PT751930E

PT751930E - Derivados amidino uteis como inibidores da sintetase de oxido nitrico

Info

Publication number: PT751930E
Application number: PT95914809T
Authority: PT
Inventors: Mark G Currie; Kam F Fok; Keith Webber; Foe S Tjoeng
Original assignee: Searle & Co
Priority date: 1994-03-24
Filing date: 1995-03-24
Publication date: 2000-04-28
Also published as: ES2141347T3; DK0751930T3; ATE188467T1; AU2190895A; EP0751930A1; DE69514341T2; GR3032365T3; EP0751930B1; DE69514341D1; WO1995025717A1

Description

DESCRIÇÃO

"DERIVADOS AMIDINO ÚTEIS COMO INIBIDORES DA SINTETASE DE ÓXIDO NÍTRICO"

Antecedentes da Invenção

Campo da Invenção A presente invenção diz respeito a novos derivados amidino, composições farmacêuticas contendo estes novos compostos e ao seu uso em etrapia, em particular o seu uso como inibidores da óxido nítrico sintase. Técnicas Relacionada É conhecido desde o início de 1980 que a relaxamento vascular provocada pela aceticolina é dependente da presença do endotélio e esta actividade foi atribuída a um factor humoral lábil denominado factor relaxante derivado do endotélio (ERDF). A actividade do óxido nítrico (NO) como vasodilatador é conhecida há mais de 100 anos e o NO é o componente activo de amilnitrito, gliceriltrinitrito e outros nitrovasodilatadores. A identificação recente do ERDF como NO coincidiu com a descoberta de uma rota bioquímica através da qual o NO é sintetizado a partir do aminoácido L-arginina através da enzima NO sintase. O NO é o estimulador endógeno do guanilato ciclase solúvel e está envolvida em várias acções biológicas, para além do relaxamento dependente do -2- endotélio, incluindo citotoxicidade de células fagocíticas e comunicação entre células no sistema nervoso central (ver Moncada et al., Biocahemical Pharmacology, 1989, 38, 1709-1715 e Moncada et al., Pharmacological Reviews, 1991, 43, 109-142). É agora considerado que a produção excessiva de NO pode estar envolvida em vários estados, especialmente estados que envolvam hipertensão sistémica tal como choque tóxico e terapia com determinadas citoquinas. A síntese de NO a partir de L-arginina pode ser inibida pelo análogo da L-arginina, a L-N-monometil-arginina (L-NMMA) e o uso terapêutico da L-NMMA para o tratamento do choque tóxico e de outros tipos de hipertensão sistémica foi já proposto (WO 91/04024 e GB-A-2240041). O uso terapêutico de outros inibidores da NO sintase diferentes da L-NMMA mas com o mesmo objectivo foi também proposto em WO 91/04024 e em EP-A-0446699.

Foi recentemente demonstrado que existem pelo menos dois tipos de NO sintase: (i) uma enzima constitutiva dependente de Ca** / calmodulina que liberta NO em resposta ao receptor ou estimulação física. (ii) uma enzima independente de Ca** que é induzida após activação do músculo liso vascular, macrófagos, células endoteliais e por um determinado número de outras células por endotoxina e citoquinas. Uma vez expressas, esta NO sintase indutível sintetiza NO durante longos períodos.

O NO libertado pela enzima constitutiva actua como um mecanismo de transdução subjacente a várias respostas fisiológicas. O NO -3- produzido pela enzima indutível é uma molécula citotóxica para células de tumores e microrganismos invasores. É também plausível que os efeitos adversos da produção excessiva de NO, em particular a vasodilatação patológica e destruição de tecidos, possam resultar em larga medida dos efeitos do NO sintetizado pela enzima NO indutível.

Alguns dos inibidores da NO sintase propostos para uso terapêutico até agora, e em particular L-NMMA, são não selectivos pelo facto de inibirem quer a NO sintase constitutiva quer a indutível. O uso de tais inibidores da NO sintase não selectivos requer um grande cuidado de modo a evitar as consequências potencialmente graves da sobre-inibição da NO sintase constitutiva incluindo hipertensão e possível trombose e destruição de tecidos. Em particular, no caso do uso terapêutico da L-NMMA para o tratamento do choque tóxico foi recomendado que o paciente fosse sujeito a uma monitorização contínua da pressão arterial ao longo do tratamento. Deste modo, enquanto que os inibidores da NO sintase não selectivos têm utilidade terapêutica, garantido seja que são tomadas as precauções apropriadas, os inibidores da NO sintase, que são selectivos no sentido em que inibem a NO sintase indutível numa extensão consideravelmente maior que a NO sintase constitutiva, seriam de maior benefício terapêutico e facilidade de uso. WO 93/13055, WO 93/24126 e Patente U.S. N.° 5.132.453 divulgam compostos que inibem a síntese do óxido nítrico e inibem preferivelmente a isoforma indutível da óxido nítrico sintase.

Sumário da Invenção A presente invenção fornece derivados amidino de fórmula (I): -4-

(I) seus sais, ésteres e pró-fármacos farmaceuticamente aceitáveis, em que X é C[-C|0 alquilo, C2CI0 alcenilo, C2-Cio alcinilo, -(CH2)kQ(CH2)l- onde k é 2 ou 3,1 é 1 ou 2 e Q é O, Se, SiY2 onde Y é CpCio alquilo, S(0)z onde z é 0, 1 ou 2, NR onde R é hidrogénio ou CpCio alquilo, e em que todos os referidos radicais podem ser opcionalmente substituídos por um ou mais substituintes escolhidos a partir de Q-Cio alquilo, halogéneo e trifluoralquilo,

Ri é hidrogénio (onde Q é Se), Ci-Cio alquilo ou hidroxialquilo, R2 é Ci-Cio alquilo, C2-Cio alcenilo, C2-Cw alcinilo ou haloalquilo, e R3 é amino, alquilamina, aminoácido, hidroxilo, C1-C4 alcoxilo, tetrazole, ou tetrazoloamina. A invenção diz ainda respeito a composições farmacêuticos compreendendo um composto de fórmula (I), Os compostos e composições acima definidos têm utilidade como inibidores da óxido nítrico sintase. Estes compostos também inibem preferivelmente a forma indutível em relação à forma constitutiva da óxido nítrico sintase e na forma mais preferida inibem a forma indutível pelo menos 3 vezes mais do que a forma constitutiva da óxido nítrico sintase.

As condições nas quais existe uma vantagem em inibir a produção de NO a partir da L-arginina inclui a hipertensão sistémica associada com o choque séptico e/ou tóxico induzida por uma ampla variedade de agentes; terapia com citoquinas tais como TNF, IL-1 e IL-2; e como um adjuvante na imunossupressão a curto termo na terapia de transplantes.

Existe também um conjunto crescente de evidências de que o NO possa estar envolvido na degeneração de cartilagem, a qual ocorre sob determinada condições tais como artrite e é também conhecido que a síntese de NO é aumentada na artrite reumatóide. Consequentemente, condições adicionais nas quais existe uma vantagem em inibir a produção de NO a partir da L-arginina incluem estados auto-imunes e/ou inflamatórios que afectam as articulações, por exemplo artrite.

Ainda outras condições adicionais nas quais existe uma vantagem em inibir a produção de NO a partir da L-arginina incluem a doença inflamatória intestinal, isquemia cardiovascular, diabetes, isquemia cerebral e outros distúrbios do SNC mediados pelo NO.

Descrição Detalhada da Invenção

Uma concretização preferida da presente invenção é um composto de fórmula (I): -6-

(ΐ) e seus sais, ésteres e pró-fármacos farmaceuticamente aceitáveis, em que X é CpÇio alquilo, C2Q0 alcenilo, C2-C10 alcinilo, -(CH2)kQ(CH2)l- onde k é 2 ou 3, 1 é 1 ou 2 e Q é O, Se, S1Y2 onde Y é CpCio alquilo, S(0)z onde z é 0, 1 ou 2, NR onde R é hidrogénio ou CpCio alquilo, e em que todos os referidos radicais podem ser opcionalmente substituídos por um ou mais substituintes escolhidos a partir de CpCio alquilo, halogéneo e trifluoralquilo,

Ri é metilo, R2 é CpCio alquilo, C2-Ci0 alcenilo, C2-Ci0 alcinilo ou haloalquilo, e R3 é amino, alquilamina, aminoácido natural, hidroxilo, C1-C4 alcoxilo, tetrazole, ou tetrazoloamina.

Uma outra concretização preferida da presente invenção é um composto de fórmula (I): -7- ggggl—Τι

R3 (I) e seus sais, ésteres e pró-fármacos farmaceuticamente aceitáveis, em que X é Ci-C6 alquilo, CrC6 alcenilo, CrC6 alcinilo de 1 a 6 átomos de carbono, -(CH2)kQ(CH2)l- onde k é 2 ou 3,1 é 1 ou 2 e Q é O, Se, SiY2 onde Y é CrCio alquilo, S(0)z onde z é 0,1 ou 2, NR onde R é H ou CpCio alquilo, e em que todos os referidos radicais podem ser opcionalmente substituídos por um ou mais substituintes escolhidos a partir de CpCio alquilo, halogéneo e trifluoralquilo,

Rj é metilo, R2 é C1-C4 alquilo, C2-C4 alcenilo, C2-C4 alcinilo e haloalquilo de 1 a 4 átomos de carbono, e R3 é amino, alquilamina de 1 a 4 átomos de carbono, hidroxilo, alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, tetrazole, ou tetrazoloamina, ou aminoácido natural.

Ainda uma outra concretização da presente invenção é um composto de fórmula (I) como acima representado em que X é um grupo alquileno com 3 a 5 átomos de carbono e que pode ser opcionalmente substituído por um ou mais C1-C3 alquilo, um grupo de fórmula -(CH2)kQ(CH2)l- onde k é 2 ou 3,1 é 1 ou 2 e Q é O, Se, S(0)z onde z é 0,1 ou 2 -8-

Rj é metilo, R2 é um radical alquilo de 1 a 4 átomos de carbono; e R3 é amino, alquilamina de 1 a 4 átomos de carbono, hidroxilo, um grupo alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono. A presente invenção inclui compostos de fórmula (I) na forma de sais, em particular sais de adição de ácidos. Sais adequados incluem aqueles formados quer com ácidos orgânicos quer com ácidos inorgânicos. Tais sais de adição de ácidos irão normalmente ser farmaceuticamente aceitáveis, embora os sais farmaceuticamente não aceitáveis possam ter utilidade na preparação e purificação do composto em questão. Deste modo, os sais preferidos incluem aqueles formados a partir dos ácidos clorídrico, bromídrico, sulfurico, cítrico, tartárico, fosfórico, láctico, pirúvico, acético, succínico, oxálico, fumárico, maleico, oxaloacético, metanossulfónico, etanossulfónico, p-toluenossulfónico, benzenossulfónico e isetiónico. Os sais dos compostos de fórmula (I) pode ser feitos por reacção do composto apropriado na forma da base livre com o ácido apropriado.

Conquanto seja possível que os compostos de fórmula (I) possam ser administrados como um químico puro, é preferível a sua apresentação como uma formulação farmacêutica. De acordo com um aspecto adicional, a presente invenção fornece uma formulação farmacêutica compreendendo um composto de fórmula (I) ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável, em conjunto com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis e opcionalmente um ou mais ingredientes terapêuticos diferentes. O(s) veículo(s) tem de ser “aceitável” no sentido em que deve ser compatível com outros ingredientes da formulação e não ser prejudicial ao seu recipiente. -9-

As formulações incluem as adequadas para administração oral, parenteral (incluindo subcutânea, intradérmica, intramuscular, intravenosa e intra-articular), rectal e tópica (incluindo dérmica, bucal, sublingual e intra-ocular), embora a via mais adequada possa depender, por exemplo, do estado e distúrbio do recipiente. As formulações podem ser convenientemente apresentadas numa forma unitária de dosagem e podem ser preparadas através de quaisquer dos métodos bem conhecidos na técnica farmacêutica. Todos os métodos incluem o passo de colocar em contacto um composto de fórmula (I) ou um seu sal ou solvato farmaceuticamente aceitável (“ingrediente activo”) com um veículo que constitua um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as formulações são preparadas colocando uniforme e intimamente em contacto o ingrediente activo com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos e então, se necessário, moldar o produto na formulação desejada.

As formulações da presente invenção adequadas para administração oral podem ser apresentadas como unidades discretas, tais como cápsulas, hóstias ou comprimidos, cada qual contendo uma quantidade predeterminada do ingrediente activo; como um pó ou grânulos; como uma solução ou uma suspensão num líquido aquoso ou um líquido não-aquoso; ou como uma emulsão líquida de óleo em água ou uma emulsão líquida de água em óleo. O ingrediente activo pode também ser apresentado como um bólus, electuário ou pasta.

Um comprimido pode ser feito por compressão ou moldagem, opcionalmente com um ou mais ingredientes acessórios. Os comprimidos feitos por compressão podem ser preparados por compressão numa máquina adequada do ingrediente activo numa forma de fluxo livre tal como um pó ou grânulos, opcionalmente misturados com um agente ligante, lubrificante, diluente inerte, tensioactivo ou dispersante. Os comprimidos feitos por moldagem podem ser preparados por moldagem numa máquina adequada de uma mistura do composto pulverizado humedecido com um diluente líquido inerte. Os comprimidos podem -10- ser opcionalmente revestidos ou entalhados e podem ser formulados de modo a proporcionar uma libertação lenta ou controlada do ingrediente activo.

As formulações para administração parenteral incluem soluções injectáveis estéreis aquosas e não-aquosas, as quais podem conter anti-oxidantes, tampões, bacteriostatos e solutos que tomem a formulação isotónica com o sangue do recipiente pretendido; e suspensões aquosas e não-aquosas que podem incluir agentes de suspensão e agentes espessantes. As formulações podem ser apresentadas em recipientes de dose unitária ou multi-dose, por exemplo ampolas ou frascos selados, e podem ser guardados num estado liofilizado, necessitando apenas a adição do veículo líquido estéril, por exemplo, água salina, água para injectáveis, imediatamente antes da sua utilização. Soluções e suspensões para injecção extemporânea podem ser preparadas a partir de pós, grânulos e comprimidos estéreis do tipo previamente descrito.

As formulações para administração rectal podem ser apresentadas como um supositório com os veículos usuais tais como manteiga de cacau ou polietilenoglicol.

As formulações para administração tópica na boca, por exemplo bucalmente ou sublingualmente, incluem pastilhas compreendendo o ingrediente activo numa base aromatizada tal como sacarose e acácia ou tragacanta, e pastilhas compreendendo o ingrediente activo numa base tal como gelatina e glicerina ou sacarose e acácia.

Formulações de dosagem unitária preferidas são aquelas contendo uma dose efectiva, como abaixo definido, ou uma sua ffacção apropriada, do ingrediente activo..

Deverá ser compreendido que em adição ao ingredientes particulares acima mencionados, as formulações desta invenção podem incluir outros agentes convencionais na técnica tendo em conta o tipo de formulação em questão, por exemplo, aqueles adequados para administração oral podem incluir agentes aromatizantes.

Os compostos da invenção podem ser administrados oralmente ou através de injecção com uma dose de 0,1 a 500 mg/kg por dia. A gama de dosagem para humanos adultos é geralmente de 5 mg a 2 g/dia. Os comprimidos ou outras formas de apresentação fornecidas em unidades discretas podem convenientemente conter uma quantidade de composto da invenção que seja efectiva em tal dosagem ou como um múltiplo do mesmo, por exemplo, unidades contendo 5 mg a 500 mg, usualmente à volta de 10 mg a 200 mg.

Os compostos de fórmula (I) são preferivelmente administrados oralmente ou através de injecção (intravenosa ou subcutânea). A quantidade precisa de composto administrado a um paciente irá ser da responsabilidade do médico assistente. No entanto, a dose utilizada irá depender de vários factores, incluindo a idade e sexo do paciente, o distúrbio específico a ser tratado e à sua gravidade. Adicionalmente, a via de administração pode variar dependendo do estado e da sua gravidade.

Como aqui utilizado, o termo “Q-Qo alquilo”, sozinho ou em combinação, denomina um radical alquilo acíclico contendo de 1 a 10, preferivelmente de 1 a 8 átomos de carbono e mais preferivelmente de 1 a 6 átomos de carbono. Exemplos de tais radicais incluem metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, iso-amilo, hexilo, octilo e similares. - 12- O termo “C2-C10 alcenilo” referese a um radical hidrocarboneto acíclico insaturado, de modo a que contenha pelo menos uma ligação dupla. Tais radicais contêm de 2 a 10 átomos de carbono, preferivelmente de 2 a 8 átomos de carbono e mais preferivelmente de 2 a 6 átomos de carbono. Exemplos de radicais alcenilo adequados incluem propilenilo, buten-l-ilo, isobutenilo, pentilen-l-ilo, 2-metilbuten-l-ilo, 3-metilbuten-l-ilo, hexen-l-ilo, hepten-l-ilo, e octen-l-ilo, e similares. O termo “C2-C10 alcinilo” referese a um radical hidrocarboneto acíclico insaturado, de modo a que contenha pelo menos uma ligação tripla, contendo tais radicais de 2 a 10 átomos de carbono, preferivelmente de 2 a 8 átomos de carbono e mais preferivelmente de 2 a 6 átomos de carbono. Exemplos de radicais alcinilo adequados incluem etinilo, propinilo, butin-l-ilo, butin-2-ilo, pentin-l-ilo, pentin-2-ilo, 3-metilbutin-l-ilo, hexin-l-ilo, hexin-2-ilo, hexin-3-ilo, 3,3-dimetilbutin-l-ilo, e similares. O termo “halogéneo” denomina flúor, cloro, bromo ou iodo. O termo aminoácido denomina um ácido amino alcanóico em que o amino pode ser collocado em qualquer ponto do grupo alquilo. O alquilo é como acima definido. O termo “pró-fármaco” referese a um composto que se toma mais activo in vivo.

Como aqui utilizado, pretende-se que a referência a “tratamento” do paciente inclua a profilaxia. E divulgado um processo sintético geral útil na preparação dos compostos da presente invenção.

- 13 -ESQUEMA I

f 1. NaNISilCHjlj ]2

2. CH3I 3. HC1

- 14-ESQUEMAII

1. C11CO3 2. acetimidato de etilo

NH

H NHj

OH

O

- 15-ESQUEMA III

(CjHjfeNSKCH,), (NH«)jS04

[Si(CH,)s]jN

OSÍ(CHj)j »1

in THF -10°C r

NaN{Si(CH3)j)2 R1

nh3 _ OH

HjN'

O 1 .Boc-NH(CHj)4Br [Si (CHj) j ] aH2.4N HC1/ dioxano

OSiíCHj), 1. CaCO,2. acetimidato de etilo NB, H3

NB

N

OH

B

O

- 16-ESQUEMAIV

j 5N HC1

HjC^ 2. acetimidato de etilo 1. CuC03 }ÍH2 H2N CH,0

CHjOH OH

OH

ESQUEMA V (C2H5)2NSi(CH3)3

[SKCHaíafeN OSi(CH3)3 (NH4)2S04 N[SI(CH3y2 em THF -10° c

NaN[Si(CH3)3]2

H3C A,

H NHj

OH O - 18- - 18-

\ A invenção é adicionalmente ilustrada pelos exemplos que se seguem: EXEMPLO 1 α-Metil-1 -Νδ-iminoetil-omitina

Foi dissolvido cloridrato de a-metil-D,L-omitina (250 mg, 1,37 mmole, adquirido da Sigma) em 5 ml de água e foi adicionado 0,5 g de carbonato cúprico. A mistura foi agitada a 60 °C durante 1 hora e filtrada. O pH do filtrado foi ajustado a pH 9,5 com uma solução de NaOH 0,5N. Foi adicionado cloridrato de acetimidato de etilo (178 mg, 1,45 mmole) e o pH foi mantido a 9,0-9,5 durante uma hora. A solução foi então ajustada a pH 7,5 e mantida à temperatura ambiente durante 12 horas. A solução foi acidificada com HC1 IN a pH 4 e colocada numa coluna Dowex 50 X 4 (forma de hidrogénio). A coluna foi lavada com água e de seguida com piridina 10%. O a-metil-NÔ-iminoetil-omitina foi eluído da coluna com NH4OH IN. As fracções com ninhidrina foram combinadas e liofilizadas. O resíduo foi dissolvido em ácido clorídrico 0,5N aquoso e re-liofilizadas. O cloridrato de a-metil-Nô-iminoetil-omitina foi isolado como um sólido branco. (MH+ = 188); ‘H-NMR (D20): δ 1,4 (s, 3H), 1,45-1,9 (m, 4H), 2,15 (s, 3H), 3,3 (t, 2H). - 19- EXEMPLO 2 α-Metil-1 -Νε-iminoetil-lisina

Uma suspensão de dicloridrato do éster etilo de lisina (33 g, 0,14 mole) e MgSC>4 (34 g, 0,28 mole) numa solução de 4-cloro-benzaldeído (39 g, 0,28 mole) e acetonitrilo (500 ml) foi agitada, enquanto de adicionou N,N-di-isopropiletilamina (36 g, 0,28 mole) em pequenas porções ao longo de XA hora. A mistura foi agitada durante 12 horas, filtrada, concentrada a um pequeno volume, e diluída com 500 ml de éter etílico. A solução etérea foi lavada com NaHCC>3 0,1% aquosa, NaOH 2N aquoso contendo 2g/100 ml de NH2OH.HCI, novamente com NaHCC>3 0,1% aquoso e NaCl saturado aquoso. Após secar com MgS04 e remover o solvente em vácuo, foi obtido N,N’-di(4-cloro-fenilmetileno)-L-alanina de etilo como um líquido límpido. O líquido foi triturado com hexanos e o sólido resultante foi lavado com hexanos várias vezes. Este intermediário parcialmente purificado foi dissolvido em 200 ml de THF e agitado num banho de de acetona/anidrido carbónico. Foi adicionado bis-(trimetilsilil)amideto de sódio em THF (11 ml, solução 1M) gota a gota ao longo de 30 minutos. Após 1 hora, foi adicionado iodeto de metilo (0,8 g, 13 mmole) em THF gota a gota. A mistura reaccional foi lentamente aquecida à temperatura ambiente e agitada durante a noite. A mistura foi diluída com água e extraída com éter etílico. O extracto etéreo foi lavado com NaHC03 0,1% aquoso e NaCl saturado aquoso e concentrado para se obter N,N’-di(4-cloro-fenilmetileno)-a-metil-D,L-alanina de etilo em bruto (M+H = 434). Este produto (4 g) foi dissolvido em éter etílico (100 -20- **&Β**=*ψ^ afse^m ml) e agitado vigorosamente com HC1 IN (50 ml) durante 2 horas, as fases separadas e a fase aquosa foi lavada com éter etílico. A solução aquosa foi adicionalmente acidificada pela adição de HC1 concentrado a 6N e foi aquecida em refluxo durante 16 horas. A solução foi arrefecida à temperatura ambiente e evaporada num evaporador rotativo à secura. O resíduo foi dissolvido em água e colocado numa coluna Dowex 50 X 4 (forma hidrogénio). A coluna foi lavada com água e de seguida com piridina 10%. O a-metil-D,L-lisina (MH+ H = 161) foi eluído da coluna com NH4OH 1M. O a-metil-D,L-lisina (300 mg) foi dissolvido em água e foi adicionado 0,5 g de carbonato cúprico. A suspensão foi agitada a 600 G durante 1 hora e filtrada. O filtrado foi ajustado a pH 9,5 e foi adicionado acetimidato de etilo em pequenas porções durante 15 minutos. O pH foi mantido entre 9,0 e 9,5. Após 1 hora de agitação à temperatura ambiente, a solução foi ajustada a pH 7 e a agitação foi mantida durante a noite. O oc-metil-D,L-lisina foi purificado por cromatografia em Dowex 50X4 (forma hidrogénio) similarmente descrita para a-metil-Nô-iminoetil-omitina. MH+ = 202; 'H-NMR (D20): δ 1,4 (s, 3H), 1,5-1,8 (m, 6H), 2,05 (s, 3H), 3,1 (t, 2H). EXEMPLO 3 Νε-iminoetil-aminoetilselenocisteína

Seleno-D,L-cistina (117 mg, 0,5 mmole, adquirido à Sigma) foi suspenso em 15 ml de água purgada com azoto gasoso. Foi adicionado boro-hidreto de sódio (38 mg, 1 mmole). A mistura reaccional tomou-se límpida ao fim de alguns minutos. Após 2 horas À temperatura ambiente, foi adicionado cloridrato de 2-bromoetilamina (1,2 g, 6 mmole) e a mistura reaccional foi agitada durante 12 horas. A reacção foi colocada numa coluna Dowex 50X4 (forma hidrogénio). A coluna foi lavada com água e piridina 10%. O 2-aminoetil-D,L-seleno-cisteína foi eluído com NH4OH 1M e, subsequentemente, tratado com carbonato cúprico e acetimidato de etilo conforme descrito para ο Νδ-iminoetil-omitina. O Nciminoetil-aminoetilselenocisteína foi obtido como um sólido amarelo pálido. MH+ = 254. EXEMPLO 4 a-Hidroxi-Ns-iminoetil-lisina

A uma mistura gelada em agitação de Νε-Cbz-L-lisina (14 g, 0,05 mole, adquirido à Sigma) em NaOH 2,5N (24 ml), foi gradualmente adicionado cloreto de benzoílo (10 g). O pH da solução foi mantido entre 10,5-10,9 pela adição de NaOH 2N. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 1 hora e filtrada. O filtrado foi extraído com uma pequena quantidade de acetato de etilo e a fase orgânica foi seca sobre sulfato de sódio. O sólido foi removido por filtração e filtrado foi evaporado à secura. O óleo em puro remanescente, Νε-Cbz-Na-benzoil-lisisna (6 g), foi aquecido a 90-100 °C com anidrido acético (100 ml) durante 30 minutos. A mistura foi então evaporada. O resíduo foi dissolvido em piridina e tratado com formaldeído aquoso (solução a 35%, Fisher). A mistura foi agitada durante 8 horas e de seguida diluída. A mistura

reaccional foi mantida a 100 °C durante a noite, o produto em bruto precipitado foi hidrolisado em HC1 5N a ferver durante 5 horas. A mistura reaccional foi arrefecida e filtrada antes de ser evaporada. O resíduo sólido foi dissolvido em água e passado através de uma coluna Dowex 50X4 (forma hidrogénio). O a-Hidroximetil-D,L-lisina (MH+ = 177) foi eluído com NH4OH IN e, subsequentemente, tratado com carbonato cúprico e acetimidato de etilo para formar a-hidroximetil-Ne-iminoetil-lisina similarmente descrito para a-metil-Νδ-iminoetil-omitina. MH+ = 218. 'H-NMR (D2O): δ 1,1-1,8 (m, 6H), 2,1 (s, 3H), 3,1 (t,2H); 3,6-3,9 (q(a,b),2H). A actividade dos compostos acima listados como inibidores da NO sintase foi determinada nos seguintes ensaios:

Ensaio de Citrulina para a Sintetase do Óxido Nítrico A actividade da óxido nítrico sintase foi medida através da monitorização da conversão de [ H]-arginina em [ H]-citrulina. A óxido nítrico sintase indutível de ratinho (miNOS) foi preparada a partir de um extracto de células RAW 264.7 tratadas com LPS e parcialmente purificadas por cromatografia DEAE-Sefarose. A óxido nítrico sintase constitutiva de cérebro de ratinho (mNOS) foi preparada a partir de um extracto de cerebelo de ratinho e parcialmente purificada por cromatografia DEAE-Sefarose. A enzima e inibidores foram incubados a 37 °C durante 15 minutos num volume de reacção de 100 μΐ com os seguintes componentes adicionados no início da reacção: Trois 50 mM (pH 7,6), albumina de soro bovino 1 mg/ml, DTT 1 mM, CaCl2 2 mM, FAD 10 μΜ, tetra-hidrobiopterina 10 μΜ, L-arginina 30 μΜ contendo L-[2,3-3H]-arginina a 300 cpm/pmole e NADPH 1 mM. No caso da NOS constitutiva foi também adicionado calmodulina 50 nM. A reacção foi terminada pela adição de tampão de terminação frio contendo EGTA 10 mM, HEPES 100 mM, pH 5,5 e Λ φ citrulina 1 mM. A [ H]-citrulina foi separada por cromatografia numa resina de permuta catiónica Dowex 50W X-8 e a radioactividade determinada por um contador de cintilação líquida. A óxido nítrico sintase indutível recombinante humana (hiNOS) foi extraída a partir de células Sf9 de insectos (infectados com baculovírus recombinantes codificando um cADN para a óxido nítrico sintase indutível que tinha sido isolada e purificada a partir de uma biblioteca de cADN lambda Zapll feita a partir de ARN isolado de uma amostra de cólon de um paciente com colite ulcerativa) e parcialmente purificada por cromatografia DEAE.

Ensaio Nitrito em Células Raw Células RAW 264.7 foram colocadas até confluência numa placa de cultura de tecidos de 96 cavidades, desenvolvida durante a noite (17 horas) na presença de LPS para induzir NOS. Uma fila de 3-6 cavidades foi deixada sem tratamento e serviu como controlo para a subtracção dos resultados não específicos. 0 meio foi removido de cada cavidade e as células lavadas duas vezes com Krebs-Ringers-Hepes (25 mM, pH 7,4) com glicose 2 mg/ml. As células são então colocadas em gelo e incubadas com 50 μΐ de tampão contendo L-arginina (30 μΜ) +/- inibidores durante 1 hora. O ensaio é iniciado por aquecimento da placa a 37 °C numa banho de água durante 1 hora. A produção de nitrito por iNOS intracelular é linear com o tempo. Para terminar o ensaio celular, a placa de células é colocada em gelo e o tampão contendo nitrito removido e analisado sobre o nitrito usando uma determinação por fluorescência previamente publicada. Todos os valores são a média de cavidades triplicadas e são comparados com um conjunto de células induzidas subtraído do resultado não específico (valor 100%). LPS é uma abreviatura para lipopolissacarídeo. -24-

TABELAI

Composto Célula ΓμΜΙ hiNOS IC50 ΓμΜΙ miNOS mNOS Exemplo 1 73,5 34,9 355,9 35,0 Exemplo 2 36,6 7,2 192,8 52,5 Exemplo 3 35,5 5,0 229,0 0,37 Exemplo 4 39% Inib. 8,6% Inib. a 10 μΜ a 10 μΜ

Lisboa, 7 de Janeiro de 2000

Λ

Agente RUA

JORGE CRUZ Oficial da Propriedade Industrial VICTOR CORDON, 14 J 1200 LISBOA

Claims

- 1

REIVINDICAÇÕES 1. Um Composto com a fórmula:

(I) e seus sais, ésteres e pró-fármacos farmaceuticamente aceitáveis, em que X é C1-C10 alquilo, C2-Ci0 alcenilo, C2-Cio alcinilo, -(CH2)kQ(CH2)l- onde k é 2 ou 3,1 é 1 ou 2 e Q é O, Se, SiY2 onde Y é CrCl0 alquilo, S(0)z onde z é 0, 1 ou 2, NR onde R é hidrogénio ou Ci-Cio alquilo, e em que todos os referidos radicais podem ser opcionalmente substituídos por um ou mais substituintes escolhidos a partir de Ci-Cio alquilo, halogéneo e trifluoralquilo, Ri é hidrogénio (quando Q é Se), Ci-Qo alquilo ou hidroxialquilo, R2 é CrCio alquilo, C2-Cio alcenilo, C2-Ci0 alcinilo ou haloalquilo, e R3 é amino, alquilamina, aminoácido, hidroxilo, C1-C4 alcoxilo, tetrazole, ou tetrazoloamina. -2-
2. O composto conforme reivindicado na reivindicação 1 em que X é CrCio alquilo, C2-C10 alcenilo, C2-C10 alcinilo, -(CH2)kQ(CH2)l- onde k é 2 ou 3, 1 é 1 ou 2 e Q é O, Se, S1Y2 onde Y é CpCio alquilo, S(0)z onde z é 0,1 ou 2, NR onde R é hidrogénio ou Cj-Cio alquilo, em que todos os referidos radicais podem ser opcionalmente substituídos por um ou mais substituintes escolhidos a partir de Q-Cio alquilo, halogéneo e trifluoralquilo, Ri é metilo, R2 é CpCio alquilo, C2-C10 alcenilo, C2-Ci0 alcinilo e haloalquilo, e R3 é amino, alquilamina, aminoácido natural, hidroxilo, C2-C4 alcoxilo, tetrazole, ou tetrazoloamina.
3. O composto conforme reivindicado na reivindicação 1 em que X é Ci-C6 alquilo, Ci-C6 alcenilo, Ci-Cõ alcinilo de 1 a 6 átomos de carbono, -(CH2)kQ(CH2)l- onde k é 2 ou 3,1 é 1 ou 2 e Q é O, Se, SiY2 onde Y é Ci-Cio alquilo, S(0)z onde z é 0, 1 ou 2, NR onde R é H ou C1-C10 alquilo, e em que todos os referidos radicais podem ser opcionalmente substituídos por um ou mais substituintes escolhidos a partir de CrCio alquilo, halogéneo e trifluoralquilo, -3- R] é metilo, R2 é C1-C4 alquilo, C2-C4 alcenilo, C2-C4 alcinilo e haloalquilo de 1 a 4 átomos de carbono, e R3 é amino, alquilamina de 1 a 4 átomos de carbono, hidroxilo, alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono, tetrazole, ou tetrazoloamina, ou aminoácido natural.
4. O composto conforme reivindicado na reivindicação 1 em que X é um grupo alquileno com 3 a 5 átomos de carbono e que pode ser opcionalmente substituído por um ou mais C|-C3 alquilo, um grupo de fórmula -(CH2)kQ(CH2)l- onde k é 2 ou 3,1 é 1 ou 2 e Q é O, Se, S(0)z onde z é 0, 1 ou 2 Ri é metilo, R2 é um radical alquilo de 1 a 4 átomos de carbono; e R3 é amino, alquilamina de 1 a 4 átomos de carbono, hidroxilo, um grupo alcoxilo de 1 a 4 átomos de carbono.
5. O composto conforme reivindicado na reivindicação 1 escolhido a partir do grupo consistindo em a-metil-NÔ-iminoetil-omitina, a-metil-Ns-iminoetil-lisina, a-metil-NE-iminoetil-aminoetil-selenocisteína e a-hidroximetil-Ns-iminoetil-lisina. -4-
6. Uma composição farmacêutica compreendendo um composto conforme reivindicado nas reivindicações 1 a 5 em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável.
7. O uso do composto conforme reivindicado na Reivindicação 1, 2, 3, 4 ou 5 para preparar um medicamento para inibir a síntese do óxido nítrico em um sujeito com necessidade de tal inibição. Lisboa, 7 de Janeiro de 2000

Agente Oficial da Propriedade Industrial RUA VICTOR CORDON, 14 1200 LISBOA