KR100449435B1 - 프로테아제로 처리되고 정제된 셀룰라아제 조성물 및 효소적 스톤워싱하는 동안 이면오염을 감소시키는 방법 - Google Patents

프로테아제로 처리되고 정제된 셀룰라아제 조성물 및 효소적 스톤워싱하는 동안 이면오염을 감소시키는 방법 Download PDF

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Abstract

데님 직물 및/또는 의류를 효소적으로 스톤워싱하는 동안, 바람직하지 않는 청색 염료 재침착이 데님 표면상에서 생긴다. 본 발명은 프로테아제 효소로 부분적으로 분해하는 것에 의해 그의 코어와 결합 영역이 제거된 트리코데르마 엔도글루카나제 및 트리코데르마 셀로비오스가수분해효소로 구성된 효소 조성물을 사용하여 상기 문제를 해결하는 방법을 제공한다. 상기 조성물을 사용하면 청색 염료의 재침착을 감소시키므로 재침착 또는 이면오염 셀룰라아제를 사용하는 것에 비하여 스톤워싱 공정을 향상시킨다.

Description

프로테아제로 처리되고 정제된 셀룰라아제 조성물 및 효소적 스톤워싱 하는 동안 이면오염을 감소시키는 방법
본 발명은 셀룰라아제 효소를 사용하여 데님직물 및 의류를 스톤워싱(stonewashing)하는 동안 인디고 염료가 데님상으로 이면오염되는 것을 감소시키거나 또는 예방하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
데님은 경사가 인디고 염료로 염색된, 보통 청색으로 염색된 면직물이다. 인디고 염색된 데님천의 한가지 바람직한 특성은 경사와 횡사의 청백사를 변경하는 것에 의해 생성된 외관, 즉 보통의 마모 및 인열시 청색상에 백색이 나타나는 외관을 갖는 것이다. 일반적인 데님의 외관은 스톤워싱된 모습이다. 이 스톤워싱된 외관은 세정되지 않은 데님에 비하여 일부 영역, 특히 솔기 근처에서 보다 더 연한 색을 갖고, 일반적으로 연한 청색으로 구성된다. 스톤워싱된 물질은 흔히 더 연질의 조직을 가지며 또 바람직한 청색상의 백색 콘트라스트를 유지한다. 전통적으로 스톤워싱은 데님원료를 경석 존재하에서 세정함으로써 탈색 또는 마모된 외관과 상술한 바와 같은 소망하는 청색상의 백색 콘트라스트를 갖는 직물을 수득하여왔다.
효소, 특히 셀룰라아제가 현재 대님 가공에 사용되고있다. 특히, 셀룰라아제는 전통적인 스톤워싱에 사용되는 다량의 경석을 필요로 하지 않고 스톤워싱된 외관을 갖는 데님을 제조하는데 사용된다. 이 가공방법은 세정기에 돌이 사용되지 않지만 효소적 "스톤워싱"이라 칭한다. 스톤워싱하기 위해 효소를 사용하는 것은 돌의 사용에 몇가지 단점이 있기 때문에 점점 더 많이 보급되고 있다. 예컨대 상기 공정에 사용된 돌은 기계의 마모와 인열, 생성된 자갈에 기인한 폐기물 환경문제를 유발하고 또 기계 및 의류의 주머니로 부터 돌을 제거하는 수작업과 관련하여 높은 노동비용을 초래한다. 따라서, 세정단계에서 돌을 감소시키거나 제거하는 것이 바람직할 것이다.
경석을 사용하는 것과는 대조적으로, 효소(특히 셀룰라아제)는 기계에 안전하므로 폐기물 문제가 거의 없고 또 노동비용을 현저하게 감소시킨다. 따라서, 스톤워싱에 효소를 사용하는 것이 유리할 수 있다. 그러나 셀룰라아제와 같은 효소의 사용이 돌을 사용하는 것과 비교하여 유리하긴 하지만, 상기 목적으로 효소를 사용하는 것에는 몇가지 문제가 있다. 예컨대 룰무 부패균인 트리코데르마(Trichoderma)로 부터 생긴 셀룰라아제와 같은 일부 셀룰라아제와 관련된 한가지 문제는 효소적 스톤워싱 공정동안 직물의 아면에 염료가 "재침착" 또는 "이면오염"(양쪽 용어는 본 명세서에서 상호 교환적으로 사용된다)되는 것이다. 이러한 재침착 또는 이면오염은 백색 데님사에 청색 착색을 유발하여 청색사와 마모지점 사이의 콘트라스트가 약하게된다(즉, 바람직한 청색상 백색 외관이기 보다 청색상 청색 외관으로 된다). American Dyestuff Reporter, Sept.1990, pp.24-28 참조.
재침착 또는 이면오염은 몇몇 이용자에게는 불쾌하게 작용한다. 예컨대 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제는 후미콜라(Humicola) 셀룰라아제 보다 데님 물질상에서 훨씬 높은 특이활성을 나타내지만, 후미콜라(Humicola)로 부터 얻은 셀룰라아제가 이면오염 문제가 적기 때문에 더 바람직하다. 트리코르데라(Trichoderma) 셀룰라아제의 현격하게 높은 성능으로 인하여 현저히 짧은 가공시간 동안 고도의 마모를 얻기 위해 보다 소량의 효소가 사용될 수 있다.
스톤워싱하는 동안 염료의 재침착 문제는 데님 가공하는 사람들에게 관심의 대상이 되어 왔다. 상기 문제를 트리코르데마(Trichoderma) 셀룰라아제를 사용하여 처리하고자하는 종래의 시도는 계면활성제 또는 기타 물질과 같은 여분의 재침착방지 화학물질을 셀룰라아제 세정단계에 부가하여 느슨하게된 인디고 염료를 분산시키고 재침착을 감소시키는 것으로 구성된다. 또한 데님 가공자들은 데님에 대한 특이활성이 적은 셀룰라아제와 함께 여분의 헹굼액을 사용하기도 했다. 그에 의해 추가의 화학물질 비용과 긴 가공시간이 초래된다. 재침착 문제를 해결하기 위한 다른 방법은 가공중에 온화한 탈색제 또는 오염제거제를 부가하는 것을 포함한다. 이 방법은 의류의 최종 색조에 영향을 주고 가공시간을 증가시킨다.
상술한 방법들은 재침착을 감소시키는데 어느 정도 공헌하긴 하지만, 이들 방법은 완전히 만족스러운 것은 아니고 여전히 바람직하지 않은 이면오염 문제가 해결되지 않고 있다. 재침착 정도를 감소시키기 위해 효소와 돌을 함께 사용하는 것도 유리할 수 있지만 이 방법에는 돌을 사용하는 것과 결부된 몇가지 문제가 잔존한다.
클락슨 일행에 의한 PCT 공고번호 WO94/29426(이후, "클락슨 일행"이라 함)에 의해 기재된 바와 같은 다른 방법은 스톤워싱 처리에 프로테아제 효소의 부가를 포함하고 있다. 재침착 셀룰라아제 및 부가된 프로테아제를 포함하는 조성물로 데님을 처리하면 백색 및 청색사 사이의 콘트라스트를 향상시키고 염료 재침착을 감소시킨다는 것이 밝혀졌다. 세정기에서 프로테아제는 셀룰라아제 단백질이 데님의 표면상의 이면에 착색 입자가 결합되는 것을 방지하고 또 적절히 사용되면 이들은 셀룰라아제의 작용으로 생성된 마모 외관상에 심각한 악영향을 갖지 않는다. 여러 이점을 갖는 이 방법은 비용이 비싸고 프로테아제의 성질상 셀룰라아제 효소를 파괴하는 경향이 있으므로 조심스럽게 제어되어야한다. 취급자는 이면오염을 감소시키는 바람직한 단백질분해 효과와 셀룰라아제의 활성을 감소시키는 바람직하지 않은 단백질분해 효과 사이의 균형을 맞추어야한다.
클락슨 일행의 공정에서, 프로테아제는 실질적으로 오염제거제 또는 오염 억제제로서 사용되며 세정공정에 포함되어야한다. 클락슨 일행은 세가지 선택권을 제시한다: (1) 프로테아제를 셀룰라아제 효소와 함께 직접적으로 세정기에 부가한다, (2) 세룰라제 처리후 헹굼 단계에 프로테아제를 부가한다, 또는 (3) 세정하기 전에 프로테아제를 셀룰라아제와 혼합한다. 프로테아제 및 셀룰라아제를 함께 부가하는 기본 공정에 대하여, 프로테아제를 헹굼단계에 부가하는 공정은 셀룰라아제에 대한 현저한 단백질분해 효과를 피할 수 있지만 추가의 가공 단계를 부가해야하는 단점이 있다. 한편, 셀룰라아제와 프로테아제를 미리 혼합하면 간단히 사용가능한 배합물을 제조하지만, 오염 제거에 대한 바람직한 단백질분해 효과와 셀룰라아제 활성을 파괴하는 바람직하지 않은 단백질분해 효과 사이의 균형을 이루기가 곤란하게된다. 예컨대 고활성 프로테아제는 저장 및 선적하는 보통의 시간 동안 셀룰라아제 효소를 완전히 분해시킨다. 이러한 저장 안정성 문제는 (1) 양호한 오염방지능을 갖지만 많아야 제한된 정도로 셀룰라아제를 분해할 수 있는 프로테아제를 선택(셀룰라아제에 대하여 활성이 그다지 높지 않지만 강력한 오염 제거제로 공지된 서브틸리신이 바람직한 선택임)하고, 및 (2) 셀룰라아제상의 단백질분해가 완전히 실시되고 또 시판중인 배합물이 저장 및 선적하는 동안 안정하도록, 선정된 프로테아제와 셀룰라아제를 승온에서 미리 배양하는 것을 필요로한다.
트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제에 대한 강한 프로테아제, 특히 프로테아제 파파인의 작용은 광범위하게 연구되어 있다. 한정된 양의 파파인 분해는 트리코데르마(Trichoderma) 셀로비오스 가수분해효소의 코어 영역을 이들의 천연적 결합 영역으로 부터 분해시킬 수 있다는 것이 밝혀져있다. 이는 상기 효소들이 아비셀(Avicel) 또는 목면과 같은 결정성 셀룰로오스에 대하여 갖는 임의의 측정가능한 활성을 실질적으로 제거하면서 β-글루칸과 같은 용해성 물질에 대한 활성을 유지하는 효과를 갖는다. 그 결과, 종래 기술자들은 천연의 결합 영역이 결정성 셀룰로오스상에 셀로비오스 가수분해효소가 작용하는데 있어 결정적인 역할을 하는 것으로 결론지었다. 결정성 셀룰로오스상에서 CBH활성을 완전히 제거하는데 필요한 파파인 처리량은 셀룰라아제 단백질 g당 약 0.1 내지 0.5 g의 파파인 단백질이고, 모두 처리시간과 곱해지며(g 분/g), 즉 셀룰라아제 단백질에 대한 프로테아제 단백질의 중량비는 처리시간과 곱해진다.
재침착을 감소시키거나 예방하기 위해 종래 실시되었던 방법의 단점을 기초로하여, 스톤워싱 처리하는 동안 염료의 재침착 또는 이면오염 문제를 해결하기 위한 보다 용이하게 제어되고 보다 비용 효과적인 방법이 필요하다.
따라서, 비용 효과적이고 양호한 저장 안정성을 가지며, 고성능이고 재침착 또는 이면오염성 셀룰라아제를 포함하지 않는 효소 조성물 또는 방법을 발견하는 것이 바람직할 것이다.
본 발명의 발명자들은 셀로비오스 가수분해효소 및 엔도글루카나제 효소를 함유하는 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제를 제한된 단백질분해(제한된 프로테아제 처리)처리시킨 다음 부가된 프로테아제를 제거하는 것에 의해 목면 인디고 염색된 데님을 이면오염이 적은 셀룰라아제 효소 조성물로 세정하는 방법이 재침착성 셀룰라아제 제제 또는 셀룰라아제 및 프로테아제를 모두 포함하는 제제를 이용하는 방법에 비하여 훨씬 우수하다는 것을 알아내었다. 이러한 조성물로 처리된 데님은 예기치않게 염료 재침착 정도가 감소되므로 데님상에서 청색사와 백색사 사이의 콘트라스트가 양호하다. 상기 조성물은 저장 안정하고 종래의 방법에 비하여 프로테아제를 훨씬 적게 필요로하며 클락슨 일행에 의해 필요한 것으로 알려진 "이면오염 억제 조성물"(즉, 프로테아제)이 존재하지 않더라도 재침착 정도가 놀랄만큼 낮다. 본 발명자들은 값비싼 성분이 재사용될 수 있도록 프로테아제를 회수하여 재활용하는 방법도 제공한다. 데님 세정 공정에서, 소량의 계면활성제는 이하에 설명한 바와 같이 경우에 따라 상기 조성물 또는 방법에 부가될 수 있다. 표면활성제가 부가되는 경우, 표면활성제는 셀룰라아제와 함께 세정단계에 부가되거나 또는 처리후 린스제로 부가될 수 있다. 또한 데님 세정공정은 상술한 조성물에 부가된 돌을 이용하거나 이용하지 않고서 실시될 수 있다.
제한 프로테아제 처리한 다음 프로테아제 제거를 위해 정제된 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제 효소 조성물로 스톤워싱된 데님은 이면오염 정도를 현저히 감소시키고 백색사 및 청색사 사이의 콘트라스트에서 눈에 뜨는 증가를 나타낸다. 본 발명자들은 특정 이론에 의거하고 싶지는 않지만, 한편으로는 프로테아제가 세정기에 필요하고(클락슨 일행) 또 다른 한편으로는 존재할 필요가 없는(본 발명) 분명히 상반되는 관측에 대한 가능한 설명으로 프로테아제가 이면오염에 영향을 줄 수 있는 것에 의해 데님 세정공정에는 2개의 별개의 분명한 메카니즘이 존재한다는 것이다.
제 1 메카니즘은 클락슨 일행에 의해 제시된 것으로 프로테아제 공급이 세정기에서 오염제거제로서 작용한다는 것이다. 이 메카니즘은 종래의 셀룰라아제 처리에서 염료가 백색 데님을 오염시킨 후에도 프로테아제가 재침착된 염료를 제거할 수 있다는 클락슨 일행의 발견과 일치한다. 이것은 또한 프로테아제를 세정계에서 오염 제거제로서 사용하는 것과도 일치한다. 물론, 셀룰라아제 단백질에 의해 생성된 염료 기제 오염은 단백질과 관련된 오염을 처리하기 위해 잘 공지된 것, 즉 프로테아제에 의해 제거될 수 있다.
그러나, 제 1 메카니즘하에서 이 분야의 숙련자들은 프로테아제가 세정기에 제공되지 않는다면 프로테아제가 세정기에서 이면오염에 대하여 작용할 것이라고는 기대하지 못할 것이다. 프로테아제가 상기와 같이 작용할 수 있는 것으로 보여지는 본 발명자들의 놀라운 발견을 설명하기 위해 본 발명자들은 제 1 메카니즘보다는 훨씬 미묘하고 덜 분명한 제 2 메카니즘이 존재할 것이라고 제안하였다. 특히 본 발명자들은 제한된 프로테아제 처리가 셀룰라아제 효소의 작용양식을 변화시켜 이면오염되지 못하는 작고 분산되기 쉬운 입자로 만드는 것으로 믿고 있다. 프로테아제는 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제 효소 착물에 존재하는 셀로비오스 가수분해효소 성분을 이들의 천연의 셀룰로오스 결합 영역을 분해시킴으로써 결정성 셀룰로오스에 대하여 불활성으로 만들 수 있다고 보고되어 있는 반면에, 본 발명자들은 이러한 처리가 그대로는 검출되지 않는 셀룰로오스에 작은 홈(nick)을 만들 수 있는 셀로비오스 가수분해효소를 잔존시킬 수 있지만, 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제 효소착물(예컨대 엔도글루카나제)에 다른 성분과 함께 사용되면 데님 세정환경에 실질적인 마모를 유발하는 것으로 가정하고 있다. 본 발명자들은 또한 변형된 셀로비오스 가수분해효소가 결합 영역을 갖지 않기 때문에 결정성 셀룰로오스에 대한 이들의 작용은 국소적으로 되지 않고 완전한 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제를 사용한 처리에서 보다 데님상에 훨씬 균일하게 분포된다. 완전한 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제 효소의 경우, 이들의 작용 모드가 국소적으로 되어 비교적 큰 입자가 셀룰로오스의 주체로 부터 방출되게되어 효소는 섬유의 큰 부분을 직접적으로 통과한다. 이와 대조적으로, 프로테아제 처리된 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제 조성물은 더 균일하게 작용되어 높은 전단력이 작용하거나 또는 혼합되는 환경에서 셀룰로오스의 주체로 부터 더 작고 보다 용이하게 분산될 수 있는 입자를 생성시킬 수 있다. 그 결과 이면오염이 덜 생기는 것이다.
인식되지는 않지만 상기 제 2 메카니즘은 클락슨에 의해 기술된 조합된 셀룰라아제 및 프로테아제 처리에서 역할이 그리 크지 않다. 제 2 메카니즘은 종래 업자들이 세정기에서 오염을 제거하기 위해 프로테아제를 보다 확실하게 이용하는 것에만 집중하였기 때문에 인식되지 않았다. 셀룰라아제 및 프로테아제 효소를 모두 함유하는 단일한 시판중인 효소 조성물을 제조하려하는 경우, 단백질분해반응을 효과적으로 제어하기가 곤란하기 때문에 충분히 이용되지 않았다. 클락슨 일행의 표현대로는, 균형을 잡기가 곤란하므로 이면오염을 감소시키기 위한 단백질분해효과와 마모를 줄이는 단백질분해작용 사이에 균형을 이루어야한다. 따라서, 세정기에 직접적으로 부가될 수 있는 조합된 셀룰라아제/프로테아제 효소 조성물을 제조하기 위하여 이 기술분야의 숙련자들은 결정성 셀룰로오스상에서 활성을 파괴하는 것으로 알려진 파파인과 같은 프로테아제의 사용을 피하려하고 세정제에서 항오염특성을 위하여 서브틸리신을 더 선호할 것이다.
놀랍게도, 본 발명자들은 (1) 처음의 항-오염 메카니즘의 이점을 포기하고(즉, 효소제제로 부터 프로테아제를 제거함으로써 데님을 세정하며), 및 (2) 상기 변화의 이점을 취하여 단백질분해반응 조건을 변경하여 보다 강력한 처리를 실시함으로써 전에는 인식되지 않은 제 2 메카니즘의 영향을 최대화하는 것에 의해 보다 나은 결과가 달성될 수 있다는 것을 발견하였다. 상기 방법으로 얻은 신규 조성물은 우수하고 비용효과적인 데님의 세정공정을 가능하게한다.
본 발명을 보다 자세하게 설명하기 전에 이하의 용어를 정의한다.
용어 "트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제 조성물"은 진균 미생물인 트리코데르마(Trichoderma)종으로 부터 생산되는 한개 이상의 셀로비오스 가수분해효소(CBH) 및 한개 이상의 엔도글루카나제(EG) 효소를 포함한다. 상기 조성물이 천연산출의 트리코데르마(Trichoderma) 미생물로 부터 산출되고 또 이들의 각 성분이 미생물에 의해 천연적으로 생산되는 비율로 발견되면, 상기 조성물은 "완전한 또는 천연의 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제 조성물"로 칭할 수 있다.
본 발명의 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제 조성물은 셀룰라아제의 한개 이상의 CBH 및/또는 EG 성분을 과도생산, 과소생산 또는 생산하지 않기 위하여 유전학적으로 변형된 트리코데르마(Trichoderma) 종으로 부터 생산된 셀로비오스 가수분해효소 및 엔도글루카나제 모두를 함유하는 임의의 셀룰라아제 조성물로 볼 수 있다. 이들 엔도글루카나제 및 셀로비오스 가수분해효소는 천연의 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제 효소 조성물의 일부인 효소 뿐만 아니라 CBH 또는 EG의 결합 영역 또는 코어 영역중의 어느 하나를 포함하는 끝이 잘라진 셀룰라아제 단백질 또는 그의 일부 또는 유도체인 변형된 셀룰라아제 조성물을 포함할 수 있다. 변형된 셀룰라아제 조성물의 다른 예는 셀룰라아제 또는 끝이잘려진 셀룰라아제의 일차 구조에서 글리코실화 또는 아미노산의 치환을 달리 할 수 있다. 상술한 바와 같은 천연의 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제 또는 이들의 변형물은 이들이 트리코데르마(Trichoderma) 이외의 유전학적으로 변형된 숙주 미생물에서 생산된다하더라도 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제 조성물로 간주된다. 용어 "프로테아제 처리된 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제"는 CBH 코어 영역의 중요 부분이 부가된 프로테아제 효소처리에 의해 분해된 CBH 결합 영역을 갖는 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제 조성물로 본다. 그러나 이 프로테아제 처리된 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제 조성물은 미생물에 의해 천연적으로 생산되는 양에 비하여 현저히 증가되거나 또는 잔류하는 활성 프로테아제를 가져서는 안된다. 이러한 증가량은 셀룰라아제 효소 조성물중의 단백질 총량의 0.1% 미만이어야한다.
본 발명의 프로테아제 처리된 셀룰라아제 조성물은 부가된 효소가 CBH 코어와 결합 영역을 절단하기 위해 사용된 제제 뿐만 아니라 CBH 코어 영역이 유전학적으로 변형된 미생물에 의해 그의 결합영역 없이도 직접적으로 생산되는 변형된 셀룰라아제 조성물을 포함할 수 있는 것으로 본다. 모든 경우에서, 프로테아제 처리된 트리코르데마(Trichoderma) 셀룰라아제 조성물은 엔도글루카나제 활성 뿐만 아니라 CBH 코어 단백질을 함유해야한다.
본 발명의 방법은 부분적으로 또는 전체적으로 효소로 스톤워싱될 데님을 의류로 부터 소망하는 염료제거정도를 달성하기에 충분한 양의 프로테아제 처리된 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제 조성물과 접촉시키는 것을 포함한다. 이러한 효소의 사용은 청색사와 백색사 사이에 탁월한 콘트라스트를 갖고 이면오염 정도가 낮은 의류를 초래한다. 효소 그자체는 양호한 안정성을 갖고 또 현저한 프로테아제 분해의 위험도 없다.
본 발명의 일개 실시예에서, 프로테아제 처리된 트리코르데마(Trichoderma) 셀룰라아제 조성물은 트리코르데마(Trichoderma) 셀룰라아제 조성물과 부가된 프로테아제 효소를 접촉시키는 것에 의해 생성되며, 프로테아제 단백질 대 셀룰라아제 단백질의 중량비에 평균 처리시간을 곱한 것으로 정의되는 처리정도는 1.0 g 분/g 내지 10,000 g 분/g 범위이다. 이어 크로마토그래피 분리법으로 셀룰라아제로 부터 프로테아제를 제거한다. 본 발명의 다른 실시예에서는 프로테아제 처리된 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제 조성물을 인디고 염색된 데님과 함께 세정기에 넣고 데님의 청색섬유와 백색섬유 사이에 높은 콘트라스트를 갖는 마모된 외관을 생성하기 위해 사용된다.
셀룰라아제 효소
트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제 조성물은 트리코르데마(Trichoderma) 진균의 수중 배양물에서 전형적으로 생산되며 또 그의 생산과 회수방법은 문헌에 공지되어 있으며 이 기술분야의 숙련자에게 널리 알려져있다. 이들 효소의 시판중인 공급자로서는 이오겐 코포레이숀, 제넨코르 인터네이쇼날, 노보 노르디스크, 기스트-브로케이드, 시그마 케미컬, 및 엔자임 디벨롭먼트 코포레이숀을 포함한다.
본 발명의 바람직한 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제 조성물중의 한개는 트리코데르마 룽기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum) 진균주에 의해 생산되며, 효소 CBH1, CBH2, EG1, EG2 및 EG3의 상대적 농도는 완전한 또는 천연의 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제 조성물에서 발견되는 값과 모두 실질적으로 일치한다.
시판중인 셀룰라아제 제제는 100% 셀룰라아제 단백질이 아니며 흔히 충전제, 완충액, 안정화제 및 기타 성분을 포함한다. 전체 셀룰라아제 단백질은 이 기술분야에서 공지된 다양한 측정법에 의해 측정될 수 있다. 여기서 사용된 측정법은 로스 엔젤레스에 소재하는 바이오라드 컴패니로 부터 시판되며 고도로 정제된 셀룰라아제 단백질을 표준으로 사용하는 바이오라드 코마씨 블루 단백질 측정법이다.
부가된 프로테아제
프로테아제는 미생물, 식물 및 동물을 비롯한 몇가지 공급원으로 부터 구입할 수 있고 또 문헌에 공지되어 있다. 몇개의 중요한 미생물 단백질분해성 공급원은 바실루스 리케니포르미스(Bacillus lichemiformis), 바실루스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 및 아스페르길루스 오리자애(Aspergillus oryzae)를 포함한다. 식물 프로테아제의 중요한 공급원은 파파인의 경우는 파파야이고 또 브로멜라인에 대해서는 파인애플이다. 본 발명에 적합한 프로테아제는 세린, 시스테인, 아스파탐산 및 메탈로 프로테아제를 포함한다. 바람직한 프로테아제의 한개는 시스테인 프로테아제 파파인이다. 프로테아제는 액체 용액, 분말과 같은 다수의 다양한 형태 또는 고형의 지지체에 부착된 불용성 효소로서 시그마 케미컬과 같은 공급사로 부터 시중에서 구입할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시예에서, 프로테아제 파파인은 액체 현탁액으로 사용된다.
시판중인 프로테아제 제제는 100% 프로테아제 단백질이 아니고 흔히 충전제, 완충액, 안정화제 및 기타 성분을 포함한다. 전체 프로테아제 단백질은 이 기술분야에 공지된 다양한 측정법에 의해 측정될 수 있다. 여기서 사용된 측정법은 로스 엔젤레스에 소재하는 바이오라드 컴패니로 부터 시판되는 바이오라드 코마씨 블루 단백질 측정법이다.
프로테아제 처리
본 발명의 제한된 프로테아제 처리는 액체 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제 조성물을, 규정된 기간의 시간 동안 제어되는 반응조건하에서, 부가된 프로테아제와 접촉시키는 것을 포함한다. 이 기술에서 숙련자는 적당한 정도의 처리가 온도, pH, 혼합물을 제조하기 위해 선정된 농도 및 선정된 프로테아제 효소의 특이 활성에 따라 상이하다는 것을 잘알고 있을 것이며 또 주어진 셀룰라아제 조성물과 부가된 프로테아제에 대한 최적 가공조건을 선정하기 위해 일상적인 시험과정이 이용될 수 있다는 것도 잘 알고 있을 것이다.
바람직한 실시예에서, 제한된 프로테아제 처리는 20℃ 내지 60℃ 사이의 승온, 보다 바람직하게는 30℃ 내지 50℃에서 실시될 수 있다. 가장 바람직한 실시예에서, 약 37℃의 온도가 채용된다.
바람직한 실시예에서, 제한된 프로테아제 처리는 3.0 내지 8.0 사이의 pH, 보다 바람직하게는 4 내지 7에서 실시된다. 가장 바람직한 실시예에서 pH는 4 내지 5 이다.
바람직한 실시예에서, 제한된 프로테아제 처리는 5 내지 250 g/l, 보다 바람직하게는 50 내지 200 g/l의 셀룰라아제 단백질 농도로 실시된다. 가장 바람직한 실시예에서 셀룰라아제 단백질 농도는 약 100 g/l이다.
바람직한 실시예에서, 제한된 프로테아제 처리시간은 5분 내지 4주, 보다 바람직하게는 1 내지 120 시간이다. 가장 바람직한 실시예에서, 프로테아제가 파파인이면, 처리시간은 약 24 내지 48시간이다.
바람직한 실시예에서, 프로테아제 단백질 대 셀룰라아제 단백질의 중량비와 평균 처리시간의 곱으로 규정된 처리정도는 1.0 g 분/g 내지 10,000 g 분/g범위, 보다 바람직하게는 10 내지 1,000 g 분/g 이다. 가장 바람직하게는 프로테아제가 파파인이면, 처리정도는 약 200 g 분/g 정도이다. 이들 바람직한 조건하에서, 파파인의 농도는 약 14 gm/리터이다.
단백질분해반응을 실행하는 바람직한 방법은 셀룰라아제 활성의 FPU 및 CMCU를 각기 측정하는 여과지 및 CMC를 이용하는 방법이다(고세 1987). 바람직하게는 프로테아제 처리는 셀룰라아제가 여과지 단위(EPU)로 측정된 초기 활성의 5% 이상 및 CMC 단위로 측정된 초기 활성의 50% 미만을 손실할 정도로 실시될 것이다. 보다 바람직하게는 셀룰라아제는 FPU로 측정된 초기 셀룰라아제 활성의 10% 이상을 잃고 또 CMCU로 측정된 초기 활성의 70% 내지 100% 로 유지하는 정도로 처리되어야한다. 보다 바람직하게는, 셀룰라아제는 FPU로 측정된 초기 셀룰라아제 활성의 약 50% 및 CMCU로 측정된 초기 활성의 10% 미만을 손실할 정도로 처리되어야한다.
프로테아제 제거 및 회수
본 발명의 방법은 외인성 프로테아제가 본 발명의 프로테아제 처리된 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제 효소 조성물을 오염시키지 않도록 단백질분해반응이 소망하는 처리정도에 도달할 때 단백질분해반응이 중지되는 것을 필요로한다. 이 반응은 셀룰라아제 착물로 부터 분리될 수 있다. 이 기술분야의 숙련자는 크로마토그래피법 분리, 선택적 침강법, 한외여과 또는 여과(고형의 담체상의 불용성 효소가 사용되는 경우)를 비롯한 트리코데르마(Trichoderma)셀룰라아제 효소 조성물로 부터 부가된 프로테아제를 선택적으로 분리하기 위한 다수의 수단이 존재한다는 것을 잘 알 것이다. 적합한 제거방법은 처리에 선택된 프로테아제의 특정성질 및 형태에 따라 다를 것이다.
상기 분리를 달성하기 위해 바람직한 방법은 용해된 프로테아제를 고형의 물질에 결합시킨 다음 그로 부터 셀룰라아제를 세정하는 것이다. 여기서 사용되는 한개의 결합 매질은 시판중인 양이온 교환수지인 S-세파로오스(스웨덴, 업살라에 소재하는 파마시아 바이오테크 제품)이다. 이것은 6.0 미만의 pH를 갖는 셀룰라아제 및 프로테아제 용액과 접촉될 때 시판중인 프로테아제 효소와 결합한다. 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제 효소 제제로 부터 프로테아제 파파인을 제거하기에 적합한 S-세파로오스를 사용한 바람직한 방법은 셀룰라아제 및 프로테아제의 혼합물을 3000 μ-S 이하의 도전성으로 투석한 다음 4.5 내지 5.0 pH 및 20℃ 미만의 온도에서 S-세파로오스 수지를 통과시키는 것이다.
바람직한 실시예에서, 프로테아제는 회수되어 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제의 다른 뱃치에 재사용될 수 있다. 프로테아제를 회수하기 위한 바람직한 방법은 4.5 내지 5.0의 pH 및 20℃의 온도에서 S-세파로오스 수지에 프로테아제를 결합시키는 것이다. S-세파로오스 수지는 약 100 gm/l의 프로테아제 파파인을 결합할 수 있다. 셀룰라아제/파파인 혼합물은 수지를 통과하고 또 수지가 파파인으로 충분히 로딩되면, 연수로 세정하여 셀룰라아제를 오염시키는 물질을 제거한 다음 1M 염화나트륨 용액으로 세정하여 파파인을 배출한다. 회수 작업동안 파파인은 가역적 산화적 불활성화되기 때문에 환원조건을 유지하는 것이 중요하다.
생성물 제제
본 발명의 셀룰라아제 조성물은 이 기술의 숙련자에게 공지된 다양한 담체를 포함할 수 있다. 예컨대 셀룰라아제 조성물과 혼화성인 계면활성제(음이온성 또는 비이온성)는 본 발명의 조성물에 유용할 것이다. 바람직한 계면활성제는 유니온 카아바이드로 부터 구입할 수 있는 TRITON® 시리즈에서 발견되는 폴리옥시에틸화 알코올과 같은 비이온성이다. 계면활성제의 혼입은 백색사 및 청색사 사이의 상대적 콘트라스트를 향상시키고 또 염료 재침착양을 감소시킨다. 상기 조성물에는 필요에 따라 다른 물질이 사용되거나 존재할 수 있는데 예컨대 돌, 충전제, 용매, 완충액, 효소 안정화제, pH 조절제, 효소 활성화제, 형성제, 기타 재침착방지제 등을 포함한다.
효소 조성물은 고체가 과립, 분무 건조되거나 응집된 형태일 수 있는 고형의 생성물로서 제제화될 수 있다. 다르게는 효소 조성물은 액체, 겔 또는 페이스트 생성물로 제제화될 수 있다. 액체 제제가 바람직하다.
데님 세정
스톤워싱된 외관을 만들기 위해 데님을 세정하는 것은 데님 또는 데님 의류를 프로테아제 처리된 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제 조성물을 함유하는 수성 조성물이 제공된 세정기에서 기계적으로 교반하는 것에 의해 실질적으로 달성될 수 있다. 데님을 처리하기 위해 사용되는 조성물의 양은 셀룰라아제 조성물에서 셀룰라아제 단백질의 농도, 세정기에서 데님 기질의 양 및 소망하는 스톤워싱 효과정도 및 이 기술분야의 숙련자에게 공지된 기타 변수에 따라 상이할 것이다. 프로테아제 처리된 트리코데르마(Trichederma) 셀룰라아제 조성물의 바람직한 양은 일반적으로 데님 kg당 500 내지 200,000 CMC 단위이고, 보다 바람직하게는 데님 kg당 약 5,000 내지 100,000 CMC 단위이다.
바람직한 실시예에서, 데님 세정처리는 30℃ 내지 70℃의 승온, 보다 바람직하게는 45℃ 내지 55℃에서 실시된다.
바람직한 실시예에서, 데님 세정처리는 pH 4.0 내지 7.5, 보다 바람직하게는 4.5 내지 6.5에서 실시된다. 가장 바람직한 실시예에서 데님 처리에서의 pH는 약 6.0 이다.
셀룰라아제 조성물 이외에, 데님 세정단계에는 다양한 기타 가공 보조재가 사용될 수 있다. 예컨대 셀룰라아제 조성물과 혼화성인 계면활성제(음이온 또는 비이온성)가 본 발명의 방법에서 세정기에 부가될 수 있다. 바람직한 계면활성제는 유니온 카아바이드로 부터 시판되는 TRITON® 시리즈에서 발견되는 폴리옥시에틸화 알코올과 같은 비이온성이다. 계면활성제의 혼입은 백색사 및 청색사 사이의 상대적인 콘트라스트를 향상시키고 염료 재침착량을 감소시킬수 있다. 세정기에는 필요에 따라 예컨대 돌, 충전제, 용매, 완충액, 효소 안정화제, pH 조절제, 효소 활성화제, 형성제, 기타 재침착방지제를 비롯한 다른 물질이 사용되거나 존재할 수 있다.
실시예:
상기 명세서에는 본 발명의 조성물과 이 조성물의 제조방법과 직물 의류를 스톤워싱하는데 상기 조성물을 사용하는 방법이 제시되어 있다. 이하의 실시예는 본 발명의 조성물과 방법에 관하여 상세한 설명을 제공한다. 부가된 프로테아제 및 셀룰라아제 및 농도, 측정, pH, 온도등과 같은 세정 조건을 달리 선정하는 것은 이 기술의 숙련자라면 잘 알고 있을 것이다.
실시예 1: 프로테아제 처리된 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제 조성물의 제조
트리코데르마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum)의 발효에 의해 약 600리터의 천연의 트리코데르마(Trichoderma)셀룰라아제 제제를 생산하여 450 μ-S의 도전성으로 투석시킨다. 이 생성물은 안정화되지 않거나 저장되지 않으면서 이오겐 코포레이숀으로부터 이오겐 셀룰라아제로서 안정화되고 저장된 형태로 구입할 수 있다. 이오겐 셀룰라아제를 단순히 투석시킴으로써 안정화제와 보전제를 제거하는 것에 의해 실질적으로 유사한 물질을 제조할 수 있다. 이어 한외여과법에 의해 500 리터의 부피로 농축시킨다. 생성한 투석된 생성물은 140 gm/l의 단백질 농도 및 고세(1987)의 방법으로 측정된 1599 CMC 단위/ml의 엔도글루카나제 활성을 갖는다. 150 리터의 제제를 제거하고 잔류하는 제제를 150 리터의 연수 및 퀘스트 인터네이셔널로 부터 제품번호 5x98490로 제조되고 퀘스트 인터네이쇼널에 의해 규정된 바와 같이 105 g/kg의 단백질 농도 및 파파인 분말mg에 대하여 1,000 밀크 응고단위(MCU)활성을 갖는 40 kg의 바이오콘 파파인 분말과 혼합한다. 벤조산 나트륨을 사용하여 pH를 4.8로 조정하고 그 혼합물을 거의 35℃ 내지 40℃에서 42 시간 동안 배양하였다. 그로인한 처리정도는 약 216 g 분/g이었다. FPU로 측정된 바와 같이 프로테아제 처리하는 동안 초기 셀룰라아제 활성의 49% 및 CMCU로 측정된 10%가 손실된다. 상기 혼합물을 1시간에 걸쳐 대략 20℃로 냉각시킨다. 그 혼합물을 규조토로 예비코팅된 플레이트 및 프레임 필터상에서 확인한다. 헹굼물을 사용하여 제제를 대략 960 리터 부피로 희석시켰다. S-세파로오스 양이온 교환수지상에서 수지 제조자의 지시(파마시아 테크니컬 메뉴얼 18-1022-19, "이온 교환 크로마토그래피: 원리와 방법", 1991)에 따라서 프로테아제 및 셀룰라아제 혼합물 제제를 통과시키는 것에 의해 프로테아제 및 셀룰라아제 혼합물로 부터 프로테아제를 제거하였다. S-세파로오스는 아세테이트 완충액으로 pH 4.7로 평형화된 다음 프로테아제/셀룰라아제 혼합물을 충전된 수지의 리터당 약 13 g의 파파인 단백질 정도로 수지에 로딩하였다. 그 수지를 pH 4.7 아세테이트 완충액으로 세정하였다. 칼럼 로딩 및 세정상으로 부터 얻은 유출물은 순수한 파파인 유리 셀룰라아제로 구성되었다: 셀룰라아제중의 파파인의 활성은 아조-카제인에 대한 활성을 기초한 검출치 미만이었다. S-세파로오스 결합된 파파인은 수지상에서 1.0 M 염화나트륨, pH 4.8을 통과함으로써 회수될 수 있다. 프로테아제 처리된 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제 제제의 부피는 약 2,700 리터였다. 생성한 프로테아제 처리된 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제 제제는 그의 pH를 4.0으로 조정한 다음 벤조산나트륨을 0.5%로 부가함으로써 저장하였다. 상기 조성물을 한외여과법에 의해 농축시키고 통상적으로 안정화("Enzyme Applications", Encyclopedia of Chemical Technology, Vol.9, Fourth Edition, 1994)시켜 약 1,800 CMC 단위/ml의 최종 농도를 얻었다.
실시예 2: 프로테아제 처리된 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제 조성물을 사용한 데님 세정
35 파운드의 유니맥(UniMac) 세정기/추출기를 이용하였다. 약 5.1 kg의 발호된 데님 의류를 상기 기기에 넣었다. 이 데님은 퀘백 드루몬드빌에 소재하는 스위프트사에 의해 제조된 스위프트(Swift) 14 온스 #37628 데님의 30 cm.길이 및 5 ㎡ 조각의 3개의 재봉 팬트 레그(pant leg) 및 스위프트 12온스 #25113 데님의 30 cm 길이의 3개의 재봉 팬트 레그로 구성되었다. 이 데님은 지스트-브로케이드사로 부터 구입할 수 있는 30 g의 펩피다제 UC 알파-아밀라제 효소화 70℃에서 15분간 처리시키는 것에 의해 발호되었다. 상기 기기에는 51 리터의 온수를 넣어 50℃로 만들었다. 액체 비율은 10:1 (액체중량 대 의류중량)이었다. 액체를 85% 인산 300 g과 수산화나트륨 펠릿 114g을 사용하여 pH 6.0으로 완충시켰다.
상기 기기를 1분간 교반하여 완충액을 분산시키고 온도를 유지시켰다. 이 지점에서 실시예 1의 70 ml의 프로테아제-처리된 셀룰라아제 제제를 기기에 부가하였다. 이 의류를 47 RPM에서 60분간 세정하였다. 이후 세정조를 탈수시켰다.
상기 세정조에 50℃의 물을 넣고 또 2 g/L의 소다회를 부가하여 pH를 9.0 내지 11.0으로 만들어 셀룰라아제 활성을 파괴시켰다. 이 기기를 10분간 교반시킨 다음 세정조를 탈수시켰다. 의류를 냉수로 5분간 헹군다음 온수로 30초간 헹구었다. 50℃에서 10분간 헹굼을 2회 실시한 다음 세정조를 탈수시켰다. 의류를 표준의 가정용 드라이어에서 30분간 건조시켰다. 의류를 드라이어로 부터 빼내고 스팀없이 다림질하였다.
엘레프로(Elrephro) 명도계를 이용하여 데님의 명도를 측정하였다. #37628 팬트 레그의 명도는 평균적인 염료 제거를 추산하는데 이용되었으며 공지된 인디고 함량의 샘플과 비교한 직물로 부터 인디고 염료 총제거량을 산출하였다. 결과를 미세정 데님에서 인디고의 %로서 보고한다. #25113 팬트 레그의 명도는 이면오염의 정도를 추산하는데 이용되었고 공지된 인디고 함량의 샘플과 비교한 직물상에 침착된 인디고 염료의 총량으로 산출되었다. 결과를 미세정 데님에서 인디고의 %로서 보고한다.
상기 과정을 88 ml의 이오겐 셀룰라아제, 표준 재침착성 셀룰라아제 효소를 사용하여 반복하였다. 그 결과를 하기 표 1에 수록한다.
표 1. 프로테아제 처리 및 미처리 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제의 대조
상기 표 1로 부터 알 수 있듯이 거의 비슷한 염료 제거정도를 갖는 것이라도 프로테아제 처리된 셀룰라아제에 노출된 데님은 재침착성 셀룰라아제 보다 훨씬 적은 이면오염을 나타낸다.
실시예 3: 부가된 계면활성제를 사용한 데님 세정
이하의 효소가 데님을 세정하는데 사용된 이외에는 실시예 2에서와 동일한 과정으로 실시하였다:
a. 실시예 2에서와 같이 실시예 1로 부터의 80 ml의 프로테아제-처리된 트리코데르마
b. 40 ppm의 TRITON® X100이 셀룰라아제 세정의 개시시에 세정기에 부가된 이외에는 실시예 2에서와 같이 실시예 1의 80 ml의 프로테아제-처리된 트리코데르마(Trichoderma)셀룰라아제.
c.160 ppm의 TRITON® X100이 셀룰라아제 세정의 개시시에 세정기에 부가된 이외에는 실시예 2에서와 같이 실시예 1의 80 ml의 프로테아제-처리된 트리코데르마 (Trichoderma) 셀룰라아제.
표 2. 부가된 계면활성제의 효과의 표시
표 2에서 나타낸 바와 같이, 계면활성제의 부가는 총 염료 방출량에 현저한 손실없이 이면오염을 감소시킨다.
실시예 4: 대조적 데님 세정 결과
이하의 효소를 데님 세탁에 사용한 이외에는 실시예 2에서 기재된 과정에 의해 실시하였다:
a. 실시예 2에서와 같이 시험된 실시예 1의 프로테아제 처리된 셀룰라아제
b. 클락슨 일행의 실험방법에 따라서, 이오겐 셀룰라아제 (142 mg/ml의 단백질로 구성)를 채침착성 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제로서 부가하고 또 각기 0.02 ml, 0.10 ml, 0.5 침착성 트리코데르마(Trithoderma) 셀룰라아제로서 부가하고 또 각기 0.02 ml, 0.10 ml, 0.5 ml, 2.5 ml 및 12.5 ml의 레티다제 WSL-2 서브틸리신(지스트-브로케이드로 부터 구입)을 프로테아제로서 부가하였다. 이 프로테아제는 110 mg/ml의 단백질로 구성된다. 이오겐 셀룰라아제의 사용양은 78 ml의 셀룰라아제를 갖는 12.5 ml 프로테아제로 실시한 실험 이외에는 88 ml이었다. 프로테아제 부가량은 셀룰라아제 단백질 중량에 대하여 0.02%, 0.08%, 0.40%, 2.0% 및 10%의 서브틸리리신 단백질이었다. 클락슨 일행에 의해 시사된 최소의 바람직한 양은 0.1% 이었다. 클락슨 일행에 의해 제시된 바와 같이, 152 g의 빙초산 및 55 g의 수산화나트륨 펠릿을 사용하여 세정기에서 pH를 5.0으로 조정하였다. 그외의 모든 과정은 실시예 2에서와 동일하였다.
결과를 하기 표 3에 나타내며 프로테아제 처리된 트리코데르마(Trichoaerma) 셀룰라아제 조성물은 클락슨 일행에 의한 방법으로 얻은 이면오염 보다 훨씬 적은 이면오염을 갖는 데님을 가능하게한다. 상기 결과는 세정시 프로테아제가 필요하다는 클락슨 일행의 제시와 대조적이지만, 이들은 세정기에서 셀룰라아제 및 프로테아제가 함께 부가되면 셀룰라아제에 대하여 0.1% 이상의 프로테아제 만큼 이면오염이 현저하게 감소됨을 뒷받침한다.
표 3. 비 재침착성 셀룰라아제 효소 조성물의 대조
실시예 5: 프로테아제 처리된 트리코데르마 셀룰라아제 조성물의 제조
트리코데르마 롱기브라키아툼(Trichoderma longibrachiatum)을 발효시키고 310 μS의 도전성으로 투석시키는 것에 의해 약 1,000 리터의 천연 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제 제제를 제조하였다. 이 생성물은 안정화되거나 보존되지 않지만 이오겐 코포레이숀으로 부터 이오겐 셀룰라아제로서 안정화된 형태 및 보존된 형태로 구입할 수 있다. 이오겐 셀룰라아제를 단순히 투석함으로써 안정화제 및 보존제를 제거하는 것에 의해 실질적으로 유사한 물질을 제조할 수 있다. 이어 한외여과에 의해 725 리터의 부피로 농축시켰다. 생성한 투석된 생성물은 98 gm/l의 단백질 농도와 고세(1987)의 방법을 이용한 1325 CMC 단위/ml의 엔도글루카나제 활성을 가지고 있었다. 375 리터의 제제를 제거하고 잔류하는 제제를 150 리터의 연수 및 폴렉스코 인코포레이티드로 부터 구입할 수 있고 32 g/kg의 활성 파파인 단백질 농도와 300 밀크 응고 단위(MCU)/mg의 파파인 분말 활성을 갖는 15.75 kg의 "Folexco Papain 300 MCU"와 혼합하였다. pH를 밴조산 나트륨으로 4.8로 조정하고 그 혼합물을 약 35℃ 내지 50℃에서 27시간 동안 배양하였다. 처리정도는 약 24 g 분/g이었다. 본 발명자들은 프로테아제 처리하는 동안 약 20%의 FPU 활성이 손실되고 CMCU 활성은 전혀 감소되지 않았다고 추산한다. 이 혼합물을 2시간에 걸쳐 약 10℃로 냉각시킨다. 이 혼합물을 규조토로 예비피복된 플레이트 및 프레임 필터상에서 분류시켰다. 물로 헹구면서 제제를 약 800 리터의 부피로 희석시쳤다. 프로테아제 및 셀룰라아제 혼합물을 수지 제조자(파마시아 테크니컬 메뉴얼 18-1022-19 "이온 교환 크로마토그래피: 원리와 방법", 1991)의 지시에 따라서 S-세파로오스 양이온 교환 수지상을 통과시키는 것에 의해 프로테아제를 제거하였다. S-세파로오스를 아세트산 완충액으로 pH 4.7로 완충시킨 다음 프로테아제/셀룰라아제 혼합물을 팩킹된 수지의 리터당 약 5 g 파파인 단백질 정도로 수지에 로딩하였다. 이 수지를 pH 4.7 아세트산 완충액으로 세정하였다. 칼럼 로딩과 세정 상으로 부터 모아진 유출액은 순수한 파파인 유리 셀룰라아제로 구성되었다: 셀룰라아제에서 파파인의 활성은 아조-카세인에 대한 활성을 기준으로 할때 검출 한도 미만이다. S-세파로오스에 결합된 파파인은 1.0M 염화나트륨(pH4.8)을 수지상에서 통과시키는 것에 의해 회수하였다. 프로테아제 처리된 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제의 부피는 약 1,600 리터였다. 생성한 프로테아제 처리된 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제 제제를 pH 4.0으로 조정하고 벤조산 나트륨을 부가하여 0.5%로 만들었다. 이 조성물을 한외여과에 의해 농축시키고 통상적으로("Enzyme Applications", Encyclopedia of Chemical Technology, Vol.9, Fourth Edition, 1994) 안정화시켜 약 2,000 CMC 단위/ml 최종 농도를 얻었다.
실시예 6: 프로테아제 처리된 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제 조성물을 사용한 데님 세정
이하의 효소가 데님 세정에 사용된 이외에는 실시예 2에 기술된 바와 같은 과정으로 실시하였다.
a. 실시예 5로 부터의 80 ml의 프로테아제-처리된 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제, 실시예 2에서와 같이 사용됨.
b. 실시예 1로 부터 70 ml의 프로테아제 처리된 트리코데르마 (Trichoderma) 셀룰라아제, 실시예 2에서와 같이 시험됨.
c. 실시예 2에서와 같이 기재되고 시험된 88 ml의 이오겐 셀룰라아제.
결과를 하기 표 4에 수록하며 표로 부터 실시예 5에서 사용된 파파인 처리량이 적으면(24 g 분/g), 실시예 1의 보다 강한 처리(216 g 분/g) 보다 양호한 성능을 나타내지 못한다는 것을 나타낸다.
표 4. 프로테아제 처리 및 미처리 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제의 대조
실시예 7: 대조적 데님 세정 결과
실시예 2에 기재된 방식에 따라 이하의 효소를 데님 세정에 사용하였다:
a. 실시예 1에서 제조되고 실시예 2에서와 같이 시험된 프로테아제 처리된 셀룰라아제.
b. 실시예 1에서 제조되고 또 실시예 3에서와 같이 시험된 80 ml의 프로테아제 처리된 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제와 40 ppm의 TRITON® X100을 셀룰라아제 세정 개시시에 세정기에 부가.
c. 프로테아제 효소, 재침착성 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제 및 계면활성제를 함유하는 것으로 알려지고 Genencor International사로 부터 시판중인 셀룰라아제 생성물인 Euro L을 100 ml의 양으로 부가하였다. 제조자의 지시에 따라서, 150 g의 빙초산 및 85 g의 수산화 나트륨 펠릿을 사용하여 pH를 5.5로 조정하였다. 그외의 모든 과정은 실시예 2와 동일하였다.
d. Euro L을 100 ml의 양으로 세정기에 부가하였다. 40 ppm의 TRITON® X100을 셀룰라아제 세정 개시시에 세정기에 부가하였다. 제조자의 지시에 따라서, 150 g의 빙초산 및 85 g의 수산화나트륨 펠릿을 사용하여 pH를 5.5로 조정하였다. 그외의 모든 과정은 실시예 2에서와 같았다.
e. 노보 노르디스크로부터 시판되며 후미콜라 인솔렌스(Humicola insolens)에 의해 제조된 이면오염이 적은 효소인 Denimax L을 250 ml의 양으로 부가하였다. 제조자의 지시에 따라서, 297 g의 인산 및 125 g의 수산화나트륨 펠릿을 사용하여 pH를 6.5로 조정하였다. 그외 모든 공정은 실시예 2에서와 같았다.
f. Demimax L을 250 ml의 양으로 세정기에 부가하였다. 44 ppm의 TRITON® X100을 셀룰라아제 세정 개시시에 세정기에 부가하였다. 제조자의 지시에 따라서, 297 g의 인산 및 125g의 수산화나트륨 펠릿을 사용하여 pH를 6.5로 조정하였다. 그외 모든 공정은 실시예 2에서와 동일하였다.
결과를 하기 표 3에 수록하며 이들 결과는 유사한 염료 방출의 경우, 프로테아제 처리된 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제 조성물이 Euro L 또는 Denimax L 보다 훨씬 낮은 이면오염을 갖는 데님을 초래함을 나타낸다. Euro L에 대하여 계면활성제 없이 이러한 프로테아제 처리된 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제의 성능이 우수한 것은 Euro L이 성능 향상 계면활성제를 함유하더라도 마찬가지이다. 후미콜라 인솔렌스(Humicola insolens)셀룰라아제의 낮은 능력은 다른 효소를 사용하여 데님을 탈색시키는데 필요한 양 보다 2 내지 3 배량의 Denimax L이 필요한 사실로 부터 알 수 있다.
표 3. 비 재침착성 셀룰라아제 효소 조성물의 대조
본 발명의 바람직한 실시예가 예시되고 기재되었지만, 본 발명은 첨부한 특허청구의 범위에 의해서만 한정될 뿐이다.

Claims (13)

  1. (a) 프로테아제를 셀룰라아제에 부가하는 것에 의해 셀로비오스 가수분해효소 및 엔도글루카나제 효소를 함유하는 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제를 제한된 프로테아제 처리시키고; 또
    (b) 조성물을 규정하도록 부가된 프로테아제를 제거하는 것에 의해 셀룰라아제를 정제하는 것을 포함하는 공정의 생성물인 프로테아제 처리된 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제를 포함하는, 천연 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제에 비하여 이면오염을 적게 나타내는 셀룰라아제 효소 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 프로테아제는 처리된 셀룰라아제가 필터 페이퍼 유닛(FPU)으로 측정된 초기 활성의 5% 내지 50%를 상실하고 또 CMC(카르복시메틸셀룰로오스) 유닛으로 측정된 초기 활성을 70 내지 100%로 유지하도록 셀룰라아제를 처리하는 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 프로테아제는 처리된 셀룰라아제가 필터 페이퍼 유닛(FPU)으로 측정된 초기 활성을 15% 내지 90%로 유지하고 또 CMC(카르복시메틸셀룰로오스) 유닛으로 측정된 초기 활성을 70% 내지 100%로 유지하도록 셀룰라아제를 처리하는 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 제한된 프로테아제 처리단계의 정도는 프로테아제 대 셀룰라아제 단백질의 중량비와 평균 처리시간의 곱을 이용하여 정의되어 1.0 내지 10,000 g분/g 사이인 조성물.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 제한된 프로테아제 처리단계의 정도는 프로테아제 대 셀룰라아제 단백질의 중량비와 평균 처리시간의 곱을 이용하여 정의되어 10.0 내지 5,000 g 분/g 사이인 조성물.
  6. 제 1항에 있어서, 부가된 프로테아제가 파파인 프로테아제를 포함하는 조성물.
  7. 제 1항에 있어서, 정제단계후 조성물내에 잔류하는 부가된 프로테아제는 전체 단백질에 대하여 측정된 바와 같이 조성물의 0 내지 0.1 중량%인 조성물.
  8. 제 1항에 있어서, 정제단계후 조성물내에 잔류하는 부가된 프로테아제는 전체 단백질에 대하여 측정된 바와 같이 조성물의 0 내지 0.05 중량%인 조성물.
  9. 제 1항에 있어서, 부가된 프로테아제는 정제단계후 조성물에 잔류하지 않는 조성물.
  10. 제 1항에 있어서, 프로테아제 처리된 트리코테르마(Trichoderma) 셀룰라아제는 엔도글루카나제(EG) 효소 및 셀로비오스가수분해효소(CBH) 코어 도메인을 포함하고, 상기 CBH 코어 도메인은 천연의 결합 영역에 연결되어 있지 않고 또 조성물은 트리코데르마에 의해 천연적으로 생산되는 양에 비하여 아무런 증가나 잔류하는 프로테아제 활성을 갖지 않는 조성물.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 셀룰라아제는 결합 영역없이 CBH 코어 도메인을 직접적으로 생산하는 트리코데르마(Trichoderma) 균주에 의해 제조되는 조성물.
  12. (a) 프로테아제를 셀룰라아제에 부가하는 것에 의해 셀로비오스 가수분해효소 및 엔도글루카나제 효소를 함유하는 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제를 제한된 프로테아제 처리시키고; 또
    (b) 조성물을 규정하도록 부가된 프로테아제를 제거하는 것에 의해 셀룰라아제를 정제하는 것을 포함하는 공정의 생성물인 프로테아제 처리된 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제를 포함하는, 천연 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제에 비하여 이면오염을 적게 나타내는 셀룰라아제 효소 조성물과 데님을 접촉시키는 것을 포함하는, 인디고 염색된 데님의 표면에 마모된 외관 및 청색섬유와 백색 섬유 사이에 높은 콘트라스트를 도입하는 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 프로테아제 처리된 트리코데르마(Trichoderma) 셀룰라아제는 엔도글루카나제(EG) 효소 및 셀로비오스가수분해효소(CBH) 코어 도메인을 포함하고 상기 CBH 코어 도메인은 천연의 결합 영역에 연결되어 있지 않고 또 조성물은 트리코데르마에 의해 천연적으로 생산되는 양에 비하여 아무런 증가나 잔류하는 프로테아제 활성을 갖지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
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