17-enos podem ser formados por reacção de um 17-cetoesteróide com um 15 84 866
ΕΡ Ο 752 860/PT reagente de Wittig, tal como o ileto derivado do tratamento de um brometo de n-propiltrifenilfosfónio com uma base forte como í-butóxido de potássio.
Exemplo 1 (referência) 3a-hidroxi-3B-(2'-feniletiD-5B-pregnan-20-ona
Dissolveu-se uma solução de 3a-hidroxi-3p-feniletinil-5P-pregnan-20-ona (44 mg) em EtOAc (12 ml), adicionou-se Pd/C (5%, 12 mg) e a mistura foi hidrogenada a uma pressão de 400 kPa durante a noite à temperatura ambiente. Por filtração do catalizador, seguida de evaporação do solvente obteve-se o produto bruto, que foi purificado por cromatografia em sílica gel, para isolar o composto em título puro (33 mg); pf 153-154°C; Rt-em TLC(hexano:acetona 7:3) = 0,4.
Exemplo 2 (referência) 3a-(3'.4'-dimetoxifeniletinin-3B-hidroxi-5B-pregnan-20-ona e 3B-(3'.4'-dimetoxifeniletinil)-3a-hidroxi-5B-pregnan-20-ona
Tratou-se uma solução de 2,2-dibromo-l-(3'.4'-dimetoxifenil)eteno (preparado pela reacção de Wittig de 3,4-dimetoxibenzaldeido com tetrabrometo de carbono na presença de trifenilfosfma) (966 mg, 3 mmol) em THF seco (15 ml), sob N2 com n-BuLi (2,5M em THF, 6 mmol, 2,4 ml) a -78°C. A mistura foi agitada a esta temperatura durante 2 horas e adicionou-se uma solução de 20-(1,2-etanodiilacetal)cíclico de 5B-pregnan-3,20-diona (720 mg, 2 mmol) em THF seco (10 ml), gota a gota, durante um período de 30 min. Após agitação da mistura resultante a -78°C durante 2 h. removeu-se o banho de arrefecimento e continuou-se a agitação à temperatura ambiente por mais outra hora. Esta foi em seguida neutralizada com solução de HC1 2N (1 ml) a -10ÚC. Removeu-se o solvente e dissolveu-se em seguida o resíduo em acetona (25 ml). Após adição de HC1 2N (10 ml), agitou-se a solução à temperatura ambiente durante 2 h. Adicionou-se solução saturada de NaHC03 para neutralizar o ácido. Removeram-se os solventes e extractou-se o resíduo com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com água, solução de NaHCO;, diluída, água e salmoura. Após secagem sobre MgS04 anidro, a solução foi filtrada e evaporada, obtendo-se o produto bruto (1,2 g). Este produto bruto foi então dissolvido numa pequena quantidade de CH2CI2 e vazado numa coluna de sílica gel. Por eluição com a mistura tolueno:acetona (96:4), obteve-se um composto fenilacetileno, que não foi caracterizado. Após nova eluição com o mesmo solvente, obteve-se 3a-(3',4'-dimetoxifeniletinil)-3P-hidroxi-5P-pregnan-20-ona (120 mg) como uma primeira fracção e 3p-(3',4'-dimetoxifeniletinil)-3a-hidroxi-5B-pregnan-20-ona como uma segunda fracção (430 mg); p.f. 82-88°C.
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Utilizou-se um método análogo para preparar: 3p-(4'-metoxifeniletinil)-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona; 3P-(4'-clorofeniletinil)-3a-hidroxi-5P-pregnan-20-ona; 3β-(2'-metoxifeniletinil)-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona; 3P-(4'-bifeniletinil)-3a-hidroxi-5P-pregnan-20-ona; 3P-(4'-dimetilaminofeniletinil)-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona e 3β-(4'-cianofeniletinil)-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona
Exemplo 3 (referência) 3B-(3'.4’-dimetoxifeniletinil~)-3a-hidroxi-5B-pregnan-20-ona
Saturou-se previamente uma mistura de Pd/C (5%, 28 mg) e EtOAc (12 ml) com hidrogénio, por agitação sob hidrogénio, durante 10 min. Adicionou-se então uma solução de 3P-(3',4'-dimetoxifeniletinil)-3a-hidroxi^'pregnan-20-ona (185 mg) em EtOAc (5 ml) e a mistura foi hidrogenada a uma pressão de 300 KPa durante a noite à temperatura ambiente. Por filtração do catalizador seguido de evaporação do solvente obteve-se o produto bruto, que foi purificado por cromatografia sobre sílica gel (hexano:acetona 4:1), para isolar o composto em título puro (135 mg); R.-em TLC (hexano:acetona4:l) = 0,14.
Exemplo 4 (referência) 3p-('4,-nitrofeniletinilV3a-hidroxi-5B-pregnan-20-ona
Tratou-se uma solução de 2,2-dibromo-l-(4-nitrofenil)eteno (preparada por reacção de Wittig de 4-nitrobenzaldeído com tetrabrometo de carbono na presença de trifenilfosfina (296 mg, l mmol) em THF seco (20 ml) sob N? com n-BuLi (2,5M em THF, 2 mmol, 0,8 ml) a -95°C. A mistura foi agitada de -80 a -100°C durante 0,5 h e em seguida adicionou-se uma solução de 20-(1,2-etanodiilacetal)cíclico de 5β-pregnan-3,20-diona (120 mg, 0,5 mmol) em THF seco (10 ml), gota a gota, durante um período de 10 min. Após agitação da mistura resultante a -80°C durante 1 h e em seguida a 0°C por mais 1 h, interrompeu-se a reacção com uma solução de NHjCl (3 ml). Removeu-se o solvente e o resíduo foi dissolvido em seguida em acetona (25 ml). Após adição de HC1 2N (10 ml), agitou-se a solução à temperatura ambiente durante 1 h. Adicionou-se uma solução saturada de NaHCC>3 para neutralizar 0 ácido. Removeram-se os solventes e extractou-se em seguida o resíduo com CH2CI2. A camada orgânica foi lavada com água e salmoura. Após secagem sobre MgSC>4 anidro filtrou-se a solução e evaporou-se para se obter o produto bruto (400 mg). Este produto bruto foi então dissolvido numa pequena quantidade de CH2CI2 e vazado numa coluna de sílica gel. Por eluição com uma mistura de tolueno:acetona (96:4) obteve-se o composto em título como um sólido castanho (70 mg); Rt- em TLC (tolueno:acetona 95:5) = 0,18.
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Exemplo 5 (referência) 3B-hidroxi-3a-fenil-5B-pregnan-20-ona e 3a-hidroxi-3B-fenil-5B-pregnan-2Q-ona
Tratou-se uma solução de 20-(1,2-etanodiilacetal)cíclico de 5P-pregnan-3,20-diona (720 mg, 2 mmol) em 15 ml de THF seco, com brometo de fenil magnésio (3M em THF, 6 mmol, 2 ml) a -70°C. Após agitação da mistura a esta temperatura, durante 3 h e em seguida à temperatura ambiente durante 2 h, esta foi neutralizada com HC1 2N (1 ml). Removeu-se o solvente e dissolveu-se o resíduo em acetona (20 ml). Após adição de HC1 IN (5 ml) agitou-se a solução à temperatura ambiente durante 15 h. Removeram-se os solventes e extractou-se o resíduo com CEFCF. A camada orgânica foi lavada com água, solução de NaHC03 diluída, água e salmoura. Após secagem sobre iYlgSCE anidro, filtrou-se a solução e evaporou-se para se obter o produto bruto (1,3 g). Dissolveu-se então o produto bruto numa pequena quantidade de CEFCb e vazou-se numa coluna de sílica gel. Por eluição com uma mistura de tolueno:acetona (95:5) obteve-se 3a-fenil-3p-hidroxi-5P-pregnan-20-ona (420 mg) como uma primeira fracção. Por nova eluição com a mesma mistura de solventes obteve-se 3P-fenil-3a-hidroxi-5P-pregnan-20-ona (185 mg), p.f. 182-184°C.
Exemplo 6 (referência) 3B-hidroxi-3a-benzil-5B-pregnan-20-ona e 3a-hidroxi-3B-benzil-5p-pregnan-20-ona
Diluiu-se uma solução de brometo de benzilmagnésio (2M em THF, 2 mmol, 1 ml) com THF (15 ml) e esta foi tratada gota a gota com uma solução de 20-(1,2-etanodiilacetal)cíclico de 5p-pregnan-3,20-diona, (360 mg, 1 mmol) em THF seco (15 ml) a -60°C. Após agitação da mistura a esta temperatura, durante 1 h e em seguida à temperatura ambiente durante 15 h, esta foi neutralizada com HC1 2N (1 ml). Removeu-se o solvente e dissolveu-se o resíduo em acetona (20 ml). Após adição de HC1 IN agitou-se a solução à temperatura ambiente durante 30 minutos. Esta foi neutralizada com NaOH 2 N. O sólido precipitado foi recolhido por filtração, lavado com água e seco, para originar 3P-hidroxi-3a-benzil-5P-pregnan-20-ona (238 mg). O filtrado foi extractado com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com água, solução de NaHCCf diluída, água e salmoura. Após secagem sobre MgSC>4 anidro, filtrou-se e evaporou-se a solução, obtendo-se o produto bruto (160 mg). Este produto bruto foi dissolvido em seguida numa pequena quantidade de CH2CI2 e vazado numa coluna de sílica gel. Por eluição com uma mistura de tolueno:acetona (95:5) obteve-se 3P-hidroxi-3a-benzil-5P-pregnan-20-ona (40 mg) como uma primeira fracção. Após nova eluição com a mesma mistura de solventes obteve-se 3a-hidroxi-3p-benzil-5P-pregnan-20-ona (30 mg) que foi cristalizada a partir de hexano:CH2Cl2 (4:1) na forma de barras incolores (15 mg); p.f. 133-141°C; Rf em TLC (toluenoracetona 9:1) = 0,5.
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Exemplo 7 (referência) 3B-r3,(.R/lS)-hidroxibutinill-3a-hidroxi-5b-pregnan-20-ona
Tratou-se uma solução de 3(R/S)-hidroxibutino (0,470 ml, 6 mmol) em THF seco (15 ml) com n-BuLi (2,5M em THF, 12 mmol, 4,8 ml) a -70°C. Após agitação da mistura a esta temperatura drurante 0,5 h, adicionou-se uma solução de 20-(1,2-etanodiilacetal)cíclico de 5P-pregnan-3,20-diona (1,08 g, 3 mmol) em THF seco e a mistura foi agitada a -78°C durante 1 h. Removeu-se o banho de arrefecimento e agitou-se a mistura à temperatura ambiente por mais 1,5 h. Esta foi neutralizada com uma solução de NH4CI (3 ml). Removeu-se o solvente e dissolveu-se 0 resíduo em acetona (10 ml). Após adição de HC1 2N (5 ml), agitou-se a solução à temperatura ambiente durante 1 h. Adicionou-se uma solução saturada de NaHCCb para neutralizar 0 ácido. Removeram-se os solventes e 0 resíduo foi extractado com EtOAc. Lavou-se a camada orgânica com água, solução de NaHCO:- diluída, água e salmoura. Após secagem sobre MgS04 anidro, filtrou-se a solução e evaporou-se para se obter o produto bruto (1,4 g). Este produto bruto foi então dissolvido numa pequena quantidade de CH2CI2 e vazado numa coluna de sílica gel. A eluição com uma mistura de tolueno:acetona (85:15) originou 3P-[3'(RS)-hidroxibutinil]-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona (145 mg) na forma de um sólido incolor; Rt em TLC (tolueno:acetona 4:1) = 0,24.
Utilizou-se um método análogo para preparar: 3P-[4'(R/S)-hidroxipentinil]-3a-hidroxi-5 P-pregnan-20-ona.
Exemplo 8 (referência) 3B-(4'-acetilfeniletinil')-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona
Agitou-se uma solução de 4-iodoacetofenona (95 mg, 0,39 mmol), 3β-είϊηί1-3α-hidroxi-5a-pregnan-20-ona (106 mg, 0,3 mmol) em pirrolidina desgaseifícada seca (3 ml), sob árgon à temperatura ambiente. Adicionou-se dicloreto de bis(trifenilfosfína)paládio (II) (5 mg) e Cul (5 mg) e agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 15 h. A TLC mostrou uma conversão de 100% do material de partida e assim a mistura foi neutralizada com uma solução de NH4CI (15 ml) e extractada com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com água. solução de NaHCO} diluída, água e salmoura. Após secagem sobre MgS04 anidro, filtrou-se a solução e evaporou-se para se obter 0 produto bruto (150 mg). Este produto bruto foi em seguida dissolvido numa pequena quantidade de CH2CI2 e vazado numa coluna de sílica gel. Por eluição com uma mistura de hexano:acetona (4:1) obteve-se 3P-(4'-acetilfeniletinil)-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona (35 mg) na forma de um sólido incolor; Rf em TLC (hexano.acetona 7:3) = 0,4.
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Utilizou-se um método análogo para preparar. 3a-hidroxi-3P-(4'-trifluorometilfeniletinil)-5p-pregnan-20-ona; 3p-(4'-acetilfeniletinil)-3a-hidroxi-5P-pregnan-20-ona; 3a-hidroxi-3P-(4'-metilfeniletinil)-5p-pregnan-20-ona; 3a-hidroxi-3P-(4’-acetoxiacetilfeniletinil)-5P-pregnan-20-ona; 3P-(3Miidroxifeniletinil)-3a-hidroxi-5P- pregnan-20-ona; 3P-(2',4'-difluorofeniletinil)-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona; 3β-(pentafluorofeniletinil)-3a-hidroxí-5P-pregnan-20-ona e éster etílico de 3a-hidroxi-3p-(4'-carboxifeniletinil)-5P-pregnan-20-ona.
Exemplo 9 3a-hidroxi-21-(T-imidazoli0-5B-pregnan-20-ona 3a-hidroxi-21 -bromo-5B-pregnan-20-ona: Adicionou-se a um frasco contendo uma solução de 3a-hidroxi-5P-pregnan-20-ona (5.15 g, 16,5 mmol) em metanol (100 ml), uma solução de bromo (1,1 ml) em metanol (30 ml), gota a gota, a uma taxa tal que permitisse manter a cor castanha de bromo até esta se tomar persistente. Em seguida adicionou-se água (200 ml) e extractou-se a mistura com CH2CI2 (3 x 100 ml). Os extractos combinados foram secos sobre NajSOj. Por remoção do solvente obteve-se o produto na forma de um sólido branco espumoso (6.63 g). Sintetizaram-se também outras 21-bromo-pregnan-20-onas (3β-etinil-3a-hidroxi-21-bromo-5p-pregnan-20-ona, 3p-metil-3a-hidroxi-21-bromo-5a- pregnan-20-ona e 3a-hidroxi-3P-trifluorometil-12-bromo-5p-19-norpregnan-20-ona), utilizando 0 mesmo método. 3a-hidroxi-21 -(1 '-imidazolol)-5B-pregnan-20-ona: Aqueceu-se uma mistura de 3a-hidroxi-21-bromo-5P-pregnan-20-ona (0,86 g) e imidazolo (0,37 g) em CH3CN (12 ml) sob Ar até ao refluxo, durante 1 h e arrefeceu-se a 25°C. Em seguida vazou-se num funil separador contendo uma solução de NH4CI (100 ml, aq. sat.) e extractou-se o produto com EtOAc (3 x 50 ml). Os extractos orgânicos combinados foram secos sobre Na2S04 e o solvente foi removido sob vácuo. Isolou-se 0 produto puro (0,59 g, 42%) por cromatografia instantânea em coluna.
Os compostos 3a-hidroxi-21-(r-benzimidazolil)-5P-pregnan-20-ona, éster etílico de 3a-hidroxi-21 -[ 1 H-(4-metil-5-carbetoxil)imidazol-1 -il)-5P-pregnan-20-ona, 3a-hidroxi-21 -(l'-imidazolil)-5a-pregnan-20-ona; 3p-etinil-3a-hidroxi-21-(r-imidazolil)-5p-pregnan-20-ona; 3a-hidroxi-21-(lH-3,5-dimetilpirazolil)-5P-pregnan-20-ona; 3a-hidroxi-21-(l'-:.midazolil)-3p-metil-5a-pregnan-20-ona; 3a-hidroxi-21-(l'-pirazolil)-5a-pregnan-20-ona; 3P-etinil-3a-hidroxi-21-(l'-pirazolil)-5p-pregnan-20-ona; 21-(l'-benzimidazolil)-3a- 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ 20
hidroxi-3p-metil-5a-pregnan-20-ona, 3a-hidroxi-21-(T-pirazolil)-3P-metil-5a-pregnan-20-ona; 3a-hidroxi-21 -(pirazol-1 -i 1)-5 P-pregnan-20-ona; 3a-hidroxi-21 -[ lH-(2-metil)imidazol-1 -il)-5P-pregnan-20-ona; 3a-hidroxi-21 -[ 1 H-(2'-foiTnil-imidazol- l-il]-5P-pregnan-20-ona, 3a-hidroxi-21 -(1 H-imidazol-1 -il)-3p-trifluorometil-5P-19-norpregnan-20-ona e 3a--hidroxi-21-(pirazol-l-il)-3p-trifluorometil-5P-19-norpregnan-20-ona foram sintetizados de acordo com o Exemplo 9.
Exemplo 10 3a-hidroxi-3B-metil-21-n', 2'. 4'-triazolil)-5a-pregnan-20-ona
Adicionou-se NaH (56 mg) a um solução de 1.2.4-triazolo (146 mg) em THF (15 ml), sob Ar, e a mistura obtida foi agitada a 25°C durante 20 min. Em seguida adicionou-se uma solução de 3P-metil-3a-hidroxi-21-bromo-5a-pregnan-20-ona (300 mg) em THF e a mistura assim obtida foi agitada durante 5 h. Em seguida vazou-se num funil separador contendo água (40 ml) e o produto foi extractado com CH^CT (3 x 50 ml). Os extractos orgânicos combinados foram secos sobre NajSCU e removeu-se o solvente sob vácuo. O produto puro (187 mg, 64%) foi isolado por cromatografia instantânea em coluna.
Sintetizaram-se 3a-hidroxi-21-(2'H-1,2.3,4-tetrazol-2'-il)-5P-pregnan-20-ona, 3a-hidroxi-21-(2H-l,2,3-triazol-2-il)-5p-pregnan-20-ona. 3a-hidroxi-21-(9'H-purin-9'-il)-5p-pregnan-20-ona 3a-hidroxi-3p-metil-21-(2'H-l',2',3'-triazol-2’-il)-5a-pregnan-20-ona,; 3P-etinil-3a-hidroxi-21 -(1 ',2',4'-triazolil)-5 P-pregnan-20-ona; 3a-hidroxi-3 P-metil-21 -(1 \2',3'-triazol-1 ’-il)-5a-pregnan-20-ona; 3a-hidroxi-21 -(1 '.2’,4'-triazol-1 -il)-5 P-pregnan-20-ona; 3a-hidroxi-21 -(1 Ή-1,2,3,4-tetrazol-1 '-il)-5 P-pregnan-20-ona; 3a-hidroxi-21 -[ lH-(4- nitro)imidazol-l-il)-5p-pregnan-20-ona; 3a-hidroxi-21-(7'H-purin-7'-il)-5p-pregnan-20-ona, 3a-hidroxi-21 -[ 1 H-(4',5'-diciano)imidazol-1 -il)]-5 p-pregnan-20-ona; 3a-hidroxi-21 -(Γ- 1,2,4-triazol-1 -il)-3 p-trifluorometil-5P-19-norpregnan-20-ona; e 3a-hidroxi-21 -[ lH-(4',5'-dicloro)imidazol-l-il)]-5P-pregnan-20-ona. de acordo com os processos descritos no Exemplo 10.
Exemplo 11 (referência) 3B-(4'-acetoxifeniletinill-3a-hidroxi-5B-pregnan-20-ona a. 3B-(4'-hidroxifeniletiniD-3a-hidroxi-5B-pregnan-20-ona
Tratou-se uma solução de 2,2-dibromo-l-(4-hidroxifenil)eteno (preparada por reacção de Wittig de 4-hidroxibenzaldeído com tetrabrometo de carbono na presença de 21 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ trifenilfosfina) (1,25 mg, 4,5 mmol) em THF seco (25 ml) sob N2 com n-BuLi (2,5M em THF, 13,5 mmol, 5,4 ml) a 70°C. A mistura foi em seguida agitada a uma temp de -70°C, durante 0,5 h e adicionou-se, gota a gota. uma solução de 20-(1,2-etanodiilacetal)cíclico de 5P-pregnan-3,20-diona, (810 mg, 2,25 mmol) em THF seco (25 ml), durante um período de 10 min. Após agitação da mistura resultante a -7S"C durante 30 min, removeu-se o banho de arrefecimento e a agitação foi continuada à temperatura ambiente por mais uma hora. Em seguida foi neutralizada com solução de NH4C1 saturada (4 ml) a -10°C. Removeu-se o solvente e o resíduo foi então dissolvido em acetona (25 ml). Após adição de HC1 2N (6 ml) agitou-se a solução à temperatura ambiente durante 15 min. Adicionou-se uma solução saturada de NaHCCb para neutralizar o ácido. Removeu-se o solvente sob pressão reduzida e utilizou-se o produto bruto (1,3 g) tal e qual, no passo seguinte. b. 3B-(4'-acetoxifeniletinil)-3a-hidroxi-5B-pregnan-20-ona
Dissolveu-se o produto bruto do passo anterior em CH2CF (5 ml) e piridina (3 ml). Adicionou-se a solução resultante a uma mistura de cloreto de acetilo (3 ml) e piridina (3 ml), arrefecida em gelo. A mistura foi agitada a 0°C durante 30 minutos e em seguida vazada em gelo (50 g). Adicionou-se HC1 2N (10 ml) e a mistura foi diluída com mais CH2CI2. Separou-se a camada orgânica, lavou-se com água, salmoura e secou-se sobre MgS04 anidro. Por remoção do solvente obteve-se um sólido bruto (2 g) que foi purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel. Por eluição com uma mistura de tolueno:acetona (95:5) obteve-se 3a-(4’-acetoxifeniletinil)-3P-hidroxi-5P-pregnan-20-ona (150 mg). Após nova eluição com a mesma mistura de solventes obteve-se 3P-(4'-acetoxifeniletinil)-3a-hidroxi-5P-pregnan-20-ona (530 mg); p.f. 171-176°C; Rr- em TLC (hexano:acetona 7:3) = 0,41.
Exemplo 12 (referência) 3 P-f4'-acetilfeniletinil)-3a-hidroxi-19-nor-5 B-pregnan-20-ona
Agitou-se uma solução de 4-iodoacetofenona (60 mg, 0,24 mmol), 3P-etinil-3a-hidroxi-19-nor-5 p-pregnan-20-ona (80 mg. 0,24 mmol) em trietilamina seca desgaseificada (0,5 ml), sob árgon a 23°C. Adicionou-se dicloreto de bis(trifenilfosfina)-paládio(II) (5 mg) e Cul (5 mg) e agitou-se a mistura a esta temperatura, durante 45 min. Adicionou-se CH2CI2 (4 ml) e agitou-se a mistura a 23°C durante 3 h. A TLC mostrou uma conversão de 100% do material de partida e, como tal, removeu-se o solvente e o resíduo foi purificado por cromatografia em sílica gel. A eluição com hexano:acetona (4:1) originou 3β-(4'-acetilfeniletinil)-3a-hidroxi-19-nor-5P-pregnan-20-ona (30 mg) na forma de um sólido 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ 22
incolor; p.f. 65-67°C, Rt- em TLC (hexano:acetona 4:1) = 0,12.
Exemplo 13 (referência)
Ester etílico de 3B-(4'-carboxifeniletinin-3a-hidroxi-19-nor-5B-pregnan-20-ona
Agitou-se uma solução de etil-4-iodobenzoato (70 mg, 0.24 mmol) e 3β-εΐίηϋ-3α-hidroxi-19-nor^-pregnan-20-ona (80 mg, 0,24 mmol) em trietilamina seca desgaseificada (1 ml), sob árgon a 23°C. Adicionou-se dicloreto de bis(trifenilfosfma)paládio(II) (5 mg) e Cul (5 mg) e a mistura foi agitada a esta temperatura durante 1 h. Adicionou-se CH2CI2 (4 ml) e a mistura foi agitada a 23°C durante 3 h. A TLC mostrou uma conversão de 100% do material de partida, e assim o solvente foi removido e o resíduo foi purificado por cromatografia em sílica gel. Por eluição com hexano:acetona (4:1) obteve-se 0 éster etílico de 3p-(4'-carboxifeniletinil)-3a-hidroxi-19-nor-5p-pregnan-20-ona (22 mg) na forma de um sólido incolor; p.f. 164-166°C. Rf em TLC (hexano:acetona 4:1) = 0,27.
Exemplo 14 (referência) Éster etílico de 3B-(4'-carboxifeniletinilT3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona
Agitou-se uma solução de 4-iodobenzoato de etilo (83 mg, 0,3 mmol), 3É-etinil-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona (103 mg, 0,3 mmol) em trietilamina seca desgaseificada (1 ml), sob árgon, a 23°C. Adicionou-se dicloreto de bis(trifenilfosfina)paládio(II) (5 mg) e Cul (5 mg) e agitou-se a mistura a esta temperatura durante 1 h. Adicionou-se CELCL (4 ml) e agitou-se a mistura a 23°C durante 1,5 h. A TLC mostrou uma conversão de 100% do material de partida, e assim 0 solvente foi removido e o resíduo foi purificado por cromatografia em sílica gel. Por eluição com hexano:acetona (4:1) obteve-se éster etílico de 3P-(4'-carboxifeniletinil)-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona (10 mg) na forma de um sólido incolor; p.f. 190-192°C, Rt-em TLC (hexano:acetona 4:1) = 0,27.
Exemplo 15 (referência) 3B-í4'-(N.N-dietilcarboxamido)fenilletinil-3a-hidroxi-5B-pregnan-20-ona
Agitou-se uma solução de 4-(N,N-dietilcarboxamido)iodobenzeno (91 mg, 0,3 mmol), 3P-etinil-3a-hidroxi-5É-pregnan-20-ona (103 mg, 0,3 mmol) em trietilamina seca desgaseificada (1 ml), sob árgon a 23°C. Adicionou-se dicloreto de bis(trifenilfosfina)paládio (5 mg) e Cul (5 mg) e agitou-se a mistura a esta temperatura durante 1 h. Adicionou-se CFLCL (4 ml) e agitou-se a mistura a 23°C durante 0,5 h. A TLC mostrou uma conversão de 100% do material de partida e assim 0 solvente foi removido e o resíduo foi purificado por cromatografia em sílica gel. Por eluição com hexano:acetona (3:1) 23 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ obteve-se ο éster etílico de 3P-[4'-(N.N-dietilcarboxamido)fenil]etinil-3oc-hidroxi-5a-pregnan-20-ona (18 mg) na forma de um sólido incolor; Rr em TLC (hexano.acetona 3:1) = 0,22.
Exemplo 16 (referência) (L2-etanodiilacetal)cíclico de 3a-hidroxi-3B-r5-oxo-l-hexinill-5B-pregnan-20-ona
Tratou-se uma solução de (l,2-etanodiilacetal)cíclico de l-hexin-5-ona (493 mg, 3,52 mmol) em THF seco (15 ml) com n-BuLi (2,5M em THF, 3 mmol, 1,2 ml) a -60°C. Após agitação da mistura a -78°C durante 0,5 h. adicionou-se uma solução de 20-(1,2-etanodiilacetal)cíclico de 5P-pregnan-3,20-diona (360 mg, 1 mmol) em THF (15 ml) e agitou-se a mistura a -78°C durante 1 h. Removeu-se o banho de arrefecimento e a. mistura foi neutralizada com uma solução de NH4CI (3 ml). Removeu-se 0 solvente e 0 resíduo foi em seguida dissolvido em acetona (40 ml). Após adição de HC1 IN (4 ml) a solução foi agitada à temperatura ambiente durante 15 min. Adicionou-se uma solução saturada de NaHCCb para neutralizar 0 ácido. Removeram-se os solventes e extractou-se 0 resíduo com EtOAc. Lavou-se a camada orgânica com água, solução diluída de NaHCOj, água e salmoura. Após secagem sobre MgSCL anidro, filtrou-se a solução e evaporou-se para se obter 0 produto bruto (700 mg). Este produto bruto foi então dissolvido numa pequena quantidade de CH2CI2 e vazado numa coluna de sílica gel. Por eluição com uma mistura de tolueno:acetona (93:7) obteve-se (l,2-etanodiilacetal)cíclico de 3a-hidroxi-3p-[5-oxo-l-hexinil]-5p-pregnan-20-ona (210 mg) na forma de um sólido incolor; p.f. 130-133°C; Rt- em TLC (tolueno:acetona 9:1) = 0,33.
Exemplo 17 (referência) 3a-hidroxi-3 β-Γ 5-oxo-1 -hexinill-5 B-pregnan-20-ona
Dissolveu-se (l,2-etanodiilacetal)ciclico de 3a-hidroxi-3B-[5-oxo-l-hexinil]-5P-pregnan-20-ona (95 mg) em acetona (5 ml). Após adição de HC1 2N (1 ml), a solução foi agitada à temperatura ambiente durante 3 h. Adicionou-se uma solução saturada de NaHCCb para neutralizar o ácido. Removeram-se os solventes e extractou-se o resíduo com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com água, água e salmoura. Após secagem sobre MgS04 anidro filtrou-se a solução e evaporou-se para se obter o produto em título, em bruto (100 mg), que foi em seguida cristalizado a partir de hexano-acetona na forma de barras incolores, rendimento de 63 mg; p.f. 104-106°C; Rt-em TLC (hexano:acetona 7:3) = 0,27.
Utilizou-se um método análogo para preparar 3a-hidroxi-3p-[6-oxo-l-heptinil]-5P-
84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ 24 pregnan-20-ona utilizando 6-(1,2-etanodiilacetal)cíclico de 1 -heptin-6-ona.
Exemplo 18 (referência) 3 β-( 5-ciano-1 -pentinil)-3a-hidroxi-5 B-pregnan-20-ona
Tratou-se uma solução de 5-cianopentino (0.84 ml. 8 mmol) em THF seco (20 ml) com n-BuLi (2,5M em THF, 7,8 mmol, 3,2 ml) a -70°C. Após agitação da mistura a -75°C durante 0,5 h, adicionou-se uma solução de 20-(1,2-etanodiilacetal)cíclico de 5P-pregnan- 3.20- diona, (720 mg, 2 mmol) em THF (20 ml) e a mistura foi agitada a -78°C durante 0,5 h. Removeu-se o banho de arrefecimento e a mistura foi neutralizada com solução de NH4CI (3 ml). Removeu-se 0 solvente e em seguida dissolveu-se o resíduo em acetona (40 ml). Após adição de HC1 IN (4 ml) agitou-se a solução à temperatura ambiente durante 15 min. Adicionou-se solução saturada de NaHCO;, para neutralizar 0 ácido. Removeram-se os solventes e 0 resíduo foi extractado com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com água e salmoura. Após secagem sobre \lgSO4 anidro, a solução foi filtrada e evaporada para se obter 0 produto bruto (1,55 g). Este produto bruto foi então dissolvido numa pequena quantidade de CHiCl? e vazado numa coluna de sílica gel. Por eluição com uma mistura de toluenoiacetona (95:5) obteve-se 3a-(5-ciano-l-pentinil)-3B-hidroxi-5B-pregnan-20-ona (170 mg) como uma primeira fracçào. Após nova eluição com a mesma mistura de solventes obteve-se 3B-(5-ciano-l-pentinil)-3a-hidroxi-5B-pregnan-20-ona (480 mg) na forma de um sólido incolor; p.f. 134-136°C; Rt em TLC (hexano:acetona 7:3) = 0,3.
Utilizou-se um método análogo para preparar 3B-(4-ciano-l-butinil)-3a-hidroxi-5B-pregnan-20-ona.
Exemplo 19 (referência) 3a-hidroxi-3B-(2-piridil)etinil-5B-pregnan-20-ona
Tratou-se uma solução de 2-etinilpiridina (270 mg, 2,6 mmol) em THF seco (15 ml) com n-BuLi (2,5M em THF, 2,5 mmol, 1 mml) a -60°C. Após agitação da mistura, a -78°C durante 0,5 h, adicionou-se uma solução de 20-( 1,2-etanodiilacetal)cíclico de 5p-pregnan- 3.20- diona, (170 mg, 0,47 mmol) em THF (15 ml) e a mistura foi agitada a -78°C durante 1 h. Removeu-se o banho de arrefecimento e a mistura foi neutralizada com uma solução de NH4CI (3 ml). Removeu-se o solvente e 0 resíduo foi então dissolvido em acetona (25 ml). Após adição de HC1 2N (2 ml) a solução foi agitada à temperatura ambiente durante 15 min. Adicionou-se solução saturada de NaHCCE para neutralizar o ácido. Removeram-se os solventes e o resíduo foi extractado com EtOAc. Lavou-se a camada orgânica com água e salmoura. Após secagem sobre MgS04 anidro, a solução foi filtrada e evaporada para se 25 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ obter ο produto bruto (360 mg). Este produto bruto foi então dissolvido numa pequena quantidade de CH2CI2 e vazado numa coluna de sílica gel. Por eluição com uma mistura de tolueno:acetona (95:5) obteve-se a etinilpiridina não reagida, como uma primeira fracção. Após nova eluição com a mesma mistura de solventes obteve-se 3p-(2-piridil)etinil-3a-hidroxi-5P-pregnan-20-ona (107 mg) na forma de um sólido incolor; p.f. 192-195°C; Rt-em TLC (tolueno:acetona 87:13) = 0,21.
Exemplo 20 (referência) 3B-(6-hidroxi-l-hexiniÍ)-3a-hidroxi-5B-pregnan-20-ona
Tratou-se uma solução de 5-hexin-l-ol (1,35 ml. 12 mmol) em THF seco (15 ml) com 11-BuLi (9,6 ml, 2,5M em THF, 24 mmol) a -65°C. Após agitação da mistura a -78°C durante 0,5 h, adicionou-se uma solução de 5p-pregnan-3,20-diona, 20-(1,2-etanodiilacetal)cíclico (l,08g, 3 mmol) em THF (20 ml) e a mistura foi agitada a -78ÚC durante 1 h. Removeu-se 0 banho de arrefecimento e continuou-se a agitação à temperatura ambiente durante 45 min. A mistura foi então neutralizada com solução de NH4CI (5 ml). Removeu-se 0 solvente e 0 resíduo foi extractado com EtOAc. Lavou-se a camada orgânica com água, solução de NaHCOj diluída, água e salmoura. Após secagem sobre MgSC>4 anidro, a solução foi filtrada e evaporada, obtendo-se 0 produto bruto (1,90 g). Este produto bruto foi em seguida cristalizado a partir de EtOAc para se obter o produto bruto na forma de barras incolores (890 mg). Este foi então dissolvido em acetona (120 ml). Após a adição de HC1 2N (3 ml) agitou-se a solução à temperatura ambiente durante 15 min. Adicionou-se solução saturada de NaHCO;, para neutralizar 0 ácido. Removeram-se os solventes e o resíduo foi extractado com EtOAc. Lavou-se a camada orgânica com água e salmoura. Após secagem sobre MgS04 anidro, filtrou-se e evaporou-se a solução para se obter o produto bruto. Este produto bruto foi então dissolvido numa pequena quantidade de CH2CI2 e vazado numa coluna de sílica gel. Por eluição com uma mistura de tolueno:acetona (95:5) obteve-se hexinol não reagido como uma primeira fracção. Após nova eluição com a mesma mistura de solventes obteve-se 3a-(6-hidroxi-l-hexinil)-3p-hidroxi-5B-pregnan-20-ona (60 mg), e em seguida 3p-(6-hidroxi-l-hexiniI)-3a-hidroxi-5P-pregnan-20-ona (620 mg) na forma de um sólido incolor; p.f. 132-134°C; Rt-em TLC (hexano:acetona 7:3) = 0,23.
84 866 ΕΡ Ο 752 860 ί ΡΤ 26
Exemplo 21 (referência)
Sal de sódio de ó^hemi-succinato de 3B-('6Mhdroxi-l'-hexinil)-3a-hidroxi-5B- pregnan-20-ona a. 6'-hemi-succinato de 3B-(6'-hidroxi-r-hexinil)-3a-hidroxi-5B-pregnan-20-ona
Tratou-se uma solução de 3P-(6'-hidroxi-l'-hexinil)-3a-hidroxi-5P-pregnan-20-ona (600 mg, 1,45 mmol) em piridina (5 ml) com anidrido succínico (600 mg, 6 mmol) e 4-(N,N-dimetil)aminopiridina (20 mg). Aqueceu-se a mistura a 70-75°C durante 1.25 h. A TLC mostrou uma conversão de 100%. Arrefeceu-se até à temperatura ambiente e vazou-se em HC1 2N em gelo. O material orgânicos foram extractados com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com HC1 0,2 N, água e salmoura. Após secagem sobre MgSOd anidro, a solução foi filtrada e evaporada para se obter o produto bruto. Este produto bruto foi então dissolvido numa pequena quantidade de CTLCL e vazado numa coluna de sílica gel. Por meio de eluição com uma mistura de hexano:acetona (7:3) foi obtido 6'-hemi-succinato de 3P-(6'-hidroxi-l'-hexinil)-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona (700 mg); Rt· em TLC (hexano:acetona:AcOH 70:30:0,5) = 0,21. b. Sal de sódio de 6'-hemi-succinato de 3B-(6'-hidroxi-r-hexinil)-3a-hidroxi-5B-pregnan-20-ona
Agitou-se uma mistura do hemi-succinato acima descrito (400 mg), NaHCO.^ (68 mg), água (8 ml) e CELCl? (1 ml) à temperatura ambiente durante 15 min. O solvente foi removido e o resíduo foi liofilizado, obtendo-se o sal de sódio na forma de um sólido incolor (400 mg).
Exemplo 22 (referência) 3B-('5'-hidroxi-r-pentini0-3a-hidroxi-5B-pregnan-20-ona
Tratou-se uma solução de 4-pentin-l-ol (1,1 ml. 12 mmol) em THF seco (15 ml) com n-BuLi (9,9 ml, 2,5M em THF, 24,5 mmol) a -65°C. Após agitação da mistura a -78°C durante 0,5 h, adicionou-se uma solução de 20-(1,2-etanodiilacetal)cíclico de 5P-pregnan-3,20-diona, (1,08 g, 3 mmol) em THF (20 ml) e a mistura foi agitada a -78°C durante 1 h. Removeu-se o banho de arrefecimento e continuou-se a agitação à temperatura ambiente durante 45 min. A mistura foi então neutralizada com solução de NH4C1 (5 ml). Removeu-se o solvente e o resíduo foi dissolvido em acetona (30 ml). Após adição de HC1 2N (7 ml), a solução foi agitada à temperatura ambiente durante 15 min. Adicionou-se solução saturada
84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ de NaHCCb para neutralizar o ácido. Removeram-se os solventes e o resíduo foi extractado com EtOAc. Lavou-se a camada orgânica com água e salmoura. Após secagem sobre iMgSOi anidro, a solução foi filtrada e evaporada, obtendo-se o produto bruto. Este produto bruto foi em seguida dissolvido numa pequena quantidade de CfLCL e vazado numa coluna de sílica gel. Por eluição com uma mistura de tolueno:acetona:EtOAc (70:15:15) obteve-se o pentinol não reagido como uma primeira fracção. Após nova eluição com a mesma mistura de solventes obteve-se 3a-(5'-hidroxi-l'-pentinil)-3P-hidroxi-5p-pregnan-20-ona (100 mg), e em seguida 3P-(5l-.hidroxi-l’-pentinil)-3a-hidroxi-5P-pregnan-20-ona (650 mg) na forma de um sólido incolor; p.f. 160-163°C; Rt-em TLC (tolueno:acetona:EtOAc 70:15:15) = 0,28.
Utilizou-se um método análogo para preparar: 3P-(4'-hidroxi-l'-butinil)-3a-hidroxi-5P-pregnan-20-ona; 3P-(4'-hidroxi-l '-butínil)-3a-hidroxi-5P-l 9-norpregnan-20-ona; 3β-(4'-hidroxi-l'-butinil)-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona; 3p-[4'(R'S)-hidroxi-l'-pentinil)-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona; 3P-[3,(R/’S)-hidroxi-r-butinil)-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona, e 3P-(3'-hidroxi-r-propinil)-3a-hidroxi-5P-pregnan-20-ona.
Exemplo 23 (referência)
Sal de sódio de 5'-hemi-succinato de 3B-(5'-hidroxi-l'-pentinilV3a-hidroxi-5B- pregnan-20-ona a. 5'-hemi-succinato de 3B-(5Miidroxi-l'-pentini0-3a-hidroxi-5B-pregnan-20-ona
Tratou-se uma solução de 3p-(6’-hidroxi-r-hexinil)-3a-hidroxi-5P-pregnan-20-ona (350 mg, 0,87 mmol) em piridina (3 ml) com anidrido succínico (380 mg, 3,8 mmol) e 4-(N,N-dimetil)aminopiridina (20 mg). Aqueceu-se a mistura a 65-70°C durante 1 h. A TLC mostrou uma conversão de 100%. Arrefeceu-se até à temperatura ambiente e vazou-se em HC1 2N em gelo. O material orgânico foi extractado com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com HC1 0,2N, água e salmoura. Após secagem sobre MgS04 anidro, a solução foi filtrada e evaporada para se obter o produto bruto (900 mg). Este produto bruto foi então dissolvido numa pequena quantidade de CHjCL e vazado numa coluna de sílica gel. Por meio de uma eluição com uma mistura de hexano:acetona (7:3) obteve-se 5’-hemi-succinato de 3P-(5'-hidroxi-l'-pentinil)-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona (350 mg); Rf em TLC (hexano:acetona:AcOH 70:30:0,5) = 0,25. 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ 28
b. Sal de sódio de 5'-hemi-succinato de 3B-(5’4iidroxi-l'-pentini11-3a-hidroxi-5P- pregnan-20-ona
Agitou-se uma mistura do hemi-succinato acima descrito (345 mg), NaHCCh (60 mg), água (5 ml), THF (2 ml) e CELCL (1 ml) à temperatura ambiente durante 1 h. O solvente foi removido e o resíduo foi liofilizado, obtendo-se o sal de sódio na forma de um sólido incolor (340 mg).
Utilizou-se um método análogo para preparar sais de sódio de hemi-succinatos de: 3 p-(4'-hidroxi-1 '-butinil)-3a-hidroxi-5 P-pregnan-20-ona; 3 P-(4'-hidroxi-1 '-butinil)-3a- hidroxi-5 β-19norpregnan-20-ona; 3 P-(4'-hidroxi-1 '-butinil)-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona; 3P-(4'(R/S)-hidroxi-l'-pentinil)-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona; 3P-(3'(R/S)-hidroxi-l'-butinil)-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona; e 3P-(3’-hidroxi-l '-propinil)-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona.
Exemplo 24 (referência) 3B-(5l-acetoxi-r-pentinil)-3a-hidroxi-5B-pregnan-20-ona
Tratou-se uma solução de pirídina (280 mg) em CELCL (2 ml) com cloreto de acetilo (280 mg) a 0-5°C. Adicionou-se uma solução de 3P-(5Miidroxi-l'-pentiml)-3a-hidroxi-5P-pregnan-20-ona (130 mg) em ClUCb (3 ml). Continuou-se a agitação a 0°C durante 20 min. A TLC mostrou uma conversão de 100%, e assim a mistura foi vazada em HC1 2N em gelo (20 g, 2 ml). O material orgânico foi extractado com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com HC1 0,2N, água e salmoura. Após secagem sobre MgSOj anidro, a solução foi filtrada e evaporada para se obter o produto bruto. Este produto bruto foi então dissolvido numa pequena quantidade de CELCL e vazado numa coluna de sílica gel. A eluição com uma mistura de tolueno:acetona (9:1) originou 3P-(5'-acetoxi-l'-pentinil)-3<x-hidroxi-5p-pregnan-20-ona (100 mg); p.f. 84.87°C; Rf em TLC (hexano:acetona 70:30) = 0,38.
Exemplo 25 (referência) 3B-f4l-acetoxi-r-butinin-3a-hidroxi-5B-pregnan-20-ona
Tratou-se uma solução de piridina (280 mg) em CELCL (2 ml) com cloreto de acetilo (280 mg) a 10°C. Adicionou-se uma solução de 3p-(4'-hidroxi-r-butinil)-3a-hidroxi-5P-pregnan-20-ona (110 mg) em CH2CI2 (3 ml). Continuou-se a agitação a 10°C durante 30 min. A TLC mostrou uma conversão de 100%. e assim a mistura foi vazada em HC1 2N em gelo (20 g, 3 ml). O material orgânico foi extractado com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com HC1 0,2N, água e salmoura. Após secagem sobre MgS04 anidro, a solução foi
84 866
ΕΡ Ο 752 860/PT filtrada e evaporada para se obter o produto bruto. Este produto bruto foi então dissolvido numa pequena quantidade de CH2CI2 e vazado numa coluna de sílica gel. A eluição com uma mistura de hexano:acetona (4:1) originou 3P-(4'-acetoxi-T-butinil)-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona (92 mg); p.f. 170-173°C; Rt-em TLC (hexano:acetona 70:30) = 0,3.
Exemplo 26 (referência) 313-('6,-acetoxi-l'-hexinil)-3a-hidroxi-5B-pregnan-20-ona
Tratou-se uma solução de piridina (2 ml) em CH2CI2 (10 ml) com cloreto de acetilo (2 ml) a 0°C. Adicionou-se uma solução de 3P-(6Miidroxi-lMiexinil)-3ct-hidroxi-5p-pregnan-20-ona (400 mg, 0,96 mmol) em CH2CI2 (5 ml). Continuou-se a agitação a 0°C durante 20 min. A TLC mostrou uma conversão de 100%, e assim a mistura foi vazada em HC1 2N em gelo (50 g, 11 ml). O material orgânico foi extractado com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com HC1 0,2N, água e salmoura. Após secagem sobre MgSCL anidro, a solução foi filtrada e evaporada para se obter 0 produto bruto (500 mg). Este produto bruto foi então dissolvido numa pequena quantidade de CH2CI2 e vazado numa coluna de sílica gel. A eluição com uma mistura de tolueno:acetona (95:5) originou 3P-(6'-acetoxi-l'-hexinil)-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona (130 mg); p.f. S5-87ÚC; Rt-em TLC (toIueno:acetona 93:7) = 0,2.
Exemplo 27 (referência) 3a-hidroxi-3B-r3-(2,-propiniloxi)-l-propinil1-5p-pregnan-20-ona
Tratou-se uma solução de éter propargílico (0,3 ml, 3 mmol) em THF seco (10 ml) com n-BuLi (2,4M em THF, 3 mmol, 1,25 ml) a -70°C. Após agitação da mistura a -75°C durante 0,5 h, adicionou-se uma solução de 20-(1,2-etanodiilacetal)cíclico de 5p-pregnan-3,20-diona, (360 mg, 1 mmol) em THF (10 ml) e a mistura foi agitada a -78°C durante 1 h. Removeu-se 0 banho de arrefecimento e a mistura foi neutralizada com solução de NH4CI (5 ml). Removeu-se o solvente e o resíduo foi em seguida dissolvido em acetona (40 ml). Após adição de HC1 IN (4 ml) agitou-se a solução à temperatura ambiente durante 15 min. Adicionou-se solução saturada de NaHCCh para neutralizar o ácido. Removeram-se os solventes e o resíduo foi extractado com EtOAc. Lavou-se a camada orgânica com água e salmoura. Após secagem sobre MgSCL anidro, filtrou-se a solução e evaporou-se para se obter o produto bruto. Este produto bruto foi então dissolvido numa pequena quantidade de CH2CI2 e vazado numa coluna de sílica gel. Por eluição com uma mistura de tolueno:acetona (95:5) obteve-se 3p-hidroxi-3a-[3-(2’-propiniloxi)-l-propinil]-5P-pregnan-20-ona (31 mg) como uma primeira fracção. Após nova eluição com o mesma mistura de solventes obteve-se 3a-hidroxi-3P-[3-(2'-propiniloxi)-l-propinil]-5P-pregnan-20-ona (255 mg) na forma de um sólido incolor; p.f. 103-106°C; Rt-em TLC (tolueno:acetona 95:5) = 0,39. 30 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ
Exemplo 28 (referência) 3a-hidroxi-3B-(3-metoxi-l-propinil)-5B-pregnan-20-ona
Tratou-se uma solução de éter propargílico (0,25 ml, 3 mmol) em THF seco (10 ml) com n-BuLi (2,4M em THF, 2,9 mmol, 1,20 ml) a -70°C. Após agitação da mistura a -75°C durante 0,5 h, adicionou-se uma solução de 20-(1,2-etanodiilacetal)cíclico de 5p-pregnan-3,20-diona, (185 mg, 0,5 mmol) em THF (10 ml) e a mistura foi agitada a -78°C durante 20 min. Removeu-se o banho de arrefecimento e a mistura foi neutralizada com solução de NH4CI (2 ml). Removeu-se o solvente e o resíduo foi em seguida dissolvido em acetona (25 ml). Após adição de HC1 2N (2 ml), agitou-se a solução à temperatura ambiente durante 15 min. Adicionou-se solução saturada de NaHCCh para neutralizar o ácido. Removeram-se os solventes e o resíduo foi extractado com EtOAc. Lavou-se a camada orgânica com água, e salmoura. Após secagem sobre MgSCTt anidro, filtrou-se a solução e evaporou-se para se obter o produto bruto (250 mg). Este produto bruto foi então dissolvido numa pequena quantidade de CH2CI2 e vazado numa coluna de sílica gel. Por eluição com uma mistura de tolueno:acetona (93:7) obteve-se 3p-hidroxi-3a-(3-metoxi-l-propinil)-5B-pregnan-20-ona (119 mg) como uma primeira fracção. Após nova eluição com a mesma mistura de solventes, obteve-se se 3a-hidroxi-3p-(3-metoxi-l-propinil)-5p-pregnan-20-ona (115 mg) na forma de um sólido incolor; p.f. 155-159°C; Rt em TLC (hexano:acetona 7:3) = 0,25.
Exemplo 29 (referência) 3a-hidroxi-3B-r3-(4'-piridiniloxi)-l-propinill-5B-pregnan-20-ona
Tratou-se uma solução de éter propargílico de 4-piridilo (peparado de acordo com Thummel et al, J. Org. Chem., 43, 4882) (173 ml, 1,3 mmol) em THF seco (15 ml) com n-BuLi (2,5M em THF, 1,3 mmol, 0,52 ml) a -70°C. Após agitação da mistura a -75°C durante 0,5 h, adicionou-se uma solução de 20-(1,2-etanodiilacetal)cíclico de 5P-pregnan-3,20-diona, (180 mg, 0,5 mmol) em THF (15 ml) e a mistura foi agitada a -78°C durante 20 min. Removeu-se o banho de arrefecimento e continuou-se a agitação à temperatura ambiente durante 1 h. A mistura foi neutralizada com solução de NH4C1 (5 ml). Removeu-se o solvente e o resíduo foi em seguida dissolvido em acetona (25 ml). Após adição de HC1 2N (2 ml), agitou-se a solução à temperatura ambiente durante 20 min. Adicionou-se solução saturada de NaHCCL para neutralizar 0 ácido. Removeram-se os solventes e 0 resíduo foi extractado com EtOAc. Lavou-se a camada orgânica com água e salmoura. Após secagem sobre MgS04 anidro, filtrou-se a solução e evaporou-se para se obter 0 produto bruto (250 mg). Este produto bruto foi então dissolvido numa pequena quantidade de CH2CI2 e vazado numa coluna de sílica gel. Por eluição com uma mistura de CH2CI2'.acetona (90:10) obteve-se 3a-hidroxi-3p-[3-(4'-piridiniloxi)-l-propinil]-5B-pregnan-20-ona (145 mg) na forma de
84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ 31 um sólido incolor; p.f. 84-90°C; Rt· em TLC (C^C^acetona 85:15) = 0,17.
Exemplo 30 (referência) 3a-hidroxi-3B-r3-(TH-1.2.3-triazol-r-il~)-l-propinill-5B-preo;nan-20-ona
Tratou-se uma solução de 1 -(2-propinil)-1 Η-1,2,3-triazolo (preparada por reacção do triazolo com brometo de propargilo) (77 mg, 0,72 mmol) em THF seco (10 ml) com n-BuLi (2,5M em THF, 0,72 mmol, 0,28 ml) a -70°C. Após agitação da mistura a -75°C durante 0,5 h, adicionou-se uma solução de 20-(1,2-etanodiilacetal)cíclico de 5B-pregnan-3,20-diona (130 mg, 0,36 mmol) em THF (10 ml) e a mistura foi agitada a -78°C durante 1 h. Removeu-se o banho de arrefecimento e a mistura foi neutralizada com solução de NH4CI (1 ml). Removeu-se o solvente e o resíduo foi em seguida dissolvido em acetona (25 ml). Após adição de HC1 2N (2 ml) agitou-se a solução à temperatura ambiente durante 30 min. Adicionou-se solução saturada de NaHCCb para neutralizar o ácido. Removeram-se os solventes e o resíduo foi extractado com EtOAc. Lavou-se a camada orgânica com água, e salmoura. Após secagem sobre iMgSCL anidro, filtrou-se a solução e evaporou-se para se obter o produto bruto. Este produto bruto foi então dissolvido numa pequena quantidade de CH2CI2 e vazado numa coluna de sílica gel. Por eluiçâo com uma mistura de tolueno:acetona (85:15) obteve-se 3cx-hidroxi-3 β-[3-( 1 Ή-1,2,3-triazol-1 '-il)-1 -propinil]-5B-pregnan-20-ona (56 mg) na forma de um sólido incolor; p.f. 142-144°C; Rt- em TLC (hexano:acetona 7:3) = 0,33.
Exemplo 31 (referência') 3a-hidroxi-3B-f3-('2,H-1.2.3-triazol-2'-in-l-propinill-5B-pregnan-20-ona
Tratou-se uma solução de 2-(2-propinil)-2H-l,2.3-triazolo (preparado por reacção do triazolo com brometo de propargilo) (35 mg, 0,33 mmol) em THF seco (10 ml), com n-BuLi (2,5M em THF, 0,33 mmol, 0,15 ml) a -70°C. Após agitação da mistura a -75°C durante 0,5 h, adicionou-se uma solução de 5P-pregnan-3,20-diona. 20-(1,2-etanodiilacetal)cíclico (60 mg, 0,16 mmol) em THF (10 ml) e a mistura foi agitada a -78°C durante lh. Removeu-se o banho de arrefecimento e a mistura foi neutralizada com solução de NH4C1 (1 ml). Removeu-se o solvente e o resíduo foi em seguida dissolvido em acetona (25 ml). Após adição de HC1 2N (2 ml) agitou-se a solução à temperatura ambiente durante 30 min. Adicionou-se solução saturada de NaHCCb para neutralizar o ácido. Removeram-se os solventes e o resíduo foi extractado com EtOAc. Lavou-se a camada orgânica com água, e salmoura. Após secagem sobre MgS04 anidro, filtrou-se a solução e evaporou-se para se obter o produto bruto. Este produto bruto foi então dissolvido numa pequena quantidade de CH2CL e vazado numa coluna de sílica gel. Por eluição com uma mistura de tolueno:acetona
84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ (85:15) obteve-se pregnan-3,20-diona (20 mg) como uma primeira fracção. Após nova eluição com o mesmo solvente obteve-se 3a-hidroxi-3P-[3-(2'H-l,2,3-triazol-2'-il)-l-propinil]-5P-pregnan-20-ona (20 mg) na forma de um sólido incolor; p.f. 139-140°C; Rf em TLC (hexano:acetona 4:1) = 0,17.
Exemplo 32 (referência) 3a-hidroxi-3B-(2,-tieni0etinil-5B-pregnan-20-ona
Agitou-se uma solução de 4-iodotiofeno (63 mg, 0,3 mmol), 3P-etinil-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-diona (103 mg, 0,3 mmol) em trietilamina desgaseificada seca (1 ml) sob árgon, a 23°C. Adicionou-se dicloreto de bis(trifenilfosfina)paládio(II) (5 mg) e Cul (5 mg) e agitou-se a mistura a esta temperatura durante 45 min. Adicionou-se CH2CI2 (5 ml) e agitou-se a mistura a 23°C, durante 1 h. A TLC mostrou uma conversão de 100% do material de partida, e assim, o solvente foi removido e o resíduo foi purificado por cromatografia em sílica gel. Por eluição com hexano:acetona (4:1) obteve-se 3a-hidroxi-3P-(2'-tienil)etinil-5P-pregnan-20-ona (50 mg) na forma de um sólido incolor; p.f. 205-206°C; Rt- em TLC (hexano:acetona 4:1) = 0,35.
Utilizou-se um método análogo para preparar o 3a-hidroxi-3B-(5'-acetil-2'-tieni)etinil-5P-pregnan-20-ona: p.f. 226-228°C, Rr- em TLC (hexano:acetona 4:1) = 0,14.
Exemplo 33 (referência) 3a-hidroxi-3B-(3,-fenil-r-propinil)-5B-pregnan-20-ona
Tratou-se uma solução de 3-fenil-l-propino (0,25 ml, 2 mmol) em THF seco (17 ml) com n-BuLi (2,5M em THF, 2 mmol, 0,8 ml) a -70°C. Após agitação da mistura a -75°C durante 10 min, adicionou-se uma solução de 20-(1,2-etanodiilacetal)cíclico de 5B-pregnan-3,20-diona (206 mg, 0,6 mmol) em THF (10 ml) e a mistura foi agitada a -78°C durante 20 min. Removeu-se 0 banho de arrefecimento e a mistura foi neutralizada com solução de NH4CI (5 ml). Removeu-se o solvente e 0 resíduo foi em seguida dissolvido em acetona (15 ml). Após adição de HC1 2N (4 ml) agitou-se a solução à temperatura ambiente durante 20 min. Adicionou-se solução saturada de NaHCO;, para neutralizar 0 ácido. Removeram-se os solventes e o resíduo foi extractado com EtOAc. Lavou-se a camada orgânica com água, e salmoura. Após secagem sobre MgSCL anidro, filtrou-se a solução e evaporou-se para se obter o produto bruto (460 mg). Este produto bruto foi então dissolvido numa pequena quantidade de CH2CI2 e vazado numa coluna de sílica gel. Por eluição com uma mistura de tolueno:acetona (85:15) obteve-se fenilpropino não reagido como uma primeira fracção. Após nova eluição com 0 mesmo solvente, obteve-se 3a-hidroxi-3B-(3'-fenil-l'-propinil)-5B-
84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ pregnan-20-ona (175 mg) na forma de um sólido incolor; p.f. 124-132°C; Rt- em TLC (hexano:acetona 7:3) = 0,46.
Exemplo 34 ('referência! 3a-hidroxi-3B-(3'-fenilpropil)-5B-pregnan-20-ona
Hidrogenou-se uma solução do derivado de fenilpropinilo acima descrito (50 mg) em EtOAc (10 ml) sobre Pd/C (10 mg, 5%) sob 2 atm de H? durante 45 min. A mistura foi em seguida filtrada através de uma pequena almofada de Celite e concentrada para se obter o composto em título na forma de um sólido incolor (40 mg); p.f. 41-46°C: Rt· (hexano:acetona 7:3) = 0,48.
Exemplo 35 ('referência) 3a-hidroxi-3B-[j-n'H-pirazol-T-il)-l-propinil]-5B-pregan-20-ona
Tratou-se uma solução de l-(2-propinil)-lH-pirazolo) (preparada por reacção de pirazolo com brometo de propargilo) (160 mg, 1,5 mmol) em THF seco (15 ml) com n-BuLi (2.5M em THF, 1,5 mmol, 0,6 ml) a -70°C. Após agitação da mistura a -75°C durante 0,5 h, adicionou-se uma solução de 20-( 1,2-etanodiilacetal)cíclico de 5P-pregnan-3,20-diona (180 mg, 0,5 mmol) em THF (15 ml) e agitou-se a mistura a -78°C durante lh. Removeu-se o banho de arrefecimento e a mistura foi neutralizada com solução de NH4CI (1 ml). Removeu-se o solvente e o resíduo foi em seguida dissolvido em acetona (25 ml). Após adição de HC1 2N (2 ml) agitou-se a solução à temperatura ambiente durante 30 min. Adicionou-se solução saturada de NaHCCL para neutralizar o ácido. Removeram-se os solventes e o resíduo foi extractado com EtOAc. Lavou-se a camada orgânica com água, e salmoura. Após secagem sobre MgS04 anidro, filtrou-se a solução e evaporou-se para se obter o produto bruto. Este produto bruto foi então dissolvido numa pequena quantidade de CH2CI? e vazado numa coluna de sílica gel. Por eluição com uma mistura de tolueno:acetona (9:1) obteve-se 3a-hidroxi-3B-[3-(TH-pirazol-T-il)-l-propinil]-5B-pregnan-20-ona (80 mg) na forma de um sólido incolor: p.f 113-115°C; Rt em TLC (tolueno:acetona 9:1) = 0,19.
Exemplo 36 (referência) 3B-(3'-acetilfeniletinil)-3a-hidroxi-5B-pregnan-20-ona
Agitou-se uma solução de 3-iodoacetofenona (74 mg, 0,3 mmol), 3β-εόηί1-3α-hidroxi-5P-pregnan-20-ona (103 mg, 0,3 mmol) em trietilamina desgaseificada seca (1 ml) sob árgon a 23°C. Adicionou-se dicloreto de bis(trifenilfosfina)paládio(II) (5 mg) e Cul (5 mg) e agitou-se a mistura a esta temperatura durante 45 min. Adicionou-se CH2CI2 (5 ml) e 34 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ agitou-se a mistura a 23°C durante 1,5 h. A TLC mostrou uma conversão de 100% do material de partida, e assim o solvente foi removido e o resíduo purificado por cromatografia em sílica gel. Por eluição com hexano:acetona (85:15) obteve-se 3p-(3'-acetilfeniletinil)-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona (30 mg) na forma de um sólido incolor; p.f, °C; Rf em TLC (hexano: acetona 4:1) = 0.
Exemplo 37 (referência) 3B-(3,-acetoxi-3'-propinil)-3a-hidroxi-5B-pregnan-20-ona
Tratou-se uma solução de piridina (280 mg) em CELCL (2 ml) com cloreto de acetilo (280 mg) a 0-5°C. Adicionou-se uma solução de 3p-(3'-hidroxi-T-propinil)-3a-hidroxi-5P-pregnan-20-ona (130 mg) em CELCL (3 ml). Continuou-se a agitação a 0°C durante 30 min. A TLC mostrou uma conversão de 100%, e assim, a mistura foi vazada em HC1 2N em gelo (20 g, 3 ml). Extractou-se o material orgânico com EtOAc. Lavou-se a camada orgânica com HCl 0.2N, água, e salmoura. Após secagem sobre MgSCL anidro, filtrou-se a solução e evaporou-se para se obter o produto bruto (150 mg). Este produto bruto foi então dissolvido numa pequena quantidade de CtLCL e vazado numa coluna de sílica gel. Por eluição com uma mistura de tolueno:acetona (4:1) obteve-se 3p-(3'-acetoxi-T-propinil)-3a-hidroxi-5P-pregnan-20-ona (110 mg); p.f. 132-150°C; Rt-em TLC (hexano:acetona 70:30) = 0,37.
Exemplo 38 (referência) 3a-hidroxi-3 B-(4-hidroxibutin-1 -il)-21 -(1 -imidazolilí-5 B-pregnan-20-ona a. 21 -bromo-3a-hidroxi-3B-(4-hidroxibutin-141)-5 B-pregnan-20-ona
Tratou-se uma solução de 3a-hidroxi-3p-(4-hidroxibutin-l-il)-5p-pregnan-20-ona (386 mg, l mmol) em MeOH (20 ml) com duas gotas de cloreto de acetilo, seguido de bromo (1,2 mmol). Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 2,5 h e esta foi vazada em água gelada. O sólido separado foi recolhido por filtração, lavado com água, seco (410 mg). O sólido semi-seco foi em seguida dissolvido em EtOAc e seco sobre MgS04 anidro. Por filtração e remoção do solvente obteve-se o derivado bromo bruto e este foi utilizado tal e qual para o passo seguinte. b. 3a-hidroxi-3B-f4-hidroxibutin-l-iD-21-f l-imidazoliD-5B-pregnan-20-ona
Tratou-se uma suspensão de NaH (138 mg, 95%, 5,46 mmol) em THF (10 ml) com uma solução de imidazolo (345 mg. 5,1 mmol) em THF (10 ml) à temperatura ambiente. Após agitação da mistura durante 30 min adicionou-se uma solução do derivado bromo bruto Ιι 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ (95 mg, 0,2 mmol) em THF (10 ml). A agitação foi continuada à temperatura ambiente durante 1 hora. Adicionou-se solução saturada de NH4C1 e removeu-se o solvente. Extractou-se o resíduo com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com água e salmoura. Após secagem sobre MgS04 anidro, filtrou-se a solução e evaporou-se para se obter o produto bruto (100 mg). Este produto bruto foi em seguida dissolvido numa pequena quantidade de CH2CI2 e vazado numa coluna de sílica gel. Por eluição com a mistura CH2Cl2:MeOH:NEt.i (95:4,5:0,5) obteve-se 3a-hidroxi-3p-(4-hidroxibutin-l-il)-21-(l-imidazolil)-5p-pregnan-20-ona (40 mg) na forma de um sólido incolor; p.f. 117-119°C; Rr em TLC (CH2Cl2:MeOH:NEt3 95:4,5:0,5) 0,21.
De modo semelhante, preparou-se 3a-hidroxi-3P-(4-hidroxibutin-l-il)-21-(l,2,4-triazol-l-il)-5p-pregnan-20-ona; p.f. 208-210°C; Rf- em TLC (CH2Cl2:MeOH;NEt3 95:4,5:0,5) 0,24; 3a-hidroxi-3p-(4-hidroxibutin-1 -i l)-21 -(tetrazol-1 -il)-5P-pregnan-20-ona; p.f. 110-112°C; Rt- em TLC (CH2Cl2:MeOH:NEt;. 96:3,5:0,5) 0,11; 3a-hidroxi-3p-(4-hidroxibutin-l-il)-21-(l,2,3-triazol-l-il)-5p-pregnan-20-ona; p.f 10l-104°C; Rr- em TLC (CH2Cl2:MeOH:NEt3 95:4.5:0,5) 0,2.
Exemplo 39 (referência) 3a-hidroxi-3P-('4-hidroxibutin-l-ilV21-(l-imidazoliD-5P-19-norpregnan-20-ona a. 21 -bromo-3a-hidroxi-3B-(4-hidroxibutin-1 -il)-5B-l 9-norpregnan-20-ona
Aqueceu-se uma solução de 3a-hidroxi^-(4-hidroxibutin-l-il)-5p-l9-norpregnan-20-ona (710 mg, 1,9 mmol) em MeOH (60 ml) a 33°C e tratou-se com duas gotas de cloreto de acetilo, seguido de bromo (2,28 mmol, 0,116 ml). Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 1,5 h e esta foi vazada em água gelada. O sólido separado foi recolhido por filtração, lavado com água, seco. Este sólido semi-seco foi em seguida dissolvido em EtOAc e seco sobre MgS04 anidro. Por filtração e remoção do solvente obteve-se o derivado bromo bruto (870 mg) e este foi utilizado como tal para o passo seguinte. b. 3a-hidroxi-3β-(4-hidroxibutin-1 -il)-21 -(1 -imidazolil)-5β-19-norpregnan-20-ona
Tratou-se uma suspensão de NaH (138 mg, 95%, 5,46 mmol) em THF (10 ml) com uma solução de imidazolo (345 mg. 5,1 mmol) em THF (10 ml) à temperatura ambiente. Após agitação da mistura durante 30 min, adicionou-se uma solução do derivado bromo bruto (90 mg, 0,2 mmol) em THF (10 ml). A agitação foi continuada à temperatura ambiente durante 1 hora. Adicionou-se solução saturada de NH4C1 e removeu-se 0 solvente. Extractou-se 0 resíduo com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com água e salmoura.
Após secagem sobre MgSCL anidro, filtrou-se a solução e evaporou-se para se obter o produto bruto (100 mg). Este produto bruto foi em seguida dissolvido numa pequena quantidade de CEbCE e vazado numa coluna de sílica gel. Por eluição com a mistura CH2Cl2:MeOH:NEt3 (95:4,5:0,5) obteve-se 3a-hidroxi-33-(4-hidroxibutin-l-il)-21-(l-imidazolil)-5P-19-norpregnan-20-ona (25 mg) na forma de um sólido incolor: p.f. 118-127°C; Rf em TLC (CH2Cl2:MeOH:NEt3 95:4.5:0.5) 0,28.
Exemplo 40 3«-hidroxi-3B-(4-hidroxibutin-l-il)-21-( 1.2.3-triazol-2-iQ-5fi-19-norpregnan-20-ona e 3a-hidroxi-3fi-('4-hidroxibutin-l-i0-21-(1.2.3-triazol-l-iQ-53-19-norpregnan-20-ona
Tratou-se uma suspensão de NaH (11 mg, 95%, 0,44 mmol) em THF (10 ml) com uma solução de 1,2,3-triazolo (30 mg. 0,44 mmol) em THF (10 ml) à temperatura ambiente. Após agitação da mistura durante 30 min adicionou-se uma solução de 21-bromo3a-hidroxi-3P-(4-hidroxibutin-l-il)-5P-pregnan-20-ona (100 mg, 0,22 mmol) em THF (10 ml). A agitação foi continuada à temperatura ambiente durante l hora. Adicionou-se solução saturada de NH4CI e removeu-se o solvente. Extractou-se o resíduo com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com água e salmoura. Após secagem sobre MgSCTj anidro, filtrou-se a solução e evaporou-se para se obter o produto bruto (100 mg). Este produto bruto foi em seguida dissolvido numa pequena quantidade de CH2G2 e vazado numa coluna de sílica gel. Por eluição com a mistura de CH2Cl2:acetona (4:1) obteve-se 3a-hidroxi-3P-(4-hidroxibutin-l-il)-21-(2H-l,2,3-triazol-2-il)-5P-19-norpregnan-20-ona (15 mg) como uma primeira fracção; p.f. 158-160°C; Rf em TLC (CH2Cl2:acetona 4:1) 0,36. Após nova eluição com a mesma mistura de solventes obteve-se 3a-hidroxi-3P-(4-hidroxibutin-l-il)-21-(lH-l,2,3-triazol-l-il)-5P-19-norpregnan-20-ona (15 mg); p.f. 1SS-190°C; Rf em TLC (CHzCLiacetona 4:1)0,2.
Exemplo 41 3a-hidroxi-2B-morfoliml-21-rr-(r.2'.4'-triazoliD]-5a-pregnan-20-ona
Adicionou-se hidreto de sódio (36 mg, 1,50 mmol) a uma solução de 1,2,4-triazolo (108 mg, 1,57 mmol) em THF seco (2,5 ml). Agitou-se a mistura a 25°C sob árgon durante 0,5 h. Em seguida adicionou-se 3a-hidroxi-2P-morfolinil-21-bromo-5a-pregnan-20-ona (130 mg, 0,27 mmol) e a mistura foi agitada a 25°C sob árgon, durante 2,5 horas. Adicionou-se água (20 ml) lentamente à mistura reaccional. O produto foi extractado com acetato de etilo (3 x 25 ml). Lavaram-se os extractos combinados com salmoura (20 ml) e água (3 x 20 ml). A solução orgânica obtida foi seca sobre sulfato de sódio e 0 solvente foi removido sob
vácuo para se obter o produto bruto (130 mg). O produto bruto (90 mg, 71%) foi obtido por cromatografía instantânea (30 g de sílica gel e 300 ml de mistura de solventes de CH2Cl2:MeOH:Et3N = 95:4.5:0.5, Rf = 0,14).
Exemplo 42 3a-hidroxi-21 -(1 '-uracil)-5a-pregnan-20-ona
Adicionou-se 3a-hidroxi-21-bromo-5a-pregnan-20-ona (400 mg, 1 mmol) a uma suspensão de uracilo (112 mg, 1 mmol) e K2CO3 (138 mg, 1 mmol) em DMF (1,5 ml) e a mistura obtida foi agitada a 25°C durante 65 h. Em seguida vazou-se num funil separador contendo água (60 ml) e acetato de etilo (100 ml). Removeu-se a camada aquosa após agitação e obteve-se 0 sólido branco na camada orgânica, por filtração, como 0 produto (87 mg, 20%); p.f. 262-265°C (decomp.).
Exemplo 43 (referência) S-(3a-hidroxi-5a-preanan-20-on-21-il)tiossulfato de sódio
Adicionou-se, gota a gota, uma solução de tiosulfato de sódio (199 mg, 1,26 mmol) em 10 ml de água a uma solução de 21-bromo-3a-hidroxi-3a-pregnan-20-ona (500 mg, 1,26 mmol) dissolvida em 50 ml de etanol. Deixou-se a reacção sob agitação à temperatura ambiente até a TLC (1:1 acetona/diclorometano) indicar o consumo completo do brometo de partida. Por concentração da reacção sob vácuo obteve-se o tiosulfato desejado contaminado com brometo de sódio. Por cromatografía instantânea (sílica gel eluída com um gradiente de 1:1 a 3:1 de acetona/diclorometano) obteve-se 430 mg (75%) do composto em título na forma de um sólido branco.
De igual maneira foi preparado o S-(3a-hidroxi-5P-metil-5a-pregnan-20-on-21-il)tiossulfato de sódio, purificado por cromatografía instantânea como acima descrito; S-(3a-hidroxi-3P-metoximetil-5a-pregnan-20-on-21-il)tiossulfato de sódio, purificado por recristalização a partir de 50:1 metanol/água; S-(3a-hidroxi-5p-pregnan-20-on-21-il)tiossulfato de sódio, purificado por cromatografía instantânea com sílica gel e 3:1 acetona/etanol; S-[3a-hidroxi-3p-(4'-hidroxibutinil)-5P-pregnan-20-on-21-il]tiossulfato de sódio, purificado por trituração com acetona quente: e S-(3a-hidroxi-3p-trifluorometil-5p-19-norpregnan-20-on-21-il)tiossulfato de sódio, purificado por trituração com acetona quente/clorofórmio.
Exemplo 44 (referência) 3a-hidroxi-3B-(E)-(2-feniletil)-5a-pregnan-20-ona
Benzi Ifenilsulfóxido
Adicionou-se lentamente uma solução de ácido m-cloroperbenzóico (Aldrich, 50-60%; 760 mg, 2,64 mmol se 60%) em 10 ml de CH?Ch a uma solução de sulfureto de benzilfenilo (Aldrich; 1,068 g, 5,33 mmol) em 25 ml de CH2C12 a -78°C. Após aquecimento até à temperatura ambiente e agitação durante a noite, adicionou-se a solução a 20 ml de uma solução saturada de NaHCCb. Separou-se a camada aquosa e extractou-se com CH2CI2 (2 x 10 ml). As camadas orgânicas reunidas foram em seguida secas (MgSO.4) e concentradas. O resíduo foi submetido a cromatografía instantânea (sílica gel, acetona/hexano a 10% e acetona /hexano a 15%), obtendo-se o sulfóxido (632 mg, 55%) na forma de um sólido branco, p.f. 123-126°C. 20.20-etilenodioxi-3a-hidroxi-3B-IT2-(fenilsulfmiD-2-fenirietil-5a-pregnano
Arrefeceu-se a -10°C uma solução de diisopropilamina (Aldrich, destilada de fresco a partir de CaH2; 0,5 ml, 361 mg, 3,57 mmol) em 2 ml de THF seco e tratou-se com uma solução 1,6M de a-BuLí em hexanos (Aldrich; 1,0 ml, 1.6 mmol), adicionada gota a gota por meio de uma seringa. Após 10 min. arrefeceu-se a solução a -75°C e adicionou-se, gota a gota, uma solução de sulfóxido de benzilfenilo (347 mg, 1,60 mmol) em 5 ml de THf seco, por meio de uma seringa, durante 30 min. Adicionou-se à solução amarelo forte resultante 297 mg (0,79 mmol) de 20,20-etilenodioxi-3(i?)-5a-pregnan-3-spiro-2'-oxirano sólido. Deixou-se a solução aquecer até à temperatura ambiente e em seguida aqueceu-se a 50°C. Após 5h, deixou-se a reacção arrefecer até à temperatura ambiente e adicionou-se a 30 ml de água arrefecida em gelo. A mistura resultante foi extractada com EtOAc (3 x 20 ml). As camadas de EtOAc combinadas foram exctraídas com uma solução saturada de NaCl, secas (Na2S04) e concentradas. O resíduo foi purificado por cromatografía instantânea (sílica gel, gradiente de 100% CH2CI2 a 20% acetona/CEfcb), obtendo-se 0 sulfóxido (405 mg, 86%) como uma mistura de dois diastereoisómeros (baseado em dois protões benzílicos em 'H RMN). 3a-hidroxi-3B-rf2-(fenilsulfinil)-2-fenilletill-5a-pregnan-20-ona
Arrefeceu-se uma solução de 20,20-etilenodioxi-3a-hidroxi-3P-[[2-(fenilsulfmil)-2-fenil]etil]-5a-pregnan (1,30 g, 2,21 mmol) em 15 ml de THF num banho de gelo/água e adicionou-se uma solução aquosa de HC1 IN (3 ml) seguido de 2 ml de acetona. Após
agitação à temperatura ambiente durante 70 min, arrefeceu-se de novo a solução a 0°C e adicionou-se a uma mistura EtOAc/água, contendo 6 ml de uma solução saturada de NaHCOí. Extractou-se a camada aquosa duas vezes com EtOAc e as camadas orgânicas combinadas foram extractadas com uma solução saturada de NaCl, secas (Na2S04) e concentradas. O resíduo foi utilizado no passo seguinte, sem purificação. 3a-hidroxi-3B-(E)-(2-feniletinil)-5a-pregnan-20-ona
Aqueceu-se uma suspensão de 3a-hidroxi-3B-[[2-(fenilsulfinil)-2-fenil]etil]-5a-pregnan-20-ona (963 mg, 1,76 mmol) em 6 ml de p-cimeno contendo 0,95 ml de 2,4,6-colidina, a 135°C, durante l h. Após repouso durante a noite a 0°C, o produto tinha precipitado e foi isolado por filtração. Lavou-se o produto bruto com /?-cimeno frio (3x5 ml) e hexano (num total de 120 ml) e obteve-se 445 mg do composto em título na forma de um sólido branco, p.f. 209-213°C.
Exemplo 45 (referência) 3a-hidroxi-2B-trimetilsililacetileno-5a-pregnan-20-ona
Arrefeceu-se uma solução de trimetilsililacetileno (0,5 ml, 0,347 g, 3,54 mmol) em 4 ml de THF seco a -78°C e tratou-se com uma solução 2,5M de /i-BuLi em hexanos. Adicionou-se BFj-EtiO (0,3 ml, 0,346 g, 2.44 mmol) através de uma seringa. Após agitação a -78°C durante 5 min, adicionou-se uma solução de 20,20-etilenodioxi-5a-pregnan-2a,3a-epóxido (557 mg, 1,54 mmol) em 3 ml de THF seco. durante 12 min. Após mais 2,5 h, adicionou-se à reacçào uma solução saturada de NH4CI. A mistura resultante foi extractada com EtOAc (3 x 25 ml). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com uma solução de salmoura, secas (Na^SOj) e concentradas sob pressão reduzida. A mistura reaccional bruta foi dissolvida em 10 ml de acetona, arrefecida num banho de gelo/água e tratada com uma solução de HC1 IN (1 ml). Após 1 h à temperatura ambiente, a reacçào foi adicionada a uma mistura de éter/água contendo 1 ml de uma solução saturada de NaHC03. A camada aquosa foi lavada duas vezes com éter e as camadas de éter reunidas foram lavadas com uma solução saturada de NaCl, secas (NajSO-O e concentradas. Por cromatografia instantânea em coluna (sílica gel, 12,5% acetona/hexano) obteve-se 249 mg do composto em título na forma de um sólido branco, p.f. 164-167°C.
Utilizou-se o processo acima para a preparação de 3a-hidroxi-2p-(3'-metoxi-l'-propinil)-5a-pregnan-20-ona. A hidrólise do composto de trimetilsililo com BÇCCh/MeOH originou 3a-hidroxi-2p- 40 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ etinil-5a-pregnan-20-ona na forma de um sólido branco; p.f. 179-189°C (decomp.)
Exemplo 46 (referência) 3a.21-di-hidroxi-3B-etinil-5p-pregnan-20-ona a. 21 -bromo-3 B-etinil-3a-hidroxi-5 B-pregnan-20-ona
Tratou-se uma solução de 3p-etinil-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona (3 g, 8,77 mmol) em MeOH (110 ml) com duas gotas de HBr (48%), seguido de bromo (0,5 ml, 10,8 mmol). Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante 1 h e esta foi vazada em água gelada. O sólido separado foi recolhido por filtração, lavado com água e seco (3,2 g). Este sólido semi-seco foi em seguida dissolvido em EtOAc e seco sobre MgSCL anidro. Por filtração e remoção do solvente obteve-se o derivado bromo bruto. Este produto bruto foi então dissolvido numa pequena quantidade de CPLCL e vazado numa coluna de sílica gel. Por eluiçào com uma mistura de hexano:EtOAc (4:1) obteve-se 21 -bromo-3P-etinil-3a-hidroxi-5P-pregnan-20-ona (3,2 g). b. 3a.21-di-hidroxi-3B-etinil-5B-pregnan-20-ona
Tratou-se uma solução do derivado bromo acima descrito (3,2 g) em acetona (100 ml) com ácido trifluoroacético (5,8 ml, 76 mmol) e trietilamina (8,5 ml). Levou-se a mistura ao refluxo durante 30 min e em seguida adicionou-se sal de sódio de ácido trifluoroacético (10 g), em porções, durante um período de 10 h. Após arrefecimento à temperatura ambiente, adicionou-se uma solução saturada de NaHCO;,. Removeu-se o solvente e o resíduo foi extractado com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com água e salmoura. Após secagem sobre MgSCL anidro, filtrou-se a solução e evaporou-se para se obter o produto bruto. Este produto bruto foi em seguida dissolvido numa pequena quantidade de CH2CI2 e vazado numa coluna de sílica gel. Por eluição com a mistura hexano:EtOAc (3:2) obteve-se 3a,21-di-hidroxi-3P-etinil-5P-pregnan-20-ona (1.6 g); p.f. 156-157°C; Rt- em TLC (hexano:acetona 3:1) = 0,2.
Exemplo 47 (referência) 3 B-(4'-acetilfeniletinil)-3a.21 -di-hidroxi-5 B-pregnan-20-ona
Agitou-se uma solução de 4-iodoacetofenona (1.22 g, 4,44 mmol), 3a,21-di-liidroxi-3p-etinil-5p-pregnan-20-ona (1,59 g, 4,44 mmol) em trietilamina desgaseificada seca (7 ml) sob árgon a 23°C. Adicionou-se dicloreto de bis(trifenilfosfma)paládio (15 mg) e Cul (5 mg) e agitou-se a mistura a esta temperatura durante 45 min. Adicionou-se CH2CI2 (30 ml) e 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ 41
agitou-se a mistura a 23HC durante 1,5 h. A TLC mostrou uma conversão de 100% do material de partida, e assim o solvente foi removido e o resíduo purificado por cromatografia em sílica gel. Por eluição com hexano:acetona (4:1) obteve-se 3P-(4'-acetilfeniletinil)-3a,21-di-hidroxi-5p-pregnan-20-ona (1,3 mg) na forma de um sólido incolor; p.f. 181-183°C; Rf em TLC (hexano:acetona 3:2) = 0,14.
Exemplo 48 (referência)
Sal de sódio de 21-hemi-succinato de 3B-(4l-acetilfeniletinil)-3a,21-di-hidroxi-5B- pregnan-20-ona a. hemi-succinato de 3B-(4'-acetilfeniletinil)-3a.21-di-hidroxi-5B-pregnan-20-ona
Tratou-se uma solução de 3P-(4'-acetilfeniletinil)-3a,21-di-hidroxi-5P-pregnan-20-ona (1,3 g, 6,76 mmol) em piridina (8 ml) com anidrido succínico (680 mg, 2,5 mmol) e 4-(N,N-dimetil)aminopiridina (25 mg), aqueceu-se a mistura a 70-75°C durante 2,5 h. A TLC mostrou uma conversão de 100%. Removeu-se a piridina e o resíduo foi extractado com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com HC1 0,1 N. água e salmoura. Após secagem sobre MgSC>4 anidro, filtrou-se a solução e evaporou-se para se obter o produto bruto. Este produto bruto foi então dissolvido numa pequena quantidade de CEbCL e vazado numa coluna de sílica gel. Por eluição com uma mistura de hexano:acetona (7:3) obteve-se 21-hemi-succinato de 3P-(4'-acetilfeniletinil)-3a,21-di-hidroxi-5p-pregnan-20-ona (1,4 g). b. sal de sódio de hemi-succinato de 3B-('4'-acetilfeniletinil)-3a.21-di-hidroxi-5B- pregnan-20-ona
Agitou-se uma mistura do hemi-succinato acima descrito (1,5 g, 2,6 mmol), NaHCCh (220 mg, 2,6 mmol), água (10 ml) e CELCL (16 ml) à temperatura ambiente durante 1 h. Removeu-se o solvente e o resíduo foi liofilizado para se obter o sal de sódio na forma de um sólido incolor (1,4 g).
Exemplo 49 (referência) 3a.21-di-hidroxi-3B-etinil-5a-pregnan-20-ona a. 21-bromo-3B-etinil-3a-hidroxi-5B-pregnan-20-ona
Tratou-se uma solução de 3p-etinil-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona (2,3 g, 6,72 mmol) em MeOH (80 ml) com duas gotas de HBr (4S%), seguido de bromo (0,4 ml, 7,73 mmol). Agitou-se a mistura à temperatura ambiente durante lhe esta foi vazada em água 42 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ gelada. Ο sólido separado foi recolhido por filtração, lavado com água e seco (2,5 g). Este sólido semi-seco foi em seguida dissolvido em EtOAc e seco sobre MgSCL anidro. Por filtração e remoção do solvente obteve-se o derivado de bromo bruto. Este produto bruto foi então dissolvido numa pequena quantidade de CFLCL e vazado numa coluna de sílica gel. Por eluição com uma mistura hexano:EtOAc (85:15) obteve-se 21-bromo-3P-etinil-3a-hidroxi-5cc-pregnan-20-ona (2,1 g). b. 3a.21-di-hidroxi-3B-ennil-5B-pregnan-20-ona
Tratou-se uma solução do derivado de bromo acima descrito (2,1 g, 5 mmol) em acetona (40 ml) com ácido trifluoroacético (3,8 ml, 50 mmol) e trietilamina (5,5 ml). Levou-se a mistura ao refluxo durante 30 min e em seguida adicionou-se sal de sódio de ácido trifluoroacético (10 g), em porções, durante um período de 10 h. Após arrefecimento à temperatura ambiente, adicionou-se uma solução saturada de NaHCO:,. Removeu-se o solvente e 0 resíduo foi extractado com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com água e salmoura. Após secagem sobre MgSCL anidro, filtrou-se a solução e evaporou-se para se obter o produto bruto (1,6 g). Este produto bruto foi em seguida dissolvido numa pequena quantidade de CH2CI2 e vazado numa coluna de sílica gel. Por eluição com a mistura hexano:EtOAc (7:3) obteve-se 3a,21-di-hidroxi-3P-etinil-5a-pregnan-20-ona (1,5 g); p.f. 214-218°C; R, em TLC (hexano:acetona 7:3) = 0,33.
Exemplo 50 (referência) 3B-(4'-acetilfeniletinil)-3a.21-di-hidroxi-5a-preunan-20-ona
Agitou-se uma solução de 4-iodoacetofenona (962 mg, 4 mmol), 3a,21-di-hidroxi-3B-etinil-5a-pregnan-20-ona (1.2 g, 4 mmol) em trietilamina desgaseificada seca (7 ml) sob árgon a 23°C. Adicionou-se cloreto de bis(trifenilfosfina)paládio (15 mg) e Cul (5 mg) e agitou-se a mistura a esta temperatura durante 45 min. Adicionou-se CELCL (25 ml) e agitou-se a mistura a 23°C durante 1,5 h. A TLC mostrou uma conversão de 100% do material de partida, e assim 0 solvente foi removido e o resíduo purificado por cromatografia em sílica gel. Por eluição com hexano:acetona (7:3) obteve-se 3p-(4'-acetilfeniletinil)-3a,21 -di-hidroxi-5a-pregnan-20-ona (750 mg) na forma de um sólido incolor; p.f. 222-225°C; Rf em TLC (hexano:acetona 4:1) = 0,13. 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ 43
Exemplo 5ί (referência)
Sal de sódio de 21-hemi-succinato de 3B-(4'-acetilfeniletiniD-3a.21-di-hidroxi-5a- pregnan-20-ona a. hemi-succinato de 3B-(4'-acetilfeniletinil)-3a.21-di-hidroxi-5a-pregnan-20-ona
Tratou-se uma solução de 3P-(4'-acetilfeniletinil)-3a,21-di-hidroxi-5a-pregnan-20-ona (276 mg, 1,4 mmol) em piridina (4 ml) com anidrido succínico (680 mg, 2,7 mmol) e 4-(N,N-dimetil)aminopiridina (20 mg). Aqueceu-se a mistura a 70-75°C durante 2,5 h. A TLC mostrou uma conversão de 100%. Removeu-se a piridina sob vácuo e o resíduo foi extractado com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com HC1 0,1 N, água e salmoura. Após secagem sobre MgSCL anidro, filtrou-se a solução e evaporou-se para se obter o produto bruto. Este produto bruto foi então dissolvido numa pequena quantidade de CH2CI2 e vazado numa coluna de sílica gel. Por eluição com uma mistura hexanoiacetona (7:3) obteve-se hemi-succinato de 3P-(4’-acetilfeniletinil)-3a,21-di-hidroxi-5a-pregnan-20-ona (400 mg). b. sal de sódio de hemi-succinato de 3B-(4,-acetilfeniletinil)-3a.21-di-hidroxi-5a- pregnan-20-ona
Agitou-se uma mistura do hemi-succinato acima descrito (400 mg, 0,7 mmol), NaHCO;, (60 mg, 0,7 mmol), água (3 ml) e CLLCl? (5 ml) à temperatura ambiente durante 1 h. Removeu-se 0 solvente e o resíduo foi liofilizado para se obter o sal de sódio na forma de um sólido incolor (390 mg).
Exemplo 52 (referência) 3a-hidroxi-33-(3-piridiDetinil-5B-pregnan-20-ona
Agitou-se uma solução de 3-bromopiridina (70 mg, 0,44 mmol), 3β-εΐϊηϋ-3α-hidroxi-5a-pregnan-20-ona (150 mg, 0,44 mmol) em dietilamina desgaseificada seca (1 ml) sob árgon a 23UC. Adicionou-se cloreto de bis(trifenilfosfma)paládio (10 mg) e Cul (5 mg) e agitou-se a mistura a esta temperatura durante 45 min. Adicionou-se CH2CI2 (4 ml) e agitou-se a mistura a 23°C durante 1,5 h. A TLC mostrou uma conversão de 100% do material de partida, e assim o solvente foi removido e o resíduo purificado por cromatografia em sílica gel. Por eluição com hexanoracetona (3:1) obteve-se 3a-hidroxi-3P-(3-piridil)etinil-5P-pregnan-20-ona (30 mg) na forma de um sólido incolor; p.f. 230-35°C; Rf em TLC (hexano:acetona 7:3) = 0,24. 44 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ
Exemplo 53 (referência) 21-bromo-3a-hidroxi-3B-(3-hidroxipropin-l-ilV5B-pregnan-20-ona
Tratou-se uma solução de 3a-hidroxi-3p-(3-hidroxipropin-l-il)-5P-pregnan-20-ona (483 mg, 1,3 mmol) em MeOH (20 ml) a 33"C e tratou-se com duas gotas de HBr (48%), seguido de bromo (1,43 mmol. 0,73 ml). Agitou-se a mistura a 37°C durante lhe esta foi vazada em água gelada. O sólido separado foi recolhido por filtração, lavado com água e seco. Este sólido semi-seco foi em seguida dissolvido em EtOAc e seco sobre MgSOí anidro. Por filtração e remoção do solvente obteve-se 21-bromo-3a-hidroxi-3p-(3-hidroxipropin-l-il)-5p-pregnan-20-ona (322 mg).
Exemplo 54 (referência! 3a-hidroxi-3B-(3-hidroxipropin-l-iD-21-(1.2.3-triazol-2-il)-5B-pregnan-2Q-ona e 3a-hidroxi-3 B-(3-hidroxipropin-1 -i 11-21 -(1,2.3-triazol-1 -ill-5 P-pregnan-20-ona
Tratou-se uma suspensão de NaH (30 mg, 95%. 1.2 mmol) em THF (10 ml) com uma solução de 1,2,3-triazolo (69 mg, 1 mmol) em THF (10 ml) à temperatura ambiente. Após agitação da mistura durante 30 min adicionou-se uma solução do derivado bromo bruto do exemplo 53 (162 mg, 0,37 mmol) em THF (10 ml). A agitação foi continuada à temperatura ambiente durante 1.5 h. Adicionou-se uma solução saturada de NTLiCl e removeu-se o solvente. Extractou-se o resíduo com EtOAc. A camada orgânica foi lavada com água e salmoura. Após secagem sobre MgS04 anidro, filtrou-se a solução e evaporou-se para se obter o produto bruto (250 mg). Este produto bruto foi em seguida dissolvido numa pequena quantidade de CHaCl? e vazado numa coluna de sílica gel. Por eluição com a mistura de Qrl^CEiacetona (6:4) obteve-se 3a-hidroxi-3p-(3-hidroxipropin-l-il)-21-(2H-l,2,3-triazol-2-il)-5p-pregnan-20-ona (40 mg) como uma primeira fracção; p.f. 188-191°C; Rf em TLC (CH^CEiacetona 6:4) 0,56. Após uma nova eluição com a mesma mistura de solventes obteve-se 3a-hidroxi-3P-(3-hidroxipropin-l-il)-21-(lH-l,2,3-triazol-l-il)-5p-19-norpregnan-20-ona (40 mg); p.f. 135-140°C: Rf em TLC (CH2Cl2:acetona 6:4) 0,34.
Exemplo 55 (referência! 3 p-(4'-hidroxi-1 '-butinill-3a-hidroxi-5 β-pregnan-11.20-diona
Tratou-se uma solução de 3-butin-l-ol (0,4 ml. 5,2 mmol) em THF seco (15 ml) com n-BuLi (4 ml, 2,5M em THF, 10 mmol) a -65°C. Após agitação da mistura a -78°C durante 0,5 h, adicionou-se uma solução de 20-(1.2-etanodiilacetal)cíclico de 5P-pregnan-3,11,20-triona (800 mg, 2,14 mmol) em THF (20 ml) e agitou-se a mistura a -78°C durante lh. Removeu-se o banho de arrefecimento e continuou-se a agitação à temperatura ambiente 45 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ durante 45 minutos. A mistura foi então neutralizada com solução de NH4CI (5 ml). Removeu-se 0 solvente e o resíduo foi em seguida dissolvido em acetona (30 ml). Após adição de HC1 2N (7 ml) agitou-se a solução à temperatura ambiente durante 15 min. Adicionou-se solução saturada de NaHCCri para neutralizar 0 ácido. Removeram-se os solventes e 0 resíduo foi extractado com EtOAc. Lavou-se a camada orgânica com água, e salmoura. Após secagem sobre iVIgS04 anidro, filtrou-se a solução e evaporou-se para se obter 0 produto bruto. Este produto bruto foi então dissolvido numa pequena quantidade de CH2CI2 e vazado numa coluna de sílica gel. Por eluição com uma mistura de tolueno:acetona (3:1) obteve-se o butinol não reagido como uma primeira fracção. Após nova eluição com 0 mesmo solvente, obteve-se 3a-(4'-hidroxi-l'-butinil)-3P-hidroxi-5P-pregnan-ll,20-diona (100 mg) e em seguida 3P-(4'-hidroxi-r-butinil)-3a-hidroxi-5P-pregnan-l 1,20-diona na forma de um sólido incolor; p.f. 158-162°C; Rf-em T.LC (tolueno:acetona 3:1) = 0,16.
Será óbvio para 0 perito na arte, que os compostos acima descritos podem estar presentes como misturas de diastereoisómeros que podem ser separados em diastereoisómeros individuais. A resolução dos diastereoisómeros pode ser conseguida, de forma conveniente, por cromatografia gasoa ou líquida, ou por isolamento a partir de fontes naturais. Salvo indicação em contrário, a referência na especificação e reivindicações aos compostos do invento, tal como discutido acima, pretende incluir todos os isómeros, quer separados quer em mistura.
Quando os isómeros estão separados, a actividade farmacológica desejada será muitas vezes predominante num dos diastereoisómeros. Tal como aqui se descreve, estes compostos apresentam um nível elevado de estereoespecificidade. Em particular, os compostos com a maior afinidade para o complexo receptor de GABA são os que possuem esqueletos esteróides 3a-hidroxipregnano, substituído em 3β.
Os compostos do, e utilizados no, invento que são as formas não tóxicas, farmaceuticamente aceitáveis, naturais e sintéticas, que actuam directamente e "pró-drogas" da progesterona, desoxicorticosterona e metabolitos de androstano têm uma actividade, até aqui desconhecida, no cérebro, no complexo receptor de GABAa- O presente invento tira vantagem da descoberta deste mecanismo e actividade anteriormente desconhecidos.
As composições farmacêuticas do presente invento são preparadas em formas de dosagem unitária convencionais, por incorporação de um composto activo de acordo com o invento ou uma mistura destes compostos, com um transportador farmacêutico não tóxico, de acordo com procedimentos aceites, numa quantidade não tóxica suficiente para produzir a actividade farmacodiâmica desejada num indivíduo, animal ou humano. De preferência, a 46 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ composição contém ο ingrediente activo numa quantidade activa, mas nào tóxica, seleccionada de entre cerca de l mg a cerca de 500 mg de ingrediente activo por unidade de dosagem. Esta quantidade depende da actividade biológica específica desejada e das condições do paciente. Os objectos desejáveis das composições e métodos do presente invento são o tratamento do stress. ansiedade. PJV1S, PND e ataques, como os que são causados pela epilepsia, para melhorar ou prevenir os ataques de ansiedade, tensão muscular e depressão, comuns em pacientes que sofrem destas anomalias do sistema nervoso central. Um objecto adicional desejável da composição e métodos é tratar a insónia e produzir uma actividade hipnótica. Outro objecto desejável dos compostos e métodos é induzir anestesia, particularmente por administração intravenosa. O transportador farmacêutico utilizado pode ser. por exemplo, sólido, líquido ou de libertação controlada (veja-se, e.g. “Remingtons Pharmaceutical Sciences”, 14a Edição, 1970). Exemplos representativos de transportadores sólidos são a lactose, terra alba, sacarose, talco, gelatina, ágar, pectina, goma arábica, estearato de magnésio, ácido esteárico, celulose microcristalina, hidrogeles polímeros e semelhantes. Os transportadores líquidos típicos são o propilenoglicol, giicofurol, soluções aquosas de ciclodextrinas, xarope, óleo de coco e azeite e emulsões semelhantes. De modo semelhante, o transportador ou diluente pode incluir qualquer material para libertação controlada conhecido na arte, como o monoestearato de glicerol, isolado ou com cera. microcápsulas, microesferas, lipossomas e/ou hidrogeles.
Podem-se utilizar uma variedade de formas farmacêuticas. Assim, quando se utiliza um transportador sólido, a preparação pode ser simplesmente moída micronizada, em óleo, em comprimidos, colocada numa gelatina dura ou cápsula com revestimento entérico num pó micronizado, ou em forma sedimentada ou na forma de um trocisco ou lozango. Os compostos do, e utilizados no. invento podem também ser administrados na forma de supositórios para administração rectal. Os compostos podem ser misturados em materiais como a manteiga de cacau e polietilenoglicóis ou outro material não irritante adequado, que é sólido à temperatura ambiente mas líquido à temperatura rectal. Quando se utiliza um transportador líquido, a preparação pode ser na forma de um líquido, como uma ampola, ou como uma suspensão líquida, aquosa ou não aquosa. As formas de dosagem líquida necessitam também de conservantes famiaceuticamente aceitáveis e semelhantes. Além disso, devido às baixas doses que serão necessárias, baseadas nos dados aqui descritos, a administração parentérica, pulverização nasal, admninistração sublingual e bucal e os pachos dérmicos de libertação controlada, são também formas farmacêuticas adequadas para administração tópica.
84 866 EP 0 752 860 / PT 47 O método para produzir uma actividade ansiolítica, anticonvulsiva, de alteração da disposição (como um anti-depressivo) ou hipnótica, de acordo com este invento, compreende a administração, a um indivíduo em necessidade dessa actividade, de um composto de acordo com o invento, normalmente preparado numa composição como acima descrito com um transportador farmacêutico, numa quantidade não tóxica suficiente para produzir a referida actividade.
Durante meses, os níveis de metabolitos excretados variam aproximadamente quatro vezes (Roseiszewska, et ai). Assim, a terapia para controlar os sintomas envolve manter o paciente a um nível de metabolitos de progesterona mais elevado que o normal, no estado pré-menstrual de pacientes com PMS. Os níveis plasmáticos de metabolitos activos e principais são monitorizados durante a pré-menstruação e pós-menstruação da paciente. A quantidade de compostos do invento administrados, quer isolados quer em misturas suas derivadas, é assim calculada de modo a atingir um nível que exerça uma actividade de receptor de GABAa igual ou superior ao nível de metabolitos de progesterona no indivíduo normal, durante o estado pré-menstrual. A via de administração pode ser qualquer via que transporte eficazmente o composto activo aos receptores GABAa, que se pretende estimular. A administração pode ser efectuada por via parentérica, entérica, rectal, intravaginal, intradérmica, intramuscular, sublingual ou nasal; prefere-se a via oral, intramuscular e dérmica. Por exemplo, uma dose num pacho dérmico pode fornecer o ingrediente activo ao paciente durante um período de até uma semana. No entanto, a via parentérica é preferida para o estado epiléptico.
Potência e eficácia no local do GR
Os dados experimentais in vitro e in vivo mostram que os metabolitos de progesterona/desoxicorticoesterona que ocorrem naturalmente e seus derivados interagem com uma afinidade elevada num local de reconhecimento novo e específico no complexo GR, para facilitar a conductância dos iões cloreto através das membranas neuronais sensíveis a GABA (Gee et ai, 1987 Harrison et al., 1987).
Os peritos na arte têm conhecimento de que a modulação da ligação de [j3S]t-butilbiciclofosforotionato (["SJTBPS) é uma medida da potência e eficácia das drogas que actuam no complexo GR, os quais podem ter um valor terapêutico potencial no tratamento do stress, ansiedade e desordens de ataques (Squires, R.F. et al., "[3:5]t- butylbicyclophosphorothionate binds with high affinitv to brain-specific sites coupled to a gamma aminobutyric acid-A and ion recognition site", Moí. Pharmacol., 23:326, 1983;
84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ 48
Lawrence, L.J. et ai, "Benzodiazepine anticonvulsant actíon: gamma-aminobutyric acid-dependent modulation of the chloride ionophore", Biochem. Biophys. Res. Comm., /25:1130-1137, 1984; Wood et al., "In vitri characterization of benzodiazepine receptor agonists, antagonists, inverse agonists and agonist/antagonists" Pharmacol. Exp. Ther., 23l·.572-576, 1984). O requerente desenvolveu várias experiências para determinar a natureza da modulação de ['°S]TBPS, afectada pelos compostos do invento. O requerente verificou que estes compostos interagem com um novo local no complexo GR, que não se sobrepõe ao do barbiturato, benzodiazepina ou quaisquer outros locais previamente conhecidos. Para além disso, estes compostos têm uma potência e eficácia elevada no complexo GR, com requesitos estruturais restritos para esta actividade. Os compostos preferidos, úteis no presente invento têm um IC50 de 2 uM ou menos no teste de ligação de [j5S]TBPS descrito mais à frente.
Os processos para realizar este teste são amplamente discutidos em: (1) Gee et ai, 1987; e (2) Gee, K.W., L.J. Lawrence and H.I. Yamamura, "Modulation of the chloride ionophore by benzodiazepine receptor ligands: influence of gamma-aminobutyric acid and ligand efficacy, "Molecular Phannacolog}· 30:218, 1986. Estes processos foram realizados como se segue:
Removeram-se os cérebros de ratos Sprague-Dawlev imediatamente após 0 sacrifício e dissecaram-se os córtices cerebrais em gelo. Preparou-se um homogenato P2 como anteriormente descrito (Gee, et al., 1986). Em resumo, os córtices foram cuidadosamente homogeneizados em sacarose 0.32M seguido de centrifugação a 1000 x g, durante 10 minutos. O sobrenadante foi recolhido e centrifugado a 9000 x g durante 20 minutos. O pelete P2 resultante foi suspendido como uma suspensão a 10% (peso original húmido/volume) em tampão fosfato de Na/K 50 mM (pH 7,4) NaCl 200 mM para formar o homogenato.
Incubaram-se alíquotas de cem microlitros (μΐ) do homogenato P2 (0,5 miligramas (mg) de proteína) com 2 nanomolar (nM) de [°S]TBPS (70-110 curies/milimol; New England Nuclear, Boston, MA) na presença ou ausência dos esteróides que ocorrem naturalmente ou dos seus derivados sintéticos a ser testados. Os compostos testados foram dissolvidos em dimetilsulfóxido (Baker Chem. Co.. Phillipsbury, NJ) e adicionados à mistura de incubação em alíquotas de 5 μΐ. Prefez-se a mistura de para um volume fmal de 1 ml, com tampão. A ligação não específica foi definida como a ligação na presença de TBPS 2 mM. O efeito e especificidade do GABA (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO) foi avaliado através da realização de todos os ensaios na presença de GABA mais (+) bicuculina (Sigma Chem. Co.). As incubações mantidas a 25°C durante 90 minutos (condições de estado 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ 49
estacionário) foram terminadas por filtração rápida através de filtros de fibra de vidro (N° 32, Schleicher e Schuell, Keene, NH). A radioactividade ligada ao filtro foi quantificada por espectrofotometria de cintilação líquida. Os dados cinéticos e as curvas dose-resposta composto/[3'S]TBPS foram analisados por regressão não linear, utilizando um processo iterativo computorizado, para obter constantes de velocidade e valores de IC50 (concentração de composto à qual ocorre metade da inibição máxima da ligação de [35S]TBPs basal).
Os dados experimentais obtidos para este ensaio estão também publicados em Gee et ai, 1987. Os dados discutidos nesta referência são apresentados na forma de gráfico nas FIGS IA e 1B. Estes gráficos mostram 0 efeito de (+)-bicuculina na modulação pelo esteróide de pregnano alfaxalona (IA) e GABA (1B) da ligação de [’=]TBPS 2 nM ao córtex cerebral de rato. Nestas figuras, (0) representa controlo sem bicuculina; (·) representa bicuculina 0,5 μΜ; (□) representa bicuculina 1,0 μ.Μ; () representa bicuculina 2,0 μΜ; e (Δ) representa bicuculina 3.0 μΜ. Nesta experiência, determinou-se 0 efeito de (Έ)-bicuculina na capacidade da alfaxalona ou GABA inibirem a ligação de ['5]TBPS. A bicuculina é conhecida por ser um antagonista competitivo do GABA e na FIG. 1B pode-se observar um desvio paralelo clássico nas curvas de dose-resposta. Pelo contrário, o local de ligação do esteróide, identificado neste trabalho é diferente do local GABAhicuculina na FIg. IA. O desvio nas curvas dose-resposta induzido pela bicuculina quando a inibição da ligação de [J"S]TBPS é causada pela alfaxalona não é paralelo. Isto indica que os locais de GABA e do esteróide não se sobrepõem.
Realizou-se um segundo conjunto de experiências para demonstrar que os esteróides, barbituratos e benzodiazepinas não partilham 0 mesmo local de ligação no receptor de GABA. A figura 2 mostra a dissociação ao longo do tempo de ["°S]TBPS a partir de homogenatos P2, corticais de rato iniciada pela adição de TBPS 2 μΜ (); 3ct-hidroxi-5a-pregnan-20-ona 1 μΜ (□); pentobarbital de Na 100 uM (·); e 3a-OH-5a-pregnan-20-ona 1 μΜ + pentobarbital de Na 100 μΜ (o). O teste foi realizado de acordo com os processos a seguir descritos. Estes dados cinéticos mostram que a dissociação da ligação de [35S] TBPS iniciada por uma concentração saturante de 3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona é potenciada por pentobarbital de Na 100 μΜ. Este efeito é uma indicação de que o 3a-OH-5a-pregnan-20-ona (esteróide) e 0 pentobarbital (barbitúrico) se ligam a locais independentes. O terceiro conjunto de experiências avaliou as interacções entre 3a-hidroxi-5oc-pregnan-20-ona e pentobarbital de Na na potenciação da ligação de ('H)flunitrazepam (FLU). Estas experiências suportam ainda a reivindicação de que os esteróides não partilham um local de acção comum com as benzodiazepinas e barbituratos. Nesta série de experiências, o efeito de várias concentrações de 3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona na ligação 50 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ de (JH) FLU, na presença ou ausência, de uma concentração estimuladora máxima de pentobarbital de Na. Uma vez que o pentobarbital de Na tem uma eficácia máxima maior que a do 3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona em potenciar a ligação de (3H)FLU, o 3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona deverá, em última análise antagonizar o efeito do pentobarbital de Na, se os dois interagirem de forma competitiva no mesmo local. Isto não é o que se observa (Fig. 3). Assim, os dados suportam ainda a conclusão do requerente de que alguns esteróides incluindo os compostos do, e utilizados no. invento interagem com um novo local, distinto do local regulatório do barbiturato ou BZ no complezo GR. Devido a este local de acção independente antecipa-se que estes compostos esteróides terão perfis terapêuticos diferentes daqueles dos barbituratos e Bzs.
Pesquisaram-se vários compostos para determinar o seu potencial como moduladores da ligação de [JiS]TBPS in vitro. Estes testes foram realizados de acordo com os processos acima discutidos. Com base nestes testes, o requerente estabeleceu os requisitos de estrutura-actividade para a sua interacção específica no complexo GR e a sua ordem de potência e eficácia. A Figura 4 proporciona as curvas de inibição por [JÍS]TBPS de 3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona (3α.5α-Ρ), 3a.21-di-hidroxi-5a-pregnan-20-ona (5a-THDOC) e R5020 (promogesterona), como exemplos experimentais, enquanto que a Tabela 1 proporciona a IC50 e a inibição máxima de numerosos compostos, incluindo exemplos reivindicados no pedido. A Ic50 é definida como a concentração de compostos necessária para inibir 50% da ligação controlo de ["S]TBPS. É uma indicação da potência de um composto in vitro. A inibição máxima é uma indicação da eficácia de um composto in vitro. (Segue Tabela 1) 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ 51
Tabela 1 COMPOSTO IC50 (nM) ÍMAX (%) 3p-(4'-acetilíeniletinil)-3a.21 -di-hídroxi-5a-pregnan-20-ona Γ 4 92 3p-(4'-acetilíenil)etinil-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona 5 93 3p-(4'-acetilfenil)etinil-3a-hidroxi-5a-19-norpregnan-20-ona 6 90 éster etílico de 3P-(4'-carboxifenil)etiníl-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona 7 79 éster etílico de 3β-(4'-θ3^οχιίεηι1)εΐίηί1-3α-1^Γθχί-5β-ρΓε5η3η-20-οη3 8 98 3β-(4-hidroxibutln-l-il)-3α-hldroxl-5β-pregnan-20-ona 13 103 3β-(4'^οεΐί1Γεηί1)εΐίηί1)-3α-1-πάΓθχι-5β-ρ^η3η-20-οη3 14 103 éster etílico de 3β-(4'-θΗΛοχιίεηί1)εΐίηί1-3α-Ηί4Γθχι-19-ηοΓ-5β-ρΓε£ρ3η-20-οηα 15 94 3β-(4^οβ«>χΛιιΰη-1-ί1)-3α-1ιίάΓθχί-5β-ρΓε§Μη-20-οη3 20 96 3β-(4'-3θ6ΐί1ΐεηί1εύηί1)-3α,21<1ί-1ιί6π>χί-5β-ρ^η3η-20-θΐΐ3 22 99 3 β-(4-hidroxibutin-1 -il)-3a-hidroxi-5 β-19-norpregnan-20-ona 22 102 3β-(3,-metoxi-Γ-propinil)-3α-hidroxi-5β-pregnan-20-ona 27 105 3β-(4'-dimetilaminofenil)etinll)-5β-pregnan-20-ona 28 77 3β-[3-(2-propiniloxi)propm-l-ιl]-3α-hidroxi-5β-pregnan-20-ona 28 105 3β-(4-hidroxibutin-l-ll)-3α-hidroxi-5α-pregnan-20-ona 35 95 3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona 37 95 3β-(4'-bifenil)etinil)-3α-hidroxi-5β-pregnan-20-ona 43 83 3α-hidroxi-3β-(4'-nitrofenil)etinil-5β-pregnan-20-ona 46 103 3a-hidroxi-21-(2H-l,2,3,4-tetrazol-2-il)^-pregnan-20-ona 46 78 3α-ΗίάΓοχί-3β-(4'-Γηεΐοχί£εηί1)επηί1-5β-ρΓε5η3η-20-οη3 47 89 3β-(4'-ίπΑυοΓθπιβίί1ίεηί1)6ΐίηί1-3α-1ώΐΓθχί-5β-ρΓε§η3η-20-οη3 52 87 3β-(5-acetiltien-2-il)etinil-3α-hidroxi-5β-pregnan-20-ona 52 89 21-(l-benzimidazolil)-3α-hidroxi-5β-pregnan-20-ona 53 100 3β-(4-ΗίότοχΛυήη-1-il)-3a-hidroxi-21-(1-imidazolil)^-pregnan-20-ona 54 93 3a-hidroxi-21 -(2H-1,2,3-triazol-2-il)-5 P-pregnan-20-ona 56 79 3 β-(4'-1πάΓθχ&ιιίίη-1 -il)-3a-hidroxi-21 -(1,2,3-triazol-2-il)-5 β-19-norpregnan-20-ona 56 93 3 β-(4'-clorofenil)etinil-3α-hidroxi-5β-pregnan-20-ona 58 89 3 β-(5,-hidroxipentin-1 -il)-3a-hidroxi-5 p-pregnan-20-ona 58 100 3α-hídroxi-3β-(tien-2-il)etinil-5β-pregnan-20-ona 59 100 3β-(3'-acetilfenil)etinil-3α-hidroxi-5β-pregnan-20-ona 62 o o 3α-ΜΓθχί-21-[1Η-(4-πιεΐίΙ-5-θ3Γ6οχίΙ)ίιτ^3ζο1-1-ί1)]-5β-ρΓε§ρ3η-20-οηΕ 62 100 3α-1ιί6Γθχί-3β-[3,-(2Η-1,2,3-Ρ·ί3Ζθ1-2-Π)-1-ρΓορίηί1]-5β-ρΓε2η3η-20-οη3 66 98 3a-hidroxi-21-(9H-l,2,3-purin-9-il)-^-pregnan-20-ona 69 59 3α-hidroxi-3β-[4,(R/S)-hidroxipeminil]-5β-pregnan-20-ona 71 103
84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ COMPOSTO ICso (nM) IMAX (%) 3a-hidroxi-21 -(irmdazol-1 -il)-5a-pregnan-20-ona 71 99 3a-hidroxi-21-(imidazoÍ-l-il)-5P-pregnan-20-ona 73 57 3P-(4'-cianoterul)etiml-3a-hidroxioP-pregnan-20-ona 73 92 3a.21-di-hidroxi-5ct-pregnan-20-ona (5a-THDOC) 76 100 3a-hidroxi^-^ntaíluoroíenil^tmil^-pregnan-20-ona 79 69 3 β-(4'-hldroxlbutin-l'-il)-3α-hidroxl-21-(1,2.3-L]-iazol-l-il)-5β-pregnan-20-ona 79 96 3β-εtinil-3α-hidroxi-21-(Γ-inlidazolil)-5β-prεgnan-20-ona 80 103 3a-hidrc>xi^-[3'-(lH-pirazol-l-ilH'-propinil]^-pregnan-20-ona 81 98 3a-hidroxi-3 β-πιεΐ:ί1-21 -(2H-1,2.3-triazol-2-il)-5a-pregnan-20-ona 85 99 3β-[4,-(N,N-dietilcarboxiamidofeníl)etinll]-3α-hldroxi-5β-pregnan-20-ona 87 94 3a-hidroxi^-(4'-rr^tilfenil)8tinil^-pregnan-20-ona 88 84 3a-hidroxi^-(6-oxo-l-l^ptinilK\B-pregnan-20-ona 90 101 3β-(4'-ΜΓθχΛιΐπη-1 Ml)-3a-hidroxi-21-(1,2,4. rriazol- l-il)^-pregnan-20-ona 93 96 3 β-(4'-ΜΓθχι6ιιΐ:ιη-1 '-il)-3a-hidroxi-21 -(tetrazol-1 -il)-5 β-ρΓεαπ3η-20-οηα 93 101 3α-hidroxi-3β-[4'(R/íS)-hidroxipεnunil]-5β-prεgnan-20-ona 94 104 3β-(5'-acεtoxipεntin-Γ-il)-3α-hidroxi-5β-prεgnan-20-ona 96 98 3α-hidroxi-21-(lH-3.5-dimεtilpirazolil)-5β-pregnan-20-ona 96 77 3α-hidroxi-21-(Γ-imidazolil)-3β-mεtil-5α-prεgnan-20-ona 97 95 3 a-hidroxi-3 β-(ίεηίΐεΐιηίΐ)-5 β-prεgnan-20-ona 98 101 3β-(4'-hidroxibuΐin-Γ-il)-3α-hidro\l-2l-(l,-imldazoIil-5β-19-norprεgnan-20-ona 98 98 3a-hidroxi-21 -(1 '-pirazolil)-5a-pregnan-20-ona 100 98 3β-(2'-hidroxifεnll)εtlnll-3α-hidroxi-5β-prεgnan-20-ona 101 83 3α-hidroxi3β-(3'-fεnil-Γ-propinil)-5β-prεgnan-20-ona 103 95 3P^tinil-3a-hidroxi-21-(r-pirazolil)-5P-pregnan-20-ona 106 99 S-(3α-hidroxi-3β-(4'-hidroxibudnlΠ-5β-pregnan-20-on-2 l-il]tiosulfato de sódio 107 97 3α-hidroxi3β-(2'-piridil)εtinll-5β-prεgnan-20-ona 108 98 3β-(2,4^ίΠιιοΐΌίεηί1)εΐίηϊ1-3α-1ι^Γθχί-5β-ρΓε5η3η-20-οη3 109 102 3β-benzil-3α-hidroxi-5β-prεgnan-20-ona 109 102 21-(T-b8nzimidazolil)-3a-hidroxi^-rnotil-5a-pregnan-20-ona 109 95 3a-hidroxi-21 -(1 '-pirazolil)^-rr^til-5a-pregnan-20-ona 115 98 3α-hidroxi-3β-(5'-l-hεximl)-5β-prεgnan-20-ona 118 101 3α-hidroxi-21-(pirazolil-l-il)-5β-prεgnan-20-ona 121 67 3 β-(4'-ΜΐΌχΛιιΐίη-1 '-il)-3a-hidroxi-21 -(1,2,3-triazol-1 -il)-5 β-19-norpregnan-20-cina 124 95 3α-ΜΐΌχί-3β-Γηεη1-2 l-(l',2',4'-triazolil)-5a-pregnan-20-ona 125 105 3 β-εηηϋ-3α-1ι^Γθχι-21 -(1 '.2',4'-tnazol)-5B-pregnan-20-ona 127 98
84 866
ΕΡ Ο 752 860 / PT 53 COMPOSTO IC50 (nM) IMAX (%) 3p-(4'-cianobutinil)-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona 131 86 S-[3a-hidroxi-3P-(metoximetil)-5P-pregnan-20-on-21-il]tiosulfato de sódio 132 103 S-(3a-hidroxi-5a-pregnan-20-on-21-il)tiosulfato de sódio 133 90 3α-ΜΐΌχί-3β-(2'-ίεηί1εΐί1)-5β-ρΓεαη3η-20-οη3 135 98 3a-hidroxi-3 β-ηιεπ1-21 -(1 ',2',3'-triazol-1 '-il)-5a-pregnan-20-ona 136 99 3α-hidroxi-3β-[3'-hidroxipropinl]]-5β-pregnan-20-ona 137 93 3α-hldroxí-3β-(3-piridil)etinil-5β-pregnan-20-ona 138 100 3a-hidroxí^-[3'(RS)-hidroxibutmil]-5a-pregnan-20-ona 144 99 3a-hidroxi^-[4-piridil)etinil-5P-pregnan-20-ona 149 103 3a-hidroxi-21-(l',2’.4'-triazol-l-il)^-pregnan-20-ona 151 60 S-(3a-hidroxi^-metil-5a-pregnan-20-on-21-il)tiosulfato de sódio 151 101 3β-(5'-οί3ηορεηύηίΙ)-3α-1·ιί6Γθχί-5β-ρΓε§η3η-20-οη3 158 100 3β-(4'-3εεΐοχί3ςεό1ίεηι1)6ΐ:ίηίΙ-3α-Η^ΐΌχί-5β-ρ^ηαη-20-οη3 171 91 3a-hidroxi^-fenilpropil^-pregnan-20-ona 173 92 3a-hidroxi^-[4'(R/S)-hidroxipentinil]-5a-pregnan-20-ona 178 101 3a-hidroxi^-[3'(RS)-hidroxibut:inil]^-pregnan-20-ona 202 102 3 β-(6-1ιι0Γθχί-Ηεχίη-1 -il)-3a-hidroxi-5 β-ρΓε2Ή3η-20-οπ3 222 99 3α-hidroxi-21-[lH-(2-metil)imidazol-l-il)-5β-pregnan-20-ona 222 95 3 P-(3'-acetoxipropin-1 '-il)-3a-hidroxi-]-5 β-pregnan-20-ona 224 104 3a-hidroxi-21 -(1 Ή-1.2.3,4-tetrazol-1 '-il)-5 β-pregnan-20-ona 227 60 3α-hidroxi-21-(2-formllimidazol-l-il)-5β-pregnan-20-ona 213 81 3α-hidroxi-3β-[2'-metoxiíenil)etinil-5β-pregnan-20-ona 238 99 3 P-(4'-hidroxi-1 '-butinil)-3a-hidroxi-5 β-pregnan-11,20-diona 268 102 3β-[(3',4,-dimetoxifenil)etinil]-3α-hidroxi-5β-pΓegnan-20-ona 283 106 3α-hidroxi-21-[lH-(4-nitro)lmidazol-l-il)]-5β-pregnan-20-ona 267 71 S-(3α-hidroxi-5β-pregnan-20-on-21-il)tiosulfato de sódio 268 88 3 β-(6'-3ε6ίοχί-όεχίη-1 '-il)-3a-hidroxi-5 β-pregnan-20-ona 306 99 S-(3α-hldroxi-3β-trifluorometil-5β-19-noΓpregnan-20-on-21-ll)tiosulfato de sódio 325 98 3α-^άΓθχι-3β-ίεηι1-5β-ρΓεστΐ3η-20-οη3 382 86 3 β-(3'-hidroxifeml)etinil-3α-hidroxi-5 β-pregnan-20-ona 407 99 3α-1ιίόΐΌχί-3β-(3-Ηι0ΓθχίρΐΌρϊη-1 -il)-21-( 1.2.3-triazol-l -il)^-pregnan-20-ona 430 107 3a-hidroxi-21-(7'H-purin-7,-il)^-pregnan-20-ona 430 71 3a-hidroxi-21-(r-uracil)-5a-pregnan-20-ona 434 90 3α-Ει0Γθχι-3β-[3'-(ριηό-4-ί1οχι)-Γ-ρτοριηι1]-5β-ρΓε5η3η-20-οη3 465 94 3β-[2-(3'.4'-dimetoxifenil)etil]-3α-hidroxi-5β-pregnan-20-ona 507 66
Js
84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ 54 COMPOSTO IC50 (nM) IMAX (%) 3a-hidroxi-3P-(3'-hidroxifenil)etinil]-5P-pregnan-20-ona 619 98 3a-hidroxi-3p-[3'-( 1H-1,2,3-triazol-1 -il)-1 ’-propinil]-5 p-pregnan-20-ona 655 102 3a-hidroxi-3(3-[3'-(lH-l,2,4-triazol-l-il)-r-propinil]-5p-pregnan-20-ona 843 99 3a-hidroxi-3p-(3-hidroxipropin-l-il)-21-(1.2,3-tnazol-l-il)-5p-pregnan-20-ona 1089 101 3P-[3'-(N,N-dimetilamino)-l'-propinil]-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona 1420 100 3P-(4'-acetoxifenil)etinil-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona 1430 100 3p-(4-hidroxifenil)etinil-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona 1550 88 3a-hidroxi-2P-morfoHml-21 -(1 Η-1,2.4-tnazol-1 -il)-5a-pregnan-20-ona 1553 97 3a-hidroxi-3p-(3'-oxopropinil)-5P-pregnan-20-ona 1720 76 3P-(4,-carboxamidofenil)etinil-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona 2240 98 3 P-(4'-carboxamidobutinil)-3 a-hidroxi-5 P-pregnan-20-ona 2340 102 3a-hidroxi-3P-(3'-oxobutinil)-5p-pregnan-20-ona 2690 107 3a-hidroxi-3p-[3'-(N-imidazolil)-r-propinil]-5P-pregnan-20-ona 2720 107 3 P-(5’-carboxamidopentinil)-3a-hidroxi-5 p-pregnan-20-ona 3090 102 Progesterona 5200 100 3a-hidroxi-3P-[3'-oxobutinil]-5a-pregnan-20-ona 6510 104 5P-(4'-aminofenil)etmil-3f3-hidroxi-5P-pregnan-20-ona 22500 103 3P-hidroxi-5a-hidroxi-pregnan-20-ona (alopregnanolona) > 10o 33 4-pregnen-l ip,21-diol-3,20-diona (corticosterona) > 10b 30 17p-estradiol naa 0 colesterol na 0 ana = não activo
Como se pode ver pela Figura 4 e Tabela 1, o 3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona, 3a,21-di-hidroxi-5a-pregnan-20-ona e compostos do, e utilizados, no invento têm uma IC50 baixa, que é a concentração necessária para atingir 50% da inibição máxima da ligação de [^SjTBPS, enquanto que compostos como os esteróides sexuais (R5020, estradiol e progesterona), glucocorticóides (corticoesterona) e colesterol com uma IC50 elevada são essencialmente inactivos. Assim, prevê-se que os esteróides hormonais e o colesterol per se não tenham qualquer valor terapêutico para as indicações aqui descritas. De modo a distinguir esta classe única de esteróides, dos esteróides hormonais, eles são agora designados por esteróides neuroactivos. No entanto, os esteróides sexuais como a progesterona podem ser metabolizados no corpo em esteróides semelhantes à 3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona. Assim, a progesterona pode ser considerada como uma pró-droga. Os dados de TBPS correlacionam-se com os dados da absorção do ião 36q^ potenciada por vários
84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ esteróides hidroxilados em 3α, descritos em Purdy R.H. et al., "Synthesis, Metabolism and Pharmacological Activity of 3a-Hydroxy Steroids Which Potentiate GABA-Receptor-Mediated Chloride Ion Uptake in Rat Cerebral Cortical Synaptoneurosomes", J. Med. Chem. 33:1572-1581 (1990), aqui incorporado para referência, e estes dados também se correlacionam com os dados electrofisiológicos obtidos por medição da actividade de esteróides, para potenciar a corrente induzida por GABA em oócitos injectados com receptores de GABA humanos, como apresentado na Fig. 5. Isto indica que o teste TBPS é uma medida aproximada da capacidade dos esteróides modularem alostericamente a actividade do canal de Cl".
Compostos com eficácia limitada
Na medida em que a actividade terapêutica desejada deverá estar disponível ao paciente com o mínimo de efeitos secundários indesejáveis, um aspecto notável do presente invento envolve a descoberta de agonistas com actividade parcial nos compostos com um grupo 5a-pregnan-5a,20a-diol, 5p-pregnan-3a,20p*diol ou os derivados e pró-drogas destes compostos, Para além disso, um subconjunto de esteróides neuroactivos, que não estes dois grupos, apresentam também uma eficácia parcial no teste TBPS (Tabela 1). Para os pacientes que desejam uma melhoria da ansiedade, ou convulsões, não é desejável a hipnose. Para os pacientes que desejam uma melhoria da insónia, a anestesia é indesejável. E esperado que os compostos e actividades descritos como antagonistas com actividade parcial tenham o efeito desejado com efeitos indesejáveis mínimos.
Para demonstrar os antagonistas com uma eficácia limitada, ilustra-se a capacidade do 5a-pregnan-3a,20a-diol e 5P-pregnan-3a,20a-diol modularem parcialmente a ligação de [35s]TBPS, mesmo em concnetrações muito elevadas (Figura 6).
Adicionalmente, também se ilustra a capacidade parcial destes compostos potenciarem o aumento da corrente de CL" mediado pelo GABA, quando comparada com a do 3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona (Figura 7) em oócitos de Xenopus injectados com genes do receptor de GABA4 humano.
Quando se utilizou o sistema de expressão de oócitos de Xenopus para testar a eficácia limite de alguns esteróides neuroactivos, realizou-se o processo seguinte. Injectaram-se oócitos de Xenopus laevis (fase IV) que tinham sido "desfoliculados" utilizando o método de digestão com colagenase (3 h @ 18-23°C, 2 mg.mpl de colagenase
84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ 56 Ά’ em solução salina de Bart sem sais de Ca-+) com transcritos de ARNc do complexo αΐβΐ e γΐ de subunidades do receptor de GABA^ humano. O complexo principal do receptor de GABA4 é constituído por subunidades αβγ. Os oócitos injectados foram mantidos individualmente em placas de 96 poços (200 μΐ por poço de solução de Barth normal, suplementada com penicilina 50 Ili.mH, estreptomicina 50 mg.mH e gentomicina 100 mg.mH) durante até 9 dias a 19-20°C. As correntes induzidas por agonistas foram registadas a partir de oócitos de Xenopus em situação de voltagem controlada a um potencial de repouso de -60 mV, utilizando 0 amplificador de voltagem controlada Axoclamp 2 (Axon Instruments) no modo de voltagem controlada com dois eléctrodos iguais. Os microeléctrodos sensíveis ã voltagem e os de passagem de corrente foram cheios com KC1 3M e tinhma resistências de 1-3 MOhms, quando medidos na solução salina padrão extracelular. Os oócitos foram perfusados continuamente com solução de Ringer de rã (NaCl 120 mM; KC1 2 mM; CaCb 1,0 mM; HEPES 5 mM pH 7,4) a um caudal de 5-7 ml mhH à temperatura ambiente (17-21°C).
Todos as drogas foram aplicadas através do sistema de perfusão. Prepararam-se os esteróides (10'-M) como soluções-mãe concentradas, quer em DMSO, quer etanol e foram em seguida diluídos em solução de Ringer na concentração adequada. A concentração final de DMSO e etanol era de 0,2°¾ v/v, uma concentração que não teve efeito nas respostas desencadeadas pelo GABA. As soluções-mãe de todas as outras drogas foram feitas em solução de Ringer. As respostas de corrente membranar foram filtradas com filtro passa-baixo a 100 Hz e registados numa fita magnética utilizando um gravador de cassetes FM (Racal Store 4 DS), para análise subsequente.
Os compostos do, e utilizados no, invento exibem uma eficácia parcial análoga à acima descrita, também apresentada nas tabelas anteriores.
Benefícios em relação à proeesterona
As correlações entre os níveis reduzidos de progesterona e os sintomas associados com o PMS, PND e epilepsia catamenial (Backstrom, et al., 1983; Dalton, K., 1984) levaram à utilização da progesterona no seu tratamento (Mattson et al., 1984; e Dalton, 1984). No entanto, a progesterona não é consistentemente eficaz no tratamento dos síndromas acima mencionados. Por exemplo, não existe nenhuma relação dose-resposta para a progesterona no tratamento do PMS (Maddocks et al., 1987). Estes resultados são previsíveis, quando 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ 57 L· considerados à luz dos resultados dos estudos in vitro do requerente, que demonstram que a progesterona tem uma potência muito baixa no complexo GR. como se pode ver pela Tabela 1, comparando com alguns metabolitos de progesterona. O efeito benéfico da progesterona está provavelmente relacionado com a conversão variável da progesterona em metabolitos de progesterona activos. A utilização de metabolitos de progesterona específicos no tratamento dos síndromes acima mencionados é claramente superior à utilização de progesterona com base na potência elevada dos metabolitos e seus derivados (veja-se Gee et al., 1987 e Tabela 1).
Nenhuns efeitos hormonais secundários
Também se demonstrou que os esteróides neuroactivos não têm efeitos hormonais secundários devido à afinidade para a progesterona e outros receptores esteróides hormonais (Tabelas 2-5). Os dados apresentados foram obtidos através da realização de testes de acordo com os processos descritos em Gee et al., 1988, anteriormente, para determinar o efeito dos metabolitos de progesterona e dos seus derivados e da progestina R5020, na ligação de [^H]R5020 ao receptor de progesterona no útero de rato (Gee et ai, 1988).
Incubou-se JH-progesterona (0,15 M) com o citosol de útero de rato na presença do composto teste. Determinaram-se as ligações específicas após incubação e comparou-se com a incubação controlo sem compostos. Os dados são expressos como percentagem da inibição da ligação. Se os compostos se ligam ao receptor de progesterona com uma afinidade elevada, será de esperar uma inibição de 100% da ligação, à concentração testada.
Estudaram-se ainda várias actividades hormonais de esteróides neuroactivos representativos, através do teste do seu potencial estrogénico, actividades mineralocorticóides e glucocorticóides. Estas actividades foram analisadas por monitorização da capacidade dos compostos inibirem a ligação das hormonas esteróides aos seus receptores hormonais respectivos. Os resultados são apresentados nas Tabelas 3-5. São expressos como a percentagem de inibição da ligação do ^H-ligando aos vários receptores de hormonas esteróides, para os compostos a 10'^M. Os valores de controlo são representados pela ligação na ausência de compostos teste.
Na Tabela 3, os ratos foram adrenalectomizados 3 dias antes do sacrifício. A fim de isolar o receptor de mineralocorticóides, prepararam-se fracções de citosol cerebral como 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ 58
descrito em Gee et ai, 1988. As drogas foram incubadas com ^H-aldoesterona 3 nM (o ligando específico para o receptor de mineralocorticóides) na presença do agonista tipo II RU28362 selectivo (0,5 μΜ), que bloqueia a ligação da ^H-aldoesterona aos receptores do tipo II (glucocorticóides).
Tabela 2 - Inibição da ligação de 'Fí-progesterona aos receptores de progesterona de útero de bovino
Competidor (10'ClM) % de inibição R5020 100 :5a-pregnan-3a-ol-20-ona 14 5a-pregnan-3a,21-diol-20-ona 13 5cc-pregnan-3a,20-diol 6 5a-pregnan-3ct-ol-3a-meti.l-20-ona 4 5 β-pregnan-3α,21 -diol-20-ona 6 5a-pregnan-3p,20-trimetil-3a,20-diol 8 .5 p-pregnan-3a,20a-diol 0 5 p-pregnan-3a-ol-20-ona 9 5a-pregnan-20-dimetil-3a,20-diol 0
Tabela 3 Inibição da ligação de Ή-aldoesterona a receptores de mineralocorticóides do hipocampo
Competidor (10'UM) % de inibição Aldoesterona 95,5 5a-pregnan-3cc,21-diol-20-ona 76,7 5 β-pregnan-3α,21 -diol-20-ona 13,8 5a-pregnan-3a,ol-20-ona 0 5β-ρ^ηηη-3α,ο1-20-οηη 0 5a-pregnan-3a,20a-diol 0 5β-pregnan-3α,20α-diol 0 5a-pregnan-3a.20-diol-20-dimetilo 0 5a-pregnan-3a-ol-3β-metil-20-ona 3,2 5α-pregnan-3β,20-trimetil-3α,20-diol 0
84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ 59
Para a Tabela 4, prepararam-se fracções de citosol cerebral tal como para a Tabela 3 e os compostos foram incubados com 3 nM de ^H-dexametasona (o ligando específico para o receptor de glucocorticóides).
Tabela 4 - Inibição da ligação de 3H-dexametasona a receptores de glucocorticóides
Competidor (10_()Μ) % de inibição Dexametasona 100 5a-pregnan-3ct,21 -diol-20-ona 29,5 5 P-pregnan-3a,21 -diol-20-ona 8,2 5a-pregnan-3a,ol-20-ona 8,7 5P-pregnan-3ct,ol-20-ona 5,9 5a-pregnan-3a,20a-diol 2,6 5 0-pregnan-3 a,20a-diol 1,4 5a-pregnan-20-dimetil-3a,20-diol 2.6 5cx-pregnan-3a-ol-3P-metil-20-ona 0,6 A Tabela 5 mostra a inibição da ligação do ^H-estadiol (o ligando específico para o receptor de estrogénios) ao citosol de útero de bovino, preparado como anteriormente descrito (Gee ei al., 1988). O ^H-estradiol ( 0,15 nM) foi incubado com o citosol na presença dos compostos.
Tabela 5 - Inibição da ligação de Ή-estradiol a receptores de estrogénios de útero de bovino
Competidor (10"6M) % de inibição 17P-estradiol 100 5a-pregnan-3a-ol-20-ona 0 5a-pregnan-3a,21-diol-20-ona 2 5a-pregnan-3a,20a-diol 0 5a-pregnan-3a-ol-3-metil-20-ona 0 5 p-pregnan-3a,21 -diol-20-ona 0 5a-pregnan-3p,20-trimetil-3a,20-diol 0 5 0-pregnan-3a,20a-diol 8 5 P-pregnan-3a-ol-20-ona 0 5a-pregnan-20-dimetil-3a,20-diol 0
84 866 ΕΡ Ο 752 860 /ΡΤ 60
Os resultados destas experiências mostram claramente que os esteróides neuroactivos não têm uma afinidade forte para qualquer dos receptores de esteróides acima referidos. Assim, estes não terão efeitos laterais hormonais previsíveis que iriam resultar duma ligação deste tipo ao receptor de esteróides.
Actividade anti-convulsiva
Realizaram-se também experiências para determinar a relevância fisiológica das interacções entre os esteróides neuroactivos e o receptor de GABA, testando a capacidade dos compostos do, e utilizados no, invento prevenirem as convulsões induzidas pelo metrazol em ratinhos. Injectaram-se os ratinhos com várias doses dos compostos teste do invento, 10 minutos antes da injecção, com metrazol. O tempo do início de mioclonus (presença de actividade clónica na pata dianteira) induzida pelo metrazol foi determinada observando cada ratinho por um período de 30 minutos. Nos ratinhos controlo, o metrazol (85 mg/kg) irá induzir convulsões em 95% dos animais. A capacidade de alguns compostos do, e utilizados no, invento protegerem os ratinhos de convulsões é apresentada na Tabela 6.
Tabela 6 - Actividade antimetrazol de esteróides neuroactivos em ratinhos
Nome via veículo Dose (mg/kg) % protegida 30-(4'-acetilfenil)etimi)-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 75 3 0-(4'-acetilfeml)etiml)-3a-hidroxi-19-nor-5 β-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 100 éster etílico de 3P-(4’-carboxifenil)etinil)-3a-hidroxi-50-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 18,75 3 P-(4'-hidroxibutin-1 '-il)-3a-hidroxi-5 P-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 100 3P-(4'-acetilfenil)etinil)-3a-hidroxi-5(3-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 75 3 β-(4'^οεΐοχίόυίίη- l'-il)-3a-hidroxi-5 P-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 100 3a-hidroxi-3 β-(3'-ιτιεΐοχί-1 ’-propinil)-5 β-ρΓε§ηαη-20-ona IP 50% hpbcd 10 75 3 β-(4'-3οεή1ίεηίΐ€ηηί1)-3 α,21 -di-hidroxi-5a-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 1 87,5 3β-(4'-3οεύ1ίεηί1εΐ:ίηί1)-3α,21-Ι^Γοχί-5β-ρΓείρΐ3η-20- ona IP 50% hpbcd 10 75 61 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ
Nome via veículo Dose (mg/kg) % protegida sal 21-hemi-succinato de 3P-(4’-acetilfeniletinil)-3a,21-di-hidroxi-5a-pregnan-20-ona PO água 10 80 sal 21-hemi-succinato de 3p-(4'-acetilfeniletinil)-3a.21-di-hidroxi-5 P-pregnan-20-ona PO água 10 75 3 P-(4'-hidroxi-1 '-butinil)-3a-hidroxi-5 P-pregnan-11.20-ona IP 50% hpbcd 10 50 3 P-[3-(2-propiniloxi)propin-1 -íl ]-3a-hidroxi-5 P-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 50 3P-(4'-hidroxibutin-1 '-il)-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 50 5’-(l,2-etanodiilacetal)cíclico de 3a-hidroxi-3P-(5'-oxo-l -hexinil)-5 P-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 50 3P-(4’-bifenil)etiml-3a-hidroxi-5P-pregnan-20-ona IP dmso 10 0 3P-(5-acetiltien-2-il)-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 25 3P-(4'-tnfluorometilfenil)etinil-3a-hidroxi-5P-pregnan- 20-ona IP dmso 10 25 3P-(4'-clorofenil)etinil-3a-hidroxi-5P-pregnan-20-ona IP dmso 10 37,5 3P-(5'-hidroxipentin-r-il)-3a-hidroxi-5P-pregnan-20- ona IP 50% hpbcd 10 12,5 3a-hidroxi-3 P-(tien-2-il)etmil-5 P-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 37,5 3P-(3'-acetilfeml)etinil-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 75 3a-hidroxi-3p-[4'(R/S)-hidroxipentiml]-5p-pregnan-20- ona IP 50% hpbcd 10 87,5 3P-(4'-cianofenil)etinil-3a-hidroxi-5P-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 43,7 sal de sódio de 4'-hemi-succinato de 3P-(4'-hidroxibutin-l'-il)-3a-hidroxi-5P-pregnan-20-ona IP água 10 87,5 3a-hidroxi-3p-[3'-(lH-pirazol-l-il)—l'-propinil]-5P-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 25 3a-hidroxi-3P-(4'-metilfeml)etinil-5P-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 75 3a-hidroxi-3 p-(6-oxo-1 -heptinil)-5 P-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 62,5 3 P-(5'-acetoxipentin-1 ’-il)-3a-hidroxi-5 P-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 12,5 62 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ
Nome via veículo Dose (mg/kg) % protegida 3a-hidroxi-33-(2'-piridi]etmil)-5P-pregnan-20-ona ÍP 50% hpbcd 10 37,5 3α-hklroxl-3β-(5’-oxo-l-hexirπl)-5β-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 25 3β-(4l-ciano-Γ-butinil)-3α-hidroxi-5β-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 12,5 3α-hidroxi-3β-(3'-hidroxiproplnil)-5β-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 25 3a-hidroxi^-[3'(RS)-hidroxibutinil]-5a-pregnan-20- ona ΓΡ 50% hpbcd 10 50 sal de sódio de 4'(R/S)-hemi-succmato de 3α-1ιΜΓθχι-3β-[4'(R/S)-hidroxipentinil]-5β-pregnan-20-ona IP água 10 50 3β-(5,-cianopentmll)-3α-hidroxl-5β-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 25 3a-hidroxi^-[4'(R/S)-hidroxipentinil]-5«.-pregnan-20- ona IP 50% hpbcd 10 25 3α-1^Γθχί-3β-[3'(&'8)-1^Γθχ^υηηί1]-5β-ρ^η3η-20- ona IP 50% hpbcd 10 25 sal de sódio de 5'-hemi-succinato de 3β-(5'-hidroxipentinil-Γ-il)-3α-hidroxi-5β-pregnan-20-ona rp 50% hpbcd 10 37,5 3β-(3'-3οεΐοχίρΓορίη-Γ-ί1)-3α-Ι^Γθχί-5β-ρΓείη3η-20- ona IP 50% hpbcd 10 12,5 3α-hidroxi-3β-(2l-metoxifenil)etlnil-5β-pregnan-20-ona rp dmso 10 12,5 3 β-(6'-3οεΐοχί-1ιεχίη-1 '-il)-3a-hidroxi 5 β-ρΓε"Π3η-20-οη3 1Ρ 50% hpbcd 10 37,5 3α-όί0Γθχί-3β-[3’-(ρ\πό-4-ί1οχί)-Γ-ρΓορίηϋ]-5β- pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 12,5 3β-[2-(3',4,-dimetoxlfenil)etil]-3α-hidroxi-5β-pregnan- 20-ona IP 50% hpbcd 10 12,5 3β-(3'-hidroxi-3l-metllbutin-Γ-il)-3α-hldroxi 5β-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 43,7 3a-hidroxi-3 β-[3'( 1 Η-1,2,3-triazol-1 -il)-1 '-propinil]-5 β-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 25 3a-hidroxi-3 β-[3'-( 1 Η-1,2,4-triazol-1 -il)-1 '-propinil]-5 β-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 10
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Nome via veículo Dose (mg/kg) % protegida S-(3a-hidroxi-53-pregnan-20-on-21-il)tiosulfato de sódio ΓΡ água 10 37,5 S-(3a-hidroxi-3P-metil-5a-pregnan-20-on-21 il)tiosulfato de sódio IP água 10 62,5 S-[3a-hidroxi-3p-(4’-hidroxibutinil)-5P-pregnan-20-on-21-il]tiosulfato de sódio PO água 40 33,3 S-(3a-hidroxi-3P-metoximetil-5a-pregnan-20-on-21-il) tiosulfato de sódio IP água 10 62,5 S-(3a-hidroxi-3p-trifluorometil-19-nor-53-pregnan-20-on-21-il)tiosulfato de sódio IP água 40 37,5 sal de sódio de hemi-succinato de 3ot-hidroxi-21 -(1 imidazolil)-5 P-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 50 3a-hidroxi-21-(2'H-l,2.3,4-tetrazol-2'-il)-5P-pregnan-20- ona IP 50% hpbcd 10 37,5 3a-hidroxi-21 -(2H-1,2,3 -triazol-2-il)-5 P-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 100 éster etílico de 3a-hidroxi-21-[l H-(4-metil-5-carboxil)imidazol-l-il)-5p-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 37,5 21-[r-(4,5-dicloro)imidazolil]-3a-hidroxi-5P-pregnan- 20-ona IP 50% hpbcd 10 37,5 3a-hidroxi-21-(r-imidazolil)-5a-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 50 3a-hidroxi-2 l-(l'-imidazolil)-5P-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 12,5 3 β-etimlo a-hidroxi-21 -(1 ’-imidazolil)-5 P-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 50 3a-hidroxi-21-(lH-3,5-dimetilpirazolil)-5P-pregnan-20- ona IP 50% hpbcd 10 50 3a-hidroxi-21-(l'-imidazolil-3P-metil-5a-pregnan-20- ona IP 50% hpbcd 10 75 3 P-etinil'3a-hidroxi-21 -(1 '-pirazolil)-5 β-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 62,5 3a-hidroxi-21-(l’-pirazolil)-3p-metil-5a-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 87,5 3a-hidroxi-21 -(pirazol-1 -il)-5 P-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 62,5
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Nome via veículo Dose (mg/kg) % protegida 3a-hidroxi-3P-metil-21-(r,2'.4'-triazolil)-5a-pregnan- 20-ona IP 50% hpbcd 10 87,5 3a-hidroxi-21-( r,2',4'-triazolil-l-il)-5p-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 37,5 21-[l'-(4.5-diciano)imidazolil]-3a-hidroxi-5P-pregnan- 20-ona IP 50% hpbcd 10 50 3oc-hidroxi-21-[lH-(2-metil)imidazolil-l-il)-5P-pregnan- 20-ona IP 50% hpbcd 10 6,2 3 a-hidroxi-21 -(1 ’-pirazo lil)-3 β-tri fluorometil-5 β-19-norpregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 12,5 3 a-hidroxi-21 -(1 '-imidazoli l)-3 β-triíluorometi 1-5 β-19-nor-pregnan-20-ona TP 50% hpbcd 10 50 A capacidade dos esteróides neuroactivos protegerem os animais contra outros convulsivantes químicos foi ainda demonstrada para o 3a-hidroxi-5a-pregnan--20-ona, 3a,21-di-hidroxi-5a-pregnan-20-ona e 3a-hidroxi-3p-metil-5a-pregnan-20-ona. Os testes de anticonvulsivos são semelhantes aos descritos acima. Os convulsivos químicos seguintes são: metrazol (85 mg/kg); (-f-)bicuculina (2,7 mg/kg): picrotoxina (3,15 mg/kg); estricnina (1,25 mg/kg); ou veículo (0,9% salina), [mediatamente após a injecção do convulsivo ou veículo, observaram-se os ratinhos durante um período de 30 a 45 minutos. Registou-se o número de animais com convulsões tónicas e/ou clónicas. No teste do electro-choque máximo, fomeceu-se uma corrente de 50 mA a 60 Hz, através de eléctrodos na cómea, durante 200 mseg, para induzir um ataque tónico. A capacidade dos compostos abolirem o componente tónico foi definida como ponto final. O potencial geral de depressão do CNS foi determinado por um teste de barra rotativa, dez minutos após a injecção dos compostos, em que se determinou o número de ratinhos que permanecem numa barra rotativa (6 rpm) durante 1 minuto num dos três ensaios. Determinou-se a ED;o (dose à qual ocorre metade do efeito máximo) para cada caso e estas são apresentadas na Tabela 7, infra. Os resultados demonstram que os esteróides neuroactivos, em comparação com outros anti-convulsivos clinicamente úteis, são altamente eficazes com perfis semelhantes aos da BZ clonazepam. Estas observações demonstram a utilidade terapêutica destes compostos como moduladores da excitabilidade cerebral, o que está em correspondência com a sua alta afinidade de interacçào com o complexo GR in vitro.
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Tabela 7 - Actividade anticonvulsiva de esteróides neuroactivos exemplificados e dos anticonvulsivos clinicamente úteis seleccionados, em ratinhos ED50 (mg/kg)
Composto RR MES MTZ BIC PICRO STR 3cocda)-P 30 28.6 4.9 12,3 10,2 >300 5a-THDOC(a) 22.9 26,7 8,1 17,8 5,6 >300 3a-hidroxi-3P-metil-5a-pregnan-20- ona(b) 246,2 >100 6,3 61,9 35,4 >100 Clonazepam* 0,184 93 0,009 0,0086 0,043 NP Fenobarbital* 69 22 13 38 28 95 Femtoína* 65 10 NP NP NP ** Progabide*** - 75 30 30 105 75 Valproato 426 272 149 360 387 293
As abreviaturas são RR ("barra rotativa"): MES (electro-choque máximo); MTZ (metrazol); BIC (bicuculina); PICRO (picrotoxina): STR (estricnina); NP (nenhuma protecção) (a) dissolvido em 20% de hidroxipropil-P-ciclodextnna em água. A via de administração para os esteróides e convulsivantes foi i.p. e s.c.. respectivamente. * Os dados de anticonvulsivos são de Svvinyard & Woodhead. '‘General principies: experimental detection. quantification and evaluation of anticonvulsants" in Antiepileptic Dmgs. D.M. Woodbury, J.K. Penry e C.E. Pippenger, eds. p. 111. (Raven Press. New York), 1982. (b) O veículo continha 0,32% de hidroxipropilmetilcelulose e 4% de tween 80 em solução salina. ** Protecção máxima de 50% a 55-100 mg/kg. *** Os convulsivos químicos nos estudos de Progabide foram administrados i.v., todos os dados são de Worms et ai, “Gamma-aminobutyric acid (GABA) receptor stimulation. I. Neuropharmacological profíles of progabide (SL 76002) e SL 75102. with emphasis on their anticonvulsant spectra”, Journal of Phannacology and Experimental Therapeutics 220:660-671 (1982)
Efeitos ansioliticos
As experiências seguintes demonstram que os metabolitos de progesterona, 3a-OH-5a-pregnan-20-ona e 3cc-OH-5p-pregnan-20-ona são ansioliticos eficazes em quatro modelos animais de ansiedade humana que medem os efeitos comportamentais de compostos ansioliticos. Deve entender-se que estes dois compostos descrevem o invento a título ilustrativo. Os dados sobre os seus derivados sintéticos nestas medições são também apresentados nas Tabelas 8-10. Os quatro modelos animais utilizados para medir os efeitos
84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ 66 comportamentais de compostos ansiolíticos são: l) teste de transição luz/escuro; 2) labirinto-mais elevado; 3) teste do conflito de Geller-Seitfer e 4) teste de Vogel. al Teste de transição luz/escuro O teste de transição luz/escuro (Crawlev e Goodwin. "Preliminary report of a simple animal behaviour model for the anxiolytic effect of benzodiazepines", Pharmacol. Biochem. Behav. /5:67-70 (1980)) baseia-se na observação de que os roedores tendem naturalmente a explorar novos ambientes, mas os roedores são aversos a arenas abertas, fortemente iluminadas e estas inibem o seu comportamento explorador (Christmas and Maxwell, "A comparison of effects of some benzodiazepines and other drugs on aggressive and exploratory behaviour in mice and rats", Neuropharmacol. 9:17-29 (1970); File, "The use of social interaction as a method of detecting anxiolytic activity of chlordiazepoxide-like drugs", J. Neurosci. Meth. 2:219-238 (1980)). Verificou-se que alguns ansiolíticos clinicamente estabelecidos, incluindo o diazepam, clonazepam e pentobarbital aumentam o número de transições entre a caixa de luz e a caixa escura, enquanto que as drogas não-ansiolíticoas não demonstram este efeito comportamental (Crawley et ai. "Absence of intrinsic antagonist actions of benzodiazepine antagonists on an exploratory model of anxiety in the mice", Neuropharmacol. 23:53-537 (1984)).
Colocaram-se ratinhos macho N.I.H. Swiss-Webster (Harlan, Harlan, Indianapolis, IN) com 15-20 g de peso, quatro por gaiola em gaiolas de polietileno com camas de serradura. O quarto da colónia tinha um ambiente controlado (22°C) com um ciclo de luz/escuro de 12 h (06.00-18.OOh). Os alimentos e água estavam disponíveis ad libitum, excepto durante o teste. As experiências foram realizadas entre as 07.00-15.00 h e os grupos foram contrabalançados quanto ao tempo de efeitos diários. Apenas se administrou droga ou veículo aos ratinhos. O método utilizado era uma modificação dos métodos anteriormente descritos (Wieland et ai, "Anxiolytic activity of progesterone metabolite 5a-pregnan-3a-ol-20-ona, Br. Res. 565:263-268 (1991)). O aparelho incluía duas câmaras de teste automático de 2 compartimentos (modelo RXYZCM16, Omnitech Electronics, Columbus, OH). O compartimento aberto estava conectado ao compartimento fechado através de uma passagem de 7,5x7,5 cm. O compartimento aberto era iluminado utilizando uma lâmpada de luz incandescente de 200 W. O quarto experimental foi mantido escuro. As interrupções dos feixes de infra-vermelhos em cada câmara eram registadas automaticamente, através de uma ligação a um computador através de um Analisador Digiscan (Omnitech Electronics) e os 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ
67 dados foram analisados utilizando o sistema integrado de monitorização de animais de laboratório (Omnitech Electronics). Administrou-se a ratinhos N.I.H. Swiss-Webster veículo ou droga teste intraperitonealmente (IP), 10 min após serem colocados no centro do compartimento iluminado. Determinou-se o número de transições entre as câmaras de luz e escura, a actividade total na câmara iluminada e o tempo dispendido na câmara iluminada durante um período de teste de 10 minutos. A Figura 8 mostra os efeitos de 3a-OH-5a-pregnan-20-ona e 3a-OH-5p-pregnan-20-ona no teste de transição luz/escuro. Ambos os compostos produziram uma curva dose-resposta significativa em relação ao número de tmasições entre a caixa escura e a caixa de luz. As comparações post-hoc mostraram que o número de cruzamentos para doses tanto de 3a-OH-5a-pregnan-20-ona como de 3a-OH-5P-pregnan-20-ona eram significativamente maiores às doses testadas, em relação ao controlo (teste de Dunnett).
Além disso, tanto o 3a-OH-5a-pregnan-20-ona como o 3a-OH-5P-pregnan-20-ona produziram aumentos significativos (p<0,01) na actividade a 10 e 20 mg/kg, quando comparado com os grupos controlo (teste de Dunnett). Não houve diferenças significativas entre os dois compostos a qualquer das doses testadas. b) Labirinto-mais elevado A base teórica para o teste do labirinto-mais elevado é semelhante à do teste de transição luz/escuro. Tal como foi anteriormente descrito (Pellow et al. "Validation of open:closed arm entries in an elevated plus-maze as a measure of anxiety in the rat", J. Neurosci. Meth. 74:149-167 (1985)), o aparelho do labirinto-mais elevado é concebido para utilizar a aversão natural do ratinho aos espaços abertos. O aparelho consiste de dois braços abertos e dois braços fechados. O teste do labirinto-mais elevado permite realizar duas medidas de ansiedade, o número de entradas nos braços abertos e o tempo dispendido nos braços abertos, ambos expressos como uma percentagem do número total de entradas e o tempo dispendido no/dentro tanto dos braços abertos, como dos braços fechados.
Colocaram-se ratinhos macho N.I.H. Swiss-Webster (Harlan, Indianapolis, IN) com 15-20 g de peso, quatro por gaiola, em gaiolas de polietileno com cama de serradura. O quarto da colónia tinha um ambiente controlado (22°C) com um ciclo luz/escuro de 12 h (06.00-18.OOh). Os alimentos e água estavam disponíveis ad libitwn, excepto durante o teste. As experiências foram realizadas das 07.00-15.OOh e os grupos foram contrabalançados quanto ao tempo e efeitos diários. Administrou-se apenas droga ou veículo aos ratinhos.
84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ 68 Ο método utilizado foi ο anteriormente descrito (Lister, "The use of Plus-Maze to measure anxiety in the mouse", Psychopharmacol. 92:180-185 (1987)). O aparelho incluía dois braços abertos perpendiculares a dois braços fechados, elevados a 50 cm do chão. Cada braço tinha 50 cm de comprimento e as paredes dos braços fechados tinham 40 cm de altura. O labirinto era completamente feito de plexiglass preto. As lâmpadas de luz incandescentes de 200 W estavam acima de cada um dos braços abertos, para produzir um contraste forte entre os braços abertos e os braços fechados.
Dez minutos após uma injecção, colocaram-se os ratinhos N.I.H. Swiss-webster no centro do labirinto-mais, de frente para os braços abertos. Durante o período de teste de 5 min, mediu-se o número de entradas para os braços abertos e braços fechados e o tempo dispendido nos braços abertos e braços fechados. Todas as quatro patas deveriam estar num dos braços, de forma a poder medir-se a variável dependente. Assim, o tempo dispendido no centro do labirinto não é contabilizado, de forma que o tempo total dispendido nos braços abertos e nos braços fechados pode não ser igual a 5 min. Os efeitos de 3oc-OH-5a-pregnan-20-ona e 3a-OH-5p-pregnan-20-ona no teste do labirinto-mais elevado são apresentados na Figura 9A. Ambos os compostos demonstraram uma proporção aumentada de entradas para os braços abertos, ao longo das doses. O 3a-OH-5a-pregnan-20-ona produziu um aumento significativo de entradas a 20 mg/kg (p<0,05), enquanto que o 3a-OH-5P*pregnan-20-ona produziu aumentos significatios de entradas a 5 mg/kg (p0,05). 7,5 mg/kg (p<0,01) e 10 mg/kg (p<0,01).
Além disso, o 3a-OH-5a-pregnan-20-ona e o 3a-OH-5P-pregnan-20-ona produziram aumentos dependentes de dose no tempo dispendido nos braços abertos (Fig. 9B). O 3a-OH-5a-pregnan-20-ona produziu aumentos significativos no tempo dispendido nos braços abertos a 10 mg/kg (p<0,01), enquanto que o 3a-OH-5p-pregnan-20-ona produziu aumentos significativos no tempo dispendido nos braços abertos a 7,5 mg/kg ( p<0,01) e 10 mg/kg (p<0,01). A Tabela 8 mostra o resumo das actividades ansiolíticas de compostos do e utilizados no invento, utilizando o labirinto-mais elevado nas mesmas condições acima descritas. (Segue Tabela 8)
Tabela 8 - Actividade ansiolítica em ratinhos em labirinto-mais elevado
Nome Via Dose mg/kg Veículo % Controlo 3P-(4'-acetilfenil)etinil-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 175,7 3P-(4'-acetilfenil)etinil-3cc-hidroxi-19-nor-5P-pregnan-20- ona IP 10 50% hpbcd 191 3P-(4’-hidroxibutm-l'-il)-3a-hidroxi-5P-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 141 3P-(4'-acetoxibutin-T-il)-3a-hidroxi-5P-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 159 3a-hidroxi-3P-(3'-metoxi-l'-propinil)-5p-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 134 3 P-[3-(2-propiniloxi)propin-1 -il]-3a-hidroxi-5 β-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 178 3 P-(4'-hidroxibutin-1 '-il)-3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 186 3 P-(4’-bifenil)etinil-1 ’-il)-3a-hidroxi-5 P-pregnan-20-ona IP 10 dmso 111 3P-(5-acetiltien-2-il)etinil-3a-hidroxi-5p-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 83 3P-(4'-clorofenil)etinil-3a-hidroxi-5P-pregnan-20-ona IP 10 dmso 161 3 p-(5'-hidroxipentin-1 '-il)-3a-hidroxi-5 p-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 137 3 a-hidroxi-3 p-(tien-1 -il)etmil-5 P-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 148 3P-(4'-acetilfeniletinil)-3a,21-di-hidroxi-5cc-pregnan-20- ona IP 1 50% hpbcd 150 3p-(4'-acetilfeniletinil)-3a,21-di-hidroxi-5P-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 115 sal 21-hemi-succinato de 3P-(4'-acetilfeniletmil)-3a,21-di-hidroxi-5a-pregnan-20-ona PO 10 água 166 sal 21-hemi-succinato de 3p-(4'-acetilfeniletinil)-3a,21-di-hidroxi-5 P-pregnan-20-ona PO 10 água 248 3 p-(4'-hidroxi-1 '-butinil)-3a-hidroxi-5 P-pregnan-11.20-diona IP 10 50% hpbcd 119 3P-(3'-acetilfenil)etinil-3a-hidroxi-5P-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 143
Nome Via Dose mg/kg Veiculo % Controlo 3β-(4'-^ηοίεηί1)εΐΐηι1-3α-Ιη0Γθχί-5β-ρΓε§η3η-20-οη3 IP 10 50% hpbcd 169 ' sal de sódio de 4'-hemisuccinato de 3β-(4'-1^ι·οχ^υίίη-Γ-ί1)-3α-ΜΐΌχί-5β-ρΓείϊτ^η-20-οτ^ IP 10 água 149 3a-hidroxi^-[3'-(lH-pirazol-l-il)-r-propm\l]^-pregnan- 20-ona IP 10 50% hpbcd 116 3a-hidroxi^-(4'-metilfeml)etinil^-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 148 3α-Ηί0Γθχί-3β-(6-οχο-1-Ηερήηί1)-5β-ρΓε2ηαη-20-οηα IP 10 50% hpbcd 130,5 3α-hidroxi-3β-(2,-piridiletiml)-5β-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 123 3β-(4'-cinano-Γ-butinil)-3α-hidroxi-5β-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 184 3α-hidroxl-3β-(3l-hidroxipropinll)-5β-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 128 3α-hidroxi-3β-[4'(R/S)-hidroxipentinil]-5α-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 102 3α-hidroxi-3β-[3'(RS)-hidroxibutinil]-5β-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 137,7 sal de sódio de hemi-succinato de 3β-(5'-Ι^Γθχίρεηΐίη-Γ-il)-3α-hidroxi-5β-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 155 3β-(3l-acetoxipropin-Γ-iI)-3α-hídroxi-5β-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 109 3α-hidroxi-3β-(2'-metoxifenll)etinll-5β-pregnan-20-ona IP 10 dmso 152 3 β-(6'-3οεΐοχί-Ηεχίη- l'-il)-3a-hidroxi-5 P-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 206 3a-hidroxi-3 β-[3'-( 1 Η-1,2,3-triazol-1 -il)- l'-propinil-5 β-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 116 3a-hidroxi-3 β-[3'-( 1 Η-1,2,4-triazol-1 -il)- l'-propinil-5 β-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 122 S-(3a-hidroxi-5p-pregnan-20-on-21-il)tiosulfato de sódio IP 10 50% hpbcd 143 S-(3a-hidroxi-3P-metil-5a-pregnan-20-on-21-il)tiosulfato de sódio IP 10 água 125
Nome Via Dose mg/kg Veiculo % Controlo S- [3 α-hidroxi- 3 P-(4’-hidroxibutini 1)- 5 p-pregnan-20-on-21 -il]tiosulfato de sódio IP 10 água 135 S-(3a-hidroxi-3P-metoximetil-5a-pregnan-20-on-21-il)-tiosulfato de sódio IP 10 água 126 S-(3a-hidroxi-3P-trifluorometil-19-nor-5P-pregnan-20-on-21-il)tiosulfato de sódio IP 10 50% hpbcd 139 3a-hidroxi-2l-(2'H-1,2.3.4-tetrazol-2'-il)-5 p-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 117 3a-hidroxi-21-(2H-l,2.3-triazol-2-il)-5P-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 164 éster etílico de 3a-hidroxi-21-[lH-(4-metil-5-carboxil)imidazol-1 -il)-5 P-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 112 3a-hidroxi-21-(l'-imidazolil)-5a-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 141 3a-hidroxi-21 -(1 '-imidazolil)-5 P-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 138 3p-etinil-3a-hidroxi-21-(l'-imidazolil)-5p-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 179 3a-hidroxi-21-(lH-3.5-dimetilpirazolil)-5P-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 128 3a-hidroxi-21-(l'-imidazolil)-3P-meul-5a-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 144 3 P-etinil-3a-hidroxi-21 -(1 '-piridazolil)-5 P-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 180 3a-hidroxi-21-(r-pirazolil)-3P-metil-5a-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 154 3a-hidroxi-21-(pirazol-l-il)-5p-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 129 3a-hidroxi-3P-metil-21-(r,2'.4'-triazolil)-5a-pregnan-20- ona IP 10 50% hpbcd 153 3a-hidroxi-21-(r,2',4'-triazol-l-il)-5P-pregnan-20-ona IP 10 50% hpbcd 135 3a-hidroxi-21-[lH-(2-metil)imidazol-l-il)-5P-pregnan.-20- ona IP 10 50% hpbcd 96
84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ c) Teste de conflito Geller-Seifter
Este modelo animal de ansiedade humana utiliza um estado de conflito condicionado em ratos, para determinar as propriedades ansiolíticas de drogas. Os ratos são condicionados a pressão com barra para um reforço positivo sob dois programas comportamentais (Geller e Seifter, "The effects of mepobramate, barbiturates. d-amphetamine and promazine on experimentally induced conflict in the rat". Psychophannacologia 1:482-492 (1960)). O primeiro inclui pressão com barra num programa de razão variável, sem punição. O segundo componente é um programa de razão fixa, em que cada pressão com barra resulta num reforço positivo e numa punição. O componente de punição produz um estado de conflito no animal. O componente sem punição permite a observação de quaisquer efeitos de resposta depressiva que uma droga possa ter. Uma resposta ansiolítica irá aumentar a resposta com punição, sem afectar a resposta sem punição.
Utilizaram-se ratos macho albinos Sprague-Dawley (Charles River Labs, Wilmington, MA) com 250-300 g de peso para experiências de conflito e estes foram mantidos numa dieta restrita de peletes alimentares de Chow da Purina Lab, estando a água disponível em todo o tempo, para manter um peso corporal de 85% relativamente aos níveis adultos com alimentação livre. Os ratos foram acomodados individualmente sob um ciclo luz-escuro de 12 horas, com luz ligada das 07.00-19.00.
Os efeitos anti-ansiedade (diminuição-punição) e de resposta depressiva do 3a-OH-5ot-pregnan-20-ona e do 3α-ΟΗ-5β-ρ^Μη-20-οη3 foram medidos em ratos pelo teste do conflito de Geller e Seifter (1960). Neste teste de 63 min, os ratos esfomeados têm uma resposta alavanca-barra para obter uma recompensa de leite adoçado. O esquema de reforço consiste em componentes de punição e não punição, alternando aproximadamente a cada 15 minutos. Os ratos foram treinados em câmaras de teste (instrumentos Coulboum) com uma alavanca montada numa parede, um pequeno tubo que fornece 0,1 ml de recompensa de leite (1 parte de leite condensado de Eagle:2 partes de água) e um chão de grade de metal, através do qual se administrava a punição de choque nas patas. Utilizou-se um minicomputador DEC PDP 11/73 que corre em SKED (State Systems), para programar e registar.
As taxas inicialmente programadas para responder a um esquema de reforço contínuo progrediram rapidamente para esquemas de intervalos variáveis (IV) de 30 seg, 1 min e 2 min. No esquema de reforço contínuo, os ratos receberam a recompensa de leite a cada pressão da alavanca; nos esquemas VI, as recompensas de leite estavam disponíveis a intervalos não frequentes e variáveis, eventualmente a uma média de uma vez a cada 2 min. 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ 73
Introduziram-se então 3 períodos de "conflito" de 3 min na linha de base VI não punida; o primeiro começou após 3 min da performance VI e os outros alternaram entre períodos de 12 min de resposta VI. Durante os períodos de conflito, que foram assinalados pela apresentação de uma luz e de um som, o esquema de reforço continuo estava novamente em força e cada pressão da alavanca forneceu tanto uma recompensa de leite, como uma punição breve(0,25 mseg) de choque na pata. A intensidade do choque era de 0,2 mA inicialmente e aumentou diariamente em incrementos de 0,02 mA. de modo a suprimir gradualmente a pressão da alavanca para 5 respostas, ou menos, por período de conflito. Este treino demorou 4-6 semanas, após o que se observaram taxas baixas estáveis durante os períodos de conflito e taxas elevadas estáveis nos períodos de não punição. Os aumentos induzidos pelas drogas na taxa de respostas com punição foram tomados como um índice da actividade de ansiedade, enquanto que os decréscimos na taxa de respostas não punidas foram tomados como um índice de resposta de depressão ou sedação.
Os efeitos do 3a-OH-5a-pregnan-20-ona e do 3ct-OH-56-pregnan-20-ona no teste de conflito estão resumidos na Figura 10. Ambos os compostos produziram grandes aumentos na taxa de respostas punidas, sugerindo que ambos seriam activos como agentes anti-ansiedade. O efeito máximo do 3a-OH-5a-pregnan-20-ona foi observado a 2 mg/kg e o do o 3a-OH-5P-pregnan-20-ona a 4,4 mg/kg, após administração subcutânea. (Para fins estatísticos e devido ao pequeno número de testes a cada dose, combinaram-se todos os testes com cada composto, para comparação com o teste controlo de veículos, utilizando um teste-t para medidas relacionadas: para o 3a-OH-5a-pregnan-20-ona, p<0,02, para o 3a-OH-5P-pregnan-20-ona, p<0,008). A Tabela 9 mostra o resumo das actividades ansiolíticas dos compostos do, e utilizados no invento, utilizando o teste de Geller-Seifter, nas condições experimentais acima descritas. (Segue Tabela 9) 74 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ
Tabela 9 - Actividade ansiolítica em Geller/Seifter em ratos
Compostos Via Veiculo Dose (mg/kg) Geller/Seifter (% controlo) 3a-hidroxi-3fi-metoximetil-5a-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 10 958 1 la-N,N-dimetiiamino-3a-hidroxi-30-trifluorometil-5p-pregnan-20-ona ÍP citrato 20 145 S-(3a-hidroxi-3P-metoximetil-5a-pregnan-20-on-21-il)tiosulfato de sódio PO água 32 4487,5 3a-hidroxi-3P-etoximedl-5a-pregnan-20-ona IP 50% hpbcd 40 3743 d) Teste de Voael O teste de Vogel baseia-se no desenvolvimento de um conflito entre um comportamento altamente motivado e uma aversão. Para este teste, a motivação forte é a sede. O animal é privado de água durante 12-16 horas, a fim de provocar uma motivação para beber. Durante o período de treino, os animais são expostos ao ambiente de teste de modo a se acostumarem ao bebedouro e minimizarem o seu medo de um ambiente novo. Após o treino, os animais têm acesso à água durante 2 horas. Durante este tempo, os animais irão beber e comer a quantidade normal de água e alimentos, compensando o tempo de privação. No entanto, este esquema ainda produz uma forte motivação para beber durante o período de teste.
Após serem privados de água durante doze a dezasseis horas, coloca-se um animal numa gaiola teste, onde lhe é permitido beber livremente durante cinco minutos. Este período é utilizado para habituar o animal ao ambiente e ao bebedouro. Após o período de treino, os animais têm acesso a água e alimentos na sua gaiola, durante 2 horas. Os alimentos estão disponíveis todo o tempo. Vinte e quatro horas mais tarde, administra-se droga ao animal, intracerebroventricularmente.
Após um atraso indicado, iniciado a partir da altura da injecção, o animal é novamente colocado na gaiola teste durante dez minutos. Um computador conta o número de vezes que um animal se lambe e após cada 20 lambidas administra um estímulo eléctrico suave, através da língua e/ou pés. O estímulo eléctrico consiste de uma corrente de 0,6 mA com uma duração de 100 mseg. Este processo produz um estado de conflito no animal que é
λ 84 866 3· ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ reduzido por administração de agentes ansiolíticos clinicamente utilizados (i.e. Valium). Para as curvas dose-resposta, injectam-se grupos separados de animais com doses crescentes de droga teste e estes são testados a um tempo pré-determinado.
Os dados dos compostos representativos utilizando estas medições estão resumidos na Tabela 10.
Tabela 10 - Actividade ansiolítica no teste de Vogel em ratos
Compostos Via Veículo Dose (pg/kg) Vogel (% controlo) 3a,20a-di-hidroxi-2p-isopropoxi-5a-pregnano i.c.v g-CD 10 169,0 3a,20-di-hidroxi-20-metil-5a-pregnano i.c.v g-CD 20 179,0 3a.20a-di-hidroxi-21 -metil-5a-pregnano i.c.v g-CD 10 157,9 3a,20a(S)-di-hidroxi-5a-pregnano i.c.v g-CD 10 193,0 3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona i.c.v g-CD 10 431,1 3a,20a-di-hidroxi-5a-pregnano i.c.v g-CD 10 283,3 2p-fluoro-3a,20a-di-hidroxi-5a-pregnano i.c.v g-CD 20 264,9 3a,20a-di-hidroxi-21-etil-5a-pregnano i.c.v g-CD 20 225,8 3a,20a-di-hidroxi-5a-pregnano i.c.v g-CD 20 267,3
Pró-drogas
As actividades anti-convulsivas e ansiolíticas das pró-drogas dos compostos básicos 3a-OH-5a-pregnan-20-ona e 3a.21-di-hidroxi-5a-pregnan-20-ona e seus derivados foram determinadas utilizando os mesmos processo acima descritos. Fez-se um gráfico da percentagem de protecção de várias pró-drogas de 3a-OH-5a-pregnan-20-ona contra ataques induzidos por metrazol em função do tempo, após administração dos compostos (Fig. 11, Tabela 11). A modificação dos compostos básicos 3a-OH-5a-pregnan-20-ona e 3a,21-di-hidroxi-5a-pregnan-20-ona nos hidroxilos 3a e 21 com vários ésteres mantém a sua actividade biológica e nalguns casos esta modificação aumenta o tempo de protecção fornecida pelo composto.
Assim, os compostos do presente invento podem ser modificados para fornecer actividades anti-convulsivas e ansiolíticas durante um período de tempo, com vários níveis de protecção.
Tabela 11 - Actividade anti-metrazol de pró-drogas de ésteres de 3a-hidroxi-5a-pregnan-20-ona (3a-(RCOO)-5tt-pregnan-20-ona) R % de protecção 60 mg/kg 1 h, IP Metilo 25 Etilo 75 Propilo 75 Butilo 33 2-Propilo 75 4-Heptilo 16 (4 horas) Ciclobutilo 17 Fenilo 4-Clorofenilo 50 4-Metoxifenilo 17 3-Piridilo 50 (20 horas) 3-( 1 -Metil-1,4-di-hidropiridinilo) 63 (20 horas)
Ao contrário das benzodiazepinas, os esteróides neuroactivos também podem induzir anestesia. Pensa-se que a sua capacidade de induzir anestesia é devida à sua capacidade de abrir o canal de iões cloro na ausência de GABA, o que é uma propriedade que as benzodiazepinas não possuem. Assim, os neuroesteróides podem actuar directamente na ausência de GABA, no receptor, e também "indirectamente", na presença de GABA. A acção "indirecta" é designada por "modulação" do receptor. (Lamber et ai, "Actions of synthetic and endogenous steroids on the GABA^\ receptor", Trends Pharmacology Science 8:224-227 (1987)).
Os compostos do, e utilizados, no invento também podem ser utilizados para indicações anestésicas a doses elevadas. No entanto, a via de administração preferida para induzir anestesia é a administração intravenosa (i.v.). Nos animais, as propriedades anestésicas de uma droga são medidas pela capacidade da droga produzir um reflexo de perda de capacidade de se endireitar. 0 reflexo de perda de capacidade de se endireitar é 77 84 866 ΕΡ Ο 752 860/ΡΤ definido como a incapacidade do animal se colocar direito dentro de 30 segundos, quando colocado de costas. Administrou-se droga i.v. na veia lateral da cauda dos ratinhos. Após a administração, colocaram-se os ratinhos de costas e observou-se a perda do reflexo de capacidade de se endireitar. Os resultados ilustrativos são apresentados na tabela 12.
Tabela 12 - Actividade anestésica de esteróides neuroactivos em ratinhos
Compostos via νείευίο Dose (mg/kg) perda do reflexo da capacidade de se endireitar 3a,21 -di-hidroxi-3 β-εήηι1-5 β-pregnan-20-ona iv 20% cremo for 10 100 3β-(ο1θΓθεηηί1)-3α-1ιί0Γθχί-5β-ρπ^ηΒη- 20-ona iv solução micronizadora 20 100 3 β-ε0ηί1-3α-1ιί0Γθχί-5 β-ρ^Μη-20-οη3 iv 10% hpbcd 30 100 3a-hidroxi^-metil-5a-pregn-16-en-20-ona iv solução micronizadora 50 100 3 a-hidroxi-5 a-pregn-9-en-20-ona iv solução micronizadora 10 100 3a-hidroxi-17(Z)-metoximetileno-19-nor-5a-androstano iv solução micronizadora 5 75 3 a-hidroxi-3 β-ηιού1-5 β-ρregnan-20-ona iv solução micronizadora 2,5 100 2β-etoxi-3α-hidroxi-5α-pregnan-20- ona iv 20% cremafor 5 100 2β-fluoro-3α-hidroxi-5α-pregnan-20- ona iv solução micronizadora 5 100 3 α-h idroxi-3 β-ηιείί1-21 -mεtoximeti 1 -5a-pregnan-20-ona iv solução micronizadora 20 100
Prevê-se que as drogas, com modificações semelhantes como acima descrito, dos compostos do, e utilizados no, invento tenham actividade como pró-drogas de 3a-OH-pregnanos reduzidos em 5.
Lisboa, 23. ASi 2003
Por Euro-Celtique S.A. - O AGENTE OFICIAL -
ENG.e ANTÓNJO J0Â0 DA CUNHA FERREIRA Ag. Of. Pr. Ind.
Rmo das Flores, 74-4.* I leoo LISBOA

Claims (28)

  1. 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ 1/7 REIVINDICAÇÕES 1. Composto de fórmula
    em que: R é hidrogénio, halogéneo. alcoxi inferior, dialquilamino, alquilo, 1-alcinilo opcionalmente substituído ou alquilo substituído; R[ é hidrogénio, alquilo opcionalmente substituído, alcenilo opcionalmente substituído, arilo opcionalmente substituído, aralquilo opcionalmente substituído, alcinilo opcionalmente substituído, aralcinilo opcionalmente substituído, alcoxialquilo, aminoalquilo, ciano, cianoalquilo, tiocianoalquilo, azidoalquilo, aralcinilo substituído, arilalquilo, arilalcenilo, aralquilalcinilo opcionalmente substituído, alcanoíloxialcinilo, heteroariloxialcinilo opcionalmente substituído, oxoalcinilo ou um cetal seu derivado, cianoalcinilo, heteroarilalcinilo opcionalmente substituído, hidroxialcinilo, alcoxialcinilo, aminoalcinilo, acilaminoalcinilo, mercaptoalcinilo, hemi-éster de ácido hidroxialquinildíóico ou um sal seu derivado ou alciniloxialcinilo; R2 é hidrogénio, hidroxi, alcoxi, alcanoíloxi. carbalcoxilo, um grupo ceto ou um grupo amino; R3 é um grupo heteroarilacetilo opcionalmente substituído; R4 é hidrogénio ou metilo, R5 é hidrogénio;
    84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ R(5 é hidrogénio, alcanoílo, aminocarbonilo ou alcoxicarbonilo; R7 é hidrogénio, halogéneo, hidroxi, alcoxi, alcanoíloxi ou carbalcoxilo; Rg é hidrogénio ou halogéneo; R9 é hidrogénio, halogéneo. alquilo, alcoxi, arilalcoxi ou amino; e RlO é hidrogénio, halogéneo, alquilo, halogenoalquilo, hidroxi, alcoxi, alcanoíloxi, carbalcoxilo, ciano, tiociano ou mercapto; ou um 3-éster seu derivado fisiologicamente aceitável, em que os termos seguintes, aqui utilizados, são definidos como se segue: o termo "alquilo" refere-se a grupos alifáticos saturados, incluindo grupos de cadeia linear, cadeia ramificada e cíclicos, podendo todos eles ser opcionalmente substituídos; 0 termo "alcenilo" refere-se a grupos insaturados que contêm pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono e incluem grupos de cadeia linear, cadeia ramificada e cíclicos, podendo todos eles ser opcionalmente substituídos. o termo "alcinilo" refere-se a grupos de hidrocarbonetos insaturados que contêm pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono e incluem grupos de cadeia linear e cadeia ramificada, que podem ser opcionalmente substituídos. o termo "alcoxi" refere-se ao éter-OR, em que R é alquilo, o termo "ariloxi" refere-se ao éter-OR, em que R é arilo, o termo "arilo” refere-se a grupos aromáticos que têm pelo menos um anel com um sistema de electrão pi conjugado e incluem arilo carbocíclico e biarilo, podendo ambos ser opcionalmente substituídos, o termo "arilo carbocíclico" refere-se a grupos em que os átomos do anel no anel aromático são átomos de carbono.
    84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ 3/7 ο termo "aralquilo" refere-se a um grupo alquilo substiuído com um grupo arilo e pode ser opcionalmente substituído, o termo "alcanoíloxi" refere-se a -0-C(0)R, em que R é alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo ou aralquilo, o termo "carbalcoxilo" refere-se a -C(0)0R. em que R é alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo ou aralquilo, o termo "carboxamido" refere-se a -C(0)NRRi, em que R e Rj são independentemente seleccionados de entre halogéneo, alquilo, alcenilo, alcinilo, arilo ou aralquilo, o termo "dialquilamino" refere-se a -NRR" em que R e R" são independentemente grupos alquilo inferiores ou em conjunto forma o resíduo de um grupo morfolino, o termo "amino" refere-se a NRR', em que ReR' são independentemente hidrogénio, alquilo inferior, ou são juntos para formar um anel de 5 ou 6 membros, o termo "opcionalmente substituído" ou "substituído" refere-se a grupos substituídos por um a três, quatro ou cinco substituintes, independentemente seleccionados de entre alquilo inferior acíclico ou cíclico, arilo, incluindo carboarilo ou heteroarilo, alcenilo, alcinilo, alcoxi, halogeno, halogenoalquilo, amino. mercapto, alquiltio, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, nitro, alcanoílo, alcanoíloxi, alcanoíloxialcanoílo, alcoxicarboxi, carbalcoxi, -COOR, em que R é alquilo inferior, carboxamido, -CONRR', em que ReR' são independentemente alquilo inferior, formilo, carboxilo. hidroxi, ciano, azido, ceto e cetais cíclicos seus derivados, alcanoílamido, heteroariloxi, heterocarbociclicoxi e sais de éster hemi-succ inato, o termo "inferior" aqui utilizado em relação aos radicais orgânicos ou compostos define de um até , inclusive, dez átomos de carbono, que podem ser de cadeia linear, cadeia ramificada ou cíclicos, o termo "heteroarilo" refere-se a radicais insaturados cíclicos contendo 5-14 membros, que contêm um, dois, três ou quatro átomos de O, N ou S e que têm 6, 10 ou 14 electrões π deslocalizados, num ou mais anéis.
    84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ
  2. 2. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que R3 é um grupo imidazolilacetilo opcionalmente substituído.
  3. 3. Composto de acordo com a reivindicação 2, que é 3a-OH-21-(l’-imidazolil)-5P- pregnan-20-ona, 3a-hidroxi-3P-(4-hidroxibutin-l-il)-21-(l-imidazolil)-5P-pregnan-20-ona, 3a-hidroxi-3P-(4-hidroxibutin-1 -il)-21 -(1 -imidazolil)-5p-19-norpregnan-20-ona, éster etílico de 3a-hidroxi-21 -[ 1 H-(4-metil-5-carboxil)imidazol-1 -il)-5 p-pregnan-20-ona, 3a-hiclroxi-21 -[ 1 H-(4-metil-5-carboxil)imidazol-1 -il)-5 p-pregnan-20-ona, 3 P-etinil-3a-hidroxi-21 -(1 imidazolil)-5P-pregnan-20-ona, 3a-hidroxi-21-(r-imidazolil)-3P-metil-5a-pregnan-20-ona, 3a-hidroxi-21 -[ lH-(2-met.il)imidazol-1 -il)-5 P-pregnan-20-ona. 3a-hidroxi-3 p-trifluorometil-21-(l-imidazolil)-5P-pregnan-20-ona, 3a-hidroxi-2l-[lH-(2'-formil)imidazol-l-il)]-5P-pregnan-20-ona, ou 3a-hidroxi-3p-trifluorornetil-21-(l-irnidazolil)-5p-19-nor-pregnan-20-ona.
  4. 4. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que R3 é um grupo pirazolilacetilo opcionalmente substituído.
  5. 5. Composto de acordo com a reivindicação 4, que é 3a-hidroxi-21-(pirazol-I-il)-5P-pregnan-20-ona, 3a-hidroxi-2 l-(pirazol- l-il)-5a-pregnan-20-ona, 3a-hidroxi-21-(lH-3,5-dimetil-pirazolil)-5p-pregnan-20-ona 3a-hidroxi-21-(l’-pirazolil)-3p-metil-5a-pregnan-20-ona, 3a-hidroxi-21-(pirazol-l-il)-3p-trifluorometil-5p-pregnan-20-ona, ou 3a-hidroxi-21-(pirazol-lil)-3P-trifluorometil-5P-19-nor-pregnan-20-ona.
  6. 6. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que R3 é um grupo triazolilacetilo opcionalmente substituído.
  7. 7. Composto de acordo com a reivindicação 6, que é 3a-hidroxi-3P-metil-21-(r,2',4'- triazolil)-5a-pregnan-20-ona, 3a-hidroxi-3 P-(4-hidroxibutin-1 -il)-21 -(1,2,3-triazol-2-il)-5p-19-norpregnan-20-ona, 3a-hidroxi-21 -(2H-1,2,3-triazol-2-il)-5p-pregnan-20-ona, 3a-hidroxi-3P-metil-21-(2,H-r,2',3'-triazol-2'-il)-5a-pregnan-20-ona, 3P-etinil-3a-hidroxi-21-(1 ',2',4'-triazolil)-5 P-pregnan-20-ona, 3a-hidroxi-3p-metil-21 -(Γ,2',3'-ΙΠ3ζο1- 1 '-il)-5a- pregnan-20-ona, 3a-hidroxi-21-(r,2',4’-triazol-l-il-5p-pregnan-20-ona, 3a-hidroxi-3p-(4-hidroxibutin-1 -il)-21 -(1,2,4-triazol-1 -il)-5P-pregnan-20-ona, 3a-hidroxi-3P-(4-hidroxibutin-1 -il)-21 -(1,2,3-triazol-1 -il)-5P-pregnan-20-ona, 3a-hidroxi-3 P-(4-hidroxibutin-l-il)-21 -(1H-1,2,3-triazol-1 -il)-5 P-19-nor-pregnan-20-ona, 3a-hidroxi-3 P-trifluorometil-21 -(1 H-l ,2,3-
    84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ 5/7 triazo 1-1 -il)-5β-19-nor-pregnan-20-ona ou 3a-hidroxi-3P-trifluorometil-21-(lH-l,2,3-triazol-1 -ί1)-5β-19-pregnan-20-ona.
  8. 8. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que R3 é um grupo tetrazolilacetilo opcionalmente substituído.
  9. 9. Composto de acordo com a reivindicação 8, que é 3cc-hidroxi-21-(2'H-l,2,3,4-tetrazoi-2'-il)-5P-pregnan-ona, 3a-hidrox-21-(rH-L2.3,4-tetrazol-l’-il)-5P-pregnan-20-ona ou 3a-hidroxi^-(4-hidroxibutin-l-il)-21-(tetrazol-l-il)-5p-pregnan-20-ona.
  10. 10. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que R3 é um grupo benzimidazolilacetilo opcionalmente substituído.
  11. 11. Composto de acordo com a reivindicação 10, que é 3a-hidroxi-21-(l'-benzimidazolil)-5p-pregnan-20-ona, 2 l-(T-benzimidazolil)-3a-hidroxi-3p-metil-5a-pregnan-20-ona ou 21-(r-benzimidazolil)-3a-hidroxi-3p-metil-5a-pregnan-20-ona.
  12. 12. Composto de acordo com a reivindicação 1. em que R3 é um grupo purinilacetilo opcionalmente substituído.
  13. 13. Composto de acordo com a reivindicação 12, que é 3a-hidroxi-21-(9'H-purin-9'-il)-5β-pregnan-20-ona ou 3α-hidroxi-21-(7Ή-purin-7,-il)-5β-pregnan-20-ona.
  14. 14. Composto de acordo com a reivindicação 1. em que R é um grupo morfolino e R3 é um grupo triazolilacetilo opcionalmente substituído.
  15. 15. Composto de acordo com a reivindicação 14. que é 3a-hidroxi-2p-morfolinil-21-(1,2,4-triazolil)-5a-pregnan-20-ona.
  16. 16. Composto de acordo com a reivindicação 1. em que R3 é um grupo uracilacetilo opcionalmente substituído.
  17. 17. Composto de acordo com a reivindicação 16 que é 3a-hidroxi-21-(l'-uracil)-5a-pregnan-20-ona.
    84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ 6/7
  18. 18. Composto de acordo com a reivindicação 1, em que R um grupo 1-alcinilo opcionalmente substituído.
  19. 19. Composição farmacêutica que compreende um composto, tal como definido em qualquer das reivindicações l a 18, e um veículo farmacêuticamente aceitável.
  20. 20. Utilização de um composto como definido em qualquer das reivindicações 1 a 18 para a preparação de um agente para modular o complexo ionóforo receptor de GABA^-cloreto num indivíduo animal, através da ligação ao local do neuroesteróide no referido complexo.
  21. 21. Utilização de um composto de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 18, para a preparação de um agente para o tratamento ou prevenção de stress, ou ansiedade num indivíduo animal.
  22. 22. Utilização de um composto de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 18, para a preparação de um agente para aliviar ou prevenir a actividade de ataques num indivíduo animal.
  23. 23. Utilização de um composto de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 18, para a preparação de um agente para aliviar ou prevenir a insónia num animal.
  24. 24. Utilização de um composto de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 18, para a preparação de um agente para aliviar ou prevenir o PMS ou PND num animal.
  25. 25. Utilização de um composto de acordo com qualquer das reivindicações l a 18, para a preparação de um agente para tratar ou prevenir desordens de disposição num indivíduo animal.
  26. 26. Utilização de acordo com a reivindicação 25, em que a referida desordem de disposição é a depressão.
  27. 27. Utilização de um composto de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 18, para a preparação de um agente para induzir anestesia num indivíduo animal. 84 866 ΕΡ Ο 752 860 / ΡΤ 7/7 28. utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 27, em que o composto é um éster ou diéster farmaceuticamente aceitável de um ácido seleccionado do grupo constituído por ácido acético, propiónico, maleico, fumárico, ascórbico, pimélico, succínico, glutárico, bismetilenossalicílico, metanossulfónico, etano-di-sulfónico, oxálíco, tartárico, salicílico, cítrico, glucónico, itacónico, glicólico, p-aminobenzóico, aspártico, glutâmico, y-amino-butírico, a-(2-hidroxietilamino)-propiónico, glicina e outros a-aminoácidos, fosfórico, sulfúrico, glucorónico e l-metil-l,4-di-hidronicotínico.
  28. 29. Utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 a 28, em que o composto está prsente numa quantidade de cerca de 1 mg a cerca de 100 mg por unidade de dosagem, quando o agente é para ser administrado intravenosamente e de cerca de 100 mg a cerca de 500 mg por unidade de dosagem, quando o agente é para ser administrado não-intravenosamente. :oc0 Lisboa, Por Euro-Celtique S.A. - O AGENTE OFICIAL -
    ENG.· AMTÓfc Ag. Of. P
    ENG.· AMTÓfc BA CUMBA Etos des Flors ieoo li
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