PT747471E

PT747471E - Composicoes de celulase tratadas com protease e purificadas e metodos para reduzir a contaminacao das cores durante a lavegem com pedras enzimatica

Info

Publication number: PT747471E
Application number: PT96304044T
Authority: PT
Inventors: Brian Foody; Colin Nicholson; Jeffrey Tolan; Theresa White
Original assignee: Iogen Corp
Priority date: 1995-06-06
Filing date: 1996-06-04
Publication date: 2001-01-31
Also published as: US5916799A; CA2177632A1; ES2150636T3; IN189444B; CN1076770C; KR970001535A; EP0747471B1; EP0747471A1; BR9602651A; CN1144288A; DK0747471T3; DE69609774D1; CA2177632C; US5700686A; KR100449435B1; DE69609774T2; JPH09117280A; AR002358A1; MX9602200A

Description

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DESCRIÇÃO "COMPOSIÇÕES DE CELULASE TRATADAS COM PROTEASE E PURIFICADAS E MÉTODOS PARA REDUZIR A CONTAMINAÇÃO DAS CORES DURANTE A LAVAGEM COM PEDRAS ENZIMÁTICA"

Esta invenção refere-se a composições e métodos para reduzir e evitar a contaminação pela tinta índigo do denim durante a lavagem com pedras ("stonewashing") do tecido denim e peças de vestuário denim utilizando enzimas celulase. O denim é um pano de tecido de algodão em que o fio da urdidura foi tingido, normalmente de azul, com a tinta índigo. Uma característica desejável do tecido denim tingido de índigo, é o aspecto criado pela alternância entre fios azuis e brancos da urdidura e fios da trama, que com o desgaste e rasgões normais, confere ao denim uma aparência de branco sobre azul. Um aspecto popular do denim é o aspecto de lavado com pedras (stonewashed). Este aspecto de lavado com pedras consiste num azul geralmente mais claro do que o denim não lavado, apresentando áreas localizadas, em especial à volta das costuras, com uma cor ainda mais clara. O material sujeito a lavagem com pedras tem ffequentemente uma textura mais macia e mantém o contraste pretendido do branco sobre o azul. Tradícionalmente, a lavagem com pedras tem sido realizada pelo acto de lavar o material denim na presença de pedras-pomes, cujo resultado é um tecido com um aspecto sumido ou usado e com o contraste branco sobre azul descrito anteriormente.

As enzimas, em particular as celulases, são actualmente utilizadas no processamento do denim. Utiliza-se em particular as celulases para conferir ao denim um aspecto de lavado com pedras, sem a necessidade de utilizar uma carga tão elevada de pedras- pomes como a da utilizada na lavagem com pedras tradicional. Este método de processamento é aqui referido como "Lavagem com pedras" enzimático, mesmo que não existam pedras na máquina de lavar. A utilização de enzimas no processo da lavagem com pedras tem-se tomado cada vez mais popular, pois a utilização de pedras acarreta várias desvantagens. Por exemplo, as pedras utilizadas no processo provocam estragos na maquinaria, problemas de resíduos ambientais devido às partículas silicosas produzidas, e têm por resultado um aumento dos custos com o pessoal, associado à remoção manual das pedras das máquinas e dos bolsos das peças de vestuário. Por consequência, é possível que a redução ou a eliminação de pedras na lavagem seja algo desejável.

Ao contrário da utilização de pedras-pomes, as enzimas (em particular as celulases) são seguras para a máquina, provocando poucos ou praticamente nenhuns problemas de resíduos e reduzindo drasticamente os custos com o pessoal. Por este motivo, é possível que a utilização de enzimas traga benefícios na lavagem com pedras. No entanto, embora esta utilização de enzimas, tais como a celulase, possa trazer benefícios em comparação com as pedras, existem alguns problemas associados à utilização de enzimas para este fim. Por exemplo, um problema com algumas celulases, como as celulases do fungo de apodrecimento da madeira Trichoderma, é aquilo a que poder-se-á chamar "redeposição" ou "contaminação das cores" (ambos os termos utilizados aqui reciprocamente), em que a tinta volta a depor-se sobre o tecido durante o processo enzimático de lavagem com pedras. Esta redeposição ou contaminação das cores provoca uma coloração azul sobre os fios brancos do denim, resultando num menor contraste entre os fios brancos e os azuis e pontos de abrasão (ou seja, um aspecto de azul sobre azul em vez do preferido branco sobre azul). Ver American Dyestuff Repórter, Setembro 1990, pág. 24-28. A redeposição ou a contaminação das cores tem inconvenientes para alguns utilizadores. Por exemplo, embora as celulases Trichoderma apresentem uma actividade específica sobre o material denim muito mais elevada do que as celulases de Humicola, as celulases de Humicola são muitas vezes preferidas por provocarem um nível mais baixo de contaminação das cores. Isto acontece, embora a potência muito maior da celulase Trichoderma permita utilizar quantidades mais reduzidas de enzima para atingir um nível de abrasão superior com tempos de processamento significativamente menores. O problema da redeposição da tinta durante a lavagem com pedras tem sido uma preocupação dos processadores do denim. Tentativas anteriores de abordar o problema com as composições de celulase Trichoderma incluem a adição de produtos químicos extra anti-redeposição, tais como os surfactantes ou outros agentes, na lavagem com celulase para ajudar a dispersar a tinta índigo solta e reduzir a redeposição. Para além disso, os processadores do denim tentaram utilizar celulases com uma actividade menos específica sobre o denim, juntamente com enxaguamentos extra. Isto resulta em adicionais custos químicos e em maiores tempos de processamento. Outro método na tentativa de abordar o problema da redeposição inclui adicionar ao processo um agente branqueador leve ou um agente de remoção de manchas. Este método afecta o tom final da peça de vestuário e aumenta o tempo de processamento

Embora estes métodos ajudem até a um determinado grau a reduzir a redeposição, não são inteiramente satisfatórios, permanecendo alguma contaminação das cores indesejada. A utilização conjunta de enzimas e pedras poderá ser vantajosa na redução do nível de redeposição. No entanto, o processador fica com alguns dos problemas associados à utilização só das pedras.

Outro método, como descrito por Clarkson et al na PCT Publication No. WO 94/29426 (seguidamente designada por "Clarkson et al") tem sido o de incluir uma enzima protease adicionada ao tratamento de lavagem com pedras. Descobriu-se que o tratamento do denim com uma composição contendo uma celulase de redeposição e uma protease adicionada melhora o contraste entre fios azuis e brancos e reduz a redeposição da tinta. Ao actuarem na máquina de lavar, considera-se que as proteases evitam de alguma forma que as proteínas celulase voltem a ligar as partículas de cor novamente à superfície do denim e, no entanto, quando utilizadas com moderação não exercem um forte efeito adverso sobre o aspecto abradado originado pela acção da celulase. Este 4

método, embora tendo algumas vantagens, tem custos elevados e exige um controlo rigoroso, pois as proteases tendem, por natureza, a destruir as enzimas celulase. E necessário que o profissional defina um equilíbrio entre o efeito proteolítico pretendido na redução da contaminação das cores e o efeito proteolítico indesejável na redução da actividade da celulase.

No processo de Clarkson et al, a protease é utilizada essencialmente como agente de remoção de manchas ou como inibidor de tingidura e deve ser incluída no processo de lavagem. Clarkson et all descrevem três opções; (1) adicionar a protease directamente à máquina de lavar com a enzima celulase, (2) adicionar a protease ao ciclo de enxaguamento após um tratamento com celulase, ou (3) juntar a protease à celulase antes da lavagem. Relativamente ao processo básico de juntar a protease e a celulase, o acto de adicionar a protease ao ciclo de enxaguamento evita um ataque proteolítico significativo sobre a celulase, mas tem a desvantagem de adicionar uma etapa extra de processamento. Por outro lado, a mistura prévia da celulase com a protease contribui para uma formulação fácil de usar, mas resulta num equilíbrio difícil entre o efeito proteolítico pretendido na remoção das manchas e o efeito proteolítico indesejável de destruição da actividade da celulase. Por exemplo, uma protease altamente activa poderá destruir completamente a enzima celulase durante o tempo que normalmente decorre para o armazenamento e transporte. Este problema de estabilidade na armazenagem pode ser resolvido mas requer: (1) a selecção de uma protease com um bom poder anti-tingimento, mas que no máximo só possa digerir a celulase até a um determinado ponto (as subtilisinas que não são altamente activas contra a celulase, mas que são muito conhecidas por serem poderosos agentes de remoção de manchas constituem uma escolha preferida), e (2) uma pré-incubação da protease e da celulase seleccionadas a uma temperatura elevada, de modo a assegurar que o ataque proteolítico exercido sobre a celulase chegue ao fim, e que uma formulação comercial permaneça estável durante a armazenagem e o transporte. A acção de proteases mais fortes, em particular da protease papaína sobre as celulase Trichoderma, foi investigada a fundo. Descobriu-se que quantidades limitadas de 5

digestão de papaína poderão separar os domínios do núcleo de celobiohidrolases Trichoderma dos respectivos domínios de ligação naturais. Isto produz o efeito de eliminar essencialmente qualquer actividade mensurável que estas enzimas tenham contra a celulose cristalina como o Avicel ou o algodão, embora mantendo ainda a sua actividade contra os substractos solúveis tais como o β-glucano. Como resultado, os profissionais anteriores concluíram que o domínio de ligação natural desempenha um papel essencial no despoletar do ataque da enzima celobiohidrolase sobre a celulose cristalina. O nível de processamento necessário para a papaína eliminar completamente a actividade CBH sobre a celulose cristalina era grosso modo de 0,1 a 0,5 gramas de proteína papaína por grama de proteína celulase, tudo multiplicado pelo tempo de tratamento em minutos (g min/g), ou seja, relação de peso da proteína protease em relação à proteína celulase multiplicada pelo tempo de tratamento.

Com base nos fracos resultados dos métodos anteriormente experimentados para reduzir ou evitar a redeposição, existe a necessidade de conseguir métodos mais fáceis de controlar e mais favoráveis em termos de preço, para abordar esta questão da redeposição ou contaminação das cores pela tinta durante a lavagem com pedras.

De acordo com isto, o que se pretendia era descobrir uma composição ou método enzimático que fosse favorável em termos de custos, que tivesse uma boa estabilidade de armazenagem, uma grande potência e que não incluísse uma celulase de redeposição ou de contaminação das cores.

Os inventores da presente invenção ("os inventores") descobriram que a lavagem do denim de algodão tingido de índigo com uma composição de enzima celulase de baixa contaminação das cores, pelo acto de sujeitar uma celulase Trichoderma contendo as enzimas celobiohidrolase e endoglucanase para uma proteólise limitada (ou seja, um tratamento com protease limitado) e pelo acto de remover depois a protease adicionada, constitui uma melhoria face à utilização de uma preparação de celulase de redeposição ou uma que inclua uma celulase e uma protease. O denim produzido pelo tratamento com esta composição apresenta, inesperadamente, um reduzido nível de redeposição da 6 r

CS tinta e, assim, um bom contraste entre os fios brancos e azuis do denim. A composição é estável durante a armazenagem, necessita de um quantidade significativamente menor de protease do que os métodos anteriores e tem um nível surpreendentemente baixo de redeposição, embora a "composição inibidora da contaminação das cores" (ou seja, a protease), necessária de acordo com Clarkson et al, não esteja presente. Os inventores também criaram métodos para recuperar e reciclar a protease, de forma a ser possível reutilizar este ingrediente de elevado custo. No processo de lavagem do denim, é possível adicionar, opcionalmente, um pequena percentagem de surfactante químico activo na superfície às composições ou aos métodos aqui descritos. Se for adicionado um agente activo na superfície, este pode ser adicionado com a celulase à lavagem ou como um enxaguamento de pós-tratamento. Para além disso, o processo de lavagem do denim pode ser realizado com ou sem pedras adicionadas às composições aqui descritas. O denim que seja lavado com pedras com uma composição de enzima celulase Trichoderma, que tenha sido sujeita a um tratamento com protease limitado e à subsequente purificação para remover a protease, demonstra uma redução dramática no nível de contaminação das cores, e um aumento visível do contraste entre os fios azuis e brancos. Embora os inventores não queiram prender-se a uma teoria em particular, uma possível explicação para as observações aparentemente contraditórias de que, por um lado, a protease é necessária na máquina de lavar (Clarkson et al) e de que, por outro lado, não necessita de estar presente (esta invenção), é a de que existem dois mecanismos separados e distintos pelos quais as proteases poderão afectar a contaminação das cores num processo de lavagem do denim. O primeiro mecanismo é o descrito por Clarkson et al, em que a protease simplesmente actua como um agente de remoção de manchas na máquina de lavar. Este mecanismo é consistente com as descobertas de Clarkson de que as proteases são capazes de remover a tinta redepositada, mesmo depois de esta ter tingido o denim branco num tratamento anterior com celulase. Também é consistente com a bem conhecida utilização das proteases como agentes de remoção de manchas em sistemas de detergente. Não é então surpreendente, que as manchas de tinta originadas pelas proteínas celulase possam ser 7 7

removidas através de uma das abordagens bem conhecidas para tratar as manchas relacionadas com proteínas: proteases.

No entanto, relativamente a este primeiro mecanismo, os peritos na matéria não esperariam que as proteases fossem capazes de combater a contaminação das cores na máquina de lavar sem nunca serem postas na máquina de lavar. No intuito de explicar a surpreendente descoberta dos inventores de que afinal as proteases são capazes de fazer precisamente isso, os inventores sugerem a existência de um segundo mecanismo que é mais subtil e menos óbvio do que o primeiro. Em particular, os inventores acreditam que um tratamento com protease limitado modifica o modo de actuação das enzimas celulase, levando a que estas formem partículas pequenas e facilmente dispersas que não contaminam as cores. Embora tenha sido relatado, por exemplo, por Tomme, P., et al em [1988] Biochem,. Biophys. Res. Commun. 156, 180-185, de que as proteases podem tomar os componentes de celobiohidrolase presentes no complexo de enzimas celulase Trichoderma inactivos contra a celulose cristalina pela separação dos domínios de ligação naturais da celulose, os inventores colocam a hipótese de que este tratamento ainda poderá deixar as enzimas celobiohidrolase com a capacidade de fazer pequenos entalhes na celulose, que não são detectáveis por si só mas que, ao serem utilizadas em combinação com outros componentes no complexo de enzimas celulase Trichoderma, ou seja, as endoglucanases, levam a uma grande abrasão num ambiente de lavagem do denim. Os inventores sugerem ainda que, visto as celobiohidrolases modificadas não possuírem domínios de ligação, a sua acção contra a celulose cristalina é provavelmente menos localizada e encontra-se distribuída de forma mais homogénea nas fibras denim do que mediante tratamento com a celulase Trichoderma intacta. Para as enzimas celulase Trichoderma intactas, o seu modo de actuação altamente localizado poderia originar a libertação de partículas relativamente grandes do corpo principal da celulose, visto que as enzimas atravessam directamente as partes grandes da fibra. Em contraste com isso, o modo de actuação mais distribuído das composições de celulase Trichoderma tratadas com protease poderá originar partículas mais pequenas e mais fáceis de dispersar, que são libertas do corpo principal da celulose num ambiente em que há uma quantidade significativa de partilha ou mistura. Como resultado, ocorreria uma menor contaminação das cores.

Este segundo mecanismo, embora não reconhecido, estaria provavelmente a desempenhar um papel menor nos tratamentos combinados de celulase e protease descritos por Clarkson. Não era reconhecido, pois os profissionais anteriores empenharam-se em explorar a utilização mais óbvia da protease, que era a de remover manchas na máquina de lavar. Não foi explorado ao máximo porque, no caso de se planear fazer uma única composição enzimática comercial contendo tanto enzimas celulase como protease, toma-se difícil controlar eficazmente a reacção de proteólise. Nas próprias palavras de Clarkson, é difícil chegar a uma solução de compromisso, sendo necessário "chegar a um equilíbrio entre o efeito proteolítico de redução da contaminação das cores e o efeito proteolítico de redução da abrasão". Assim, de modo a criar uma composição enzimática combinada celulase/protease que possa ser adicionada directamente a uma máquina de lavar, os peritos na matéria iriam certamente querer evitar a utilização de proteases como a papaína, que são conhecidas por destruírem a actividade na celulose cristalina, em favor daquelas que são mais conhecidas pelas suas propriedades anti-tingimento em detergentes, por exemplo, a subtilisina.

Surpreendentemente, os inventores descobriram que se obtêm, em termos gerais, melhores resultados ao (1) prescindir dos benefícios deste primeiro mecanismo "anti-tingimento" (ou seja, pela remoção da protease da preparação enzimática e, assim, da lavagem do denim), e (2) tirar vantagem desta modificação para alterar as condições da reacção proteolítica, de modo a obter um tratamento mais forte e mais agressivo e, assim, maximizar o impacto do segundo mecanismo que anteriormente não era reconhecido. Em resumo, as novas composições resultantes desta abordagem permitem uma lavagem superior do denim e mais favorável em termos de custos.

Antes de descrever esta invenção mais em detalhe, serão definidos os seguintes termos. 9 ι (

§ 0 termo "composição de celulase Trichoderma" inclui pelo menos uma ou mais das enzimas celobiohidrolase (CBH), e uma ou mais das enzimas endoglucanase (EG) produzidas pelo microorganismo fúngico Trichoderma sp. Quando a composição é produzida por um microorganismo Trichoderma natural e quando cada um destes componentes se encontra na proporção produzida naturalmente pelo microorganismo, a composição é por vezes referida, de acordo com esta invenção, como uma "composição de celulase Trichoderma completa ou natural." E contemplada a hipótese de as composições de celulase Trichoderma da presente invenção também fazerem referência a qualquer composição de celulase contendo tanto uma celobiohidrolase como uma endoglucanase, que seja obtida a partir de uma Trichoderma sp. geneticamente modificada para sobreprodução, subprodução ou não produção de um ou mais dos componentes CBH e/ou EG da celulase. Estas endoglucanases ou celobiohidrolases poderão incluir não só enzimas que sejam uma parte da composição de enzimas celulase Trichoderma natural, mas também as composições de celulase modificadas como as proteínas celulase truncadas, incluindo o domínio de ligação ou o domínio de núcleo das CBHs ou EGs, ou uma porção ou derivados destas. Outros exemplos de composições de celulase modificadas poderão incluir alterações no grau de glicosilação, ou substituição(ões) de aminoácido(s) na estrutura primária das celulases ou das celulases truncadas. Também se contempla que quaisquer versões naturais ou modificadas de celulases Trichoderma naturais, tais como as referidas anteriormente, sejam consideradas composições de celulase Trichoderma, mesmo que sejam produzidas num microorganismo hospedeiro geneticamente modificado sem ser a Trichoderma. O termo "celulase Trichoderma tratada com protease" refere-se a uma composição de celulase Trichoderma, em que uma ffacção significativa dos domínios de núcleo CBH sofreram a separação dos respectivos domínios de ligação CBH, por exemplo, com o tratamento mediante uma enzima protease adicionada. As composições de celulase Trichoderma tratadas com protease não deveriam, no entanto, ter qualquer protease activa incremental ou residual detectável acima da quantidade que é produzida naturalmente pelo microorganismo.

Uma quantidade assim detectável deverá, por exemplo, ser inferior a 0,1% da quantidade total de proteína na composição de enzimas celulase.

Contempla-se que a composições de celulase tratadas com protease da presente invenção possam incluir ambas as preparações, em que se utiliza uma enzima protease adicionada para separar o núcleo CBH e os domínios de ligação, assim como composições de celulase modificadas, em que o domínio de núcleo CBH é produzido directamente sem o respectivo domínio de ligação por um microorganismo modificado geneticamente. No entanto, em quaisquer dos casos uma composição de celulase Trichoderma tratada com protease deverá conter actividade endoglucanase assim como proteína do núcleo de CBH.

Os métodos da presente invenção incluem pôr o denim em contacto, com vista a ser sujeito parcial ou totalmente à lavagem com pedras enzimática, com uma composição de celulase Trichoderma tratada com protease numa quantidade que seja suficiente para atingir o nível pretendido de remoção de tinta da peça de vestuário. A utilização de uma enzima destas irá originar uma peça de vestuário com um contraste excelente entre os fios azuis e brancos, e um nível baixo de contaminação das cores. A própria enzima apresentará uma boa estabilidade e não correrá o risco de uma degradação significativa pela protease.

Numa realização desta invenção, a composição de celulase Trichoderma tratada com protease é produzida pela junção de uma composição de celulase Trichoderma com uma enzima protease adicionada, em que a extensão do tratamento, como definida pela relação de peso da proteína protease em relação à proteína celulase multiplicada pelo tempo de tratamento médio, se encontra entre 1,0 g min/g e 10.000 g min/g. A protease é depois removida da celulase utilizando-se uma separação cromatográfica. Noutra realização desta invenção, a composição de celulase Trichoderma tratada com protease é adicionada a uma máquina de lavar com denim tingido de índigo, e utilizada para criar um aspecto abradado com um grande contraste entre as fibras azuis e brancas do denim. 11

Enzimas celulase

As composições de celulase Trichoderma são habitualmente produzidas numa cultura submergida do fungo Trichoderma, e os métodos para a sua produção e recuperação encontra-se bem documentados na literatura e são amplamente conhecidos pelos peritos na matéria. As fontes comerciais destas enzimas incluem a Iogen Corporation, a Genecor International, Novo Nordisk, Gist-Brocades, Sigma Chemicals e a Enzyme Development Corporation.

Uma das composições de celulase Trichoderma preferidas desta invenção é a produzida por estirpes do fungo Trichoderma longibrachiatum, em que as concentrações relativas das enzimas CBH1, CBH2, EG1, EG2 e EG3 são todas no essencial consistentes com o que se encontra numa composição de celulase Trichoderma completa ou natural.

As preparações de celulase comerciais não são feitas de 100% de proteína celulase, incluindo muitas vezes filtros, tampões, estabilizadores e outros ingredientes. A proteína celulase total pode ser medida através de vários métodos de ensaio conhecidos neste âmbito. O ensaio utilizado preferencialmente de acordo com a invenção, é o ensaio comercialmente disponível Biorad Coomassie Blue Protein vendido pela Biorad Company, Los Angels, utilizando proteína celulase altamente purificada como padrão.

Protease adicionada

As proteases são disponibilizadas por várias fontes, incluindo fontes microbianas, vegetais e animais, e encontram-se bem documentadas na literatura. Algumas fontes proteolíticas microbianas importantes incluem o Bacillus licheniformis, Bacillus subtilis e Aspergillus oryzae. Entre as fontes importantes de proteases vegetais encontram-se a papaia para a papaína e ananases para a bromelaína. Entre as proteases adequadas a esta invenção encontram-se a serina, a cisteína, o ácido aspártico e as metalo proteases. Uma das proteases preferidas é uma protease de cisteína, a papaína.

As proteases encontram-se comercialmente disponíveis através de empresas como a Sigma Chemicals sob uma série de formas diferentes, onde se incluem soluções

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líquidas, pós ou como enzimas insolúveis ligadas a suportes sólidos. Numa realização preferida desta invenção, a protease papaína é utilizada numa suspensão líquida.

As preparações de protease comerciais não são constituída por 100% de proteína protease, incluindo muitas vezes filtros, tampões, estabilizadores e outros ingredientes. O total de proteína protease pode ser medido por diferentes métodos de ensaio conhecidos neste âmbito. O ensaio utilizado preferencialmente de acordo com a invenção, é o ensaio comercialmente disponível Biorad Coomassie Blue Protein vendido pela Biorad Company, Los Angels.

Tratamento com protease O tratamento com protease limitado desta invenção inclui pôr uma composição de celulase Trichoderma líquida em contacto com uma protease adicionada sob condições controladas da reacção durante um período de tempo determinado. Um perito na matéria irá reconhecer que a extensão de tratamento apropriada irá depender da temperatura, pH, concentração escolhida para preparar a mistura e da actividade específica da enzima protease seleccionada, e irá ainda reconhecer que os procedimentos de teste de rotina poderão ser usados para escolher um conjunto óptimo de condições de processamento para uma determinada composição de celulase e protease adicionada.

Numa realização preferida, o tratamento com protease limitado é realizado a uma temperatura elevada entre os 20 °C e os 60 °C e, melhor ainda, entre os 30 °C e os 50 °C. Na realização mais preferida, é utilizada uma temperatura de cerca de 37 °C.

Numa realização preferida, o tratamento com protease limitado é realizado com um pH entre 3,0 e 8,0 e, melhor ainda, entre 4 e 7. Na realização mais preferida, o pH encontra-se entre 4 e 5.

Numa realização preferida, o tratamento com protease limitado é realizado com uma concentração de proteína celulase entre 5 e 250 g/1 e, mais preferencialmente, entre 50 e 200 g/1. Na realização mais preferida, a concentração de proteína celulase ronda 100 g/1.

Numa realização preferida, o tempo de tratamento com protease limitado vai de 5 minutos a quatro semanas e, mais preferencialmente, de uma a 120 horas. Na realização mais preferida, em que a protease é a papaína, o tempo de tratamento ronda entre 24 e 48 horas.

Numa realização preferida, a extensão do tratamento, como definida pela relação de peso da proteína protease em relação à proteína celulase multiplicada pelo tempo de tratamento médio, encontra-se entre 1,0 g min/g e 10.000 g min/g e, mais preferencialmente, entre 10 e l.OOOg min/g. Naquela realização que é a mais preferida em que a protease é a papaína, a extensão do tratamento ronda 200 g min/g. Mediante estas condições preferenciais, a concentração da papaína é de cerca de 14 gm/litro.

Um método preferido para seguir a evolução de uma reacção de proteólise, é o de utilizar um papel de filtro e ensaios CMC que medem respectivamente UPF e unidades CMC da actividade da celulase (Ghose 1987). De preferência, o tratamento com protease será realizado até ao ponto de a celulase perder pelo menos 5% da sua actividade inicial como medido em unidades de papel de filtro (UPF), e não mais do que 50% da sua actividade inicial como medido em unidades CMC. Ainda mais preferencialmente, a celulase deverá ser tratada ao ponto de perder pelo menos 10% das sua actividade de celulase inicial como medido em UPF, e de manter a sua actividade inicial fundamentalmente entre 70 e 100% como medido em unidades CMC. Ainda mais preferencialmente, a celulase deverá ser tratada ao ponto de perder cerca de 50% da sua actividade celulase inicial como medido em UPF e menos de 10% da sua actividade inicial como medido em unidades CMC.

Remoção e recuperação de protease O método desta invenção requer ainda que a reacção proteolítica seja interrompida ao atingir a extensão de tratamento pretendida, de modo a que não existam quantidades significativas de protease exógena a contaminar a composição de enzima celulase Trichoderma tratada com protease desta invenção. A reacção pode ser interrompida, por exemplo, através de arrefecimento ou ajuste do pH. Depois, a protease adicionada pode 14 β &χ |V..· Ρ .

I ser separada do complexo de celulase. Um perito na matéria irá reconhecer que há uma série de meios para remover de forma selectiva a protease adicionada de uma composição de enzima celulase Trichoderma, incluindo a separação cromotográfica, precipitação selectiva, ultrafiltração ou filtração (se for utilizada uma enzima insolúvel num suporte sólido). O método apropriado de remoção dependerá da natureza e da forma específicas da protease seleccionada para o tratamento.

Um método preferido para conseguir esta separação é o de ligar uma protease dissolvida a um material sólido e, depois, remover a celulase por lavagem. Este tipo de meio de ligação usado de acordo com a invenção é uma resina, disponível comercialmente, de troca de catiões, S-Sepharose, vendida pela Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia, que irá ligar muitas enzimas protease comerciais ao entrar em contacto com uma solução de celulase e protease num pH inferior a 6,0. Um método preferido de utilizar a S-Sepharose, aplicável na remoção da protease papaína de uma preparação de enzima celulase Trichoderma, é o de dialisar uma mistura de celulase e protease para uma condutividade de 3.000 μ-S ou menos, e depois passá-la para uma resina S-Sepharose com um pH entre 4,5 e 5,0 e a uma temperatura inferior a 20 °C.

Numa realização preferida, a protease é recuperada e reutilizada noutra porção de celulase Trichoderma. Um método preferido de recuperar a protease é o de a ligar a uma resina S-Sepharose com um pH entre 4,5 e 5,0 e a uma temperatura inferior a 20 °C. A resina S-Sepharose pode ligar aproximadamente 100 gm/1 da protease papaína. A mistura de celulase/papaína é passada para a resina e quando a resina está completamente carregada com papaína, é lavada com água amaciada, de modo a remover qualquer celulase contaminante, e depois lavada com 1 M de solução de cloreto de sódio para desabsorver a papaína. A solução de papaína é depois dialisada para remover excesso de sal, estando depois pronta para ser reutilizada. Durante esta operação de recuperação, é importante manter um ambiente redutor, pois a papaína encontra-se sujeita a uma inativação oxidativa reversível. 15 fi ií ·«-<

Formulação do produto

As composições de celulase desta invenção também podem incluir diversos adjuvantes, como é do conhecimento dos peritos na matéria. Por exemplo, um surfactante (aniónico ou não iónico) compatível com a composição de celulase seria útil nas composições da presente invenção. Os surfactantes preferidos são os não-iónicos, tais como os álcoois polioxietilados encontrados na gama de surfactantes TRITON® (surfactantes não-iónicos octilfenoxipolietoxietanol), disponíveis no mercado pela Union Carbide. Dever-se-á ter em conta que a inclusão de um surfactante poderá melhorar ainda o contraste entre os fios azuis e brancos, e reduzir a quantidade de redeposição de tinta. Também é possível utilizar outros materiais com a composição ou nela incluídos, consoante o pretendido, incluindo pedras, filtros, solventes, tampões, estabilizadores enzimáticos, agentes de controle de pH, activadores enzimáticos, encorpantes, outros agente anti-redeposição e outros do género. A composição enzimática poderá ser formulada como um produto sólido, em que o sólido poderá ser granular, seco por pulverização ou aglomerado. Em alternativa, a composição enzimática poderá ser formulada como um produto líquido, gel ou pasta. Nesta invenção é dada preferência a uma preparação líquida.

Lavagem do denim A lavagem do denim para lhe conferir um aspecto de "lavado com pedras" poderá ser realizada fundamentalmente pela utilização de um processo com ou sem pedras, em que o denim ou as peças de vestuário denim são agitados mecanicamente numa máquina de lavar com uma composição aquosa contendo as composições de celulase Trichoderma tratadas com protease. A quantidade de composição utilizada para tratar o denim dependerá da concentração de proteína celulase na composição de celulase, da quantidade de substrato denim na máquina de lavar, e do grau pretendido de efeito "lavado com pedras", e outros parâmetros bem conhecidos dos peritos na matéria. A quantidade preferida da composição de celulase Trichoderma tratada com protease situa-se geralmente entre 500 e 200.000 unidades CMC de enzima por kg de denim e, 16 mais preferencialmente, rondando entre 5.000 e 100.000 unidades CMC por kg de denim.

Numa realização preferida, o tratamento de lavagem do denim é realizado a uma temperatura elevada entre os 30 °C e os 70 °C e, mais preferencialmente, entre os 45 °C e os 55 °C.

Numa realização preferida, o tratamento de lavagem do denim é realizado com um pH entre 4,0 e 7,5 e, mais preferencialmente, entre 4,5 e 6,5. Na realização mais preferida, o pH do tratamento do denim ronda 6,0.

Para além da composição de celulase, a etapa de lavagem do denim também poderá empregar uma série de outros meios auxiliares para o processamento. Por exemplo, um surfactante (aniónico ou não-iónico) compatível com a composição de celulase será útil quando adicionado à máquina de lavar nos métodos da presente invenção. Os surfactantes preferenciais são não-iónicos, tais como os álcoois polioxietilados encontrados na gama de surfactantes TRITON® (surfactantes não-iónicos de octilfenoxipolietoxietanol, disponíveis no mercado pela Union Carbide. Dever-se-á ter em conta que a inclusão de um surfactante poderá melhorar ainda o contraste entre os fios azuis e brancos, e reduzir a quantidade de redeposição de tinta. Também é possível utilizar outros materiais com a máquina de lavar ou nela incluídos consoante o pretendido, incluindo pedras, filtros, solventes, tampões, estabilizadores enzimáticos, agentes de controle de pH, activadores enzimáticos, encorpantes, outros agentes anti-redeposição e outros do género.

Exemplos: A especificação anterior permite debater as composições da invenção e os métodos para produzir e utilizar as composições na "lavagem com pedras" de peças de vestuário em tecido. Os seguintes exemplos fornecem detalhes específicos relativamente às composições e aos métodos da invenção. Outras escolhas de protease adicionada e celulase, assim como as condições de lavagem tais como a concentração, medição, pH, 17 (ΜΑαα* temperatura, e outras do género, serão evidentes para os peritos na matéria com base nas explicações desta invenção.

Exemplo 1: Preparação de uma composição de celulase Trichoderma tratada com protease.

Aproximadamente 600 litros de uma preparação de celulase Trichoderma natural foram produzidos pela fermentação de Trichoderma longibrachiatum e dialisados para uma condutividade de 450 μ-S. Enquanto este produto não se encontrava estabilizado ou conservado, encontra-se agora sob uma forma estabilizada e conservada como celulase Iogen da Iogen Corporation. Um material essencialmente idêntico pode ser preparado ao simplesmente dialisar a celulase Iogen, de modo a remover os estabilizadores e os conservantes. A preparação foi depois concentrada num volume de 500 litros por ultrafiltração. O produto dialisado resultante apresenta uma concentração proteica de 140 gm/1 e uma actividade endoglucanase de 1599 unidades CMC/ml, utilizando o método de Ghose (1987). 150 litros da preparação foram removidos e a preparação restante foi depois misturada com 150 litros de água desendurecida e 40 kg de pó de papaína Biocon comercializado pela Quest International (número do produto 5x98490) e com uma concentração proteica de 105 g/kg e uma actividade de 1.000 unidades de coagulação do leite (MCU)/mg de pó de papaína como especificado pela Quest International. O pH foi ajustado para 4,8 utilizado benzoato de sódio, e a mistura foi incubada mais ou menos entre os 35 °C e os 40 °C durante 42 horas. A extensão de tratamento resultante foi aproximadamente de 216 g min/g. 49% da actividade de celulase inicial perdeu-se durante este tratamento com protease, como medido em UPF, e menos de 10% como medido em unidades CMC. A mistura foi depois arrefecida até cerca dos 20 °C durante o período de uma hora. A mistura foi depois clarificada sobre uma placa pré-revestida com terra de diatomácias e filtro de quadro. A preparação foi diluída com água de enxaguamento até atingir um volume de cerca de 960 litros. Foi removida protease da mistura de celulase e protease, ao passar a preparação para uma resina de troca de catiões S-Sepharose, de acordo com as instruções do fabricante da resina (Pharmacia Technical Manual 18-1022-19 "Ion Exchange Chromatography: Principies and Methods", 1991). A S-Sepharose foi primeiramente equilibrada para um pH de 4,7 com tampões de acetato e, depois, a mistura de protease/celulase foi carregada para a resina numa proporção de aproximadamente 13 g de proteína papaína por litro de resina embalada. A resina foi lavada com um tampão de acetato de pH 4,7. Os efluentes combinados das fases de carregamento e de lavagem da coluna, consistiram em celulase isenta de papaína pura: a actividade da papaína na celulase era inferior aos limites de detecção, com base na actividade contra azo-caseína. A papaína de ligação S-Sepharose foi subsequentemente recuperada ao passar 1,0 M de cloreto de sódio, pH 4,8, para a resina. O volume da preparação de celulase Trichoderma tratada com protease era de cerca de 2.700 litros. A preparação de celulase Trichoderma tratada com protease resultante foi conservada ao ajustar o respectivo pH para 4,0 e ao adicionar benzoato de sódio até 0,5%. Esta composição foi depois concentrada por ultrafiltração e estabilizada de forma convencional ("Enzyme Applications", Encyclopedia of Chemical Technology, Vol. 9, Fourth Edition, 1994) para uma concentração final de aproximadamente 1.800 unidades CMC/ml.

Exemplo 2: Lavagem do denim com uma composição de celulase Trichoderma tratada com protease

Foi utilizada uma máquina de lavar/extractora UniMac de 35 lb. Aproximadamente 5,1 kg de uma peça de vestuário denim sem acabamento foi colocada na máquina. O denim consistia em 3 pernas de calças cosidas com 30 cm de comprimento e 5 peças com 1 metro quadrado de denim Swift 14 oz. #37628, e 3 pernas de calças cosidas com 30 cm de comprimento de denim Swift 12 oz. #25113, todas elas feitas pela Swift Drummondville, Quebeque. O denim ficou sem acabamento graças ao tratamento de 15 minutos a 70 °C, com 30 g enzima alfamilase UC Rapidase, disponibilizada pela Gist-Brocades. A máquina foi enchida com 51 litros de água quente e foi até aos 50 °C. A relação da solução era de 10:1 (peso da solução em relação ao peso das peças de vestuário). A solução foi tamponada para um pH de 6,0 com 300 gramas de ácido fosfórico a 85% e 114 gramas de grãos de hidróxido de sódio. A máquina foi agitada durante 1 minuto para dispersar o tampão e estabelecer a temperatura. Nesta ponto, 70 ml da preparação de celulase Trichoderma tratada com protease do Exemplo 1 foram adicionados à máquina. As peças de vestuário foram lavadas a 47 rev/min durante 60 minutos. Depois disto, o banho foi descarregado.

Depois o banho foi enchido com água a 50 °C e foram adicionadas 2 g/1 de cinzas de soda, de modo a ajustar o pH para 9,0 a 11,0, com vista a destruir a actividade da celulase. A máquina foi agitada durante 10 minutos e depois o banho foi descarregado. As peças de vestuário foram depois enxaguadas com água fria durante 5 minutos e com água quente durante 30 segundos. A isto seguiram-se os dois enxaguamentos de 10 minutos a 50 °C e, depois, o banho foi descarregado e centrifugado. As peças de vestuário foram depois secas numa máquina de secar doméstica normal durante 30 minutos. As peças de vestuário foram então retiradas da máquina de secar e engomadas sem vapor.

Foram tiradas leituras de intensidade luminosa ao denim utilizando um medidor de intensidade luminosa Elrephro. As leituras de intensidade luminosa da perna das calças #37628 foram utilizadas para avaliar a remoção de tinta efectiva, e foram convertidas em quantidade efectiva de remoção de tinta índigo no tecido, por meio de comparação com amostras de teor de índigo conhecido. Os resultados são divulgados como uma percentagem do índigo no denim não lavado. As leituras de intensidade luminosa da perna das calças #25113 foram utilizadas para avaliar o grau de contaminação das cores e convertidas para quantidade efectiva de tinta índigo redepositada no tecido, por meio de comparação com amostras de teor de índigo conhecido. Os resultados são divulgados como uma percentagem do índigo no denim não lavado. O procedimento foi repetido com 88 ml de celulase logen, uma enzima celulase de redeposição padrão. Os resultados obtidos encontram-se na Tabela 1. j 20

Comparação de celulase Trichoderma tratada e não tratada Libertação efectiva de tinta Contaminação das cores Celulase tratada com protease 19,2% 2,8% Celulase Iogen 21,4% 8,3%

Como demonstrado pela Tabela 1, para mais ou menos o mesmo grau de remoção de tinta, o denim exposto à celulase tratada com protease apresenta muito menos contaminação das cores do que a celulase de redeposição.

Exemplo 3: Lavagem do denim com surfactante adicionado

Na utilização dos procedimentos descritos no exemplo 2, com as excepções anotadas, foram utilizadas as seguintes enzimas na lavagem do denim: a. 80 ml de celulase Trichoderma tratada com protease do Exemplo 1, utilizada como no Exemplo 2. b. 80 ml de celulase Trichoderma tratada com protease do Exemplo 1, utilizada como no Exemplo 2, com a excepção de terem sido adicionados 40 ppm de TRITON®X100 à máquina de lavar no início da lavagem com celulase. c. 80 ml de celulase Trichoderma tratada com protease do Exemplo 1, utilizada como no Exemplo 2, com a excepção de terem sido adicionados 80 ppm de TRITON®X100 à máquina de lavar no início da lavagem com celulase. d. 80 ml de celulase Trichoderma tratada com protease do Exemplo 1, utilizada como no Exemplo 2, com a excepção de terem sido adicionados 160 ppm de TRITON®X100 à máquina de lavar no início da lavagem com celulase. 21

Tabela 2

Demonstração do efeito do surfactante adicionado Libertação efectiva de tinta Contaminação das cores Celulase tratada com protease (0 ppm TRITON®X100) 21,46% 2,81% Celulase tratada com protease (40 ppm TRITON®X100) 21,09% 2,29% Celulase tratada com protease (80 ppm TRITON®X100) 20,08% 2,22% Celulase tratada com protease (160 ppm TRITON®X100) 17,72% 2,09%

Como demonstrado pela Tabela 2, a adição de surfactante reduz ainda mais a contaminação das cores sem uma perda significativa da libertação efectiva da tinta.

Exemplo 4: Resultados comparativos da lavagem do denim

Na utilização dos procedimentos descritos no Exemplo 2, as seguintes enzimas foram utilizadas na lavagem do denim: a. Celulase tratada com protease do Exemplo 1 e testada no Exemplo 2. b. Seguindo os protocolos de Clarkson et al, foi adicionada celulase Iogen (que consiste em 142 mg/ml de proteína) como a celulase Trichoderma de redeposição, e foram adicionados 0,02 ml, 0,10 ml, 0,5 ml, 2,5 ml e 12,5 ml respectivamente de subtilisina Rapidase WSL-2, disponibilizada pela Gist-Brocades, como a protease. Esta protease consiste em 110 mg/ml de proteína. A quantidade de celulase Iogen utilizada foi de 88 ml, à excepção do ensaio com 12,5 ml de protease, que tinha 78 ml de celulase. Os níveis de adição de protease foram respectivamente de 0,02%, 0,08%, 0,40%, 2,0% e 10% em peso de proteína subtilisina em relação ao peso de proteína celulase. Segundo Clarkson et al, o nível mínimo pretendido era de 0,1%. Como sugerido por Clarkson et al, o pH na máquina de lavar foi ajustado para 5,0 com 152 g 22

de ácido acético glacial e 55 g de grãos de hidróxido de sódio. Todos os outros procedimentos decorreram como no Exemplo 2.

Os resultados encontram-se listados na Tabela 3 e demonstram que a composição de celulase Trichoderma tratada com protease conferiu ao denim um nível de contaminação das cores muito inferior ao do método de Clarkson et al. Embora os resultados contradigam as afirmações de Clarkson et al relativamente à necessidade de protease na lavagem, estes suportam as suas afirmações de que quando a celulase e a protease são adicionadas juntas à máquina de lavar, a contaminação das cores sofre uma redução significativa com a presença de mais de 0,1% de protease em relação à celulase.

Tabela 3

Comparação de composições de enzima celulase sem redeposição Libertação efectiva de tinta Contaminação das cores Celulase tratada com protease 19,2% 2,8% Clarkson et al (0,02%) 23,8% 13,6% Clarkson et al (0,08%) 24,7% 9,7% Clarkson et al (0,4%) 28,4% 6,1% Clarkson et al (2,0%) 24,8% 6,2% Clarkson et al (10,0%) 23,6% 7,1%

Exemplo 5: Continuação da preparação de composições de celulase Trichoderma tratadas com protease.

Aproximadamente 1.000 litros de uma preparação de celulase Trichoderma natural foram produzidos pela fermentação de Trichoderma longibrachiatum e dialisados para uma condutividade de 310 pS. Embora este produto não estivesse estabilizado ou conservado, encontra-se disponível sob uma forma estabilizada e conservada como celulase Iogen da Iogen Corporation. É possível preparar um material fundamentalmente idêntico, ao simplesmente dialisar a celulase Iogen, de modo a remover estabilizadores e conservantes. Depois foi concentrado até a um volume de 725 23

litros por ultrafiltração. O produto dialisado resultante tinha uma concentração proteica de 98 gm/1 e uma actividade de endoglucanase de 1325 unidades CMC/ml, utilizando o método de Ghose (1987). 375 litros da preparação foram removidos e o restante da preparação foi depois misturado com 150 litros de água macia e 15,75 kg de "Folexco Papain 300 MCU" disponibilizada pela Folexco Incorporated, e com uma concentração de proteína papaína activa avaliada em 32 g/kg, e uma actividade avaliada em 300 unidades de coagulação do leite (MCU)/mg de pó de papaína. O pH foi ajustado para 4,8 utilizando benzoato de sódio, e a mistura foi incubada a uma temperatura entre mais ou menos 35 °C e 50 °C durante 27 horas. A extensão de tratamento resultante era aproximadamente de 24 g min/g. Os inventores estimam que cerca de 20% da actividade UPF e nenhuma da actividade em unidades CMC se perdeu durante este tratamento com protease. A mistura foi depois arrefecida para cerca de 10 °C durante um período de duas horas. A mistura foi depois clarificada numa placa pré-revestida de terra com diatomácias e filtro de quadro. A preparação foi diluída com água de enxaguamento até atingir um volume de cerca de 800 litros. A protease foi removida da mistura de protease e celulase, ao passar a preparação para uma resina de troca de catiões S-Sepharose, de acordo com as instruções do fabricante de resina (Pharmacia Technical Manual 18-1022-19 "Ion Exchange Chromatography: Principies and Methods", 1991). A S-Sepharose foi primeiramente equilibrada para um pH de 4,7 com um tampão de acetato e, depois, a mistura de protease/celulase foi carregada para a resina até aproximadamente 5 g de proteína papaína por litro de resina embalada. A resina foi lavada com tampão de acetato de pH 4,7. Os efluentes combinados das fases de carregamento e de lavagem da coluna consistiam em celulase pura isenta de papaína: a actividade da papaína na celulase era inferior aos limites de detecção com base na actividade contra azo-caseína. A papaína de ligação S-Sepharose foi depois recuperada ao passar 1,0 M de cloreto de sódio , pH 4,8, para a resina. O volume da preparação de celulase Trichoderma tratada com protease era de cerca de 1.600 litros. A preparação de celulase Trichoderma tratada com protease foi conservada ajustando o respectivo pH para 4,0 e adicionando benzoato de sódio até 0,5%. Esta composição foi depois concentrada por ultrafiltração e estabilizada de forma convencional ("Enzyme 4 -'*! % 24

ϋ

A

Applications", Encyclopedia of Chemical Technology, Vol. 9, Fourth Edition, 1994) para uma concentração final de aproximadamente 2.000 unidades CMC/ml.

Exemplo 6: Lavagem do denim com composições de celulase Trichoderma tratadas com protease

Na utilização dos procedimentos descritos no Exemplo 2, com as excepções referidas, foram utilizadas as seguintes enzimas na lavagem do denim: a. 86 ml de celulase Trichoderma tratada com protease do Exemplo 5, empregue como no Exemplo 2. b. 70 ml de celulase Trichoderma tratada com protease do Exemplo 1 como testado no Exemplo 2. c. 88 ml de celulase Iogen como descrito e testado no Exemplo 2.

Os resultados encontram-se listados na Tabela 4 e demonstram que os níveis mais baixos de tratamento com papaína empregues no Exemplo 5 (24 g min/g) não têm uma eficácia tão boa quanto os tratamentos mais fortes do Exemplo 1 (216g min/g).

Tabela 4

Comparação de celulase Trichoderma tratada e não-tratada com protease Libertação efectiva de tinta Contaminação das cores Celulase tratada com protease (Exemplo 5) 18,0 3,8% Celulase tratada com protease (Exemplo 1) 19,2% 2,8% Celulase Iogen 21,4% 8,3%

Exemplo 7: Resultados comparativos de lavagem do denim

Na utilização dos procedimentos descritos no Exemplo 2, foram utilizadas as seguintes enzimas na lavagem do denim: a. Celulase tratada com protease do Exemplo 1 como testado no Exemplo 2. Λ 25 .. b. 80 ml de celulase Trichoderma tratada com protease do Exemplo 1, como testado no Exemplo 3 com 40 ppm de TRITON©X100, adicionados à máquina de lavar no início da lavagem com celulase. c. Euro L, um produto de celulase comercial da Genencor International, que cremos conter enzima protease, uma celulase Trichoderma de redeposição e um surfactante; foi adicionado numa quantidade de 100 ml. Como sugerido pelos fabricantes, o pH foi ajustado para 5,5 com 150 g de ácido acético glacial e 85 g de grãos de hidróxido de sódio. Todos os outros procedimentos decorreram como no Exemplo 2. d. O Euro L foi adicionado à máquina de lavar numa quantidade de 100 ml. Também foram adicionados 40 ppm de TRITON®X100 à máquina de lavar no início da lavagem com celulase. Como sugerido pelos fabricantes, o pH foi ajustado para 5,5 com 150 g de ácido acético glacial e 85 g de grãos de hidróxido de sódio. Todos os outros procedimentos decorreram com no Exemplo 2. e. O Denimax 1, um produto comercial da Novo Nordisk, que cremos conter enzima de baixa contaminação das cores produzida pela Humicola insolens, foi adicionado numa quantidade de 250 ml. Como sugerido pelo fabricante, o pH foi ajustado para 6,5 com 297 g de ácido fosfórico e 125 g de grãos de hidróxido de sódio. Todos os outros procedimentos decorreram como no Exemplo 2. f. O Denimax L foi adicionado à máquina de lavar numa quantidade de 250 ml. Também foram adicionados 44 ppm de TRITON®X100 à máquina de lavar no início da lavagem com celulase. Como sugerido pelos fabricante, o pH foi ajustado para 6,5 com 297 g de ácido fosfórico e 125 g de grãos de hidróxido de sódio. Todos os outros procedimentos decorreram como no Exemplo 2.

Os resultados encontram-se listados na Tabela 3 e demonstram que para uma libertação de tinta idêntica, a composição de celulase Trichoderma tratada com protease confere ao 26

denim um nível mais baixo de contaminação das cores do que o Euro L ou o Denimax L. Esta boa eficácia da celulase Tríchoderma tratada com protease sem surfactante relativamente ao Euro L, é conseguida apesar do Euro L conter surfactantes que ampliam a eficácia. A baixa potência da celulase Humicola insolens toma-se evidente pelo facto de ter sido necessário duas ou três vezes mais Denimax L para esbater o denim do que com as outras enzimas.

Tabela 3

Comparação de composições de enzima celulase sem redeposição Libertação efectiva de tinta Contaminação das cores Celulase tratada com protease 19,2% 2,8% Celulase tratada com protease (40 ppm de TRITON®X100) 21,09% 2,29% Euro L 19,9% 3,4% Euro L (40 ppm de TRITON®X100) 21,44% 3,35% Denimax L 19,6% 3,6% Denimax L (40 ppm de TRITON®X 100) 18,17% 3,32%

Embora realizações preferidas da nossa invenção tenham sido descritas e demonstradas, a invenção deverá ser definida somente pelo âmbito das reivindicações anexas.

Lisboa,2 0 OUT. 2000— Λ U

Dr. Américo da Silva Caralho Agenío Gíicici cb Pr s?;.-:!;·.·.· IncbsÍrfsl r. Casíao, ao:-:’·£ is;c-c-a; ííSôoa Telsfs. 213851339 - 213334613

Claims

1

REIVINDICA ÇÕES 1. Uma composição de enzimas celulase de baixa contaminação das cores, incluindo uma celulase Trichoderma tratada com protease, caracterizada pelo facto de antes do tratamento com protease, a celulase incluir a enzima endoglucanase (EG) e domínios de núcleo de celobiohidrolase (CBH) e de, depois do tratamento com protease da celulase, os domínios de núcleo da CBH não se encontrarem ligados aos respectivos domínios de ligação, e de a composição não conter qualquer actividade de protease detectável residual acima da quantidade que é produzida naturalmente pela Trichoderma.

2. Uma composição de enzimas celulase de baixa contaminação das cores de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo facto de a referida celulase a ser tratada ser produzida por uma estirpe de Trichoderma geneticamente modificada, para produzir directamente pelo menos alguns domínios de núcleo da CBH, que não estão ligados a domínios de ligação naturais da CBH.

3. Uma composição de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo facto de a protease adicionada que permanece na composição ser inferior a 0,1 % em peso da composição, como medido pelo teor proteico total.

4. Uma composição de acordo com a reivindicação 3, caracterizada pelo facto de a protease adicionada que permanece na composição ser inferior a 0,05% em peso da composição, como medido pelo teor proteico total.

5. Um método para a produção de uma composição de enzima celulase de acordo com as reivindicações anteriores, caracterizado por: (a) sujeição de uma celulase Trichoderma contendo uma enzima CBH e uma enzima EG a um tratamento com protease limitado, ao adicionar uma protease à celulase; e (b) purificação da celulase ao remover substancialmente a protease adicionada.

6. Um método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de a protease tratar a celulase ao ponto de a celulase tratada perder pelo menos 5% da sua actividade inicial, como medido em unidades CMC.

8. Um método de acordo com as reivindicações 5 a 7, caracterizado pelo facto de a etapa de tratamento com protease limitado utilizar uma relação de peso da protease, em relação à celulase, multiplicada por um tempo de tratamento médio que se encontra, fundamentalmente, entre 1 e 10.000 gmin/g.

9. Um método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo facto de a etapa de tratamento com protease limitado utilizar uma relação de peso da protease, em relação à celulase, multiplicada por um tempo de tratamento médio que se encontra, fundamentalmente, entre 10 e 5.000 g min/g.

10. Um método de acordo com as reivindicações 5 a 9, caracterizado pelo facto de a protease ser uma protease papaína.

11. Um método para a produção de uma composição de enzima celulase de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado por: (a) sujeição de uma celulase Tríchoderma contendo uma enzima CBH e uma enzima EG a um tratamento com protease limitado, ao adicionar uma protease à celulase, sendo o tratamento com protease limitado definido pela utilização de uma relação de peso da protease, em relação à celulase, multiplicada por um tempo de tratamento médio que se encontra, fundamentalmente, entre 1,0 e 10.000 g m/g, (b) interrupção da reacção da protease por arrefecimento ou por ajuste do pH, e (c) purificação da celulase ao ponto de nenhuma protease adicionada detectável permanecer na composição acima da quantidade que é produzida normalmente pela Tríchoderma.

12. Um método para a produção de uma composição de enzima celulase de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizado por: (a) sujeição de uma celulase Trichoderma contendo uma enzima CBH e uma enzima EG para um tratamento com protease limitado, ao adicionar uma protease à celulase, sendo o tratamento com protease limitado definido pela utilização de uma relação de peso da protease, em relação à celulase, multiplicada por um tempo de tratamento médio que se encontra, fundamentalmente, entre 1,0 e 10.000 g m/g, (b) interrupção da reacção da protease por arrefecimento ou por ajuste do pH.

13. Um método para introduzir numa superfície de denim tingido de índigo, uma área localizada de variação da cor e um grande contraste entre as fibras azuis e as brancas, caracterizado pelo facto de o denim entrar em contacto com uma quantidade eficaz de uma composição de enzima celulase de baixa contaminação das cores, de acordo com as reivindicações 1 a 4, ou ser produzido em conformidade com o método de acordo com as reivindicações 5 a 12. Lisboa, 2 0 0U1. 2000

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