JPH06510999A - ステロイド結合部位を有する新規ＧＡＢＡ↓ａレセプター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ステロイド結合部位を有する新規ＧＡＢＡＡレセプター関連出願の引用 本件は、１９８７年８月２５日に出願し、既に放棄された出願番号第０８９．３ ６２号の一部Ｎ！続である、１９８９年７月１３日に出願した同時係属出願番号 第３７９．０４７号の一部継続である１９９０年５月１日に出願した同時係属出 願番号第０７１５１７．１９４号の一部継続である。出願番号第５１７．１９４ 号及び出願番号第３７９．０４７号の開示は、引用して特に明細書の一部とする 。

発明の背景 これまでの研究により、幾つかのプレグナンステロイド、特にプロゲステロンの ３α−ヒドロキシル化−５σ−還元化代謝物が脳励起性に速やかな且つ十分な効 果を有することを示した。最近の研究では、脳励起性効果はＧＡＢＡＡレセプタ ー塩化物イオン泳動複合体（ＧＲＣ）（ここでＧＡＢＡはγ−アミノ酪酸を表す ）により伝達されうること、プレグナンステロイドはＧＲＣの他の既知部位と独 立した新規な部位を経てＧＲＣを調節することが明らかにされた。

共に治療上有用な薬物であるバルビッール酸塩及びベンゾジアゼピン類は、ＧＲ Ｃをアロステリックに調節しうることが知られている。バルビッール酸塩及びべ ／ジノアゼピン類への幾つかのＧＲＣの部位があると信じられる。本発明は、一 部、ステロイドに特異的であるＧＲＣの新規レセプター部位を定義する。さらに 、それは他のレセプターがＧＲＣに存在するかどうか測定する方法、及びどんな 分子が新しく同定された部位に結合するかを測定する方法に関する。

発明の一般的記載 本発明は、ＧＲＣ保持ステロイド認識又はＧＲＣでの塩化物チャンネルの開始の ための結合部位に関する。我々は、このＧＡＢＡＡ結合神経ステロイドレセプタ ー（ＧＮＲ）が存在し、ＧＲＣの他の既知部位と別個であり、そしてそのアゴニ ストに高親和性を有することを発見した。我々は天然に生じるレセプターに見い 出されるサブユニットの数より少ないがそれにもかかわらずＧＮＲを有するＧＲ Ｃを調製し得た。我々の発明は、天然に生じるレセプターの全てのサブユニット より少ないが少なくともアルファ（α）及びベータ（β）サブユニット、そしで ある例では、さらにガンマ（γ）サブユニットを有するＧＲＣに関する。以下に 詳細に記載される我々の研究は、又、活性な部位に存在する結合部位に対し、レ セプターがα、β及びγサブユニットの全てを有する必要がないことをも示した 。用いられた結合剤に依存するＧＮＲはαβサブユニット結合に脩ゎりうる。

本発明は、又、ＧＲＣ中のＧＮＲの存在及び他の認識部位がその複合体に存在す るかを測定する方法に関する。アロステリック調節検定は化合物の新規又は既知 部位で複合体に結合する能力を測定することを記載する。競合検定も、この目的 に用いることができる。

本発明は、又、ストレス、不安、不眠、出生後機能低下（ＰＮＤ）　、月経前症 候群（ＰＭＳ）、神経疾患、例えばウラ病及び発作の処置に有効なＧＮＲ−アゴ ニスト薬物をスクリーニングする手段を提供する。それは、又、ＧＮＲに対する アゴニストを投与することにより上記の状態を処置する手段を提供する。

さらに、本発明は異なるサブタイプ特異性でＧＮＲに結合する薬物をスクリーニ ングする手段を提供する。

最近の研究は、プロゲステロン、特に３ａ−ヒドロキシ−５α−プレグナン−２ ０−ｆン（３α−０Ｈ−ＤＨＰ）　の代謝ｖｔｔｂ＜、ＧＡＢＡルセブター複合 体の強力な調節剤であることを示唆する。マジエウス力等、「ステロイド・ホル モン・メタポライン・ジー・バーピッレイト−ライク・モジュレーション・オブ ・ザＧ、ＡＢＡレセプター」、サイエンス、２３２．１００４（１９８６）、ジ ー等、Ｆガンマ−アミノブチリック・アンラド−デペンデント・モジュレーショ ン・オブ・ザ・クロライド・イオノフオア・パイ・ステロイズ・イン・ラット・ ブレインズ」、ユーロビアン・ジャーナル・オブ・ファーマコロジイ、１３６． ４１９　（１９８７）。このステロイド調節はレセプター複合体のバルビッール 酸塩部位により伝達されることを初めて思わせた。マンエウスカ等（上掲、ハリ ソン等、「ストラフチャ一アクティビティ・リレイノヨン／ツブス・フォア・ス テロイド・インターラクンヨン・ウィズ・ザ・ガンマ−アミノ・ブチリック・ア ノツビーＡレセプター・コンプレックスｊ１ジャーナル・オン・ファーマコロジ イ・アンド・エクスペリメンタル・テラビューティクス、２４１．３４６　（１ ９ｇ？）。しかしながら、続く実験は、これらのステロイド類がバルビッール酸 塩部位で相互に作用せず、むしろレセプター複合体と結合した新しい部位で作用 することを示した。ジー等、「ステロイド・モノユレーノタン・オン・ザ・クロ ライド・イオノフオア・イン・ラット・プレイン、ストラフチャー−アクティビ ティ・リクアイアメンツ・レンヨナル・デペンデント・アンド・メタニズム・オ ン・アク／コン」、ジャーナル・オン・ファーマコロンイ・アンド・エクスベリ メンタル・テラビューティクス、２４６．８０３　（１９８８）　、１９８７年 ８月２５日に出願し、既に放棄されたＵＳ、特許出願番号第０８９．３６２号、 ペーターズ等、［モノニレ−／タン・オン・ザ・ＧＡＢ、ヘルセプター・パイ・ デペンデント・バルビソレイン・アンド・プレグナン・ステロイズ」、プリティ ッノユ・ジャーナル・オン・ファーマコロジイ、９４．１２５７　（１９８８） 。

最近のクローニングの努力により、ＧＡＢＡＡレセプターが少なくとも３つのサ ブユニット、α、β及びγからなることが明らかになった。ジョフールド等、「 ノーケンス・アンド・ファ／クノヨナル・エクスブレソノタン・オン・ザ・ＧＡ 　Ｂ　、Ａレセプター・ノヨーズ・ア・リガンド−ゲイテッド・レセプター・ス ーパー−ファミリイ」ネイチャー、３２８．２２１　（１９８７）。プリツエノ ト等、「イノポータンス・オン・ア・ノベルＧＡＢＡルセブター・サブユニ・ン ト・フォア・ベンゾジアゼピン・ファーマコロジイ」ネイチャー、３３８．５８ ２　（＋９８９）。

加えて、α、β及びγサブユニットの変異体も存在する。レビタン等、［ストラ フ千ユラル・アンド・ファンクノヨナル・ベイノズ・フォアＧＡＢＡルセプター ・ヘテロゲニテイ］、ネイチャー３３５．７６　（１９８８）　、イマー等、ｒ ＧＡＢ八ルセへターＢサブユニット・ヘテロゲニテイ　ファンリンクナル・エク スブレノノタン・オン・クローンド・ＣＤＮＡ５」、ＥＭＢｏジャーナル、８． １６６５　（１９８９）。これらのサブユニット変異体は機能的に異なるＧＲＣ サブタイプを表しうる。これらのＧＲＣサブユニｌトを哺乳動物細胞にコードす るｃＤＮＡの一時的発現を含む実験は、α及びβサブユニツト結合にＧＡＢＡＡ 及びバルビッール酸塩部位の再構成を示し、一方、ベンゾジアゼピン（Ｂ　Ｚ） 部位は、これら全てのサブユニットが移入された場合にのみ検出された。プリチ ェット等、止揚参照。

ステロイド部位がＧＲＣに存在するという仮説を試験するために、ｃＤＮＡ暗号 化ヒトＧＡＢＡルセブターα２、α２又はα、並びにβ１及びγ、サブユニット をヒト胎児腎臓２９３細胞で共発現し、ベンゾジアゼピン及びＧＡＢＡＡ結合を アロステリンクに調節し、又、［’Ｈ］　３α−０Ｈ−ＤＨＰの発現レセプター 複合体への直接結合を阻害するステロイドの能力を測定した。

本発明は、ＧＮＲが既に脳ホモンネートで示されたと同じ構造活性関係を有する ことを示す。ノー等、（１９８ｇ）止揚。ＧＮＲでの相互反応によるＧＡＢＡＡ 結合のアロステリック調節は、ＧＲＣの他の既知レセプター部位での相互反応に よる調節とは異なる。従って、本発明はＧＲＣの他のレセプター部位と物理的に 異なるＧＮＨの確認により異なる部位としてＧＮＲの存在を示す。この新しく発 見された部位はＧＲＣの池の部位に比べそのリガンドに高い親和性を有する。

ＧＮＲの不均質群が、これら２つの位置でＧＮＲアゴニストの活性の変化に基づ （皮膚及びを髄に認められた。ノー等、「ザＧＡＢＡルセブター・コンプレック ス・イン・ラット・フロンタル・コーテンシス・アンド・スピナル・コード・／ ヨウ・ディファレン／アル・レスポンダ・ツー・ステロイド・モジュレーション 」モレキュラー・ファーマコロジイ、印刷中。この不均質はＧＮＨの異なる蛋白 サブユニットサブタイプ組成物において反映され、ＣＮＳ及び体の異なる効果て 、異なる機能と結合しうる。

さらに、どのような分子が新しく同定されたステロイド部位に結合するかを、特 にアロステリック調節検定及び競合結合検定を用い測定する方法を示す。本発明 により同定された化合物の特異性をインビトロ及びインビボの両データを用い記 載する。これらの化合物は本明細書に記載されるステロイドレセプター及びその サブタイプとの相互反応によりインビボ投与すると抗不安、抗痙彎、鎮静／低張 、ＰＭＳ及びＰＮＤ緩和、並びに精神疾患緩相効果を有する。

図面の説明 本発明は、添付の図面を引用することにより当業者によりよく理解され、その利 点が正しく評価されつる。図において、図１は、３α−０Ｈ−ＤＨＰの量の対数 に対してプロットしたＧＡＢＡの存在下、［’Ｈ］　ＦＬＵ結合の最大増加のパ ーセントのグラフである。

図２は、ミオクロヌス対、異なる濃度の本発明で有用なステロイド化合物の開始 時間の棒グラフである。３α−０Ｈ−ＡＮＤは３α−ヒドロキシ−アントロスタ ンを示す、ＰＲＥＧ−３ｏｌはプレグネノロン硫酸を示し、ＰＲＥＧはプレグネ ノロンを示す。

図３は、３α−０Ｈ−ＤＨＰの種々のプロドラッグ及び合成誘導体の抗痙翠活性 の時間経過のプロットである。

図４は、神経活性ステロイドプロドラッグ及び直接作用分子の経口抗痙傘活性の プロットである。

図５は、３α−０Ｈ−ＤＨＰの種々の投与量での投与、１０分以内に起きる移行 の数のグラ、フである。

図６は、３ａ　２］−７ヒドロキジー５α−プレグナン−２０−オン（５α−Ｔ 　ＨＤ　ＯＣ）の種々の投与量での投与、１０分以内に起きる移行の数のグラフ である。

図７は、ジアゼパムの種々の投与量での投与、１０分以内に起きる移行の数のグ ラフである。

図８は、キャリアー（β−／クロデキスト１ル）、３β−ヒドロキシ−５α−プ レグナン−２０−オン（３β−０Ｈ−ＤＨＰ）及び３α−０Ｈ−ＤＨＰの投与、 １０分以内の移行の数を比較するグラフである。

図９は、３α−０Ｈ−ＤＨＰ及びジアゼパムにより起きた移行の数の増加及びそ れらの増加に関し実験薬ｒ！Ａｃ　Ｇ　Ｓ−８２１６の影響を示すグラフのセ・ ソトである。

図１０は、正のコントロール、クロルノアゼポキノドにより生じた増加１＝比べ ３α−０Ｈ−ＤＨＰにより生じた苦痛を受けた反応性の／＜−セント増加を示す 。

図１１は、ラット子宮でプロゲステロンレセプターに結合して（入る［’Ｈ］　 −Ｒ５０２０へのプロゲステロン代謝物及びプロゲステロン（Ｒ５０２０）の影 響を示すプロットである。

図１２は、３α−０Ｈ−ＤＨＰへのβ１及び乃サブユニットの結合での種々のα サブユニットを伴う発現されたヒトＧＲＣの特異反応を示す。

図１３は、小脳及びを髄からのＰ２ホモンネート中、３α−０Ｈ−ＤＨＰに対す る反応での［３Ｈ］−フルニトラゼパム（［”Ｈ］−ＦＬＵ）結合を示す。そし て、 図１４は、αβサブユニットから構成されるレセプターでの３α−０Ｈ−ＤＨＰ に対する反応を示す。

発明の詳細な説明 本発明は、ＧＲＣの全ての既知部位、例えばバルビッール酸塩及びＢＺ部位と異 なるＧＲＣの仮説されたステロイド部位を調査するために生物工学技術を利用す る。本発明では、ヒトＧＲＣα１、α２又はα３並びにβ１及びγ２サブユニッ トを暗号化しているｃＤＮＡを真核細胞培養物、例えば哺乳動物細胞の培養物に 発現した。付加的研究を、α４、α２又はα、及びβ、を含んでいる複合体につ いて行った。以下のトランスフェクノジン及び発現、結合検定をステロイドを存 在又は存在させることなく行い、ステロイドが発現したレセプター複合体のベン ゾジアゼピン及びＧＡＢＡ部位への結合をアロステリックに調節できるかどうか を測定し、又、立体特異的方法でＧＮＲを直接標識する［’Ｈ］　３α−０Ｈ− ＤＨＰの能力を測定した。［”Ｈ］−ＦＬＵは、ＧＲＣのＢＺ部位に結合し、Ｂ Ｚ部位をモニターするのに用いることができ、一方［３Ｈ］−ムスキモール結合 はＧＲＣのＧ、Ａ　Ｂ　ＡＡ部位を標識する。

レセプター部位、例えばＧＮＲが本発明により明らかにされると、これらのレセ プターは、患者への投与により種々の生理的効果を有する医薬をスクリーニング するのに用いることができる。例えば、本発明のステロイド部位は、抗不安、抗 痙電、催眠、誘眠、抗抑制、抗−ＰＮＤ、抗−ＰＭＳ及び他の効果を有するアゴ ニスト化合物をスクリーニングするのに用いることができる。

哺乳動物細胞は、選択されたＤＮＡをコードしているベクターを取り上げ、機能 的方法で蛋白を発現する能力についてクローニングする段階で選択した。この場 合、レセプターサブユニットをコードしている遺伝子の発現は、遺伝子が正常に 発現される細胞、即ちニューロンで、それらの自然なコンフィギユレーションを ミＥ　ｙりする方法で細胞表面にまとめなければならない。そのような細胞タイ プの一つの非限定例は、以下の実施例で用いられるヒト胎児腎臓細胞である。

遺伝子を培養細胞に移入するための数多くの方法が利用できる。例えば、遺伝子 はベクター、例えばプラスミド、コスミッド又はレトロウィルスに挿入すること ができ、又、既知方法により細胞に移入することができる。リン酸カルシウム沈 澱、細胞−細胞融合、エレクトロポレーンタン、リポソーム、リポフエクショ／ 及び種々の他の方法がこの分野で知られており、実施することができる。

以下の実施例は、本明細書に記載される本発明を実施するための一方法を提供す る。

ＧＮＲの発現 ＧＲＣの種々のサブユニットをクローンしくプリチェット等、上湯）　、ｃＤＮ Ａを以下の実験に用いた。

実施例Ｉ ＧＡＢＡＡレセプター複合体の発現 ヒト胎児腎臓２９３細胞をトランスフェクション前日、１０−ｃｍ皿にシードし た。細胞は、既に記載された（ブリチェソト等、上湯）、修飾高効率ＣａＰＯ４ 沈澱法を用い、皿当り全２０−約３０μｇのＤＮＡを移入した。トランスフェク ションに用いたＤＮＡは、発現ベクターで個々に構築されたヒトＧＡＢＡＡα３ 、Ｃ２又はＣ３、β１及びγ２サブユニットをプログラムしているクローン化さ れた等量のｃＤＮＡの混合物であった。トランスフェクションの４８時間後、細 胞を集めリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７，２で２回洗浄し、凍結するか又は 、［”Ｈ］フルニトラゼパム（［３Ｈ］　ＦＬＵ）結合検定に直ちに用いた。

ＢＺ部位 フルニトラゼパムはＧＲＣのＢＺ部位に結合するＢＺである。従って、［３Ｈ］ −ＦＬＵ結合のモニタリングはＢＺ部位のモニタリングを行わせる。以下の実験 によりＧＮＲでのステロイド結合のＢＺ部位でのアロステリック調節効果を研究 した。

実施例２ ［”Ｈ］　ＦＬＵ結合検定 実施例１の移入された細胞を１０■Ｍリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７，２中で均 一にし、遠心により１回洗浄した。細胞膜ベレット（１００，０００ｘｇ）を１ ０■Ｍリン酸カリウム、ｐＨ７，２及び１００冒Ｍ塩化カリウムの混合物中で均 一にした。

細胞膜のアリコート（１００μｌ）を、２ＨＭの［３ＨコＦＬＵ　（７５−９０ Ｃｉ／ａｎａｌ、シュポン、二ニー・イングランド・ヌクレア）と、ＧＡＢＡ　 （シグマ・ケミカル・カンバニイ、セントルイス、ＭＯ）の存在で、ステロイド （ステラロイズ、ウィルトン、ＮＨ）を存在させ又はさせることなく、インキュ ベートした。

全ての検定は、５０ｍＭＮａ／リン酸緩衝液及び２００ｍＭ　ＮａＣ１を含む１ ｍｌの最終容量とした。非特異結合は、１μＭクロナゼパム（シグマ・ケミカル ・カンパニイ）の存在での結合として定義した。検定は、２５℃で９０分インキ ュベーノヨタン、ンユライチャー及びンユエルＮｏ、　３２グラスフアイバーフ イルターを通す高速濾過により終わらせた。フィルターを５ｍｌの水冷ＰＢＳで ２回洗浄した。

フィルター結合放射活性を、液体ンンチレーシタンスペクトル光度測定法により 測定した。

ＧＲＣの発現したＢＺレセプターへの［’Ｈ］　ＦＬＵ結合をアロステリックに 調節するステロイドの能力を用い、ＢＺ部位に機能的に結合されている発現され たＧＲＣの特異的ステロイド認識部位、ＧＮＲの存在を測定した。［”Ｈ］ＦＬ Ｕ結合は、γ２サブユニットがトランスフェクションに含まれる場合にのみ検出 されるので（プリチェット等、上湯）、ＢＺ部位は、γ２サブユニットが含まれ る場合にのみ存在し、α、（又はＣ２又はＣ３）、β及びγ、サブユニットは、 本研究で実施した全ての実験で一時的に共発現した。

これまでの発見と一致して、ＧＡＢＡによる［３Ｈ］　ＦＬＵ結合の増加は、α ３サブユニツトが移入された場合により著しい。へりチェット等、タイプ１アン ドタイプｎＧＡＢＡＡ−ベンゾジアゼピン・レセプターズ・プロシュースト・イ ン・トランスフエフテッド・セルズ、サイエンス、２４５．１３８９　（１９８ ９）。ＧＡＢＡは１ＨＭで［”Ｈ］　ＦＬＵ結合を増加し、３α−０Ｈ−ＤＨＰ はこの増加を促進した。以下の表３Ａ参照。興味あることに、μＭ濃度で３α− ０Ｈ−ＤＨＰだけでも、ＧＡＢＡの存在で観察されたものより低度ではあるが、 ［３Ｈ］　ＦＬＵ結合を増加した。表３Ａ参照。ＧＡＢＡの不存在で３α−０Ｈ −ＤＨＰによる塩化物コンダクタンス直接活性化についても、電気生理学的研究 で観察した。ハリソノ等、上湯。［３Ｈ］　ＦＬＵ結合の促進作用の定性的な違 いは、Ｃ２又はα３サブユニツトがα１サブユニツトと置換した場合には観察さ れなかった（表３Ａ）。

木観察は、ステロイド結合部位も種々のＢＺレセプターサブタイプと結合するこ とを示唆する。

図１（Ｆｉｇ、１）は、１ＨＭのＧＡＢＡ及び種々の濃度の３α−０Ｈ−ＤＨＰ の存在で３α−０Ｈ−ＤＨＰによる［”Ｈ］　ＦＬＵ結合の促進作用を示す。グ ラフ上の各点は、６つの別個の実験の平均を示す。棒はＳＥＭを示す。ステロイ ドの不存在での［３Ｈ］　ＦＬＵ結合をコントロールと定義した。最大促進のパ ーセントはこれらの実験で、上記コントロールの５７％と１９５％の間で変わる １μＮ１の３α−○Ｈ−ＤＨＰにより生じた促進のパーセントと定めた。

［’Ｈ］　ＦＬＵ結合のＧＡＢＡ刺激を促進する幾つかのステロイドの能力を表 ３Ｂに示す。ラット脳Ｐ２ホモンネートで観察されたこと（ジー等、１９８８、 上湯）と一致して、３α−ヒドロキシル化ステロイド、例えばテトラヒドロデオ キシコルチコステロン（ＴＨＤＯＣ）及び３α−ヒドロキシ、５−α−プレグナ ン−２０−オン（３α、５β−０Ｈ−ＤＨＰ）は［３）（コＦＬＵ結合のＧＡＢ Ａ増加を促進し得た。これに対し、３β−ヒドロキシ−５α−プレグナン−２０ −オン（３β−０Ｈ−５α−ＤＨＰ）及びプロゲステロンは、比較的低い能力を 有する。従って、発現したステロイド部位についての立体選択性及び構造活性要 求は脳で観察さねたものと類似する。

３α−０Ｈ−ＤＨＰによる［３Ｈ］　ＦＬＵ結合の投与量依存促進作用は、各実 験で１ＨＭのＧＡＢＡの存在下に実施した。３α−０Ｈ−ＤＨＰについてのＥＣ ５ｏ（半一最大促進が観察される濃度）はサブユニット組成に依存して、５３か ら３４０ｎＭまで拡がった。これらの値は、同様の実験条件で（即ち、プラス１ μＭＧＡＢＡ）（ジー等、１９８８、上湯、１９８７年８月２５日に出願し、既 に放棄したＵ、Ｓ特許出願第０８９．３６２号）ラット脳ホモジネートに観察さ れたものと非常に類似する。

このように、ＢＺ及びＧＡＢＡレセプターに機能的に結合する発現したＧＲＣの 部分である特異的ステロイド認識部位、ＧＮＲの存在を示した。

ＧＡＢＡ部位 ムスキモールは特異的ＧＡＢＡＡアゴニストで、それはＧＲＣのＧＡＢＡＡ部位 に結合し、結果としてＣＩ−チャンネルの開始となる。ラット脳ホモジネートで 、ステロイドが、ｒ’Ｈ］　ＦＬＵ結合の促進について観察されたと同様の特異 性をもって［３Ｈ］−ムスキモール結合を調節する（即ち促進する）ことができ ることを示した。従って、我々は、ｃＤＮＡから発現したレセプターでのムスキ モールの結合を研究した。

ＧＡＢＡＡレセプターサブユニットｃＤＮＡの発現を含む実験は、α及びβサブ ［３Ｈ］−ムスキモール結合は、１０μＭ（＋）ビククリンを用いた以外は、［ ３ＨコＦＬＵ結合についてのものと類似の条件下に実施し、非特異結合を明らか にした。我々はα及びβサブユニットから構成された複合体のステロイド部位の 可能な存在について試験した。我々の結果は、３α−０Ｈ−ＤＨＰは［３Ｈ］ム スキモ一ル結合を調節（即ち促進）する能力があり、これに対し、その３β−異 性体は活性がないことを示す。さらに５α−プレグナン−３α、２０α−ジオー ルは、脳ホモジネート調製品を用いるインビボ及びインビトロ検定で示したと同 様に効力を限定しこように見える。データは、１）ステロイド認識部位はα、β サブユニットに存在し、２）５α−プレグナン−３α、２０α−ジオールはこの ステロイド部位で部分アゴニストのようにふるまうことを示唆する。

［３Ｈコ］ムスキモ一ル結合 ３ａ−ＯＨ−ＤＨＰ　３８９　８０１ ５α−プレグナン−３７２，２０α−ノオール　１２１　２９５３β−０Ｈ−Ｄ ＨＰ　０　０ ＧＮＰの直接標識化 ３ａ−ＯＨ−ＤＨＰはＧＮＲで直接アゴニストである。　［３）（コ３ａ−ＯＨ −ＤＨＰを以下の実験に用い、ＧＮＨに直接結合させて標識した。

実施例３ ［！Ｈコ３α−０Ｈ−ＤＨＰ結合検定 実施例１の移入された細胞を用い、実施例２で［３Ｈ］　ＦＬＵ結合について記 載したものと同様の方法で特異的［３Ｈ］　３α−０Ｈ−ＤＨＰ結合の存在を測 定した（：　［’Ｈ］　３α−０Ｈ−ＤＨＰ　（２ＨＭ）を用い、ステロイド部 位を標識した。

非特異的結合は、薬理的に活性な立体異性体、３α−０Ｈ−ＤＨＰ、３ＨＭの存 在での結合と定めた。

デターンエント可溶化ステロイド部位への結合を、ノー等、モジュレー／タン・ オン・す・クロライド・アイオノフォア・パイ・ペンジノアゼビン・レセプター ・リガノズ　イノフリューエンス・オンＧＡＢＡアンド・リガンド・エフィヵン イ、モレキュラー・ファーマコロノイ、３０．２１８−２５５　（１９８６）に 記載された条件下、ラント脳皮質からのＰ２フラクションを可溶化することによ り測定した。

硫酸アンモニウム（２０％）を可溶性フラク／タンに加え、得られる沈澱を１０ ０゜０００Ｘｇで遠心によりペレット化した。ペレットを５ａｍＭリン酸Ｎａ／ に緩衝液（ｐＨ７，４）及び２００ｍＭ　ＮａＣ１中、遠心により３回洗浄し、 最終ペレットを１１１ｉ液に再び懸濁して１０％（元の湿った重量／容量）ホモ ジネートとした。ホモジネートの１００μｍアリコートを、１■１の総反応容量 で５ＨＭ　［３Ｈ］　３α−０Ｈ−ＤＨＰ及び緩衝液と、２５℃で６０分間イン キュベートした。

非特異的及び立体特異的結合を明らかにするための条件は、発現したレセプター について記載されたものと同一であった。インキュベーンヨを０３％ポリエチレ ンイミン及び１％トリトン−１００に３時間浸漬したグラスファイバーフィルタ ー（ワットマンＧＦ／Ｃ）を通す高速濾過により停止した。フィルターの調製及 びフィルター結合放射活性の定量は実施例２に記載のように実施した。

結合した［３）１コ３ａ−ＯＨ−ＤＨＰ　（カラ２８フ分）条件　ラット皮質膜 　発現したレセプター＋３ｕＭ　３ａ−ＯＨ−ＤＨＰ　１５６９　８９６↓３Ｈ Ｍ　３β−０Ｈ−ＤＨＰ　２５５７　１２６２結果は、［３Ｈ］　３ａ−ＯＨ− Ｄ！（Ｐの結合は、３ａ−ＯＨ−ＤＨＰｉ：、にり特異的に置換できるが薬理的 に不活性な立体異性体３β−０Ｈ−ＤＨＰではできないことを示す。ＧＲＣのス テロイド認識部位の存在は直接結合により確認した。

発現したＧＡＢＡえγレセプター複合体への［３Ｈ］　ＦＬＵ結合のＧＡＢＡ促 進についての３α−０Ｈ−ＤＨＰ及び他のステロイドの影響 調節剤サブユニット組成　１ （１ＨＭ） Ａ　コントロール結合はＧＡＢＡの不存在での２ＨＭ　［３Ｈ］　ＦＬＵ結合と 定義する。データは２つの別個のトラ〉スフエクノタン実験の平均である。％促 進作用は、％上記コントロール結合と定義する。

Ｂ　コントロール結合はＧＡＢＡ　（１ＨＭ）の存在下、２ＨＭ　［３Ｈ］　Ｆ ＬＵ結合と定義する。データは、Ｃ１、β１及びγ２サブユニットをプログラム しているｃＤＮＡを用いる別個のトランスフェクノタン実験の平均を示す。

発現したＧＮＰの構造的要求について本明細嘗て与えた知識に基づいて、ＧＮＲ にアゴニストとして作用するであろう化合物のクラスをここに明らかにする。

ＧＮＲて活性であるステロイドは、１９８９年７月１３日に出願した特許出願番 号第３７９、０４９号及び１９９０年５月１０日に出願した出願番号筒５２１． ７２４号及び１９９１年８月１３日に出願した出願番号未詳のものに開示したス テロイドを含む。他の活性ステロイドはグラクツに対するＵＳ特許番号第３．８ ２２．２９７号、第３．８２２．２９８号、第３、８６９．４５１号、第３．８ ７５．１４８号、第３．８８０．８９６号、第３．８８２．１５１号、第３．８ ８３．５６９号、第３．８９１．６３１号、第３．９３３．７９９号、第３．９ ４３．１２４号、第３．９５２．０３１号、第３．９５３．４２９号、第３．９ ５９．２６０号　第３．９６９．３４５号、第３．９８０．１１１号、第３．９ ８９．６８６号、第３．９９８゜８２９号、第４．１９２．８７５号及び第４． １９７．２９６号に開示したステロイドを含み、これらの特許を明確に引用して 明細書記載の一部とする。

他の二つの特許も、本発明の新規なレセプターに結合できるプレグナン−型ステ ロイドを開示する。これらの特許はＵ、Ｓ第４．０２９．７７７号（フェーリン グ）及びＵ、Ｓ　第４．４２４．１５９号（チハーカイギー）でこれらの特許を 明確に引用して明細書の一部とする。

抗痙翠活性 実験を実施し、マウスでＴＢＰＳ誘発痙翠を調節する化合物の能力を測定するこ とによりＧＮＲ−活性ステロイド化合物の相互反応の生理的関連を測定した。

実施例４ ＴＢＰＳ誘発痙彎の調節 スイス−ウェブスターマウスに、ＴＢＰＳの注射１０分前に、図２に示すように 種々の投与量の試験化合物を注射した。ＴＢＰＳにより誘発されたミオクロヌス （前設間代性活性の存在）の開始の時間を４５分間、各マウスを観察することに より測定した。コントロールマウス対ステロイド処置マウスでの開始時間の間の 有！差を、スチューデントのｔ試験により測定した。これらのステロイドのイン ビボでの相対的ランク順位能力及び有効性は、インビトロで測定したこれらの値 とよく相関した。

３α−０Ｈ−ＤＨＰの抗痙輩及び毒物学的プロフィルをさらに測定した。抗痙彎 スクリーンでは、マウスに以下の化学的痙翠剤の注射１０分前に、種々の投与量 の３α−０Ｈ−ＤＨＰ又はビークル（ツメチルスルホキシド）を注射した：メト ラゾール（８５ｍｇ／ｋｇ）、（＋）ビククリン（２，７＋＋ｇ／ｋｇ）　、ピ クロトキンン（３，１５ｍｇ／ｋｇ）　、ストリキニン（１，２５ｍｇ／ｋｇ） 又はビークル（０，９％食塩水）ｅ痙章剤又はビークルの注射後、直ちにマウス を３０ないし４５分間観察した。強直性及び／又は間代性置傘を伴う動物の数を 記録した。最大電気ショック試験において、６０Ｈｚで５ａｍＡの電流を２００ １ＩＳｅＣの間、角膜電極を通して送り、強直性発作を誘発した。強直性成分を 停止させる３α−０Ｈ−ＤＨＰの能力を終点と定義した。鎮静潜在力を３α−０ Ｈ−ＤＨＰの注射後１０分で、ロトロソド試験により測定し、回転する（５ｒｐ ｓ）棒に３回試験でそれぞれ２１分間とどまるマウスの数を測定した。ＥＤ、。

（半一最大効果が起きる投与量）を各スクリーンについて測定した。急性ＬＤｓ 。（試験した動物の１／２に対し致死である投与量）を、３α−０Ｈ−ＤＨＰの 投与後４８時間の生存を数えることにより測定した。

結果は、以下の表４に示され、３α−０Ｈ−ＤＨＰが他の臨床的に有用な抗痙筆 削に比べて、ＢＺクロナゼパムのそれと同様のプロフィルを有して非常に有効で あることを示す。抗痙撃剤投与量での鎮静障害は、ロトロツド試験及び（＋）ビ ククリンー誘発発作についてのＥＤｓｏ値を比較することにより示されるように 低い。３ａ−ＯＨ−ＤＨＰについての治療係数（ＬＤｓｏ対ＥＤ６．の比）は、 ＥＤ５０アゴニスト（＋）ビククリンー誘発発作を基にしたとき、〉１２２であ り、従って、非常に低い毒性を示す。これらの観察は、これらの化合物の、ＧＲ Ｃインビトロとのそれらの高親和相互作用と対応する脳興奮性の調節剤としての 治療有用性を示す。

表４ マウスにおける３α−○Ｈ−ＤＨＰの抗痙翠及び急性毒物学的プロフィール並び に選択された臨床的に有用な抗痙筆削のそれらＥＤき・（ｍｇ／ｋｇ） 化合物　ＲＲＭＥＳ　ＩＩＴＺ　ＢＩＣＰＩＣＲＯＳＴＲＬＤｓ＊３σ−０１１ −ＤＨＰ”’　３０　２８６　４．９　１２，３　１０．２　＞３００　−５ａ −Ｔ［１ＤＯＣ”’　２２，９　２６．７　８，１　１７．８　５．６　＞３０ ０　−３ａ−０［１−ＤｔＴＰ””　４０−１００　＞３００　１８．８　４， １　３１．７　＞３００　＞５００ウロナセバム’　０．１８４　９３　０．０ ０９　０．００８６　０．０４３　ＮＰ　＞６０００フエノバルヒタ〜ル＊　６ ９　２２　１３　３８　２８　９５　２６５零　本本 フェニトイン６５１ＯＮＰＮＰＮＰ２３０γロガバイＦ＊＊＊　−７５３０３０ １０５７５３０００本 パルプロエイト　４２６　２７２　１４９　３６０　３８７　２９３　１１０５ 略語はＲＲ（ロトロソド）、ＭＥＳ（最大電気ショック）　、ＭＴＺ　（メトロ ゾール）、ＢＩＣ（ビククリン）　、ＰＩＣＲＯ（ピクロトキンン）　、ＳＴＲ （ストリキニン）、ＮＰ（防御なし）である。

（ａ）水中２０％ヒドロキシプロピル−β−７クロデキストリンに溶解した。

ステロイド及び痙彎剤の投与経路はそれぞれ腹腔内及び筋肉内であった。

（ｂ）ＤＭＳＯに溶解した。データはベレリ等、１９８９年から取った。ＥＤｓ 。値は、９５％防御限度を含む。

８抗痙電データは、アンチェビレブチイック・ドラッグス、Ｄ、Ｍウッドバリ、 Ｊ、にベンリイ及びＣ，Ｅ、ビベンガー編集、１１１頁（レイブン・プレス、ニ ューヨーク）　、１９８２年のスウィニャード・アンド・ウッドヘッド、ジェネ ラル・プリンンプルズ　エクスペリメンタル・デテクンタン、クアンティフィケ インタン・アンド・エバルエインタン・オン・アンティコンパルサントからであ る。

”　５５−１００ｍｇ／ｋｇで５０％最大防御８＊＊プロガバイド研究での化学 的痙彎剤は静脈内投与した。全データは、ウォームス等、ガンマ−アミノブチリ ック・アシッド（ＧＡＢＡ）レセプター・スティミュレー／タン■、ニューロフ ァーマコロジカル・プロフィールス・オン・プロガバイド（Ｓ　Ｌ　７６００２ ）アンド・５Ｌ７５１０２、ウィズ・エンファンズ・ゼア・アンティコ／パルサ ント・スペクトラ、ジャーナル・オン・ファーマコロジイ・アンド・エクスペリ メンタル・テラビューティクス、２２０．６６０−６７１．１９８２からである 。

代謝作用によりアゴニストとなりＧＮＲに結合するプロドラッグの抗痙翠活性の 研究を、基本化合物３α−０Ｈ−ＤＨＰの修飾による時間経過に渡りさらに行っ メトラゾール誘発発作 大人雄ＣＦＩマウス（２０−３０ｇ）をこれらの研究に用いた。抗ｉｌｌ活性は 、スウィニャード及びウソトヘノド（１９８２）止揚により既に記載されたよう に評価した。メトラゾール誘発発作に対するパーセント防御は、化合物の投与後 の時間に対してプロットした。マウスに、化合物（３α−０ＨＰ、３０ｍｇ／ｋ ｇ、３α−了セチルー５α−プレグナン−２０−オン（３α−ＡＣ−ＤＨＰ）　 、３α−プロピル−５α−プレグナン−２０−オン（３ａ−ＰＲ−ＤＨＰ）　、 及び３α−ブチリル−５α−プレグナン−２０−オン（３α−ＢＵ−ＤＨＰ）　 、全て６０１ｇ／ｋｇ）の投与後、種々の時間にメトラゾール（８５ｆｆ１ｇ／ ｋｇ皮下）を注射した。１０−１２匹のマウスを試験薬物の投与量当りに用いた 。

マウスに、ＤＭＳＯ又は２−ヒドロキシプロピル−β−ンクロデキストリンに溶 解した化合物を、又はビークルのみを（ＤＭＳＯについて、５μＬ／ｇ体重）、 メトラゾールのＣＤｅｙ（動物の９７％がスウィニャード及びウッドヘッド、１ ９８２から発作を起こす投与量）投与量（８５ＩＩＩｇ／ｋｇ）又はビークル（ ０，９％食塩水、５μＬ／ｇ体重）の投与（皮下）前、種々の時間に注射した（ 膠腔内）。匣翠剤又はヒークルの注射後、直ちにマウスを３０−４０分の間、観 察した。強直性及び／又は間代性ａ傘を伴う動物の数を配録した。

ステロイドの強直性−間代性成分を停止する能力を終点と定義した。鎮静剤可能 性をロトロノド試験により測定し、そこで回転する（６　ｒｐｍ）棒に２１分と どまっているマウスの数を３回の実施の各々について測定した。急性ＬＤ、。を 、抗痙電化合物の投与（腹腔内）後４８時間の生存を数えることにより測定した 。全ての５０％有効量をリンチフィールド及びウィルコキソンの方法（１９４９ ）により測定した。

図３は、これらの実験の結果を示す。基本化合物、３α−０Ｈ−ＤＨＰの３ａ位 でのアセテート、プロピオネート又はブチレート基による修飾により、化合物に より与えられた防御の時間が増加した。従って、ＧＮＲに結合する化合物は、防 御の程変を変えることにより、一定期間にわたる抗痙傘活性を与えるよう修飾で きる。

抗痙電活性に対するＧＮＲアゴニストの経口投与の影響についても研究した。

図４は、ＧＮＲアゴニストプロドラック及び直接作用ＧＮＲアゴニストの経口抗 痙彎作用を示す。

実施例６ 経口投与 全ての研究は、昼間の間（０６００−１７００）　、非断食ＣＦＩマウス（チャ ールズ・リバー）を用いて行った。分子を０９％ＮａＣ１中、０３５％ヒドロキ シプロピルセルロース及び４％ツウィーン８０を含むビークル（微細化溶液）中 で経口的に投与した。分子は投与前に４８時間にガラスピーズを入れたガラスミ ルジャーに入れ、微細化した。この操作によってビデオ顕微鏡により測定して、 約７−３５μメーターの大きさの薬物粒子となる。抗ｉｔステロイド、３α−イ ソブチリルオキシー５α−プレグナン−２−オン（１００画ｇ／ｋｇ）　（・） 及び３α−ヒドロキシ−３β−メチル−５α−プレグナン−２０−オン（１０ｍ ｇ／ｋｇ）（０）を経口給飼管より与えた。化学的痙掌剤、メトラゾール（８５ ｍｇ／ｋｇ、皮下）を種々の時間に、続いて抗ａｔステロイドを投与した。

結果は、痙翠試薬の投与３０分以内にミオクロナスの徴候を示さなかった動物の パーセント（即ち防御されたパーセント）として示す（図４）。

図４から判るように、プロドラッグ又は直接作用抗痙翠神経活性ステロイドを経 口的に投与すると、有効な期間にわたって広範囲な抗痙翠活性が存在する。これ は、このような薬物を治療に用いた場合の重要な特徴である。

抗不安（ａｎｘｉｏｌｇｔｉｃ）効果 ＧＮＲは不安を処置するのに有効な医薬をスクリーンし、選択するのに有効であ る。以下の実験は、プロゲステロン代謝物及びＧＮＲアゴニスト３α−０Ｈ−Ｄ ＨＰが抗不安化合物の行動効果を測定するヒト不安の３つの動物モデルで有効な 抗不安剤であることを示す。加えて、これらは３α−０Ｈ−ＤＨＰの抗不安効果 がＢＺのものとは異なる機作により伝達されることを示す。

明／暗移行試験（クロウリイ及びグツドウィン、１９８０）は、纂歯類は通常は 新しい環境を探索する傾向があるが、開放したはっきりと明るくした舞台は翳歯 類にとってきらいで、探索行動を抑制することの観察に基づく（クリスマン及び マクスウェル、１９７０１フアイル、１９８０）。ジアゼパム及びクロナゼパム 並びにベンドパルビタールを含む種々の臨床的に確立された抗抑制剤が、明箱と 暗箱の間の移行の数を増加するが、一方、非抗抑制薬物は、この行動効果を示さ ないことが判っている（プラム／ユタイン及びクロウリイ、１９８３・クロウリ イ、１９８１　クロウリイ及びディビス、１９８２　クロウリイ及びグツドウィ ン、１９８０　クロウリイ等、１９８１）。

明／暗移行試験と同様に、開放領域試験により、新環境探索傾向ときらいな環ｉ １（はっきりと明るくした舞台）に依然■まる傾向との間の拮抗現象を測定する 。

ＢＺは開放領域舞台での通行を増加することを示した（ディピース及びンユタイ ンベルグ、１９８４　ヒユーゲス及びブレイブ、＋９７５・サンラン、１９７９ 　：ブルーウィラー等、１９９０　ブルーウィラー、１９９０）。開放領域試験 は新規化合物の潜在的抗不安性質の簡単な、罰を与えない評価を提供する。

最後に、３ａ−ＯＨ−ＤＨＰをフォーゲル葛藤パラダイムで抗不安性質について 試験した。ＢＺの葛藤パラダイムで処罰による行動の抑制を減する能力は、よく 確立されている（ゲラ−等、１９６２、フォーゲル等、１９７１）。フォーゲル 試験は、ＧＮＲ了ゴ＝ス）３α−０Ｈ−ＤＨＰ及び５ａ−ＴＨＤＯＣの抗不安効 果を試験するについて、不安の２つの「探索」モデルに対する古典的行動医薬支 持を与える。加えて、ＣＧ　Ｓ−８２１６、ＢＺ拮抗物質は明／暗移行試験でジ アゼパムの抗不安効果をブロックすることが判った（クロウリイ等、１９８４） 。さらにインビトロでステロイド部位の独特さを示すために、我々は明／暗移行 試験でＣＧ　Ｓ　−８２１６による３α−０Ｈ−ＤＨＰの抗不安効果をブロック することを試みた。

実施例７ 抗不安試験 重さ１５−２０ｇの雄Ｎ、１．Ｈスイスーウェブスターマウス（バーラン）を全 実験で用いた。マウスは、おがくずのねぐらを備えたポリエチレンかごに４／か ご収容した。群の部屋は、１２時間明／暗サイクル（０６００−１８００時間） により環境的に制御した（２２℃）。マウスは食餌及び水に自由に近づけた。実 験は０７００−１５００時間実施し、グループは昼間の影響の時間をうめあわせ た。

ａ）明／暗移行 使用した方法は、既にクララレイおよびグツドウィン（１９８０）により述べら れたものであった。装置は、小さな箱（１５Ｘ２２Ｘ１４ｃ■）に、穴（５ｘ６ ｃ■）を通して結合している大きな箱（２６Ｘ３３Ｘ２４ｃｍ）を含んだ。大き な箱は標１！１００ｗ白熱電球で明るく照らし、一方小さい箱は暗いままにした 。試験薬物での前処理に続いて、マウスを大きな箱の真ん中に入れ、大きな箱と 小さな箱の間の移行の回数を１０分間数えた。薬物前処理時間は下肥の通りであ る　ジアゼパム（３０分）、３α−０Ｈ−ＤＨＰ　（１，０分）、および５α− ＴＨＤＯＣ（１０分）。拮抗剤研究の間、ＣＧ５−８２１６を試験薬物の前３０ 分に投与した。

ｂ）開放領域活動 抗不安効果の２次測定と（７て、神経質なマウスを大きなはっきりど明るくした プレキノガラス箱（４２Ｘ４２Ｘ３０．５ｃ＋＋）の真ん中に入れ、移動した距 離の合計を１０分の試験期間の量測定した。抗不安薬は新しい環境での「探索」 または移動の量の増加を示した（トレイト、１９８５　；リスター、１９９０） 。ノギスカン・アクティビティ−・モニター（オミンテソク・エレクトロニクス 、コロンバス、ＯＨ）は、箱を取り囲む１６の光線を含む。活動モニターはノギ スカン・アナライザー（オミノテンク・エレクトロニクス）を経由してコンピュ ーターと連動し、データはインチグレーテンド・ラブ・アニマル・モニタリング ・／ステム（オミンテック・エレクトロニクス）を使用して分析する。マウスは 明／暗移行試験で述べたように薬物を投与した。

一般的な活動における薬物の効果の評価のために、マウスは最初に１５分間開放 領域装置に慣らした。翌日、マウスを試験薬物で前処理し１、活動室の真ん中に 入れた。移動した距離の合計を１０分間測定した。

Ｃ）フォーゲルパラダイム アンキ゛ノーモニター（オミンテノク・エレクトロニクス、コロンバス、ＯＨ） を用い、なめる行動の抑制を測定した。試験室は、床から２．５ｃｍで、箱の中 に２Ｃ１１延びた金属の飲用管のついた透明なプレキンガラス箱（２９ｃｍｘ　 ２９ｃ＋＋Ｘ　２３ｃｌりから構成された。刺激は軟料飲み口を通して与え、ア ンキソーモニターで制御した。なめる数を、アンキソーモニターで数え表示した 。補強剤は０１％）ニークロースであった。

葛藤試験法は、フォーゲルら（１９８０）が記載したものを使用した。この方法 は、最初にフォーゲルら（１９７１）が述べた基本のなめる行動抑制試験の修飾 法である。

水を剥奪してから２４時間後、マウスは試験装置を探索させ、１０分間または１ ００回なめるまで罰無しで飲ませた。翌日（水の剥奪開始から４８時間後）、マ ウスを３α−０Ｈ−ＤＨＰ　（２０おｇ／ｋｇ）　、クロルジアゼポキ／ド（Ｃ ＤＰ：ＩＱ　ｍｇ／”ｋｇ）またはビークルで前処理し、葛藤装置内に続いて入 れた。マウスは２０回なめるまで罰無しで飲用管を利用させ、その後、１０回な める毎に０．１ｍＡ刺激で罰した。試験期間は５分てあった。

スモロイド３α−〇Ｈ−ＤＨＰ、３β−０Ｈ−ＤＨＰおよび５α−ＴＨＤＯＣを 、本明細書に引用して包含する出願番号未知で、１９９１年８月１３日に出願の 米国特許出願に記載の通り合成した。２−ヒドロキシプロピルβ−ンクロデキス トＩ）＞（β−／クロデキストリン）はアルドリノヒ（ミルウオーキー、Ｗｌ） から入手できる。／アゼパムおよびクロロンアゼホキノドは／グマ・コーホレイ ンヨシ（セント・ルイス、Ｎ１０）から入手できる。ＣＧ５−８２１６はチノく 一ガイギー（スミント、ＮＪ）から得た。全ての薬物は２０％のβ−７クロデキ ストリン水溶液に溶解し、−晩超音波処理した。全ての薬物は１００μＬ／２０ ｇの量で腹腔内投与した。ＣＧ５−８２１６は１００ｕＬ／２０ｇの量で皮下投 与した。

３α−０Ｈ−ＤＨＰ、５α−ＴＨＤＯＣおよびジアゼパムの明／暗移行試験で得 られる投与量依存曲線は数日間にわたって追跡した。ビークル対照データは１方 向相違分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して試験日を通して分析した。ビークルデータ は日を通して有意な違いがないため、対照データはそれぞれの薬物に対して失敗 した。用量依存曲線を、１方向ＡＮＯ〜’Ａを用い、次に個々の投与量と対照の 間を比較するダネソトのｔ−検定によりて分析した。開放領域および習慣的な移 動データは１．ＡＮ○〜“Ａ、続いてダネットのｔ−検定を用いて分析した。３ α−０Ｈ−ＤＨＰおよびＣＤＰはなめる行動抑制試験においては別の日に行った 。対詔群は、有意に異なり、従って、データはステニープントのｔ−検定（両側 ）を用いて分析し、比較のために、対応する対照に対するパーセントでグラフ化 する。

全てのデータは平均±Ｓ、Ｅ、Ｍで示す。

ＧＮＲアゴニスト３α−０Ｈ−ＤＨＰは、明／暗移行パラダイムでの移行の数の 増加から判るように、抗不安効果を生じた（図５）。３α−０Ｈ−ＤＨＰは有意 な投与量依存反応ヲ生じｆ：　（Ｆ（４，６３）＝２１．５　：　ｐ＝、ｏｏｏ ｌ）　。移行の数は、１０．２０および４０ＩＩｇ／ｋｇの３α−０Ｈ−ＤＨＰ により、有意に増加した（ｐ＜、０１）。３ａ−ＯＨ−ＤＨＰは２０ｍｇ／ｋｇ の投与量テ、１０分間で平均７０２±４３移行である最大効果に到達した。試験 した最大投与量、４０ｍｇ、、−’　ｋ　ｇから移行の数は減少に向かう傾向が 始まった。いくつかの化合物が逆Ｕ−形用量依存曲線を明／暗移行パラダイムで 生ずることが判った（クララレイら、１９８６）。

デオキシコルチコステロイド代謝物およびＧＮＲアゴニスト５α−ＴＨＤＯＣは 有！な（Ｆ（４，５４）＝１０　：　ｐ＝、０００１）用量依存効果を明／暗移 行試験で生じた（図６）。５α−Ｔ　ＨＤ　ＯＣは、２０■ｇ／ｋｇの用量でビ ークルと有意に異なった（ｐ＜、０１．）。５α−ＴＨＤＯＣは１０■ｇ／ｋｇ の濃度で、ビークルに比べ大きな数の移行を生じたが（４９４±２０対３５２± ２．０）、この差は有！には達しなかった（ｐ＜、０６）。試験した最大濃度で は、５α−ＴＨＤＯＣ（４０ｆｆ１ｇ／ｋｇ）はビークル対照と比較して移行の 数を有意に減少させた（ｐ＜、０５）。

明／暗試験におけるジアゼパムの効果は図７に示す。ジアゼパムは有意な逆Ｕ− 形用量依存曲線を生じた（Ｆ（５，７２）＝３１．６；ｐ＝、ｏｏｏｌ）。ジア ゼパムは、１０．５．０．１０および２０＋ｇ／ｋｇの濃度で対照と有意に異な った（ｐく　０１）。ジアゼパムの最大反応は８６４±５４移行の１０ｍｇ／ｋ ｇであった。

２０ｆｆｉｇ／ｋｇでは有意であるが、ジアゼパムの効果は１０１ｇ／ｋｇでの 効果と比較して小さかった。これらの結果は、２つのＧＮＲアゴニスト、３α− ０Ｈ−ＤＨＰおよび５α−ＴＨＤＯＣで見られた逆Ｕ−形曲線と類似する。

図８に示すように、３α−〇Ｈ−ＤＨＰのジアステレオマー、３β−０Ｈ−ＤＨ Ｐ（２０＋ｇ／ｋｇ）は、明／暗移行パラダイムにおいて抗不安効果を生じなか った。

同様の実験で、３α−ＯＨ−ＤＨＰ（２０ｗｇ／ｋｇ）は明／暗移行の数を、担 体単独（β−７クロデキストリン）で生じたもの以上に有意に（ｐ＜、０１）増 加させた。

これらの結果はステロイド３α−０Ｈ−ＤＨＰの抗不安効果における立体特異性 、つまりＧＮＨの立体特異性を示す。

特異的Ｂｚ拮抗剤ＣＧ５−８２１６　（１０ｍｇ／ｋｇ）は３α−０Ｈ−ＤＨＰ の抗不安効果をブロックしなかった（図９Ａ）。３α−０Ｈ−ＤＨＰ　（１０ｖ ｇ／ｋｇ）は単独およびＣＧ　Ｓ−８２１６の存在下有意な（ｐ＜、０１）上昇 を生じた（図９Ａ）。

しかしながらＣＧ５−８２１６はジアゼパムの抗不安効果をブロックできた（図 ９Ｂ）。ジアゼパム（１，０ｍｇ／ｋｇ）は単独では対照と比較し移行において 有意な（ｐ＜、０１）上昇を生じた（図９Ｂ）。ＣＧ　Ｓ　−８２１６は同等固 有作用を示さずビークル対照と有意には異ならなかった（ｐ＞、４）。これらの 結果は、ステロイド３α−０Ｈ−ＤＨＰの抗不安効果が、Ｂｚ類のものとは別の 神経系機構を経由していることを示す。

新規な明るく照らした開放領域に置かれた場合、マウスは低いレベルの活動（即 ち探索、移動等）を示すが、一方、抗不安剤は新規な環境での活動を増加させる （リスター、１９９０’）。表５に示すように、開放領域活動において有意な薬 物効果があった（Ｆ（４，４４）＝１８．０５　：　ｐ＝、ｏｏｏｌ）。特に、 ＧＮＲアゴニスト３ａ−ＯＨ−ＤＨＰおよび５α−ＴＨＤＯＣは対照と比べて活 動を有意に（ｐく０１）増加させた。加えて、ジアゼパムはβ−ノンクロデキス トリンビークル対照比較して活動を有意に（１）（，０１）増加させた。明／暗 移行パラジウムと一致して、３β−０Ｈ−ＤＨＰは開放領域試験でいかなる効果 も示さなかった。

点鼻 開放試験におけるステロイドおよびジアゼパムの効果薬物　用量（巽ｇ／ｋｇ） 　総合距離（Ｃ曹）β−７クロデキストリン　２００４．６±１３４６３β−０ Ｈ−ＤＨＰ　２０　］、９７９．８±１７４．５３α−０Ｈ−ＤＨＰ　２０　５ ３４４．９±７５４．５１５α−ＴＨＤＯＣ２０７３２８，４±７６９３ジアゼ パム　１０　４８１７．７±５２８．４林マウスは開放領域装置の真ん中に入れ る前１０分または３０分（ジアゼパム）、前処理した。総合移動距離は１０分間 測定した（詳細は方法参照）。それぞれの群は９−１０匹のマウスから構成され た。

零本ｐく　０１　ダネットのｔ−検定によると、β−ノンクロデキストリンビー クル対照有！に異なる。

３α−０Ｈ−ＤＨＰはまた試験室に慣らされたマウスの移動距離の有意な（ｐく ０１）上昇を引き起コシタ。３ａ−ＯＨ−ＤＨＰ　（２０ｍｇ／ｋｇ）Ｔ処理し たマウスは、総合距離が対照２０６１．２±１５７．７ｃ■と比較して、５６９ ４．７±６０８．４ｃｍ移動した。ジアゼパム（１０ｍｇ／ｋｇ）はこれらの実 験条件下では移動距離（２２５８，０±８９７．７ｃｍ）に影響を及ぼさなかっ た。

３α−〇Ｈ−ＤＨＰ　（２０■ｇ／ｋｇ）の投与は、飲むことの罰誘発抑制を減 少しなかった（図１０）。３α−０Ｈ−ＤＨＰは５分の試験時間の間に受けた刺 激の数を、対語と比較して有意に２３５６％増加させた（１３９土２．１対５． ９±０．５４　：　ｔ＝−３，９８：　ｐ＝、ｏｌ）　、　：ｔＬ１ｍ比へ、Ｃ Ｄ　Ｐ　（１０ｖｇ／ｋｇ）　ハ罰反応を対照と比較して１９７４％増加させた （６１４±１１４対３１１±０．６８　、ｔ＝−２，４：　ｐ＝、０３）。

他の効果 ＧＲＣについてのＧＮＲのアゴニストはまたこのレセプター複合体の塩化物チャ ンネルの開閉より影響された他の条件を処置するのに有効であろう。ＧＲＣに結 合しているアゴニストＢｚ類およびパルピッレートは、催眠状態および睡眠を誘 発する。本発明により、Ｂｚｌ及びパルピッレートによるＧＡＢＡＡ結合の調節 とＧＮＲにおけるアゴニストによるＧＡＢＡＡ結合の調節の間の相関を示す。加 えて、全ての動物で、曳在ＧＮＨのアゴニストとして知られているいくつかの化 合物が催眠状態および睡眠を誘発することが示された。従って、本発明により、 ＧＮＲアゴニストが催眠状態および／または睡眠を同様に誘発するであろうこと が判る。

さらに、Ｂｚ類およびパルピッレートは、気分不快およびパニック症候群により 生じるような襲速な不安の攻撃の処置に普通に使用されている。それらの作用の 機構はＧ　Ａ　Ｂ　Ａ、受容体の調整を経由する。ロイド　Ｋ、Ｇおよびモルセ リ−Ｐ　Ｌ　７フイコフ７−マコロノー・オン・ＧＡＢＡアーギソク・ドラッグ ス、１８３−１９５頁、Ｈ，’ｌ−メルソアー曙、ラベン・プレス、ＮＹ、＋９ ８７）。従って、本明細書に示すデータは、ＧＮＲのアゴニストが抑欝のような 気分不快およびパニック症候群により生じるような急速な不安の攻撃の処置に有 用であることを示す。

レセプター特異性 新規ＧＮＨのアゴニストは、これらの化合物がプロゲステロンへの親和性を欠く ことによってホルモ〉棟側作用を欠くことも証明された（図１１）。図１１にプ ロＩトしたデータは、引用により本明細書に包含されるジーら（１９８８）　、 前掲、に記載された受容体結合検定に従って検定を行うことにより得られ、［３ Ｈ］Ｒ５０２０のラット子宮プロゲステロン受容体への結合に関するＧＮＲアゴ ニストおよびプロゲスチンＲ５０２０の影響を示した。図１１でプロットされた 全ての点は３回測定の平均を示す。以下の化合物は図１１に挙げられたものであ る　５ａ−プレグ半／−３α−オルー２０−オン（５β、３α−０Ｈ−ＤＨＰ） 、５α−プレグナノー３α、２１−フォル−２０−オン（５α−ＴＨＤＯＣ）お よび５β−プレグナ〉−３α、２０α−ノオール（５ＢＥＴＡ）　ｅ新規ステロ イド受容体のアゴニストのホルモン様活性を、潜在的エストロゲン様、プロゲス チン様、鉱質コルチコイドおよび糖質コルチコイド活性を試験することによって 更に研究した。これらの活性は、薬物の各々対応する受容体へのホルモンの結合 を阻害する能力をモニターすることにより分析した。結果は表６−９に示す。そ れらは３Ｈ−リガンドの種々のステロイドホルモンレセプターへの結合の、１０ −６および１０−５Ｍでの薬物のパーセント阻害で示す。対照値は薬物不存在下 での結合を示す。

実施例８ 鉱質コルチコイドレセプター 表６において、ラットは犠牲の３日前に投与した。鉱質コルチコイドを分離する ために、脳すイトゾルフラク／タンを以下のように調製した。雄スブラギュード ゥレイラノトからの脳を犠牲後直ちに取り出し、脳皮質を氷の上方で解剖した。

Ｐ２ホモンネートを既に記載されたように調製した（ジー等、「モジュレーショ ン・オン・ザ・クロライド・イオノフオア・パイ・ベンゾジアゼピン・レセプタ ー・リガンズ　インフルエノス・オン・ガンマ−アミノブチリック・アンラド・ アンド・リガンド・エフィカノイコ、モレキュラー・ファーマコロジイ、３ｏ１ ２１８　（１９８６）。簡単に述べると、皮質を０．３２Ｍン二−クロース中で 緩やかに均一化し、］０００Ｘｇで１０分間遠心した。上清を集めて９０００Ｘ 　ｇで２０分間遠心しｌ：。得られるＰ２ベレットを５αｍＭリン酸Ｎａ／に緩 衝液（ｐＨ７，４ン２００＊ＭＮａＣＩ中１０％（元の湿重量／容量）墾濁液に 懸濁し、ホモジネートを形成させた。

薬物を、タイプＴＩ（ｗ質コルチコイド）レセプターへの３Ｈ〜アルドステロン 結合をブロックする選択的タイプ■アゴニストＲＵ　２８３６２の存在下、３Ｈ Ｍの３Ｈ−アルドステロン（鉱質コルチコイドレセプターの特異的リガンド）と インキュベートした。特異的結合は１７５６ｃｐｍ／フラクションであった。

海鳥サイトツル鉱質コルチコイドレセプターへの３Ｈ−アルドステロン結合の阻 害 ５α−プレグナン−３σ、２１−ジオール−２０−オン　７６．７５β−プレグ ナン−３α、２１−ジオール−２０−オン　１３．８５α−プレグナン−３α、 オール−２０−オン　０５β−プレグナン−３α、オール−２０−オン　０５α −プレグナン−３α、２０α−ジオール　０５β−プレグナン−３α、２０α− ジオール　０５α−プレグナン−３α、２０−ジオール−２０−ジメチル　０５ α−プレグナン−３α−オール−３β−メチル−２０−オン　３．２５α−プレ グナン−３β、２０−）リフチル−３α、２０−ジオール　０実施例９ 糖質コルチコイドレセプター 表７に関し、脳すイトゾルフラクンタンを表６に関するように調製し、薬物を３ ＨＭの３Ｈ−デキサメタシン（糖質コルチコイドレセプターの特異的リガンド） とインキュベートした。特異的結合は１１７Ｊｃｐ■／フラクシヨンであった。

表７ 糖質コルチコイドレセプターへの ３Ｈ−デキサメタシン結合の阻害 競合剤（１０−６Ｍ）　阻害の％ デキサメタシン　１００ ５α−プレグナン−３α、２１−ジオール−２０−オン　２９．５５β−プレグ ナン−３α、２１−ジオール−２０−オン　８．２５α−プレグナン−３α、オ ール−２０−オン　８．７５β−プレグナン−３α、オール−２０−オン　５． ９５α−プレグナン−３α、２０α−ジオール　２．６５β−プレグナン−３α 、２０α−ジオール　１４５ａ−プレグナン−２０−ツメチル−３α、２０−ジ オール　２６５α−プレグナン−３α−オール−３β−メチル−２０−オン　Ｏ ６実施例１０ エストロゲンレセプター 表８は、既に記述された通りにＴｊａｌ！２シた、ウソ子宮サイドシルへの８Ｈ −エストラジオール（エストロゲンレセプターの特異的リガンド）結合の阻害を 示す。

２つの濃度の’）（−ｘストラジオール：　（Ａ）０．１５βＭ及び（Ｂ）０． ２５βＭを、薬物の存在下サイドシルとインキュベートした。０．１５βＭ及び ０．２５βＭでの３Ｈ−ニストランオールの特異的結合は、それぞれ１２４１ｃ ｐｍ／フラクション及び１９５１ｃｐ■／フラクシヨンであった。

表呈 ラン子宮エストロゲンレセプターへの ３Ｈ−エストラジオールの結合の阻害 ５α−プレグナン−３α、オール−２０−オン　０　０　０　３５α−プレグナ ン−３α、２１−ジオール−２０−オン　２　４　２３　２３５α＝プレグナン −３α、２０α−ジオール　０　０　７　１３５α−プレグナン−３α−オール −３β−メチル−２０−オン　０　０　２　６ ５β−プレグナン−３α、２１−ジオール−２０−オン　０　４　３　７５α− プレグナン−３β、２０−トリメチル−３α、２０−ジオール　０　４　３　７ ５β−プレグナン−３α、２０α−ジオール　８　０　０　０５β−プレグナン −３α、オール−２０−オン　０　０　５　０５α−プレグナン−２０−ジメチ ル− ３α、２０−ジオール　０　０　５　５実施例１１ プロゲステロンレセプター 表９に示したデータに関し、ウシ子宮サイドシルは、表７に関すると同様に分離 し、′Ｈ−プロゲステロン、自然のりガントの阻害をめることによりプロゲステ ロンレセプターへの以下の結合について用いた。２つの３Ｈ−プロゲステロ−・ 濃度（Ａ）０．１５βＭ及び（Ｂ）０．２５βＭを薬物の存在下、サイドシルと イノキュベートした。０．Ｉ５ｎＭ及び０．２５βＭでの３Ｈ−プロゲステロン の特異的結合は、それぞれ２８９３ｃｐｍ／フラクション及び４２２２ｃｐ■／ フラクションであった。

二のデータは、ＧＮＰアゴニストがプロゲステロンレセプターに何の活性もない ことを示す、図１１に示される我々の発見を補強する。

４嘩１０”Ｍ　１０−’Ｍ ５α−プレグナン−３α、オール−２０−オン　１４２４１４０５ａ−プレグナ ン−３α、２１〜ノオールー２０−オン　１３５３５２８５ａ−プレグナン−３ α、２０α−ジオール　６　１　２　３５α−プレグナン−３α−オール−３β −メチル−２０−オン　４２１０５ ５β−プレグチン−３α、２１−ノオール−２０−オン　６２１９１０５α−プ レグナン−３β、２０−トリメチル−３α、２０−ジオール　８０５０ リーブレグナン−３α、２０α−ジオール　００１１５Ｂ−プレグナン−３ａ、 オール−２０−オニ／９１１７１３５α−プレグナン−２０−ツメチル− ３ａ　−２０−’−’　オールＯｏｏ　。

そのレセプターへの新規ステロイドレセプターのアゴニストの選択性をさらに評 価するため、３α−０Ｈ−３β−メチル−５α−プレグナン−２０−オンを種ヤ の既知レセプター又はｗ識部位と結合した一連の放射リガンドに対して試験した 。これらの研究は、ツバスクリーン（商標）（ツバ・ファーマノユーティヵルズ 、ボルチモア、Ｍ　Ｄ　）プロトコールに従って実施した。結果は表１０に示す 。

表１０ ＧへＢ　Ａ　、及びＢＺ結合部位についての表１０のノバスクーン検定は、本明 細書に報告した他のＧ　Ａ　Ｂ　Ａ　Ａ及びＢＺ研究が行われたよう実施したの でないことに注き、ノバスクーノ検定では、外因性ＧＡＢＡは与えなかった。従 って、本データでは、正の協同性性質は試験せず、ＢＺ結合部位での結果は正で はなかった。

さらに、クロ１１ドチヤ／ネル蛋白は正の阻害を示し、効果はＧＡＢＡを存在さ せないことにより最Ｉｊ＼となった。

これらの実験の結果は、新規ＧＮＲのアゴニストは上記の試験したレセプター及 び蛋白のいずれにも強い観相性を有しないことを明確に示す。加えて、それらは ホルモン様ステロイドレセプター結合に由来するであろうホルモン様副作用を士 明細書に記載したステロイドレセプターのサブユニット（α１−６、β、−３、 γ１、等）のサブタイプが種ノ１の組合せてインビボで起きる。研究により、を 髄はα１サブユニツトが欠けており、一方、小脳はα、サブユニットに富んでい ることが判ったｒビ、二Ｓ、（＋９９１）ファーフコ０ノツク・／グニフィカシ ス・オン・叶・ストラクチュラル・ヘテロゲニティ・オン・ザ・ＧＡＢＡ、レセ ブター−りロライト・イオン・壬ヤノネル・コンプレックス、ニューロサイコツ アーマコロ７・、４．９−１５）。レセプターサブユニットサブタイプの部分的 な選択的発現は、組織のＧへＢ、Ａアーギノク阻害及び神経ステロイド調節的効 果への特異反噴を言央明しうる。

加えて、本明細書に記載したＧＮＨのサブユニットは、種々の組合せて発現でき る、実験によね発現したサブユニットの種々の組合せに対するＧＮＰアゴニスト ○結合を分析することを実施した。結果は、異なるサブタイプの機能として、７ ニニストに対する特異反応があることを示す。

’ａｌ　ＧへＢ　Ａ、レセプター複合体の発瑛トニレスフェク７−Ｊ７の２４時 間前ではなく、３６時間で細胞を接種する以外は、」二記のトランスフェク７ヨ シ操作に従った［Ｐｒｉ　ｔｃｈｅｔ　ｔら、（１９８９）　トランス−ニＭ　 Ｌ細物に産生ミれる■型及び■型ＧＡＢＡＡレセプター　５ｃｉｅｎｃｅ　２４ ５．１３８９−１３９２Ｅ　−上】５ノ改を高効ｍ’＋ノ酸カル／ウム沈降法ｊ ｃｈｅｎ及びＯｋａｙａｍａ、　（１９８丁）″ラスミドＤ＼、へによる＃ｌ乳 動物細胞の高効率形質転換Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏｌ　７．２７４５−　 ：　Ｔ　ｖ　′２）を用い、皿二とに全ＤＮへ２０μｇによってヒト肝腎２９３ 細胞をト３７スーニクトした、このトランスフェクノヨンに使用したＤＮＡは、 発現ベク々−ｆＣｈｅｎ及びＯｋａ〜ａｍａ　前掲］にて個々に構築されるヒト ＧＡＢＡヮα３、α２又はα７．５１伎二（ビル丑ブユニットをコートするクロ ーン化ｃＤＮＡそれぞれの等Ｎの混合物であったウ　トー７／スフェク／タンの ４８時間後に細胞を採取し、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７，２で２回洗 浄し、凍結するか又は即座に結合輸宇に使用しｍ：。

〆ｂ＋　Ｈ″Ｈ：１Ｆｌ−Ｕ及びｊ３Ｈコムスキモール（ｍｕｓｃｉｍｏｌ　） 結合検定に二、スフェクト細り又はラット（雄性スブラーグーダウリー、１５ｌ ５０−２Ｏ０の選択領域由来の脳組織を５０１１ＩＮｉ　リン酸カリウム緩衝液 ｐＨ７，２中にてふモ、↓イスし、遠し・により１回洗浄したつ得られたｍ砲弾 ベレット（１０゜０００ｙＧｌを１０ｆｆｌ＼１１１ン酸カリウム、ｐＨ７，２ 及び１００１１Ｍ＼ａｃｆの混合物中で十モ、−１−イスした。細胞嗅調製物の 試料１０μＣを１．ｕＭ　ＧＡＢ、Ａ　［ン６７・−ミカル・カッパニー］の存 在下に２βＭ　［３Ｈ］ＦＬＵ　（７５−９０Ｃｉ／＝ｔｏ１．　＝ユ十シ　ニ ュー・イアグランド・ヌクレアー）と共に、又は３０ｎＭ［’■ムスキモール（ ２０、ＯＣｉ、’ｍｍｏ１．デュポン、ニュー・イングランド・ヌクし下−）と 共に、ステロイド［５ｔｅｒａｌｏｊｄｓ、ウィルトン、ＮＨ３の存在又は不存 在下にイシ土ユベートした。すべての検定は５０ｍＭ　リン酸ナトリウム緩衝液 及：”　１　（］　ＯＩＩＭＮａＣｔて許容量１４／とした。、［３Ｈ］ＦＬＵ 及び［３Ｈ］ムスキモ一ル結合検定における非特異的な結合はそれぞれ、１μＭ クロナゼバム［ングマ・←ミカル・カンパニー１及び１０／ｙＭＧＡＢＡの存在 下での結合と定義した。

検定は９０分（７３Ｈ］ＦＬＵ結合）の、又は６０分の２５℃でのインキュベー ノ３、、袴に、５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ及び５ｃｈｕｅｌｌ　［Ｋｅｅｎｅ、　Ｎ Ｈ３３２番カラスファイバーフィルターによる迅速濾過によって終了させた。そ のフィルターを水冷Ｐ　Ｂ　３５ｍｌで２回洗浄した。フィルター結合放射活性 を液体ンンチレーンタン分光装置によって定量した。結合の半一最大増強を、以 下の等式による用量一応答曲線の非線形回帰によって測定した　Ｙ＝’（Ｙｖａ ｘ＊　Ｘ／　（Ｘ＋ＥＣ５ｏ）コ＋対照（ココニ、Ｙ＝対対間合性の％てあり、 Ｘ＝ｌ　ｏｇ［３α−０Ｈ−ＤＨＰコである）。対間＝１００％、ＥＣ５゜＝半 一最大増強を得るのに要する３α−０Ｈ−ＤＨＰの濃度。

θ、及びγ、のサブユニットと共に種々のαサブユニットを含有する発現ヒトＧ ＲＣの３α−０Ｈ−ＤＨＰに対する差異応答を図１２に示す。最大増強及びＥＣ す値は、１μ〜ｆＧＡＢ、Ａ及び種々の濃度の３α−０Ｈ−ＤＨＰの存在下、α １β１７：−’・　Ｅｍａｘ＝　６６％、ＥＣｓａ＝３４０ｎＭ）　、α２β１ ７２　（○、Ｅｍａｘ＝８”６−　ＥＣｓ’−５３ｎＭ）及びα３β１７２　（ ■、Ｅｔａｘ＝２０８％、ＥＣ，、＝２２６ｎ〜１）トランスフェクト細胞膜に 対する［３＋（］Ｆ　ＬＵ　（２βＭ）についてのものである。各市は４−６個 の独立したトランスフエクノタン実験の平均を表し、檀て〒すＳＥ〜りを付して いる。３α−０Ｈ−ＤＨＰ不存在下での［’Ｈ］ＦＬＵ結合憔を１結合部結合性 と規定するっα３β１７２、ａ２β１γ２及びα３β、γ２の対印結合値はそれ ぞれ１０−３９．２３−８７、及び５−３３ｆＩＩＩｏｌ／ｍｇタンパク質であ った− そのス二ロイドは明らかに、各実験レセプター叶ブタイブに対する［３Ｈ］ＦＩ −Ｕｑ合性を増大させた。しがし、α、サブユニットを有する組み立てし・セブ ターは統一的に、他のσサブユニ７・トを含有するレセプターと比較して非常に 大きなステロイド刺激に対する最大応答を与えた。α３β１γ、レセプター複合 体を使用すると、３ａ−ＯＨ−ＤＨＰは［３Ｈ］ＦＬＵ結合性の２００％増大を 与え、α１β、γ２及びα２β、γ２２ａ体は対照は越えているが１００％増大 よりも低い結合性しか与えなかった。攪々のαサブユニットを用いるＧＡＢＡに 対するＧＲＣの類似した差異応答はまた、既に示されている［Ｐｒ１ｔｃｈｅｔ ｔら、前掲］。

本試験で使用しているＧＡＢＡ濃度（１μＭ）は、Ｇ　Ａ、　Ｂ　Ａ不存在下の 結合性［ＰｒＩｔｃｈｅｔｔら、前掲］と比較した場合、有意な差異増大を与え なかったので、本試験ではそれを対照条件に使用した。ステロイドによる増大パ ーセンテージは種々のトランスフェクンタン実験間で変動する対照結合性のレベ ルとは無関係に、一定のままであった。

ＧＡＢＡによるＢｚ結合性の刺激増大が幼若動物由来の脳膜［１１ａｌｌｏｒｇ ａら、（１９８０）脳ベンゾジアゼピン結合性のＧＡＢＡ調節の個体発生変化、 　Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃ。

１ａｇｙ　１９．４０５−４０８］又はシナプスＩＧＲＣが破壊されている組織 由来の脳膜［Ｌ。

ら、　（１９８３）黒買におけるＩ型及び■型ベンゾジアゼピン結合部位の局在 差異］において報告されているが、ＧＮＲアゴニストに対する組繊内応答の差異 は報告されていない。従って、本発明者らは、小脳及びを髄由来のＰ２ホモノネ ートにおける３α−０Ｈ−ＤＨＰに応答する［３Ｈ］ＦＬＵ結合性を測定した（ 図１３）。

図１３は、ラットを髄（・、ＥＣａ＝１％、ＥＣｓａ＝１５２ｎＭ）及び小脳（ ○、Ｅｆｆｌａｘ＝２８％、ＥＣｓｏ＝４２ｎＭ）のＰ２ホモノネートにおける ［３Ｈ］ＦＬＵ結合性の相乗作用（増強）を表している。この検定は５βＭ　Ｇ ＡＢＡ及び種々の濃度の３α−０Ｈ−ＤＨＰの存在下に行った。各点は３つの実 験の平均±Ｓ、Ｅ＼１を表している。３α−０Ｈ−ＤＨＰが不存在下ての［３Ｈ ］ＦＬＵ結合性を１０００６結合性と規定する。

ノｊ・脳及びを髄におけるＧＡＢＡルセプターはそれぞれ、α、サブユニットが 特異に豊富であり、又はそれを欠いていることが同系（ｉｎ　５ｊｔｕ）試験に て示されているので、これら２つの領域を選択した［Ｖｉｃｉｎｉ　Ｓ、、前掲 ＨＭｅｍｏら、前掲］。

同じ実験条件では、を髄における［’Ｈ］ＦＬｔＪ結合性は３α−０Ｈ−ＤＨＰ に対する応答が小脳よりも大きいことが示された。しかし、これら２つの組織間 の応答の相違は、トランスフェクト細胞で観察されるもの稈には太き（なかった が、これはおそらく、これらの組織のサブユニット分布が全く均一でないことに よるのであろう。

αβサブユニットのみの同時発現によ７て形成されるＧＲＣに対する従前の電気 生理学的試験でも、ＧＡＢＡに対する差異応答が観察されている［Ｐｒ１ｔｃｈ ｅｔｔら、前掲］。しかし、σβγサブユニｙｈから構成されるレセプター複合 体を試験した場合、これとは異なる観察結果が得られた。α２β、レセプター複 合体は、α、β１及びα３β、サブユニット組合わせ物よりもＧＡＢＡに対する 感受性が高いが［Ｌｅｖｉｔａｎら、（１９８８）ＧＡＢＡＡレセプター異質に 関する構造及び機能的基礎。

Ｎａｔｕｒｅ　３３５．７６−７９コ、他方α３β、γ２レセプター複合体はα １β１γ２及びα２βげ２複合体よりもＧＡＢＡに対する略受性が高いことが見 いだされた。２つ又は３つのサブユニットから構成されるレセプターの薬理学的 及び電気生理学的性質の相違は、上記の観察事項を裏付けることができる。

より最近になって判明したが、Ｘｅｎｏｐｕｓ卵母細抱に発現されるＧＲＣサブ タイプもまた、サブユニット組成に依存して３α−０Ｈ−ＤＨＰによって別個に 調整されていた［Ｓｈｉｎｇａｉら、　（１９９１）神経ステロイドに対する応 答に与えるクローン化ＧＡＢＡＡレセプターのサブタイプ型の効果、　Ｅｕｒ、 　Ｊ、　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、　ｌ１ｏ１．　Ｐｈａｒｍａｃｏｌ。

Ｓｅｃ、　２０６．７７−８０１゜このサブユニット依存性は本試験にて観察さ れたものと相違していた。この相違を調和させるのは困難であるが、Ｘ　ｅｎｏ ｐｕｓ卵母細胞においてＧ　、Ａ　Ｂ　Ａ活性化クロライド流がどのようにして 増強されるのかに対する、相乗的な結合相互作用を媒介する機序の相違と関連し ているのかもしれない。

本試験において、本発明者らは同様のアロステリック調節結合検定により、αβ サブユニットからなるレセプターにおける３α−０Ｈ−ＤＨＰに対する応答性も 調査した（図１４）。図１４は、トランスフェクト細胞膜における３α−０Ｈ− ＤＨＰによる［３Ｈ］ムスキモ一ル結合性の増大を示している。種々の濃度の３ ａ−ＯＨ−ＤＨＰの存在下、α１β１−（・、Ｅｍａｘ＝　１９％、ＥＣ５ａ＝ １１βＭ）、α２β１−（○、Ｅｍａｘ＝８２％、ＥＣｓｏ＝４６３ｎＭ）及び α３β１−（■、Ｅｍａｘ＝１９１％、ＥＣ５゜＝３６６ｎＭ））ランスフエク ト細胞膜に対する［３Ｈ］ムスキモール（３０ｎＭ）結合性。各点は４−６個の 独立したトランスフェク／タン実験の平均であり、欅で示すＳＥＭを付している 。３α−０Ｈ−ＤＨＰ不存在下の［３Ｈ］ムスキモ一ル結合を１００％結合性と 規定する。α１β１、α２β１及びα３β１の対間結合値はそれぞれ２８−１０ １．３９−１１２、及び２２１−１３０ｆ。

１、／ｍｇタンパク質であっｔこ。

αβγレセプター複合体を用いて観察される事項と矛盾なく、α３β１は、α１ β、又はα２β１サブユニツトからなるものよりも３α−０Ｈ−ＤＨＰによる［ 用コムスキモール結合性の大きな増大を示したが、α２β、との相違はそれほど 顕著ではなく、従って二のことはステロイドとの相互作用の部位がαβγ又はα βレセブクーの両種合体においておそらくは類似していることを示している。レ セプターが里−サブユニット（ホモオリゴマー）からなる場合にＧＮＲアゴニス トに対する差異応答が起こるのか否かは分かっていない。

幾つかのステロイドの活性の順位オーダーを発現α、β１γ２、α２β１γ２及 びα、β１γ２レセプターにて調査した。１βＭステロイドては、３α−０Ｈ− ＤＨＰは３つすべてのレセプター複合体にて［３Ｈ］ＦＬＵ結合性の最も大きな 増大を示したが、３β−０Ｈ−ＤＨＰ及びプロゲステロンは最小限の効果しか示 さなかった１表１１）、立体異性体の５−β立体配座はその対応する５−α異性 体と比較すると弱い効果しか示さない。興味深いことに、差異応答はα、サブユ ニットよζつちα、及びα、からなる複合体において顕著である。

ａサブユニット変異の分布はＣＮＳにて不均質であり、また変異体は別個にＧ＼ Ｒ了ゴニストと応、答するらしいので、ＧＮＲアゴニストに対する応答の強さは 部位によって変動し得る。さらに特性化すると、この性質によって、この新規な ス０ロイドｔＰ識部位を欅的化する、より高いサブタイプ選択的な化合物を設計 することができる、 表１１ １μＭ　ＧＡＢＡの存在下、発現ＧＡＢＡＡレセプター複合体に対する［３Ｈ］ ＦＬＬ’結合性増強における様々なステロイドの相対的活性相対的活性Ｉ＋ ステロイド　α１β１γ２　α２β、γ２　α３β１γ２３ａ−Ｏｆ＋−５ａ− Ｄ［ＩＰ　１００　１００　１００５σ−Ｔ［ＩＤ０Ｃ６５，２±４．４　８８ ．４±２６零　７９５土３４本零３ａ−ＯＲ−５６−ＤＦＩＰ　４６　±８．３ 　８５．２±３．２＊＊　５６．６±４８５Ｅ−ＴｔｌＤＯＣ２８，８ｔ４．３ 　６３．５±６．３　２６．８ｉ２．６アルフアキサロン　４６３±８．７　５ ２．３±４．３　４１．５±４．８３６−ＯＲ−ＤＦＩＰ　０　４　±１７　０ プロゲステロン　０　３．８ｔｈ１．９　０１）　３α−０Ｈ−５α−ＤＨＰに 対する［３Ｈ］　ＦＬＵ結合性の増強は、１００％活性として定義される。各実 験において、３α−０Ｈ−ＤＨＰの効果を陽性対照化合物として検定した。相対 的活性は、指示したステロイドの存在下の［３Ｈ］　ＦＬＵ結合性の増強の、同 じ実験における３α−０Ｈ−５α−ＤＨＰにより誘導されるものに対する割合と して定義した。

ステロイド濃度は全て１μＭであった。データは、４−８の独立したトランスフ エクノタン実験の平均±Ｓ、Ｅ、Ｍを表している。

本　＊ネ　ステニープント対合を一検定に基づいて木Ｐ＜０．０２及び零零Ｐ＜ ０．０１て３ａ−ＯＨ−５α−ＤＨＰとは有意に相違する。

供給 ＧＮＰアゴニスト又はＧＮ’Ｒアゴニストと許容された操作に従った非毒性医薬 担体との混合物を被験者である動物又はヒトに所望の薬動力学活性を生起させる に充分な非毒性量で導入することにより本発明のＧＮＲアゴニストは調製され、 それは通常の投与単位影響て個体に投与される。好ましくは、本発明の組成物に は、投与単位当たり約５ｍｇ−約５００ｍｇの活性成分から選択される、活性で あるが非毒性量の活性成分を含有させる。この量はＧＮＲに対する化合物の親和 性、所望の特定な生物活性、及び轡者の状態によって変動する。本発明の望まし い目的は、ストレス、不安症、ＰＭＳＳＰＮＤ、及び発作、例えば癲１Ｉｌ（て んかん）により引き起こされる発作を処置し、これらの中枢神経系異常の轡者に 共通する不安発作、筋緊張及びうつ病を改善又は予防することである。本発明の さらなる望ましい目的は、不眠症の予防及び催眠活性の誘導である。

使用する医薬担体は例えば、固形、液体、又は経時放出のいずれであってもよい （例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅ ｎｃｅｓ、　１４編、　１９７０を参照のこと）。代表的な固形担体は乳糖、ア ラビアゴム、ノヨ糖、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アカノア、ステアリ ン酸マグネシウム、ステアリン酸、微結晶セルロース、ハイドロゲル・ポリマー などである。典型的な液体担体はプロピレングリコール、β−サイクロデキスト リンの水溶液、ンロンブ、ピーナツ油、オリーブ油、及び同様のエマルジョンな どである。同様に、担体又は希釈剤には、当業者に周知の遅速物質、例えばグリ セリン−ステアリン酸又はグリセリンニステアリン酸単独、又は蝋が一緒になっ たそれら、マイクロカプセル、微小球、リポソーム及び／′又はハイドロゲルな どがある。

医薬列形は広節に使用てきる。従って、固形担体を使用する場合、調製方法とし ては、軍用な製粉機ｌｊ・化、油中、錠剤化、硬ゼラチン又は腸溶剤皮カプセル に微・ｊ・粉末又はペレット形態で入れる、又はトローチ、ロゼンジ又は坐剤形 態にすることなるが挙げられる。液体担体を使用する場合、調製物は、アンプル などの液体剤、又は水性もしくは非水性液体’Ｍ剤とすることができる。液体投 与形態には製薬的に許容される保存剤なども必要である。さらに、本明細書のデ ータに基づいて低用量が要求されるのみであるので、鼻スプレー、舌下投与、及 び徐放性皮膚バッチも局所投与に適した医薬列形である。

不安解消、抗けいれん、気分改変（例えば、抗うつ剤）、又は催眠活性を生起さ せる本発明の方法は、このような活性が必要な被験者に、通常は医薬担体との上 記の組成物中で調製されるアゴニストのＧＮＲにて該活性を生起させるに充分な 非毒性量を投与することを特徴とする。

月経の際には、排出される代謝産物のレベルは約４倍に変動する［Ｒｏｓｃｉｓ ｚｅｖｓｋａら　ｏｐ、　ｃｉｔ、　］。従って、徴候を制御するための治療で は、ＧＮＲ活性プロゲステロン代謝産物（即ち、ＧＮＲアゴニスト）のレベルが ＰＭＳ患者の月経前状呼の正常レベルよりも高いレベルで轡者を維持させる。活 性であり主要である代謝産物の血漿レベルを患者の月経前及び月経後にモニター する。このようにして、ＧＮＲアゴニストの単独又はその混合物としての投与量 は、月経前状態のＧＮＲ活性プロゲステロン代謝産物のレベルを補充するものと して計算する。

投与経路は、刺激するＧＲＣに活性化合物を有効に輸送できるいずれの経路であ ってもよい。投与は、腸管外、腸溶的に、経直腸、膣内、陵内、舌下、又は経鼻 的に行うことができ、経口及び経皮投与が好ましい。例えば、皮膚パッチの製剤 は活性成分を１週間の期間１．密書に供給することができる。

これまで好ましい呼様を記載し説明してきたが、本発明の範囲を逸脱しない限り 種々の置換及び改変を加えることができる。従って、上記は単なる例示であって 限定を意図するものではないと理解すべきである。

対数〔３αＯＤＨＰＩ（Ｍ） ミオクロヌスの開始時間（分） 〜 ざ）　％　防御 抗メトラゾール活性 ０　２　４　６　８　ｔｏ　１２　１４　１６時間（時） ３ａ−ＯＨ−ＤＨＰ（ｒｒｉｇ／ｋｇ）５ａ−ＴＨＤＯＣ（ｍｇ／ｋｇ） ０　０．５　＋　５　１０　２０ ジアゼパム（ｍｇ／ｋｇ） ＩＧ　７ １３　＞り０テ＊スト’Ｊ　：／　３β−０Ｈ−ＤＨＰ　３ａ−ＯＨ−ＤＨＰＩ Ｇ　９Ａ 結合した［３Ｈ］−Ｒ５０２０％ ＦＩＧ　／２ 対数［３α−ＯＨ−ＤＨＰＩ（Ｍ） ＦＩＧ　／３ 対数［３α−０Ｈ−ＤＨＰＩ　（Ｍ） ＦＩＧ　／４ 対数［３α−０Ｈ−ＤＨＰＩ　（Ｍ：）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ＧＲＣ上のＧＮＲのアゴニスト。 ２．ＧＲＣ上のＧＮＲのアゴニストの有効量を投与することを特徴とする哺乳動 物の不安症を処置する方法。 ３．不安症が全身化不安障害である請求項２に記載の方法。 ４．不安症が恐慌障害である請求項２に記載の方法。 ５．ＧＲＣ上のＧＮＲのアゴニストの有効量を投与することを特徴とする哺乳動 物のてんかん発作を処置する方法。 ６．ＧＲＣ上のＧＮＲのアゴニストの有効量を投与することを特徴とする哺乳動 物の気分障害を処置する方法。 ７．気分障害がうつ病である請求項６に記載の方法。 ８．ＧＲＣ上のＧＮＲのアゴニストの有効量を投与することを特徴とする哺乳動 物のＰＭＳを処置する方法。 ９．ＧＲＣ上のＧＮＲのアゴニストの有効量を投与することを特徴とする哺乳動 物のＰＮＤを処置する方法。 １０．ＧＲＣ上のＧＮＲのアゴニストの有効量を投与することを特徴とする哺乳 動物の不眠症を処置する方法。 １１、不安症、痙攣、気分障害、ＰＭＳ、ＰＮＤ、及び不眠症の中から選ばれる 疾患を処置するうえで有効な薬物をスクリーニングするための方法であって、Ｇ ＲＣ上のＧＮＲのアゴニストに関してスクリーニングすることを特徴とする方法 。 １２．スクリーニングを競合検定によって行う請求項１１に記載の方法。 １３．スクリーニングをアロステリック調節検定によって行う請求項１１に記載 の方法。 １４．異なるサブタイプ特異性を有するＧＮＲと結合する薬物をスクリーニング するための方法であって、ＧＲＣサブタイプをコードするｃＤＮＡを細胞内で発 現させて発現ＧＮＲサブタイプを生成させ、該サブタイプのアゴニストをスクリ ーニングすることを特徴とする方法。 １５．スクリーニングを競合検定によって行う請求項１４に記載の方法。 １６．スクリーニングをアロステリック調節検定によって行う請求項１４に記載 の方法。