CN1076770C - 用蛋白酶处理并纯化的纤维素酶组合物 - Google Patents
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Abstract
在斜纹粗棉布织物和/或衣服的酶促“石磨”过程中,经常发生不希望的蓝色染料在斜纹粗棉布表面上的再沉积。本发明涉及一种解决这一问题的方法,该方法中使用了含有木霉属内切葡聚糖酶和木霉属纤维二糖水解酶的酶的组合物,这些酶已用蛋白酶部分消化以分离其核心区和结合区。使用这一组合物能降低蓝色染料的再沉积,从而改进涉及使用再沉积或返染纤维素酶的石磨过程。
Description
本发明涉及一种在斜纹粗棉布织物和衣服用纤维素酶石磨时,用来降低或防止靛蓝染料反染到斜纹粗棉布上的组合物和方法。
斜纹粗棉布是一种编织棉布,其经纱经常用蓝色染料靛蓝染色。用靛蓝染色的斜纹粗棉布的一个必要特征是由经纱和纬纱的蓝线和白线交替所产生的观感,由于平常的磨耗和磨损使斜纹粗棉布具有蓝上见白的外观。斜纹粗棉布的流行外观是石磨外观。这种石磨外观包括与未石磨的斜纹粗棉布比较,特别是在线缝处周围,局部有淡蓝色,甚至是较淡的颜色。石磨材料通常具有较软的质地,与蓝色相对维持所希望的白色。依照传统的做法,石磨通过将斜纹粗棉布材料在有浮石存在的条件下洗涤来完成的,使得织物具有褪色或穿旧的观感以及在与之相对的蓝色上有所希望的白色。
酶,特别是纤维素酶,经常用在斜纹粗棉布的加工过程中。特别地,使用纤维素酶使斜纹粗棉布具有石磨的外观,而不需使用传统石磨方法中那么多的浮石。这种处理方法在这里称之为酶促“石磨”,即使在洗涤机中没有使用浮石也是这样。由于石头的使用有几方面的缺点,所以石磨中使用酶变得更加普遍了。例如在加工过程中使用的石头会引起机器的磨耗和磨损、由于产生硬渣而导致的环境废物问题,以及与从机器和衣服的口袋中除去石头相关的高劳动成本。因此期望在洗涤中减小石头的用量或不用石头。
与使用石头相反,对于机器来说,酶(特别是纤维素酶)是安全的,导致了小的或没有废物问题,大大地降低了劳动成本。因此在石磨中使用酶是有利的。尽管使用如纤维素酶之类的酶比使用石头相比是有利的,然而存在与为这一目的而使用酶相关的问题。例如,与某些纤维素酶一如从朽木真菌木霉属(wood-rotting fungus Trichoderma)中得到的纤维素酶,相关的一个问题被称之为“再沉积(redeposition)”或“返染(baekstaining)”(这两个术语在此将被交替使用),这是指在酶促石磨过程中某些染料返回到织物上。这种“再沉积”或“返染”会导致蓝颜色染到斜纹粗棉布的白色纱上,使得蓝色与白色纱之间的对比较小,并且有磨蚀点出现(如,在蓝色外观上有蓝点,而不是在蓝色外观上有白色)。请参看AmericanDyestuff Reporter,Sept.1990,pp.24-28。
再沉积和返染对某些使用者来说是令人讨厌的。例如,尽管木霉属纤维素酶与腐殖菌属(Humicola)纤维素酶相比对斜纹粗棉布材料具有特殊的活性,但是由于从腐殖菌属获得的纤维素酶的具有低水平的返染,所以是优选的。同样,由于木霉属纤维素的能力越高酶的使用量就越少,在明显较短的加工过程中能得到程度越高的磨蚀。
染料在石磨过程中的再沉积问题已为斜纹粗棉布加工者所关心。过去曾对木霉属纤维素酶组合物问题所作的努力包括向纤维素酶洗涤中添加抗再沉积化学药品,如表面活性剂和其它试剂,帮助分散释放出来的靛蓝染料以降低再沉积。此外,斜纹粗棉布加工者还试图使用对斜纹粗棉布活性较小的纤维素酶,再加上超量的漂洗。这将导致额外的化学药品的成本和较长的加工时间。为解决再沉积问题的另一方法包括在加工过程中加入适度的漂白剂或污渍去除剂。这种方法影响衣服的最终色泽且延长了加工时间。
这些方法对减小再沉积程度的能力是有限的,不能完全令人满意,并且还有一些令人讨厌的返染存在。酶和石头一起使用在减轻再沉积程度上是有利的,然而对于加工者存在与使用石头有关的问题。
另一种方法是在石磨处理过程中添加蛋白酶,正如Clarkson等人在公开的PCT说明书No.WO94/29426(以下称之为“Clarkson等人的”)中所描述的。发现用包含再沉积纤维素酶和添加的蛋白酶的组合物处理斜纹粗棉布改善了白色和蓝色纱之间的对比,降低了染料的再沉积。蛋白酶在洗衣机中起作用,由于某些原因被认为能防止纤维素酶蛋白质(cellulaseproteins)粘附到有色的颗粒上再返回到斜纹粗棉布的表面,当用量适度时,它们对由于纤维素酶的作用所得的磨蚀外观的没有显著的不良影响。这一方法在提供了某些优点的同时,其成本很高,而且需要小心控制,这是因为蛋白酶由于其性质趋向于破坏纤维素酶。工作人员必需在期望的对减少返染的蛋白酶解作用(proteolytic effect)与不期望的对降低纤维素酶活性的蛋白酶解作用之间保持平衡。
在Clarkson等人的方法中,蛋白酶基本上是作为一种污渍去除剂或污渍抑制剂使用,必须在洗涤过程中使用。在Clarkson等人提出了三种选择:(1)与纤维素酶一起直接向洗衣机中添加蛋白酶;(2)在用纤维素酶处理后向漂洗循环中添加蛋白酶;(3)在洗涤之前将蛋白酶与纤维素酶掺混。相对于同时添加蛋白酶和纤维素酶的基本方法,在漂洗循环中添加蛋白酶避免了对纤维素的酶的显著蛋白酶解作用,其缺点是增加了额外的加工步骤。另一方面,纤维素酶与蛋白酶的预先掺混提供了一种简单的易使用的配方,但是难以在期望的去除污渍的蛋白酶解作用与不期望的破坏纤维素酶活性的蛋白酶解作用之间保持平衡。例如,高活性的蛋白酶在通常的储存和运输期间内能完全破坏纤维素酶。这种储存的稳定性是能解决的,但是需要:(1)选择一种具有抗沾污能力,但至多在有限限度内能消化(digest)纤维素酶的蛋白酶(枯草杆菌蛋白酶是一种对纤维素酶活性不太高的,却是熟知的蛋白污渍去除剂,是优选的),(2)在提高的温度下将选择的蛋白酶和纤维素酶预先保温,以保证在纤维素酶上的蛋白酶解作用所要攻击的物质能完全消除,而且工业配方在储存和运输期间将是稳定的。
较强的蛋白酶作用,特别是蛋白酶木瓜蛋白酶对木霉属纤维素酶的作用,已得到了深入的研究。已经发现,有限量的木瓜蛋白酶消化作用能够将木霉属纤维二糖水解酶的核心区与其天然的结合区割裂。这就具备了基本消除这些酶所具有的抵抗结晶纤维素如微晶纤维素(Avicel)或棉花的任何可测量的活性以及同时保护它们抵抗可溶性底物如β一葡聚糖的活性的效果。作为结果,以前的操作工推断天然结合区域在使纤维二糖水解酶对结晶纤维素进行攻击中扮演了重要的角色。使木瓜蛋白酶完全消除CBH在结晶纤维素上的活性所需的量大约为每克纤维素酶蛋白0.1—0.5克木瓜蛋白酶,如果都乘以以分钟计的处理时间(g min/g),则是乘以了处理时间的蛋白酶蛋白与纤维素酶蛋白的重量比率。
基于前述关于降低或防止再沉积方法的缺点,有必要提出一种更易控制,成本更为有效的方法解决染料在石磨过程中的再沉积或返染。
与之相应,需要找到一种酶促组合物或方法,它在成本上更有效、具有更好的储存稳定性和高性能,而不包括再沉积或返染纤维素酶。
本发明的发明者已经发现:将含有纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶的木霉属纤维素酶经过有限的蛋白水解(即有限蛋白酶处理)后除去添加的蛋白酶,从而制成的低返染纤维素酶组合物,用这样制成的低返染纤维素酶组合物洗涤靛蓝染色的棉花,与使用再沉积纤维素酶制剂或既含有纤维素酶又含有蛋白酶的制剂比较是一种改进。通过用这种组合物处理得到的斜纹粗棉布出人意料地具有低水平的染料再沉积,因此,在斜纹粗棉布上具有良好的蓝白纱的对比。这种组合物是储存稳定的,与过去的方法比较只需要明显少量的蛋白酶,即使在没有Clarkson等人指出的“返染抑制组合物”(即蛋白酶)存在的条件下也具有令人惊奇地低的再沉积水平。本发明者还提供了一种回收和再循环蛋白酶使这种昂贵的组份能够再利用的方法。斜纹粗棉布的洗涤过程中,可以选择地向所描述的组合物或方法中添加少量的化学表面活性剂。如果添加表面活性剂,它可以和纤维素酶一起在洗涤时加入,也可以作为一种后处理漂洗。此外,在进行斜纹粗棉布洗涤过程中,可以向所述组合物中添加或不添加石头。
当斜纹粗棉布与木霉属纤维素酶组合物一起石磨时,显示出返染水平明显降低,并且在蓝白纱之间的对比有明显的提高,该组合物经受有限的蛋白酶处理,接着纯化以除去蛋白酶。发明者并不寄希望有任何特别的理论来帮助,但是对这种明显矛盾的现象,一方面在洗涤中需要蛋白酶(Clarkson等人的),另一方面它又不必存在(本发明),的一种可能的解释是:蛋白酶在斜纹粗棉布的洗涤过程中以两种独立的、不同的机理影响返染。
第一种机理是Clarkson等人提出的,蛋白酶在洗衣机中简单地起污渍去除剂的作用。这种机理与Clarkson等人的发现相一致,这一发现是即使在纤维素酶处理中自色的斜纹粗棉布已经被沾污,蛋白酶也能除去再沉积的染料。这也与熟知的在洗涤剂系统中将蛋白酶用作污渍去除剂相一致。有一点并不令人惊奇,即由纤维素蛋白产生的以染料为基础的污渍是可以用一种熟知的处理与蛋白质一蛋白酶有关的污渍的方法来除去。
然而,如果本领域内的技术人员从来没有将蛋白酶放入洗衣机中的话,在第一种机理的引导下,并不能预料蛋白酶能够抑制洗涤中的返染。为了解释发明者的惊人的发现,即蛋白酶似乎能够做到这一点,本发明者认为存在第二种机理,与第一种机理相比是更微妙和更不明显的。特别是本发明者相信有限的蛋白酶处理改变了纤维素酶的作用模式,把它们变成了更小、更易分散的不会返染的颗粒。已有报道蛋白酶通过切割其天然纤维素结合区,能使存在于木霉属纤维素酶复合物中的纤维二糖水解酶组份对结晶纤维素不具有活性。本发明者假设这种处理仍然可以留下能够使纤维素中产生小缺口的纤维二糖水解酶,它自身是不能检测出来的,但是当与木霉属纤维素酶复合物中的其它组份,如内切葡聚糖酶,结合使用时,将在斜纹粗棉布的洗涤环境中导致实实在在的磨蚀。本发明者还进一步认为,由于改性的纤维二糖水解酶不具有结合区,与用未经处理过的木霉属纤维素酶处理的相比,它们对结晶纤维素作用可能受到较少的局限,并更均匀地分布在斜纹粗棉布纤维上。对于未经处理过的木霉属纤维素酶,它们的高度局部化的作用模式可能会导致相对大的颗粒,这些颗粒是当酶在大部分纤维中直接切人时从纤维素的主体上释放出来的。与此相反,在存在有显著量的剪切和混合的环境中,用蛋白酶处理的木霉属纤维素酶组合物的分散样式越多,将使得从纤维素主体上松动脱落下来的颗粒越小、越容易分散。其结果是返染也就越少。
第二种机理,尽管还未被认识,但它在Clarkon等人所描述的结合纤维素酶和蛋白酶的处理上可能扮演了一个次要的角色。由于以前的操作人员集中研究在洗衣机中更明显地使用蛋白酶来去除污渍,所以至今还未能认识。如果一个人准备制造一种包括纤维素酶和蛋白酶的单一的商用酶组合物,是难以有效地操纵蛋白酶解作用的,因此不能全面地研究。用Clarkson等人自己的话说,这是一种困难的协调,你必须“在对降低污渍的蛋白酶解作用与降低磨蚀的蛋白酶解作用之间保持平衡”。因此,为了制造一种能直接加到洗涤中的结合纤维素酶/蛋白酶的酶组合物,本领域的技术人员肯定会避免使用如木瓜蛋白酶这样的蛋白酶,这是因为人们已经知道这种蛋白酶能破坏结晶纤维素活性,而采用人们更了解的,如枯草杆菌蛋白酶在洗涤剂中抗污渍性能。
令人惊奇的是本发明者发现按下面的方法能得到较好的总效果:(1)放弃第一种“抗污渍”机理带来的好处(即从酶的制剂中除去蛋白酶再洗涤斜纹粗棉布),(2)利用这种变化带来的优点改进蛋白酶解反应的条件得到更强和更富攻击性的处理,从而使从前未认识到的第二种机理的效果最大。总之用这种方法得到的新组合物能使斜纹粗棉布得到很好的,而且成本上更有效的洗涤。
在进一步详细讨论本发明之前,先定义下面的术语:
术语“木霉属纤维素酶组合物”至少包括由真菌微生物木霉属菌种(Trichoderma sp.)产生的一种或多种纤维二糖水解酶(CBH),和一种或多种内切葡聚糖酶(EG),当组合物是由天然存在的木霉属微生物产生的时,每一种组份都是以微生物自然产生的比率存在,这一组合物有时称之为“完全的或天然的木霉属纤维素酶组合物”。
本发明中的木霉属纤维素酶组合物也可以是指含有纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶的从木霉属菌种得到的纤维素酶组合物,这种木霉属菌种已在遗传上改性,能多生成。少生成或不生成CHB和/或EG纤维素酶组份中的一种或多种。这些内切葡聚糖酶和纤维二糖水解酶不仅可以包括作为天然木霉属纤维素酶组合物中一部分的那些酶,而且可以包括作为截短的纤维素酶蛋白质的改性纤维素酶组合物,或它们的一部分,或其衍生物,其中的纤维素酶蛋白质含有CBHs或EGs的结合区或核心区。改性纤维素酶组合物的其它例子可以包括在某种程度上的糖基化转化或在纤维素酶或截短的纤维素酶的一级结构上的氨基酸取代,天然木霉属纤维素酶,如上面所描述的那些,的任何天然的或改性的变体都可认为是木霉属纤维素酶的组合物,即使它们是以木霉属以外的基因改性的宿主微生物所产生的也是这样。术语“蛋白酶处理过的木霉属纤维素酶”是指其中有很大一部分CBH核心区的CBH结合区被切去的木霉属纤维素酶组合物,这种处理的例子为通过添加蛋白酶来处理。然而,这种用蛋白酶处理的木霉属纤维素酶组合物中不应有大量增加的或残留的高于由微生物自然产生量的活性蛋白酶存在。例如,这一增量应小于纤维素酶组合物中蛋白质总量的0.1%。
本发明的用蛋白酶处理的纤维素酶组合物可以包括两种制剂,其中添加的蛋白酶用来将CBH核心和结合区切割,此外,改性纤维素酶组合物的CBH核心区没有结合区域是直接由基因改性的微生物产生的。在所有情形中,用蛋白酶处理的木霉属纤维素酶组合物都应含有内切葡聚糖酶和CBH核心蛋白。
本方法包括使要部分或全部酶促石磨的斜纹粗棉布与蛋白酶处理的木霉属纤维素酶组合物接触,其中组合物用量应足以达到从衣服上去除染料的程度。这样一种酶的使用将使衣服在蓝白纱之间具有良好的对比,并且具有低水平的返染。酶本身具有良好的稳定性,而且不存在蛋白酶明显降解的危险。
在本发明的一个方案中,用蛋白酶处理的木霉属纤维素酶组合物是通过将木霉属纤维素酶组合物与添加的处理量的蛋白酶接触来制备的,蛋白酶蛋白质对纤维素酶蛋白质的重量比率乘以平均处理时间应为1.0g min/g-10,000g min/g。然后,使用色谱分离法从纤维素酶中除去蛋白酶。在本发明的另一方案中,用蛋白酶处理的木霉属纤维素酶组合物与靛蓝染色的斜纹粗棉布一起放入洗衣机中,在斜纹粗棉布的蓝色和白色纤维上产生高对比度的磨蚀现象。纤维素酶
木霉属纤维素酶组合物通常是用木霉属真菌浸入培养(submergedculture)来生产的,其生产和回收方法在文献中有详细记载,是本领域中的技术人员所熟知的。这些酶的来源有包括Iogen Corporation,GenencorInternational,Novo Nordisk,Gist-Brocades,Sigma Chemicals和EnymeDevelopment Corporation。
本发明的一种优选木霉属纤维素酶组合物是用真菌木霉属longibrachiatum的菌株生产的。其中,酶CBH1、CBH2、EG1、EG2和EG3的相对浓度与完全或天然木霉属纤维素酶组合物中所发现的一致。
商用纤维素酶制剂都不是100%的纤维素酶蛋白质,经常包括填料、缓冲液、稳定剂和其它组份。总纤维素酶蛋白质可以通过各种已知的测试方法来测定。在这里优选的测试试料(assay)是可商购的由BioradCompany,Los Angeles出售的Biorad Coomassie Blue Proteh试料,并使用高度纯化的纤维素酶作为标准。
添加的蛋白酶
蛋白酶可以从包括微生物、植物和动物的几种来源得到,在文献中有详细记载。某些重要的微生物蛋白酶解源包括地衣芽孢杆菌、枯草杆菌和米曲霉。植物蛋白酶的重要来源包括能得到木瓜蛋白酶的番瓜和能得到菠萝蛋白酶的凤梨。适于本发明的蛋白酶包括丝氨酸、半肌氨酸、天冬氨酸和金属蛋白酶。优选的一种蛋白酶是半肮氨酸蛋白酶木瓜蛋白酶(cysteine protease papain)。
蛋白酶很容易从如Sigma Chemical等公司以多种不同形式购买到,如液态溶液、粉末或负载在固体载体上的不溶性酶。在本发明的一个优选方案中,本瓜蛋白酶是以液体悬浮体的形式使用。
商用纤维素酶制剂都不是100%的纤维素酶蛋白质,经常包括填料、缓冲液、稳定剂和其它组份。总的纤维素酶蛋白质可以通过各种已知的测试方法来测定。在这里优选的测试试料(assay)是可商购的由Biorad Company,Los Angeles出售的Biorad Coomassie BlueProtein测试试料。
蛋白酶处理
本发明的有限蛋白酶处理包括使液体木霉属纤维素酶组合物与添加的蛋白酶在受控反应条件下接触一定时间。本领域的技术人员能认识到合适的处理程度取决于选择用来制备混合物的温度、pH、浓度以及所选蛋白酶的特殊活性,也能进一步认识到针对给定纤维素酶组合物和所添加的蛋白酶,可以使用常用的测试方法来选择一套最优的加工条件。
在优选的方案中,有限蛋白酶处理是在20℃-60℃更优选30℃-50℃的提高的温度下进行,在最优选方案中,采用的温度是37℃。
在优选的方案中,有限蛋白酶处理是在3.0—8.0优选4—7的pH值下进行,在最优选的方案中,采用的PH值是4—5。
在优选的方案中,有限蛋白酶处理是在5—250g/l优选50—200g/l的纤维素酶蛋白质浓度下进行的,在最优选的方案中,采用的浓度是约l00g/l。
在优选的方案中,有限蛋白酶处理的时间是5分钟到四周,优选l—120小时,在蛋白酶是木瓜蛋白酶时,其最优选的方案中所采用的处理时间是24—48小时。
在优选的方案中,处理程度是由蛋白酶蛋白质与纤维素酶蛋白质的重量比乘以平均处理时间所定义的,是在1.0g min/g—10000gmin/g之间,优选在10.0—5000g min/g之间,更优选在10—1000gmin/g之间。在蛋白酶是木瓜蛋白酶时,其最优选的方案中的处理程度是约200gmin/g。
在这些优选方案中,木瓜蛋白酶的浓度是约14gm/升。
如下的蛋白酶解反应过程的一种优选方法是使用滤纸和CMC试料,它们分别用来测定纤维素酶的FPUs和CMCUs(Ghose 1987)。优选蛋白酶处理应达到这样的程度:以滤纸单位(FPUs)测定时,纤维素酶失去至少5%的初始活性,以CMCs单位测定时,失去的初始活性不超过50%。进一步优选的是,蛋白酶处理应达到这样的程度:以FPUs测定时,纤维素酶失去至少10%的初始活性,并基本上维持在其起始活性的15%—90%之间,以CMCs单位测定时,基本上维持70%—100%的初始活性。更优选的是,纤维素酶的处理应达到这样的程度:以FPUs测定时,纤维素酶失去至少50%的初始活性,以CMCs测定时,失去小于10%的初始活性。蛋白酶的除去和回收
本发明方法进一步需要在已达到所需要的处理程度时终止蛋白酶解反应,使得没有显著量的外源蛋白酶污染本发明的用蛋白酶处理的木霉纤维素酶组合物。优选地,相对于组合物的重量,按总蛋白质测定,在纯化步骤后保留在组合物中的添加的蛋白酶少于0.05%。可以通过例如冷却或调节pH值来终止反应。然后可以从纤维素酶复合物中将添加的蛋白酶分离出来。本领域内的技术人员应当认识到有多种方法能从木霉属纤维素酶组合物中选择地除去添加的蛋白酶,包括色谱分离法、选择沉淀法、超滤法、或过滤法(如果使用了固体载体上的不溶性酶),合适的除去方法取决于所选择用来处理的蛋白酶的形式和其特殊性质。
完成这一分离的一种优选的方法是将溶解的蛋白酶结合到固体材料上,然后从其上洗掉纤维素酶。在这里所用的一种结合介质是可购买到的阳离子树脂,S-琼脂糖,是由瑞典的Pharmacia Biotech,Uppsala所出售的,当它与纤维素酶和蛋白酶的水溶液在低于6的pH值下接触时,能结合多种工业蛋白酶。使用S-琼脂糖从木霉属纤维素酶制剂中除去木瓜蛋白酶的一种优选方法是将纤维素酶和蛋白酶的混合物渗析到电导率为:3000μ-S或更小,然后使之在4.5-5.0的pH值和低于20℃的温度下通过S-琼脂糖树脂。
在本发明的一个优选的实施方案中,蛋白酶被回收并被用于另一批木霉属纤维素酶。一种优选的回收蛋白酶的方法是使蛋白酶在pH4.4—5.0的pH值和低于20℃的温度的条件下结合到S-琼脂糖树脂上。S-琼脂糖树脂大约能结合100gm/l的木瓜蛋白酶,使纤维素酶/木瓜蛋白酶混合物通过树脂,当树脂上载满木瓜蛋白酶时,用软水洗涤以除去任何污染的纤维素酶,再用lM氯化钠溶液使木瓜蛋白酶解吸。再渗析木瓜蛋白酶溶液以除去过量的盐,这样就可以再使用了。因为木瓜蛋白酶易于可逆氧化失活,所以在回收操作中维持一还原环境是很重要的。产品配方
本发明的纤维素酶组合物可以包括本领域内的技术人员已知的各种助剂。例如,能与纤维素酶组合物共混的(阴离子的或非离子的)表面活性剂在本发明的组合物中是有用的。优选的表面活性剂是非离子的,例如,TRITON_表面活性剂(辛基苯氧基聚乙氧基乙醇非离子表面活性剂)系列中的聚氧乙烯醇,可以从Union Carbide购买到。应当注意到表面活性剂可以进一步改进在白色和蓝色纱线之间的对比度,并能减少染料的再沉积量。必要时,在组合物中还可以使用其它材料或用其取代别的材料,这些材料包括石头、填料、溶剂、缓冲液、酶稳定剂、pH控制剂、酶激活剂、助洗剂和其它抗再沉积剂等。
酶组合物可以配成固体产品,这种固体可以是颗粒的、喷雾干燥的或造粒的。另外酶的组合物也可以配成液体、凝胶或糊状产品,在这里制备成液体是优选的。斜纹粗棉布的洗涤
产生“石磨”外观的斜纹粗棉布洗涤要以使用石头或不使用石头,斜纹粗棉布或斜纹粗棉布衣服在洗衣机中与含有用蛋白酶处理的木霉属纤维素酶组合物的水溶液组合物一起机械搅拌。用来处理斜纹粗棉布的的组合物的量取决于纤维素酶组合物中纤维素酶蛋白的浓度,洗衣机中斜纹粗棉布基料的量,所期望的石磨效果,和本领域中技术人员已知的其它参数。优选的用蛋白酶处理的纤维素酶组合物的用量通常是每kg斜纹粗棉布500-200,000CMC单位的酶,进一步优选的用量是每kg斜纹粗棉布5,000-100,000CMC单位的酶。
在优选的方案中,斜纹粗棉布的洗涤处理是在提高的温度下进行的,该温度为30℃-70℃进一步优选45℃-55℃。
在优选的方案中,斜纹粗棉布的洗涤是在4.0-7.5,进一步优选为4.5-6.5的pH值下进行,在最优选的方案中pH值是6.0。
除纤维素酶组合物外,斜纹粗棉布的洗涤步骤中还可以各种其它加工助剂。例如,在本发明的方法中,将能与纤维素酶组合物共混的(阴离子的或非离子的)表面活性剂加入洗衣机中是有用的。优选的表面活性剂是非离子的,例如,TRITON_表面活性剂(辛基苯氧基聚乙氧基乙醇非离子表面活性剂)系列中的聚氧乙烯醇,可以从Union Carbide购买到。应当注意到表面活性剂可以进一步改进在白色和蓝色纱线之间的对比度,并能减少染料的再沉积量。必要时,在组合物中还可以使用其它材料或用其取代别的材料,这些材料包括石头、填料、溶剂、缓冲液、酶稳定剂、pH控制剂、酶激活剂、助洗剂和其它抗再沉积剂等。
实施例
在上面已经讨论了本发明组合物以及该组合物的制备方法和它在织物布料的“石磨”中的应用。下面的实施例提供本发明的组合物和方法的特别详细的细节。基于这些指导,选择添加蛋白酶和纤维素酶的其他选择,以及选择洗涤条件,如浓度、测定方法、pH值、温度等对本领域的技术人员来说是非常明显的了。实施例1:用蛋白酶处理的木霉属纤维素酶组合物的制备
通过木霉属longibrachiatum的发酵生产600升天然木霉属纤维素酶制剂,再渗析到电导率为450μ-S。这种产品是不稳定不能保存的,但可以从Iogen Corporation以稳定和可保存的形式购买到Iogen Cellulase。基本类似的材料可以通过简单地渗析Iogen Cellulase除去稳定剂和保存剂来制备。然后经超滤浓缩到500升的体积。所得产品的蛋白质浓度为140gm/l,用Ghose(1987)方法测定,内切葡聚糖酶的活度为1599CMC单位。拿出150升制剂,剩下的制剂与150升软水以及40kg Biocon木瓜蛋白酶粉末混合,该粉末是从Quest International(产品号为5×98490)购买的,据Quest International所标明,蛋白质浓度为105g/kg,其活度为1,000凝乳单位(MCU)/mg。用苯甲酸钠将pH值调至4.8,混合物在大约35-40℃下培养42小时。所达到的处理程度为约216g min/g。在这一蛋白酶处理过程中,以FPUs测定时,有49%的起始活性损失掉了,以CMCUs测定时,则小于10%。在1小时内混合物冷却到约20℃。然后混合物在有硅藻土(diatamaceous)覆盖的板和滤框澄清混合物。用漂洗水将制剂稀释到约960升。按树脂生产商的指引(Pharmacia Technical Manual 18-1022-19“Ion Exchange Chromatography:Principles and Methods”,1991),使制剂通过S-琼脂糖阳离子交换树脂,从蛋白酶和纤维素酶的混合物中除去蛋白酶。首先用乙酸盐缓冲液将S-琼脂糖平衡到PH值为4.7,再将蛋白酶/纤维素酶混合物加到树脂上,使得每升填料树脂上有约13g木瓜蛋白酶蛋白质。树脂用pH值为4.7的缓冲液漂洗。从柱中流出的混合物流和洗涤相含有纯的不含木瓜蛋白酶的纤维素酶:在纤维素酶中的木瓜蛋白酶的活性是在基于偶氮酪蛋白(azo-casein)活性的检测极限之下,使1.0M的PH值为4.8的氯化钠溶液流过树脂,回收与S-琼脂糖结合的木瓜蛋白酶。用蛋白酶处理的木霉属纤维素酶制剂的体积为约2,700升。通过将PH值调节到4.0再添加0.5%的苯甲酸钠保存所得的用蛋白酶处理的木霉属纤维素酶制剂。然后通过超滤浓缩这一组合物并按传统方法(“EnzymeApplications”,Encyclopedia of Chemical Technology,Vol.9,Fourth Edition,1994)稳定到约1,800CMC单位/ml的最终浓度。实施例2:用蛋白酶处理的木霉属纤维素酶组合物洗涤斜纹粗棉布
使用35镑的UniMac Washer/Extractor洗衣机。将约5.1kg的要洗的斜纹粗棉布衣服放入洗衣机中。斜纹粗棉布包括Swift 14 oz.#37628斜纹粗棉布的3块30cm长的缝合的裤腿(pant legs)和5块一平方米的布片,以及Swift 12 oz.#25113斜纹粗棉布的3块30cm.长的缝合的裤腿,所有这些都是由Swift,Drummondville,Quebec制造的。斜纹粗棉布用30g从Gist-Brocades购买的Rapidase UCα-淀粉酶在70℃下处理15分钟。洗衣机中充入51升热水,并调至50℃。液体比为10∶1(液体的重量对衣服重量)。用300克85%的磷酸和114克氢氧化钠颗粒将液体缓冲至PH值为6.0。
洗衣机搅拌1分钟,以分散缓冲物并达到所需温度。这时向洗衣机中添加70ml实施例1的用蛋白酶处理的纤维素酶制剂。衣服在47RPM下洗涤60分钟,之后放掉缸中的水。
缸中充入50℃的水,并添加2g/L的苏打灰,将PH值调整到9.0-11.0以破坏纤维素酶的活性。洗衣机搅拌10分钟,然后放掉缸中的水。接着衣服用冷水漂洗5分钟,再用热水漂洗30秒钟。然后在50℃下漂洗10分钟,再放掉缸中的水,甩干。衣服用标准家用干燥机干燥30分钟。将衣服从干燥机中拿出并熨烫,熨烫时不使用蒸汽。
用Elrephro光度计(brightness meter)检测斜纹粗棉布的光度。对于#37628裤腿,其光度读数是用来和已知靛蓝含量的样品比较,以估计染料净除去量并转换成靛蓝染料从织物上的净除去量。其结果表示成未洗斜纹粗棉布上靛蓝的百分数。对于#25113裤腿,其光度读数是用来和已知靛蓝含量的样品比较,以估计返染的程度并转换成在织物上沉积的靛蓝染料净量,其结果表示成未洗斜纹粗棉布上靛蓝的百分数。
这一程序用88ml的标准再沉积纤维素酶-Iogen Cellulase进行重复,结果列于表1。表1.用蛋白酶处理的和未处理过的木霉属纤维素酶的比较。
染料净释放量 | 返染量 | |
蛋白酶处理过的纤维素酶 | 19.2% | 2.8% |
Iogen Cellulase | 21.4% | 8.3% |
从表1中可以明显看出染料的除去程度基本相同,暴露于蛋白酶处理过的纤维素酶的斜纹粗棉布与暴露于再沉积纤维素酶的斜纹粗棉布相比,表现出小得多的返染。实施例3:添加有表面活性剂的斜纹粗棉布洗涤
除特别声明外,使用实施例2的方法,在斜纹粗棉布的洗涤过程中使用了下列酶:a. 80ml实施例1的用蛋白酶处理的木霉属纤维素酶,按实施例2使用。b. 80ml实施例1的用蛋白酶处理的木霉属纤维素酶,按实施例2使用,但在用纤维素酶开始洗涤时向洗衣机中添加40ppm的TRITON_X100。c. 80ml实施例1的用蛋白酶处理的木霉属纤维素酶,按实施例2使用,但在用纤维素酶开始洗涤时向洗衣机中添加80ppm的TRITON_X100。d. 80ml实施例1的用蛋白酶处理的木霉属纤维素酶,按实施例2使用,但在用纤维素酶开始洗涤时向洗衣机中添加160ppm的TRITON_X100。表2.证实添加表面活性剂的效果。
染料净释放量 | 返染量 | |
蛋白酶处理过的纤维素酶(0ppm TRITON_X100) | 21.46% | 2.81% |
蛋白酶处理过的纤维素酶(40ppmTRITON_X100) | 21.09% | 2.29% |
蛋白酶处理过的纤维素酶(80ppmTRITON_X100) | 20.08% | 2.22% |
蛋白酶处理过的纤维素酶(160ppmTRITON_X100) | 17.72% | 2.09% |
应用实施例2的方法,在斜纹粗棉布的洗涤中使用了下列酶:a.实施例1的并在实施例2中测试过的用蛋白酶处理的纤维素酶。b.按Clarkson等人的方案,添加Iogen Cellulase(含有142mg/ml的蛋白质)作为再沉积木霉属纤维素酶,以及分别添加0.02ml,0.10ml,0.5
ml,2.5ml,12.5ml的从Gist-Brocades购买的Rapidase WSL-枯草杆菌
蛋白酶作为蛋白酶。这一蛋白酶含有110mg/ml的蛋白质。Iogen
Cellulase的用量是88ml,只有用12.5ml蛋白酶时例外,此时用78ml
纤维素酶。枯草杆菌蛋白酶蛋白质重量对纤维素酶蛋白质重量的水
平分别为0.02%,0.08%,0.40%,2.0%,10%。Clarkson等人所指导
的最低水平是0.1%。按Clarkson等人的建议,用152g冰醋酸和55g
氢氧化钠片将PH值调至5.0。所有其它程序按实施例2进行。
结果列于表3,它显示了与Clarkson等人的方法比较,用蛋白酶处理的木霉属纤维素酶组合物得到了低得多的返染水平。这一结果反驳了Clarkson等人关于洗涤中需要蛋白酶的指导,它们不支持如下指导:当纤维素酶和蛋白酶一起添加到洗衣机中时,如果相对于纤维素酶的量蛋白酶的量高于0.1%,则反染明显降低。表3.非再沉积纤维素酶组合物的比较。
实施例5:蛋白酶处理过的木霉属纤维素酶组合物的另一种制备方法。
染料净释放量 | 返染量 | |
蛋白酶处理过的纤维素酶 | 19.2% | 2.8% |
Clarkson等人的(0.02%) | 23.8% | 13.6% |
Clarkson等人的(0.08%) | 24.7% | 9.7% |
Clarkson等人的(0.4%) | 28.4% | 6.1% |
Clarkson等人的(2.0%) | 24.8% | 6.2% |
Clarkson等人的(10.0%) | 23.6% | 7.1% |
通过木霉属longibrachiatum的发酵生产1,000升天然木霉属纤维素酶制剂,再渗析到电导率为310μS。这种产品是不稳定不能保存的,但可以从Iogen Corporation以稳定和可保存的形式购买到Iogen Cellulase。基本类似的材料可以通过简单渗析Iogen Cellulase除去稳定剂和保存剂来制备。然后经超滤浓缩到725升的体积。所得产品的蛋白质浓度为98gm/l,用Ghose(1987)方法测定,内切葡聚糖酶的活度为1325 CMC单位/ml。拿出375升制剂,剩下的制剂与150升软水以及15.75kg从FolexcoIncorporarte购买的“Folexco Papain 300 MCU”混合,后者的活性木瓜蛋白酶蛋白质浓度估计为32g/kg,其活度估计为300凝乳单位(MCU)/mg木瓜蛋白酶粉末。用苯甲酸钠将PH值调至4.8,混合物在约35-50℃下培养27小时。所达到的处理程度为约24g min/g。本发明者估计在蛋白酶处理过程中,约有20%的FPU活性被损失掉了,但没有CMCU活性损失。在2小时内混合物冷却到约10℃。然后混合物在有硅藻土(diatamaceous)覆盖的板和滤框澄清混合物。用漂洗水将制剂稀释到约800升。按树脂生产商的指引(Pharmacia Technical Manual 18-1022-19“Ion ExchangeChromatography:Principles and Methods”,1991),使制剂通过S-琼脂糖阳离子交换树脂,从蛋白酶和纤维素酶的混合物中除去蛋白酶。首先用乙酸盐缓冲液将S-琼脂糖平衡到PH值为4.7,再将蛋白酶/纤维素酶混合物加到树脂上,使得每升填料树脂上有约5g木瓜蛋白酶蛋白质。树脂用PH值为4.7的缓冲液漂洗。从柱中流出的混合物流和洗涤相含有纯的不含木瓜蛋白酶的纤维素酶:在纤维素酶中的木瓜蛋白酶的活性是在基于偶氮酪蛋白(azo-casein)活性的检测极限之下,使1.0M的PH值为4.8的氯化钠溶液流过树脂,回收与S-琼脂糖结合的木瓜蛋白酶。用蛋白酶处理的木霉属纤维素酶制剂的体积为约1,600升。通过将PH值调节到4.0再添加0.5%的苯甲酸钠保存所得的用蛋白酶处理的木霉属纤维素酶制剂。然后通过超滤浓缩这一组合物并按传统方法(“Enzyme Applications”,Encyclopedia ofChemical Technology,Vol.9,Fourth Edition,1994)稳定到约2,000CMC单位/ml的最终浓度。实施例6:用蛋白酶处理的木霉属纤维素酶组合物洗涤斜纹粗棉布。
除特别声明外,使用实施例2的方法,在斜纹粗棉布的洗涤过程中使用了下列酶:a. 86ml实施例5的用蛋白酶处理的木霉属纤维素酶,按实施例2使用。b. 70ml实施例1的用蛋白酶处理的木霉属纤维素酶,按实施例2使用。c. 88ml实施例2中所描述和测定过的Iogen Cellulase。
结果列于表4,证实了在实施例5(24g min/g)中使用较少量的木瓜蛋白酶来处理不能得到与实施例1(216g min/g)中同样好的性能。表4.用蛋白酶处理的和未处理过的木霉属纤维素酶的比较。
实施例7:斜纹粗棉布洗涤结果的比较
染料净释放量 | 返染量 | |
用蛋白酶处理的纤维素酶(实施例5) | 18.0% | 3.8% |
用蛋白酶处理的纤维素酶(实施例1) | 19.2% | 2.8% |
Iogen Cellulase | 21.4% | 8.3% |
使用实施例2的方法,在斜纹粗棉布的洗涤过程中使用了下列酶:a.在实施例2中测试过的,实施例1的用蛋白酶处理的纤维素酶。b. 80ml实施例1的用蛋白酶处理的木霉属纤维素酶,在用纤维素酶开始洗涤时向洗衣机中添加40ppm的TRITON_X100,按照实施例3测试。c.添加100ml的Genencor International的商用纤维素酶产品EuroL,我们认为它含有蛋白酶、再沉积木霉属纤维素酶和表面活性剂。按生产商的指导,用150g冰醋酸和85g氢氧化钠片将PH值调至5.5,所有其它程序都按实施例2进行。d.向洗衣机中添加100ml的Euro L,在用纤维素酶开始洗涤时,还添加40ppm的TRITON_X100。按生产商的指导,用150g冰醋酸和85g氢氧化钠片将PH值调至5.5,所有其它程序都按实施例2进行。e.添加250ml的Novo Nordisk的商用产品Denimax L,我们认为它含有Humicola insolens产生(mage)的低返染酶。按生产商的指导,用297g磷酸和125g氢氧化钠片将PH值调至6.5,所有其它程序都按实施例2进行。f.向洗衣机中添加250ml的Denimax L,在用纤维素酶开始洗涤时,还添加40ppm的TRITON_X100。按生产商的指导,用297g冰醋酸和125g氢氧化钠片将PH值调至6.5,所有其它程序都按实施例2进行。
结果列于表5,可以看出,与Euro L或Denimax L比较,在染料释放量差不多的情况下,用蛋白酶处理的木霉属纤维素酶组合物能给予斜纹粗棉布较低的返染水平。不带表面活性剂的用处理过的木霉属纤维素酶,相对于Euro L,甚至相对于含有提高性能的表面活性剂的Euro L,都表现出良好的性能。与其它酶比较,需要多于2-3倍的Denimax L才能使斜纹粗棉布褪色,从这一事实就可以看出,Humicola insolens纤维素酶的性能较差。表5.非再沉积纤维素酶组合物的比较。
染料净释放量 | 返染量 | |
用蛋白酶处理的纤维素酶 | 19.2% | 2.8% |
用蛋白酶处理的纤维素酶(40ppm的TRITON_X100) | 21.09% | 2.29% |
EuroL | 19.9% | 3.4% |
Euro L(40ppm的TRITON_X100) | 21.44% | 3.35% |
DenimaxL | 19.6% | 3.6% |
Denimax L(40ppm的TRITON_X100) | 18.17% | 3.32% |
至此,已经描述完了本发明的优选方案,本发明仅仅用用所附的权利要求书来限。
Claims (10)
1、一种含有用蛋白酶处理的木霉属纤维素酶的低返染纤维素酶组合物,它是包括下列加工步骤的产品:
(a)通过向含有纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶的木霉属纤维素酶中添加蛋白酶,使纤维素酶经受有限的蛋白酶处理,其中使用的蛋白酶对纤维素酶的重量比率乘以平均处理时间基本上在1.0-10000gmin/g之间;
(b)通过冷却或调节pH值来终止反应;和
(c)通过基本上除去所添加的蛋白酶来纯化该纤维素酶,从而限定该组合物。
2、根据权利要求1的低返染纤维素酶组合物,其特征在于,所述的蛋白酶处理应达到这样的程度:以滤纸单位测定时,被处理的纤维素酶的起始活性至少损失5%,以CMC单位测定时,其起始活性的损失不超过50%。
3、根据权利要求1的组合物,其特征在于,所述的蛋白酶处理应达到这样的程度:以滤纸单位测定时,被处理的纤维素酶基本上维持在其起始活性的15%—90%之间,以CMC单位测定时,基本上维持在其起始活性的70%—100%之间。
4、根据权利要求1的组合物,其特征在于,有限的蛋白酶处理步骤是这样限定的:使用的蛋白酶对纤维素酶的重量比率乘以平均处理时间基本上在10.0—5000g min/g之间。
5、根据权利要求1的组合物,其特证在于,所添加的蛋白酶包括木瓜蛋白酶。
6、根据权利要求1的组合物,其特征在于,相对于组合物的重量,按总蛋白质测定,在纯化步骤后保留在组合物中的添加的蛋白酶少于0.1%。
7、根据权利要求1的组合物,其特征在于,相对于组合物的重量,按总蛋白质测定,在纯化步骤后保留在组合物中的添加的蛋白酶少于0.05%。
8、根据权利要求1的组合物,其特征在于,在纯化步骤后的组合物中没有可检测到的所添加的蛋白酶。
9、根据权利要求1的组合物,其特征在于,所述木霉属纤维素酶含有内切葡聚糖酶(EG)和纤维二糖水解酶(CBH)核心区,其中CBH核心区不连接到它们原来的结合区,且相对于木霉属天然产生的量,组合物基本上没有增加的或残留的蛋白酶活性。
10、根据权利要求9的组合物,其特征在于,所述纤维素酶是通过培养经基因改性能直接产生没有结合区的CBH核心区的木霉属菌株制备的。
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